Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль ассоциации глицеральдегид - 3 - фосфат - дегидрогеназы с другими ферментами в регуляции образования 2,3-дифосфоглицерата в эритроцитах

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль ассоциации глицеральдегид - 3 - фосфат - дегидрогеназы с другими ферментами в регуляции образования 2,3-дифосфоглицерата в эритроцитах"

РГб од

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

1 О ФЕВ 1998им. М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

ПЕТЕЧИНСКАЯ КСЕНИЯ ВИТАЛЬЕВНА

УДК 577.152.121

РОЛЬ АССОЦИАЦИИ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-З-ФОСФАТ-ДЕГИДРОГЕНАЗЫ С ДРУГИМИ ФЕРМЕНТАМИ В РЕГУЛЯЦИИ ОБРАЗОВАНИЯ 2,3-ДИФОСФОГЛИЦЕРАТА В ЭРИТРОЦИТАХ

(03.00.04-Биохимия)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1998

Работа выполнена в отделе биохимии животной клетки института физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского Московского Государственного университета

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор В.И.Муронец

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Н.Б.Гусев

доктор химических наук, профессор Б.И.Курганов

Ведущая организация: Российский Университет дружбы народов.

Защита состоится "_"_1998 г. в "_" часов на заседании

Специализированного Совета Д. 053.05.32 при Московском Государственном Университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан_199_г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

М.В.Иванов

Характеристика работы.

Актуальность проблемы. Гликолиз в эритроцитах отличается от гликолиза, протекающего в любой другой клетке, т.к. 1,3-дифосфоглицерат, образующийся в реакции, катализируемой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой, может использоваться не только 3-фосфоглицераткиназой с образованием АТФ и 3-фосфоглицерата, но и 2,3-дифосфоглицератмутазой с образованием 2,3-дифосфоглицерата. 2,3-ДФГ понижает сродство гемоглобина к кислороду. 2,3-ДФГ связывает дезоксиформу гемоглобина. Это приводит к увеличению выхода кислорода из эритроцитов в ткани и к улучшению снабжения клеток кислородом. Изменение концентрации 2,3-ДФГ может понизить сродство гемоглобина к кислороду в 26 раз. Выявление роли 2,3-ДФГ в транспорте кислорода важно для подбора условий хранения крови, ведь его концентрация в эритроцитах снижается с 4,5 до менее чем 0,5 мМ за 10 дней хранения крови. Одним из возможных механизмов регуляции 2,3-ДФГного шунта может быть изменение рН плазмы крови. За последние 20 лет влияние рН на уровень 2,3-ДФГ изучалось многими авторами, но полученные ими данные противоречивы и не дают четкого представления о зависимости концентрации 2,3-ДФГ от рН. Мы предположили, что эта зависимость опосредуется через образование биферментных комплексов ГАФД с 3-ФГК и с 2,3-ДФГМ. Существование комплекса между ГАФД и 3-ФГК было показано в нашей лаборатории, но о возможности взаимодействия 2,3-ДФГМ и ГАФД сведения отсутствовали. В данной работе исследовалось взаимодействие ГАФД с этими ферментами в гемолизате эритроцитов человека при различных значениях рН инкубации, а также изучалось влияние инкубации гемолизатов эритроцитов при разных значениях рН на выработку 2,3-ДФГ и ряда гликолитических субстратов. Изучение влияния рН на образование 2,3-ДФГ представляет большой интерес для понимания регуляции гликолиза в эритроцитах.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение влияния рН на образование биферментных комплексов ГАФД с 3-ФГК и 2,3-ДФГМ. В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1) исследование возможности образования комплекса между ГАФД и 2,3-ДФГМ из эритроцитов человека;

Список сокращений: 1,3-ДФГ - 1,3-дифосфоглицерат; 2,3-ДФГ - 2,3-дифосфоглицерат; 2,3-ДФГМ - 2,3-дифосфоглицератмутаза; 3-ФГ - 3-фосфоглицерат; 3-ФГК - 3-фосфоглицераткиназа; ГАФД - Э-глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа.

2) выяснение влияния рН инкубации на взаимодействие ГАФД с киназой и мутазой непосредственно в гемолизатах эритроцитов;

3) изучение влияния инкубации эритроцитов при разных значениях рН на накопление продуктов реакции мутазы и киназы, соответственно 2,3-ДФГ и 3-ФГ и роль биферментных комплексов в этом процессе.

Научная новизна работы. С помощью иммобилизованных моноклональных антител к ГАФД из гемолизата эритроцитов человека были выделены биферментные комплексы ГАФД и 3-ФГК, а также ГАФД и 2,3-ДФГМ, причем состав комплексов зависел от рН инкубации. С помощью метода иммобилизации белков на нерастворимом носителе впервые показано образование комплекса между ГАФД и 2,3-ДФГМ, изолированными из эритроцитов человека. Установлено, что используемый в работе клон антител (6С5) выработан на область межсубъединичных контактов молекулы дегидрогеназы и связывает лишь димеры ГАФД. Показано, что ГАФД, закрепленная на нерастворимом носителе с помощью иммобилизованных антител, образует прочные комплексы с растворимыми 3-ФГК и фосфоглицератмутазой из мышц кролика. Установлено, что инкубация эритроцитов при разных значениях рН изменяет накопление продуктов реакции 3-ФГК и 2,3-ДФГМ - 3-ФГ и 2,3-ДФГ, и показано, что такое отличие в накоплении данных гликолитических субстратов обусловлено существованием различных биферментных комплексов, а именно ГАФД и 3-ФГК или ГАФД и 2,3-ДФГМ.

Практическое значение работы состоит в том, что полученные в ней результаты позволяют выяснить как влияет рН плазмы крови на взаимодействие ГАФД с другими ферментами, участвующими в превращении 1,3-ДФГ - 3-ФГК и 2,3-ДФГМ, а, следовательно, и на регуляцию гликолиза и 2,3-ДФГного шунта. Эти наблюдения могут служить основой для создания концепций о механизмах регуляции метаболизма в эритроцитах. Кроме того полученные данные показывают и возможные пути регуляции образования 2,3-ДФГ, что позволяет лучше понимать процессы, протекающие в организме человека при алкалемии или ацидемии. Полученная информация может быть использована при чтении спецкурсов на кафедре биохимии биологического факультета, а также на других кафедрах биохимии университетов и медицинских институтов.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на совместном заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ и отдела биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ, а также на Втором съезде Биохимического общества РАН (Москва, ¡997), 23 Meeting of FEBS, (Basel, 1995), на конференции им. А.Н.Белозерского.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Объем работы составляет страниц печатного текста, включая ... таблиц и ... рисунков.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

D-глицеральдегид-З-фосфат (3-ФГА) получали по методу Шевчука [Szewczuk et al., 1961]. Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназу выделяли из мышц кролика по методу Хилла [Hill et а1.,1975]. При выделении ГАФД из эритроцитов человека мы взяли за основу методику группы Стека [Rogalski et al., 1989]. Выделение 3-ФГК и ФГМ из мышц кролика проводили по методике Скоупса [Scopes, Stoter, 1982]. При выделении 2,3-ДФГМ из эритроцитов человека мы основывались на методике, предложенной Розе [Rose, 1975]. Свежие эритроциты брались в лаборатории поликлиники N . Моноклональные антитела на ГАФД из мышц кролика (клон 6С5) были любезно предоставлены А.Г.Катрухой.

Определение концентрации белка. Концентрацию белков определяли методом Бредфорд [Bradford, 1976].

Концентрацию белков определяли также спектрофотометрически.

Молекулярные массы белков считали равным ГАФД - 144 ООО, 2,3-ДФГМаза - 57 ООО, 3-ФГКаза - 43 ООО.

Концентрацию иммобилизованных белков определяли по модифицированному методу Бредфорд [Asryants, 1985].

Определение активности ГАФД проводили спектрофотометрически при 340 нм в среде следующего состава: 100 мМ глицин, 50 мМ калий-фосфат, 5 мМ ЭДТА, 0,5 мМ NAD+, 0,5 мМ 3-ФГА, рН 8,9. За ходом реакции следили по увеличению оптической плотности в результате накопления NADH. Активность 3-ФГК определяли также спектрофотометрически в сопряженной системе с ГАФД. Среда измерения содержала: 30 мМ HEPES, рН 7,5; 3 мМ АТФ, 0, 22 мМ NADH, 10 мМ MgS04, 10 мМ 3-ФГК, 8-10 ед. ГАФД. Активность 2,3-ДФГМ определяли спектрофотометрически в сопряженной системе с ГАФД. Среда измерения содержала: 10 мМ фосфат калия, 0,5 мМ ЭДТА, рН 7,5; 1 мМ 3-ФГК, 0,5 мМ NAD\ 0,5 мМ 3-ФГА, 8-10 ед. ГАФД. Активность фос<Ьоглицератмутазы определяли спектрофотометрически в сопряженной системе с ГАФД и 3-ФГКазой. Среда измерения содержала: 0,05 М ТЭА-НС1, рН 7,5; 2 мМ 2,3-ДФГ, 1 мМ ATP, 1 мМ MgC12, 0,25 мМ NADH, 1,6 ед/мл ГАФД, 1,6 ед/мл 3-ФГКазы, 1 мМ 2-фосфогликолевой кислоты. Активности ферментов, связанных с сефарозой, определяли так,

как описано выше, в среде того же состава, но концентрации субстратов и кофакторов были удвоены.

Иммобилизацию ГАФД и антител производили по методике Чередниковой и др. [СЬеге&пкоуа, 1980]. Степень активации сефарозы при иммобилизации ГАФД составляла 5 мг ВгСЫ на мл сефарозы при иммобилизации фермента за одну субъединицу и 30 мг ВгСЫ на мл сефарозы при иммобилизации за две субъединицы. При иммобилизации антител степень активации сефарозы составляла 50 мг ВгСЫ на мл сефарозы.

Для очистки антител суспензию антител (клон 6С5), хранящихся в насыщенном растворе сульфата аммония, центрифугировали и растворяли осадок в 50 мМ КН2РО4, содержащем 0,15 М ЙаС1, рН 7,2 (концентрация белка составляла 0,3-0,4 мг/мл). Раствор антител наносили на колонку с иммобилизованной ГАФД, предварительно промытую 50 мМ КН2Р04, содержащим 0,15 М ЫаС1, рН 2,0 и уравновешенную тем же раствором с рН 7,2. После отмывания колонки от несвязавшегося белка антитела элюировали буфером с рН 2,0. В полученном растворе антител сразу же доводили рН до 6,5-7,5 с помощью 1 М К3РО4, рН 11,0.

Отмывание эритроцитов. Суспензию эритроцитов трижды промывали равным объемом 5 мМ фосфата калия, содержащего 0,15 М №С1. Лейкоцитарную пленку, образующуюся на поверхности уплотненных центрифугированием эритроцитов, отсасывали с помощью водоструйного насоса.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Исследование образования комплекса между ГАФД и 2,3-ДФГМ, изолированными из эритроцитов человека.

На первом этапе работы мы изучали возможность образования комплекса между ГАФД и 2,3-ДФГМ из эритроцитов человека. Эксперименты проводились при двух крайних физиологических значениях рН, равных 6,8 и 7,8, чтобы посмотреть, будет ли влиять изменение рН в физиологическом диапазоне на параметры связывания этих двух ферментов. Дело в том, что значение рН плазмы различается в разных участках кровяного русла, и рН плазмы крови в капиллярах мышц несколько кислее, чем в капиллярах, окружающих легочные альвеолы. Эритроцит в капиллярах, пронизывающих работающую скелетную мышцу, должен отдать кислород тканям и, следовательно, нуждается в 2,3-ДФГ. При постановке эксперимента мы использовали метод иммобилизации одного из ферментов, а именно, ГАФД, на нерастворимом носителе.

Было проведено выделение ГАФД и 2,3-ДФГМ из эритроцитов человека. Оба фермента были гомогенны по результатам электрофореза,

удельная активность ГАФД составляла 50 единиц, 2,3-ДФГМ - 7 единиц, что соответствует литературным данным [Rose, 1975]. Затем нами был получен препарат эритроцитарной ГАФД, иммобилизованной на BrCN-активированной сефарозе-4В. Он характеризовался удельной активностью 12 Ед/мг и содержанием белка 168 мкг на 1 мл уплотненного геля.

Возможность образования комплекса изучалась при различных концентрациях 2,3-ДФГМ в присутствии одного из субстратов дегидрогеназной реакции - 3-ФГА. Для инкубации готовились по две пробы, в одну из которых вносили 0,5 мл уплотненного геля сефарозы с иммобилизованной ГАФД, а в другую - 0,5 мл сефарозы без белка. В каждую пробу добавляли 3-ФГА (до конечной концентрации 0,5 мМ) и 2,3-ДФГМ (конечная концентрация от 2,5 до 12,5 мкМ); объем проб доводили до 1 мл с помощью 30 мМ фосфата калия, содержащего 0,5 мМ ЭДТА, рН 6,8 (7,8) и инкубировали в течение 20 мин при 25°С. Затем суспензии центрифугировали, отбирали супернатанты контрольных и опытных проб и определяли в них содержание белка. Количество 2,3-ДФГМ, связавшейся с иммобилизованной ГАФД, рассчитывали по убыли белка в опытной пробе по сравнению с контрольной.

Рис. 1. Связывание 2,3-ДФГМазы с иммобилизованной ГАФД.

Иммобилизованную ГАФД (1,2 мкМ) инкубировали с различными концентрациями 2,3-ДФГМазы (2,5-12,5 мкМ) в присутствии 0,5 мМ 3-ФГА в 30 мМ КН2РО4, в течение 20 мин при 25°С. Кл комплекса составила 2,48±0,бЗ мкМ.

[ДФГМаза]сво6, мкМ

После обработки данных, полученных в результате нескольких параллельных экспериментов, выяснилось, что ферменты взаимодействуют

с образованием комплекса с Кд=2,48±0,63 мкМ в молярном соотношении тетрамер ГАФД:3,8 димеров мутазы при рН инкубации, равном 6,8. При рН инкубации, равном 7,8, эти ферменты комплекса не образуют. Полученные данные подтверждают предположение о влиянии рН на образование комплекса ГАФД и 2,3-ДФГМ. Образование комплекса при кислых значениях рН приводит к тому, что практически весь 1,3-ДФГ, образующийся в ходе дегидрогеназной реакции, используется мутазой с образованием 2,3-ДФГ, побуждающего гемоглобин отдавать кислород тканям.

2. Извлечение из гемолизата эритроцитов человека биферментных комплексов ГАФД с 3-ФГК и 2,3-ДФГМ с помощью моноклональных антител к ГАФД, иммобилизованных на BrCN-активированной сефарозе.

Для того, чтобы исследовать образование комплексов ГАФД с киназой и мутазой непосредственно в гемолизате эритроцитов мы решили использовать иммобилизованные моноклональные антитела к ГАФД. Нами было показано, что хотя эти антитела и были выработаны против ГАФД, выделенной из скелетных мышц кролика, они обладают высоким сродством к дегидрогеназе из эритроцитов человека. Мы предположили, чти если мы добавим иммобилизованные антитела, выработанные против ГАФД к гемолизату эритроцитов, то мы сможем извлечь из него не только молекулы самой ГАФД, но также и те белки, которые с ней взаимодействуют.

Отмытые эритроциты подвергали лизису при рН 7,4. Полученный гемолизат инкубировали с иммобилизованными на сефарозе антителами (концентрация антител составляла 150-200 мкг белка на мл геля) из расчета 1 мл сефарозы на 30 мл гемолизата. Инкубацию проводили в течение часа во льду. Затем сефарозу отмывали от несвязавшегося белка. После промывания на сефарозе была обнаружена активность ГАФД (2,50 ед/мл) и 3-ФГК (в среднем 0,16 единиц на мл сефарозы). Поэтому мы предположили, что извлеченная из гемолизата эритроцитов ГАФД находится в комплексе с 3-ФГК. Далее мы промывали сефарозу буфером с рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, что вызывало элюцию неспецифически связанных белков. В элюатах не промерялась ни киназная, ни мутазная активность, хотя она по-прежнему присутствовала на сефарозе. Промывание сефарозы буфером, содержащим 0,3 М NaCl также не вызвало элюцию киназы. Чтобы добиться диссоциации комплекса ГАФД и киназы на следующем этапе мы промывали сефарозу буфером, содержащим субстраты ГАФД - 2 мМ NAD+ и 2 мМ 3-ФГА. Предпосылкой этих опытов были наблюдения, сделанные в нашей лаборатории, свидетельствующие о том, что конформационное состояние ГАФД и 3-ФГК изменяется при взаимодействии с субстратами и кофакторами. Было, в частности показано,

что при связывании 1,3-ДФГ с 3-ФГК резко снижается сродство 3-ФГК к ГАФД (ЗикЪосЫе^ й а1., 1988]. При промывании комплекса ГАФД*3-ФГК субстратами ГАФД (ЫАЕ>+ и 3-ФГА) на сефарозе в результате дегидрогеназной реакции образуется 1,3-ДФГ, связывающийся с 3-ФГК, что приводит к элюции киназы с удельной активностью 0,96 единиц. Однако вместе с киназой элюировались и другие белки, в частности, 2,3-ДФГМ, чья удельная активность составляла 5,54 единиц. Мы провели несколько аналогичных экспериментов, в которых элюция субстратами каждый раз вызывала схождение с сефарозы и 3-ФГК, и 2,3-ДФГМ (см рис. 2, А).

Рис. 2. Электрофореграмма белков из гемолизата эритроцитов человека, адсорбировавшихся на иммобилизованных антителах к ГАФД при рНинкубации, равном 7.4 (А), 6,5 (В) и 8,0 (С).

1,3, 5 - белки-маркеры (кДа); 2 и 4 - белки, сошедшие с сефарозы после элюции субстратами ГАФД (см. текст) при рН 7,4 и 6,5 соответственно; 6 - ГАФД, очищенная из эритроцитов человека; 7 - 3-ФГК, очищенная из эритроцитов человека; 8 - белки, сошедшие с сефарозы после промывания буфером А, содержащим 0,15 М №С1; 9 -белки, обнаруженные в препарате сефарозы после ее промывания 0,1 М глицином, рН 2,0 и последующей инкубации с разрушающей смесью для электрофореза, содержащей додецилсульфат натрия; 10 - белки, сошедшие с сефарозы после элюции субстратами ГАФД (рН 8,0) или субстратом 3-ФГК, 2 мМ 1,3-ДФГ (11).

В

56-Щ

21-

1 2

66- т

48.5-

29- I-

3 4

97-

664*

29- — 20- _ 14.2-

I ±м

5 6 7 8 9 10 11

Вышеописанные эксперименты проводились при рН инкубации, равном 7,4 - физиологическом значении рН плазмы крови. Мы предположили, что при таком значении рН часть молекул дегидрогеназы является связанной с киназой, а часть - с мутазой. И если изменять рН инкубации в кислую и щелочную стороны, то мы сможем получить

биферментные комплексы ГАФД или с мутазой, или с киназой и элюировать с сефарозы чистые растворы активных мутазы и киназы.

Поэтому дальнейшие опыты мы проводили при двух значениях рН, равных 6,5 и 8,0. Опыты строились по вышеописанной схеме, менялся лишь рН буфера для промывания и лизиса эритроцитов и буфера А. Всего было проведено 8 экспериментов - 5 из них проводились при рН при лизисе и последующей инкубации, равном 6,5; и 3 - при рН=8,0.

Таблица 1.

Количество белка, связанного с афинным сорбентом (моноклоналъные антитела к ГАФД, иммобилизованные на сефарозе) на разных стадиях эксперимента.

этап обработки рН=6,5, мг белка на мл геля рН=8,0 мг белка на мл геля

после инкубации геля с гемолизатом эритроцитов и промывания буфером А 1,130 1,228

после промывания 0,15 М КаС1 0,610 0,948

после элюции субстратами 0,420 0,775

после элюции 0,1 М глицином 0,200 0,360

количество связавшейся ГАФД 0,220 0,415

количество связавшейся 2,3-ДФГМазы 0,190

количество связавшейся 3-ФГКазы 0,173

молярное соотношение [мономер ГАФД]: [мономер 2,3-ДФГМ] 1 :1,17

молярное соотношение [мономер ГАФД]: [мономер 3-ФГК] - 1 : 0,35

В опытах, поставленных при рН 6,5, элюция субстратами вызывала схождение белка с сефарозы одним пиком, который во всех случаях содержал чистую 2,3-ДФГМ (см. рис. 2, В) в концентрации 0,030-

0,050 мг/мл, имеющую активность 40 ед/мг (средние значения по 5 экспериментам).

При инкубации гемолизата при рН=8,0 элюция субстратами вызвала схождение с сефарозы 3-ФГК в концентрации 0,40-0,45 мг/мл и с активностью 4-8 ед/мг (см. рис. 2, С).

Основные этапы проведения эксперимента показаны в таблице 1. В таблице приведено количество белка, содержащееся на сефарозе на разных стадиях проведения эксперимента, и показано, как рассчитывалось молярное соотношение белков в комплексе.

В таблице представлены данные двух типичных экспериментов. Средние же значения по соотношению белков в комплексе близки к табличным значениям и составляют для комплекса мономер ГАФД/мономер мутазы = 1/1,06, а для комплекса мономер ГАФД/мономер киназы = 1/0,36. Т.е. на тетрамер ГАФД приходится 2 димера мутазы или одна молекула киназы.

Высокое содержание киназы и, особенно, мутазы в составе комплексов с ГАФД было довольно неожиданным для нас, поскольку известно, что в эритроцитах концентрация дегидрогеназы существенно выше, чем этих ферментов, а по нашим данным, практически вся ГАФД находится в комплексе с киназой или с мутазой. У нас возникло предположение, что использованные нами антитела с большей эффективностью взаимодействуют не с тетрамерами ГАФД, а с какими-то иными формами этого фермента, например, с димерами.

3. Исследование взаимодействия антител с тетрамерной и димерной формой ГАФД, иммобилизованной на сефарозе-4В.

Нашей следующей задачей было выяснить на какую область молекулы ГАФД выработаны антитела - находится ли антигенная детерминанта на поверхности молекулы или же в области межсубъединичных контактов. С этой целью мы изучали взаимодействие антител с иммобилизованными тетрамерами и димерами ГАФД из мышц кролика. Иммобилизацию ГАФД проводили при степени активации сефарозы, равной 30 мг/мл геля. При такой степени активации тетрамер ГАФД связывается с носителем через две субъединицы [Чередникова, 1980]. Количество белка, ковалентно связанного с носителем, составляло 420 мкг на 1 мл уплотненного геля сефарозы.

Димеры ГАФД получали следующим образом: колонку, заполненную ГАФД-сефарозой, промывали 50 мМ фосфатом калия, содержащим 0,15 М NaCl, рН 2,0, затем уравновешивали тем же раствором с рН 7,2. После обработки иммобилизованной ГАФД раствором с рН 2,0 на носителе оставалось 41-46% от исходного количества ГАФД, т.е. происходила диссоциация иммобилизованного белка на димеры.

Далее, на колонку с иммобилизованными димерами и на колонку с иммобилизованными тетрамерами ГАФД наносили раствор антител в избытке. Инкубировали 30-40 мин, промывали колонку от несвязавшегося белка, затем элюировали антитела раствором с рН 2,0. В элюате доводили рН до нейтрального значения с помощью 1 М К3РО4 и затем определяли концентрацию антител. Результаты измерений представлены в табл. 3. Из данных таблицы следует, что данный клон антител практически не связывается с тетрамерной формой ГАФД, но хорошо взаимодействует с иммобилизованными димерами, что позволяет предположить, что антигенная детерминанта скорее всего располагается не на поверхности тетрамерной молекулы дегидрогеназы, а в области межсубъединичных контактов. В тетрамере данные участки экранированы соседними субъединицами и поэтому недоступны для связывания с антителами.

Таблица 2.

Количественные характеристики взаимодействия антител (клон 6С5) с иммобилизованными димерами и тетрамерами ГАФД.

Форма иммобилизованного фермента Количество ГАФД (мкг) Количество добавленных антител (мкг) Количество антител, связавшихся с ГАФД (мкг) Молярное соотношение тетрамер ГАФД:АТ

Димерная 250,5 1616,0 434,0 1 : 1,7

Тетрамерная 588,0 1664,0 0 _

Чтобы проверить это предположение нами был поставлен опыт по реассоциации иммобилизованных димеров кроличьей ГАФД, полученных двумя разными способами, с растворимыми димерами. Иммобилизованные димеры получали с помощью инкубации иммобилизованных тетрамеров ГАФД в присутствии АТФ или инкубируя растворимую ГАФД, содержащую равновесную смесь димеров и тетрамеров, с иммобилизованными на сефарозе антителами клона 6С5.

4. Реассоциация димеров ГАФД, связанных с сефарозой двумя способами.

Димеры первым способом получали по известной методике [Чередникова, 1980], используя препарат ГАФД, иммобилизованной за

одну субъединицу.

Таблица 3.

Реассоциация димеров ГАФД, полученных путем диссоцации иммобилизованных за одну субъединицу тетрамеров (А) и из комплекса ГАФД »иммобилизованные антитела (Б).

А)

мкг ГАФД на мл геля уд.акт. ГАФД на сеф. ед/мг

имм. тетрамеры ГАФД 162 4,83

имм. димеры ГАФД 76 2,80

после реассоциации 174 4,48

Б)

мкг ГАФД на мл геля уд.акт.ГАФД на сеф. ед/мг

до реассоциации 181 7,82

после реассоциации 151 7,74

Полученные иммобилизованные димеры содержали 76 мкг белка на мл геля, активность ГАФД на сефарозе составляла 2,8 ед/мг. Для проведения реассоциации взяли 1 мл сефарозы с иммобилизованными димерами ГАФД и инкубировали с 10 мл раствора дегидрогеназы, с концентрацией белка 0,5 мг/мл в течение часа при 4°С и в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем сефарозу отмывали от несвязавшегося белка. Как видно из таблицы 3, реассоциация имела место - концентрация белка на сефарозе составляла 174 мкг на мл геля, удельная активность ГАФД была равна 4,48 ед/мг, т.е. мы получили на сефарозе тетрамеры ГАФД.

Для получения иммобилизованных димеров вторым способом 13 мл раствора ГАФД в концентрации 0,3 мг/мл инкубировали с 2 мл препарата иммобилизованных антител, содержащего 150 мкг антител на мл сефарозы в течение 1 часа. Затем сефарозу отмывали от несвязавшегося белка. Как видно из таблицы 3, в результате ГАФД связалась с иммобилизованными антителами в количестве 181 мкг на мл иммобилизованных антител, удельная активность ГАФД на сефарозе составляла 7,82 ед/мг. С таким препаратом ГАФД в комплексе с иммобилизованными антителами был

поставлен опыт по реассоциации по той же схеме, как описано выше. После промывания геля на сефарозе определялась концентрация и активность ГАФД. Как видно из таблицы, реассоциация не прошла -концентрация ГАФД составила 151 мкг на мл геля, удельная активность ГАФД практически не изменилась и составила 7,74 ед/мг. Это подтверждает наше предположение о том, что антигенная детерминанта располагается в той части поверхности ГАФД, которая отвечает за межсубъединичные контакты. В иммобилизованных обычным способом димерах область межсубъединичных контактов обращена в раствор, и такие димеры могут взаимодействовать с димерами из раствора с образованием иммобилизованных тетрамеров. При фиксации ГАФД на сефарозе с помощью иммобилизованных антител область межсубъединичных контактов экранирована от взаимодействия с димерами, и поэтому реассоциации не происходит. В наших опытах по извлечению биферментных комплексов из гемолизата эритроцитов с помощью иммобилизованных антител, связывание киназы и мутазы также по-видимому обеспечивается противоположной от области межсубъединичных контактов поверхностью ГАФД.

5. Изучение комплексов, образуемых эритроцитарной ГАФД, связанной с иммобилизованными антителами, с мутазой и киназой из мышц кролика.

Таким образом, были получены доказательства существования биферментных комплексов ГАФД с 3-ФГК и 2,3-ДФГМ в эритроцитах человека, причем комплексов очень прочных. В самом деле, промывание сефарозы буфером, содержащим 0,15 М и даже 0,3 М КаС1 не вызывало диссоциации комплекса. Мы предположили, что такая высокая прочность может быть обусловлена способом иммобилизации ГАФД. Чтобы проверить это предположение мы поставили опыт по связыванию эритроцитарной ГАФД, связанной с сефарозой через иммобилизованные антитела, и 3-ФГК, выделенной из скелетных мышц кролика. Комплекс ГАФД»антитела у нас оставался на сефарозе после элюции субстратами в вышеописанных экспериментах, концентрация связанной с антителами ГАФД составляла 0,080-0,090 мг на мл сефарозы. Для постановки эксперимента аликвоты суспензии сефарозы инкубировали в буфере, содержащем 30 мМ фосфат калия, 0,5 мМ ЭДТА, рН 8,0 с различными концентрациями киназы из мышц кролика и в присутствии 0,5 мМ 3-ФГА. После инкубации в супернатантах определяли концентрацию несвязавшегося белка. В качестве контроля использовали образцы, содержащие гель сефарозы с иммобилизованными антителами. По полученным результатам был построен график и рассчитана Кд комплекса, которая составила 0,49±0,11 мкМ. (см. рис 3). В нашей лаборатории

изучалось взаимодействие иммобилизованной обычным способом дегидрогеназы из эритроцитов человека и киназы из мышц кролика. Кд комплекса составила 9,8 мкМ. Таким образом, разница в прочности комплексов при разном способе иммобилизации ГАФД составляет 20 раз.

_Рис. 3. Взаимодействие эритроиитарной ГАФД, связанной с

сефарозой через иммобилизованные антитела, и 3-ФГК, очищенной из мыши кролика.

Сефарозу с адсорбировавшейся из гемолизата эритроцитов ГАФД инкубировали с различными концентрациями 3-ФГК из мышц кролика.

13-ФГКаза1„о6,мМ

Аналогичный опыт по связыванию мы провели и с фосфоглицератмутазой, очищенной из мышц кролика. Мы сочли возможным использовать мутазу из мышц кролика потому, что, как следует из литературных данных, 2,3-ДФГМазная и ФГМазная активности принадлежат одному и тому же белку, который в мышцах выполняет в основном ФГМазную функцию, а в эритроцитах - главным образом, 2,3-ДФГМазную. Фермент также обладает высокой степенью консервативности, и мутаза из мышц кролика и из эритроцитов очень похожи по своему составу [Rosa et al., 1975; Sasaki et al., 1976; Berrocal, Carreras, 1983]. Опыт был поставлен по той же схеме и выяснилось, что ФГМ из мышц кролика взаимодействует с эритроцитарной ГАФД с Кд=0,54±0,12 мкМ (см. рис. 4). Интересно, что Кд комплекса между очищенными из эритроцитов ГАФД и 2,3-ДФГМ, как написано выше, составляет 2,48±0,63 мкМ. Т.е. при иммобилизации ГАФД через антитела комплекс между ферментами из разных источников в 5 раз прочнее комплекса ферментов из одного источника.

Рис. 4. Взаимодействие эритроиитарной ГАФД, связанной с сефарозой через иммобилизованные антитела с ФГМ из мыши кролика.

Сефарозу с адсорбировавшейся из гемолизата эритроцитов человека ГАФД инкубировали с различными концентрациями ФГМ из мышц кролика. Кд комплекса равна 0,54±0,12 мкМ.

2

3 ,

I

I I

п

к J

в А

о •

г—-I

а

ГО

га

s

L_

е

о

0 12 3

[ФГМаза]своб> мкМ

На заключительном этапе мы изучали связывание между ФГМ и ГАФД, очищенными из мышц кролика. Препарат ГАФД из мышц кролика инкубировали с иммобилизованными антителами, затем сефарозу отмывали от несвязавшегося белка. В результате концентрация ГАФД на сефарозе составила 111 мкг на мл геля. Препарат иммобилизованных таким образом димеров инкубировали с растворимой ФГМ как описано выше и выяснилось, что два фермента образуют прочный комплекс (см рис. 5) с Кд = 0,18±0,10 мкМ.

Возможно в гемолизате эритроцитов присутствуют две популяции молекул ГАФД - свободная и связанная с мутазой или киназой. В обоих случаях есть равновесие между димерной и тетрамерной формами, причем, вероятно, присоединение к поверхности тетрамера дополнительных белков ослабляет взаимодействие между субъединицами ГАФД. Добавление в такую систему иммобилизованных антител, обладающих сродством к области междсубъединичных контактов ГАФД

приводит к тому, что димерные формы ГАФД (судя по конечным результатам, в основном в комплексе с киназой или мутазой) начинают связываться с антителами. В результате равновесие димер-тетрамер сдвигается в сторону образования димеров и новые порции их комплексов с функционально связанными ферментами сорбируются на иммобилизованных антителах. Возможно также, что взаимодействие

Рис. 5. Связывание ГАФД из мыши кролика, связанной с сефарозой через иммобилизованные антитела, и ФГМ из мыши кролика.

Растворимую ГАФД из мышц кролика инкубировали с иммобилизованными антителами к ГАФД, затем сефарозу отмывали от несвязавшегося белка. Препарат иммобилизованной таким способом ГАФД инкубировали с различными количествами растворимой мутазы из мыши кролика. Кд комплекса равна 0,18±0,10 мкМ.

[ФГМаза] сво6, мкМ

ГАФД с антителами делает ее комплексы с мутазой и киназой более прочными. Может быть, взаимодействие ГАФД с антителами моделирует взаимодействие ГАФД с другими структурными элементами, например с белком полосы 3.

6. Изучение биферментных комплексов ГАФД с 2,3-ДФГМ и 3-ФГК с помощью поперечно-сшивающих реагентов.

Чтобы получить более полное представление об образующихся в эритроцитах комплексах мы решили связать их при разных значениях рН непосредственно в гемолизатах с помощью сшивающих реагентов. В

нашей работе мы использовали метод "нулевой сшивки", предложенный Грабареком иГергели [вгаЬагек, Се^е1у, 1990].

Гемолизат эритроцитов разбавляли в 5 раз буфером для лизиса и инкубировали при рН 6,5 и 8,0 в присутствии сшивающих реагентов -растворимого карбодиимида (ЕБС), конечная концентрация 20 мМ и Ы-гидроксисукцинимида (ЫНБ), конечная концентрация 50 мМ. Инкубацию проводили в течение одного часа и останавливали реакцию добавлением меркаптоэтанола до конечной концентрации 0,02 М.

Далее гемолизат (10 мл) инкубировали с 2 мл уплотненного геля сефарозы с иммобилизованными антителами в течение часа. Затем гель отмывали от несвязавшегося белка. На следующем этапе с помощью буфера, содержащего 0,15 М ЫаС1, элюировали неспецифически связанные с антителами белки. Промывание 0,1 М глицином, рН 2,0, вызывало схождение с сефарозы сшитых с ГАФД белков. Наконец, промывание сефарозы разрушающей смесью для электрофореза, содержащей ДСН, вызывало элюцию антител с сефарозы.

Рис. 6. Электрофореграмма белков из гемолизата эритроцитов человека, которые, после инкубации со сшивающими реагентами, адсорбировались на иммобилизованных антителах к ГАФД.

1, 2 - белки, сошедшие с сефарозы после промывании 0,15 М ЫаС1 при рН инкубации, равном 8,0 (1) и 6,5 (2). 3 и 6 - белки-маркеры. 4, 5 - белки, сошедшие с сефарозы после промывания 0,1 М глицином, рН 2,0 в опыте при рН инкубации, равном 8,0 (4) и 6,5 (5). 7, 8 - белки, обнаруженные на сефарозе после ее инкубации с раствором, содержащим ДСН, в опытах, проведенных при рН, равном 8,0 (7) и 6,5 (8).

Г * .

' '1

1 *" М|* aav -205

1 ' .я» • «ш, -116

—' -97

f <** т -66

i „ * f 1 __ ш -55

ш »ш -36

123456 7 8

На рис. 6 представлена электрофореграмма опытов, проведенных при pH 6,5 и 8,0. 1 и 2 дорожки: белки, сошедшие с сефарозы после промывания ее 0,15 М NaCl в обоих опытах. Полосы на обеих дорожках соответствуют

мономеру ГАФД. 4 дорожка: белки, сошедшие с сефарозы после промывания ее 0,1 М глицином, рН 2,0 в опыте, проведенном при рН 8,0. При этом значении рН инкубации у нас образуется комплекс ГАФД и киназы. Следовательно, мы можем ожидать появления белковых полос с молекулярной массой, равной 36 кДа (мономер ГАФД), 43 кДа (молекула киназы), а также их комбинации. И, действительно, на дорожке присутствуют полосы, соответствующие мономеру ГАФД, киназы, димеру ГАФД. Далее следует полоска с молекулярной массой 119 кДа, которая может соответствовать димеру ГАФД и молекуле киназы. На 5 дорожке: белки, сошедшие с сефарозы после промывания ее 0,1 М глицином, рН 2,0 при рН инкубации 6,5, когда ГАФД образует комплекс с мутазой. Это значит, что молекулярная масса пептидных полосок будет равна 26 кДа (мономер мутазы), 36 кДа (мономер ГАФД) или их комбинациям. На дорожке мы видим полоски, соответствующие мономеру ГАФД, димеру мутазы, димеру ГАФД. Полоска с молекулярной массой 108 кДа, скорей всего представляет собой димер ГАФД и мономер мутазы. Примечательно, что в обоих случаях у нас отсутствуют тетрамеры ГАФД

1. Изучение концентрации некоторых гликолитических субстратов в ходе инкубации эритроцитов при рН 6,5; 7,4 и 8,0.

Итак, можно считать доказанным существование биферментных комплексов ГАФД с киназой и мутазой в эритроцитах человека и зависимость их образования от значения рН. Можно предположить, что инкубация эритроцитов при разных значениях рН будет влиять на накопление гликолитических субстратов и 2,3-ДФГ. При инкубации эритроцитов при рН 6,5 в них будет возрастать содержание 2,3-ДФГ, а при рН 8,0 - содержание 3-ФГ. Чтобы проверить это предположение, инкубировали эритроциты при рН, равном 6,5; и 8,0 при 37°С.

При постановке эксперимента мы воспользовались методикой изложенной в работе Jloy [Harrison et al., 1991]: 1 мл отмытых эритроцитов инкубировали с 1 мл буфера Рингера, рН = 6.5/8.0 в течение часа при 37°С. Затем добавляли 1 М НСЮ4 и проводили нейтрализацию. В лизатах определяли концентрацию 2,3-ДФГ и 3-ФГ, 3-ФГА. Концентрации субстратов определяли также в так называемой "нулевой точке" , в этом случае обработку хлорной кислотой проводили непосредственно после добавления к отмытым эритроцитам буфера Рингера. Всего было проведено 5 экспериментов.

Результаты всех экспериментов сведены в таб. 4.

Как видно из таблицы, результаты экспериментов подтверждают наше предположение - содержание 2,3-ДФГ в эритроцитах при инкубации при рН 6,5 возрастает в 1,5 раза, а при инкубации при рН 8,0 - практически не меняется. Накопление 3-ФГ при инкубации эритроцитов при рН 8,0

почти в два раза превышает его накопление при инкубации при 6,5. Нами было поставлено два опыта, когда эритроциты инкубировались при рН 7,4. Накопление 2,3-ДФГ составило 3,72 мМ, а накопление 3-ФГ - 0,66 мМ. Как видим, результаты инкубации при разных значениях рН подтверждают тот факт, что при рН 6,5 1,3-ДФГ более доступен для 2,3-ДФГМ, чем для киназы и наоборот.

Таблица 4.

Концентрации 2,3-дифосфоглицерата. 3-фосфоглицерата и 3-фосфоглицеринового альдегида в эритроцитах после инкубации в течение часа при 37 °С в присутствии глюкозы при рН 6.5 и 8.0.

2,3-ДФГ, мМ 3-ФГ, мМ глицеральдегид-3-фосфат, мМ

N "0" рН6,5 рН8,0 "0" рН6,5 рН8,0 "0" рН6,5 рН8,0

1 3,45 4,92 3,26 0,41 1,41 2,14 2,40 1,64 2,87

2 3,72 5,24 4,02 0,58 0,26 0,35 1,28 0,44 1,33

3 3,29 4,99 3,90 0,46 0,24 0,37 1,18 0,64 1,45

4 4,21 4,44 2,06 0,11 0,36 1,19 1.13 1.09 1.30

5 2.03 4.14 2.17 1.41 0.30 0.79 0.86 0.28 0.50

ср. 3.34± 4.75± 3.08± 0.59± 0.51+ 0.97± 1.3 7± 0.82± 1.49±

0.36 0.20 0.42 0.22 0.22 0.33 0.27 0.25 0.38

Чтобы доказать, что разница в накоплении вызвана именно образованием биферментных комплексов мы повторили опыт, но предварительно удалили из гемолизата эритроцитов биферментные комплексы с помощью моноклональных антител к ГАФД. Для этого после проведения лизиса эритроцитов к гемолизату добавляли иммобилизованные антитела из расчета 1 мл геля на 10 мл гемолизата и инкубировали в течение часа. С помощью стеклянного фильтра отделили гемолизат от сефарозы.

Результаты эксперимента, проведенного при рН 6,5, представлены на рис. 7. После часовой инкубации уровень 2,3-ДФГ в контрольной пробе вырос в 2 раза, а в опытной, после удаления из гемолизата комплекса ГАФД-мутаза уровень 2,3-ДФГ практически не меняется. Содержания 3-ФГ не меняется, ни в контрольной, ни в опытной пробе. Что касается эксперимента, поставленного при рН 8,0, то здесь ситуация иная. На рис. 8 видно, что удаление из гемолизата комплекса ГАФД*3-ФГК не влияет на содержание 2,3-ДФГ как в контрольной, так и в опытной пробе и препятствует накоплению 3-ФГ, содержание которого в контрольной пробе за это время возросло в два раза (рис. 9). Эти результаты показывают, что

отличие в накоплении гликолитических субстратов при разных значениях рН обусловлено именно рН-зависимым образованием биферментных комплексов ГАФД с 2,3-ДФГМ и 3-ФГК.

Рис. 7. Концентрации 2.3-ДФГ и 3-ФГ в эритроцитах после инкубации последних в присутствии глюкозы при рН 6,5.

2 мл гемолизата эритроцитов инкубировали с 3 мл уплотненного центрифугированием геля сефарозы с иммобилизованными антителами к ГАФД (контрольные пробы инкубировали с отмытой сефарозой) в течение часа при 4°С при рН 6,5. Затем сефарозу отделяли от гемолизата и последний инкубировали в присутствии глюкозы при рН 6,5. В указанные интервалы времени добавляли 0,5 мл 4 М НСЮ4. После нейтрализации рН лизаты фильтровали через бумажный фильтр и определяли в них концентрации субстратов. Концентрации 3-ФГ: 1 - контрольные пробы; 2 -пробы после инкубации с иммобилизованными антителами. Концентрации 2,3-ДФГ: 3 -контрольные пробы; 4 - пробы после инкубации с иммобилизованными антителами.

9

г 2

е

со 5

8

7

6

1

5

ц

0

0 10 20 30 40 50 60 70

минуты

Рис. 8. Концентрации 2,3-ДФГ в эритроцитах после инк\>бации в присутствии глюкозы при рН 8,0.

Экспериментальные условия описаны в подписи к рис. 8. Концентрации 2,3-ДФГ: 1 - контрольные пробы; 2 - пробы после инкубации с иммобилизованными антителами.

Рис. 9. Концентрации 3-ФГ в эритроцитах после инкубации последних в присутствии глюкозы при pH инкубации, равном 8,0. Экспериментальные условия описаны в подписи к рис. 8. Концентрации 3-ФГ: 1 - контрольные пробы; 2 - пробы после инкубации с иммобилизованными антителами.

т 20

30 40 минуты

Полученные в работе результаты свидетельствуют о том, что рН среды влияет на образование 2,3-ДФГ в эритроцитах человека и это влияние опосредуется через образование биферментных комплексов ГАФД с 3-ФГК и 2,3-ДФГМ.

2

ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что при рН 6,8 ГАФД и 2,3-ДФГМаза из эритроцитов человека образуют биферментный комплекс с Кд=2,48 мкМ, а при рН 7,8 ферменты практически не взаимодействуют друг с другом.

2. С помощью иммобилизованных моноклональных антител к ГАФД проведено извлечение биферментных комплексов из гемолизата эритроцитов человека. При рН 6,5 выделены комплексы ГАФД и 2,3-ДФГМазы; при рН 8,0 - комплексы ГАФД и 3-ФГКазы, а при рН 7,4 два типа комплексов - ГАФД и мутазы и ГАФД и киназы.

3. Показано, что ГАФД из эритроцитов человека, закрепленная на нерастворимом носителе с помощью иммобилизованных антител, при pH 6,5 образует комплекс с ФГМазой из мышц кролика с Кд=0,54 мкМ, а при pH 8,0 - комплекс с 3-ФГКазой из мышц кролика с Кд=0,49 мкМ.

4. Установлено, что использованные в работе моноклональные антитела (клон 6С5) взаимодействует с димерами ГАФД, но не связываются с тетрамерной формой фермента.

5. Показано, что инкубация эритроцитов при pH 6,5 повышает накопление 2,3-ДФГ в клетке, в то время как инкубация при pH, равном 8,0 увеличивает образование 3-фосфоглицерата, причем эти изменения могут быть устранены после удаления из гемолизата эритроцитов биферментных комплексов ГАФД с киназой и мутазой с помощью иммобилизованных антител.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Петечинской (Фокиной) К.В.

1. Muronetz, V.l., Dainyak, М.В., and Fokina, K.V. "Using of immobilized antibodies for isolation of enzyme complexes" Abstr. of 23 Meeting of FEBS, Basel, P. 134 (1995).

2. Fokina, K.V., Dainiak, M.B., Tcherbatova, N.A., and Muronetz, V.l. "The role played by specific interactions between enzymes involved in the synthesis and transformation of the 2,3-bisphosphoglycerate in the erythrocytes". Тезисы докладов на VI Международной конференции «Современные проблемы биохимии и молекулярной биологии. Наследие А.Н.Белозерского», с. 17 (1995)

3. Fokina, K.V., Dainyak, М.В., Nagradova, N.K., and Muronetz, V.l. " A study on the complexes between human erythrocyte enzymes participating in the conversions of 1,3-diphosphoglycerate" Arch.Biochem.Biophys., V. 345, P.185-192 (1997)

4. Муронец В.И., Шмальгаузен E.B., и Фокина K.B. "Роль глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и функционально-связанных с ней ферментов в регуляции гликолиза". Тезисы симпозиальных докладов Второго съезда Биохимического общества РАН, Москва, с. 8 (1997).

5. Дайняк М.Б., Григорьева Ю.А., Фокина К.В., и Муронец В.И. "Влияние антител, взаимодействующих с неактивными формами белков на их сворачивание". Тезисы стендовых сообщений Второго съезда Биохимического общества РАН, Москва, часть I, с. 22 (1997).