Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль генов углеводного и белкового комплексов эндосперма в формировании качества зерна пшеницы

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Роль генов углеводного и белкового комплексов эндосперма в формировании качества зерна пшеницы"

На правах рукописи

РЫЖКОВА Татьяна Александровна

РОЛЬ ГЕНОВ УГЛЕВОДНОГО И БЕЛКОВОГО КОМПЛЕКСОВ ЭНДОСПЕРМА В ФОРМИРОВАНИИ КАЧЕСТВА ЗЕРНА ПШЕНИЦЫ

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

5

2015

005558699

Белгород-2014

005558699

Работа выполнена в федеральном государственном автономном

образовательном учреждении высшего профессионального образования

«Белгородский государственный национальный исследовательский университет» Министерства образования и науки Российской Федерации.

Научный руководитель:

Нецветаев Владимир Павлович, доктор биологических наук, профессор. Официальные оппоненты:

Боронникова Светлана Витальевна, доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» Министерства образования и науки Российской Федерации, заведующий кафедрой ботаники и генетики растений

Поморцев Андрей Анатольевич, доктор биологических наук, доцент, ФГБУН Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, ведущий научный сотрудник лаборатории генетических основ идентификации растений

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Российский государственный аграрный университет — МСХА имени К.А. Тимирязева» Министерства сельского хозяйства Российской Федерации

Защита диссертации состоится «¿У» г& 2015 г. в « часов

на заседании совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 212.015.13 при ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» по адресу: 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» Минобрнауки России и на сайте www.bsu.edu.ru

Автореферат разослан ¡Хи£су11& 2015 г.

И.о. ученого секретаря совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 212.015.13

доктор медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Озимая мягкая пшеница (Triticum aestivum L.) -ведущая зерновая культура, используемая как для продовольственных целей, так и формирования кормовой базы для нужд животноводства. На мировом рынке Российская Федерация входит в число ведущих поставщиков высококачественного зерна и располагает самым зимостойким генофондом пшеницы.

По данным Беспаловой JLA. [2006] за последние сто лет продуктивность пшеницы увеличилась более чем в два раза. Этому способствовало внедрение современных агротехнологий, а также создание новых генотипов мягкой пшеницы, обладающих более высокой зерновой продуктивностью и сохраняющих свои потребительские свойства в существующих условиях среды [Atwell W.A., 2001; Гурковская Е.А., 2006; Nishio Z. et al, 2007]. Создание нового сорта начинается с подбора пар для гибридизации, чему способствует знание генетических механизмов наследования качественных и количественных признаков организма.

Научные исследования последних десятилетий показали, что изучение генетики запасных белков и различных форм ферментов позволили значительно расширить представления о генетическом разнообразии генофонда пшеницы мягкой [Копусь М.М., 1998; Конарев А.В. и др., 2000; Delwiche S.R., Graybosch R.A., 2002; Hayakawa К. et al., 2004; Sasaki Т., 2005; Yasui Т., 2006; Гаврикова

0.М., 2007; Драгович А.Ю., 2008; Ma W. et al., 2009; Обухова Л.В., 2010; Мельникова Е.Е., 2011; Бобошина И.В., 2013; Климушина М.В., 2013]. Так, в современной литературе достаточно полно представлены данные о генетическом полиморфизме н'аг>'-протеина и белков глиадинов, а также распространении аллелей этих генов в сортах ряда селекционных центров [Yamamory М., Quynh N.T., 2000; Zhang W. et al., 2004; Петрова И.В. и др., 2007; Климушина М.В. и др., 2010; Абдулина И.Р. и др., 2012; Alvares J.B., Guzman С., 2013; Абдулина И.Р. и др., 2013]. В то же время, открытым остается вопрос о влиянии дозы waxy генов в геноме пшеницы на формирование качества зерна, а также о встречаемости аллелей глиадинкодирующих локусов в сортах и селекционных формах нашего региона и перспективах их использования. Не менее актуальным остается вопрос об особенностях и возможностях использования генетического потенциала пшеницы при создании новых сортов продовольственной пшеницы в условиях Центрально-Черноземного региона РФ.

Цель: изучение влияния нщу-генов, генов запасных белков эндосперма мягкой пшеницы и внешних факторов окружающей среды на проявление количественных параметров качества зерна.

Задачи:

1. Установить генотипический состав по waxy-генам образцов озимой мягкой пшеницы, включенных в гибридизацию.

2. Определить наиболее эффективные условия года для идентификации waxy-генотипов пшеницы по реологическим свойствам теста.

3. Выявить внутривидовое разнообразие новых и районированных сортов мягкой пшеницы по наследственным вариантам глиадинов и исследовать сопряженность глиадинкодирующих локусов с хозяйственно-ценными признаками мягкой пшеницы.

4. Установить особенности влияния генетических и средовых факторов на формирование качества зерна пшеницы.

Научная новизна. Впервые на основе анализа пыльцевых зерен Fb где одним из родителей был полный рецессив по всем генам waxy, установили генотипы ряда сортов и образцов озимой мягкой пшеницы. Определили, что для изменения реологических свойств теста недостаточно одного или двух рецессивных генов waxy. Полный рецессив ухудшает реологические свойства теста. Выявлено, что создание новых сортов мягкой пшеницы высокого качества с использованием генов waxy должно строиться на многолинейных сортах, доля рецессивных гомозигот в которых не должна превышать 30%. Впервые определены условия года, при которых идентификация waxy форм пшеницы с использованием прибора Миксолаб будет максимально эффективна. Установлен генотипический состав по локусам, контролирующим глиадины среди образцов мягкой пшеницы белгородской селекции. Показано влияние числа дисульфидных связей между пептидами зерновки на формирование реологических свойств теста и действие метеофакторов среды на его проявление.

Научно-практическое значение. Полученные данные по особенностям формирования показателей качества зерна под действием генотипа и среды реализуются и могут быть использованы при оценке технологических свойств селекционных образцов. Созданные генотипы озимой мягкой пшеницы используются в качестве исходного материала в селекции этой культуры ГНУ Белгородский НИИСХ Россельхозакадемии. Результаты работы используются в учебном процессе в ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет».

Апробация работы. Основные положения и результаты работы были представлены на Международных и Всероссийских научных и научно-практических конференциях: «Управление продукционным процессом в агротехнологиях 21 века» к 35-летию образования Белгородского научно-исследовательского института сельского хозяйства» (Белгород, 2010); «Биологизация адаптивно-ландшафтной системы земледелия — основа повышения плодородия почвы, роста продуктивности сельскохозяйственных культур и сохранения окружающей среды» (Белгород, 2012); «Селекция и генетика сельскохозяйственных растений: традиции и перспективы (к 100-летию Селекционно-генетического института - Национального центра семеноводства и сортоизучения) (Украина, Одесса 2012); «Проблемы и перспективы аграрной науки в России», посвященная 135-летию со дня рождения А.И. Стебута (Саратов, 2012); «Impactul relizärilor §tiintiflce asupra producjiei §i calitätii cerealelor spicoase» (Rep. Moldova, Bälfi, 2013). Диссертационная работа выполнена при частичной финансовой поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы».

Личный вклад автора. Полевые и лабораторные исследования выполнялись автором лично или при непосредственном участии в составе научного коллектива. Автор лично проводил обработку, анализ и интерпретацию полученных результатов, подготовку публикаций и оформление рукописи.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 12 - в изданиях, рекомендованных перечнем ВАК РФ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разнообразие некоторых сортов и форм озимой пшеницы по генам waxy и эффект этих генов на изменение крахмального комплекса зерновки.

2. Полиморфизм новых, районированных сортов и селекционных образцов озимой мягкой пшеницы по вариантам глиадина, как основа улучшения этой культуры по хозяйственно-ценным признакам и свойствам.

3. Роль генотипа и среды в формировании признаков качества зерна озимой мягкой пшеницы, обусловленных генами waxy и локусами Gld.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, библиографического списка и приложений. Работа изложена на 138 страницах машинописного текста, включает 19 рисунков и 21 таблицу. Библиографический список содержит 186 наименований, из них 94 - на иностранных языках.

УСЛОВИЯ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Условия исследования. Полевые опыты проводили с 2010 по 2013 гг. при лаборатории селекции и семеноводства пшеницы Государственного научного учреждения Белгородский научно — исследовательский институт сельского хозяйства Россельхозакадемии на опытных полях в пос. Гонки, расположенном в западном агроклиматическом районе Белгородской области.

Почва опытного участка - чернозем типичный среднемощный малогумусный тяжелосуглинистый на лёссовидном суглинке с содержанием в пахотном слое 5,18-5,32 % гумуса. Содержание в почве подвижной формы фосфора 52-58 мг/кг, обменного калия 95-105 мг/кг, рНсол. - 5,8-6,4 [Соловиченко В.Д. и др., 2012].

Предшественником в опытах был чистый пар в соответствии с принятым трехпольным севооборотом (черный пар - озимая пшеница - кукуруза).

Погодно-климатические условия в годы исследования характеризовались неоднородностью и значительной контрастностью по температурному режиму, количеству и времени выпадения атмосферных осадков, что предоставило возможность дать объективную характеристику коллекционному и гибридному материалу озимой пшеницы по количественным показателям в присутствии различных лимитирующих факторов среды.

Материалом исследования генетического разнообразия выступала коллекция сортов озимой мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) конкурсного сортоиспытания Белгородского НИИСХ Россельхозакадемии, районированных в ЦЧР (5 регион РФ) и формы, отличающиеся по качеству зерна. В качестве рецессивных гомозигот по трем на генам использовали сорт одесской селекции

Софшка, любезно предоставленный А.И. Рыбалка, а также яровые формы 991D529 (UA 0106163) h 991D389 (UA 0106473), полученные из Института растениеводства (г. Харьков). Такой генотип представляет собой пшеницу амилопектинового типа. Также в опытах по исследованию наличия доминантных генов Wx и созданию генотипов озимой пшеницы амилопектинового типа принимали участие гибриды первого и последующих поколений (Fi-Fx), где одним из родителей выступала рецессивная гомозигота по трем генам wx.

Выбор генотипов и сортов T. aestivum L. в качестве объектов исследования был обусловлен необходимостью исследования показателей качества пшеницы, как главной продовольственной культуры, при совокупном влиянии генетических и средовых факторов.

Методы исследования. Электрофоретические спектры (ЭФС) проламинов зерна получали путём их электрофореза в 13-14% крахмальном геле [Созинов A.A., Попереля Ф.А., 1974]. Аллели глиадинкодирующих локусов в спектрах озимой мягкой пшеницы идентифицировали по каталогу [Попереля Ф.А., Собко Т.Я., 1987]. Для выявления состава родительского генотипа пшеницы по Wx/wx генам изучали характер расщепления окраски пыльцевых зерен пшеницы под воздействием раствора йода (5%) у гибридов первого и последующих поколений.

Помол зерна проводили на лабораторных мельницах типов МЛУ-202 «Бюллер» швейцарской фирмы BUHLER для получения муки 70% выхода и MF 10 basic IKA WERKE с размером сита 1 мм для получения шрота зерна. Количество и качество клейковины определяли ручным способом [ГОСТ 13586.1-68] и по модифицированной методике [Нецветаев В.П. и др., 2005]. Уровень агрегации белковых молекул за счет межмолекулярных дисульфидных связей определяли по оригинальной методике Нецветаева В.П. и др. [2008]. Реологические и ферментативные свойства теста пшеницы определяли на приборе Миксолаб (CHOPIN Technologies (Франция)) в протоколе «Chopin-Wheat+» по инструкции прибора.

Статистические методы исследования Оценку существенности разности выборочных средних определяли по t-критерию Стьюдента [Доспехов Б.А., 1985]. Соответствие между наблюдаемыми и ожидаемыми распределениями по признакам качества тестировали на основе критерия х2 [Нецветаев В.П., 2008]. Оценку частот встречаемости аллелей по изученным локусам для диаллельного распределения вычисляли обычным способом [Рокицкий П.Ф., 1974], а при множественном аллелизме - по формулам [Ли Ч., 1978]. Корреляционный, дисперсионный анализы проводили с использованием пакета анализа данных программы «Statistica 6.0». Расчет долей влияния отдельных факторов среды и генотипа производили на основе программы «StatNov».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ 1. Изучение waxy пшеницы

Характеристика сортов озимой пшеницы по числу Wx/wx. Наиболее наглядным способом выделения расщепляющихся по м>йху-генам генотипов

является воздействие раствора йода на пыльцу пшеницы. Пыльцевые зерна с нормальным составом крахмала приобретали сине-черное окрашивание, а пыльцевые зерна с амилопектиновым типом крахмала оставались красно-коричневыми (рис. 1).

Рис. I. Расщепление окраски пыльцевых зёрен с растений А) Р| 77/12 X Софшка Б) сорт Софшка по йодной реакции (увеличение 15x20)

Результаты генетического анализа по наследованию признака реакции на окраску йодом пыльцевых зёрен (табл. 1) показали, что если расщепление пыльцевых зерен близко к соотношению 1:1, то родительские формы различаются между собой по аллелям одного гена. Таким образом, сорта Коротышка, № 650/00 несут доминантный Ч'х аллель одного гена и рецессивные аллели х по двум другим генам. Представленные ранее данные указывали на присутствие в сорте Коротышка рецессивного аллеля по одному гену [Климушина М.В. и др., 2010; 2012]. Причиной несоответствия данных может быть гетерогенность сорта Коротышка.

Таблица 1

Расщепление пыльцевых зерен по генам ИЬ/мх растений

Растения гибриды К, Фенотип ические классы X2.:, Х23:1 Х2т:,

\Ух мх

I Коротышка х Софшка 84 50 8.63 10,84 75,43

2 № 650/00 х Софшка 64 41 5,04 11,05 67,66

3 Казачья х Софшка 76 22 29.76 0.34 8,87

4 № 77/12 х Софшка 97 48 16,56 5,08 56,28

5 Везёлка х Софшка 44 11 19.80 0,73 2,83

6 Софшка х Волжская 100 95 16 56,23 6,63 0,37

7 Софшка х N9 220/12 177 37 91,59 6,79 4,49

8 № 51/12 х Софшка 181 33 102,36 10,47 1,67

9 № 66/12 х Софшка 83 7 64.18 14,24 1,83

10 № 100/12 х Софшка 104 8 82,29 19,05 2,94

11 № 106/12 х Софшка 99 5 84,96 22,62 5,63

12 № 120/12 х Софшка 79 15 43,57 4,10 1,03

Расщепление пыльцевых зерен в соотношении 3:1 свидетельствовало, что сорта Козачья, Везёлка и №77/12 отличаются по доминантным аллелям двух генов от гомозиготного wx сорта Софшка. Расщепление, близкое к соотношению 7:1, характерно для сортов с доминантными аллелями по трем Wx генам. Таких сортов и селекционных номеров оказалось большинство.

В процессе анализа выявили полиморфные сорта по признаку расщепления йодной окраски, среди которых оказались У ни 1, Волжская 100 и образцы № 114/12 и № 220/12. Среди растений старших поколений (F3.4) от скрещивания с полным wjc-рецессивом не было обнаружено гомозиготных waxy форм, но были обнаружены семьи, продолжающие расщепляться.

Реологические свойства waxy пшеницы в зависимости от дозы генов

wx. Известно, что количество рецессивных аллелей wx влияет на соотношение амилоза/амилопектин в крахмале и изменяет реологические свойства теста пшеницы. Приняв за основу аддитивное действие вакси генов, в 2012-13 гг. на приборе Миксолаб провели моделирующий эксперимент, выявивший характер реологического поведения пшеницы дикого типа по генам waxy и моделирующих смесей при наличии одной, двух, трех «доз» генов wx в них (рис. 2).

-Беченчукск.ш 380 -2/3 Бетенчукскпа » 1<ЗСоф»Тм1

-1 3 Бсчснчукскоя 2/3 Соф1Пка -Соф|Кка

Рис. 2. Миксограммы безостого сорта дикого типа по ног генам Безенчукская 380, рецессивной гомозиготы по wx генам сорта Софшка и их смесей 2012 г.

Степень чувствительности индексов по годам была неодинаковой, что свидетельствовало о зависимости показателей прибора Миксолаб не только от сортовых особенностей, но и от погодно-климатических условий периода выращивания.

С ростом дозы рецессивных генов waxy в моделирующих смесях возрастали водопоглотительная способность шрота в 2012 году с 7,7 баллов для дикого типа до 9,0 баллов для wx типа пшеницы (НСР0,95= 0,67, табл. 3) и в 2013 году - с 8,3 до 9,0 баллов (НСР0,95 = 0,58, табл. 4); замешивающая способность в моделирующих смесях с остистой пшеницей с 3,7 для дикого типа до 5,0 баллов для сорта Софшка (НСР0,95 = 0,58, табл. 2). В условиях увеличения дозы wx-составляющей в пшенице индекс Глютен имел тенденцию на снижение (в опыте с остистыми сортами с 2,7 до 1,0 балла при НСР0,95 = 0,94, а в опыте с безостыми сортами - с 5,0 до 1,0 балла при НСР0.95= 1,15, табл. 2, 3).

Таблица 2

Реологические показатели моделирующих смесей остистых сортов пшеницы 2012 года в зависимости от дозировки муки ии>составляющей

Сорт/смесь п Среднее значение индексов, балл

впс Замес Глютен+ Вязкость Амилаза Ретрог-радация

Дикий тип 3 6,7 3,7 2,7 0,7 4,0 1,3

1 жс рецессив 3 8,3 4,0 1,7 0,0 4,0 1,7

2 п>х рецессива 3 9,0 5,0 1,3 0,0 5,0 1,7

3 н>х рецессива 1 9,0 5,0 1,0 0,0 5,0 1,0

НСР„.„ 2,29 0,58* 0,94* 0,52* 0,00 1,11

Доля влияния фактора, %

доза \кс 49,1 86,4 70,0 60,0 100,0 31,4

сорт 15,7 3,4 10,0 10,0 0,0 5,7

случайные 35,2 10,2 20,0 30,0 0,0 62,7

* - достоверно при р>0,95; п=10

Таблица 3

Реологические показатели моделирующих смесей безостых сортов пшеницы 2012 года в зависимости от дозировки муки и>л>составляющей

Сорт/смесь п Среднее значение индексов, балл

ВПС Замес Глютен+ Вязкость Амилаза Ретрог-радация

Дикий тип 3 7,7 3,7 5,0 5,3 3,7 4,7

1 п>х рецессив 3 8,7 4,3 2,0 0,0 5,0 2,0

2 ч>хрецессива 3 9,0 5,0 1,3 0,0 4,0 2,0

3 №с рецессива 1. 9,0 5,0 1,0 0,0 5,0 1,0

НСР„„ 0,67* 1,49 1,15* 2,08* 1,15* 2,52*

Доля влияния фактора, %

доза 1кс 72,9 40,7 91,8 87,7 61,5 63,7

сорт 13,6 22,2 2,0 зд 9,6 9,1

случайные 13,6 37,0 6,1 9,3 28,9 27,2

* - достоверно при р>0,95; п=10

Таблица 4

Реологические показатели моделирующих смесей сортов пшеницы 2013 года в зависимости от дозировки муки илг-составлягащей

Сорт/смесь ц Среднее значение индексов, балл

ВПС Замес Глютен+ Вязкость Амилаза Ретрог-радация

Дикий тип 3 8,3 4,0 3,0 4,3 4,7 7,0

1 п'х рецессив 3 9,0 4,3 2,7 1,0 5,0 3,7

2 и>л: рецессива 3 9,0 5,0 2,7 0,0 4,7 2,0

3 п>х рецессива 1 9,0 5,0 2,0 0,0 4,0 2,0

НСР 0.95 0,58* 1,73 2,73 1,15* 0,88* 1,15*

Доля влияния фактора, %

доза н'х 60,0 25,2 12,3 93,2 54,3 94,9

сорт 10,0 24,3 1,3 1,7 5,7 1,3

случайные 30,0 50,5 86,5 5,1 40,0 3,8

* - достоверно при р>0,95; п=10

В углеводно-амилазном комплексе наблюдались более значимые изменения. Наибольшую чувствительность к процентному содержанию wx-рецессива в моделирующих смесях имел индекс Вязкость. Вне зависимости от первоначально высокого (табл. 3, 4) или низкого (табл. 2) значении индекса пшеницы дикого типа добавление уже одной ('/з) части муки полного рецессива по генам wx вызывало критическое разжижение теста и проявления типичной реологической картины муки waxy пшеницы. Аналогичное явление наблюдалось в отношении индекса Ретроградация.

Таким образом, моделирующий эксперимент позволил показать, что при аддитивном действии генов для проявления эффекта waxy пшеницы достаточно наличия одного рецессивного гена wx.

Однако на практике при анализе сортов гетерогенных по wx генам такой закономерности не наблюдалось. Проследив реологическое поведение выделенных на основе анализа пыльцевых зерен генотипов, отличающихся по составу Wx/wx, установили, что наличие только трех генов wx в рецессивном состоянии, как у сорта Софгйка, вызывало снижение индекса Вязкости до нуля, а гетерогенные сорта по вакси генам имели значения индекса отличные от нуля, но близкие к носителям доминантных аллелей этих локусов.

Влияние среды на реологические свойства муки подобное проявлению действия генов нее. Установлено, что реологическое поведение теста нормальной пшеницы, сходное с эффектом waxy, может наблюдаться в годы с переувлажненным периодом во время созревания зерна, как было отмечено в 2012 году. Из-за присутствия проросшего зерна тесто нормальных сортов пшеницы оказалось слишком разжиженным. Следовательно, в годы, неблагоприятные для формирования углеводного комплекса, идентификация генов waxy пшеницы по реологическим свойствам затруднена из-за активности амилаз наклюнувшихся зерен, что приводит к частичной деградации крахмала.

2. Полиморфизм глиадинкодирующих локусов и его связь с хозяйственно-ценными признаками озимой пшеницы

Распространение глиадинкодирующих аллелей в образцах озимой мягкой пшеницы Белгородской области. Анализ распространения аллелей глиадинкодирующих локусов мягкой пшеницы подтвердил, что белгородские сорта обладали достаточным полиморфизмом по аллелям Gld локусов.

Проведенное ранжирование глиадинкодирующих аллелей по частоте встречаемости в селекционном материале Белгородской области и оценка существенности различий выявили, что в наборе сортов и линий Белгородской области лидирующее положение занимали аллели Gld 1А2 и Gld 1А4, Gld 1В1, Gld 1D1 и Gld IDS. На это указывает существенность различий по встречаемости между некоторыми из них (рис. 3).

Хромосома 1А

--- 8,43**" -►

■«- 3,65*** -»

"- 8,23*" -►

-- 6,90™ --

■«- 1,54 -►

-- 6,38**"-► -2,88**-»

•<- 6,22*"-► -- 2,71—-»

-—0,00 —» ■•—5,58"*-» —— 0,72—» »-0,19—► <—0,64-» »—1,96—» -— 0,44-»

A3 (34,2) =А4 (34,2) > А17 (9,5) > А10 (7,4) > A3 (6,8) > А9 (5,3) > AS (1.6) > А6 (1,1) <-5,58***-» <- 0,91 -► ч 2,54«-»

-6,22***-» »- 0,83-» ■*-2,30*— 6,39*"-»

6,90*** -

3,34*

3,05*

8,23***

8,43***

Хромосома ш — 10.3" -

8.84"

Хромосома 1В л- 8.43"

11,8"* -► -- 7.0 -► •«- 4.21"

«-11,3"-—► ••-0,7 -» *- 1.63-» «-5-38^ •<— 3.62*^—»•<— 0.82—►

ВЦ19Л) > В3(\\,1) > Я2(9,3) т (47.3) > 1)5(37.5) > D4 ( 12.0) > D2 (2.2) > DO (1.1)

Рис. 3. Ранжирование аллелей глиадинкодирующих локусов по частоте встречаемости в Белгородской области (различия существенны при уровне значимости: * р>0,95, ** р>0,99, *** р>0,999)

Маркеры ржаных транслокаций 1AL/1RS (аллель Gld 1А17) и 1BL/1RS (аллель Gld IBS) несли порядка 9,5% и 11,7% образцов. Среди сортов белгородской селекции донором аллеля Gld 1А17 является сорт Богданка -первый российский сорт с ржаной транслокацией в хромосоме 1А, а аллеля Gld IBS - сорт Синтетик. Для локусов 6-ой хромосомы было характерно диаллельное распределение с равномерным присутствием обоих аллелей, за исключением локуса Gld 6А, где преобладал аллель 6АЗ (табл. 3).

Таблица 3

Оценка частот генов 6-ой хромосомы, ответственных за кодирование глиадинов

Аллель Число образцов Встречаемость ± ошибка средней,% Критерий t

Gld 6А1 8 10,95±3,65 t-15,1*"

Gld 6АЗ 65 89,04±3,65

Gld 6В1 31 42,46±5,78 t=l,84

Gld 6В2 42 57,53±5,78

Gld 6D1 40 54,79±5,82 t=l,17

Gld 6D2 33 45,20±5,82

*** - достоверно при р>0,999; п=73

Оценка сопряженности некоторых аллелей глиадинкодирующих локусов с морфологическими, хозяйственно-ценными и качественными признаками зерна мягкой пшеницы. Установлено, что варианты пептидов, контролируемые разными аллелями глиадинкодирующих локусов в условиях Белгородской области, вносили неодинаковый вклад в проявление показателей качества зерна.

Высокой урожайностью на протяжении нескольких лет отличались сорта-носители аллеля Gld 1А17, в том числе сорт Богданка, а носители варианта глиадина GLD 1А10, контролируемого аллелем Gld 1А10, имели более низкую урожайность (различия были существенны и достигали 95 и 99% уровня значимости). Достоверных сопряженных связей глиадинкодирующих аллелей локуса Gld 1А и показателей высоты растений и зимостойкости в 2012 году выявлено не было. Наличие аллелей Gld 1А2 и Gld 1А4 оказывало отрицательный эффект на показатель натуры зерна, в то время как с аллелями Gld 1AI0 и Gld 1А17 наоборот, был связан положительный эффект. Различия между носителями этих вариантов были существенны на 99% уровне значимости.

Стоит отметить, что различия по связи аллелей локусов Gld 1В и Gld ID с формированием хозяйственно-ценных признаков растения (зимостойкость, урожайность, высота и натура) были менее значимы. Статистически достоверным был положительный эффект носителей аллелей Gld 1D1 и Gld 1D5 на показатель урожайности по сравнению с генотипами, имевшими аллель Gld 1D4 (t = 2,82; n=54,5; р > 0,99 и t = 2,59; n = 45,5; р > 0,99 соответственно).

Наибольшее число сопряженных связей было выявлено для показателя SDS-седиментации. С одной стороны, положительный эффект был связан с аллелем Gld 1D4, а с другой, отрицательный вклад в показатель был сопряжен с аллелями Gld 1А17, Gld 1ВЗ, Gld 1D1, Gld 1D5. Параметр числа межмолекулярных дисульфидных связей, как один из основных факторов поддержания структуры белка, был сопряжен с аллелем Gld 1ВЗ отрицательной связью (t = 3,90; п = 73,5; р > 0,999). В тоже время положительный вклад был ассоциирован с аллелями Gld 1А4, Gld 1В1 и Gld 1D4, которые чаще встречаются в генотипе сильной пшеницы.

Отрицательное действие на индекс деформации клейковины было связано с аллелями Gld 1В1 и Gld 1ВЗ. Количественные параметры сырой и сухой клейковины были положительно сопряжены с аллелем Gld 1D4, в отличие от альтернативных аллелей Gld 1D1 и Gld 1D5

Аллельное состояние глиадинкодирующих локусов некоторых генотипов мягкой пшеницы. Многолетние исследования показали, что лидирующие позиции по урожайности на опытных участках области занимали сорта с типом спектра Gld 1А2, 1В1, IDS, 6АЗ, 6В1, 6D1 (тип Везелка) и Gld 1А17, 1В4, 1D5, 6АЗ, 6В1, 6D1 (тип Богданка), что свидетельствовало о хорошем потенциале адаптивности к изменчивым погодным условиям региона. Низкие показатели урожайности в 2012 году показали стандарты (Белгородская 12 и Одесская 267) с типами спектра, соответственно, Gld 1А2, 1В1, 1D1, 6АЗ, 6В2, 6D1 и Gld 1А4, 1В1, 1D5, 6АЗ, 6В2, 6D2, а в 2013 году - безостые сорта мягкой пшеницы со следующими типами спектрами Gld 1А9, IBS, 1D1, 6АЗ, 6В2, 6D1; Gld 1A3, 1B1, 1D4, 6A3, 6B2, 6D2 и Gld 1A2, 1B1, IDO, 6A3, 6B2, 6D2.

Отличительная особенность генотипа Gld IA4, 1ВЗ, 1D5, 6АЗ, 6В1, 6D2 (Синтетик) заключалась в способности демонстрировать низкие значения показателя интермолекулярных дисульфидных связей даже i в годы, способствующие интенсивной агрегации белковых молекул. Представленный анализ глиадинкодирующих аллелей позволил оценить внутривидовой полиморфизм сортов пшеницы белгородской селекции, а также выявить наиболее продуктивные генотипы.

3. Средовая и наследственная изменчивость в контроле качества пшеницы

Влияние метеорологических факторов года и генотипа в формировании качества зерна мягкой пшеницы. Значительная дифференциация данных между образцами по количеству дисульфидных связей наблюдалась в 2013 году, когда условия вегетационного периода были близки к климатической норме для Белгородской области. Высоким уровнем агрегации белков выделились сорта Селянка одесская, Уни 1, Ариадна и Безенчукская 380. Сорта с ржаными транс локациями в геноме, наоборот, демонстрировали низкий уровень полимеризации белков, что подтвердилось данными Миксолаба - низкий индекс Замес характеризовал слабую устойчивость белкового комплекса. Анализ доли влияния факторов показал, что в параметры белкового комплекса (индексы Водопоглощение, Замес и Глютен) больший вклад вносили генетические особенности изучаемых сортов, а параметры углеводного комплекса определялись факторами среды.

Дефицит влаги и повышенные температуры 2010, 2011, 2012 годов исследования способствовали активной агрегации белковых молекул за счет межмолекулярных дисульфидных связей, вследствие чего различия между образцами в большей степени нивелировались. В целом дифференциация данных по числу -S-S- связей в 2011 и 2012 годах была выше, по сравнению с 2010 годом, но ниже чем в 2013 году. Это не помешало выделению образцов с наследственно

высоким уровнем агрегации белка. Наиболее эффективно вести отбор генотипов на качество зерна в годы с большей дифференциацией данных как по признаку числа дисульфидных связей, так и структурно-механическим свойствам теста, т.е в годы близкие к климатической норме для региона.

Роль показателя числа межмолекулярных дисульфидных связей белкового комплекса зерна при оценке хлебопекарных свойств. Провели анализ реологических свойств пшеницы на приборе Миксолаб генотипов пшеницы 2012 года, имеющих различный уровень агрегации белков. Выделили группы сортов с высоким (№ 1) й низким (№ 2) числом межмолекулярных -Б-8-связей (табл. 4).

Таблица 4

Реологические свойства теста образцов пшеницы в зависимости от числа межмолекулярных дисульфидных связей в 2012 г. [Рыжкова Т.А. и др., 2012]

Группа п Среднее число дисульф. связей, у.е Среднее значение индексов, балл

ВПС Замес Глютен+ Вязкость Амилаза Ретрог-радация

№1 6 4,93 4,50 2,83 3,33 1,00 4,00 1,67

№2 6 7,65 6,00 4,17 3,00 2,00 4,33 2,50

t 17,88*** 1,14 4,38*** 0,59 0,97 1,58 0,45

*** — достоверно при р>0,999.

Установлено, что образцы с высоким показателем числа межмолекулярных -S-S- связей и, соответственно, высоким уровнем полимеризации пептидов отличались достоверно более высокими показателями замешивающей способности - 4,17 против 2,83 баллов (табл. 4, р > 0,95; п = 12), в сравнении с сортами с низким показателем количества дисульфидных связей. Сопряженность параметров агрегации полипептидов и индекса Замес подтвердилась, в том числе и корреляционным анализом (п = 34; г = 0,52 ± 0,12; р > 0,99). Была также выявлена достоверная отрицательная связь показателя числа -S-S- связей и показателей индекса деформации клейковины (п = 34; г = - 0,53 ± 0,12; р > 0,99), что свидетельствовало о том, что условия, способствующие активной агрегации белковых молекул с помощью дисульфидных связей, способствуют и большему укреплению клейковины.

По показателям углеводного комплекса достоверных отличий между выделенными группами . выявлено не было. Низкие значения показателей Вязкости, Амилазы и Ретроградации в 2012 году можно объяснить наличием проросшего зерна.

Изменепие качества мягкой пшеницы под влиянием повреждения клопом вредная черепашка (Eurygaster integriceps Put.). Модифицированный метод отмывки клейковины позволил снизить влияние средовой изменчивости, проявляющейся в виде повреждения зерна клопом вредная черепашка (табл. 5).

Кислые условия при замачивании шрота способствовали существенному укреплению клейковины — в группе сортов без повреждения клопом деформация клейковины уменьшилась на 19 у.е., а при 3%-ом повреждении - на 11 у.е. Различия между средними значениями ИДК; стандартного и модифицированного методов отмывки клейковины в обеих группах превышало наименьшую существенную разницу, что подтверждало достоверность полученных данных. Значения ИДК в обеих исследованных группах определялись более чем на 55% выбором метода анализа клейковины.

Таблица 5

Влияние метода отмывки клейковины на показатель ИДК пшеницы при различном уровне поражения клопом вредная черепашка (2012 г., п=5)

Степень повреждения Без повреждения клопом 3% повреждения клопом

Метод станд. метод модиф. метод станд метод модиф. метод

Среднее 89,0 70,0 91,0 80,0

НСР0,95 9,9* 7,9*

Доля влияния фактора, %

метод 56,8 59,3

генотип 33,5 26,9

случ. отклон. 9,7 13,8

* — достоверно при р>0,95

Различия по количеству сырой и сухой клейковины в зависимости от используемого метода были менее значимыми и находились в пределах ошибки опыта.

Изучили реологические свойства теста из полностью поврежденного клопом и здорового зерна двух сортов - Корочанка (урожая 2011 года) и Коротышка (урожая 2010 года) на приборе Миксолаб (рис. 6).

Деструкция белкового комплекса зерновки под действием протеиназ клопа сопровождалась изменением реологических свойств, в частности, уменьшался показатель замешивающей способности. На миксограмме это проявилось в виде «сужения» пика в первую фазу анализа для шрота из поврежденного зерна, в отличие от более широкого пика для здорового зерна.

Как в 2010, так и в 2011 годах было отмечено увеличение значения индекса Глютен, который характеризовал число водородных связей между пептидами. Следовательно, разрушение пептидных связей под действием ферментов насекомого компенсировалось увеличением числа слабых водородных связей белкового комплекса, что не улучшало физических свойств теста.

Рис. 6. Миксограммы и профайлеры качества сортов в зависимости от степени поврежденное™ зерна клопом вредная черепашка А) Коротышка, Б) Корочанка

сорт Корочанка

Разрушение амилозных цепочек крахмала под действием амилазы клопа вызвало критическое снижение консистенции теста и, как следствие, падение индекса Вязкости до нуля и уменьшение эффекта кристаллизации крахмала.

В 2010 году действия ферментативной системы клопа в поврежденном зерне проявилось в снижении индекса Амилаза и увеличении амилолитической активности зерна, что в 2011 году замечено не было. Возможно, это объяснялось тем, что в 2011 году в процессе созревания на качество зерна влияли факторы -наличие вредителя и высокая влажность во время налива зерна, что вызвало его «стекание». Отобрав только здоровое зерно, был снят фактор влияния клопа, но явление стекания зерна осталось, что и отразилось на степени амилолитической активности.

Изменение качества мягкой пшеницы под влиянием преждевременного прорастания зерна на корню. В 2012 году в связи с присутствием проросшего зерна удалось разделить генотипы пшеницы по устойчивости к этому фактору. Остистые сорта были в значительно большей степени подвержены прорастанию, чем безостые генотипы, что подтвердилось статистически (п = 34; г = 3,81; р > 0,999 табл. 6). О связи морфологии колоса с устойчивостью к прорастанию было отмечено в более ранних работах [Крупнов В.А. и др., 2010].

Белковый комплекс зерна при прорастании остался практически неизменным, о чем свидетельствовало стабильное значение индекса Замес, как для остистых, так и безостых генотипов в 2012 году. Было установлено, что индекс Глютен характеризовался более высокими значениями среди устойчивой к прорастанию (безостой) пшеницы (п = 34; I = 3,34; р > 0,99).

Таблица 6

Структурно-механические показатели теста генотипов пшеницы в зависимости от степени прорастания зерна (2012 г., п=34)

Тип колоса п % прорастания впс Замес Глютен+ Вязкость Амилаза Ретроградация

Остистый 24 10,3 5,9 3,8 2,5 1,0 4,1 1,4

Безостый 10 1,0 7,1 3,8 3,9 4,2 4,2 4,4

t критерий 3,81*** 1,78 0,12 3,34** 4,06*** 0,44 4,22***

*** - достоверно при р>0,999.

Следует отметить, что наиболее уязвимым под действием прорастания оказался углеводный комплекс зерна, что проявилось в значительном изменении параметров вязкости теста и ретроградационной активности крахмала зерна. Так консистенция теста остистых (т.е. подвергшихся преждевременному прорастанию) генотипов была достоверно более низкой по сравнению с безостыми (табл. 6). Представленная в литературе информация о том, что снижение вязкости теста из проросшего зерна связано с нарушением соотношения амилоза/амилопектин в процессе прорастания, как следствие ферментативного распада крахмала [Беркутова

H.С., Швецова И.А., 1984; Крупное В.А. и др., 2010; Васильчук Н.С. и др., 2010], объясняет полученные нами данные. Аналогичная ситуация наблюдалась и для индекса Ретроградация, однако, принято считать, что низкое значение индекса свидетельствует о более медленной кристаллизации крахмала. Сопряженность показателей углеводного комплекса и степени прорастания зерна была оценена корреляционным анализом и составила между степенью прорастания и индексом Вязкость г = - 0,48 ± 0,13 (р > 0,99; п = 34) и с индексом Ретроградация г = - 0,43 ± 0,14 (р > 0,95; п = 34).

ВЫВОДЫ

I. На основе получаемых соотношений фенотипических классов пыльцевых зерен при окраске йодом с растений F, можно судить о числе доминантных генов IVx рекуррентного родителя, если другой родитель являлся полной рецессивной гомозиготой по всем этим генам.

2. В гетерозиготных по Wx/wx генам формах пшеницы достаточно наличия одного доминантного гена IVx для восстановления амилозного типа синтеза крахмала. Только полная рецессивная гомозигота по всем wx генам имеет амилопектиновый тип крахмала и проявляет уникальные реологические свойства.

3. Идентификация гомозиготных waxy генотипов пшеницы по реологическим свойствам эффективна в годы, когда в период созревания зерна складываются сухие условия и значительно затруднена в годы с переувлажнением в это время.

В последнем случае формы нормальной пшеницы могут иметь структурно-механические свойства теста близкие к waxy генотипам, что затрудняет оценку. Для решения проблемы целесообразно использовать реакцию на йод.

4. Выявлен значительный множественный аллелизм глиадинкодирующего локуса Gld 1А. Доминирующими аллелями 1 группы сцепления являются 1А4 и 1А2, 1В1, 1D1 и 1D5. Частоты распределения в образцах озимой мягкой пшеницы белгородской селекции (Белгородский НИИСХ) индикаторных аллелей пшенично-ржаных транслокаций Gld 1А17 и Gld 1ВЗ составляют 11,7 ± 2,60% и 9,5 ± 2,18% соответственно. Снижение показателей SDS-седиментации, показателей клейковины связано с факторами Gld 1А17 и Gld 1ВЗ, а аллели Gld 1А4, Gld 1В1 и Gld 1D4, наоборот, приводят к положительному эффекту.

5. Выявлена сопряженность между количеством дисульфидных связей белкового комплекса и реологическими свойствами теста. Чем выше показатель агрегации белков, тем лучше замешивающая способность теста и стабильность белкового комплекса (г = 0,52; р > 0,99; п = 34).

6. В условиях, способствующих прорастанию зерна на корню, безостые генотипы пшеницы проявляют большую устойчивость к прорастанию по сравнению с остистыми формами (t = 3,81; р > 0,999; п = 34), сохраняя при этом отличные вязко-эластичные свойства теста и ретрограционную активность крахмала (t = 4,06 и t = 4,22 соответственно, р > 0,999 ; п = 34). При повреждении зерна клопом вредная черепашка изменению подвергаются показатели белкового и углеводного комплекса эндосперма зерна. При этом снижается сила и устойчивость теста во время замешивания, консистенция теста и феномен кристаллизации крахмала

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В годы с влажным периодом во время созревания зерна озимой мягкой пшеницы, способствующим присутствию проросших (наклюнувшихся) зерен, идентификация и отбор генотипов waxy пшеницы по реологическим свойствам малоэффективны.

2. Значительная дифференциация между образцами по количеству межмолекулярных дисульфидных связей и структурно-механическим свойствам теста наблюдается, когда условия вегетационного периода близки к климатической норме для Белгородской области.

3. Отбор генотипов пшеницы на качество белкового комплекса не следует вести в годы, характеризующиеся повышенной температурой и сухой погодой в период формирования и созревания зерна, что приводит нивелированию генотипических различий.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Нецветаев, В.П. Улучшение физических свойств клейковины путем добавления зернобобового компонента в шрот мягкой пшеницы [Текст] / В.П. Нецветаев, Ю.Н. Куркина, Т.А. Рыжкова // Научные ведомости Белгородского государственного университета. - Серия: Естественные науки. - 2010. - № 3(74). Выпуск 10.-С. 19-22.

2. Нецветаев, В.П. Изменение качества клейковины при добавлении зернобобовых в шрот мягкой пшеницы [Текст] / В.П. Нецветаев, Ю.Н. Куркина, Т.А. Рыжкова // Управление продукционным процессом в агротехнологиях 21 века: материалы междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 35-летию образования Белгородского НИИСХ, Белгород, 15-16 июля 2010 г. / Рос. акад. сельхоз. наук, ГНУ Белгородский НИИСХ - Белгород: «Отчий край», 2010. - С. 262-267.

3. Нецветаев, В.П. Использование прибора Миксолаб при исследовании муки высшего сорта [Текст] / В.П. Нецветаев, М.Ю. Третьяков, Т.А. Рыжкова // Судебная экспертиза. - 2011. -№ 1. - С. 91-99.

4. Рыжкова, Т.А. Влияние равномерности подачи воды на реологические показатели пшеничной муки [Текст] / Т.А. Рыжкова, М.Ю. Третьяков, В.П. Нецветаев // Достижения науки и техники АПК. - 2011.- №4. - С. 25-27.

5. Третьяков, М.Ю. Оценка качества муки общего назначения [Текст] / М.Ю. Третьяков, Т.А. Рыжкова, В.П. Нецветаев // Хранение и переработка сельскохозяйственного сырья. - 2011. - № 7. - С. 52-55.

6. Влияние добавок муки некоторых бобовых на биологическую ценность и структурно-механические свойства теста из пшеничной муки [Текст] / Т.А. Рыжкова, А.Н. Чулков, М.Ю. Третьяков [и др.] // Хлебопечение России. -2012.-№2.-С. 4-6.

7. Третьяков, М.Ю. Изменение качества пшеничной муки различного целевого использования в процессе хранения [Текст] / М.Ю. Третьяков, Т.А. Рыжкова // Хранение и переработка сельскохозяйственного сырья. - 2012. -№ 3. - С. 27-30.

8. Влияние генов wx на хлебопекарные качества мягкой пшеницы [Текст] / Т.А. Рыжкова, М.Ю. Третьяков, И.П. Моторина [и др.] // Достижения науки и техники АПК. - 2012. - № 4. - С. 21-23.

9. Оценка качества сортообразцов мягкой озимой пшеницы [Текст] / И.П. Моторина, Т.А. Рыжкова, О.В. Акиншина [и др.] // Биологизация адаптивно-ландшафтной системы земледелия — основа повышения плодородия почвы, роста продуктивности сельскохозяйственных культур и сохранения окружающей среды: материалы Всерос. науч.-практ. конф., Белгород, 12-13 июля 2012 г. : [в 2 т.] / Рос. акад. сельхоз. наук; Белгородский НИИСХ - Белгород: «Отчий край», 2012. - Т. 2. - С. 319-322.

10. Рыжкова, Т.А. Реологические и ферментативные свойства муки мягкой пшеницы в зависимости от доли генов wx [Текст] / Т.А. Рыжкова, В.П. Нецветаев // Селекция и генетика сельскохозяйственных растений: традиции и перспективы (к 100-летию Селекционно-генетического института - Национального центра семеноводства и сортоизучения): тезисы междунар. науч. конф., Украина, Одесса, 17-19 октября 2012 г. / СГИ - Одесса, 2012. - С. 352-353.

11. Гены wx и реологические свойства шрота мягкой пшеницы [Текст] / Т.А. Рыжкова, М.Ю. Третьяков, В.П. Нецветаев [и др.] // Научные ведомости Белгородского государственного университета. - Серия: Естественные науки. -2012. - № 15 (134). Выпуск 20. - С. 46-50.

12. Нецветаев, В.П. Выявление зависимости хлебопекарного качества зерна мягкой пшеницы от воздействия клопа вредная черепашка [Электронный ресурс] / В.П. Нецветаев, Т.А. Рыжкова, Е.А. Болховитина // Современные проблемы науки и .образования. - 2012. - № 6. - Режим доступа: www.science-education.ru/106-7346.

13. Новый подход к оценке качества зерна мягкой пшеницы [Текст] / В.П. Нецветаев, JI.C. Бондаренко, Т.А. Рыжкова [и др.] // Достижения науки и техники АПК. - 2012. - № 9. - С. 24-26.

14. Третьяков, М.Ю. Отличие блинных смесей от пшеничной муки [Текст] / М.Ю. Третьяков, Т.А. Рыжкова, В.П. Нецветаев // Хлебопечение России. - 2012. -№6.-С. 22-23.

15. Оценка сортообразцов белгородской селекции [Текст] / И.П. Моторина, Т.А. Рыжкова, О.В. Акиншина [и др.] // Проблемы и перспективы аграрной науки в России (посвящ. 135-летию со дня рожд. А.И. Стебута): сборник докладов Всерос. науч.-практ. конф. молод, учен, и спец., Саратов, 14-16 марта 2012 г. / Рос. акад. сельхоз. наук, ГНУ НИИСХ Юго-Востока. - Саратов, 2012. - С. 61-65.

16. Роль показателя числа дисульфидных связей белкового комплекса в контроле качества зерна пшеницы [Текст] / Т.А. Рыжкова, Л.С. Бондаренко, О.В. Акиншина [и др.] // «Impactul relizärilor §tiin{ifice asupra productiei §i calitätii cerealelor spicoase»: materialele conferintei internationale, Rep. Moldova, Bälti, 21 iun. 2013 / col. red.; Vozian Valeriu. - Chi§inäu : S.n., 2013. - P. 177-182.

17. Нецветаев, В.П. Варианты глиадина и количество дисульфидных связей в белковом комплексе мягкой пшеницы [Электронный ресурс] / В.П. Нецветаев, М.М. Копусь, Т.А. Рыжкова // Современные проблемы науки и образования. -2013. -№ 5. - Режим доступа: http://www.science-education.ru/lll-10351.

18. Рыжкова, Т.А. Роль углеводного комплекса в формировании хлебопекарных свойств мягкой пшеницы [Текст] / Т.А. Рыжкова, М.Ю.Третьяков, В.П. Нецветаев // Белгородский агромир. - 2013. - № 3 (77). - С. 42-45.

Подписано в печать 17.12.2014. Формат 60x84/16 Гарнитура Times. Усл. п. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 330. Оригинал-макет подготовлен и тиражирован в ИД «Белгород» НИУ «БелГУ». 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85