Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль антиоксидантной энзиматической системы в адаптации растений к условиям аноксии и постаноксической аэрации

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Роль антиоксидантной энзиматической системы в адаптации растений к условиям аноксии и постаноксической аэрации"

Санкт - Петербургский государственный университет

На правах рукописи

ЛАСТОЧКИН Виктор Валерьевич

Роль антиоксидантной энзима гической системы в адаптации растений к условиям аноксии и постаноксической аэрации

Специальность: 03.00.12 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Санкт - Петербург 2005

Работа выполнена на кафедре физиологии и биохимии растений биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Чиркова Тамара Васильевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Гринёва Галина Михайловна

доктор сельскохозяйственных наук, профессор Воробейков Геннадий Александрович

Ведущая организация: Воронежский государственный педагогический

университет

Защита состоится 2005 Г. в часов па

заседании диссертационного совета Д 212.232.07 по защите диссертаций на соискание учёной степени доктора биологических наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, Биолого-почвенный факультет СПбГУ, аудитория т.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке имени А.М.Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан

/

Учёный секретарь диссертационного совета

Е.И.Шарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Живые организмы постоянно испытывают на себе влияние различных факторов окружающей среды. Растения, в силу своего прикрепленного образа жизни, особенно подвержены этим воздействиям. Одним из широко распространенных неблагоприятных факторов является кислородная недостаточность, которая наблюдается при затоплении растений, образовании ледяной корки на поверхности почвы при выращивании озимых злаков, создании асфальтовых покрытий в городах и т.д. С гипоксическим или аноксическим воздействиями тесно связано влияние еще одного неблагоприятного фактора - окислительного стресса, который возникает сразу после действия кислородной недостаточности, когда растения вновь оказываются в условиях нормальной аэрации. В природе окислительный стресс - прямое следствие гипоксии и апоксии, поэтому устойчивые к кислородной недостаточности растения, по-видимому, должны обладать устойчивостью и к этому воздействию.

Для предотвращения действия окислительного стресса клетки растений располагают многоуровневой системой защиты от повреждающего действия активных форм кислорода (АФК). Важнейшей частью антиоксидантной системы являются ферменты, предотвращающие образование АФК или разрушающие их, основную роль среди которых выполняют пероксидазы. Функция их состоит в катализе окисления химических соединений за счёт кислорода перекиси водорода. В качестве субстратов используются также различные восстановители: фенольные соединения, аскорбиновая кислота, восстановленная форма глутатиона или сама перекись водорода. Пероксидазы в ходе катализа всегда превращают перекись водорода в воду. Осуществление этой функции чрезвычайно важно, особенно при стрессовых воздействиях, поскольку при стрессе образуется большое количество АФК.

В условиях гипо- и аноксии показано увеличение пероксидазной активности и появление новых изоформ пероксидаз (Рубин, Логинова, 1965;

Будилова и др., 1971; Чиркова, 1988). Увеличение активности псроксидазы связывают с необходимостью разрушения накапливающихся продуктов анаэробного обмена, в том числе и фенольных соединений. Кроме того, в анаэробных условиях пероксидаза способна катализировать образование молекулярного кислорода при разложении перекиси, что может иметь важное значение в адаптации к кислородной недостаточности.

При постаноксической аэрации было показано участие гваяколпероксидаз в процессе разложения пероксида водорода у проростков сои. Обнаружена активация фермента в апопласте, однако появления новых изоформ выявить не удалось (Amor et al., 2000). Вместе с тем, известны данные и о снижении активности гваяколпероксидазы в условиях аноксии (Lee, Lin, 1995).

Таким образом, в литературе имеются немногочисленные и неоднозначные данные о влиянии недостатка кислорода на активность гваяколпероксидазы. Что касается остальных пероксидаз, то изменение их активности в условиях аноксии и постаноксической аэрации не исследовалось. Кроме того, почти отсутствуют сведения об изменении изоферментного спектра пероксидаз в условиях окислительного стресса после действия анаэробиоза. Нет данных и по сопоставлению активности различных видов пероксидаз и продукции пероксида водорода у растений, контрастных по устойчивости к гипоксии.

Цель работы. Целью настоящей работы явилось изучение влияния анаэробиоза и последующей реаэрации на продукцию супероксид-апиона и пероксида водорода, а также на активность как цитоплазматических, так и связанных с клеточной стенкой ряда пероксидаз и каталазы, участвующих в разрушении различных пероксидов в проростках пшеницы и риса.

Задачи работы.

1. Определить продукцию супероксидного анион-радикала и пероксида водорода побегами и корнями проростков пшеницы и риса при аноксии и последующей аэрации.

2. Изучить действие аноксии и последующей аэрации на активность каталазы и гваяколпероксидазы в клеточных стенках и цитозоле растений пшеницы и риса.

3. Выяснить влияние анаэробиоза и последующей аэрации на активность аскорбат- и глутатионпероксидаз в проростках пшеницы и риса.

4. С помощью ингибиторов транскрипции, трансляции и везикулярного транспорта изучить возможный вклад этих процессов в изменение активности анализируемых ферментов в условиях аноксии и реаэрации у проростков пшеницы и риса.

5. Определить влияние аиоксического и окислительного стресса на изоферментный состав гваяколпероксидаз опытных растений.

6. Сопоставить активность различных форм каталазы и пероксидаз с возможностью детоксикации пероксида водорода и участием в работе антиоксидантной системы.

Научная новизна работы. Впервые проанализирована продукция основных АФК (супероксидного анион-радикала и пероксида водорода) у растений, различающихся по устойчивости, в условиях анаэробиоза и последующей аэрации. Рассмотрен комплекс цитоплазматических и апопластных форм антиоксидантиых ферментов в условиях аиоксии и реаэрации у растений, контрастных по уровню приспособления к недостатку кислорода. Проведено сопоставление продукции АФК и эффективности работы антиоксидантной энзиматической системы у растений, различающихся по устойчивости. Использование ингибиторного анализа и электрофоретического разделения пероксидаз позволило предположить о связи активации антиоксидантных ферментов с синтезом de novo ряда их изозимов. Полученные данные позволяют заключить, что растение, устойчивое к дефициту кислорода благодаря эффективно работающей антиоксидантной системе, способно лучше противостоять и окислительному стрессу при выходе растения из анаэробной среды в условия аэрации.

Практическая значимость. Изучение адаптационных механизмов к кислородной недостаточности и окислительному стрессу необходимо для разработки способов выращивания растений на затопляемых почвах, приёмов защиты от повреждения или повышения устойчивости растений, введения в культуру приспособленных к недостатку кислорода растений. Более глубокое представление о механизмах адаптации важно для создания тестовых систем для селекционного отбора устойчивых к затоплению видов и сортов растений, для программирования урожая различающихся по устойчивости к кислородному дефициту растений. Полученные результаты могут быть также использованы как в лекционных курсах, так и практикумах по экологической физиологии растений.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены па 11 (Варна, Болгария, 1998) и 13 конгрессе FESPP (Херсонес, Греция, 2002), XIX (Йоэнсу, Финляндия, 1999) и XX конгрессе SPPS (Ророс, Норвегия, 2001), IV (Москва, 1999) и V съезде физиологов растений (Пенза, 2003), всероссийской молодежной научной конференции "Растение и почва. Проблемы агрохимии, агрофизики и фитофизиологии" (Санкт-Петербург, 1999), VII и VIII молодежных конференциях ботаников в Санкт-Петербурге (2000, 2004), международном симпозиуме "Plant and Stress" (Москва, 2001), международной научной конференции "Проблемы физиологии растений Севера" (Петрозаводск, 2004) и на заседании секции "физиология растений" Русского ботанического общества (Санкт-Петербург, 2005).

Положения, выносимые на защиту.

• Меньшая интенсивность продукции АФК у растений, контрастных по устойчивости к кислородной недостаточности, в условиях аноксии и постаноксической аэрации находится в прямой зависимости от эффективности работы аптиоксидантной системы.

• Отсутствие накопления АФК у устойчивого к гипоксии растения связано с активацией апопластных форм антиоксидантных

ферментов, обеспечивающих детоксикацию АФК вне клетки, препятствуя тем самым их проникновению в цитоплазму.

• Растение, устойчивое к кислородной недостаточности, обладает способностью противостоять и окислительному стрессу, возникающему при выходе растения из анаэробной среды в условия аэрации.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 4 статьи и 11 тезисов докладов на междунарождных и национальных конференциях.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, изложения результатов, обсуждения, выводов. Список литературы содержит 145 названий, в том числе 115 на английском языке. Текст диссертации изложен па 128 страницах, содержит 21 рисунок.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Исследования выполняли на 7-дневных проростках пшеницы, которую использовали в качестве неустойчивого растения и 10-днсвных проростках риса, которые являлись устойчивым растением. Растения выращивали в гидропонной культуре. Анаэробные условия создавали путём помещения растений в герметичные камеры, через которые пропускали газообразный азот. Продукцию супероксидного анион-радикала определяли спектрофогометрически по превращению адреналина в адренохром (Misra, Fiidovich, 1972), тогда как о продукции Н2О2 судили спектрофотометрически при помощи ксиленового оранжевого (Gay et al., 1999). Для получения ферментов из клеточной стенки растительный материал в течение 20 мин подвергали вакуум-инфильтрации 0,05 М MES-буфером (рН 6,0), содержавшим 1 М NaCl, а затем центрифугировали над сеточкой при 1100 g в течение 15 мин (Otter, Polle, 1997). Возможность загрязнения выделяемой апопластной фракции цитоплазмой контролировали определением

активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеиазы (маркерного фермента цитоплазмы). Во всех рассмотренных вариантах она не превышала 0,5% от активности фермента в цитоплазме.

Оставшуюся растительную ткань использовали для экстракции цитоплазматических форм ферментов. Активность гваяколпероксидазы измеряли по накоплению тетрагваякола (Maehly, 1955). Активность каталазы определяли по разрушению пероксида водорода (АсЫ, 1983). Аскорбатпероксидазы анализировали по окислению aскорбата методом Асады (Nakano, Asada, 1981). Активность глутатионнероксидазы регистрировали в сопряжённой с глутатионредуктазой реакции по окислению ПАДФП (Tappel, 1978). Активность ферментов рассчитывали в микромолях окисляемого субстрата на 1 г сырой массы в минуту. При расчёте активности всегда учитывали вклад автоокисления субстратов пероксидом водорода. Электрофорез гваяколпероксидазы был проведён в 7,5% поли-акриламидпом геле согласно Дэвису (Davies, 1964).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Супероксидный анион-радикал. Результаты анализа показали, что исходный уровень его продукции у риса был выше, чем у пшеницы. Однако его образование у риса, в отличие от пшеницы, менялось во время экспозиции в условиях аноксии и последующей аэрации в меньшей мере.

Пероксид водорода. Поскольку в процессе одноэлектрошюю восстановления супероксидного анион-радикала супероксиддис-мутазой (СОД) он превращается в пероксид водорода, было рассмотрено влияние аноксии и постаноксичсской аэрации на продукцию пероксида водорода в побегах и корнях проростков пшеницы и риса. Оказалось, что исходный уровень продукции пероксида у риса, так же как и супероксидпого анион-радикала, был выше, чем у пшеницы (рис. 1) У проростков пшеницы аноксия не приводила к существенному изменению в содержании пероксида водорода (рис. 1). У риса же, аноксическое воздействие значительно снижало уровень

Побег Корень Побег Корень

пшеница рис

Рис. 1. Влияние 72 ч аноксии и последующей аэрации на продукцию пероксида водорода в проростках пшеницы и риса.

продукции. Во время реоксигенации у обоих растений образование пероксида водорода усиливалось и было особенно значительными побегах и корнях пшеницы, в то время как у риса оно лишь несколько превышало контрольные значения (рис. 1).

Сопоставляя результаты определения продукции супероксидного анион-радикала и пероксида водорода, можно заключить, что изменения в уровне обеих АФК у растений, различающихся по устойчивости, были сходными. Однако, несмотря па более высокое содержание и супероксидного анион-радикала, и Н2О2 у риса, по сравнению с пшеницей, значительного накопления этих АФК при реаэрации у него не происходило. Полученные данные могут свидетельствовать о более эффективной работе у риса как систем продукции АФК, так и антиоксидантной системы, в частности каталазы и пероксидаз, участвующих в распаде пероксида водорода.

Каталаза. Этот фермент не нуждается в дополнительных субстратах и окисляет Н2О2 за счёт другой молекулы пероксида водорода. Каталаза широко распространена в цитоплазме клеток, однако нет однозначного суждения о её локализации в апопласте клеток. Учитывая это, мы использовали салициловую кислоту (ингибитор каталазы) и показали наличие каталазной активности в апопласте клеток, которая почти полностью подавлялась салициловой кислотой.

Активность апопластной каталазы в побегах и корнях проростков пшеницы почти не отличалась от таковой в проростках риса л была довольно низкой (рис. 2). После 72 ч действия кислородной недостаточности наблюдалось снижение активности фермента в проростках пшеницы, особенно заметное в корнях. У риса, наоборот, наблюдалась сё активация, которая особенно усиливалась при возвращении в аэробные условия. У пшеницы реаэрация ещё более усугубляла ингибирование каталазы в клеточной стенке (рис. 2).

пшеница

Рис. 2. Влияние 72 ч и последующей аэрации на активность каталазы апопласта (вверху) и цитоплазмы (внизу) в проростках пшеницы и риса.

Исходная активность каталазы в цитоплазме у пшеницы и риса не различались (рис. 2). У пшеницы после 72 ч апоксии и последующей аэрации её активность несколько снижалась. У риса же, напротив, происходила активация каталазы в цитоплазме во время анаэробного воздействия, которая сохранялась в течение всего периода реаэрации (рис. 2).

Использование ингибиторов транскрипции (актиномицин D), трансляции (циклогексимид) и везикулярной секреции (брефельдин А)

показало значительное снижение активности каталазы в апопласте клеток побегов и корней риса.

Таким образом, у неустойчивого растения не происходило активации каталазы в апопласте и в цитоплазме, а у риса активность каталазы возрастала, особенно интенсивно в апопласте при реаэрации. Это хорошо коррелирует с отсутствием накопления у риса пероксида и указывает на возможную антиоксидаитную роль этого фермента. Результаты использования ингибиторов позволяют предположить, что возрастание активности связано с усилением экспрессии генов, белковым синтезом и везикулярной секрецией каталазы в апопласт.

Аскорбатпероксидаза. Среди антиоксидантпых ферментов каталаза отличается низким сродством к перекиси водорода. Поэтому были рассмотрены более аффинные к этой АФК ферменты. Аскорбатпероксидаза представляет собой важнейший антиоксидантный фермент, осуществляющий разрушение пероксида водорода за счёт окисления им аскорбиновой кислоты. Особенностью данного фермента является наличие в его активном центре цистеина. Это позволяет вычленить долю активности данного фермента при использовании ингибиторов SIl-фсрментов. В наших экспериментах парахлормеркурийбензойиая кислота существенно подавляла аскорбатпероксидазную активность, а гваяколпероксидаза, также способная окислять аскорбат, не ипактивировалась в присутствии этого ингибитора. Эти данные позволяют предполагать, что доля собственно аскорбатпероксидазы в пероксид-зависимом окислении аскорбата в наших опытах была значительной.

Исследования активности аскорбатпероксидазы показали, что исходный уровень активности фермента мало различался у пшеницы и риса (рис. 3). Действие апоксии и последующей аэрации приводило к снижению активности этого фермента в проростках пшеницы, тогда как у риса его активность не изменялась (рис. 3).

Побег Корень Побег Корень

пшеница рис

Рис. 3. Влияние 72 ч аноксии и последующей аэрации на активность аскорбат- и глутатионпероксидаз в проростках растений

Глутатионпероксидаза. Этот фермент представляет собой антиоксидантный энзим, осуществляющий детоксикацию гидропероксидов жирных кислот или перекиси водорода за счёт окисления глутатиона. Исходный уровень активности этого фермента был одинаков у пшеницы и риса в побегах (рис. 3). Динамика изменения активности фермента в растениях пшеницы и риса, была такой же, как и в случае с аскорбатпероксидазой, только ингибирование фермента у пшеницы после 72 ч аноксии и последующей аэрации было полным (рис. 3). Использование ингибиторов транскрипции и трансляции показало возможность синтеза фермента de novo для поддержания активности в проростках риса как во время анаэробиоза, так и после него.

Таким образом, у неустойчивого растения длительное анаэробное воздействие и дальнейший окислительный стресс приводили к существенному подавлению активности главных внутриклеточных

антиоксидантных пероксидаз, тогда как у устойчивого их активность поддерживалось на постоянном контрольном уровне. Следует отмстить, что в случае глутатионпероксидазы, это поддержание, возможно, происходило за счет синтеза белка.

Гваяколпероксидаза. Одной из самых распространённых и активно работающих пероксидаз является гваяколпероксидаза, основными функциями которой считали участие в ростовых процессах, а также в фенольном обмене растений. Этот фермент до последнего времени не рассматривался как компонент антиоксидантной защиты. Тем не менее, в нашей работе получены данные об его антиоксидантиой роли, Лпопласшая форма фермента у обоих растений была менее активна, чем внутриклеточная. Аноксия приводила к снижению интенсивности её работы в проростках пшеницы, тогда как у риса она не только поддерживалась па контрольном уровне, но даже возрастала в корнях (рис. 4). Во время постаноксического

пшеница

Рис. 4. Влияние 72 ч аноксии и последующей аэрации на активность гваякол-пероксидазы апопласта (вверху) и цитоплазмы (внизу) в проростках растений.

окислительного счрссса происходила активация гваяколпероксидазы в апопласте обоих растений, но у пшеницы гораздо слабее, чем у риса (рис. 4).

В результате действия анаэробиоза активность цитоплазматической формы фермента понижалась в проростках обоих растений (рис. 4). При реаэрации она возрастала, причём сильнее в побегах, чем в корнях (рис. 4). Весьма любопытно, что после длительной аноксии активация внутриклеточной пероксидазы у устойчивого растения была сопоставима или даже превосходила таковую у неустойчивого растения, тогда как краткосрочное анаэробное воздействие вызывало значительное повышение активности фермента только у пшеницы.

Активация гваяколпероксидаз апопласта проростков риса в условиях реоксигенации снималась в результате действия циклогсксимида, брефельдина А и, в меньшей степени, актиномицина D. Внутриклеточный фермент, наоборот больше подавлялся актиномицином, особенно в побегах. В проростках пшеницы только использование брефельдина А оказалось эффективным в снижении активности пероксидазы клеточных стенок.

Электрофорез гваяколпероксидаз. Полученные данные о возможности de now синтеза ферментов у устойчивого растения могли свидетельствовать или о появлении новых изоформ или об усилении синтеза уже имеющихся. Для выяснения ответа на этот вопрос был проведён электрофорез гваяколпероксидаз в полиакриламидном геле, данные которого показали, что у пшеницы и при анаэробиозе, и при реаэрации наблюдалась тенденция к снижению активности всех изоформ, количество которых оставалось неизменным. У риса же под действием реоксигенации было обнаружено появление новой изоформы пероксидазы в клеточной стенке (рис. 5). Накопление этого изофермента в апопласте блокировалось всеми тремя использованными ингибиторами, однако, в большей степени это было заметно при действии циклогексимида и брефельдина А (рис. 5).

Таким образом, при анаэробиозе и особенно при постаноксии активность гваяколпероксидазы возрастала главным образом в апопласте у

Новая изоформа

Рис. 5. Влияние реаэрации после 12 часов анаэробиоза на изоферментный состав пероксидаз апопласта в побегах проростков риса.

К - аэрация, 1 - реаэрация, 2 - действие актиномицина, 3 - действие циклогексимида, 4 - действие брефельдина.

К 1 2 3 4 1 2 3 4 1 час 24 часа

устойчтивого растения. Не исключено, что увеличение активности связано, с синтезом белка гваяколпероксидазы de novo а цитоплазме и последующим его везикулярным транспортом в апопласт. Эта реакция, по всей вероятности вызвана тем, что устойчивое растение не только сохраняет рост побега в условиях кислородной недостаточности, по и осуществляет детоксикацию пероксида водорода в апопласте клеток.

Предполагается, что у устойчивого растения активация гваяколпероксидазы и каталазы в апопласте в условиях апоксии и постаноксической аэрации является адаптивным механизмом, необходимым для разрушения пероксида водорода в клеточной стенке, что препятствует проникновению его в цитозоль. В цитоплазме риса детоксикации АФК может способствовать повышение активности каталазы и поддержание активности аскорбат- и глутатионпероксидазы. У пшеницы, в отличие от риса слабая активация ферментов антиоксидантной защиты в клеточной стенке, по-видимому, благоприятствует накоплению АФК и открывает им доступ в цитоплазму клеток, где в их обезвреживании участвуют цитоплазматические пероксидазы. Однако такая дстоксикация была, вероятно, недостаточной, поскольку происходила довольно быстрая инактивация ферментов в

цитоплазме, а накапливающиеся АФК способствовали дестабилизации мембран, разрушению клеточных компонентов и быстрой гибели растения.

Следовательно, адаптационные механизмы, позволяющие растениям приспосабливаться к недостатку кислорода, включают в себя не только устойчивость к собственно гипо- и аноксии, но и к последующему окислительному стрессу. Значительный вклад в эти механизмы у устойчивых растений вносит интенсивно работающий комплекс антиоксидантиых ферментов.

ВЫВОДЫ.

1. Показано, что под влиянием аноксии и последующей аэрации происходило усиление продукции супероксид-аниона и пероксида водорода только у неустойчивого к гипоксии растения пшеницы, в отличие от устойчивого риса.

2. Под влиянием аноксии и последующей аэрации наблюдалось повышение активности гваяколпероксидазы и каталазы в апопласте и цитоплазме устойчивого растения. Возрастанию активности гваяколпероксидазы сопутствовало появление новых изоформ.

3. У неустойчивого растения пшеницы при аноксии и реаэрации существенной стимуляции гваяколпероксидазы и каталазы не происходило. Новые изоформы гваяколпероксидазы не были обнаружены.

4. При длительных сроках аноксии и последующей реаэрации активность цитоплазматических ферментов аскорбатпероксидазы и глутатионпероксидазы в проростках риса не менялась, в то время как у пшеницы при этом наблюдалась значительная инактивация этих ферментов.

5. При обработке растений ингибиторами синтеза белка на уровне транскрипции (актиномицином D) и трансляции (циклогексимидом) происходило торможение активности каталазы и гваяколпероксидазы

у риса, в то время как у пшеницы влияние ингибиторов не проявлялось. Активность глутатиоппероксидазы тормозилась и у пшеницы, и у риса при действии обоих ингибиторов. Влияния ингибиторов на активность аскорбатпероксидазы в условиях опыта обнаружено не было. Блокатор везикулярного транспорта брефельдин А снижал активность апопластных форм гваяколпероксидазы и каталазы.

6. Полученные результаты позволяют заключить, что у риса, в отличие от пшеницы, отсутствие накопления супероксидного анион-радикала и пероксида водорода при апоксии и постаноксичсской аэрации обеспечивается эффективной работой аптиоксидантной ферментной защитной системы.

7. Растение, устойчивое к кислородной недостаточности, способно лучше противостоять также и окислительному стрессу, возникающему при выходе растения из анаэробной среды в условия аэрации.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Yemelyanov V., Zhukova Т., Laslochkin V., Kirchikhina N., Chirkova Т. Peroxidase activity in wheat and rice seedlings under anaerobiosis. // Bulgarian Journal of Plant Physiology. 1998. Special issue. (Abstracts of the lllh FESPP Congress, 7-11 September, 1998, Varna, Bulgaria) - P.290.

2. Ласточкин В.В. Влияние аноксии на рост и активность пероксидазы в проростках злаков. // Труды победителей конкурса грантов 1998 года для студентов, аспирантов и молодых ученых Санкт-Петербурга. Направление «Биология».- СПб НИИХ СПбГУ, 1998.- С 132-133.

3. Yemelyanov V., Kirchikhina N., Lastochkin V., Chirkova Т. Plant growth and hormones under the lack of oxygen. // Abstracts of XIX Congress of Scandinavian Society for Plant Physiology, 21-23 June, 1999, Joensuu, Finland. - P. 127.

4. Емельянов В.В., Ласточкин В.В., Жукова Т.М., Чиркова Т.В. Влияние аноксии на активность пероксидазы в проростках пшеницы и риса. // Тезисы докладов IV Съезда общества физиологов растений России "Физиология растений - наука III тысячелетия" Т. 1. 4-9 Октября 1999, Москва. -С.356-357.

5. Ласточкин В.В., Емельянов В.В. Влияние аноксии и постаноксической аэрации на активность пероксидазы в проростках пшеницы и риса. // Тезисы докладов Всероссийской молодежной научной конференции

"Растение и почва. Проблемы агрохимии, агрофизики и фитофизиологии" 6-10 Декабря 1999, Санкт-Петербург. - С.136-137.

6. Ласточкин В.В. Пероксидаза как фермент антиоксидантной защиты растений при аноксии и постаноксическом воздействии. // Тезисы VII Молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге, 15-19 мая 2000, Санкт-Петербург. -СПб., 2000, С. 128

7. Ласточкин В.В., Емельянов В.В., Чиркова Т.В. Активность пероксидазы в проростках пшеницы и риса в связи с воздействием аноксии. // Вестник С.-Петербург. Ун-та. Сср.3.2000. Вып.З. (№ 19). С.59-64.

8. Yemelyanov V., Lastochkin V., Chirkova Т. The role of pcroxidasc in plant adaptation to anaerobiosis and post-anoxic aeration. // Abstracts of XX Congress of Scandinavian Society for Plant Physiology, 18-20 June 2001, Roros, Norway. - P.54.

9. Lastochkin V.V., Yemelyanov V.V., Chirkova T.V. About possible participation of guaiacol-peroxidases in detoxification of reactive oxygen species under the anaerobiosis and the post-anoxic aeration. // Abstracts of International Symposium "Plant and Stress", 23-28 October 2001, Moscow, Institute of Plant Physiology, Russia. - P. 159-160.

10.Yemelyanov V.V., Lastochkin V.V., Chirkova T.V. Peroxidases of wheat and rice seedlings under anoxia and post-anoxic aeration. // Abstracts of the 13lh FESPP Congress, 2-6 September 2002, Hersonissos, Hcraklion, Crete, Gieece. -P.743.

11Ласточкин В.В., Емельянов В.В., Чиркова Т.В. Участие пероксидаз в адаптации растений к анаэробиозу и постаноксической аэрации. // Тезисы докладов V Съезда общества физиологов растений России, 15-21 сентября 2003, Пенза.-С. 296-297.

12.Емельянов В.В., Кирчихина H.A., Ласточкин В.В., Чиркова Т.В. Гормональный баланс проростков пшеницы и риса в условиях аноксии. // Физиол. раст. - 2003. Т.50 (№6) С.922-929.

13.Ласточкин В.В., Емельянов В.В., Чиркова Т.В. Участие пероксидазы в антиоксидантной системе при адаптации растений к аноксии и постаноксической аэрации. // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов. Выпуск 5. / под ред. Л.В. Кобелевой -Воронеж: Центрально-черноземное книжное издательство, 2003, С. 163-

14.Ласточкин В.В., Емельянов В.В. Участие гваяколпероксидазы, каталазы и аскорбатпероксидазы в адаптации растений к аноксии и постаноксической аэрации. // Тезисы VIII Молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге. 17-21 Мая 2004. - С. 128.

15.Ласточкин В.В., Емельянов В.В., Чиркова Т.В. Роль различных пероксидаз в адаптации растений к аноксии и постаноксической аэрации. // Тезисы докладов Международной научной конференции "Проблемы физиологии растений Севера", 15-18 Июня 2004, Петрозаводск. - СИЗ .

169.

Подписано в печать 04.04.05. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л.0.93. Тираж 150 экз.Заказ №11.

ЦОП типографии Издательства СПбГУ. 199061, С-Петербург, Средний пр., 41.

í i;;

* „

2 2 AÎ1P 2005

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ласточкин, Виктор Валерьевич

с СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1.Устойчивость растений к недостатку или отсутствию кислорода.

2.1.1.Морфолого-анатомические приспособления к корневой гипоксии.

2.1.2.Метаболические приспособления к гипо- и аноксии.

2.2. Активные формы кислорода.

2.2.1.Особенности активных форм кислорода и пути их образования.

2.2.2. Биологическое значение активных форм кислорода.

2.2.3.Активные формы кислорода в условиях аноксии и постаноксической аэрации.

2.3.Механизмы защиты от активных форм кислорода у растений.

2.3.1.Способы снижения образования активных форм кислорода.

2.3.2.Системы антиоксидантной защиты.

2.3.2.1.Неферментативная антиоксидантная система.

2.3.2.2.Роль антиоксидантов при аноксии и постаноксической аэрации.

2.3.3.Ферментативная антиоксидантная система.

2.3.3.1.Супероксиддисмутаза.

4 2.3.3.2.Каталаза.

2.3.3.3.Пероксидазы: структура, локализация, функции.

2.3.3.4.Роль пероксидаз в стрессовых реакциях.

2.3.3.5.Антиоксидантные ферментные системы при кислородной недостаточности и окислительном стрессе.

3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1.Растительный материал.

3.2.Определение продукции супероксидного анион-радикала.

З.З.Определение продукции пероксида водорода.

3.4. Получение гваяколпероксидазы и каталазы клеточной стенки.

3.5.Экстракция цитоплазматической гваяколпероксидазы и каталазы.

З.б.Определение активности каталазы.

3.7. Экстракция и определение активности аскорбат-пероксидазы.

3.8. Экстракция и определение активности глутатион-пероксидазы.

3.9.Определение активности гваяколпероксидазы.

3.10.Определение изоферментного состава пероксидаз.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

А 4.1.Влияние аноксии и последующей реаэрации на содержание супероксидного анион-радикала в тканях растений.

4.2.Влияние аноксии и последующей аэрации на содержание пероксида водорода в тканях растений.

4.3.Влияние аноксии и последующей аэрации на активность каталазы в клеточной стенке и цитоплазме растений.

4.4.Влияние аноксии и последующей аэрации на активность аскорбатпероксидазы в тканях растений.

4.5.Влияние аноксии и постаноксической аэрации на

Ф активность глутатионпероксидазы в тканях растений.

4.6.Влияние анаэробиоза и постаноксической аэрации на активность гваяколпероксидазы в клеточной стенке и цитоплазме растений.

4.7.Действие ингибиторов на активность каталазы и различных пероксидаз.

4.8.Влияние аноксии и постаноксической аэрации на изоферментный состав гваякол пероксидаз.

5. ОБСУЖДЕНИЕ.

6. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль антиоксидантной энзиматической системы в адаптации растений к условиям аноксии и постаноксической аэрации"

Живые организмы постоянно испытывают на себе влияние различных факторов окружающей среды. Растения, в силу своего прикрепленного образа жизни, особенно подвержены этим воздействиям. Одним из широко распространенных неблагоприятных факторов является кислородная недостаточность, которая наблюдается при затоплении растений, образовании ледяной корки на поверхности почвы при выращивании озимых злаков, создании асфальтовых покрытий в городах и т.д. С гипоксическим или аноксическим воздействиями тесно связано влияние еще одного неблагоприятного фактора - окислительного стресса, который возникает сразу после действия кислородной недостаточности, когда растения вновь оказываются в условиях нормальной аэрации. В природе окислительный стресс - прямое следствие гипоксии и аноксии, поэтому устойчивые к кислородной недостаточности растения, по-видимому, должны обладать устойчивостью и к этому воздействию.

Постоянное или временное переувлажнение характерно для многих регионов Земли, и в том числе для Северо-Запада России. Подобные условия способствуют возникновению кислородной недостаточности, при этом ограничивается жизнедеятельность представителей дикой флоры и создаются трудности для возделывания сельскохозяйственных культур. Поэтому изучение путей адаптации растений к кислородной недостаточности и последующей реаэрации представляет большой интерес и имеет значительную практическую ценность.

У большинства растений отсутствие кислорода вызывает остановку роста, что характерно, например, для пшеницы. Тем не менее, существуют растения, способные произрастать не только в обедненной кислородом среде, но даже при его полном отсутствии. В первую очередь это гидро- и гигрофитные виды. Многочисленные исследования, направленные на изучение этого феномена, показали, что подобные растения обладают рядом морфолого-анатомических и физиолого-биохимических приспособлений, затрагивающих главным образом дыхательный метаболизм и энергетику клетки (Чиркова, 1988). К адаптивным реакциям этих растений относится синтез аноксических стрессовых белков и перестройки в структуре и функциях мембранных компонентов (Чиркова, 1988). У устойчивых к гипоксии растений может происходить удлинение побегов, в то время как рост корней обычно тормозится. Так, например, при постоянно сменяющихся условиях гипоксии и реаэрации растет рис (Drew, 1997).

В литературе известно большое количество работ, посвящённых проблеме окислительного стресса у животных объектов. Это связано с тем, что активные формы кислорода (АФК) в клетках животных участвуют в таких процессах как фагоцитоз, бактерицидные эффекты, различные виды патогенеза при ишемической болезни сердца, лучевом поражении, катаракте, воспалительных процессах и многих других болезнях. Известно, что АФК, образующиеся в период реоксигенации, принимают участие в механизмах программируемой смерти клетки у животных, растений и микроорганизмов (Levine et al.,1996). У растений же этой проблеме до недавнего времени уделялось недостаточное внимание, хотя роль АФК в их мембранных структурах очень велика (Мерзляк, 1989). Влияние реоксигенации на клетки растений после выдерживания их в условиях гипо- и аноксии рассмотрено лишь в нескольких работах (Monk et al., 1987; Van Toai et al.,1991, Biemelt et al., 1998).

Первым шагом в образовании АФК является генерация супероксид-аниона 02*~, который представляет собой начальный компонент окислительного каскада. Образующийся супероксид, при помощи супероксиддисмутазы переводится в пероксид водорода (НгОг), который в настоящее время рассматривается и как компонент сигнальной трансдукции. Однако, вместе с тем, это соединение запускает перекисное окисление липидов, нарушает стабильность мембран, т.е., оказывает повреждающее воздействие на клетку.

Клетки растений располагают многоуровневой системой защиты от повреждающего действия АФК. К ней относятся ферментные системы, предотвращающие образование супероксид-аниона, а также антиоксидантные системы, убирающие продукты одноэлектронного восстановления кислорода. К этой группе помимо супероксиддисмутазы относят каталазу, а также различные виды пероксидаз, среди которых выделяют аскорбат-, глутатион- и гваяколпероксидазы. Гваяколпероксидаза связана с фенольным обменом в клетках растений и способствует функционированию таких процессов как, например, лигнификация клеточной стенки. Аскорбат- и глутатионпероксидазы входят в состав антиоксидантных систем клеток и играют важную роль в разрушении Н202. Таким образом, растительные пероксидазы входят в антиоксидантную систему растений, и, кроме того, гваяколпероксидазы связаны с ростовыми процессами. Исследование антиоксидантных систем при переходе растений от гипо- или аноксии к нормальной аэрации проводились в немногих работах (Чиркова, 1988; Blokhina et al., 2001; Biemelt et al., 1998 и некоторых другие).

Итак, взаимодействие аноксии и окислительного стресса, а также особенности функционирования комплекса защитных антиоксидантных систем у растений, различающихся по устойчивости к недостатку кислорода, остаются почти не исследованными. Поэтому, целью настоящей работы явилось изучение влияния анаэробиоза и последующей реаэрации на продукцию некоторых АФК (супероксид-аниона и пероксида водорода), а также на активность как цитоплазматических, так и связанных с клеточной стенкой ряда пероксидаз и каталазы, участвующих в разрушении различных пероксидов в проростках пшеницы и риса.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие задачи:

1. Определить продукцию супероксидного анион-радикала и пероксида водорода побегами и корнями проростков пшеницы и риса при аноксии и последующей аэрации.

2. Изучить действие аноксии и последующей аэрации на активность каталазы и гваяколпероксидазы в клеточных стенках и цитозоле растений пшеницы и риса.

3. Выяснить влияние анаэробиоза и последующей аэрации на активность аскорбат- и глутатионпероксидаз в проростках пшеницы и риса.

4. С помощью ингибиторов транскрипции, трансляции и везикулярного транспорта изучить возможный вклад этих процессов в изменение активности анализируемых ферментов в условиях аноксии и реаэрации у проростков

• пшеницы и риса.

5. Определить влияние аноксического и окислительного стресса на изоферментный состав гваяколпероксидаз опытных растений.

6. Сопоставить активность различных форм каталазы и пероксидаз с возможностью детоксикации пероксида водорода и участием в работе антиоксидантной системы.

Научная новизна.

19 Впервые проанализирована продукция основных АФК супероксидного анион-радикала и пероксида водорода) у растений, различающихся по устойчивости, в условиях анаэробиоза и последующей аэрации. Рассмотрен комплекс цитоплазматических и апопластных форм антиоксидантных ферментов в условиях аноксии и реаэрации у растений, контрастных по уровню приспособления к недостатку кислорода. Проведено сопоставление продукции АФК и эффективности работы антиоксидантной энзиматической системы у растений, различающихся по устойчивости. Использование ингибиторного анализа и электрофоретического разделения пероксидаз позволило предположить о связи активации антиоксидантных ферментов с синтезом de novo ряда их изозимов. Полученные данные позволяют заключить, что растение, устойчивое к дефициту кислорода благодаря эффективно работающей антиоксидантной системе, способно лучше противостоять и окислительному стрессу при выходе растения из анаэробной среды в условия аэрации.

Практическая значимость.

Изучение адаптационных механизмов к кислородной недостаточности и окислительному стрессу необходимо для разработки способов выращивания растений на затопляемых почвах, приёмов защиты от повреждения или повышения устойчивости растений, введения в культуру приспособленных к недостатку кислорода растений. Более глубокое представление о механизмах адаптации важно для создания тестовых систем для селекционного отбора устойчивых к затоплению видов и сортов растений, для программирования урожая различающихся по устойчивости к кислородному дефициту растений. Полученные результаты могут быть также использованы как в лекционных курсах, так и практикумах по экологической физиологии растений.

Положения, выносимые на защиту.

• Меньшая интенсивность продукции АФК у растений, контрастных по устойчивости к кислородной недостаточности, в условиях аноксии и постаноксической аэрации находится в прямой зависимости от эффективности работы антиоксидантной системы.

• Отсутствие накопления АФК у устойчивого к гипоксии растения связано с активацией апопластных форм антиоксидантных ферментов, обеспечивающих детоксикацию АФК вне клетки, препятствуя тем самым их проникновению в цитоплазму.

• Растение, устойчивое к кислородной недостаточности обладает способностью противостоять и окислительному стрессу, возникающему при выходе растения из анаэробной среды в условия аэрации.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Ласточкин, Виктор Валерьевич

6. выводы.

1. Показано, что под влиянием аноксии и последующей аэрации происходило усиление продукции супероксид-аниона и пероксида водорода только у неустойчивого к гипоксии растения пшеницы, в отличие от устойчивого риса.

2. Под влиянием аноксии и последующей аэрации наблюдалось повышение активности гваяколпероксидазы и каталазы в апопласте и цитоплазме устойчивого растения. Возрастанию активности гваяколпероксидазы сопутствовало появление новых изоформ.

3. У неустойчивого растения пшеницы при аноксии и реаэрации существенной стимуляции гваяколпероксидазы и каталазы не происходило. Новые изоформы гваяколпероксидазы не были обнаружены.

4. При длительных сроках аноксии и последующей реаэрации активность цитоплазматических ферментов аскорбат-пероксидазы и глутатионпероксидазы в проростках риса не изменялась, в то время как у пшеницы при этом наблюдалась значительная инактивация этих ферментов.

5. При обработке растений ингибиторами синтеза белка на уровне транскрипции (актиномицин D) и трансляции (циклогексимид) происходило торможение активности каталазы и гваяколпероксидазы у риса, в то время как у пшеницы влияние ингибиторов не проявлялось. Активность глутатионпероксидазы тормозилась и у пшеницы, и у риса при действии обоих ингибиторов. Влияния ингибиторов на активность аскорбатпероксидазы в условиях опыта обнаружено не было. Блокатор везикулярного транспорта брефельдин А снижал активность апопластных форм гваяколпероксидазы и каталазы.

6. Полученные результаты позволяют заключить, что у риса, в отличие от пшеницы, отсутствие накопления супероксидного анион-радикала и пероксида водорода при аноксии и постаноксической аэрации обеспечивается эффективной работой антиоксидантной ферментной защитной системы.

7. Растение, устойчивое к кислородной недостаточности, способно лучше противостоять также и окислительному стрессу, возникающему при выходе растения из анаэробной среды в условия аэрации.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ласточкин, Виктор Валерьевич, Санкт-Петербург

1. Андреева В.А. Фермент пероксидаза. М., Наука, -1988. - 340 с.

2. Будилова Е.В., Рубин Б.А., Иванова М.А., Семенова Н.А. Изоферменты пероксидазы в листьях кубышки. // Доклады АН СССР-1971. -Т. 200, N 4. -С. 980-983.

3. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. // М.: Наука. 1972. 252 с.

4. Воронков Л.А. О биологической роли и механизме действия фермента пероксидазы. // Сельскохозяйственная биология. 1967. -Т. 2, N 1. -С. 78-84.

5. Гамалей И.А., Клюбин И.В. Перекись водорода как сигнальная молекула. 11 Цитология. -1996. -Т.38, №12. -С. 1233-1247.

6. Гамбург К.З. Биохимия ауксина и его действие на клетки растений. -Новосибирск: Наука. 1976. -272 с.

7. Гуревич Л.С. Роль гормонального баланса ауксина и этилена в адаптивных реакциях высших растений. // Ботан. Журн. -1979. -Т. 64, N 11.-С. 1600-1614.

8. Гуськов А.В. Метаболизм ауксинов в растениях и его регуляция. // Итоги науки и техники ВИНИТИ., сер. Физиология растений. -1991.-Т.8. -151 с.

9. Э.Емельянов В.В. Гормональный статус растений в условиях недостатка кислорода./ Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Санкт-Петербург. СПбГУ. 1998. 158 с.

10. Ю.Запрометов М.П. О функциональной роли фенольных соединений в растениях. //Физиол. Раст. -1992. -Т. 39, N 1. -С.1197-1207.

11. И.Запрометов М.П. Специфические функции фенольных соединений в растениях. // Физиол. Раст. -1993. -Т. 40, N 6. -С.921-931.

12. Калашников Ю.Е., Балахнина Т.И., Закржевский Д.А. Эффект почвенной гипоксии на активацию кислорода и систему защиты от окислительной деструкции в корнях и листьях Hordeum vulgare. Н Физиол. Раст. -1994. -Т.41. -С.583-588.

13. Кулинский В.И. Активные формы кислорода и оксидативная модификация макромолекул: польза, вред и защита. // Соросовский образ, журнал. -1999. -№1. -С.2-7.

14. Ласточкин В.В., Емельянов В.В., Чиркова Т.В. Активность пероксидазы в проростках пшеницы и риса в связи с воздействием аноксии. // Вестник СПбГУ. -2000. -Сер. 3. -Вып. 3. -№19. -С. 59-63.

15. Ласточкин В.В., Емельянов В.В., Чиркова Т.В. Участие пероксидазы в антиоксидантной системе при адаптации растений к аноксии и постаноксической аэрации. // Сборник трудов. Воронеж. -2003. Вып. 5. С.163-169.

16. Лозовская Е.Л., Вартанян Л.С. Супероксиддисмутаза: определение активности по ингибированию фотосенсибилизированной хемолюминисценции глицилтриптофана. // Биохимия. -2000. -Т.65, №5. -С.704-708.

17. Маслов Ю. И. Установление степени достоверности (значимости) различий между сериями измерений. // Методы биохимического анализа растений. Л.: изд-во ЛГУ. -1978. -С.163-183.

18. Мерзляк М.Н. активированный кислород и жизнедеятельность растений. // Соросовский образ, журнал. -1999. №9. -С.20-26.

19. Мерзляк М.Н. Активированный кислород и окислительные процессы в мембранах растительной клетки. // Итоги науки и техники. Сер. Физиология растений. М.: ВИНИТИ. -1989. -Т.6. С.1-168.

20. Рубин Б.А., Логинова Л.Н. Завершающие этапы окисления в листьях полупогруженных растений. // Биохимия -1965. -Т. 30, N 4. -С. 681-686.

21. Рункова Л.В. Окисление ауксинов в растительных тканях. // Рост растений и природные регуляторы. М.: Наука. -1977.- С. 245-256.

22. Скулачёв В.П. Кислород в живой клетке: добро и зло. // Соросовский образ. Журнал. 1996. -№3. -С.4-10.

23. Тарчевский И.А. Регуляторная роль деградации биополимеров и липидов. // Физиол. Раст. -1992. -т.39. -С. 1215-1223.

24. Тарчевский И.А. Элиситор-индуцируемые сигнальные системы и их взаимодействие. // Физиол. Раст. -2000. -Т.47, №2. -С.321-331.

25. Чиркова Т.В. Пути адаптации растений к гипоксии и аноксии. Л.: изд-во Ленингр. ун-та. -1988. -244 с.

26. Чиркова Т.В. Физиологические основы устойчивости растений. // СПб: издательство СпбГУю -2002. -240 с.

27. Чиркова Т.В., Блохина О.Б. Влияние аноксии на уровень эндогенного перекисного окисления липидов в корнях растений, различающихся по устойчивости к недостатку кислорода. // Вестн. ЛГУ. Биология. -1991. -Вып.4. -С.85-90.

28. Чиркова Т.В., Новицкая Л.О., Блохина О.Б. Перекисное окисление липидов и антиоксидантные системы в условиях аноксии у растений, различающихся по устойчивости к кислородной недостаточности. // Физиол. Раст. -1998. -Т.45. -N.1. -С.55-62.

29. Чиркова Т.В., Соколовская Е.А., Хазова И.В. Активность и изоферментный состав пероксидазы корней растений в зависимости от условий временного анаэробиоза. // Физиол. Раст. -1973. -Т. 20, N 6. -С. 1236-1246.

30. Шарова Е.И., Суслов Д.В., Динамика секреции пероксидаз в процессе роста колеоптилей кукурузы. // Вестник С.-Петербург, унта, Сер. 3. -1998. -Вып.2, N 10. -С. 103-109.

31. Aebi Н.Е. Methods of enzymatic analysis. // Wienheim., Verlag Chemie. -1983. -P. 273-286.

32. Amor Y., Chevion M., Levine A. Anoxia pretreatment protect soybean cells against H202-induced cell death: possible involvment of peroxidases and of alternative oxidase. // FEBS Letters -2000. -V.477. -P. 175-180.

33. Агога A., Byrem T.M., Nair M.G. Strasburg G.M. Modulation of liposomal membrane fluidity by flavanoids and isoflavanoids. // Arch. Biochem. Biophys. -2000. -V.373. -P. 102-109.

34. Asada K. Ascorbate peroxidase a hydrogen peroxide - scavenging enzyme in plants. // Physiol. Plant. -1992. -V.85. -P. 235-241.

35. Asada K. The water-water cycle in chloroplasts: scavenging of active oxygen and dissipation of excess photons. // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. -1999. -V.50. -P.601-639.

36. Avsian-Kretchmer O., Eshdat Y., Gueta-Dahan Y., Ben Hayym G. Regulation of stress-induced phospholipid hydroperoxide gluthatione peroxidase expression in citrus. // Planta. -1999. -V.209. -P.469-477.

37. Bertani A., Brombilla I. Effect of decreasing oxygen concentration on wheat roots: growth and induction of anaerobic metabolism. // Plant Physiol. -1982. -V.108. -N.3. -P.283-288.

38. Biemelt S., Keetman U., Albrecht G. Re-aeration following hypoxia or anoxia leads to activation of the antioxidative defense system in roots of wheat seedlings. //Plant. Physiol. -1998. -V. 116, P.651-658.

39. Biemelt S., Keetman U., Mock H.-P., Grimm B. Expression and activity of isoenzymes of superoxide dismutase in wheat roots in response to hypoxia and anoxia. // Plant Cell Environ. -2000. -V.23. -P. 135-144.

40. Blockhina О.В., Fagerstedt K.V., Chirkova T.V. Anoxic stress leads to hydrogen peroxide formation in plant cells. // J. Exp. Bot. -2001. -V. 52, N 359.-P. 1179-1190.

41. Blockhina O.B., Virolainen E., Fagerstedt K.V., Hoikkala A., Wahala K., Chirkova T.V. Antioxidant status of anoxia-tolerant and -intolerant plant species under anoxia and reaeration. // Physiol. Plant. -2000. -V.109. -P. 396-403.

42. Bolwell G.P., Bindschedler L., Blee K.A., Butt V.S., Davies D.R., ш Gardner S., Gerrish C., Minibayeva F. The apoplastic oxidative burst inresponse to biotic stress in plants: a three-component system. // J. Exp. Bot. -2002. -V.53, №372. -P. 1367-1376.

43. Bolwell G.P., Butt V.S., Davies D.R., Zimmerlin A. The origin of the oxidative burst in plants. II Free Radical Res. -1995. -V.23. -P.517-532.

44. Bolwell G.P., Wojtaszek P. Mechanisms for the generation of oxygen species in plant defence a broad perspective. // Phisiol. Mol. Plant Pathol. -1997. -V.51. -P.347-366.

45. Bolwell G.P.,Blee K.A., Butt V.S., Davies D.R., Gardner S., Gerrish C., Minibayeva F., Rowntree E.G., Wojtaszek P. Recent advances in• understanding the origin of apoplastic oxidative burst in plant cell. II Free Radical Res. -1999. -V.31. -P.137-145.

46. Bown A., Hall D.E., MacGregor K.B. Insect footsteps on leaves stimulate the accumulation of 4-aminobutyrate and can be visualized through increased chlorophyll fluorescence and superoxide production. // Plant Physiol. -2002. V.129. -P. 1430-1434.

47. Physiol. -1986. -V. 80, N 1.-P. 130-133.

48. Campbell M.M., Sederoff R. Variation in lignin content and composition. Mechanisms of control and implications for the genetic improvement of plants. // Plant Physiol. -1996. -V.110, N 1. -P.3-13.

49. Casano L.M., Martin M., Sabater B. Sensitivity of superoxide dismutase transcript levels and activities to oxidative stress is lower in mature-senescent than in young barley leaves. // Plant Physiol. -1994. -V.106, №3. -P. 1063-1069.

50. Charles S.A., Halliwell B. Effect of hydrogen peroxide on spinach {Spinacia oleracea) Chloroplast fructose bisphosphatase. // Biochem J. -1980. -V. 189. -P.373-376.

51. Cho H.T., Kende H. Expansins in deepwater rice internodes. // Plant Physiol. 1997.-V. 113, N4. -P. 1137-1143.

52. Cleland R. Cell wall extension //Ann. Rev. Plant. Phisiol. -1971; -V. 22.-P. 197-222.

53. Corpas F.J., Barroso J.В., del Rio L.A. Peroxisomes as a sourse of reactive oxygen species and nitric oxide signal molecules in plant cell. // Tr. Plant Sci. -2001. -V.8, №4. -P.145-150.

54. Crawford R.M.M., Walton J.C., Wollenweber-Ratser B. Similarities between post-ischaemic injury to animal tissues and post-anoxic injury in plants. // Proceedings of the Royal Society of Edinburgh. Edinburgh, 1994. -V.102b. -P.325-332.

55. Criqui M. C. Jamet E., Parmentier Y., Marbach J., Durr A., Fleck J. Isolation and characterisation of a plant cDNA showing homology to animal glutathion peroxidases. // Plant. Mol. Biol. -1992. -V.18. -P.623-627.

56. Dat J.F., Vandenabeele, Vranova E., Van Montagu M., Inze D., Van Breusegem F. Dual action of the active oxygen species during plant stress responses. // Cell Mol. Life Sci. -2000. -V.57. -P.779-795.

57. Davis B. Disc electrophoresis. II. Method and application for humen serum proteins. //Ann. N. Y. Acad. Sci. -1964. V. 121. -P.404-427.

58. Desikan R., Neill S.J., Hancock J.T. Hydrogen peroxide-induced gene expression in Arabidopsis thaliana. II Free Rad. Biol. Med. -2000. -V.28, №5. -P. 159-172.

59. Drew M. C. Oxygen deficiency and root metabolism: injury and acclimation under hypoxia and anjxia. //Annu. Rew. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. -1997. -V. 48. -P. 223-250.

60. Eshdat Y., Yolland D., Faltin Z., Ben-Hayyim G. Plant glutation• peroxidases. //Physiol. Plant. -1997. -V.100. -P. 234-240.

61. Fita I., Rossmann M.G. The active center of catalase. // J. Mol. Biol. -1985.-V. 185. -P.21-27.

62. Foyer С. H., Noctor G. Redox sensing and signaling associated with reactive oxygen in chloroplasts, peroxisomes and mitochondria. // Physiol. Plant. -2003. -V.119. -P.355-364.

63. Gahagan H., Holm R., Abeles F. Effects of ethylene on peroxidase activity. // Physiol. Plant. -1968. -V. 21.,N 6.-P. 1270-1279.

64. Gaspar Т., Pennel C., Castillo I., Greppin H. A two-step control of basic and acidic peroxidases and its significance for groth and development. // Physiol. Plant. -1985.-V. 64.-P.418-423.

65. Gaspar Т., Pennel C., Thorpe Т., Greppin H. Peroxidases 1970-1980: A survey of their biochemical and phisiologicfl roles in higher plants. Geneve: Univ. De Geneve. Centre de Botanique. -1982. -324 p.

66. Gay C., Gebiski J.M. A critical evaluation of the effect of sorbitol on theferric-xylenol orange hydroperoxide assay. // Annal. Biochem. -2000. -V.284. -P.217-220.

67. Geissmann Т., Neukom H. Vernetzung von phenolcarbonsaure-estern von polysacchariden durch oxydative phenolische kupplung. ,// Helv. Chim. Acta -1971. -V.54. -P. 1108-1112.

68. Guan L.M., Scandalios J.G. Hydrogen peroxide-mediated catalase gene expression in response to wounding. // Free Rad. Boil. Med. -2000. -V.28, №8. -P. 1182-1190.

69. Gueta Dahan Y., Yaniv Z., Zilinskas B.A., Ben-Hayym G. Salt and• oxidative stress: similar and specific responses and their relation to salt toleranse in Citrus. II Planta. -1997. -V.203. -P.460-469.

70. Halliwell B. Superoxide dismutase, catalase, and glutathion peroxidase: solutions to the problem of living with oxygen. // New Phytol. -1974. -V.73. -P. 1075-1086.

71. Hoson Т., Wada S. Role of hydroxyproline-rich cell wall protein ingrowth regulation of rice coleoptiles grown on or under water. // Plant Cell Physiol. -1980. -V. 21, N 4. -P. 511-524.

72. Jackson P., Ricardo C. The changing peroxidase polymorphism in Lupinus albus during vegetative development. // Austr. J. Plant Physiol. -1998.-V. 25.-P.261-269.

73. Kawano Т., Kadono Т., Furuichi Т., Muto S., Lapeyrie F/ Aluminium-induced distortion in calcium signaling involving oxidative burst and channel regulations tobacco BY-2 cells. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -2003. -V.308. -P.35-42.

74. Kutschera U., Hoss R., FrOhlic M., Hoson T. Analysis of the growth response of air-grown rice coleoptiles to submergence. // Bot. Acta -1993. -V. 106, N 2.-P. 164-169.

75. Kutschera U., Kende H. The biophysical basis of elongation growth in internodes of deepwater rice. // Plant Physiol. -1988. -V. 88, N 2. -P. 361366.

76. Lamb C., Dixon R. A. The oxidative birst in plant disease resistance. // Annual Rev. Plant Physiol. Plant Moiec. Biol. -1997. -V.48. -P.251-275.

77. Lander H.M. An essential role for free radicals and derived species tn signal transduction. // FASEB J. -1997. -V.11. -P. 118-124.

78. Lee T.M., Lin Y. Changes in soluble and cell wall-bound peroxidase activities with growth in anoxia-treated rice (Oryza sativa L.) coleoptiles and roots. // Plant Sci. -1995. -V. 1, N 1. -P. 1-7.

79. Levine A., Pennell R. I., Alvarez M. E., Palmer R., Lamb C. Calcium-mediated apoptosis in a plant hypersensitive disease resistance response. // Curr. Biol. -1996. -V. 6. -P.427-437.

80. Levine A., Tenhaken R., Dixon R., Lamb C. H202 from the oxidative birst orchestrates the plant hypersensitive disease resistence response. // Cell. -1994. -V. 79. -P.583-593.

81. Liochev S.I., Fridovich I. On the role of bicarbonate in peroxidations catalysed by Cu/Zn superoxide dismutase. // Free. Rad. Biol. Med.• 1999.-V.27, №11-12. -P. 1444-1447.

82. Mera N., Aoyagi H., DiCosmo F., Tanaka H. Production of cell wallaccumulative enzymes using immobilized protoplasts of Catharanthus roseus in agarose gel. // Biotechnol. Lett. -2003. -V.25. -P. 1687-1693.

83. Mika A., Luthje S. Properties of guaiacol peroxidase activities isolated from corn root plasma membranes. // Plant Physiol. -2003. -V.132. -P. 1489-1498.

84. Minibayeva F.V., Mika A., Luthje S. Salicylic acid changes the properties of extracellular peroxidase activity secreted from wounded wheat (Triticum aestivum L.) roots. // Protoplasma. 2003. -V. 221. -P . 67-72.

85. Misra H.P., Fridovich I. The generation of superoxide radical during the autooxidation of hemoglobin. // J. Biol. Chem. -1972. -V.247. -P.69609 6962.

86. Monk L. S., Fagerstedt К. V., Crawford R. M. M. Superoxide dismutase as an anaerobic polypeptide. A key factor in recovery from oxygen deprivation in Iris pseudacorus. II Plant Physiol. -1987. -V.85. -P. 10161020.

87. Morel Y., Barouki R. Repression of gene expression by oxidative stress. // Biochem. J. -1999. -V.342. -P.481-496.

88. Morrow D., Jones R. Localisation and partial characterisation of the extracellular proteins centrifuged from pea internodes. // Physiol. Plant. -1986.-V. 67.-P.397-407.• 104.Musel G., Shindler Т., Bergfeld R., Ruel K., Jacquet G., Lapierre C.,

89. Speth V., Shopfer P. Structure and distribution of lignin in primary and secondery cell wall of maize coieoptiles analysed by chemical and immunological probes. // Planta.-1997.-V. 201.-P. 146-159.

90. Nakano Y., Asada K. Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate specific peroxidase in spinach chloroplasts. // Plant Cell Physiol. -1981. -V.22. -P.867-880.

91. Noctor G., Foyer С. H. Ascorbate and glutathione: keeping active oxygen under control. // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. -1998.• -V.49. -P.249-279.

92. Otter Т., Polle A. Characterisation of acidic and basic apoplastic peroxidases from needles of norway spruce (Picea abies L., Karsten) with respect to lignifying substrates. // Plant Cell Physiol. -1997. -V.38, N 5. -P.595-602.

93. Perata P., Guglielminetti L., Alpi A. Mobilization of endosperm reserves in cereal seeds under anoxia. // Ann. Bot. -1997 (Sup. A). -P. 49-56.

94. Piatt J.P., Cheema A.S., O'Brien P.J. Peroxidase catalyzed singlet oxygen formation from hydrogen peroxide. // FEBSS Letters. -1977. -V. 74, N2. -P. 251-254.

95. Polidoros A.N., Scandalios J.G. Role of hydrogen peroxide and different classes of antioxidants in the regulation of catalase and glutathione-S-transferase gene expression in maize (Zea mays L.) // Physiol. Plant. -1999. -V.106. -P. 112-120.

96. Reisfeld R., Lewis U., Williams D. Disc electrophoresis of basic proteins and peptides on polyacrylamide gels. // Nature. -1962. V.195. P.281-283.

97. Rice-Evans C.A., Miller N.J., Paganga G. Antioxidant properties of phenolic compounds. // Trends in Plant Sciences. -1997. -V.2. -P. 152159.

98. Salguero J., Bottger M. Secreted catalase activity from roots of developing maize {Zea mays L.) seedlings. //Protoplasma. -1995. -V.184. -P.72-78.

99. Sanchez M., Queijeiro E., Revilla G., Zarra I. Changes in ascorbic acid level in apoplastic fluid during growth of pine hypocotyls. Effects on peroxidase activities associated with cell walls. // Physiol. Plant. -1997. -V.101. -P. 815-820.

100. Sauter M., Kende H. Levels of (3-glucan and lignin in elongating internodes of deepwater rice. // Plant Cell Physiol. -1992. -V. 33, N 8. -P. 1089-1097.

101. Shafer F.Q., Buettner G.R. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple. // Free Rad. Biol. Med. -2001. -V.30, №11. -P.1191-1212.

102. Shinkle J., Swoap S., Simon P., Jones R. Cell wall free space of Cucumis hypocotyls contains NAD and a blue light-regulated peroxidase activity. // Plant. Physiol. -1992.-V. 98. -P.1336-1341.

103. Smith M., O'Brein T. Distribution of autofluorescence and esterase and peroxidase activities in the epidermis of wheat roots. // Austr. J. Plant. Physiol. -1979.-V. 6.-P.201-219.

104. Sugimoto M., Furui S., Suzuki Y. Molecular cloning and characterization of a cDNA encoding putative phospholipid hidroperoxide gluthatione peroxidase from spinach. // Biosci. Biotech. Biochem. -1997. -V.61.-P. 1379-1381.

105. Takahama U. Effects of ascorbate on the oxidation of derivative of hydroxycinnamic acid and the mechanism of the oxidation of sinapic acid by cell wall-bound peroxidases. // Plant Cell. Physiol. -1994. -V.35. -P. 593-600.

106. Takahama U. Effects of fusicoccin and indole-3-acetic acid on the level of ascorbic acid and dehydroascorbic acid in the apoplast duringelongation of epicotyl segments of Vigna angularis. II Physiol. Plant. -1996. -V.98. -P.731-736.

107. Takahama U., Oniki T. A peroxidase / phenolics / ascorbate system can scavenge hydrogen peroxide in plant cell. //Physiol. Plant. -1997. -V.101. -P.845-852.

108. Takahama U., Oniki T. Flavonoids and some other phenolics as substrates of peroxidase: physiological significance of the redox reactions. // J. Plant. Res. -2000. -V.113. -P.301-309.

109. Tang Y., Chevone B.I. Hess J.L. Ozone-responsive proteins in a tolerant and sensitive clone of white clover (Trifolium repens). I I Environ. Poll. -1999. -V.104. -P.89-98.

110. Tappel A.L. Glutathione peroxidase and hydroperoxides. // Metods in enzymology. -1978. -V.52. -P.506-516.

111. Tognolli M., Penel C., Greppin H., Simon P. Analysis and expression of the class III peroxidase large gene family in Arabidopsis thaliana. II Gene. -2002. -V.288. -P. 129-138.

112. Tyson H., Taylor S., Fields M. Segregation of environmentally induced relative mobility shifts in flax genotroph peroxidase isozymes. // Heredity. -1978.-V. 40., N. 2. -P.281-290.

113. Ursini F., Maiorino M., Brigelius-Flohe R., Aumann K. D., Roveri A., Schomburg D., Flohe L. Diversity of glutation peroxidases. // Methods Enzymol. -1995. -V.252. -P.38-53.

114. Ushimary Т., Kanematsu S., Shibasaka M., Tsuji H. Effect of hypoxia on the antioxidative enzymes in aerobically grown rice (Orysa sativa) seedlings. // Physiol. Plant. -1999. -V.107. -P.181-187.

115. Vanaker H., Carver T.L.W., Foyer C.H. Pathogen-induced changes in the antioxidant status of the apoplast in barley leaves. // Plant Physiol.1998. -V.117. -P. 1103-1114.

116. Van Huystee R. Some molecular aspects of plant peroxidase• byosintetic studies. // Ann. Rev. Plant. Physiol. -1987. -V. 38. -P.205-219.

117. Van Toai Т., Bolles C. S. Post-anoxic injury in soybean (Glycine max) seedlings. // Plant Physiol. -1991. -V.97. -P.588-592.

118. Vartapetian B.B., Jackson B.M. Plant adaptations to anaerobic stress. //Ann. Bot. -1997. -V. 79 (sup. A). -P. 3-20.

119. Vranova E., Inze D., Van Breusegem F. Signal transduction during oxidative stress. // J. Exp. Bot. -2002. -V.53, №372. -P.1227-1236.

120. Whetten R., Sederoff R. Lignin biosynthesis. // Plant Cell -1995. -V.7,• N7.-P.1001-1013.

121. Willekens H., Chamnongpol S., Davey M., Schraudner M., Langebartels C., Van Montagu M., Inze D., Van Camp W. Catalase is asink for H202 and is indispensable for stress defence in C3-plants. II Eur. Molec. Biol. Organis. J. -1997. -V.16. -P.4806-4816.

122. Yamasaki H., Grace S. EPR detection of phytophenoxil radicals by zinc ions: evidence for the redox-coupling of phenolics with ascorbate in the H202-peroxidase system. // FEBS Lett. -1998. -V.422. -P.377-380.

123. Yan В., Dai Q., Liu X., Huang S., Wang Z. Flooding-induced membrane damage, lipid oxidation and activated oxygen generation in corn leaves. // Plant and Soil. -1996. -V.179. -P.261-268.