Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рибонуклеиновые кислоты тканей телят под влиянием витаминов группы В

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Рибонуклеиновые кислоты тканей телят под влиянием витаминов группы В"

^ ® Лаїнська академія аграрних наук

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ І БІОХІМІЇ ТВАРИН

На правах рукопису

НАКОНЕЧНА ' Ольга Владиславівна

РИБОНУКЛЕЇНОВІ КИСЛОТИ ТКАНИН ТЕЛИЦЬ ПІД ВПЛИВОМ ВІТАМІНІВ ГРУПИ в

03.00.04.-Біохімія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступепя кандидата біологічних наук

Львів-1993.

Робота виконана в лабораторії генної інженерії Інституту фізіології і біохімії тварин Української академії аграрних наук.

Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор Розгоні 1.1.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, академік УААН Палфій Ф.Ю., доктор біологічних наук Сологуб Л.І. .

Провідна установа - Білоцерківський сільськогосподарський Інститут.

Захист дисертації відбудеться "В " ск,<>ТґЖ? 1994 р.

о 10 год. на засіданні спеціалізованої ради Д 020.14.01 при Інституті фізіології і біохімії тварин Української академії аграрних наук.

Адреса інституту: 290034, м.Львів-34, вул. В.Стуса, 38.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту фізіології і біохімії тварин УААН.

Автореферат розісланий " & " &'199Ур.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук

Актуальність роботи. Вирішення проблеми забезпечення насе-[єння України повноцінними і доброякісними продуктами полягає в нтепсифіїсації виробництва продукції тваринництва. Однак, підви-цеїшя продуктивності сільськогосподарських тпарин при традиційних іетодах ведення тваринництва є довготривалим і економічно невигіднім процесом. Одною з найбільш прогресивних сучасних ланок селек-ййно-племінної роботи є трансплантація ембріонів ВРХ.

В полі зору наукових досліджень в цій галузі знаходяться сонтролюючі фактори онтогенезу від ендокринної регуляції функції іідтворення організма до визрівання ооцитів, їх запліднення, •

іересадки і розвитку зародків після трансплантації тварині-реципі-:нту (Baum N.. 1986; Donaldson В., 1985; Nieman H. etaL;T985). Іриживлення і нормальний розвиток зародка неможливі при низькому іівні біосинтетичних процесів в репродуктивних органах реципієнта, їідомо, що вітаміни групи В як складові частини фермечтних систем іктивугать біосинтетичні, імунні і енергообмінні процеси в бага-■ьох органах (Антал Я. и др.; 1987, Mariani А.Р. et аі., 1983; vlariani А.Р., 1988)

Дослідженнями встановлено, що як при забезпеченні високої про-суктивності, так і при підвищенні функції репродуктивних органів готреба організму в вітамінах групи В різко зростає і не може бути абезпечена рівнем синтезу їх мікрофлорою передшлунків в господарських умовах (Kung L., 1984; Ridell D. et al., 1986).

Механізм дії вітамінів групи В, як ферментних кофакторів, тісно юв'язаиий із процесами транскрипції ¡-трансляції генетичної інформації в ядрі клітини та всіми ланками цитоплазматичного і ка-ііоплазматичного білкового синтезу (Gulberg R., 1976; Solomon L.,

.982, Westerhuis L.; 1983).B багаточисельних експериментах як нашою габораторією, такі іншими дослідниками був встановлений безпосе-іедній вплив гонадотропінівнарізні етапи експрессії генома в літині - реплікацію ДНК, синтез іРНК і рРНК, активність ДНК- і ’НК-полімераз, рівень функціонування рибосом і мітохондрій Розгоні 1.1., 1974, 1975; Griswold M. etal. 1976; Johanson R.,

975).

Враховуючи вищевказані дані, ми висунули гіпотезу про можливий синергізм дії гонадотропінів і вітамінів групи В на хромосомно- ядерцсвий апарат клітин. В доступній нам літературі відсутні дані про механізми дії комплексних гормонально-вітамінних препаратів на фоні ін'єкцій окремих вітамінів групи В у донорів і реципієнтів ембріонів на біосинтез білків і нуклеїнових кислот в репродуктивних органах телиць і корів. Тому важливе теоретичне значення має дослідження механізмів дії гонадотропних препаратів в комплексі з вітамінами групи В на обмін речовин як в органах-мішенях (репродуктивних), так і в органах депонування вітамінів (паренхіматозних), імунній та кроветворній системі організму телиці-реципієнта.

Ці питання мають також і значний практичний інтерес в зв’язку з необхідністю підвищення ефективності метода трансплантації ембріонів з метою швидкого покращення генетичного потенціалу продуктивних якостей ВРХ.

Мета і завдання досліджень. Виходячи з вищесказаного, метою даної роботи було вивчення впливу гормональної обробки телиць комплексним препаратом "Овоген" на фоні внутрішньом'язевих ін'єкцій окремих вітамінів групи В на концентрацію нуклеїнових кислот в клітинних ядрах, вмісту рибосомальних і мітохондріальних фракцій РНГ. і ДНК, білок-синтезуючу актив ність ізольованих клітинних ядер, деякі гістоморфометричні показники тканин репродуктивних органів.

Відповідно з метою роботи досліджували:

1. Вплив вітамінів В], В2, В^, В12, Вс, РР та їх поєднань на

“ О

вміст окремих фракцій нуклеїнових кислот в -.слітинних ядрах, рибо-сомальній і мітохондріальній фракції клітин ендометрія, яєчників, печінки, селезінки, підшлункової залози, мезентеріальних лімфовузлів на фоні введення гормонально-вітамінного препрату "Овоген".

2. Інтенсивність включення препаратами ізольованих клітинних ядер вищевказаних тканин [и-14С]-амінокислот гідролізати білків хлорели під впливом застосованих вітамінів групи В.

3. Вплив поєднання гормональної обробки та ін'єкцій вітамінів групи В на товщину призматичного епітелію матки, довжину та товщину складок слизової оболонки яйцепроводу, кількість фолікулів в яєч -никах.

Иаукова новизна роботе. Вперше встановлено, що застосовані окремі вітаміни групи В диференційовано і тканиноспецифічно підвищують рівень нуклеїнових кислот і білків в клітинах тканин дослідних телиць. Спостерігається синергічний вплив вітамінів групи В при поєднаному їх введенні під час гормональної обробки па концентрацію досліджуваних фракцій РНКддер, мітохондрій і рибосом в клітинах еидометрія, яєчників, печінки і селезінки, що приводить до значного підвищення інтенсивності включення [и-14С]-амінскис-лот ізольованими ядрами клітин тканин.

На прикладі зміни концентрації ядерних попередників цитоплазматичних РНКі ДНК та рибосомальних РНК в клітинах ендометрія і яєчників показане значення дози і частоти введення вітамінів групи В телицям. ' ■

Практична цінність роботи. Результати наших досліджень дали можливість використати вітаміни групи В як додаткові компоненти при розробці комплексного гормонального препарату для покращення функції репродуктивних органів корів під час інволюції при стимуляції поліовуляції та покращення приживлення ембріонів.

Апробація роботи. Матеріали дисертації доповідались та обговорювались на конференції аспірантів і молодих вчених Інституту' фізіології і біохімії тварин УААН (Львів, 1992), на розширеному засіданні лабораторії генної інженерії цього ж інституту (1993), на VI Українському Біохімічному з'їзді (Київ, 1992), на конференції молодих вчених і спеціалістів (В.Баїсга, 1992), на науксво-ви-робничій конференції "Біотехнологія відтворення" (Харків, 1993).

За матеріалами дисертації опубліковано 6 друкованих рг>біт.

Структура і об’єм роботи. Дисертація складається з вступу, згляду літератури, експериментальної частиш та обговорення, зисновків і списку літератури. Текст викладений на 148 сторінках. Експериментальні дані представлені в 39 таблицях і 4 рисунках. Список літератури включає 322 джерела, з них 212 на іноземних .швах.

2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ Досліди проводились в період 1991-1992 p.p. на телицях 18-!0-ти місячного віку, підібраних методом ректального дослідження

по принципу аналогів, на базі радгоспу "Радянська армія" Стрийсь-кого району та агрофірми ім. Я.Галана Радехівського району Львівської області.

Гормональна обробка з метою викликання фонікулогскезу і оогенезу у всіх дослідних тварин полягала у введенні телицям 10 мл. комплексного гормонально-вітамінного препарату "Овоген". В одній дозі (10 мл.) даного препарату містилось: естрадіола дипропінат - 0,75 мг, тестостерона пропіонат - 7,5 мг, вітаміну А - 7,5 тис.МО, вітаміну Рз - 10 тис. МО, вітаміну Е - 5,0 мг, ГСЖК (гонадотропіну сироватки жеребних кобил) - 1000- 1200.МС). Синхронізація охоти у телиць проводилась естрофаном - 500 мкг.

Попередньо тварини всіх дослідних груп були синхронізовані для викликання статевої охоти естрофаном (500 мкг клопростенолу -аналогу ПГФ2а). Другий раз гормональний препарат вводили в ліотеїн-ову фазу статевого циклу. Телиці дослідних груп одержували внутріш-ньом'язеві ін’єкції окремих вітамінів групи В в дозі: В; - 0,48 г,

Вг - 0,05 г, Вб - 0,3 г, В12 -1,0 мг, Бс - 30,0 мг, РР -0,20 г, або їх комбінацій щоденно на протязі 7 днів. Вітамінна обробка телиць контрольної групи не проводилась. Забій проведено через 48 годин після виявлення ознак статевої охоти.

Для дослідження відбирались проби ендометрія, яєчників, печінки, підшлункової залози, селезінки і мезгнтеріальних лімфовузлів. Проби тканин охолоджувала до 1=2°С і промивали фізіологічним розчином ИаСІ. В холодній кімнаті проводили морфометричні, гістохімічні і біохімічні дослідження. Матеріалом для біохімічних досліджень служили виділені з тканинних гомогенатів методом диференційованого центрифугування клітинні ядра, мітохондрії і рибссоми.

Клітинні ядра одержували у вигляді осаду при центрифугуванні тканинного гомогенату на рефрижераторній цетрифузі ЦЛР-1 з швидкістю 2000 об/хв на протязі 15 хвилин при 1=2°С.Ядерну фракцію гомогенізували в розчині 2,2 М сахарози, яка містила 0,005 М магнію хлористого і калій-фосфатний буфер 0,001 М (pH .6,5). Центрифугування гомогенату проводили на центрифузі УАС-бОІ при швидкості 2500(£ обертів за хвилину на протязі 40 хвилин. Надосадову рідину зливали, а стінки пробірок протирали марлею. Осад ядер два рази промивали в розчині ТМС і центрифугували при швидкості 2000 обертів за хвилину на протязі 10 хвилин. Одержані ядра використовували для досліджень. Чистоту препаратів перевіряли методом мікроскопії на фазово-контрастному мікроскопі МБИ-15 після забарачення суспензії метиленовим

синім.

Для виділення субклітинних фракцій використовували надосадову рідину, одержану після першого центрифугування тканинного гомогенату з ТМС при виділенні ядер. Перше центрифугування надосадової рідини проводили на центрифузі ЦЛР-І 10 хвилин на швидкості 5000 обертів за хвилину - при цьому осаджувались мітохондрії. Надосадову рідину центрифугували знову на центрифузі VAC-60I при швидкості 100000*g на протязі ЗО хвилин. В осаді одержували суміш мікросом і рибосом. В мітохондріалізній фракції визначали вміст РНК і ДНК, а в рибосомальній фракції - вміст РНК (Цанев Р.Г., Марков Г.Г., I960).

З очищених клітинних ядер методом послідовної буферної екстракції, розробленим Г.Н. Георгіевимі співроб. (1966), одержували РНК фракцій pH 7 і pH 8. Білки, РНК і РНП- комплекси з екстрактів осаджували рівними об'ємами охолодженої 10% НСІО4 і'досліджували. В ядрах, що залишились після екстракції, визначали залишкову РНК і ДНК. Визначення білок-синтсзуїочої активності кліти,тних ядер проводили шляхом інкубації їх з U- 14С-амінокислогами гідролізату білків хлорели (Szian 1., Burdman І.А., 1973). По величині радіоактивності, яка залишалась в кислотонерозчинному осаді, судили про здатність ядер до включення амінокислот в ядерні білки. Осад збирали на мембранні фільтри і промивали 5% ТХО з гідролізатом. Радіоактивність рахували на лічильнику LKB (Швеція). Інтенсивність включення радіоактивної мітки виражали в тис. імп/хв на 1 мг білка. Вміст білка в пробі визначали за методом Jloypi і інш. (1951). Одержані цифрові дані статистично оброблені на ЕОМ IBM PC/AT 486 "Texas system". • .

3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ■

3.1 Вивчення впливу ін'єкцій вітамінів Вб, В12, Вс

на синтез нуклеїнових кислот і білків в клітинних ядрах при гормональній стимуляції охоти у телиць

Одержані експериментальні дані показують,що ін'єкції вітамінів Вб, В12 і Вс під час гормональної синхронізації статевої охоти впливають на вміст різних класів РНІ< в ядрах і цитоплазмі клітин окремих тканин статевозрілих телиць-реципієнгів. Вміст фракції pH 8 РНК (ядерного попередника цитоплазматичної інформаційної РНК), дещо зростав в ядрах ендометрія телиць, то одержували вітамін Вс (2 група) та вітамін Вб (3 група) і складав відповідно 14,44 та 13,04 проти 12,34 мкг Р-РНК/г тканини у контрольних телиць (Табл. 1). Вміст ДНК в клітинних ядрах ендометрія телиць, що одержували

Таблиця 1.

Вміст нуклеїнових кислот в клітинах сндомстрія статевозрілих телиць (М + т, п=4), мкг Р-РНК ( Р-ДНК )/г сирої тканини.#

Групи тварин

Показники 1 контроль 2 Вс 3 В6 4 В12

Ядетші НК фракція рН 7 РНК 20,03 + 0,82 17,95 + 0,79 15,79 + 0,64** 19,39 + 0,48

фракція рН 8 РНК 12,34 + 0,69 14,44 + 1,92 13,04 + 0,77 10,75 ± 0,28* '

"залишкова1’ РНК 30,49 ±1,94 32,67 ±6,38 32,07 + 2,06 33,80 + 4,69

ядерна ДНК 65,10 + 1,96 • 67,77 + 3,92 72,20 + 0,69** 75,30 + 1,47**

Цитоплазматичні НК Рибосомальна РНК 85,69 + 10,05 85,19 + 12,28 88,59 + 9,45 121,02. + 5,51*

# Тут і далі: вірогідність різниць в порівнянні з контрольною групою - *при Р < 0,05; **при Р < 0,01; ***при Р < 0,001.

вітаміни В5 і В і2, зростає відповідно до 72,2 і 75,3 мкг Р-ДНК/г, в

той час як у контрольних тварин становить лише 65,1 мкгР-ДНК/г тканини (Р<0,01). Достовірно зростає Р-РНК рибосомальної фракції гомогенатів клітин ендометрія дослідних телиць під впливом введених вітамінів В. Так, у телиць 3 групи при введенні вітаміну Вб виявлено 88,59, а вітаміну В12 -121,02 (Р<0,05) в порівнянні з 85,69 мкг ° Р- РНК/г тканини ендометрія контрольних тварин. Про інтенсифікацію синтетичних процесів в мітохондріях клітин ендометрія свідчить зростання концентрацій РНКта ДНК мітохондріальної фракції гомоге натів ендометрія тварин, що одержували ін’єкції вітамінів Вс і В^. Вміст РНК в мітохондріях клітин ендометрія тварин 2 групи становив

-7118,26 (Р<0,05), а вміст ДНК - 13,70, тоді як у мітохондріальній фракції гомогенатів ендометрія контрольних тварин ці показники дорівнювали відповідно - 80,69 мкг Р-РНК/г та 10,20 мкг Р-ДНК/г сирої маси тканини.

Майже на 50% зростало включення мічених амінокислот в клітинні ядра ендометрія телиць 2-ої і 3-ої груп і становило відповідно при введенні вітаміну Вс - 56,32, а вітаміну В^ - б 1,61, в той час як у контрольних тварин цей показник дорівнює 41,34 тис.імп/хв/мг білка ядерної маси (Таб.2).

Таблиця 2.

Інтенсивність включення [и -14С] мічених амінокислот ' гідролізату білків хлорели в ізольовані клітинні ядра тканин телиць ( М + ш, п=4 ), тис.імп/хв/мг білка. ’

, . Групи тварин

Тканини 1 контроль 2 Вс 3 В6 4 В12

Ендометрій 41,34 56,32 61,61 47,93

±13,15 + 6,05* + 6,63* + 21,78

Яєчник . 72,74 89,83 75,72 82,90

+19,55 ±14,29** + 17,72 + 17,88*

Печінка 40,32 85,32 101,43 93,36

±9,39 + 21,25** ±10,92* + 11,37

Селезінка 67,45 136,62 90,71 82,68

± 17,40 + 36,95* + 22,30 ± 10,69*

При дослідженні тканини яєчника ми спостерігаємо картину зміни імісту ядерних РНК, дещо відмінну від такої в ендометрі'і. Тгх,

іміст фракції рН 7 ядерних РНК, що складається в основному з ядер-юго попередника цитоплазматичних рРНК, дещо зростає у телиць, що ідержували вітаміни Вс і Вб і становить відповідно 15,81та 15,41 іроти 13,78 мкг/г сирої маси у контрольних тварин. Одночасно із ¡ищеописаними змінами, нами встановлений факт значного зростання :онцентрації "залишкові«“ РНК в ядрах клітин яєчника дослідних

тварин, причому зміни концентрації РНК під впливом вітамінів в порівнянні з тваринами контрольної групи статистично достовірні. Наприклад, найбільший ефект спостерігається при застосуванні вітаміну Вс - 49,85 мкг Р-РНК в порівнянні з 17,16 мкг/г у контрольних тварин (Р<0,001). Дещо слабший, в порівнянні з вітаміном Вб, мали вплив вітаміни Вб і В і;. У тварин, що отримували дані вітаміни, знайдено відповідно 30,85 і 31,09 мкг залишкового Р-РНК на г сирої маси тканини (Р<0,01). Вміст ядерної ДНК в клітинах яєчника зростає у тварин всіх дослідних груп. ■

Введення екзогенних вітамінів групи В також приводить до посиленого включення [ІІ-14с]-мічених амінокислот гідролізату білків хлорели в ізольовані клітинні ядра яєчників дослідних телиць (таблиця 2). Так, у телиць, що одержували вітамін Вс, включення мічених амінокислот складало 89,80, у телиць, що одержували вітамін Вб -75,70, а у телиць 3-ої групи (вітамін В12) - 82,90, в порівнянні з 72,70 тис.імп/хв/мг білка ядер у контрольних тварин (Р<0,01 і Р<0,05).

Результати проведених морфогістологічних досліджень препаратів репродуктивних органів дослідній тварин в основному узгоджуються з одержаними біохімічними показниками та дають змогу проаналізувати і пояснити окремі констатовані нами факти. (Дослідження проведені спільно з 1.1. Гевканом).

Результати аналізу змін вмісту нуклеїнових кислот в гепатоцитах у тварин, що одержували вітаміни групи В, в основному узгоджуються з даними, одержаними при дослідженні тканин репродуктивних органів.В клітинних ядрах печінки дослідних телиць-реципієнтш спостерігається значне зростання вмісту всіх фракції!' РНК під впливом досліджуваних вітамінів. Так, вміст ядерного попередника цитоплазма -тичної рибосомальної РН К. (фракція рН 7) в гепатоцитах зростає в 2 - З рази і становить відповідно у тварин 2 групи при введенні вітаміну Вс 25,10 , у тварин 3 групи (вітамін Вб) - 32,81 , у тварин 4 групи (вітамін В12) - 25,93 мкг/г в порівнянні 10,95 у ядрах печінки контрольної групі тварин. с-

Підтвердженням наших міркувань є результат дослідження активності включення [и-14С]-мічених амінокислот гідролізату білків хлорели в ізольовані ядра гепатоцитів (таблиця 2). Так, у тварин 2 групи, яким вводили вітамін Вс, включення в ядра гепатоцитів становило 85,3 (Р<0,01), у тварин 3 групи (вітамін Вб) - 101,4 (Р<0,05), у тварин 4 групи (вітамін В12) - 93,3 (Р<0,05), тоді як у контроль-

них тварин включення становило тільки 40,3 тис. імл/хв/мг білка ядер. Це свідчить про посилення синтетичних процесів в ядрах клітин печінки, і, зокрема, про збільшений рівень синтезу білків.

Наведені вище дані узгоджуються з результатами досліджень впливу згаданих вітамінів на здатність ізольованих клітинних ядер селезінки включати мічені [и-!4С]-амінокислоти гідролізату білків хлорели (таблиця 2). Кількість зареєстрованих радіоактивних імпульсів в препаратах інкубованих ядер зросла у телиць всіх дослідних груп і становить 136,6 (Р<0,01) при введенні вітаміну Вс, 90,7 (Р<0,05) -вітаміну Вб і 82,6 (Р<0,05) - вітаміну В12 в порівнянні з 67,4 тис. імп/хв/мг білка у ядрах селезінки контрольних тварин. '

3.2. Дослідження дії сумісних ін'єкцій вітамінів Вс+Вб та Вс+Вб+Ві2 на синтетичні процеси при стимуляції статевої охоти З досліджуваних нами тканин телиць особливий інтерес з точки зору проблеми трансплантації ембріонів мають тканини репродуктивних органів - ендометрій матки та яєчники. Проведені дослідження вказують на суттєвий вплив застосованих сумісних ін'єкцій вітамінів Вс, Вбта В12 на концентрацію нуклеїнових кислот в клітинах ендо-метрію (Таб. 3).Вміст "залишкових" РНК в ядрах клітин ендометрію збільшується у телиць обох дослідних груп. Так, у телиць, що одержували вітаміни Вс+Вб, цей показник дорівнює 487,99 у порівнянні з 143,68 мкг Р-РНК/г тканини контрольних тварин. Значне зростання кількості рибосомальних РНК відмічено у телиць 3 групи, що одержували ін’єкції Вс+В§+В 12 -до 642,3 в порівнянні з 218,79 мкгР-РНК/г тканини контрольних тварин.

Нашими дослідженнями виявлений значний регуляторний вплив :умісних ін'єкцій вітамінів трупи В на перебіг біосинтетичних процесів з клітинах яєчника. Так, вміст ядерного попередника цитоплазматичної зибосомальної РНК дещо знижується у телиць, що одержували вітамі -т Вб+Вс та достовірно зростає у телиць, що одержували додатково ві-■амін Ві2- У контрольних тварин концентрація рН 7 фракції РНК ста -товила 27,47 мкг Р-РНК/г тканини, у телиць 2 групи - 12,23, а у те-іиць 3 групи - відповідно 31,50 мкг Р-РНК/г тканини (Р<0,05). В х>й же час вміст попередника цитоплазматичної інформаційної РНК, фракції рН 8 РНК, достовіпно зростає під впливом обох застосованих :омбінацій вітамінів групи В.

Таблиця З

Вміст нуклеїнових кислот в клітинах ендометрія статевозрілих телиць (Mim, п=4), мкг Р-РНК ( Р-ДНК )/г сирої тканини.

Групи тварин

Показники 1 контроль 2 Вс+Вб 3 Вс+Вб+Ві2

Ядепні НК

фракція pH 7 14,09 18,11 10,09

РНК ± 1.06 + 1,25** + 0,97*

"залишкова” 143,66 487,99 429,86

РНК + 10,42 + 16,96* + 13,36**

Цитоплазматичні НК

Мітохондріальні 40,39 44,60 78,26

РНК ±1,94 + 14,76 ± 9,49*

Мітохондріальні 10,43 26,20 23,31

ДНК ±0,54 + 0,36*** + 0,50**

Рибосомальна 218,79 248,79 642,31 .

РНК ± 19,43 + 10,19 + 42,35**

Нами показано, що застосування поєднаних ін'єкцій вітамінів групи В під час гормональної стимуляції статевих процесів у телиць значно збільшує вміст нуклеїнових кислот в рибосомальній та міто-хондріальиій фракції цих клітин. Так, вміст рибосомальної РНК у телиць 2 групи (вітаміни Вс+Вб) становив 413,77 (Р<0,05), в той час як в контрольній групі - 319,90мкг Р-РНК/гтканини.

Спостерігається висока синтетична активність ізольованих клітинних ядер печінки дослідних телиць. Включення [|4С]-мічених амінокислот клітинними ядрами гепатоцитів телиць 2 дослідної групи (вітаміни Вб+Вс) становило 300 тис. імп/хв/мг білка ядер, у телиць З групи (вітаміни Вс+Вб+Ві2) Суло максимальним - 521,6, втой час як у телиць контрольної групи цей показник становив лише 251,8 тис. імп/хв/мг білка.

-11-

3.3. Вплив вітамінів В), В2 і РР на концентрацію нуклеїнових кислот в клітинних органелах та інтенсивність включення мічених амінокислот ізольованими клітинними ядрами тканин телиць З даних таб. 4 видно, що застосовані нами вітаміни групи В виявляють регуляторний вплив на процеси транскрипції і трансляції генетичної інформації в клітинних ядрах ендометрію дослідних телиць. Так, достовірно зростає вміст попередників цитоплазматичної рибосомальної РНК при ін'єкціях вітаміну В2 - У тварин цієї групи вміст рН 7 фракції РНК становить 55,39 мкг Р-РНК/г маси тканини в порівнянні з 44,60 (Р<0,05) у контрольних телиць.

Таблиця 4.

Вміст нуклеїнових кислот в клітинах ендометрія статевозрілих • телиць ( М + ш, п=4), мкг Р-РНК ( Р-ДНК )/г сирої тканини.

Групи тварин

Показники 1 контроль 2 В, 3 В2 4 РР

Ядерні НК фракція рН 7 РНК 44,60 + 3,14 49,69 + 3,87 55,39 + 2,62* 43,05 + 5,43

"залишкова" РНК 224,69 + 6,35 281,75 + 28,05 257,85 + 10,63* 298,89 + 14,65**

Цитоплазматичні НК Мітохондріальні 209,80 РНК + 20,72 220,47 + 15,82 201,11 + 10,54 260,02 + 46,02*

Мітохондріальні днк 41,00 ± 14,57 54,60 + 7,32 97,20 ±11,01* 59,60 + 15,80

РибОсомальна РНК 209,53 + 32,67 263,43 + 9,52 328,37 + 27,71* 352,50 +.25,90**

Досліджувана нами, так звана "залишкова" РНК, складається з резервних форм рН 7 і рН 8 фракцій РНК. У телиць, що одержували ін'єкції вітамінів, вміст "залишкових" РНК в клітинних ядрах становив відповідно в 2 групі (вітамін Ві) - 281,75, в 3 групі (вітамін В2) - 257,85 і в 4 групі - 298,89 (Р<0,01) в порівнянні з 224,66 мкг Р-РНК /г сирої маси тканини ендометрію контрольних тварин.

Активна експресія генома клітин ендометрія під впливом застосованих короткотривалих ін'єкцій вітамінів групи В проявляється також і в підвищеній здатності клітинних ядер включати [II- 14С]-амінокислотгідролізата білків хлорели (таблиця 5). Так, у телиць контрольної групи показник білок-синтезуїочої активності клітинних ядер ендометрію становив 74,42 тис. піп/хв/мг білка ядер; при застосуванні вітаміну Ві у телиць 2 групи зріс до 86,43, а при застосуванні вітаміну В2 у телиць 3 групи був максимальним - 105,87 тис. імл/хв/мг білка (Р<0,05). Також помітно збільшується вміст РНК ри-босомальної фракції клітин ендометрія телиць, які одержували екзогенні вітаміни Ві, В2 і РР. Найбільший ефект дало використання рибофлавіну та нікотинаміду - відповідно у телиць 3 групи вміст ри-босомальних РНК становив 328,4 (Р<0,05), а у телиць 4 групи - 352,5 (Р<0.01), в порівнянні з 209,53 мкг Р-РНК/г сирої маси ендометрію у контрольних телиць.

Таблиця 5,

Інтенсивність включення [ и -14С ] мічених амінокислот гідролізату білків хлорели в ізольовані клітинні ядра тканин телиць ( М + ш, п=4), тис.імп/хв/мг білка.

Групи тварин

Тканини 1 контроль 2 Вх 3 в2 4 РР

Ендометрій 72,42 86,43 105,87 79,91

+1,68 + 7,71 ±12,70* ¿1,73

Яєч:ник 162,99 102,76 464,30 336,20

±4,95 + 49,53 + 9,91* + 6,20*

Селезінка 17,14 22,91 31,14 44,29

+ 2.45 + 3.10* + 3.05** + 9.28

Дуже важливим фактом є регуляторний вплив гормональної обробки на фоні введення вітамінів В|, В2 і РР на функціонування клітин яєчника дослідних телиць. Аналізуючи одержані дані бачимо, що вітамінні ін'єкції приводять до суттєвого збільшення рівня синтезу нуклеїнових кислот в клітинних ядрах цієї тканини. Так, вміст попередників цитоплазматичних рибосомальних РИК, що екстрагуються у вигляді фракції рН 7, зростає у всіх трьох дослідних групах. У телиць,що одержували вітамін Ві, цей показник становив 57,78 (Р<0,05), при введенні вітаміну В2 був максимальним - 61,43, а при введенні РР зріс до 58,82 (Р<0,05) мкг Р-РНК/г тканини яєчника. У телиць, що вітамінні ін'єкції не одержували, вміст рН 7 фракції РНК становив лише 47,55 мкг Р-РНК/г тканини.

З даних таблиці 5 видно, що підвищення концентрації ядерних нуклеїнових кислот в клітинах яєчника дослідних телиць тісно пов'язане із активною експресією генома клітин. В дослідних групах значно зростає включення мічених [!4С]-амінокислст гідролізата білків хлорели в ізольовані клітинні ядра яєчника. Так, під впливом вітаміну В2 білок-синтезуюча активність ядер клітин яєчника телиць З дослідної групи зросла до 464,3 (Р<0,05), а під впливом РР - до 336,20 (Р<0,05), в той час як у контрольних тварин цей показник становив лише 162,99 тис. імп/хв/мг білка ядер. Помітно збільшується вміст РНК в рибосомальній фракції клітин яєчника телиць всіх дослідних груп. Однак, найбільша і статистично достовірна зміна занотована в 2 групі, де телиці одержували ін'єкції тіаміну під час гормональної стимуляції - тут вміст рибосомальних РНК становив '265,32 (Р<0,05), в порівнянні з 191,02 мкг Р-РНК/г тканини яєчника у контрольних телиць.

Всі застосовані нами вітаміни прі-г одять до зростання в клітинних ядрах гепатоцитів вмісту попередників цитоплазматичних інформаційних РНК. В той час як в контрольній групі вміст рН 8 РНК становив 65,36 мкг Р-РНК/г тканини, в 3 і 4 групі відповідно на вітамінах В2 і РР - 81,63 (Р<0,01) і 77,15 (Р<0,05). Вміст резервних "залишкових" РНК в клітинних ядрах печінки зростав під дією двох вітамінів - В2 і РР. Відповідно, в 3 та 4 групах тварин цей показник становив 701,81 (Р<0,05) та 882,07 (Р<0,05) в порівнянні з 514,99 мкг Р-РНК/гтканини печінки в контролі.

-14-

- 3.4.Досліцження вмісту нуклеїнових кислот та

білок-синтезуючої активності клітинних ядер при сумісному введенні вітамінів Ві+РР В таблиці б показано, у телиць, що одержували вітамінні ін’єкції, зростає вміст ядерних попередників цитоплазматичних рибосо-мальних РНК (фракція рН 7 РНК) до 26,03, в той час як у контрольних телиць цей показник становив 21,7 мкг Р-РНК/г сирої маси тканини.

Достовірно зростає при застосуванні вітамінів вміст ядерних ДНК в ендометрії дослідних телиць. Так, у контрольних телиць знайдено 148,0 мкг Р-ДНК/г тканини, при застосуванні вітамінів Ві+РР у дослідних телиць - 177,8 (Р<0,05) мкг Р-РНК/г тканини. .

Таблиця 6,

Вміст нуклеїнових кислот в клітинах ендометрія статевозрілих телиць ( М + т, п=4), мкг Р-РНК ( Р-ДНК )/г сирої тканини.

Групи тварин

Показники 1 контроль 2 Ві+ РР

Ядерні НК

фракція рН 8 13,09 16,41

РНК ±1,04 + 0,84*

"залишкова” 72,29 185,30

РНК ±28,80 + 34,00*

ядерна 148,00 177,60

ДНК ± 25,50 + 11,36*

Цитоплазматичні НК

Мітохондріальні 17,90 ' 26,00

ДНК ± !»'28 7,60*

Рибосомальна ' 142,26 168,48

РНК + 16,52 + 7,10*

-153 даних таблиці 7 видно, що підвищення включення [14С}-амі-нокислот в ізольовані клітинні ядра ендометріїо дослідних телиць свідчить про значну каріоплазматичну білок-синтезуїочу активність. Так, більше як в 2 рази зростає включення мічених амінокислот в клітинні ядра ендометріїо телиць, що одержували сумісні ін'єкції тіаміну і нікотинаміду. Відповідно, у тварин цієї групи показник включення становив 80,6, тоді як у контрольних тварин лише 39,6$ тис. імп/хв/мг білка ядер.

Таблиця 7

Інтенсивність включення [и-НС] мічених амінокислот гідролізату білків хлорели в ізольовані клітинні ядра тканин телиць ( М ± ш, п=4 ), тис.імп/хв/мг білка.

Групи тварин

Тканини 1 контроль 2 Ві + РР

Ендометрій 39,67 80,61

±5,39. І 17,10

Яєчник 61,31 187,83

±5,54 + 15,51***

Печінка 74,91 83,18

+ 1,81 ± 1,08

Селезінка 54,19 95,58

ч ± і,зо ± 1,15*

Застосовані препарати мають значний регуляторний вплив на вміст нуклеїнових кислот в клітинних ядрах печінки дослідних телиць. Так, достовірно збільшується вміст попередників цитоплазматичних рибосомальних РНК. в клітинних ядрах печінки телиць, яким ввс,,или вітаміни В]+РР. ВмістрН 7 фракції ядерних РИК в цій групі становить 6^,86 (Р<0,05),в порівнянні з 46,98 мкг Р-РНК/г тканини у телиць контрольної групи, яким вітаміїіи не вводили.

. Дані таблиці 7 показують, шо ізольовані клітинні ядра печінки . телиць, яким вводили тіамін і нікотинамід, більш інтенсивно

вкшочають [)4С]-амілокислоти гідролізату білків хлорели. В цій групі телиць показник білок-сшітезуючої активності складав 83,18 в порівнянні з 74,90 тис. імп/хв/мг білка ядер у телиць контрольної групи.

Під впливом застосованих вітамінних ін'єкцій зростає вміст всіх фракцій цитоплазматичних РНК в клітинах мезентеріальних лімфовузлів дослідних телиць. Так, якщо вміст рибосомальних РНК в контрольній групі становив лише 359,0+, то при введенні тіаміну і ніко-' тинаміду в клітинах мезентеріальних лімфовузлів цей показник зріс до 443,74 (Р<0,05) мкг Р-РНК/г тканини.

3.5.Вплив вітамінів В] та РР, введених по

модифікованій схемі, на б;осинтетичні процеси в клітинах репродуктивних органів телиць

З метою спрощення схеми вітамінної обробки телиць під час гормональної стимуляції статевої охоти в останньому досліді нами була застосована модифікована схема введення вітамінів. Дослідним телицям вводили вітаміни В і і РР в тій же разовій дозі, що і в третьому досліді, але через день.

Результати проведеного аналізу вмісту нуклеїнових кислот в клітинах ендометріїо дослідних телиць вказують, що, хоча і зменшилась сумарно одержана доза вітамінів, однак спостерігається інтенсифікація процесів транскрипції і трансляції генетичної інформації. Введення вітамінів В і і РР по модифікованій схемі приводить до зростання концентрації окремих класів нуклеїнових кислот.в клітинних ядрах ендометріїо дослідних телиць. Наприклад, якщо в контрольній групі телиць вміст рН 7 фракції РНК становив 122,30, то при введенні вітаміну РР телицям 3 групи цей показник зріс до 189,43 мкг Р-РНК/г тканини (Р<0.05). При введенні вітаміну В і також відмічається зростання вмісту попередника цитоплазматичної рибосомальної РНК, але дещо менше, - у телиць 2 групи концентрація рН 7 фракції РНК становить 153,33 мкг Р-РНК/г тканини.

Про інтенсивний перебіг процесів транскрипції і трансляції генетичної інформації в клітинах ендометріїо дослідних телиць свідчить підвищена білок-синтезуюча активність ізольованих клітинних ядер. При введенні вітаміну В] включення [14С]-аміііокислот гідро-лізата білків хлорели в ядра клітин ендомегрію телиць 2 групи становило 425,07, а при введенні вітаміну РР телицям .3 групи - 309,57 (Р<0,05), тоді як в контролі цей показник становив лише 278,6 тис. імп/хв/мг білка ядер.

Важливим показником функціонального стану генітальних органів є рівень синтетичних і обмінних процесів в яєчнику. На рисунку 5 наведені дані про вплив застосованих вітамінів групи В на біосинтез різних фракцій нуклеїнових кислот в ядрах, рибосомах і мітохондріях клітин яєчника дослідних телиць. Так, зростає вміст ядерних попередників рибосомальних і інформаційних РНК у телиць обох дослідних груп; наприклад, при застосуванні нікотшіаміду у телиць 3 групи

- до 148,89 (Р<0,05), тоді як у контрольних телиць цей показник становив 117,25 мкг Р-РНК/г тканини.

В результаті сумісної дії вітамінів і гормонального препарату поряд із синтезом попередників цитоплазматичних РНК, в ядрах клітин яєчника синтезуються і резервні форми нуклеїнових кислот. На -приклад,введення телицям вітаміну В] привело до зростання вмісту ядерних "залишкових" РНК в клітинах яєчника від рівня 296,2 у конт -рольних телиць до 362,81 (Р<0,05) мкг Р-РНК/г тканини.

Активація процесів експресії генома клітин яєчника під впливом застосованих вітамінів групи В проявляється у збільшенні здатності ізольованих клітинних ядер до включення [1‘,*С]-амінокислот. Наприклад, застосування тіаміну в якості вітамінного фону при стимуляції еструсу у телиць приводить до зростання білок-синте-зуючсї активності ізольованих клітинних ядер яєчника телиць 2 дослідної групи до рівня 279,94 (Р<0,05), а застосування нікотииаміду у телиць 3 дослідної групи - 273,55, в порівнянні з 212,46 тис. імп/хв/мг білка ядер у контрольних телиць.

Результати проведених нами експериментальних досліджень по впливу окремих вітамінів групи 3 на обмін нуклеїнових кислот, особливо ядерних їх фракцій, в клітинах репродуктивних органів телиць свідчать, по-перше, про участь їх в регуляції біосинтезу нуклеїнових кислот в ядрах клітин, а значить, приймають участь в регуляції експресії генів, активуючи полімеразні ферментні системи, подруге, підвищують рівень біосинтезу ядерних білків, підвищуючи бі-лок-синтезуючу активність ядерних рибосом, створюючи, очевидно, ак'і ивні конфігурації макромолекул, включаючи, таким чином, в біо-синтетичні.й процес більшу кількість неактивних рибосом. Можливо, що це саме відбувається і в цитоплазматичних білок-синтезуючих по-дісомальних структурах. Можна також думати, ідо кожен вітамін групи В має свій специфічний мембранний і цитоплазматичний рецептор, за допомогою якого транспортується в цитоплазму і ядро, де в ком-

плексі з гормонами регулює клітинні біосинтетичні процеси в репродуктивних органах тварин.

4. ВИСНОВКИ

1. Показано, що вітаміни групи В, введені статевозрілим тели-

цям на протязі 7 днів під час стимуляції репродуктивних функцій комплексним гормональним препаратом "Озоген", диференційовано підвищували рівень нуклеїнових кислот і білків в клітинах тканин дослідних тварин. ' ■

2. Вітаміни Вб і В і2 підвищували концентрацію ядерного попе-

редника цитоплазматичної інформаційної РНК (іРНК) і ДНК ядер та цитоплазматичноїрибосомальної РНК, а вітаміни В5 і Вс - концентрацію мітохондріальної РНК і ДНК та бі^ок-синтезуючу активність ізо -льованих клітин ендометрію телиць, концентрацію залишкової РНК і ДНК ядер, мітохоидріальної РНК і ДНК та білок-синтезуючу активність ядер клітин яєчників. '

3. Встановлено, що вітаміни Вб, Вс і В12, ткашщослецифічно підвищували концентрацію попередників цитоплазматичних рРИК і іРНК, залишкової РНК і ДНК ядер, РНК і ДНК мітохондрій, цитоплазматичної РНК рибосом, достовірно стимулювали інтенсивність включення [іМ4С]-амінокислот ядрами гєпатоціггів, спленоцитів, клітин підшлункової залози і мезентеріальних лімфовузлів.

4. Виявлено, що підвищення рівня залишкової РНК і ДНК ядер,

мітохондріальної РНК і ДНК та рибосомальної РНК цитоплазми клі -тин ендометрію і яєчників краще виражене при поєднаному введенні тваринам Вс+Вб+ Віз,ніж при введенні Вс+Вб. Ці дані підтверджуються результатами гістоморфометричних досліджень ендометрію і яєчників. .

5. Концентрація фракцій ядерних РНК і ДНК, мітохондріальної ДНК гепатоцитів, фракцій ядерних РНК, мітохондріальних і рибосома-льних РНК, 1,5 - 2-разове зростання інтенсивності включения

[II-І4С]-амінокислот ядрами клітин підшлункової залози, селезінки

і мезентеріальних лімфовузлів підтверджують перевагу ввгдення трьох вітамінів, Вс+Вб+Ві2 для створення оптимального їх рівня в ткашшзх організму телиць.

6. Підвищення рівня вітамінів в організмі шляхом щоденного введення Ві, В2 і РР на протязі 7 днів сприяло зростанню рівня за-

ліішкопої РНК і ДНК ядер, РНІС мітохондрій і рибосом клітин сндо -метрію і яєчників, підвищувало білок-синтезуючу активність ядер клі -тіш ендометрію, яєчників, гепатоцитів, силеноцитіи, внаслідок чого збільшувалась товщина призматичного епітелію, плоша крипт ендо-мстрію, ісількість мітотичних клітин стійки ростучих фолікулів, товщина епітелію та довжина складок слизової оболонки яйцепроводу.

7. Комплексний гормонально-вітамінний препарат на фоні поєднаного введення дослідним тваринам вітамінів Ві+ РР підвищив концентрацію досліджуваних фракцій РНК ядер, мітохондрій і рибосом в клітинах ендометрію, яєчників, печінки і селезінки, що свідчить про високий рівень їх біосинтезу, внаслідок чого втричі підвищувалась інтенсивність включення [ и -14 С] -аміиокі!сл от ізольованими ядрами тканин.

8. Вітаміни Ві і РР, введені телицям що другого дня, підвищували концентрацію ядерних попередників цитоплазматичних рРНК і іРНК, залишкової РНК і ДНК ядер, мітохондріальної РНК і ДНК та рибосомальної РНК в клітинах ендометрію і яєчників. Це стимулювало включення [и-14С]-амінокислот ізольованими ядрами, що вказує на значення дози і частоти введення вітамінів групи В тваринам.

9. Показано, що вітаміни групи В можуть служиги активними компонентами комплексного гормонального препарату для покращен -ня функції репродуктивних органів корів під час інволюції, при стимуляції поліовуляції та покращення приживання ембріонів.

5. ПРОПОЗИЦІЇ ДЛЯ ПРАКТИКИ

1. Одержані дані по біосинтезу нуклеїнових кислот і білків

використовуються нами в розробці високоефективних ліпосомальних гормонально-вітамінних препаратів для підвищення функції репродуктивних органів корів і телиць при пересадці ембріонів великої рогатої худоби. В одну дозу комплексного препарату для телиць паруваль-

ного віку пропонуємо вводити: В і-0,48 г; Вг - 0,05 г; Вб - 0,3 г;

В а - 0,001 г; Вс-0,03 г;РР-0,2 г.

2. Підготовлені заявки на одержання патентів по впливу вітамі-

нів . рупи В на репродуктивні функції тварин.

3. Одержані дані використовуються у навчанні студентів Акаде-

мії ветеринарної медицини по технології виготовлення і використан-

ня комплексних гормонально-вітамінних препаратів.

-20-

6. СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ПО ТЕМІ ДИСЕРТАЦІЇ

1.Наконечна О.В., Кузимків З.В., Чорненький Т.Я., Вишневський М.М. Вплив вітамінів групи В на рівень нуклеїнових кислот в тканинах телиць-реципієнтів.// VI Укр. біохім. з'їзд. Тези доповідей, -Київ, 1992,4. 2,с. 71.

2.Наконечна О.В., Чорненький Т.Я., Вишневський М.М., Розгоні І.І. Інтенсивність синтезу білка клітинними ядрами генітальннх та паренхіматозних органів телиць-реципієнтів під впливем застосованих вітамінів групи В.// Матеріали конф. молодих вчених "Проблеми с.-г. виробництва карпатського регіону", Тези доповідей, В. Бакта, 1992,

с. 55.

3. Наконечна О.В., Розгоні І.І. Вміст нуклеїнових кислот в . клітинах репродуктивних органів на фоні ін'єкцій вітамінів групи В.// Науково-технічний бюлетень ІФіБ тварин УААК, - в.14(1), с.71.} :

4. Наконечна О.В., Розгоні І.І. Білок-синтезуюча активність клітинних ядер у тканинах телиць Під впливом вітамінів групи "В". //Науково-технічний бюлетень ІФіБ тварин УААН, - в.14(1), с.38., * ^ -

5. Наконечна О.В., Чорненький Т.Я., Розгоні І.І. Включення [и-!4С]-амінокислот в білки клітинних ядер телиць при ін’єкціях вітамінів Ві, В2 і РР.//Науково-техлічний бюлетень ІФіБ тварин УААН,-в.І5(1),с.7-10.

6. Наконечна О.В., Розгоні 1.1., Чорненький Т.Я. Вплив віта-

мінів Bj, В2 і РР на синтез нуклеїнових кислот в матці і яєчнику телиць.//Науково-технічний бюлетень ІФіБ тварин УААН, - в. 15(1), с.10-13. .