Роль эндогенных и микробных протеаз в процессе получения и сбраживания ржаного сусла

Дячкина, Алла Борисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль эндогенных и микробных протеаз в процессе получения и сбраживания ржаного сусла
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль эндогенных и микробных протеаз в процессе получения и сбраживания ржаного сусла"

На правах рукописи

Дячкина Алла Борисовна

Роль эндогенных и микробных протеаз в процессе получения и сбраживания ржаного сусла

Специальность 03.00.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва - 2005

Работа выполнена на кафедре «Биохимия и зерноведеиие» ГОУ ВТЮ «Московский Государственный Университет Пищевых Производства

Научный руководитель:

доктор технических наук, профессор Карпиленко Геннадий Петрович

Официальные оппоненты:

доктор технических наук, профессор Иванова Людмила Афанасьевна доктор биологических наук, профессор Голенков Виктор Федорович

Ведущая организация: Московский государственный университет

технологий и управления

Защита состоится «XX » ^¿ЦйО^У 2005 г. в ¿Г часов, ауд.

ЗОЛ

корпус А

на заседании диссертационного Совета К 212.148.01 при ГОУ ВПО «Московский Государственный Университет Пищевых Производств», 125080, Москва, Волоколамское шоссе, 11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО МГУПП Министерства образования РФ

Автореферат разослан « 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совега к.б.н., доцент

НА-

»006-Н 1ШШ

!■ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы. Перед спиртовой отраслью стоят непростые задачи по совершенствованию производства - сокращению теплоэнергетических затрат, более эффективному использованию сьфья',' увеличению выхода и повышению качества готовой продукции. Для их решения предлагаются различные схемы переработки зерна, в основу кoт6>p¿Ix положены низкотемпературные режимы воздействия на' крахмалёоДёрЖаЦбе сырье с использованием ферментных препаратов, основными из которых являются препараты амилолитического спектра действия.

Вместе с тем, в последнее время заметно возрос интерес к исследованиям, посвященным ферментным препаратам, гидролизующим другие биополимеры зерна (некрахмальные полисахариды Vбелки). Белкам и продуктам протеолиза в спиртовом производстве отводится осббая роль, поскольку они выполняют множество разнообразных функций и 'оказывают

'I ч

существенное влияние, как на протекание технологического процесса, так и на выход и качество готового продукта. '""

Среди микробных протеаз отечественного и зарубежного производства лишь некоторые достаточно хорошо изучены с позиции состава, входящих в препарат отдельных ферментов ,и их действия на стандартный субстрат. Однако, имеющихся сведений по применению микробных препаратов протеолитического действия недостаточно, чтобы с научной точки зрения прогнозировать эффективность их использования в контексте - сырье, режим получения сусла, специфика метаболизма определенных рас дрожжей.

Рожь, наряду с пшеницей, явл^етря основным сырьем, перерабатываемым на этиловый спирт Она из-за проблем получения вязких технологических сред относится к трудноперерабатываемому сырью. Вместе с тем, рожь имеет, по сравнению с пшеницей, такие особенности биохимического состава, в частности активные собственные амилазы и протеазы, которые можно рассматривать как позитивные.

Однако, существующие технологические режимы механико-ферментативных схем переработки сырья в должной степени не йспользуют данный факт. Также необходимо учитывать, что при переводе процесса на низкотемпературные режимы часто возникает проблема пенообразования при сбраживании сусла. Причина данного явления до конца не выявлена, что ограничивает применение технически^ приемов к ее устранению.

Все выше изложенное свидетельствует о том, что исследования

посвященные разработке научно-г^рактинеских осцов технологии производства

этанола из зерна ржи, базирующиеся на изучении белкового комплекса сырья и

изменений, происходящих в нем под действивд^ и

БИБЛИОТЕКА ' С. Пет. •Э

используемых ферментных препаратов микробного происхождения, являются, несомненно, актуальными и перспективными.

1.2. Цель и задачи исследования. Целью данной работы является исследование процессов деструкции белков зерна ржи под действием эндогенных и микробных протеаз и установление их роли в процессе получения и сбраживания ржаного сусла.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

- охарактеризовать белково-протеиназный комплекс фуражного зерна ржи, используемого в технологии этанола;

- изучить действие ферментных препаратов протеаз бактериального и грибного происхождения на стандартном и зерновом субстрате;

- разработать общую процессуальную схему получения осахаренного сусла, с применением микробных ферментных препаратов протеаз;

- изучить фракционный состав белков осахаренного сусла методом гель-хроматографии;

- исследовать влияние микробных ферментных препаратов на показатели качества ржаного сусла;

- исследовать стадию сбраживания ржаного сусла, полученного с использованием препаратов микробных протеаз.

1.3. Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование белкового комплекса сырья спиртового производства и выявлена роль эндогенных и микробных протеаз в технологии этанола из зерна ржи.

Изучены особенности действия ферментных препаратов протеаз бактериального и грибного происхождения на белки зернового сырья.

С помощью метода гель-хроматографии изучен фракционный состав продуктов протеолиза белков осахаренного сусла Выявлена связь избыточного пенообразования на стадии сбраживания ржаного сусла и продуктов протеолиза белков сусла под действием эндогенных протеаз.

Показано, что вид ферментного препарата, стадия его внесения и параметры осахаривания оказывают значительное влияние на показатели качества ржаного сусла.

Установлено влияние исследуемых ферментных препаратов протеолитического действия, расы спиртовых дрожжей и температуры сбраживания на интенсивность процесса брожения.

Выявлена связь определенных групп азотсодержащих соединений сусла с выходом этилового спирта и содержанием летучих примесей.

1.4. Практическая значимость работы. Данные, полученные в ходе .проведения экспериментов, позволят рационально использовать сырье и

микробные ферментные препараты протеолитического действия в технологии

этанола Предложенные технологические режимы позволят снизить пенообразование и за счет этого уменьшить потери сбраживаемых углеводов.

Рекомендуемые режимы и стадии внесения микробных ферментных препаратов протеаз бактериального и грибного происхождения позволят интенсифицировать процесс и увеличить выход спирта при одновременном снижении вредных летучих примесей.

1.5. Апробация работы. Материалы работы были доложены на Второй Международной конференции «Зерновая индустрия XXI век» (Москва, 2004); на научно-практическом семинаре «Пути повышения качества и увеличения выхода ректификованного спирта с применением ферментных препаратов» (Москва, 2004) и на Всероссийской научно-практической конференции «Перспективы развития пищевой промышленности в России» (Оренбург, 2005).

1.6. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

1.7. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов и библиографии.

Работа изложена на 150 страницах основного текста, содержит 24 таблицы и 42 рисунка. Список литературы включает 184 источника.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы обобщены литературные данные об особенностях биохимического состава зерна ржи, как сырья Для производства этанола; приведены сведения о ферментных препарата* и режимах Механико-ферментативной обработки сырья; проанализированы современные подходы к оптимизации процесса сбраживания сусла; рассмотрены биохимические механизмы образования примесей при брожении.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Материалы и методы исследования

В работе использовали фуражное зерно ржи и ферментные препараты:

амилолитического действия:

Термам ил - термоустойчивая бактериальная а-амилаза (Novo Nordisk);

Коверзим - глюкоамилаза (Ende Industries);

протеолитического действия: 1 '" -

Нейтраза - бактериальная металлопроТеиназа (Zn), продуцируемая Bacillus amyloliquefaciens (Novozymes);

Алкалаза FG- бактериальная протеиназа, продуцируемая Bacillus licheniformis (Novozymes);

Дистицим Протацид Экстра - грибная протеаза, продуцируемая Aspergillus niger (Duhler);

Протеаза GC-106 - грибная протеаза, продуцируемая Aspergillus oryzae (Genencor);

Спиртовые дрожжи: S cerevisiae - чистая культура, раса XII, сухие дрожжи «Angel» (Китай) и «Фермиол» (США).

Основные физические и химические показатели качества зерна ржи определяли в соответствии с ГОСТами. Содержание водорастворимого белка определяли по методу Лоури; аминный азот - методом формольного титрования. Активность протеаз определяли модифицированным методом Ансона по начальной скорости реакции.

Гель-хроматографию осуществляли с использованием сефадексов G-75, 100 и TSK-gel Toyoperl HW-55F; ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе DE-32; изоэлектрическое фокусирование проводили на колонке 110 мл (LKB, Швеция) в диапазоне рН 3 - 10.

Аминокислотный состав продуктов протеолиза определяли на аминокислотном анализаторе «Мультихром "Hitachi - 850"» (Япония).

Бродильную активность дрожжей определяли весовым методом, содержание растворимых сухих веществ, кислотность и рН сусла -общепринятыми в спиртовой промышленности методами.

Определение концентрации спирта и действительного экстракта в зрелой бражке осуществляли дистилляционным методом. Определение побочных продуктов брожения проводили методом газовой хроматографии согласно ГОСТ 30536-97, с использованием газового хроматографа HP- FFAP (США).

3.2. Характеристика белково-протеиназного комплекса зерна ржи

Изучение количественного соотношения и свойств различных фракций белков зерна и эндогенных протеаз представляет как теоретический, так и практический интерес для технологий, использующих зерно в качестве основного сырья, в частности при производстве этанола. В технологии этанола до настоящего времени вопросам, связанным с белково-протеиназным комплексом сырья, уделялось недостаточное внимание.

В исследуемом образце зерна ржи обнаружены активные кислые протеазы с оптимумом действия при рН 3,5 и нейтральные протеазы с оптимумом рН 6,5 при гидролизе бычьего сывороточного альбумина, причем активность нейтральных протеаз, извлекаемых 0,35% Na2C03, в 1,5 раз выше по сравнению с активностью протеаз, извлекаемых водой. Температурный оптимум для кислых протеаз составляет 60-65°С, а нейтральных - 50°С, но при 60°С они сохраняют большую часть своей активности (85,7%). Для обоснования изменений в белковом комплексе сырья в процессе производства

сусла, нейтральные протеазы зерна ржи были выделены и очищены с использованием схемы, предложенной М.П. Поповым и А.Ж Тер-Мовсесян (1981), которая включала следующие этапы: экстракциию 0,35% раствором Ыа2С03; осаждение подкислением лимонной кислотой, гель-хроматографию на сефадексе в-100; ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе ОЕ-32; изоэлектрическое фокусирование в диапазоне рН 3 - 10. В результате был получен препарат нейтральной протеазы со степенью очистки 500 раз, характеристика которого представлена в табл. 1.

Таблица I

Характеристика нейтральной протеазы ржи

Показатель Препарат, очищенный в 500 рат

Оптимум рН 6,5

Влияние цистеина, 2,0 мг/мл Активирует на 95%

Влияние п-ХМБ, 0,5 мг/мл Ингибирует на 100%

Влияние ДГ1ФФ. 0.54мМ Не ингибирует

Влияние ингибитора Кунитца из сои. 0.8мг/мл Не ингибирует

Влияние ЭДТА, от 2,0 до 8.0 мМ Не влияет

Иэоэлектрическая точка 8.1

Таким образом, нейтральная протеаза зерна ржи может быть классифицирована как тиоловая протеиназа. Показана способность нейтральной протеазы расщеплять собственные белки.

3.3. Характеристика микробных ферментных препаратов протеолитического действия

В последние юды возрос интерес к применению протеолитических ферментных препаратов в спиртовом производстве. Их использование обеспечивает дрожжевые клетки легко ассимилируемым азотом, необходимым особенно на первом этапе брожения, когда скорость процесса лимитируется количеством дрожжей и их продуктивностью. В последнее время наряду с отечественными ферментными препаратами протеолитического действия все чаще в производстве применяют препараты зарубежных компаний. Однако предоставляемых сведений недостаточно для рационального использования этих ферментных препаратов в технологии этанола

При традиционной характеристике ферментных препаратов, выявление оптимума температуры и рН, проводится с использованием стандартного субстрата. Вместе с тем, в промышленных условиях в качестве последнего, выступает сложная ге1ерогенная система, что приводит к изменению основных кинетических параметров ферментативной реакции В технологии этанола - это сложная многокомпонентная система, представляющая собой смесь зернового

помола и воды. Состав данного субстрата может оказывать влияние на характер протекания процесса протеолиза и изменить оптимальные значения температуры и рН.

Так, при изучении влияния рН на активность препаратов бактериального происхождения установлено, что оптимум рН при гидролизе белков зернового субстрата для препаратов «Нейтраза» и «Алкалаза» сдвигается в кислую область рН относительно стандартного субстрата и составляет 6,0 - 5,5 и 6,5 -6,0 соответственно, причем при рН 5,0 препарат «Нейтраза» сохраняет только около 45% максимальной актиности, в то время как «Алкалаза» - 70%

Аналогичные исследования влияния рН на активность ферментных препаратов грибного происхождения выявили, что препарат «Дистицим» проявляет активность в кислой зоне рН. причем на стандартном субстрате оптимум рН 3,0; на зерновом субстрате - 3,5. Препарат «Протеаза» проявляет максимальную активность при гидролизе стандартного субстрата при рН 5,0; а при гидролизе зернового субстрата при рН 5,5 6,0.

Температурный оптимум для препарата «Нейтраза» при действии на стандартный субстрат составляет 40°С и сдвигается в область более высоких температур при действии на зерновой субстрат, причем в этом случае при 60°С сохраняется 90% максимальной активности, а при 70°С - 45%. Температурный оптимум для препарата «Алкалаза» при гидролизе стандартного субстрата составляет 60°С, при 70°С активность снижается на 70% При протеолизе белков зернЬвого сырья температурный оптимум для «Алкалазы» смещается в сторону более низких температур (40°С) Температурный оптимум для препарата «Дистицим» при действии на оба субстрата составляет 60°С, а препарата «Протеаза» - 50°С. Препарат «Дистицим» сохраняет большую часть своей активности при повышении температуры также при действии на оба субстрата (90% при 70°С и 80% при 80°С). Активность препарата «Протеаза» при 70°С снижается до 20% и 30% для стандартного и зернового субстрата.

3.4. Фракционирование белков осахаренного сусла методом гель-

хроматографии

Для изучения процесса гидролиза белков ржи в ходе механико-ферментативной1 обработки сырья были поставлены эксперименты по получению сусла по вариантам (рис. 1) с получением 3-х образцов

Образец 1 (К1) - контроль - классическая схема переработки сырья в соответствии с Регламентом.

Образец 2 (К2) - контроль - схема переработки сырья по режимам механико-ферментативного способа переработки со следующими паузами: г = 45-50°С (30 мин); I = 60-62°С (3 часа); I = 95-98°С (30 мин); осахаривание при 56-5 8°€(1 час).

Образец 3 (К4) - контроль - схема переработки сырья по режимам Образеца 2 (К2) с дополнительным подкислением замеса до рН 5,0 - 5,1.

Данные по фракционированию продуктов протеолиза сусла представлены на рис. 2 и демонстрируют, что все анализируемые образцы характеризуются большим разнообразием белков с различной молекулярной массой, варьируемой от 700 до 1 кД. При этом можно выделить семь основных пиков. В табл. 2 представлены данные по определению молекулярной массы этих белков графическим методом с использованием калибровочной кривой.

Таблица 2

Молекулярная масса белков осахаренного сусла

Белки Объем элюата, мл Молекулярная масса, Да

1 пик 32-58 Больше 700000 (выход декстрана синего)

II пик 60-64 450000-350000

III пик 68-76 145000 - 90000

IV пик 88-92 35000

V пик 96- 100 10000 - 8200

VI пик 112-120 2000-1500

VII пик 132-152 Низкомолекулярные азотные соединения (выход тирозина)

Значительную часть анализируемых белков составляют агломераты белков с молекулярной массой 700 ч 350 кД, особенно их много в Образце 2.

Сравнительный анатаз белковых фракций с молекулярной массой от 145 до 1,5 кД показывает, что сусло типового варианта, полученное в соответствии с Регламентом (Образец 1) и варианта с подкислением среды на стадии получения разваренной массы (Образец 3) характеризуется в отличии от образца 2 (получение разваренной массы при рН 6,0 - 6,5 с удлиненной паузой до 4-х часов при температуре 60 - 62°С) практическим отсутствием фракций с молекулярной массой 145 ч 90 кД (III пик); 35 кД (IV пик); 2 ч 1,5 кД (VI пик) и значительным уменьшением белковой фракции с молекулярной массой 10 ч 8,2 кД (V пик). Фракции белков, выходящие при фракционировании с III, IV и V пиками относятся к высоко- и среднемолекулярным белкам, которые, по всей видимости, участвуют в пенообразовании (Кунце, 2001).

Кроме того, в предлагаемом варианте проведения механико-ферментативной обработки сырья (Образец 3) наблюдается значительное увеличение низкомолекулярных азотных соединений (VII пик - выход тирозина), что можно отнести к позитивным изменениям, так как они являются источником азотного питания для дрожжей.

Рис. I. Общая процессуальная схема получения сусла

• - о - Образец 1 К1 —*— Образец 2 К2 - ♦ - Образец 3 К4

2 3 4 5 6 7

I 10 11 12 13 14 15 16 1? 18 19 20 21 32 ¿3 24 25 26 27 28 29 ЭО 31 2 33 ¿4 35 36 37 38 Э9 40 41 42 43

Рис 2 Фракционирование белков осахаренного сусла , методом гель-хроматографии на колонке ТЭК- 2е1 ТоуореаН - 55 Р

Выявленные различия в накоплении белков разной молекулярной массы при исследуемых режимах переработки сырья можно объя^нит^. с одной стороны, действием высокоактивных нейтральных протеаз, действующих в нейтральной зоне рН 6,0 -6,5 и сохраняющих большую часть своей активности при температуре 60-62°С, что приводит к накоплению высоко- и среднемолекулярных фракций белков, ответственных за пенообразование.,

Подкисление среды до рН 5,0-5,2 снижает содержание белк.ов с молекулярной массой 35; 10 ч 8,2 и 2 ч 1,5 кД, так как действие нейтральных протеаз в этой области рН не проявляется.

3.5. Характеристика продуктов протеолиза белков осахаренного сусла, полученного с использованием микробных препаратов протеаз

Сусло получали с применением бактериальных протеаз («Нейтраза» и «Алкалаза») и грибных протеаз («Дистицим» и «Протеаза»),'согласно' приведенной схеме (рис.1). Профили элюции при фракционировании продуктов протеолиза белков сусла' при внесении препаратов бактериальных протеаз на стадии замеса на колонке с сефадекСом 0-75 представлены на рис. 3'.

Анализ распределения продуктов протеолиза белков сусла при внесении препаратов бактериальных протеаз на стадии замеса показывзет, что количество высокомолекулярных белков, выходящих свободным объемом колонки уменьшается пр сравнению с контрольным образцом, Кроме того,

происходит перераспределение количества белков во фракциях с молекулярной массой 40ч 10 кД.

А280

оаоо

f 4

0200 | 0100 1

О 1 2 3 4 5 в 7 в 9 10 11 12 13 14 15 'в 17 16 19 20 21 22 23 24 25 2в 27 38 29 30 31 32 33 34 35 Зв 37 38 39 40 41 42 43 44 45 4в 47 48 4« 50

О 100 '

—■—Контроль , - Неитраза Алкалаза Ne фракций

Рис.3. Фракционирование продуктов протеолиза белков сусла при внесении препаратов протеаз на стадии замеса

Содержание низкомолекулярных фракций, выходящих с общим объемом колонки значительно возрастает, причем в образце с использованием «Нейтразы» накопление низкомолекулярных фракций идет более интенсивно, чем в образце с использованием «Алкалазы».

Фракционирование продуктов протеолиза белков сусла при внесении препаратов бактериальных протеаз на стадии Осахаривания выявило снижение доли высокомолекулярных белков и увеличение количества низкомолекулярных соединений. Однако эти изменения не так значительны, как при действии исследуемых препаратов протеаз, вводимых на стадии замеса.

Анализ распределения продуктов протеолиза белков сусла при внесении грибных протеаз на стадии осахаривания показывает, что количество высокомолекулярных белков, выходящих со свободным объемом колонки, уменьшается по сравнению с контрольным образцом Кроме того, происходит перераспределение количества белков во фракциях с молекулярной массой 40ч 10 кД. ,Содержание низкомолекулярных фракций, выходящих с общим объемом колонки, значительно возрастает, причем в образце с использованием «Протеазы» их накопление идет более интенсивно, чем в образце с использованием «Дистицима».

Профили элюции продуктов протеолиза белков сусла всех вариантов с поАкислением существенно отличаются от аналогичных вариантов без подкисления (рис. 4). Так, в контрольном образце с подкислением фракция высокомолекулярных белков, выходящая со свободным объемом колонки

значительно уменьшается: с 39,47% до 11,04% от общего количества. Кроме того, четко выделяется фракция с молекулярной массой 60ч45 кД и возрастает доля среднемолекулярных белков Количество низкомолекулярных азотистых соединений практически одинаково

А280

0900 , 0 800 ( 0700 |

оеоо ок»:

0400 : 0300 ^ 02® ] 0100 1 ООСО |

Рис 4. Фракционирование продуктов протеолиза белков сусла при внесении грибных протеаз на стадии осахаривания (с подкислением)

Сравнительный анализ профилей элюции показывает, что внесение препаратов грибных протеаз не только изменяет соотношение различных фракций, но и во многом изменяет картину элюции. Так, сусло, полученное с применением препарата чПротеаза» характеризуется уменьшением фракции высокомолекулярных белков; резким снижением доли белков с молекулярной массой 45ч25 кД и снижением практически в 2 раза доли белков с молекулярной массой 20ч10 кД по сравнению с контрольным образцом. При этом накопление низкомолекулярных азотистых соединений, идет интенсивнее В то же время, сусло, полученное с применением препарата «Дистицим» характеризуется резким уменьшением доли высокомолекулярных белков, хотя характер элюции по сравнению с контролем сохраняется. Отличительной чертой сусла, полученное с применением данного препаратом является высокое содержание низкомолекулярных продуктов протеолиза, молекулярная масса которых не превышает 10ч 15 кД и низкомолекулярных азотистых соединений.

3.6. Влияние микробных ферментных препаратов протеаз на показатели качества ржаного сусла

Анализ данных, представленных в табл 3, показывает, что суммарное содержание растворимых сухих веществ повышается1 при использовании препаратов протеаз бактериального происхождения.

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50

Ю фракций

■— Контроль с подкислением

Протеаэа ОС

Дистицим

Таблица 3

Сравнительная характеристика показателей качества ржаного сусла, полученного с использованием бактериальных протеаз___

Вариант Ферментный препарат Стадия внесения ферментного препарата рН Титруемая кислотность, град С В, % Растворимый белок, мг/см3 Аминный азот. • мг/ см3

Контроль - - 7,0 1,26 16,[ 14.0 0,62

Опыт 1 Нейтраза на замес 6,9 0,25 16.7 28,0 1,11

Опыт 2 Алкал аза на замес 6.6 0.20 16.2 23.6 0.91

Опыт 3 Нейтраза на осахаривание 6,9 0,25 16,4 19,2 0.94

Опыт 4 Ал кал аза на осахаривание 6,5 0,19 16,4 17,0 0,87

Вероятнее всего это связано с увеличением содержания водорастворимого белка, а также с большей степенью растворения крахмала за счет его лучшего высвобождения из крахмальных зерен и, как следствие, лучшей атакуемости амилазами. Максимальный эффект выявлен в образце -опыт 1 (внесение препарата «Нейтраза» на стадии замеса), где содержание сухих веществ превышает контроль на 0,6%; содержание водорастворимых белков возрастает в 2 раза; аминный азот увеличивается на 80%

Аналогичные исследования были проведены с использованием препаратов протеаз грибного происхождения (табл. 4).

Таблица 4

Сравнительная характеристика показателей качеова ржаного сусла, ____полученного с использованием грибных протеаз __________

Вариант Условия осахаривания Ферментный препарат РН Титруемая кислотность, град СВ. % Растворимый белок, мг/см3 Аминный азот, мг/ см3

Контроль I без подкисления — 7,0 0,26 16,1 14,0 0,62

Контроль II с подкислением — 5,0 0,32 16.0 1 15,3 0,70

Опыт 1 без подкисления Протеаза 6,9 0,21 16,1 1 16,2 0,88

Опыт 2 с подкислением Протеаза 5.1 0,29 17.0 25,3 1.19

Опыт 3 без ' подкисления Дистицим 6,5 0.19 16,2 15,3 0,70

Опыт 4 с подкислением Дистицим 5,1 0,26 17,0 20,7 1,48

Максимальное значение отмечается для образцов, полученных с подкислением среды и использованием протеолитических ферментных препаратов [рибного происхождения. Вероятнее всего, это связано с увеличением содержания водорастворимого белка. Причем, установлена четкая зависимость влияния подкисления среды на этот показатель, поскольку действие грибных протеаз более эффективно в кислой зоне рН. Так, при использовании препарата «Протеаза» содержание растворимого белка составляет 25,3 мг/см\ а препарата «Дистицим» - 20,7 мг/см3. Эти различия в накоплении водорастворимого белка объясняются тем, что при рН 5,0 «Протеаза» сохраняет 80% активности, а «Дистицим» только 50%.

Однако данные по накоплению аминного азота имеют противоположный характер: его содержание при использовании препарата «Дистицим» составляет 1,48 мг/см3 против 1,19 мг/см3 при использовании препарата «Протеаза ОС -106» Это кажущееся противоречие вероятнее всего связано с различным характером действия отдельных протеаз, входящих в состав исследуемых ферментных препаратов, и с составом образующихся продуктов протеолиза.

3.6.1. Динамика изменения показателей качества ржаного сусла

С целью выявления различий в действии исследуемых ферментных препаратов протеолитического действия в процессе получения сусла и выбора наиболее эффективного препарата, а также стадии его внесения была исследована динамика накопления суммарных растворимых веществ, растворимого белка и аминного азота.

Установлено, что основная масса сухих веществ переходит в сусло при выдержке замеса в течение 3 часов при температурах 60-62°С. Максимальное количество сухих веществ обнаружено в варианте с применением «Нейтразы», внесенной на стадии замеса Так же, установлено, что проба (опыт 1 -применение «Нейтразы» на стадии замеса и выдержке при 45-50 С в течение 30 минут) содержит водорастворимого белка меньше, чем в пробе - опыт 2 с применением «Алкалазы». Это связано с ра$личной эффективностью действия исследуемых препаратов на белки зернового субстрата. При 45°С «Нейтраза» сохраняет примерно 80% активности, а «Алкалаза» свыше 90%.

Динамика изменения аминного азота (рис. 5) носит более сложный характер. Видно, что на первом этапе получения сусла (I = 45-5б°С; 30 минут) накапливается от 0,37 до 0.42 мг/см5 аминного азота, который, очевидно, представлен свободными аминокислотами, аминами и амидами всегда присутствующими в сырье, а также продуктами протеолиза белков эндогенными протеазами зерна ржи Использование ферментных препаратов увеличивает этот показатель на первом этапе получения сусла лишь незначительно. Основная часть аминного азота накапливается на второй стадии

производства сусла 0 - 60-62°С; 3 часа), причем применение «Нейтразы» существенно эффективнее, чем препарата «Алкалаза». Третья стадия производства сусла (I = 95-98°С; 30 минут) сопровождается снижением содержания аминного азота. Данный факт может быть объяснен, связыванием аминного азота в реакции меланоидинообразования. Причем можно предположить, что в реакцию с аминокислотами вступают как гексозы, так и пентозы, а содержание последних, в зерне ржи, как известно, существенно.

Рис. 5. Изменение содержания аминного азота по стадиям производства сусла ¿препараты прртеаз введены на стадии замеса)

3.6.2. Аминокислотный состав свободных аминокислот и пептидов

осахаренного ржаного сусла В настоящее время доказан факт того, что смесь аминокислот в определенных количествах и соотношениях более благоприятно действует на физиологическое состояние дрожжевой клетки, чем отдельная аминокислота, при этом повышается не только скорость потребления азота, но и скорость размножения дрожжевых клеток, а также синтез биомассы (Коновалов. 1980).

Для определения аминокислотного состава с помощью аминокислотного анализатора были выбраны опытные образцы сусла с лучшими качественными

показателями, и, в первую очередь, накоплением низкомолекулярных фракций азотсодержащих соединений следующих вариантов:

1 - Контроль - без внесения протеаз (Вариант 1):

2 - «Алкалаза» - внесена на стадии осахаривания (Вариант III);

3 - «Протеаза» - внесена на стадии осахаривания (Вариант IV).

Анализ данных аминокислотного состава исследованных проб сусла, с

точки зрения сбалансированности аминокислотного состава продуктов протеолиза белков сусла, являющихся источниками азотистого питания дрожжей, позволяет констатировать следующее:

- при осаждении белков сусла 3% раствором сульфасалициловой кислоты в растворе остаются свободные аминокислоты и пептиды. При этом в пробах сусла, полученного с применением препаратов протеаз общая сумма неосаждаемых азотистых соединений выше, чем в контрольной пробе. Так, в процентах к водорастворимому белку сусла, этот показатель составляет для контрольной пробы - 13,57%, а для проб сусла полученных с применением препаратов протеаз 33.88% («Алкалаза») и 28,97% («Дистицим»). Эти данные согласуются с данными по накоплению аминного азота и фракционному составу продуктов протеолиза, полученных методом гель-хроматографии, и свидетельствуют о глубоком протеолизе белков сусла под действием микробных протеаз, приводящем к образованию пептидов и аминокислот;

- для всех исследуемых образцов сусла отмечено высокое суммарное, содержание кислых аминокислот и их амидов, особенно, глутаминовой кислоты + глутамина, что в целом характерно для аминокислотного состава белков ржи,

в опытных образцах по сравнению с контролем снижается доля цистина (примерно в 3 раза) и тирозина (примерно в 1,5-3 раза), а аспарагиновой кислоты + аспарагина уменьшается примерно на 1%.

3.7. Исследование стадии сбраживания осахаренного ржаного сусла, полученного с применением препаратов микробных протеаз

Известно, что процесс сбраживания зернового сусла зависит от целого ряда факторов. К ним относятся- состав сусла, его концентрация, степень гидролиза крахмала сырья, количественный и качественный состав продуктов протеолиза белков; используемые расы спиртовых дрожжей; продолжительность сбраживания и температура проведения процесса.

3.7.1. Изучение динамики выделения диоксида углерода при сбраживании сусла

В работе изучали динамику выделения диоксида углерода при сбраживании сусла, полученного с использованием препаратов бактериальных

и грибных протеаз при разных вариантах их внесения с использованием трех рас дрожжей S. cereviviae: XII раса, сухие дрожжи "Angel" и "Фермиол".

На рис. 6 представлены данные показывающие, что применение «Нейтразы» и «Алкалазы» интенсифицирует процесс сбраживания. Особенно значительная разница в выделении С02 контрольного и опытных вариантов отмечена для 12-18 часового периода брожения. Также выявлена бульшая эффективность брожения при внесении препарата «Нейтраза» на стадии замеса (кривая В I1-H) и препарата «Алкалаза» на стадии осахаривания (кривая В III-А). Объяснением полученной зависимости являются данные по влиянию температуры и рН среды на действие исследуемых препаратов протеаз Так, «Нейтраза» при 30°С сохраняет около 40% от активности, проявляемой при оптимальной температуре 65°С. Препарат «Алкалаза» на стадии сбраживания работает эффективнее, чем препарат «Нейтраза», так как в отличии от него в более кислой среде сохраняет большую часть своей активности Кроме того, при 28-30°С активность препарата «Алкалаза» составляет свыше 60%.

Аналогичные эксперименты были проведены с использованием сухих дрожжей "Angel" и "Фермиол". Установлено, что динамика выделения диоксида углерода при сбраживании сусла, полученного с использованием бактериальных протеаз, сухими дрожжами имеет тот же характер, что и при сбраживании дрожжами расы XII.

^Г-'Г-J

12 24 36 48 60

Время сбраживания, час

—К II

* В II - А

* В III - н

* В III - А В II - н

Рис. 6. Динамика выделения СО? при сбраживании сусла, полученного с ^использованием бактериальных протеаз, дрожжами расы XII К II - контроль (без протеаз).

В Н-Н. В Ш-Н - опыт («Нейгра!а»); В II—А. В III-А - опыт («Алкалаза»)

Влияние расы дрожжей на примере контрольных вариантов представлены на рис. 7.

о з

Установлено, что за первые 12-24 часа исследуемые расы дрожжей по уменьшению интенсивности сбраживания можно расположить в следующий ряд: Раса Х1Г —* "Angel" "Фермиол"

При сбраживании опытных образцов сусла, полученных с использованием препарата «Нейтраза» на стадии замеса, данная зависимость сохраняется, но меняется время, соответствующее максимальной интенсивности выделения С02 (12 часов), а также увеличивается сам показатель часового прироста (примерно в 1,3 - 1,5 раз).

Анализ полученных данных по применению препаратов грибных протеаз позволяет выявить следующие общие закономерности:

• Применение ферментных препаратов «Дистицим» и «Протеаза» на стадии осахаривания незначительно повышает интенсивность сбраживания сусла при 28 - 30°С.

• Сбраживание опытных вариантов ВШ-Д; ВШ-П («Дистицим», «Протеаза» без подкисления среды) эффективнее проводить термотолерантными дрожжами «Фермиол» при температуре 33 - 35°С.

• Подкисление контрольного образца сусла, полученного без применения грибных протеаз, практически не влияет на ход сбраживания;

• Применение грибных протеаз на стадии осЭхаривания и дополнительное „ подкисления среды до рН 5,0 - 5,1 значительно интенсифицирует

процесс брожения.

0 12 24 36 48 60 72 Врьмя сбралсияаиих час

Рис.7. Влияние расы дрожжей на интенсивность сбраживания ржаного сусла контрольных вариантов

3.7.2. Анализ зрелой бражки по содержанию этилового спирта

Установлено, что концентрация этилового спирта в дистилляте зависит от:

- расы используемых дрожжей;

- вида ферментного препарата протеолитического действия;

- стадии внесения препарата протеазы и режима осахаривания.

Максимальный выход спирта обнаружен в бражках, полученных с

использованием сухих дрожжей "Angel" В пробах с применением препарата «Нейтраза» максимальный выход этанола обнаружен в вариантах, в которых препарат вносили на стадию замеса (7,07-7,18 об.%); а препарат «Алкалаза» на стадию осахаривания (7,07-7,14 об.%). В пробах с применением грибных протеаз максимальная концентрация спирта отмечена при использовании дрожжей XII расы для препарата «Дистицим» и составляет 7,08 об.%; при использовании дрожжей "Angel" для препарата «Протеаза» - 7,03 об.%.

Подкисление среды (табл. 5) повышает уровень содержания этилового спирта в бражке, особенно при использовании препарата «Протеаза».

Таблица 5

Содержание этилового спирта и действительного экстракта в зрелой бражке

(варианты с применением грибных протеаз)

№ Препарат грибной протеазы Режим осахаривания Раса дрожжей Продолжительность брожения, час Концентрация спирта, об.%

1 Контроль 1 (без протеаз) - Чистая культура раса XII 72 6,87

2 Контроль Г (без протеаз) подкисление —"— 72 6,90

3 Дистицим - —"— 60 7,08

4 Дистицим подкисление _к 60 7,10

5 Протеаза - —"— 60 6,97

6 Протеаза подкисление —"— 60 7,14

7 Контроль 2 (без протеаз) - Сухие дрожжи "Angel"' 72 7,03

8 Контроль 2' (без протеаз) подкисление t» 72 7,00

9 Дистицим - — 60 7,05

10 Дистицим подкисление ir 60 7,10

И Протеаза - _и_ 60 7,03

и Протеаза подкисление —"— 60 7,25

13 Контроль 3 (без протеаз) - Сухие дрожжи "Фермиол" 60 6,82

14 Контроль 3' (без протеаз) подкисление _И_ 60 6,81

15 Дистицим - И 48 6,95

16 Дистицим подкисление И 48 7,00

17 Протеаза - —"— 48 6,90

18 Протеаза подкисление —"— 48 7,08

Варианты с подкислением среды имеют значения 7,08 - 7,25 об.%. против 6, 90 - 7,03 об.% в вариантах без подкисления

3.7.3. Анализ зрелой бражки по содержанию летучих примесей

Эффективность стадии сбраживания осахаренного сусла определяется не только накоплением конечного продукта - этилового спирта, но и количеством образующихся побочных продуктов, сопутствующих процессу сбраживания. Известно, что нет прямой корреляционной зависимости между выходом этанола и содержанием в бражке основных летучих компонентов. В идеале необходимо стремиться к получению максимального выхода этилового спирта и минимума суммы примесей Последние в основном накапливаются в ходе спиртового брожения и являются продуктами метаболизма дрожжевых клеток. Содержание вредных летучих примесей в бражке, также как и содержание этилового спирта, зависит от ряда факторов, причем по данным ряда исследователей (Римарева и др, 200!) преобладающее значение имеет раса используемых дрожжей.

Поэтому были проанализированы образцы зрелой бражки с целью выявления зависимости между содержанием примеси и расы дрожжей. Анализ дистиллята контрольных образцов бражки на содержание летучих примесей, проведенный методом газовой хроматографии представлен в таблице 7 и позволяет сделать следующие выводы:

• Минимальное количество примесей содержат образцы бражки, полученные с применением дрожжей расы XII и "Фермиол". Сухие дрожжи "Angel" накапливают значительно больше примесей за счет фракции сивушных масел

• Метаболизм дрожжей расы XII характеризуется накоплением в бражке ацетальдегида Этой фракции накапливается примерно 2,5 - 3,0 раза больше, чем при использовании сухих дрожжей.

. Основная доля примесей приходится на фракцию сивушных масел, причем в ней преобладает изоамилол.

Таблица б

Содержание летучих примесей в зрелой бражке___

Летучие примеси, мг/дм'* Чистая культура Сухие дрожжи

безводною спирта раса XII* "Angel" * "Фермиол" **

Ацетальдегид 852.47 257,56 253,99

Эгилацетат 130,63 191,13 75,14 '

Метанол ( об %) 0,0077 0,0052 0,0038

1-ПрСшанол 388,07 897,05 228.22 .

2-Пропанол 1,5 4.17 -

И юбу ганол 1487,89 1600,62 1040.87.

1- Буганол 6.61 9,13 1

Изоамилол 3369.58 5403,62 4704,02

Общее количество примесей 6242,76 3363,29 6302Д4

* - время сбраживания - 72 часа, t = 28 30°С ** - время сбраживания - 60 часов, t == 33 - 35°С

В табл. 7 приведены сравнительные данные по анализу содержания летучих примесей в опытных образцах зрелой бражки. Наибольший интерес представляют данные по применению препаратов протеаз бактериального происхождения на оптимальных стадиях их внесения («Нейтраза» на стадии замеса, «Алкалаза» на стадии осахаривания), поскольку крепость бражного дистиллята для этих образцов примерно одинакова и составляет 7,10 - 7,08 об.%.

Таблица 7

Сравнительный анализ содержания летучих примесей в опытных образцах бражки (дрожжи расы XII)

Летучие примеси. мг/дм3 безводного спирта Варианты получения сусла

К1 «Нейтраза» на стадию замеса «Алкалаза» на стадию осахаривания К4 «Протеаза» на стадию осахаривания с нод-кислением «Дистицим» на стадию осахаривания с подкис-лением

Ацетальдегид 852,47 1239,6 469,22 96.27 523,44 689.34

Этилацетат ' 130,63 ' 194,73 117,22 143,15 149,56 188,95

Метанол (об.%) 0,0077 0.0085 0.008 0.009 0,0103 0,0101

(-Пропанол 388.07 623,77 466,47 365,88 491,57 461.04

2-Пропанол 1,5 . 1,32 2,5 - 1,69 3,33

Изобутанол 1487,83 м 1356,3 1162,96 1224,61 1186,43 1293,3

1- Бутанол 6,61 8.65 5.39 7,34 5.88 5.63

Изоамилол 3369.58 3166,8 1984,43 3482.11 2257,03 2330,38

Общее количество примесей 6242,7'6 6591,18 4208,20 6192,00 4615.61 4971.98

% к общему количеству в контроле 100 105,6 61,1 100 74.5 80,3

% к варианту без подкисления 100 - - 99.2 67,3 70.5

Однако по содержанию летучих примесей эти образцы существенно отличается,

Негативное влияние препарата «Нейтраза», приводящее к увеличению летучих примесей, может быть связано с двумя факторами:

Образование меланоидинов в сусле. Установлено, что в процессе производства сусла на стадии выдержки сырья при 60-62°С накапливается много аминокислот, которые в дальнейшем при температурах 95-98°С, вероятнее всего, вступают в реакцию меланоидинообразования с редуцирующими сахарами разваренной массы Причем в качестве последних выступают не гексозы, а более реакционноспособные пентозы. Известно, что зерно ржи содержит большое количество слизей и гумми, на 90% состоящих из пентозанов, а также свободных пентоз.

Повышенное содержание меланоидинов в сусле по мнению ряда авторов (1Ы^тоуа еЬ а1., 1995, Сгиргуг^Ы е^ а1., 2000) способствует накоплению альдегидов в бражке. В нашем случае при использовании ферментного препарата «Нейтраза» также обнаружено значительное увеличение содержания ацетальдегида (на 40 - 50%) по сравнению с контролем.

Составом продуктов протеолиза белков сырья. Протеолитические ферменты, входящие в состав исследуемых ферментных препаратов, вероятнее всего, отличаются по специфичности действия, что не исключает возможности образования различных аминокислот, которые являются предшественниками в синтезе высших спиртов Теоретически предшественником н-пропанола может служить треонин, а изоамилола - лейцин.

Вместе с тем, подкисление среды и использование на стадии осахаривания препаратов грибных протеаз приводит к снижению накопления вторичных побочных продуктов брожения

С целью выявления оптимальных режимов получения и сбраживания сусла полученные данные обобщены в табл. 8.

Таблица 8

Обобщенные данные для выбора оптимального варианта технологического режима получения и сбраживания сусла

№ Вариант Дрожжи Крепость Летучие примеси, мг/дм3

приготовления сусла дистиллята, об.% А тьде-гиды Эфиры Сивушные масла Общее количество примесей

1 «Нейтрала» раса XII 7,10 1200 200 4800 6200

2 на стадии имеса "Фермиол" 7,12 850 150 5200 6200

3 «Ал кал аза» раса XII 7,08 470 120 4000 4590

4 осахаривания "Фермиол" 7,07 350 70 4700 5120

5 «Протеача» на стадии осахаривания с подкислением раса XII 7,14 520 150 3900 4570

6 "Фермиол" 7,08 450 80 3900 4430

7 «Дистицим» на стадии осахаривания с подкислением раса XII 7,10 700 200 4100 5000

8 "Фермиол" 7,00 550 130 4200 4880

Анализ этих обобщенных данных позволяет выявить и рекомендовать оптимальные режимы.

Выводы

1. Впервые проведено комплексное исследование белкового комплекса сырья спиртового производства и выявлена роль эндогенных и микробных протеаз в технологии этанола из зерна ржи.

2. Выделены и охарактеризованы эндогенные протеазы зерна ржи (степень очистки 500 раз), с оптимумом рН 6,5. Показана их способность гидролизовать белки зерна ржи.

3. Выявлено отличие в действии микробных ферментных препаратов протеаз бактериального и грибного происхождения на стандартный и зерновой субстраты. Показано, чго оптимум рН действия ферментных препаратов «Нейтраза», «Алкалаза РС» «Протеаза вС-Юб», «Дистицим Протацид Экстра» на зерновой субстрат составляет соответственно: 5,5 - 6,0; 6,0 -6,5 и 5,5 - 6,0; 3,5. Температурный оптимум для препарата «Нейтраза» при действии на зерновой субстрат составляет 50-60°С. Для препарата «Алкалаза РС» соответственно 40°С. Температурный оптимум для препарата «Дистицим Протацид Экстра» при действии на оба субстрата составляет 60 С, а препарата «Протеаза вС-Юб» - 50°С

4. Методом гель-хроматографии изучен фракционный состав белков осахаренного сусла и показана роль нейтральных протеаз зерна ржи в процессе образования продуктов протеолиза, ответственных за повышенное пенообразование.

5. Выявлены различия в степени и глубине гидролиза белков осахаренного сусла под действием микробных препаратов протеаз бактериального и грибного происхождения Максимальное образование низкомолекулярных продуктов гидролиза белков (аминокислоты и пептиды) отмечено для вариантов с использованием бактериальных препаратов «Нейтраза» и «Алкалаза РС» на стадии замеса (49^31 и 42,78% от общего количества) и грибных препаратов «Протеаза СС 106» и «Дистицим Протацид Экстра» на стадии бсахаривания с одновременным подкислением разваренной массы до рН 5,0 - 5,1 (45,43 и 51,69 % от общего количества).

6. Проведена оценка качественных показателей ржаного сусла, полученного с использованием исследуемых препаратов протеаз; изучена динамика изменения содержания растворимого белка и аминного азота по стадиям производства сусла и выявлена закономерность этих изменений от вида применяемых препаратов протеолитического действия.

7. Исследован аминокислотный состав свободных аминокислот и пептидов осахаренного сусла, полученных с использованием препаратов «Алкалаза РС» и «Протеаза вС-Юб». Установлена прямая корреляционная зависимость между содержанием аминного азота, содержанием низкомолекулярных фракций, полученных при гель-хроматографии и общим содержанием аминокислот и пептидов в сусле, неосаждаемых 3% сульфасалициловой кислотой

8. Изучена динамика выделения диоксида углерода при сбраживании сусла, полученного с использованием препаратов протеаз бактериального и грибного происхождения. Максимальная интенсивность процесса сбраживания выявлена для вариантов получения сусла с использованием

препаратов. «Нейтраза» - на стадии замеса; «Алкалаза FG» - на стадии осахаривания, «Протеаза GC 106» и «Дистицим Протацид Экстра» - на стадии осахаривания с подкислением разваренной массы.

9. Исследовано влияние различных рас спиртовых дрожжей (S cerevisiae раса XII, сухие дрожжи «Angel» (Китай) и «Фермиол» (США)) на процесс сбраживания ржаного сусла, полученного с использованием микробных протеаз. Максимальный выход спирта установлен в пробах бражки с использованием сухих дрожжей «Angel»

10. Методом газовой хроматографии определен качественный и количественный состав летучих примесей в образцах дистиллята бражки. Установлено, что на накопление примесей влияют режим получения осахаренного сусла, применяемый ферментный препарат и используемая для сбраживания раса дрожжей

11. На основании проведенных экспериментов могут быть рекомендованы следующие оптимальные режимы

- применение препарата «Алкалаза FG» на стадии осахаривания и сбраживание сусла дрожжами S cerevisiae расы XII (продолжительность брожения 60 часов). Крепость дистиллята соответствует 7,08 об.%. Суммарное содержание летучих примесей 4600 мг/дм^;

- применение препарата «Протеаза GC-106» на стадии осахаривания с дополнительным подкислением среды и сбраживанием сусла дрожжами S cerevisiae расы XII (продолжительность брожения 60 часов). Крепость дистиллята соответствует 7,14 об.%. Суммарное содержание летучих примесей 4600 мг/дм1

- применение препарата «Протеаза GC-106» на стадии осахаривания с дополнительным подкислением среды и сбраживанием сусла термотолерантными дрожжами "Фермиол" (продолжительность брожения 48 часов) Крепость дистиллята соответствует 7,08 об.% Суммарное содержание летучих примесей 4400 мг/дм5

Список pañoi, опубликованных по материалам диссертации

1 Моисеенко В С . Дячкина А Б Подкисление замесов при производстве згилового спирта из зернового сырья // Ликероводочное производство и виноделие - 2003, №11. с 7 - 9

2 Карпиленко ГП , Дячкина А Б Перспективное направление использования зерна ржи // Хранение и переработка зерна, 2004, № 11. с. 32 - 33

3 Моисеенко В С . Дячкина А Б , I рачева О В Образование высших спиртов в ходе метаболизма дрожжей Saccharomyces cerevtstae Ч Производство спирта и ликероводочных изделий. 2004, № 1. с 11 - 13

4 Дячкина А Б, Карпиленко I 11 Нижотемпературная обработка зерна ржи в технологии этанола // Ма1ериалы Всероссийской на> чно-пракчической конференции «Перспективы развития пищевой промышленности в России» - Оренбург, 2005, с 145 - 149.

5 Дячкина Л Б1'. Карпиленко I П , Моисеенко В С Роль белково-протеиназного комплекса в технолоши получения панола из )срна ржи h Производство спирта и ликероводочныч изделий. 2005, № 2. с 10-12

6 Карпиленко 1 П , Дячкина А Б Характеристика ферментных препараюв протеолитического действия, исполыуемых в технологии этано ia // Изв ВУЗов Пищевая технология. 2005, № 4, с 22 - 24

Подписано в печать 17.11.05. Формат 30x42 1/8. Бумага типографская № 1 Печать офсетная, Уч.-изд. л. 0,9. Печ. л. 1,1. Тираж 100 экз Заказ 311.

--М-

125080, Москва, Волоколамское ш., 11 Издательский комплекс МГУПП 26

«23 84t

РНБ Русский фонд

2006-4 25794

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Дячкина, Алла Борисовна

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Характеристика основного сырья спиртового производства.

1.1.1. Агропромышленные аспекты производства зерна ржи

1.1.2. Особенности биохимического состава зерна ржи

1.1.3. Амилолитические и протеолитические ферменты зерна ржи

1.2. Ферментные препараты, используемые в технологииспиртового производства.

1.2.1. Протеолитические ферментные препараты

1.3. Способы подготовки крахмалосодержащего сырья к сбраживанию.

1.3.1. Режимы механико-ферментативной обработки сырья.

1.4. Современные подходы к оптимизации процесса сбраживания сусла.

1.4.1. Характеристика спиртовых дрожжей, применяемых вспиртовом производстве.

1.4.2. Факторы, влияющие на образование примесей при брожении.

1.4.3. Механизмы образования побочных продуктов

1.4.4. Белковые соединения, определяющие пенообразование в технологиибродильных производств

2. Экспериментальная часть.

2.1. Методы исследования.

2.1.1. Определение физических и химических показателей зерна ржи

2.1.2. Определение водорастворимого белка по методу Лоури

2.1.3. Определение фракционного состава белков

2.1.4. Определение активности протеаз модифицированным методом Ансона

2.1.5. Фракционирование белков методом гель-хроматографии

2.1.6. Ионообменная хроматография белков

2.1.7. Изоэлектрическое фокусирование белков

2.1.8. Определение аминного азота методом формольного титрования

2.1.9. Определение активной и титруемой кислотности

2.1.10. Определение аминокислотного состава с помощью аминокислотного анализатора

2.1.11. Определение побочных продуктов брожения методом газовой хроматографии

2.1.12. Определение концентрации спирта и действительного экстракта в зрелой бражке

2.2. Характеристика исследуемого образца ржи по физическим и химическим показателям.

2.3. Характеристика белково-протеиназного комплекса зерна ржи.

2.3.1. Фракционный состав белков ржи

2.3.2. Характеристика протеолитических ферментов исследуемого образца зерна ржи

2.3.3. Выделение и очистка нейтральных протеаз зерна ржи

2.3.4. Характеристика очищенного препарата нейтральных протеаз зерна ржи

2.3.5. Действие нейтральных протеаз ржи на собственные белки

2.4. Характеристика микробных ферментных препаратов протеолитического действия.

2.4.1. Характеристика ферментных препаратов протеаз 71 бактериального происхождения

2.4.2. Характеристика ферментных препаратов протеаз грибного происхождения

2.5. Разработка общей процессуальной схемы получения осахаренного сусла.

2.6. Фракционирование белков осахаренного сусла методом гель-хроматографии.

2.6.1. Характеристика продуктов протеолиза белков сусла, под действием эндогенных протеаз

2.6.2. Характеристика продуктов протеолиза белков осахаренного сусла, полученного с использованием препаратов бактериальных протеаз

2.6.3. Характеристика продуктов протеолиза белков осахаренного сусла, полученного с использованием препаратов грибных протеаз

2.7. Влияние микробных ферментных препаратов протеаз на показатели качества ржаного сусла.

2.7.1. Показатели качества ржаного сусла

2.7.2. Динамика изменения показателей качества ржаного сусла

2.7.3. Аминокислотный состав свободных аминокислот и пептидов осахаренного ржаного сусла.

2.8. Исследование стадии сбраживания ржаного сусла, полученного с использованием микробных протеаз.

2.8.1. Изучение динамики выделения диоксида углерода при сбраживании сусла, полученного с использованием бактериальных протеаз

2.8.2. Изучение динамики выделения диоксида углерода при сбраживании сусла, полученного с использованием грибных протеаз

2.8.3. Анализ зрелой бражки по содержанию этилового спирта.

2.8.4. Анализ зрелой бражки по содержанию летучих веществ 120 Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль эндогенных и микробных протеаз в процессе получения и сбраживания ржаного сусла"

Актуальность темы

Перед спиртовой отраслью на современном этапе стоят непростые задачи по совершенствованию производства — по сокращению теплоэнергетических затрат, более эффективному использованию сырья, увеличению выхода и повышению качества готовой продукции.

Для их решения отечественными и зарубежными специалистами предлагаются различные схемы переработки зерна, в основу которых положены низкотемпературные режимы воздействия на крахмалсодержащее сырье с использованием ферментных препаратов, основными из которых являются препараты амилолитического спектра действия.

Вместе с тем, в последнее время заметно возрос интерес к исследованиям, посвященным ферментным препаратам, гидролизующим другие биополимеры зерна (некрахмальные полисахариды и белки). Белкам и продуктам протеолиза в спиртовом производстве отводится особая роль, поскольку они выполняют множество разнообразных функций и оказывают существенное влияние, как на протекание технологического процесса, так и на выход и качество готового продукта.

Среди микробных протеаз отечественного и зарубежного производства лишь некоторые достаточно хорошо изучены с позиции состава, входящих в препарат отдельных ферментов и их действия на стандартный субстрат. Однако, имеющихся в литературе сведений по применению микробных препаратов протеолитического действия недостаточно, чтобы с научной точки зрения прогнозировать эффективность их использования в контексте — сырье, режим получения осахаренного сусла, специфика метаболизма определенных рас спиртовых дрожжей.

Рожь, наряду с пшеницей, является основным сырьем, перерабатываемым на этиловый спирт. Она из-за проблем получения в ряде случаев вязких технологических сред относится к трудно перерабатываемому сырью. Вместе с тем, рожь имеет, по сравнению с пшеницей такие особенности биохимического состава, в частности активные собственные амилазы и протеазы, которые при определенных условиях можно рассматривать как позитивные.

Однако, существующие технологические режимы механико-ферментативных схем переработки сырья, внедренные на отечественных спиртовых заводах, в должной степени не используют данный факт. Также необходимо учитывать, что при переводе процесса на низкотемпературные режимы подготовки зерна часто возникает проблема повышенного пенообразования при сбраживании сусла. Причина данного явления до конца не выявлена, что ограничивает применение технических приемов к ее устранению.

Все выше изложенное свидетельствует о том, что исследования, посвященные разработке научно-практических основ энерго- и * ресурсосберегающей технологии производства этанола из зерна ржи, базирующиеся на изучении белкового комплекса сырья и изменений, происходящих в нем под действием эндогенных протеаз и используемых ферментных препаратов микробного происхождения, являются несомненно актуальными и перспективными.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы является исследование биотехнологических процессов деструкции белков зерна ржи под действием эндогенных и микробных протеаз и установление их роли в процессе получения и сбраживания ржаного сусла.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

- охарактеризовать белково-протеиназный комплекс фуражного зерна ржи, используемого в технологии этанола;

- разработать общую процессуальную схему получения осахаренного сусла, с применением микробных ферментных препаратов протеолитического действия;

- изучить фракционный состав белков осахаренного сусла методом гель-хроматографии;

- исследовать влияние микробных ферментных препаратов на показатели качества ржаного сусла;

- исследовать стадию сбраживания ржаного сусла, полученного с использованием препаратов микробных протеаз.

Научная новизна

Впервые проведено комплексное исследование белкового комплекса сырья спиртового производства и выявлена роль эндогенных и микробных протеаз в технологии этанола из зерна ржи.

С помощью метода гель-хроматографии изучен фракционный состав продуктов протеолиза белков осахаренного сусла. Выявлена связь избыточного пенообразования на стадии сбраживания ржаного сусла и продуктов протеолиза белков сусла под действием эндогенных протеаз.

Практическая значимость работы

Данные, полученные в ходе проведения экспериментов, позволят рационально использовать сырье и микробные ферментные препараты протеолитического действия в технологии этанола.

Предложенные технологические режимы позволят снизить избыточное пенообразование и за счет этого уменьшить потери сбраживаемых углеводов.

Апробация работы

Материалы работы были доложены на Второй Международной конференции «Зерновая индустрия в XXI веке» (Москва, 2004); на научно-практическом семинаре «Пути повышения качества и увеличения выхода ректификованного спирта с применением ферментных препаратов» (Москва, 2004) и на Всероссийской научно-практической конференции «Перспективы развития пищевой промышленности в России» (Оренбург, 2005).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

1. Обзор литературы

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Дячкина, Алла Борисовна, Москва

1. Авдеев А.Н., Носовская Л.Т., Лаптева Н.К. Технологическая оценказерна ржи перспективных сортов как сырья для производства крахмала// Хранение и переработка сельхозсырья. — 2003, №3, с. 66 — 67.

2. Алексеев В.П., Грунин Е.А. Качество ректификованного спирта // Нроизводство спирта и ликёроводочных изделий. - 2001, №1, с,34 - 35.

3. Артюхов В.Г., Нагрудная Н.А. Влияние летучих примесей на качество пищевого спирта. -М.: ЦНРШТЭНПищепром, 1983, Вып. 7, -28с.

4. Андреев Н,Р. Научное обеспечение комплексной переработки ржи на крахмал, корма и спирт // Хранение и переработка сельхозсырья. —1999, № 1,с.28-29.

5. Андреев Н.Р. Основы производства нативных крахмалов. — М.: Нищепромиздат, 2001, - 283 с.

6. Аношина А.Н., Егоров И.М., Егоров А., Кушаков И.С. и др. Технология низкотемпературного разваривания крахмалистого сырья впроизводстве спирта // Производство спирта и ликёроводочныхизделий. - 2002, №4, с. 37-39.

7. Антипова Л.В. Применение ферментных препаратов протеолити- ческого действия в пивобезалкогольной промышленности. —М.: Агро-НИИТЭИПП, 1992, сер.22, вып. 1, - 24 с.

8. Бабаева А. Роль азотного и углеводного состава среды и условий сбраживания на процесс образования высших спиртов дрожжами.Автореф. дисс. на соискание уч. ст. канд. техн. наук. - М.: 1996, - 24 с.

9. Бабаян Т.Л., Латов В.К. Кинетическая характеристика гидролиза белков процессе индуцированного автолиза биомассы // Прикладнаябиохимия и микробиология. - 2003, т.39, № 6, с. 637-641.

10. Банайтене Е.С. Исследование головных примесей спирта-сырца, вырабатываемого в Литовской ССР и методы улучшения качества132ректификованного спирта. Автореф. дисс. на соискание уч. ст. канд.техн. наук. - Каунас, 1969. - 25 с.

11. Барановская О.Е., Дидык О.Г., Жизневский В.М., Погасий А.Н. Природный цеолит в качестве пеногасителя // Хранение и переработкасельхозсырья. — 2000, № 4, с. 42 -44.

12. Башкис Э. В., Шпокеле А.П. Глубипа гидролиза белковых веществ техническими ферментными препаратами // Ферментная и спиртоваяпромышленность. - 1980, № 8, с. 23 - 25.

13. Белозерский М.А. Свойства и физиологическая роль протеиназ и их ингибиторов в семенах некоторых высших растений. Автореф. дисс. насоискание уч. ст. докт. биол. наук. - М.: 1983, - 44 с.

14. Берри Д. Биология дрожжей (пер с англ.). - М.: Мир, 1985, — 96 с.

15. Благовешенский А.В., Юргенсон М.А. О протеолитичских ферментах. // Бюлл. эксп. биологии и медицины, 1936, т.11, вып. 1, с.76.

16. Бойко И.К., Агеева Н.М., Марковский М.Г. Влиярше выделенной расы спонтанной микрофлоры на концентрацию аминокислот // ИзвестияВУЗов. Пищевая технология. - 2004, № 4, с. 45 - 46.

17. Бондарь М.В. Разработка технологии получения и сбраживания осветленного сусла при переработке зернового сырья на этанол.Автореф. дисс. на соискание уч. ст. канд. техн. наук. — Воронеж, 1999. —20 с.

18. Борисенко Н.А. Разработка технологии ферментированных продуктов на основе зерна ржи. Автореф. дисс. на соискание уч. ст. канд. техн.наук.-М.: 1996,-25 с.

19. Бригаденко М.К., Фомичев Г.К. Влияние вакуум-охлаждения разваренной массы на содержание метанола в спирте // Ферментная испиртовая промышленность. — 1971, № I, с. 35—36.

20. Бущук В., Кембэлл У.П., Древе Э. и др. Рожь (пер. с англ.).- М.: Колос, 1980.-247 с.133

21. Быков В.Г., Павлюченков А.К. Зерновой комплекс России в период рыночных преобразований в АПК // Хранение и переработкасельхозсырья. - 2004, № 5, с. 7 -10.

22. Быков В.Г., Павлюченков А.К. Зерновые ресурсы и рынок зерна в Российской Федерации // Хранение и переработка сельхозсырья. —2003, № 9 , с. 22-23.

23. Васильева Н.Я., Маслова О.П., Цурикова Н.В. Комарова Н.П. Опыт применения микробных ферментных препаратов на Мичуринскомэкспериментальном заводе // Производство спирта и ликероводочныхизделий. - 2000, № 1, с. 24-25.

24. Васильева Н.Я., Цурикова Н.В., Широкова Т.Ю. и др. Сбраживание крахмалсодержащего сырья с применение ферментного препаратаЦелловиридин Г2х // Хранение и переработка сельхозсырья. — 2001, №4, с. 46-47.

25. Веселов И.Я., Грачева И.М., Иванова Л.А. Изменение азотистых веществ в сусле и пиве в зависимости от состава затора и температурыброжения. - М.: АгроПИИТЭИПП, 1973, с. 3-8.

26. Веселов И.Я., Канн А.Г., Грачева И.М. Синтез аминокислот и образование высших спиртов при брожении // Ферментная и спиртоваяпромышленность. — 1964, № 8, с. 7 — 9.

27. Войнарский И.Н., Римарева Л.В., Яровенко В.Л. Отбор препаратов протеаз для спиртового производства по интенсивности и глубинегидролиза белков сусла // Ферментная и спиртовая промышленность. -1979, № 8 , с. 2 9 - 3 1 .

28. Востриков СВ., Бондарь М.В., Мальцева О.Ю., Федорова Е.В. Изучение влияния концентрации засевных дрожжей на накоплениеэтилового спирта и примесей при сбраживании осветленного сусла //Тезисы XXXV научной конференции. - Воронеж, 1997, - с. 57.

29. Востриков СВ., Бондарь М.В., Анашин А.Н. Федорова Е.В. Сравнительный анализ динамики накопления этилового спирта при134сбраживании осветленного и традиционного сусел // Известия ВУЗов.Пищевая технология. — 1997, № 6, с.41 - 42.

30. Востриков СВ., Губрий Г.Г., Горшков Е.А. Влияние температуры на образование побочных продуктов при сбраживании осветленногозернового сусла // Известия ВУЗов. Пищевая технология. - 2001, № 1,с. 36-38.

31. Востриков СВ., Губрий Г.Г., Горшков Е.А., Бондарь М.В. Оптимизация процесса получения и сбраживания осветленного сусла сприменением Протосубтилина Г10Х на стадии приготовления замеса //Хранение и переработка сельхозсырья. — 2001, N» 4, с. 51 -52.

32. Востриков СВ., Мальцева О.Ю., Федорова Е.В. Динамика накопления примесей этилового спирта при сбраживании различных видов сусла //Известия ВУЗов. Пищевая технология. - 1999, № I, с. 1 9 - 2 1 .

33. Востриков СВ., Яковлев А.П., Бунин М.А. Влияние различных факторов на накопление аминного азота в процессе водно-тепловойобработки зернового сырья // Хранение и переработка сельхозсырья. —2004, .№ 10, с. 34-35.

34. Гильзин В.М. Исследование биохимических особенностей различных частей зерна ржи и промежуточных продуктов его помола с цельюрационального формирования сортов ржаной муки. Диссер. насоискание уч. ст. канд. техн. наук. -М.: 1977, - 162 с.

35. Главарданов Р. Ферменты Ново-Пордиск в современном производстве спирта // Современные технологии в спиртовой и ликероводочнойпромышленности: Докл. Межд. научн.-практ. конф. - М . : 1997. с.79-86

36. Голенков В.Ф. Проблемы биохимии ржи в связи с оценкой ее качества. Дисс. на соискание уч. ст. докт. биол. наук. -М.: 1973, — 405 с.

37. ГОСТ 30536-97. Водка и спирт этиловый. Газохроматографический метод определения содержания токсичных микропримесей.

38. Грачева И.М. Биосинтез высших спиртов дрожжами /Микробиология т. 1.-м.: ВИНИТИ, 1972, с. 9 7 - 170.135

39. Грачева И.М., Кривова АЛО. Технология ферментных препаратов. — М.:Элевар, 2000,-512с.

40. Громов СИ. Особенности переработки отдельных видов зернового сырья в спиртовом производстве // Ликероводочное производство ивиноделие. - 2003, Х2 3, с. 8 - 10.

41. Громов СИ. Особенности низкотемпературной переработки зернового сырья на спиртовых заводах // Ликероводочное производство ивиноделие. - 2005, № 4, с. 4 - 6.

42. Грязнов В.П. Изменение состава сивушного масла в зависимости от вида и степени дефектности сырья // Ферментная и спиртоваяпромышленность. — 1964, № 6, с. 11—149.

43. Гунькина Н.И., Фараджева Е.Д. Исследование физико-химических свойств глюкоамилазы дрожжей Saccharomyces cerevisiae Y—717 //Хранение и переработка сельхозсырья. - 2001, №7, с. 33 —35.

44. Гунькина Н.И., Фараджева Е.Д. Применение дрожжей Saccharomyces cerevisiae Y-717 в производстве спирта // Производство спирта иликероводочных изделий. - 2002, JNTo 3, с. 14 - 15.

45. Гусева Т.И., Калинина О.А., Колдин Э.Н. Микробиологические аспекты получения качественного зернового сусла при производствеспирта // Производство спирта и ликероводочных изделий. - 2004, JNT» 1,с.12-14.

46. Детерман Г. Гель-хроматография. - М.: Мир, 1970, - 252 с.

47. Дубодел И.П. Исследование клейковинных белков ржи. Автореф. дисс. на соискание уч. ст. канд. биол. наук. — М.: 1978, — 24 с.

48. Дубодел Н.П., Груздев Л.Т., Синячкин Е.И., Вакар А.Б. Компонентный и аминокислотный состав белковых фракций клейковины ржи //Прикладная биохимия и микробиология. — 1977, т. 13, JNfe 5, с. 769 — 775.

49. Дудкин М.С Определение содержания пишевых волокон в ншеничных и ржаных отрубях // Вопросы питания. -1988, М» 1, с. 5 - 6.136

50. Дунаевский А.Е., Белозерский М.А. Метод выделения БАПА-азы из семян ржи. // Вестник Московского Университета. -1974, № 1, с. 81 -84.

51. Дунаевский А.Е., Емцева И.Б., Белозерский М.А. Локализация и изменение активности БАПА-аз в нроцессе прорастания семян гречихии ржи. // Вестник Московского Университета. -1978, № 1, с. 75 - 77.

52. Дунаевский А.Е., Команцев В.Н., Белозерский М.А. Трипсино- подобный фермент из семян ржи. // Биоорганическая химия, 1976, № 2,с. 221-227.

53. Егоров Г.А. Технологические свойства зерна. -М.: Агропромиздат, 1985,-334 с.

54. Ермолаева Г.А. Повышение стойкости нива // Пиво и нанитки, 2003, N2 3,с. 10-11 .

55. Забродский А.Г. Водно-тенловая обработка сырья в сниртовом нроизводстве / нод ред. Философова М.С. - Киев: 1959, - 158 с.

56. Ибрагимова СИ., Беневоленский СВ., Глянцев Н.И., Шкаринова Т.В. Штаммы для производства спирта. // Пищевая промышленность. —1993, № 2 , с. 28.

57. Ибрагимова СИ., Беневоленский СВ., Пыхова СВ., Чередниченко B.C. и др. Новый термотолерантный штамм дрожжей // Хранение ипереработка сельхозсырья, — 1993, JNT» 1, с. 18—19.

58. Использование комнлексных ферментных нренаратов в производстве рожь содержащих комбикормов: Рекомендации. М.: Информагротех,1988,-16 с.

59. Кадиева А.Т. Разработка интенсивной технологии этанола на основе целенаправленного применения мультэнзимных систем и новых расспиртовых дрожжей. Автореф. дисс. на соискание уч. ст. канд. техн.наук. - М . , 2003,-29 с.

60. Казаков Е.Д. Зерноведение с основами растениеводства. — М.: Колос, 1983,-352 с.

61. Казаков Е.Д., Карпиленко Г.П. Биохимия зерна и хлебопродуктов. — СПб.: ГИОРД, 2005, -512 с.

62. Казаков Е.Д., Кретович В.Л. Биохимия зерна и продуктов его переработки. - М.: Агропромиздат, 1989, - 368 с.

63. Калинина О.А., Гусева Т.И., Колдин Э.Н., Скворцов Е.А. Оптимизация переработки зерна ржи в спиртовом производстве // Производствоспирта и ликероводочных изделий. — 2004, № 1, с. 18-20.

64. Каминский Э. Биохимическая характеристика сортов ржи, возде- лываемых в Польше // Биохимия зерна, 1958, сб. 4, с. 108.

65. Кириллов П.К., Петрушенков П.А. Кавитационное измельчение зерна в нроизводстве иищевого сиирта // Хранение и переработкасельхозсырья. - 1998, № 1, с. 49-51.

66. Козьмина Н.П. Биохимия зерна и продуктов его переработки. -М.: «Колос», 1976, 375с.

67. Коновалов А. Биохимия дрожжей. - М.: Пищевая промышленность, 1980,-240 с.

68. Котов В.Б., Коновалов А. О возможности прямой диссимиляции аминокислот дрожжами // Ферментная и спиртовая промышленность —1965, №2, с. 9 - 1 5 .

69. Кошевая В.Н., Емельянова Н.А., Салманова Л.С., Мальцев П.М. Содержание и некоторые физико-химические свойства некрахмальныхполисахаридов ржи // Прикладная биохимия и микробиология. - 1978,T.14,JN2 5,c.742-745.

70. Кретович В.Л. Биохимия зерна и хлеба. - М.: Паука, 1991, - 136 с.

71. Кретович В.Л. Биохимия растений, М.: Высшая школа, 1980, - 445с.

72. Кретович В.Л., Токарева P.P., Петрова Т.В., Дроздова Т.В., Кульман А.Г., Бранопольская А. Ауэрман Л.Я., Смирнова П.И.Биохимическое, коллоидно-химическое и технологическоеисследование созревания ржи // Биохимия зерна, 1951, № 1, с. 65.

73. Кунце В., Мит Г. Технология солода и пива (пер. с нем.) СПб.: Профессия, 2001,-912 с.

74. Лаптева П.К. Современное производство и качество зерна ржи, новые сорта с улучшенными хлебопекарными свойствами муки // Хранение ипереработка сельхозсырья. — 2000, JV« 5, с. 52 -53.139 75. Леденев В.П., Галлямова Л.П., Ибрагимова С И . , Шелехова Т.М. и др. Зависимость образования побочных продуктов в зрелой бражке откачества сырья // Производство спирта и ликероводочных изделий. —2002, № 3 , с. 12-13.

76. Леденев В.П., Калинина О.А. Влияние механокавитационной обработки зерна ржи на процессы получения концентрированных сред// Производство спирта и ликероводочных изделий - 2001, № 1 , с.19 -20.

77. Лихтенберг Л.А. Влияние технологических приемов на качество спирта // Производство спирта и ликероводочных изделий. - 2001, № 2, с. 2 8 -29.

78. Лихтенберг Л.А. Гидродинамическая обработка зернового замеса в технологии спирта. - М.: АгроИИИТЭИПП, 1993, сер. 24, вьш.З, - 32 с.

79. Лихтенберг Л.А., Устинников Б.А., Ефремова В.И. Веселкина Т.Н., Левит И.М. Пути снижения потерь зерна в производствах пищевойтехнологии. - М.: АгроНИИТЭИПП, 1998, сер.24, вып. 2, -28 с.

80. Лукерченко В.Н. Повое в организации биохимических процессов при производстве спирта. // Ферментная и спиртовая промышленность. —2002, № 1, с. 3 2 - 3 3 .

81. Лукерченко В.П. Ферментные препараты для производства спирта на установках малой и средней мощности. Ч. 1—2 // Пищеваяпромышленность, 1999, № 9, с. 14 - 16, № 10, с. 1 2 - 1 4 .

82. Лукин П.Д., Ладур Т.А., Томанн Р. Биоконверсия ржаной муки с использованием собственной ферментной системы // Хранение ипереработка сельхозсырья. — 1999, № 4, с. 34—38.

83. Майоров А.Ю., Курамшин Р.А., Еникеев Ш.Г. Сухие активные дрожжи в производстве спирта // Производство спирта и ликероводочныхизделий. - 2002, JVe 4, с. 22.

84. Максимова Е.М. Разработка комплексной ресурсосберегающей технологии этанола на основе целенаправленного изменения140реологических характеристик зерна. Дисс. на соискание уч. ст. канд.техн. наук. -М.: 2001,-180с.

85. Мальцева О.Ю. Образование примесей в процессе сбраживания осветлённого зернового сусла. Автореф. дис. на соискание уч. ст. канд.техн. наук. -Воронеж: 1999, — 20с.

86. Малыгин А.Г. Метаболизм карбоновых кислот. -М.: Международная программа образования, 1999, — 40 с.

87. Маринченко В.А., Кислая Л.В., Мудрак Т.Е., Серова Ю.З. Применение термотолерантных дрожжей расы К-81 в производстве спирта //Ферментная и спиртовая промышленность. — 1987, № 3, с. 24 — 26.

88. Маринченко В.А., Кислая Л.В., Мудрак Т.Е., Серова Ю.З., Добролинская Г.М. Сбраживание сусла из крахмалосодержащего сырьятермотолерантными дрожжами // Ферментная и спиртоваяпромышленность. - 1985, № 5, с. 24-26.

89. Маринченко В.А., Смирнов В.А., Устинников Б.А. Технология спирта. - М . : Легкая и пишевая промышленность, 1981, -416 с.

90. Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. -М.: Наука, 1971,-414 с.

91. Олийничук СТ., Коваленко А.Д., Ткаченко А.Ф. Сравнительная характеристика спиртовых рас дрожжей при сбраживании мелассногосусла с повышенным содержанием сухих вешеств // Ферментная испиртовая промышленность. — 1981, № 2, с. 35 - 37.

92. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. — М.: Наука, 1985,-536 с.

93. Пахомов А.И. Проблемы рынка зерна и эффективность его использования в спиртопроизводстве. Автореф. дисс. на соискание уч.ст. канд. эконм. наук. -Воронеж: 1994, —18 с.

94. Плешков Б.П., Шебшелева З.П. Крищенко В.П. Фракционный и аминокислотный состав белков зерна ржи в процессе созревания //Известия ТСХА, 1966, № 2, с. 137 - 143.141

95. Полыгалина Г.В. Технохимический контроль спиртового и ликероводочного производства. — М.: Колос, 1999, — 334 с.

96. Поляков В.А., Римарева Л.В. О научном обеспечении биотехнологии ферментных препаратов для перерабатывающих отраслей АПК //Хранение и переработка сельхозсырья, 2003, № 8, с. 106 — 111.

97. Поляков В.А., Римарева Л.В., Ксандопуло Г.Б. Перспективные биотехнологические процессы для спиртовой промышленности //Производство спирта и ликероводочных изделий. -2002, №1, с. 6 -8.

98. Поляков В.А., Римарева Л.В., Оверченко М.Б., Трифонова В.В. Сравнительная характеристика ферментных препаратовпротеолитического действия по степени гидролиза микробного белка //Прикладная биохимия и микробиология, 2000, т. 36, JVb3, с. 299 - 302.

99. Приезжева Л.Г., Голенков В.Ф. Изменение белкового комплекса зерна озимой пшеницы при созревании // Прикладная биохимия имикробиология, 1968, т.4, вып.2, с. 131.

100. Рид Дж. Ферменты в пищевой промышленности. - М.: Пищевая промышленность, 1971, - 416 с.

101. Римарева Л.В. Повые расы дрожжей для повышения эффективности спиртового производства // Производство спирта и ликероводочныхизделий. - 2000, № 1, с. 18 - 20.

102. Римарева Л.В. Перспективы использования протеолитических ферментных препаратов // Пищевая промышленность. — 1996, № 3, с.4 4 ^ 5 .

103. Римарева Л.В., Войнарский И.Н., Яровенко В.Л. Роль протеолитических ферментов в повышении активности солода иинтенсификации спиртового брожения // Ферментная и спиртоваяпромышленность. - 1981, JV» 3, с. 27-30.

104. Римарева Л.В., Макеев Д.М., Устинников Б.А. Влияние протеолитических ферментов на выход снирта // Пиш,еваяпромышленность. — 1993, № 2, с. 28.

105. Римарева Л.В., Оверченко М.Б., Гернет A.M. Скрининг активных рас дрожжей с термотолерантными и осмофильными свойствами дляинтенсификации производства этанола // Пиво и напитки. -2000, № I,с. 3 4 - 3 6 .

106. Римарева Л.В., Оверченко М.Б., Игнатова Н.И. Зависимость физиологической активности спиртовых дрожжей S. Cerevisiae 985-Т и987-О от экстремальных температур и осмоса // Хранение ипереработка сельхозсырья. - 2005, № 2, с. 25 - 27.

107. Римарева Л.В., Оверченко М.Б., Игнатова П.И. Технологические аспекты использования сухих дрожжей в нроизводстве спирта //Производство спирта и ликероводочных изделий. — 2003, №. 1, с. 15 —16.

108. Римарева Л.В., Оверченко М.Б., Игнатова И.И., Кадиева А.Т. Интенсификация спиртового производства на основе использованиямультиэнзимных систем // Производство спирта и ликероводочныхизделий. -2004, № 2, с.26 - 28.143

109. Римарева Л.В., Оверченко М.Б., Игнатова Н.И., Кадиева А.Т., Шелехова Т.М. Технологические аспекты получениявысококачественного спирта // Производство спирта и ликероводочныхизделий.-2002, №3, с. 16-19.

111. Рукман Л., Рябая О, Аминокислотный состав зерна ржи // Хлебопродукты. - 2000, № 6, с. 15-17.

112. Рукман Л., Рябая О. Содержание витаминов в зерне ржи и нродуктов из нее // Хлебопродукты. - 1999, № 11, с. 24 - 26.

113. Савчук М.Я., Максимюк О.И. Влияние условий сбраживания на качество ректификованного спирта. // Ферментная и спиртоваяпромышленность. — 1985, N2 2, с. 20-21.

114. Сергеев В.Н. Состояние спиртовой и ликероводочной промышленности России // Производство спирта и ликероводочныхизделий. - 2002, JVo 4, с.5-11.

115. Сергиенко Н.Н, Бригаденко М.К. Зависимость качества спирта от дозировок осахариваюших материалов // Пиво и напитки. -1999, №2, с.61-62.

116. Серова Ю.З., Адаптация дрожжей к высоким температурам.// Пищевая промышленность. —1994, Jfyl, с. 23 — 24.

117. Сидоркин В.Ю. Способ механико-ферментативной обработки замеса на спиртзаводе ЗАО «Союз+» / Ликероводочное производство ивиноделие.-2002, №11, с. 4 - 5 .

118. Сизенко Е.И. Иаучное обеспечение производства и переработки зерна озимой ржи в Российской Федерации // Хранение и переработкасельхозсырья. — 2003, № 5, с. 7 - 8.144I

119. Смолкина E. Функциональные виды зернового хлеба // Хлебопродукты. -2002,№ И, с. 3 0 - 3 1 .

120. Солярек Л., Леденев В.П., Петров Р.А. Ферментные препараты «Повозаймс А/С» в производстве спирта // Производство спирта иликероводочных изделий. — 2001, №. 1, с. 32 — 34.

121. Солярек Л., Пазарова П.Г., Чечнев Р.В. Эволюция ферментных препаратов «Повозаймс» для производства спирта // Производствоспирта и ликероводочных изделий. — 2003, № 2, с. 23 — 25.

122. Сотников В.А., Марченко В.В., Гамаюрова В.В. Лимитирующий фактор низкотемпературного разваривания крахмалистого сырья //Производство спирта и ликероводочных изделий. — 2005, № 1, с. 12 —16.

123. Сотников В.А., Федоров А.Д., Гамаюрова B.C., Котельникова П.И., Котельников М.В. Способ низкотемпературного развариваниякрахмалистого сырья в производстве спирта // Производство спирта иликероводочных изделий. — 2002, JVb 1, с. 13 — 15.

124. Способ получения сахаросодержащего продукта из ржаной муки / Попадич И.А., Шуб И.С., Базина И.В., Потейкина М.В. Патент РФ JsTi2013449, 1994.

125. Способ получения этилового спирта / Сотников В.А., Федоров А.Д. и др. Патент РФ №2199586, 2003.

126. Способ производства этилового спирта / Федоров А.Д., Кесель Б.А., Дьяконский П.И., Паумова Р.П. и др. Патент РФ №2138555, 1999.

127. Стабников В.П. Этиловый спирт. —М.: Пищевая промыщлен-ность, 1976.-272 с.

128. Стабников В.П. Перегонка и ректификация этилового спирта. — М.: Пищевая промыщленность, 1969,-456 с.

129. Суходол В.Ф. Водная экстракция сивущного масла на спиртовых заводах. Автореф. дисс. на соискание уч. ст. канд. техн. наук. — Киев,1969.-24 с.145

130. Телишевская Л.Я. Белковые гидролизаты: получение, состаЕ,- применение / под ред. А.Н. Панина. - М.: 2000, -295 с.

131. Тер-Мовсесян А.Ж. Нейтральные протеазы зерна ржи и их белковые ингибиторы. Дисс. на соискание уч. ст. канд. биол. наук. — М., 1981. —134 с.

132. Технология спирта. / Под ред. В.Л. Яровенко. -М.: Колос, 1999. - 464 с.

133. Тим О'Рурк. Коллоидная стабилизация пива // Пиво и напитки. -2002, ^ь 6, с. 23-25.

134. Типовой технологический регламент производства спирта из крахмалистого сырья. — М.: 1998, —78 с.

135. Тихомиров А.С. Интенсификация процесса подработки зернового сырья в технологии получения продуктов брожения. Автореф. дисс. насоискание уч. ст. канд. тех. наук. — М,: 1987. — 25 с.

136. Устинников Б.А., Громов С И . Внедрение гидроферментативной обработки крахмалистого сырья на спиртовых заводах. -М.:АгроНИИТЭИПП, 1992, сер. 24, вып. I, с. 32.

137. Устинников Б.А., Зотов В.Н., Козлов А.Б. Применение корундовых измельчителей для тонкого помола зерна в спиртовом производстве //Ферментная и спиртовая промышленность — 1985, №1, с. 6-9.

138. Устинников Б.А., Пыхова СВ., Громов СИ, Карайчев СИ. Производство спирта с использованием механико-ферментативнойобработки сырья. -М.: АгроИРШТЭИПП - 1989, сер.,24, вып. 4, с. 32.

139. Федоров А.Ф., Миляков В.П. Образование метанола и других летучих примесей при переработке на спирт крахмалистого сырья и сахарнойсвеклы. - М.: ЦНИИТЭИпищепром, 1974, - 36 с.

140. Фертман Г.И., Шойхет М.И. Технология спиртового и ликероводочного производства. - М.: Пищевая промышленность, 1973,-280 с.

141. Фертман Г.И., Шульман М.С Физико-химические основы производства спирта. - М.: Пищепромиздат, 1960, — 259 с.146

142. Халилова Э.А., Абрамов Ш.А. Влияние питательных сред на состав свободных аминокислот дрожжей Saccharomyces cerevisiae IIПрикладная биохимия и микробиология. - 2001, т.37, JVb 5, с. 578-581.

143. Хефтман Э., Кастер Т., Нидервизер Ф., Кацимпулас Н., Куксис А., Кротью Р., Рональд Р. Хроматография. Практическое приложениеметода. В 2-х частях. Пер. с англ./ под ред. Э. Хефтмана. — М.: Мир,1986, 4.1.-336 с.

144. Хорунжина СИ. Биохимические и физико-химические основы технологии солода и нива. - М.: Колос, 1999. - 312 с.

145. Цурикова Н.В., Васильева П.Я., Иванов В.В., Нефедова Л.И. Применение термостабильной а-амилазы Bacillus licheniformis вспиртовом производстве // Хранение и переработка сельхозсырья. —2001, № 5 , с. 3 0 - 3 3 .

146. Чередниченко B.C. Влияние технологических факторов на органолептические показатели спирта // Ликероводочное производствои виноделие. -2004, JST» 2 с. 3 - 5.

147. Чередниченко B.C., Абрамова И.М., Воробьева Е.Г. Применение ферментных препаратов в производстве спирта // Производство спиртаи ликероводочных изделий, 2001, ЛГ»!, с. 11.147

148. Чешинский Л.С. Рынок зернового сырья для производства спирта // Пиво и напитки, 1999, № 5, с. 38,

149. Чипчар Р.А. Разработка интенсивной технологии и аппаратуры для подготовки крахмалосодержащего сырья к сбраживанию. Автореф.дисс. на соискание уч. ст. канд. техн. наук. — Киев: 1986, -25 с.

150. Шахтимир Э.Л., Перова Э.Я. Применение способов холодного затирания на спиртовых заводах ФРГ и ГДР // Ферментная и спиртоваяпромышленность. - 1982, J^ Г^ 7, с. 44 - 46.

151. Шахтимир Э.Л., Перова Э.Я., Левит И.М. Технология производства спирта без разваривания сырья. // Ферментная и спиртоваяпромышленность. - 1983, № 7, с. 44 - 47.

152. Ярмош В.И. Состояние и перспективы развития спиртовой и ликероводочной промышленности России // Производство спирта иликероводочных изделий. — 2003, К2 2, с.6 - 8.

153. Anson M.L. The estimation of pepsin, trypsin, papain and catepsin with hemoglobin. // J. Gen. Physiol., -1938, v.22, p.79 - 82.

154. Balls A.K., Hale W.S. The preparation and properties of wheat proteinase // Cereal Chem., -1938, v. 25, no 5, p. 622

155. Czuprynski В., Klosowski G., Kotarska K. Aldehydy w spirytusach surowychnome trendy // Przem. Ferment Owos. - Warz. - 2000, v.44, no 2,p. 24-26.

156. Drews E. Der Einfluss der Beschaffenheit der Roggenquellstoffe auf die Qualitat von Kom und Mehl. - Dt.:Muller. - Ztg. - 1973, Jg. 71, H.24, S.506-510.

157. Engel C , neins J. The distribution of the enzymes in resting cereals // Biochem. Biophys. Acta. - 1947, v. 1, p. 190 - 196

158. Gams T.C. Bin Verzuckeriengsenzym mit niedrigen Temperaturoptimum und Begleitenzymen in drucklosen Starkeaufshloss // DieBranntveinwirtschaft. - 1982, № 5, S. 24 - 27.148I

159. Inlow D., McRae J., Ben-Bassat A. Fermentation of com starch to ethanol with genetically engineered yeast// Biotechnology and Bioengineering. —1988, V. 32, p. 227-234.

160. Jaschke P. Flussigkeiten and Feststoffe Kontinuierlich mischen und dispergiesen dei // Brauwelt - 1997, no 3, 97 - 114.

161. Kim K., Park C.S., Mattoon J.R.. High-efficiency, one-step sterch utilization by transformed Saccharomyces cells wich secrete bothglucoamylase and mouse a-amylase. Appl. Environ. Microbiol. —1988, v.54:p. 966-971.

162. Kreipe H. Des drucklose starkoufchluss in Theorie und Praxus // Brannerei — Kalender.-1982,№5, S. 12-16 .

163. Kreipe H. Gewinnung von Ethanol aus Weizen // Alkohol - Industrie - 1985,^23, S. 53-54.

164. Kreipe H., Dinglinger V. Betriebserfahrunger mit dem Kaltmaischver fahzen in Kornbbrennerei // Alkohol - Industrie - 1981, №11, S. 21 - 40.

165. Lowry O.H., Rosebrougt N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent. // J. Biol. Chem. - 1951, v. 193, p. 265.

166. McDonald E. C. Proteolj'tic enzymes of wheat and their relation to baking quality // Baker and Digest., 1969, v. 43, no 2, p. 26

167. Menger H. J., Miroll F. Dispergiermaischverfahsen. - Ein neves Verfahren zur Optimierung des mechanischen Starkeaufschlusses // Brauwelt- 1999,^o30/31,S. 1372-1388.

168. Seinosuke Veda, Yojiro Koba. Alcoholic fermentation of raw starch without cooking by using black-koji amylase // Journal of FermentationTechnology. - 1980, v. 58, № 3, p. 234 - 237.

169. Siebel W., Stephan H. Verarbeitungswert von Roggen-Mahlerzeugnssen, Auswertung von Roggen-Backversuchen // Getreide, Mehl und Brot. - 1980(34), .№ 8, S. 203-206.

171. Zydorczyk V.S., Biliaderis C.G. Effect of molecular size physical properties of wheat arabinoxylan // J. Agr, Food Chem. - 1992, v. 40, № 4, p. 561 -568.150

Информация о работе

Дячкина, Алла Борисовна
кандидата технических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.04

Диссертация

Роль эндогенных и микробных протеаз в процессе получения и сбраживания ржаного сусла - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы