Рецепция этилена и роль мономерных G-белков в передаче этиленового сигнала

Мошков, Игорь Евгеньевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Рецепция этилена и роль мономерных G-белков в передаче этиленового сигнала
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Рецепция этилена и роль мономерных G-белков в передаче этиленового сигнала"

На правах рукописи

мошков

Игорь Евгеньевич

Рецепция этилена и роль мономерных &-белков в передаче этиленового сигнала

(03.00Л2 - физиология и биохимия растений)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва-2003 (¿])гу (

> ОБЯЗАЛ" ьПЬНЫЙ •

Работ» выполнена в Институте фюшологнн растений ям. КЛ Тимирязева РАН, г. Москва.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, [деофессор доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук, профессор

Лев Сергеевич Ягужннскяй Мнханл Сергеевич КрнякнИ Дмитрий Анатольевич Лось

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и ЮЛ. Овчинникова РАН, г. Москва

Защита состоится 25 ноября 2003 г. в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.210.0] при Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35. Факс: (095)977 8018, электронная почта: ШхЙфргазл]

С диссертацией можг ломиться в библиотеке Института физиологии растение им. К.А. Тимирязева РХ

Автореферат разослан 21

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор биологических НГ7

Н.В. Загоскина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из важнейших факторов, обеспечивающих и координирующих физиологические функции растений, являются фито гормоны. Наиболее актуальным и интенсивно развивающимся направлением современной фитогормо-иологни является исследование процессов восприятия, усиления, передачи и преобразования гормональных сигналов. Центральное положение в этом ряду занимают процессы специфического узнавания гормона его рецепторами, в результате чего инициируется цепь биохимических реакций, необходимых для передачи гормонального сигнала к месту его реализации и осуществления эффекта гормона на уровне клетки.

Фитогормон этилен является глобальным регулятором физиологических изменений, происходящих в растениях как при нормальных, так и стрессовых условиях (Abeles et а/., 1992). Этилен и ингибиторы его действия - в отличие от остальных фитогормонов — широко применяются в сельском хозяйстве и пищевой индустрии. В связи с этим на протяжения многих лет исследования механизма действия этого фитогормона были и остаются одной из центральных задач биологии растений.

Однако следует отметить, что исследования рецепторов этилена и наиболее ранних событий, происходящих на посг-рецепторном уровне, начались несколько позднее, чем для других фитогормонов, поскольку сама идея существования белковых рецепторов для газа вызывала сомнения, а технические проблемы, связанные с биохимической идентификацией возможных рецепторов, не были решены.

Тем не менее, на рубеже 70- и 80-х годов прошлого столетия двумя группами исследователей были идентифицированы этилен-связдаающие сайты у Vigna radiata (Sisler, 1979) и Phaseoltis vulgaris (Bengochea et al. t ] 980). У обоих объектов связывающие сайты имели высокую аффинность к этилену, но скорости ассоциации/диссоциации были низкими (Tía ~ 12 час). Поскольку многие эффекты этилена проявляются быстро, то можно было ожидать, что рецепторы должны иметь высокие скорости ассоциации/диссоциации. В связи с этим полученные результаты были скорее неожиданными, но именно это свойство этилен-связываюцщх сайтов Ph. vulgaris - низкая скорость диссоциации связанного этилена - было использовано для выделения этилен-связывающих белков (ЭСБ).

Последние два десятилетия отмечены значительными результатами в области изучения рецепторов этилена. В определенной степени это произошло благодаря исследованиям связывания этилена in vivo (Sister and Wylie, 1978), что возможно только для газообразных веществ и, в частности, этилена в связи с отсутствием проблем с их проникновением внутрь растения. Следует подчеркнуть, что именно этот метод был использован для характеристики полученных этилен-нечувствительных мутантов АгаЫ-dopsis (Bteecker et al., 1988; Guzman and Ecker, 1990). При исследовании связывания этилена in vivo в этиолированных пророста ах риса и гороха, а также листьях Arabidopsis (Sanders etal., 1990, 1991) бьшо обнаружено существование не одного, каку семядолей

Pk vulgaris, а, по крайней мере, двух типов этилеи-связывающих сайтов: один с Тщ - 30 мин (быстрые" сайты), другой с Т|я ~ 12 час ("медленные" сайты), причем оба типа связывающих сайтов имели близкую аффинность к этилену.

Исследование связывания этилена in vivo растениями этилен-нечувствительного мутанта Arabidopsis etr¡ показало, что у него связывание гормона снижено на 80% по сравнению с диким типом (Bleecker et al., 1988). Это позволило предположить, что в etrl мутации произошли в гене рецептора этилена. Позиционное клонирование гена ETR1 (Chang et al., 1993) и анализ его последовательности показали, что ETR1 кодирует сенсорную гистидинкиназу, гомологичную тем, которые участвуют в рецепции различных сигналов у бактерий и грибов (Parkinson and Kofoid, 1992). Данные генетического анализа рада этилен-нечувствительных мутантов Л. thaliana (Roman et al, 1995) позволили заключить, что кодируемый геном ETR1 белок располагается в самом начале цепи передачи этиленового сигнала, что также указывало на его возможную рецмтгорную функцию. При экспрессии в клетках Saccharomyces cerevisiae немутированного гена ETR1 дрожжи приобретали способность связывать этилен (Schaller and Bleecker, 1995). Эти результаты убедительно демонстрировали рецепторную роль белка ETR1.

Молеку лярно-генетическис исследования мутантов A, thaliana по чувствительности к этилену послужили основанием рассматривать белок, кодируемый геном CTR1, в качестве следующего за рецептором компонента (Kieber et ai, 1993). Белок CTR1 представляет собой Сер/Тре протеин киназу, которая имеет гомологию с МАПЗ киназами Raf типа животных (Kieber et ai, 1993). На основании этих данных было постулировано, что в передачу этиленового сигнала вовлечен МАП-КШазпый каскад.

МАП-китозные каскады являются эффекторами ГТФ-связывающих белков (G-бел ков) как гетеротримерных, так и мономерных, в клетках животных и дрожжей (Gil-man, 1987; Hall, 1990; Herskowitz, 1995). В указанных системах G-белки интенсивно исследуются, поскольку не вызывает сомнений их важная роль в сигнальной транедукции, а также ввиду того, что G-белки являются продуктами онкогенов (Hunter, 1997). Иная ситуация наблюдалась у растений. К началу нашей работы информация о возможной роли G-белков в передаче сигналов в высших растениях была фрагментарна несмотря на то, что было обнаружено и охарактеризовано значительное число генов, кодирующих растительные G-белки, гомологичные О-белкам животных и дрожжей (Тепуп et aL, 1993; Ma, 1994). В работах ряда авторов было продемонстрировано возможное участие гетеротримерпых G-белков (iG-белков) при передаче аухеинового сигнала (Zaina et al., 1990), световой регуляции (Romero el ai, 1991; Warpeha et ai, 1991), грибной инфекции (Legendrc et ai, 1992; Kawakila aad Dokc, 1994), а также при связывании фузикокцина с его предполагаемым рецептором (De Boer etal, 1994).

Гомология между белком CTR1 и МАПЗ киназой Raf типа, которая в клетках животных регулируется мономерными G-бслками (мО-белками) Ras суперсемейства (Daum et al., 1994), позволяла предполагать, что G-белки могут участвовать в передаче этиленового сигнала. Правомерность такого предположения подкреплялась тем, что

трехмерная структура акцептирующего {receiver) домена рецептора этилена ETR1 (Schaller et al, 1995) сходна со структурой представителей Ras су переем ейства mG-белков (Bourne et я/., 1991). Однако исследований возможного участия G-белков в транедукции этиленового сигнала не проводилось.

Перечисленные выше проблемы определили необходимость проведения настоящей работы, поскольку исследования рецепторов этилена и событий, разворачивающихся на пост-рецепторном уровне, являются ключевыми для установления механизма действия фитогормона и важны для выяснения общих принципов восприятия и передачи сигналов в растительной клетке.

Цель исследования состояла в изучении молекулярных механизмов рецепции этилена и путей передачи его сигнала в клетках растений, идентификации компонентов, во&зехаемых в этот процесс, и исследовании их функциональной активности.

Задачи исследования.

1. Исследовать связывание этилена in vitro с мембранами и мембранными белками из этиолированных эпнкотилей гороха и изучить его кинетические параметры.

2. Выделить и охарактеризовать этилен-связывающне белки из семядолей развивающихся семян Phascohts vulgaris.

3. Исследовать регуляцию этиленом связывания ГТФ в клетках высших растений и идентифицировать ГТФ-связывающие белки, активность и экспрессия генов которых модулируется этиленом.

4. Изучить возможность участия ГТФ-связывающих белков в передаче этиленового сигнала.

5. Исследовать возможное взаимодействие этилена и цитокинина на уровне компонентов предполагаемых путей передачи сигналов этих фито гормонов.

Основные положения, выносимые на защиту.

• Впервые исследовано связывание этилена in vitro с мембранами из этиолированных эпнкотилей гороха и определены его кинетические параметры, которые соответствуют таковым /« vivo. Связывание этилена in vitro регулируется фосфорилироеанием бел ков-рецегтгоров.

• Идентифицированы и охарактеризованы полипептиды (26 и 28 кДа), обладающие этилен-связывающей функцией в семядолях фасоли, и показано их родство с рецептором этилена ETR1 га листьев Arabidopsts.

• Впервые доказано участие mG-белков в транедукции этиленового сигнала в клетках высших растений.

• Этилен дифференциально и транзиторно регулирует ГТФ-связывающую активность G-белков в листьях Arabidopsts и этиолированных эпикотилях гороха. Совокупность свойств этилен-регулируемых G-белков позволила отнести их к mg-белкам Ras суперсемейства, в частности - Rab семейству.

• Модуляция активности MG-белков рецептор-зависима к этилен-специфична, что доказано с использованием мутантов Arabidopsis и высокоспецифичных ингибиторов действия этилена рецепторного уровня.

• ГТФ-связывающая активность коррелирует с фенотипом и чувствительностью к этилену у растений Arabidopsis: обработка этиленом растений дикого типа приводит к повышению ГТФ-связывающей активности; в etrl-1 она значительно ниже, чем в диком типе, и не регулируется этиленом, тогда как в ctrl~l, который проявляет сильный этиленовый фенотип, - значительно повышена и также не регулируется этиленом.

• Активация этиленом связывания ГТФ с мембранными MG-белкаии является одним из наиболее быстрых биохимических ответов на этилен в интактной ткани. Скорость активации MG-белков позволяет предположить, что они располагаются в непосредственной физической близости от рецепторов этилена в цепи передачи сигнала этого фитогормона.

• Этилен дифференциально и транзиторно регулирует экспрессию генов MG-белков Rab семейства.

• В листьях Arabidopsis взаимодействие этилена и цитокинина происходит на ранних этапах путей передачи их сигналов, что выражается в антагонистическом действии этой пары фнтогормонов на активность MG-белков. В этиолированных гнпокотилях Arabidopsis этилен и цитокинин проявляют аддитивный эффект при ингнбировании роста гипокотилей, причем угнетающее влияние цитокинина является не только результатом увеличения сшпеза этилена, но и следствием прямого действия цитокинина, что показано с использованием рецегтгорных этилен-нечувствительных мутантов Arabidopsis и ингибиторов действия этилена рецепторного уровня.

• Сходство кннетик активации мО-белков и этил ен-активируемого МАП-кнназного каскада позволяет выдвинуть предположение, что они функционируют в одном пути передачи сигнала. Мономерные G-белки являются промежуточным компонентом между рецепторами этилена и этилен-активируемым МАП-киназным каскадом.

Научная новизна работы. Настоящая работа, посвященная изучению рецепции этилена и роли MG-белков в транедукции этиленового сигнала, является оригинальным научным исследованием, основные результаты которого имеют приоритетный характер. Полученные результаты послужили экспериментальной базой, позволившей сформулировать новые представления о передаче этиленового сигнала на пост-рецепторном уровне, которые принципиально отличаются от пути передачи сигнала, постулированного на основании генетического анализа мутантов A. tkaliana. В работе впервые покаэаио, что у высших растений этилен транзиторно и избирательно регулирует ГТФ-связывающую активность ряда G-белков, совокупность свойств которых позволила классифицировать их как MG-белки Ras суперсемейства; некоторые из этилен-регулируемых G-белков принадлежат Rab семейству; с использованием мутантов Arabidopsis и высокоспецифичных ингибиторов действия этилена рецепторного уровня доказано, что регуляция активности MG-белков специфична для данного гормона и рецептор-зависима. Впервые

продемонстрировано, что этилен дифференциально и транзиторно регулирует экспрессию генов мв-белков ИаЬ семейства. Впервые исследовано связывание этилена т уИго с мембранами этиолированных эликотилей гороха и показано, что в этиолированных проростках гороха связывание этилена регулируется посредством фосфорилирован ия рецепторов. Из семядолей фасоли выделен и очищен белок, обладающий этилен-евязывающей функцией и имеющий иммунодетерминангы, сходные с мембранным рецептором этилена ЕТК1 из АгаЫ<к>рвЬ. Впервые получены данные, показывающие, что угнетающее влияние цитокинина на роет этиолированных гипокотилей АгаЫ<к>р$13 является не только результатом увеличения синтеза этилена, но и следствием прямого действия цитокинина; антагонизм этилена и цитокинина в листьях ЛгаЫс1ор51з обнаруживается уже на уровне активности мС-белков,

Научная и практическая значимость исследований.

Проведенные исследования имеют, прежде всего, фундаментальный характер, поскольку позволяют сформулировать общие принципы рецепции и передачи этиленового сигнала на самых ранних этапах между рецепцией фитогормона и включением/выключением нижележащих в пути передачи сигнала МАП-киназных каскадов. Вместе с тем они могут иметь и практическое значение ввиду того, что этилен является ключевым регулятором многих процессов роста и развития высших растений. Некоторые эффекты этилена, например: ускорение открывания коробочек хлопчатника, стимуляция образования адвентивных корней, усиление потока латекса у каучуконосов, влияние на преимущественное образование женских цветков у представителей семейства СисигЫ(асеае, — широко используются в сельскохозяйственной практике. Однако некоторые эффекты этилена весьма нежелательны с хозяйственной точки зрения. Так, этилен абсолютно необходим для созревания климактерических плодов, но рост продукции этилена ведет к перезреванию плодов и потерям урожая овощей и фруктов при их хранении и транспортировке. В связи с этим получение новых знаний о механизме действия этилена позволяет не только глубже понять этот процесс, по и дает возможность "управлять'1 событиями, ведущими к биологическим ответам, что может найти применение при создании новых стратегий получения растений с высокими коммерческими свойствами.

Материалы, изложенные в диссертации, могут быть использованы в учебной работе при подготовке студентов и аспирантов, специализирующихся по физиологии и биохимии растений.

Апробация работы. Материалы работы были доложены на: Международном симпозиуме "Биохимические механизмы в регуляции роста" (Милан, Италия, 1991); Международной конференции "Этилен: физиология, биохимия и практическое применение" (Москва, Пущино, Санкт-Петербург, 1992); Международном симпозиуме "Клеточные и молекулярные аспекты биосинтеза и действия гормона растений этилена* (Ажен, Франция, 1992); Международном симпозиуме "Рецепция и транедукция сигналов гормонов растений" (Москва, 1994); 9-ом конгрессе Федерации Европейских 06-

ществ физиологов растений (Брно, Республика Чехия, 1994); 10-ом конгрессе Федерации Европейских Обществ физиологов растений (Ферензе, Италия, 1996); Международном симпозиуме "Биология и биотехнология гормона растений этилена" (Хания, Греция, 1996); Международной конференции "Молекулярные, биохимические и физиологические аспекты биологии растений" (Москва, 1997}; Международном симпозиуме "Биология и биотехнология гормона растений этилена II" (Санториин, Греция, 1998); Международном симпозиуме "Сигнальные системы растительной клетки1' (Москва, 2001); 17-оЙ Международной конференции по ростовым веществам растений (Брно, Республика Чехия, 2001); ежегодной конференции Всероссийского Общества физиологов растений (Уфа, 2001); Международном симпозиуме по стрессам растений (Москва, 2001); Международной конференции "Биология и биотехнология гормона растений этилена" (Мурсия, Испания, 2002); Международной конференции "Фитогормоны в биотехнологии растений и сельском хозяйстве" (Москва, 2002) и других научных мероприятиях.

Личный вклад соискатели. Результаты, представленные в диссертации, получены лично автором в совместной работе с вед. научн. сотр. Института физиологии растений РАН, докт. биол. наук Г.В, Новиковой. В экспериментах по выделению и характеристике эгсилен-связывающего белка из семядолей фасоли участвовал Dr. N.V.J. Har-pham, а изучение влияния этилена на экспрессию генов mG-белков проводилось совместно с Dr. L.A.J Миг (оба - Institute of Biological Sciences, University of Wales, Aberystwyth, UK). На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, основная идея которых принадлежит автору, и в получении которых роль автора была определяющей.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 86 научных работ, в том числе 36 статей в отечественных и зарубежных рецензируемых научных журналах н сборниках трудов международных научных конференций.

Структура диссертации. Диссдэтационная работа содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа изложена на 288 страницах, включает 77 рисунков и 13 таблиц. Список литературы содержит 615 наименований.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Связывание -пилена in vitro с мембранами этиолированных эпнкотилей гороха.

При исследовании связывания этилена с этиолированными эцикогилями гороха in vivo было обнаружено наличие двух типов этилен-связывающих сайтов, которые имели одинаковые значения К^ но различались по скоростям ассоциации и диссоциации этилена (Т[д - 30 мин и 12 час) (Sanders et al, 1991). Аналогичные данные были получены для закончивших рост листьев Arabidopsis (Sanders et ai., 1991) и для этиолированных проростков риса (Sanders et ai., 1990). Однако исследования связывания этилена /и vivo не ответили на несколько важных вопросов: какие структуры ответственны за связыва-8

ние этилена, сколько таких структур, в чем состоят различия между двумя типами связывающих сайтов. В связи с этим одной из задач нашей работы было исследовать связывание этилена in vitro с мембранными препаратами из этиолированных эгтикотилей гороха, поскольку именно у этого объекта связывание этилена in vivo было изучено наиболее обстоятельно. Следует отметить, что для изучения связывания этилена in vitro предпочтительнее было бы использовать семядоли фасоли вследствие высокого содержания в них этилен-связываюших сайтов: до 80 пмоль/г сырого веса (Hall et al., 1990) по сравнению с 1,5-2,5 пмоль/г сырого веса в этиолированных эпикотилях гороха (Sanders et al., 1991). Однако физиологический ответ семядолей на этилен не известен, тогда как этиолированные проростки гороха обладают высокой чувствительностью к этилену, а их реакция на экзогенный этилен ярко выражена в виде так называемого "тройного ответа"; укорочение и утолщение эпикотиля и увеличение угла закручивания его апикальной частя. Кроме того, семядоли фасоли содержат лишь "медленные" сайты связывания (Bengochea et <tl., 1980), тогда как изучение связывания этилена in vivo листьями А. thaliana указывало, что функциональные рецепторы этилена, скорее, имеют высокие скорости ассоциации/диссоциации (Blcecker et al, 1988). Именно по этим причинам мы избрали в качестве объекта исследования этиолированные проростки гороха (Pisum sativum L.) сорта Аляска, в которых имеются оба типа связывающих сайтов.

Поскольку в семядолях фасоли этилен-связывающие сайты ассоциированы с мембранами (Bengochea et al., 1980), мы начали работу с характеристики связывания эткле-

Вр«мя, час

'Рис, 1, Кинетика ассоциации и диссоциации [14С]этилена с мембранами этиолированных проростков гороха in vitro. • - ассоциация этилена; о —диссоциация этилена после 2 час ассоциации с [иС]этилсном; о - диссоциация этилена после 20 час ассоциации с [1*С]этнленом, Стрелки указывают время начала вентиляции образцов.

на мембранной фракцией из 5-дневных этиолированных эпикотилей гороха, которая содержала плазмалемму и эндомембраны, Кинетика ассоциации и диссоциации [|4С]этилена in vüro (рис, 1) была аналогична таковой при связывании фитогормона in vivo. Связывание протекало наиболее активно в течение первых 20-30 мин, достигая 6065% величины максимального связывания. Затем скорость ассоциации снижалась и сохранялась на одном уровне в течение последующего инкубационного периода. Диссоциация этилена происходила в обоих случаях наиболее активно в течение первого часа вентилирования образцов, после чего скорость диссоциации снижалась. Если образцы перед началом вентилирования инкубировали с этиленом в течение двух часов, наблюдалась практически полная диссоциация гормона, тогда как при связывании этилена в течение 20 час даже после 20-часовой вентиляции уровень связанного этилена оставался довольно высоким. Этот "остаточный" этилен представляет собой гормон, связанный с "медленными" сайтами, а не является результатом его метаболизации, поскольку метаболизм этилена в этиолированных эпикотилях гороха в целом относительно низок (Sanders et ai, 1989). Кроме того, возможное включение этилена в метаболизм блокировалось добавлением в инкубационный буфер 100 мкл/л CSj, который в этой концентрации эффективно предотвращает метаболизацию этилена (Beyer, 1977; Abeles, 1984), не влияя па его связывание (Sanders et al., 1989). Эгилец, диссоциировавший в течение первого часа вентиляции, был связан с "быстрыми" сайтами. Связывание этилена in vitro с обоими типами сайтов было насыщаемым и достигало максимума при концентрации гормона - 200 нл/л (в газовой фазе). Заметим, что in vivo насыщение связывания достигалось при концентрации этилена - 50 нл/л (в газовой фазе). При сравнении этих данных следует учитывать, что растворимость этилена в липидах мембран намного превышает растворимость газа в водной среде (коэффициент растворимости этилена в буфере при температуре проведения эксперимента составляет - 0,15). Следовательно, с учетом коэффициента растворимости этилена в водной фазе, насыщение связывания происходило при концогграции гормона в водной фазе ~ 30 нл/л, что хорошо согласуется с данными, полученными in vivo. Трансформация данных по насыщению этилен-связывающих сайтов по методу Скэтчарда позволила рассчитать константы

«д

о,в \о

o* * \ \й

£ м- «■ t\» \ * \ \ \ о

м-

0,1 ■ \

0 ОДС 0,1 0.1 S <и в

Рис. 2. Графики Скэтчарда для связывания этилена с "быстрыми" (•) и "медленными" (о) сайтами в мембранах этиолированных эпикотилей гороха. В - связанный этилен (пмоль/г сыр. веса); В/Р - отношение связанного гормона к свободному (пмоль/мл в жидкой фазе).

диссоциации (Кц) для обоих типов связывающих сайтов (рис. 2), которые были близки между собой и составляли ~ 3 х Ю"10 M (в жидкой фазе). Полученные значения Кх> согласуются с данными по связыванию этилена in vivo этиолированными эпикотилями гороха (A"d = 6-8 х 10"10 M) (Sanders et al., 1991) и in vitro мембранами из семядолей созревающих семян фасоли (АГс = 6,4 х 10"JO M) (Bengochea et ai, 1980), a также с величинами физиологически активных концентраций фитогормона. В последующих экспериментах мы попытались реконструировать связывание этилена in vitro с белками, солюбилизиро-вэнными Тритоном Х-100 из мембран этиолированных эпикотилей гороха. Эти эксперименты оказались неудачными, хотя Bengochea с соавт. (1980) и Sisler (1982) сообщали о специфическом связывании этилена с солюбилизированными Тритоном Х-100 мембранными белками из семядолей фасоли и проростков маша. Отсутствие связывания этилена с солюбилизированными мембранными белками эпикотилей гороха в наших экспериментах могло объясняться несколькими причинами: содержание этилен-связывающих сайтов в проростках маша значительно выше, чем в проростках гороха; при солюбилизации из мембран этилен-связавшощие белки могли быть повреждены; для проявления эгилен-связывающей способности белкам необходимо специфическое липидное окружение. Наиболее вероятной причиной отсутствия связывания этилена с мембранными белками, солюбилизированными Тритоном Х-100 из этиолированных эпикотилей гороха, мы считаем то, что при солюбилизации мог нарушиться фолдинг эгилен-связывающих белков, и они потеряли способность к образованию необходимой для связывания конфигурации. Правомерность такого объяснения подкрепляется данными изучения гена ETR1 (Chang et al., 1993), кодирующего рецептор этилена в Arabi-dopsis, которые позволили предположить, что этилеп-связывающий сайт образуется ди-мером белка ETR1. Это предположение впоследствии было подтверждено иммунологическими методами (Schallcr et ai, 1995).

J 0,25-i

Il " I

îH г I

Filii

i г з *

Обработка

Рис. 3. Связывание [мС]этилена in vitro с мембранами этиолированных эпикотилей гороха в зависимости от степени фосфорилирования этилеп-связываю-щих сайтов, 1 - связывание с контрольными (необработанными) мембранами ; 2 - для дефосфорилированая белков мембраны перед проведением связывания обрабатывали щелочной фосфатазой (1 мг/мл); 3 - для ингибирования эндогенных фосфатаз мембршгы обрабатывали NaF (20-50 мМ); 4 - для создания возможности фосфорилирования белков эндогенными протеинкиназэми мембраны обрабатывали NaF + MgCl2 (10 мМ) + АТФ (ОД мМ).

Таким образом, связывание этилена in vitro с мембранной фракцией из этиолированных эпикотилей гороха достаточно достоверно отражало картину, полученную при исследовании связывания этилена с интактными проростками гороха in vivo (Sanders et ai., 1991). И хотя нам не удалось продемонстрировать связывания этилена in vitro с со-любилизированнымн мембранными белками, тем не менее, при использовании методики связывания этилена in vitro с мембранами из этиолированных эпикотилей гороха нам удалось получить принципиально важный результат. Было обнаружено, что дефосфори-лирование мембранных белков при помощи обработки мембран фосфатазой приводило к удвоению связывания. Ингябирование эндогенных фосфатаз или создание условий, благоприятных для фосфорилировакия белков, приводите к снижению связывания (рис. 3). То есть этилен-связывающие белки должны быть дефоефорилированы, чтобы быть способными связывать этилен. Таким образом, связывание этилена с белками-рецепторами может регулироваться за счет их фосфорилирования/дефосфорилирования. Позднее было обнаружено, что предполагаемый рецептор этилена ETR1 содержит консервативный остаток гистиднна, по которому, как это было показано в реакции in vitro, может происходить фосфорилирование белка (Gamble et al, 1998).

2. Выделение этилен-связывающего белка нз семядолен фасоли.

Попытки выделить этилен-связывающие белки (ЭСЕ) начались практически сразу после обнаружения связывания этилена в растениях. Эти работы были возможны вследствие наличия "медленных" сайтов, с которыми радиоактивный этилен сохранялся в связанном состоянии в течение длительного времени. Этот тип сайтов был детально изучен в сшрсваюших семядолях фасоли, которые с высокой аффинностью и специфичностью связывают этилен (Hall et al., 1990). Эти обстоятельства, а также высокое содержание этилеи-связывающнх сайтов в семядолях фасоли по сравнению с другими растениями делали этот объект весьма привлекательным источником для выделения и очистки ЭСБ, хотя, как уже упоминалось, проявление ответа семядолей на этилен не известно. Схема выделения и очистки ЭСБ состояла из следующих основных этапов: выделение мембранной фракции; удаление с мембран ассоциированных белков промывкой 100 мМ КС1 при рН 12; солюбилизация интегральных белков мембран 3% Тритоном X-100; последовательная хроматография солюбилизированных мембранных белков на DEAE-Sepharose FF и Mono Q IIR5/5; электрофорез в полуденатурирующих условиях. Использованию этой схемы выделения ЭСБ предшествовала инкубация семядолей с [14С] этиле ном, что позволяло по связанной радиоактивности идетгтифицироватъ ЭСБ в ходе его выделения. Максимальное осаждение связанной радиоактивности достигалось лишь при 4-час центрифугировании при 130000 g, что указывало на локализацию ЭСБ в эндомембранах аналогично тому, что было показано ранее (Bengochea et al., 1980). Этилен-связывающие сайты прочно ассоциированы с мембранами и не диссоциировали от мембран даже при обработке IOOmMKCI, рН 12. Они солюбшгизнровались лишь детергентом высокой концентрации (3% Тритон Х-100), что свидетельствовало об их высокой

гидрофобности и о том, что они являются интегральными белками мембран. В результате описанных процедур белок был очищен в 440 раз с выходом ~ 43%, при этом следует принять во внимание, что степень очистки и выход оценивались по изменению специфической этипен-связывающей активности, но ассоциированный этилен в процессе выделения белка постоянно диссоциировал, что заведомо приводило к заниженным цифрам.

При хроматографии на DEAE-Sepharose мС-радиоакгивностъ элюировалась в виде одного пика, который не совпадал с пиками злюнрующегося белка. При последующей хроматографии фракций, содержащих 1 ^-радиоактивность, на Mono Q этилен-связывающая активность также элюировалась в виде единственного пика. При злектро-форетическом анализе этой фракции в присутствии ДДС-Na, но без дитиотреитола нли 2-меркаптоэтанола и без прогревания образца перед электрофорезом {полуденатурирующие условия) обнаруживалось два полипеягида с мол. массами 28 и 26 кДа, которые удерживали связанную радиоактивность (рис. 4). Изучение статуса гликозилнрования этих полипептидов показало, что только полнпептид 28 кДа был гликозилирован (рис.

Рис. 4. Электрофорез ЭСБ семядолей фасоли в полуденатурирующих условиях. Слева приведена электрофоре грамма окрашенного ку-масси препарата ЭСЬ после хроматографии на Mono Q, справа - распределение связанной мС-радиоакгивности вдоль трека электрофоре граммы,

Рис. 5. Гдикозилированне полипептида 28 кДа ЭСБ семядолей фасоли. После ДДС-Na электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозою мембрану н проводили окрашивание на гликаны (DIG Glycan Detection Kit, Boe-hringer Mannheim Biochemica). 1 -ЭСБ; 2 - трансферрнн (гликозн-лированный белок); 3 - креатина-за (негликоэилиро ванный белок).

5). На родство выделенных из семядолей фасоли ЭСБ с рецептором этилена ETR1 из Arabidopsis указывали результаты вестерн-анализа с антителами против ETR1, кинетические характеристики которого соответствуют "быстрым" сайтам связывания этилена

(антитела предоставлены Dr. A.B. Bleecker). Оба полипептида - 28 и 26 кДа - реагировали с антителами (рис. 6, линия ]), Кроме полипептидов 26 и 28 кДа антитела взаимодействовали с полипептидом 72 кДа, который по мол. массе близок к ETR1 (Schaller et ai, 1995). По-видимому, 26-, 28- и 72-кДа полипептиды реагировали с антителами специфически, так как они отсутствовали во фракции, не проявляющей этилен-связывающей активности (рис. 6, линия 2). Сильное взаимодействие с антителами к ETR1 проявлял поли пептид с мол. массой 50 кДа (линия 1), но мы рассматриваем это взаимодействие как, скорее, неспецифическое, поскольку реакция этого полипептида с

антителами была ярко

2 1

67 — 72 (Л*

43- »—50 «Да

зо- ^_28 «Да

— 26*Д»

20,1-

14,4-

Рис, 6. Вестерн-анализ ЭСБ семядолей фасоли. Для анализа использовали препараты белка, элюированные с Mono Q: 1 -фракция, содержащая максимальную этилен-связывающую активность (2380 dpm на линию); 2 - фракция, предшествующая пику этилен-связывающей активности (329 dpm на линию). В качестве первичных антител использованы антитела к рецептору этилена ETR1 из Arabidopsis.

выражена и во фракции, где связанная ,4С-радиоактивность была существенно ниже (линия 2), Дтя окончательного решения вопроса о 72- и 50-кДа полипепгидах требуются дальнейшие исследования.

Двумерный электрофорез полипептидов 28 и 26 кДа, элюированных из одномерного геля, показал, что эти полосы содержат по одному полипептиду (рис. 7), которые слегка различаются по изоэлекгрнческой точке. Не исключено, что наблюдаемые различия в мол. массах и р1 этих полипептидов обусловлены гликознлированием полипептида 28 кДа.

кДа

5,5«-

£2 28 кДа

:?!5 94 = 87 -

43 -- } - 30 -

V- - 20,1 -Ш - 14,4 -

р.':

'7,5

га

26 кДа

Рис. 7. .Двумерный электрофорез полипептидов 28 и 26 кДа, элюированных из одномерного геля после полуденатурирующего электрофореза.

Таким образом, из семядолей созревающих семян фасоли была выделена фракция белка, в которой были идентифицированы два полипептида с мол. массами 28 и 26 кДа,

отнесенные к этилен-связывающему белку на основании связывания [14С]зтяена и реакции с антителами к рецептору этилена ETR1 из Arabidopsis, что демонстрирует функциональную значимость выделенных ЭСБ. Наличие кросс-реактивносш ЭСБ семядолей фасоли с антителами к ETR1 позволяет сформулировать ряд сушественных выводов: во-первых, ЭСБ семядолей фасоли представляет собой один из возможных рецепторов этилена; во-вторых, оба тина этилен-связываюших сайтов - "быстрые" и "медленные" - являются сходными по иммунологическим свойствам белками. Однако, на наш взгляд, вопрос о сходствах и различиях белков, несущих эти два типа сайтов, требует дальнейшего изучения.

3, ГТФ-связываюшие белки - возможный компонент пути передачи этиленового сигнала.

ГТФ-связывающие белки известны как важные компоненты путей передачи различных сигналов у животных (Gilman, 1987; Glick et al, 2000; Mumby, 2000). Напротив, относительно немного информации о природе и возможной роли G-белков в высших растениях существовало к началу нашей работы (Тепуп et al., 1993), хотя появлялись отдельные сведения об их вероятном участии в трансдукции сигналов красного (Romero et al., 1991) и синего (Warpeha et al., 199!) света, а также в ответах на грибные элискто-ры (Legendre et al, 1992; Kawakita and Doke, 1994) и токсины (De Boer et al, 1994). Наиболее интригующими были сведения о вовлечении G-белков в передачу ауксинового сигнала в клетках риса (Zaina et al, 1990), тыквы (Scherer, 1992) и культивируемых клетках сои (Scherer and Andre, 1993). Принимая во внимание эти дакные, нам представлялось важным установить, вовлекаются ли G-белкн в передачу этиленового сигнала.

3.1. ГТФ-связывающие белки семядолей созревающих семян фасоли.

Выделение ЭСБ из семядолей фасоли, свойство которого близки рецептору этилена Arabidopsís, ставили вопрос о нижележащих компонентах цепи передачи этиленового сигнала. Этот вопрос стал центральным после идентификации гена CTRL кодирующего протеинкиназу гомологичную MAII3 киназам Rafnma животных (Kieber et al., 1993). Наличие MAI 13 кил азы указывало на возможное участие МАП-киназного каскада в пути передачи этиленового сигнала. В клетках животных и дрожжей сигналы, воспринятые сенсорными системами, часто передаются на МАП-киназные каскады через G-белкн (Schmidt and Hal), 1998; Bos, 2000). В связи с этим мы предположили, что передача этиленового сигнала также может осуществляться с участием G-белков, Поскольку в исследованных путях передачи сигналов G-белки располагаются после локализованных в мембранах рецепторов, но до МАП-киназных каскадов, функционирующих в щггозо-ле, нам представлялось логичным установить, содержатся ли G-белкн в тех фракциях мембранных белков, что н ЭСБ. Для выполнения этой задачи в ходе выделения ЭСБ из семядолей фасоли мы проводили также тестирование получаемых фракций с [у-355]ГТФ7$ с целью обнаружения ГТФ-Связывающей активности, используя метод сорб-

цин несвязанного лиганда активированным углем (Romero el al, 1991). Как показано на рис. 8, при хроматографии на DBAE-Sepharose фракции мембранных белков, солюбили-зированных Тритоном Х-100, нам удалось обнаружить ГТФ-связывающую активность, причем пик этой активности элюировался раньше (фракции 9-П, рис. 8), чем пик этилен-связывающей активности (фракции 11-14, рис. 8). Фракции с максимальной

Рис. 8. Хроматография на DEAE-Sepharose FF белков, солюбилизированных Тритоном Х-100 из мембран семядолей фасоли. Во фракциях (5 мл) анализировали [у-!58]ГТФу8-связывающую и [иС]этилен-евязанную активности. Объединенные фракции с максимальной ГТФ-связывающей (9+10) И этилен-связывающей (12+13) активностями (указаны стрелками) подвергали дальнейшему анализу,

ГТФ-связывающей (9+10) и этилен-связывающей (12+13) активностями объединяли и каждую из объединенных фракций хроматографировали на Mono Q. В обоих случаях этилен-связы вающая активность элюировалась одним пиком и не совпадала с пиками ГТФ-связывающей активности (рис. 9А, Б), При хроматографии DEAE-Sepharose фракций 9+10 (рис. 8) ГТФ-связывающая активность элюировалась одним пиком (рис. 9А), тогда как при хроматографии фракций 12+13 (рис, 8) обнаруживалось два пика ГТФ-связывающей активности, причем первый пик по месту выхода соответствовал пику ГТФ-связывающей активности фракций 9+10 (рис. 9Б), а второй элюировался при более высоких концентрациях NaCl. Основываясь на результатах хроматографии на Mono Q, можно было предполагать, что во фракции мембранных белков семядолей фасоли содержится, по крайней мере, две группы G-белков. Однако связывание с fy-^SJITOyS не позволяло сказать, представителями каких классов G-белков они являются.

Одним из селективных методов идентификации G-белков является использование in situ окисленного периодатом [а-згР]ГТФ в качестве аффинной метки (Low et al, 1992), Сайт-специфическая реакция индивидуальных G-белков достигается путем взаимодействия 2',3'-днальдегидного производного ГТФ с остатком лизина в консервативной последовательности ГТФ-связывающего сайга G-белков Асн-Лиз-Х-Асп путем образования Шиффова основания с последующим его восстановлением цианоборгидридом. При помощи этого метода можно '"метить" индивидуальные G-белки и анализировать их затем, например, при помощи ДДС-Na электрофореза с последующей авторадиографией. Применив этот метод меченая с последующим разделением белков в ДДС-Na ПААГ и авторадиографией, мы обнаружили, что в Mono Q фракциях 5 н б специфически метятся полипептиды с мол. массами от 18 до 40 кДа (рис. ЮЛ и Б). Спектр меченых полипептидов в Mono Q фракциях 5 и 6, полученных при хроматографии DEAE-Sepharose фракций 9+10 и 12+13. различался, но в обоих случаях мечение высокомолекулярных полипептидов (28-40 кДа) активировалось в присутствии A1F4", который является активатором tG-белков (Gilman, 1987; Carty and Iyengar, 1994). To есть фракции 5 и б, полученные при хроматографии па Mono Q (рис. 9А и Б), содержали как tG-белки, так н MG-белки. В пользу наличия последних указывают мат. массы меченых полипептидов в области 18-25 кДа, мечение которых не активировалось AlF-f.

— «ПО; | к ! 0 г? \ a

Z V*™ п 1« g

I ю Ii

V 10004 р I «ом 1 1 V4X * \ В F -1 2 0 a

Ь 10 t« id ЛЪфрдецп

ляо Т 1Т*Н' I к »0 I i VA 1 a ш *

2 1, иш А 1

р 7400 5 саМ' S гм» Е JM 1. tt t> ^ saa | г 3 ■

' с

УЬ фрямлам

Рис. 9. Хроматография мембранных белков семядолей фасоли на Mono Q. Фракции 9+10 и 12+13, полученные при хроматографии на DEAE-Sepharose, объединяли и хромагографи-ровали на Mono Q HR5/5. В элюированных градиентам NaCl (0-350 мМ) фракциях (1 мл) анализировали активность связывания [у-3SS]rT<t>yS и наличие связанного [14С]этилена. А - хроматограмма фракций 9+10; Б — хрома-тограмма фракций 12+13. Стрелки указывают фракции, которые были использованы в последующем для аффинного мечения с [а-33Р]ГТФ.

5 6 ' * *

I-

- + - + AlFj-

II 12

- + - +

AIF7

Рис. 10. Электрофорез в денатурирующих условиях аффинномеченых с [а-32Р]ГТФ мембранных белков семядолей фасоли. Анализировали фракции белка, полученные при хроматографии на Mono Q. А - фракции 5 и 6 (см. рис. 9А); Б -фракции 5 и б (см. рис. 9Б); В - фракции 11 и 12 (см. рис. 9Б).

Иная картина наблюдалась при анализе Mono Q фракций 11 и 12: мы наблюдали сильное мечение полнпептидов g мол. массами 22-27 кДа, активность которых не изменялась в присутствии A1F«-(рис. 10В), то есть эти фракции содержали только mg-белки.

Меченые белки Mono Q фракций 6, в которой в присутствии A1F4* усиливалось связывание [а-32Р]ГТФ, и 12, в которой AUY" не оказывал влияния на мечение белков, были проанализированы в двумерном электрофорезе (рис. 11). Двумерный электрофорез

Рис. П. Двумерный электрофорез Mono Q фракций 6 и 12, меченых [сс-"Р]ГТФ.

Представлены радиоавтографы гелей.

показал, что фракция 12 содержит несколько полипептидов с мол. массой 25 кДа, которые различались по pi. Кроме этих полипептидов в этой фракции содержались полипептиды с мол. массами 20-25 кДа с близкими значениями pi. В Mono Q фракции 6 aif4" существенно активировал связывание (а-32Р]ГТФ с полипептидом 31-32 кДа, а также полипептидом 18 кДа, которые не обнаруживались в Mono Q фракции б. Эти результата подтверждали выводы, сделанные яа основании одномерного электрофореза, и позволили получить дополнительную информацию: сам ЭСБ, который содержался (хотя и не в мажорных количествах) в Mono Q фракции 12 (рис. 9Б), не является ГТФ-свяэывающим

белком, поскольку соответствующие ЭСБ (рис. 7) полипептиды не были обнаружены при анализе меченых G-белков двумерным электрофорезом. Кроме того, двумерный электрофорез показал, что даже фракции, полученные хроматографией на Mono Q, которая теоретически характеризуется высоким разрешением, могут содержать не один, а несколько близких G-белков как, например, фракция 12.

Таким образом, в мембранах семядолей фасоли ЭСБ, MG-белки и iG-белки имеют одинаковую топологию. Это позволило предположить, что G-белки могут быть потенциальными компонентами системы трансакции этиленового сигнала. Однако семядоли фасоли не являются наилучшей системой для изучения транедукции этиленового сигнала, поскольку не известны внешние проявления тех физиологический процессов в семядолях, которые происходят в ответ на этилен. Кроме того, поскольку выделение ЭСБ и детектирование G-бслков, описанные выше, проводили, используя материал уже обработанный этиленом, то невозможно было дискриминировать те компоненты, активность которых изменялась в ответ на обработку ткани этиленом. В связи с этим дальнейшая работа по исследованию возможного участия G-белков в транедукции этиленового сигнала была проведена на этиолированных эпи копиях гороха и сформировавшихся листьях Arabidopsis, то есть в биологических системах, которые отображают две разные стадии развития растений. Обе выбрашше системы характеризуются высокой чувствительностью к этилену, и внешние проявления этилен-зависимых физиологических процессов хорошо известны. Так, у этиолированных эпикотилей гороха, а также у этиолированных гипокотилей Arabidopsis экзогенный фнтогормон вызывает "тройной ответ". В сформировавшихся листьях растений Arabidopsis физиологический эффект этилена выражается в ускорении деградации хлорофилла. Выбор растений Arabidopsis в качестве модели был обусловлен и тем, что имеется широкий набор генетически охарактеризованных мутантов как по рецепторам этилена, так и по некоторым компонентам предполагаемого пути транедукции этиленового сигнала. Использование генетически охарактеризованных мутантов могло позволить расположить неизвестные ранее компоненты путей транедукции этиленового сигнала, ориентируясь и привязываясь к уже установленным.

3.2. Связывание ГТФ с мембранными белками этиолированных проростков гороха.

Поскольку в семядолях фасоли G-белки локализованы в мембранной фракции, содержащей ЭСБ, то для изучения связывания ГТФ с мембранными белками этиолированных эпикотилей гороха их выделяли так же, как из семядолей фасоли, но с некоторыми модификациями. Обработку растений этиленом или ингибиторами его действия проводили in vivo. Мембранные белки из препаратов мембран (130000 g) последовательно солюбилизировали 100 mMKCI, 750 мМ КС1 и 1% Тритоном Х-100.

Активность связывания ГТФ оценивали по связыванию негидролизуемого аналога ГТФ — [355]ГТФу5. Для исследования связывания с препаратами мембран использо-

вали фильтрацию через 0,2 мкм нитроцелдюлозные фильтры (Perdue and Lomax, 1992), а для препаратов растворимых белков и солюбнлизированных мембранных белков - метод сорбции свободного лиганда активированным углем (Romero et al, 1991).

Связывание [358]ГТФу5 с мембранами было высокоспецифичным, поскольку ин-гибировалось только туаниновыми нуклеотидтрн- и дифосфатами (рис. 12). Другие нук-

леотидгри- и дифосфаты на связывание практически не влияли. Связывание было высокоаффипным с Ко ~ 4,6 • 10'® Ми характеризовалось наличием только одного типа связывающих сайтов (рис. 13). Эти результаты согласуются с опубликованными данными (Hasunuma and Funadera, 1987; Hasunuma et al, 1987; Blum et al, 1988; Jacobs et al, 1988; Perdue and Lomax, 1992; Wise and Mill-ner, 1992). Интересный факт был обнаружен при изучении влияния свободных ионов Mg2+ на ГТФ-связывающую активность: она достигала максимума при микромолярных концентрациях свободного Mg2* (рис. 14), снижаясь нри увеличении концентрации Mg2+. Такая стимуляция связывания ГТФ микромолярными концентрациями Mg2+ характерна для MG-белков, тогда как TG-белки активируются миллимолярными концентрациями Mg2+ (Gilman, 1987; Cany and Iyengar, 1994). Активаторы TG-белков мастопаран (Higashîjima et al, 1988) и A1F4~ (Kahn, 1991; Bamtt and Gregory, 1997) не оказывали влияния на связывание [33S]rT<I>yS. Эти результаты указывали, что в исследуемых препаратах, скорее присутствуют в-белки, принадлежащие классу MG-белков,

При изучении связывания ГТФ с расгворимыми белками и солюбипизированны-ми мембранными белками специфическое связывание [55S]IT<î>yS было обнаружено во всех исследованных фракциях, однако в расчете на единицу белка оно было наивысшим в препаратах мембранных белков, солюбнлизированных 750 мМ КО и 1 % Тритоном X-100.

Поскольку G-бслки кроме ГТФ-связывающей обладают и ГТФазноЙ активностью, мы изучили гидролиз ГТФ препаратами мембран и мембранных белков этиолированных эпикотилей гороха. Активность гидролиза ГТФ оценивали по образованию меченого неорганического фосфата из [у- Р]ГТФ. ГТФазная активность была обнаружена во всех

Рис. 12. Специфичность связывания ["SJiTOyS с мембранами из этиолированных эпикотилей гороха. • - ГТФуБ; О - ГДФРЯ; ■ - ГТФ; □ - ГДФ; ♦ -ЦТФ; О - УТФ: А - АТФ; Д - АДФ,

В, пиолЫигбвлы

Рис. 13, Анализ по Сюгчарду связывания Рис. 14. Зависимость связывания [3iSirT<t>7S с мембранами из этиолирован- [35$]ГТ<3>-у8 от концентрации свободно-ных эникотнлей гороха. В - концентрация го Mg2+. связанною лиганда; B/F - отношение концентрации связанного лиганда к концентрации свободного.

исследованных препаратах и составляла 300-400 нмоль/(мг белка мин). Лишь во фракции белков, солюбилизированных из мембран Тритоном Х-100, она была на порядок ниже. Следует сказать, что полученные значения ГТФазной активности значительно ниже, чем для т<3-белков. То есть наблюдалось явное несоответствие высокого уровня связывания ГТФ (особенно в препаратах, солюбилизированных 750 мМ КС! и Тритоном Х-100) и низкой ГТФазной активности. Такая низкая ГТФазная активность при высокой ГТФ-связывающей свойственна мС-белкам, хотя их ГТФазная активность может возрастать многократно при взаимодействии MG-белков с так называемыми белками GAP (GTPase activating protein) (McCormick, 1989). Это послужило дополнительным указанием на то, что обнаруженная ГТФ-связывающая активность может быть обусловлена присутствием мО-белков.

3.3. Влияние этилена на связывание ГТФ с мембранными белками этиолированных проростков гороха.

Результаты, изложенные в предыдущем разделе, а также обнаружение G-бслков в препаратах мембранных белков семядолей фасоли были основанием для изучения влияния этилена на ГТФ-связывающую и ГТФазную активности в этиолированных эпикоти-яях гороха. Этиолированные проростки гороха обрабатывали этиленом (1 мкл/л) в течение 1 или 20 час, поскольку именно в такие временные интервалы происходит насыщение "быстрых" и "медленных" этилен-связывающих сайтов in vivo (Sanders et al, 1991) и in vitro, как показано в нашей работе. Исследование связывания [358]ГТФу5 с препара-

Kfliffrft Зтшлм Кмтродь Эплн 1ч 1ч 10ч г&ч

Й Ш -ц- ЩЩ

mm:'

тами мембран и солгобнлизированных мембранных белков позволило установить, что после I-час обработки проростков этиленом наблюдалось невысокое (20-40%) увеличение связывания в препаратах мембранных белков, солюбилизированных 750 мМ КС1 и Тритоном Х-100, причем увеличение ГТФ-связы вающей активности не сопровождалось изменениями ГТФазной активности. Последнее могло быть объяснено потерей локализованного в цитозоле GAP в ходе выделения мембран. Что касается связывания ГТФ, то интерпретация результатов, полученных при использовании ПФуЭ, весьма непроста. Прежде всего, применение ГТФу5 имеет некоторые особенности. Так, даже в отсутствие сигнала само связывание ГТФуЗ с G-белками приводит к активации TG-белков и к активации или ингибированню (в зависимости от конкретного пути, где задействованы эти

белки) MG-белков (Gilman, 1987; Melan^on et al, 1987; Bourne etai, 1991; Kahn, 1991;Codina and Bimbaumer, 1994; Wuoffer and Balch, 1994; Barritt and Gregory, 1997). Вполне возможно, что именно по этой причине мы не смогли обнаружить сксль-либо значительного влияния этилена на ГТФ-связывающую активность, поскольку связывание с ГТФу5 в образцах из не обработанных фитогормоном проростков могло приводить к активации связывания ГТФ и выравниванию его уровней между контрольным и опытными вариантами. Кроме того, связывание с [353]ГГФу8 дает картину суммарного связывания, не позволяя дискриминировать связывание с отдельными белками. Если же допустить, что этилен влияет на ГТФ-связывающую активность нескольких G-белков, причем влияет дифференциально, то есть, повышая активность одних н понижая активность других, то при этом вызванные этиленом изменения могут взаимно компенсироваться. С другой стороны, если допустить, что этилен влияет на ГТФ-связывающую активность незначительного числа G-белков, то такие изменения также могут быть не видны на фоне общего связывания ГТФ, Дтя того чтобы оце* нить связывание ГТФ с индивидуальными белками, было применено аффинное мечеиие [а-Р]ГТФ.

При использовании этого метода мы не

Кнтрвль Эплп Кфигроль Эишп 1ч 1 ч 10 ч И*

67433020,114,4-ГТФ:

• • •

- + - +-+- +

1% Тритон Х-100

Рис. 15. Эффект этилена на связывание [а- Р]ГТФ с мембранными белками, солюбилизированными 750 мМ КС! и 1% Тритоном Х-100. Этиолированные проростки гороха обрабатывали этиленом (1 мкл/л) в течение 1 или 20 час. Солюбилизи-рованные белки метили [а-31Р]ГТФ и разделяли в ДДС-№ ПААГ. Представлены радиоавтографы меченых полипетггидов.

Рис. 16. Специфичность аффинного мечекия мембранных белков этиолированных эпикотилей гороха с [а-'2Р]ГТФ. Реакцию аф-финпого мечения мембранных белков, солюбил жированных Тритоном Х-100, проводили в присутствии 100-кратного избытка немеченых нуклеотидов. Ме-че1ше белки разделяли в ДДС-Na ПААГ и визуализировали авторадиографией.

12 3 4

67 —

43 —

30 — • • -■ Ш

20,1 —

14,4 —

Рис. 17. Иммунонрещтитация мембранных белков этиолированных эпикотилей гороха анти-рап-Язз антителами. Солюбилизиро-ванные Тритоном Х-100 белки метили с [а-згР]ГТФ, затем проводили иммунопреципигацию с последующим разделением белков в ДЦС-Ка ПЛАТ. Представлен радиоавтограф электрофореграммы. Линии 1 И 3 - без обработки этиленом; линии 2 и 4 - обработка этиленом (1 мкл/л) в течение 1 и 20 час соответственно.

обнаружили влияния этилена па специфическое связывание ГТФ в препаратах, солюбилизиро-ванных из мембран 100 мМ KCl. Однако в препаратах мембранных белков, солюбнлизирован-ных 750 мМ KCl я Тритоном Х-100 наблюдалось значительное усиление специфического связывания ГТФ с полипептццами 26-28 кДа (рис. 15). Подчеркнем, что такого порядка молекулярные массы характерны для mg-белков, В последующих экспериментах препараты, солю-билюированные 100 мМ KCl, не анализировали, поэтому в дальнейшем под мембранными препаратами, солюбилизировадными KCl, мы будем подразумевать препараты мембранных белков, солюбилизированиых 750 мМ KCl- Связывание [а-32Р]ГТФ с полипептидами 26-28 кДа было высокоспецифичным, поскольку полностью блокировалось 100-кратным избытком немеченых гуа~ ниновых нуклеотидтри- и дифосфатов (рис. 16), тогда как ни ЦТФ, ни УТФ на связывание не влияли. Некоторое снижение связывания наблюдали в присутствии АТФ, что можно было ожидать, поскольку и ГТФ, и АТФ принадлежат к пуриновому ряду, а при таких высоких концентрациях весьма вероятно, что наблюдаемый эффект носит неспецифический характер.

Таким образом, совокупность результатов указывала, что в этиолированных проростках гороха этилен, по-видимому, регулирует активность MG-белков. Для подтверждения этого вывода была использована иммунопреципитация с антителами против mG-бел ков Ras семейства животных (aHTH-pan-Ras антитела), обладающими широкой видовой специфичностью по отношению к mg-белкам. Как показано на рис. 17, после аффинного мечения и иммунопрецнпита-ции обнаруживались меченые полипептиды с мол. массами 26-28 кДа, что соответствует данным рис. 15 и 16, причем активность связывания ГТФ была выше в образцах из обработанной

этиленом ткани. Эти данные позволяют сделать вывод о принадлежности регулируемых этиленом G-белхов к Ras суперсемейству MG-белков. Согласно Venioud с соавг. {2003), Ras суперсемейство мв-белков Arabidopsis представлено 93 белками, которые распределены в четыре семейства: Rab, Art Rho и Ran. Однако в отличие от Homo sapiens и Sac-charotnyces cerevisiae у Arabidopsis не обнаружено MG-белков, соответствующих представителям Ras семейства животных. Это обстоятельство, вероятно, является отражением того, что у растений представители других семейств MG-белков выполняют их функции в проведении сигналов.

Недавно Zegzouti с соавт. (1999) обнаружили в плодах томатов транзиюрное изменение экспрессии гена ER43 в ответ на этилен. Ген ER43 имеет высокую гомологию с геном Ypí S. cerevisiae, который, в свою очередь, гомологичен генам Rab семейства клеток животных. При анализе последовательностей Rab генов мы обнаружили, что наибольшей гомологией с ER43 обладал ген RabS гороха. В связи с этим мы провели имму-нопреципитацию мембранных белков из этиолированных эпикотилей гороха с антителами к RabS клеток млекопитающих. Из фракций мембранных белков, солюбклизиро-ванных как KCl, так и Тритоном Х-100, антитела к Rab8 преципигировали полипептиды с мол. массами - 21-22 и 26-28 кДа (рис. 18). Однако эффект этилена на ГТФ-

нипеттгидов выражался по-разному. Так, в KCl-солюбнлизируемой фракции этилен активировал связывающую активность полипептидов с мол. массой 21-22 кДа, не влияя на лолипептиды 26-28 кДа. В Тритон-солюбилизированной фракции этилен активировал связывание ГТФ с обоими типами полипептидов, но активация полипептидов 26-28 кДа была значительно выше по сравнению с поли-пепткдами 21-22 кДа. Полученные результаты позволяют, во-первых, с достаточно высокой надежностью отнести часть регулируемых этиленом MG-белков к Rab семейству Ras суперсемейства; во-вторых, сделать вывод о том, что этилен дифференциально регулирует ГТФ-связывающую активность MG-белков Rab семейства.

Для доказательства специфичности действия этилена на ГТФ-связывающую активность были использованы высокоспецифичные ингибиторы действия этилена рецеп-торного уровня 1-метилциююпропен (1-МЦП) и 2,5-норборнадиен (НБД) (Sisler et al, 1986, 1996; Sisler and Wood, 1988). Согласно нашим данным, 1-МЦП полностью блокирует влияние этилена на рост этиолированных проростков гороха уже при концентрации 50-100 нл/л, тогда как для НБД эти концентрации составляют 2000-3000 мкл/л в том же биотесте. Если проростки были предобработаны этими ингибиторами, а затем подвергнуты воздействию этилена, то мы наблюдали снижение эффекта этилена на связывание

связывающую активность этих

KCl Тритон

30 — II if

20,1 — ■ s

14,4 — #jt ■Й

Этилен: - + - +

Рис. 18. Иммунопреципитация аффинном еченых мембранных белков антителами к Rab8.

ГТФ с мембранными белыми (рис. 19), хотя следует отметить, что сами ингибиторы действия этилена могли вызывать некоторую активацию связывания ГТФ. Эти результа-

Рис. 19. Влияние 1-МЦП и НБД на ГТФ-связывающую активность мС-белков, регулируемых этиленом. Этиолированные проростки гороха перед обработкой этиленом (1 мкл/л) обрабатывали 1-МЦП (100 нл/л) или НБД (2000 мкл/л), после чего выделяли мембранные белки, проводили их мечение [а-5 Р]ГТФ и разделяли в ДДС-N8 ПААГ. Представлен радиоавтограф белков, солюбилизируемых КС). Стрелка указывает на специфически меченые мй-белки, активность которых регулируется этиленом.

ты показывают, что наблюдаемая активация связывания ГТФ специфична по отношению к этилену и что процессы, приводящие к этой активации, инициируются рецепторами этилена. Наличие эффекта самих ингибиторов действия этилена на связывание ГТФ можно, по-видимому, объяснить тем, что, обладая высоким сродством к этилен-связывающим сайтам (аффинность 1-МЦП к связывающим сайтам выше, чем аффинность этилена), эти соединения могут инициировать цепь биохимических реакций, однако масштаб этих изменений значительно ниже, чем при действии этилена.

Кинетика активации этиленом связывания ГТФ с КС1- н Тритон-солюбилизированными мембранными белками этиолированных эпикотилей гороха носила транзиторный характер (рис. 20). В случае белков, солюбипизированных КС1 (рис. 20А), первый пик связывания достигал максимума при 15-20-мин обработке этиленом, затем связывание резко снижалось к 30 мин. Второй пик ГТФ-связывающеЙ активности наблюдался при 40-60-мин обработке, причем этот пик был более продолжительным н несколько ниже по величине активации по сравнению с первым. Следует особенно отметить быстроту ответа связывания ГТФ на обработку этиленом: даже 2-м ин обработка приводила более чем к двукратному росту связывающей активности. Это один из самых быстрых биохимических ответов на этилен, зарегистрированных при действии гормона на тггакгную ткань. Если проростки предобрабатывали 1-МЦП, то последующая обработка этиленом не вызывала акшвацим связывания ГТФ, Сам 1-МЦП несколько активировал связывание ГТФ, но во всех проведенных экспериментах эта активация была значительно ниже по величине, чем активация связывания этиленом.

Сходная картина наблюдалась и при анализе связывания ГТФ с мембранными белками, солюбнлизированными Тритоном Х-100 (рис. 20Б), но в этом случае активация была не столь быстрая, величина активации была ниже, а пики связывания были не-

Н6Д:-----+ +

1-МЦП:---+ +--

Этнпвн: - - +. - + - +

- +---

ГТФ

сколько сдвинуты в сторону более поздних времен по сравнению со связыванием ГТФ с мембранными белками, солюбилизированны ми KCl. Такие различия, вероятно, могут быть объяснены тем, «гго Тритоном Х-100 и KCl солюбилгаируются разные популяции MG-белков.

Рис. 20. Влияние этилена и 1-МЦП на связывание ГТФ с мБ-белками, солюбилизированными КС1 (А) и Тритоном Х-100 (Б). Этиолировании е проростки гороха обрабатывали этиленом (1 мкл/л; *), 1-МЦП (100 нл/л; о) или этиленом после обработки 1-МЦП (а) в течение указанного времени. Затем из эпикотилей выделяли мембранные белки и мстили их [а-32Р]ГТФ. Меченые бедки разделяли в ДДС-Ыа ПААГ и визуализировали авторадиотрафией, Связывание ГТФ оценивали по плотности полос, соответствующих мй-белкам, на радиоавтографе. На графиках представлены результаты сканирования, выраженные в процентах активации по сравнению с контролем (точка 0). Стрелка указывает время введения этилена после обработки 1-МЦП.

Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что в мембранах этиолированных эпикотилей гороха имеются G-белки, свойства которых указывают на их принадлежность к MG-белкам Ras суперсемейства. По крайней мере, часть из них относится к MG-белкаи Rab семейства. Этилен в физиологических концентрациях активирует связывание ГТФ с этими белками, причем наблюдаемая активация рецептор-зависима, дифференциальна и носит 1ранзиторный характер. Быстрота, с которой происходит активация связывания ГТФ, может свидетельствовать о непосредственной физической связи мО-белков с рецепторами этилена или, по крайней мере, о близости расположения этих компонентов в пути передачи этиленового сигнала. Эти данные подкрепляют наше предположение о возможном вовлечении G-белков в передачу этиленового сигнала.

SO 100 150 200 Продолжительность обработай, мин

3.4. Влияние этилена на связывание ГТФ с мембранными белками листьев

Arabidopsis.

Дальнейшие доказательства участия mg-белков в передаче этиленового сигнала были получены при изучении влияния этого фитогормона на связывание ГТФ с мембранными белками листьев растений Arabidopsis дикого типа и мутантов etrl-î к Ctrl-!, Использование последних давало возможность интегрировать mg-белкн, активность которых регулируется этиленом, в схему трансдукции этиленового сигнала, постулированную на основании молекулярно-генетических исследований мутантов (Chang and Shockey, 1999; Schaller and Kieber, 2002; Wang et al, 2002).

Для изучения влияния этилена на связывание ГТФ мембраны н мембранные белки из листьев A. thaliana выделяли так же, как и из этиолированных эпикотилей гороха, но перед центрифугированием 130000 g проводили дополнительное центрифугирование при 50000 g в течение 1 часа.

Мембраны н мембранные белки листьев растений дикого типа специфически связывали [^SjrTOyS, причем по величине связывание было сравнимо со связыванием в препаратах из гороха, но при этом ГТФ-гицролизующая активность была примерно на два порядка величин ниже, чем в соответствующих препаратах из этиолированных эпикотилей гороха.

При использовании [Э15]ГТФу5 нам не удалось обнаружить эффекта этилена на связывание ГТФ, поэтому во всех дальнейших экспериментах связывание ГТФ оценивали методом аффинного мечения. Мы не обнаружили специфического влияния этилена на связывание ГТФ с мембранными белками, солюбилнзированными из мембран, пре-ципитированньгх при 50000 g, но активирующий эффект этилена наблюдался во фракциях мембранных белков, солюбилизированных 750 мМ КС1 и особенно 1% Тритоном Х-100 из мембран листьев растений Arabidopsis дикого типа, преципитированных при 50000-130000 g (рис. 21). Здесь следует отметить, что около 75% ГТФ-связывающей ак-

дикий тип ctrl-1 etrl-î

Этилен: 30 — 20,1 — --+ • | + --+ и + jgjju ш — +

14,4 — - f ^ 1 1 _ ■ »

ГТФ: - + - + - + - +

Рис. 21. Влияние этилена на связывание ГТФ с мембранными белками листьев А. ¡НаНапа, солюбилнзированными Тритоном Х-100. й-белки метили [а-32Р]ГТФ и разделяли в ДДС-Ыа ПААГ. Для выявления компонентов, специфически связывающих ГТФ, в реакцию мечения добавляли 100-кратный избыток немеченой ГТФ. Представлены радиоавтографы гелей.

тивности было локализовано в солюбилизироаанной Тритоном Х-100 фракции. Специфическое этилен-модулируемое связывание наблюдалось с полипептидами 22 и 25 кДа, что соответствует мол. массам MG-белков. На специфичность связывания ГТФ с этими полипептидами указывал тот факт, что уже 100-кратный избыток немеченой ГТФ полностью блокировал связывание [а-32Р]ГТФ (рис. 21). Связывание ГТФ с этими полипептидами активировалось этиленом в разной степени: в Тритон-солюбилиэированной фракции этилен активировал связывание ГТФ с полипептндом 25 кДа в 1,6 раза, тогда как с полипептндом 22 кДа - в 2,8 раза, то есть, этилен дифференциально регулировал связывание ГТФ с разными G-белками. Таким образом, в листьях растений Arabidopsis дикого типа этилен активировал связывание ГТФ с белками, которые по их локализации (мембраны, осаждаемые при 130000 g) были сходны с мй-белками мембран нз эпикоти-лей гороха. Высокая гидрофобность и низкая ГТФазная активность также указывали на их возможную принадлежность к мв-белкам. Кроме того, как показано на рис. 22, анти-pan-Ras антитела преципитировали меченые полипепетиды с теми же мол. массами (22 и 25 кДа), что связывали ГТФ и без кммунопреципигации.

Для выяснения специфичности действия этилена на ГТФ-связывающую актив* ность были использованы этилен-нечувствительные мутанты A. thaliana etrl-1 и ctrl-l. Мутант etrl-J не чувствителен к этилену вплоть до концентраций 1000 мкл/л (Bleecker et al.t 1988) вследствие мутации в гене, кодирующем рецептор этилена ETR1 (Chang et al., 1993). Мутант ctrl-l имеет ярко выраженный этиленовый фенотип (то есть фенотип растения дикого тина, выращенного в постоянном присутствии этилена) вследствие мутации в гене CTR1, который кодирует преггеинкннаэу, гомологичную МАШ киназам Raf типа животных (Kieber etai, 1993). У обоих мутантов ГТФ связывался с полипептидами той же мол. массы, что и в диком типе (рис. 21), но конститутивный уровень связывания

в мутантах и растениях дикого типа был различен: в ctrl-1 он очень высок и сравним с уровнем связывания ГТФ а растениях дикого типа после обработки этиленом, тогда как в etrl-1 он значительно ниже, чем в растениях дикого типа. Но в обоих мутантах этилен не влиял на связывание ГТФ (рис. 21). При иммунопреципитации с анти-pan-Ras антителами у мутантов наблюдалось то же распределение уровня конститутивного связывания ГТФ: связывание в ctrl-l было выше (рис. 22), а в etrl-1 — ниже, чем в диком типе, но (фи этом мол. массы преципитированных белков были сходны с таковыми без иммунопреципитации. Таким образом, как в диком типе, так и в исследованных мутантах связывание ГТФ происходило с MG-белкаии Ras суперсемейства.

Для исследования зависимости связывания ГТФ с mG-белками от времени обработки этиленом листья рас-

43 — . 1

™

1 20,1 —

14,4 — ди Т1 кий etrt-t in

Рис. 22. Иммунопреципитации анти-pan-Ras антителами аффинноме-ченых MG-белков, солю-билизнрованных Тритоном Х-100.

тений АгаЫ(1ор$13 дикого типа и еь-1-1 экспонировали с гормоном в течение 0,10, 20 и 40 мин (рис. 23). Активация связывания носила транзиторный характер: в обеих белко-

а I ш . м . м

в 10 20 40 Продолжительность обработки, ыии

О ■ I » I I » I I

о ш м 40

Прмопжителмюсть обработки, мин

Рис. 23. Зависимость связывания ГТФ м<3-белками листьев А. 1каНапа от продолжительности обработки листьев растений дикого типа (□) и мутанта е1г1-1 (■) этиленом. Мембранные белки, солюбилизированвые КС1 (А) и Тритоном Х-100 (Б), метили [а-32Р]ГТФ и разделяли в ДЦС-Ыа ПААГ с последующей авторадиографией. Гистограммы построены на основании результатов сканирования радиоавтографов,

вых фракциях ГТФ-связывающая активность увеличивалась в результате 10-мин обработки этиленом в 2-4 раза, достигала максимума при 20-мин обработке, а затем снижалась при 40-мин обработке гормоном. У этилен-нечувствительного рецепторного мутанта ей-/-/ регуляции связывания ГТФ не было обнаружено ни при одной экспозиции растений с этиленом. Результаты, полученные с использованием егг!-1, показывают, что мО-белкн, по-видимому, вовлечены в передач)' этиленового сигнала, поскольку у му-тантных растений с дефектом в рецепторе этилена ГТФ-связывающая активность существенно снижена и не регулируется этиленом в отличие от растений дикого типа, В подтверждение нашей гипотезы о вовлечении О-белков в транедукцию этиленового сигнала можно привести данные Не с соавт. (1996), которые показали, что обработка корней кукурузы ГТФуЗ имитировала эффект этилена в индукции целлюлазной активности. Кроме того, у томатов обработка этиленом приводила к усилению транскрипции генов некоторых мб-белков (Ьогаше е! а1,1996; Хеётени е1 а!., 1999).

3.5. Исследование влияния этнлеяа на связывание ГТФ при помощи аффинного мечен ни н двумерного электрофореза.

Приведенные в двух предыдущих разделах результаты убедительно показывают, что этилен модулирует ГТФ-связывающую активность мв-белков в этиолированных эпикотилях гороха и листьях АгаЬМорав. Более того, полученные результаты указывают на дифференциал ьпую регуляцию активности этих белков. При этом следует иметь в

виду, что мол. массы MG-белков очень близки, поэтому по результатам одномерного электрофореза трудно судить о количестве компонентов, проявляющих ГТФ-связывающую активность, и также о том, активность каких именно компонентов меняется при действии этилена, Для более детального изучения влияния этилена на ГТФ-связывающую активность индивидуальных белков мы применили разделение аффинно-меченных полнпептидов в двумерном электрофорезе.

При исследовании мембранных белков, солюбилиэированпых KCl из мембран этиолированных эпикотилей гороха, обнаруживалось, как минимум. 15 компонентов (рис. 24А). Эти полипептиды распределялись по величине мал. масс от 17 до 30 кДа я величине р! от ~ 4 до ~ 6. Для некоторых из этих полипептидов мы проанализировали зависимость изменения ГТФ-связывающей активности от продолжительности обработки проростков этиленом (1 мкл/л). Изменения связывания ГТФ с двумя компонентами (8 и 9, рис. 24А) носили бимодальный характер (рис. 24Б): связывание достигало максимума при 20-мин обработке, затем падало почти до начального уровня и вновь возрастало при 40-мик обработке, что сходно с результатами, полученными при анализе ГТФ-связывающих компонентов одномерным электрофорезом (рис. 20А). Активности четырех других компонентов (2,6,12 и 14, рис. 24А) снижались при 15-ЗО-мин экспозиции с фитогормоном, затем при 40-мин обработке возвращались к исходному уровню, сохраняясь в дальнейшем на постоянном уровне (рис. 24В).

Во фракции, солюбилиэированной из мембран этиолированных эпикотилей гороха Тритоном Х-100, также обнаруживалось значительное число ГТФ-связывающих компонентов, но нам не удалось получить разрешения, необходимого для оценки изменения в ГТФ-связывающей активности индивидуальных компонентов. Это связано, с одной стороны, с высокой гидрофобностью этих белков и, с другой стороны, с высокой энергией излучения 3iP. Тем не менее, объединив ГТФ-связывающие компоненты по их мат. массе в группы (рис. 25А), мы оценили изменения ГТФ-связывающей активности этих групп в зависимости от продолжительности обработки ткани этиленом. Три группы компонентов (5, б и 7, рис. 25Б) демонстрировали бимодальную активацию, сходную с бимодальной активацией во фракции, солюбилиэированной KCl. Значительное увеличение ГТФ-связывающей активности наблюдалось уже при 2-мин обработке, достигая максимума при 10- и 40-мин экспозиции с этиленом. Группа 3 (рис. 25В) также проявляла бимодальный характер активации, но с пиками при 20- и 60-мин обработке, тогда как четыре другие группы (1, 2, 4 и 8), активируясь транзиторно, имели максимум активности при 20-мин обработке, после этого максимума изменения были столь незначительны, что их активация может рассматриваться как одномодадьиая.

Следует отметить, что различия в активации этиленом индивидуальных G-белков в этих двух фракциях, скорее всего, связаны с тем, что эти фракции содержат разные "наборы" белков. В пользу этого предположения говорят данные по иммупопрецишгга-ции с антителами к Rab8 (рис. 18). Хотя не исключено, что некоторые белки могут различаться вследствие пост-трансляционной модификации, например, пренилирования,

4,8

"РН *

•в,7

<3> С13 * •

— 24

— Й0.1

$ V I V в и £ м I м 1

3 м

0,0

-1 i ■ 1 с" i "т ' "г"

^ 3,0' Б

£* К

1А-

0,6

с.""1.......

в » 40 М М 100 ш ПрЦМОЛЦМПЛЫЮСТЬ ООрЛООТШ. ннн

Рис. 24. Разделение мв-белков, солю-билизированных из мембран этиолированных эпикотилей гороха 750 мМ КС1, двумерным электрофорезом. А -радиоавтограф, Б и В - количественная (щенка изменения ГТФ-связывающей активности отдельных компонентов в зависимости от продолжительности обработки проростков этиленом. ГТФ-саязывающую активность оценивали сканированием плотности отдельных пятен и выражали в относительных единицах по сравнению с необработанным контролем (точка 0). Представлена количественная оценка для компонентов £ (Я) и 9 (О) (Б) н 2 (•}, ¿(♦), 12(Д)и14(0)(В).

Рис. 25. Разделение мО-белков, еалю-билизнрованных из мембран этиолированных эпикотилей гороха 1% Тритоном Х-100, двумерным электрофорезом. А - радиоавтограф, Б и В - количественная оценка изменения ГТФ-связывающей активности отдельных компонентов в зависимости от продолжительности обработки проростков этиленом. ГТФ-свяэы вающую активность оценивали сканированием плотности отельных пятен и выражали в относительных единицах по сравнению с необработанным контролем (точка 0). Представлена количественная оценка для групп: 5 (И),6 (А) и 7 (О) (Б); 1 (О), 2 (•), 3 (♦), 4 (А) и 8 (О) (В).

что влечет за собой различия в гидрофобносги, величине pi и мол. массе. Уровень активации связывания ГТФ с индивидуальными MG-белкши сравним с таковым в клетках животных (Dcnhardt, 1996). Высокая скорость активации связывания ГТФ при обработке этиленом указывает, что наблюдаемые изменения инициированы рецепторами этилена аналогично тому, как это происходит в клетках животных (Boguski and McConnick, 1993), причем рецепторы и G-бслки в таких случаях располагаются в непосредственной близости друг от друга.

Для доказательства рецептор-зависимой моду ляции связывания ГТФ с тщивиду-альными mG-белками были использованы препараты мембранных белков из листьев Arabidopsis дикого типа и этилен-нечувствнтелышх мутантов. В Тритон-солюбилизированной фракции мембранных белков, как и в аналогичной фракции из этиолированных эпикотилей гороха, ГТФ-связывающие компоненты были объединены в группы на основании их мат. масс (рис. 26). В растениях дикого типа после обработки этиленом наблюдалась значительная активация связывания ГТФ с белками групп В, С и D, Связывание ГТФ с белками группы А было низким и не регулировалось этиленом. Следует напомнить, что у Arabidopsis около 75% ГТФ-связывающеЙ активности обнаруживалось именно во фракции мембранных белков, солюбилизированкой Тритоном X-100, Предобработка растений в течение 2 час 1-МЦП (100 ил/л) приводила к незначительному повышению связывания ГТФ в группах В, С и D, но последующее добавление этилена не вызывало активации связывания ГТФ. Эти данные указывали, во-первых, на специфичность наблюдаемой активации по отношению к этилену и, во-вторых, на ее рецептор-зависимый характер. Подобный эффект 1-МЦП и этилена мы наблюдали и в препаратах мембранных белков, солюбилизированных КС1. В аналогичных препаратах из листьев рецепторного мутанта etrl-1 связывание ГТФ было существенно снижено по сравнению с диким тппом (рис. 26). Следует помнить, что в растениях дикого типа образуются измеряемые количества эндогенного этилена (Sanders et al„ 1991), то есть наблюдаемая ГТФ-связывающая активность в необработанных экзогенным гормоном листьях растений дикого типа может быть отнесена на счет эндогенного этилена, В etrl-1 уровень образования эндогенного этилена сравним с таковым в диком типе, но вследствие дефекта в рецепторе этилена связывание гормона в этом мутанте практически отсутствует (Schaller and Bleecker, 1995). Поэтому etrl-1 может рассматриваться как эквивалент "нулевого уровня" этилена или "нулевого контроля". В err 1-1 уровень продукция этилена также не отличается от дикого типа (Kieber et al, 1993), поэтому высокий конститутивный уровень связывания ГТФ (рис. 26) не может быть результатом сверхлро-дукции этилена. Следует подчеркнуть, что, несмотря на различия в уровне конститутивного связывания ГТФ, набор ГТФ-с вязы вающих полипепткдов во всех трех типах растений Arabidopsis был сходен, что свидетельствует о том, что различия в уровне связывания обуславливаются либо изменением связывающей активности компонентов, либо за счет изменения их содержания.

4.0 + 30- WT

•pH-*e.5 4.0

pH-

■ i.5

20,114,4 — 30— wtrt-1

WT«-C,H4

ctrf*l

20,1 -UA-

30— WT ♦ MCP

■

20,1 — ^^ 14,4-

Wt + MCP * CjH,

„. 200 Ё

5 £ ieo

I > 3 I

3 I 12°

i 80 ш I 40

< 0

I WT □vht^CjH.

■ WM DeM-t

XL!

■ WT+ИСР О ИТ+ИСР+СД

ABCD ABCDABCD Группы

Рис. 26. Двумерный электрофорез аффинномеченых ГТФ-свяэываюших белков, солго-бнлизированньгх Тритоном Х-100 из мембран листьев Arabtdopsis. Приведены радиоавтографы гелей и количественный анализ изменений активности связывания ГТФ в группах. WT - дикий тип, MCP - 1-МЦП.

В препаратах мембранных белков, сояюбилизированных KCl, обнаруживаются те же закономерности, что и для солюбил из про ванных Тритоном Х-100 белков: повышение ГТФ-связывающей активности в ответ на этилен в растениях дикого типа, низкий конститутивный уровень связывания в etrUl и конститутивно высокий - у ctrl-l (рис. 27). В KCl фракции можно было различить до 20 связывающих компонентов (рис. 28А). Расчет величин мол. масс и pl индивидуальных компонентов позволил сравнить полученные нами результаты с имеющимися в базе данных для Arabidopsis (Bjellqvlst et ei, 1993; httpi//www.expasy.cMools/pi_tool.html). Сравнение показало, что этилен-регулируемые мв-белки, по-видимому, не принадлежат Rae и Rho семействам, которые

4--рН-»-6,5 4-*--рН-^6.5

29- 29-

26- «V 26- «ь •«

•к

17- 17"

дикий тип, контроль дикий тип, + этилен -рН--«.6.5 4-*-рН-^6.5

29-) гэ-

ге-» 26- ^ . .

* *

17-' 17-

etrl-1 ctn-1

Рис. 27. Анализ ГТФ-связывающих белков, солюбилизированных 750 мМ KCl из мембран листьев Arabídopsis, при помощи двумерною электрофореза. Приведены радиоавтографы гелей.

имеют pi/мол. масса (средние величины) 9,24/21,7 кДа (Rae) и 9,3/21,6 кДа (Rho). Они также не представляют собой Ran (6,4/25 кДа), поскольку Ran локализованы в ядре. Следовательно, наиболее вероятно, что обнаруженные в наших экспериментах этилеи-регулируемые G-белки относятся к Rab семейству Ras суперсемейства MG-белков.

Для 10 ГТФ-связывающих компонентов, имеющих достаточно высокое разрешение, была проведена количественная оценка изменения ГТФ-связывающей активности при действии этилена (рис. 28Б). ГТФ-связывающая активность шеста белков в cirl-1 была сравнима с активностью, обнаруживаемой в диком типе после обработки этиленом. Эти бедки были объединены в группу "¿^/-ассоциированных" белков. ГТФ-связывающая активность четырех других белков в диком типе при обработке этиленом превышала таковую в ctrJ-1, поэтому эти четыре белка были классифицированы как "сй-/-независимые". Тот факт, что в диком типе при действии этилена ГТФ-связывающая активность некоторых MG-белков значительно превышала активность соответствующих белков в Ctrl-1 ('VfW-независимые"), свидетельствует в пользу того, что путь передачи этиленового сигнала через протеитштазу CTR1 не является единственным. Иными словами, эти данные дают основание предположить, что этиленовый сигнал может проводиться и через другой путь, отличный от CTR1-зависимого. Это предположение не противоречит результатам Hua и Meyerowitz (1998), которые пришли к сходному заключению на основании генетического анализа рецепторных мутантов Ârabidopsis. Так, у рецессивного мутанта по четырем рецепторам этилена (ETRI, ETR2, ERS2 и EIN4) эти исследователи наблюдали экстремально сильный (более ярко выра-

женный, чем у ctrl-1) этиленовый фенотип, что привело их к выводу о существовании иных путей, ведущих к ответу на этилен, которые регулируются тем же семейством рецепторов этилена, но независимо от CTR1.

6,5

29 — 26 —

17 —

в 260

ctrf-ессоциированные cfrf-независимые

,_...__1_____

Е 3 мл

[ □дикий тип ■ +С,Н4 ■ etrl-I IcIrMj

1 2 3 t It I) 1 t 8 14

Рис. 28. Количественная оценка связывания ГТФ с солюбилизированными KCl MG-белками из листьев Arabidopsis. Л: нумерация ГТФ-связывающих компонентов в препаратах из ctrl-1; Б: связывание ГТФ было оценено для 10 компонентов в препаратах дикого типа (обработанного и необработанного этиленом) и мутантов etrl-1 и ctrl-L Связывающие компоненты были разделены на два типа: "^/-ассоциированные" (уровни связывания в ctrl-1 и диком типе, обработанном этиленом, были близки) и "cfr/-независимые" (связывание в диком типе, обработанном этиленом, выше, чем в ctrl-I).

Таким образом, данные, приведенные в трех последних разделах, показывают, что в двух видах двудольных растений (Pisum sativum и Arabidopsis thaliana), принадлежащих к двум семействам (сем. бобовые и сем. крестоцветные) и находящихся на разных стадиях развития (этиолированные эпикотли и сформировавшиеся зеленые листья) обнаруживаются общие закономерности в действии этилена на связывание ГТФ. В обоих случаях эгилен регулирует связывание ГТФ с MG-белками, принадлежащими Ras суперсемейству, часть из которых относится к Rab семейству. На первый взгляд может показаться, что активность слишком многих G-белков регулируется этиленом. Однако результаты исследований на животных клетках показали, что в передаче одного сигнала могут участвовать несколько разных G-белков (Mira et al, 2000; Zondag et al, 2000; Sa-hai et al., 2001), причем взаимодействие между индивидуальными MG-белками с образованием каскадов является одной из характерных черт многих систем (Feig et al, 1996;

Van Aelst and D'Souza-Schorey, 1997; Bar-Sagi and Hall, 2000). Следует также учитывать, что две белковые фракции, использованные в нашей работе, содержат прочно ассоциированные с мембранами белки, которые имеют разную степень гидрофобности, что характерно для MG-белков {Zhang and Casey, 1996; Choy et al, 1999; Rodriguez-Conception et al, 1999). Кроме того, отдельные пятна на двумерном геле могут и не являться различными белками, а быть изоформами одною белка, или результатом посттрансляционной модификации одного белка, или результатом модификации белка при подготовке к электрофорезу (Celis and Gromov, 1999).

Полученные результаты показывают, что активация этиленом мО-белков является транзиторной и дифференциальной. Некоторые mg-белки в ответ на обработку этиленом активируются очень быстро, и временная кривая их активации имеет бимодальный характер. Последнее отмечается и в некоторых животных системах как для mg-белков, так и для их эффекторов - МАП-киназкых каскадов - в ответ на продолжительно поступающий сигнал (Melodie et al, 1992; Lcnormand et al, 1993; Foschi et al, 1997; Egan et al, 2002), но для растений продемонстрировано впервые. Регуляция ГТФ-связывающей активности mg-белков является этилен-специфичной, поскольку снимается при применении ингибиторов действия этилена рецепторного уровня 1-МЦП и 2,5-НБД, Она инициируется идентифицированными в Arabidopsis рецепторами этилена, о чем говорит отсутствие активации связывания ГТФ у рецепторного этилен-нечувствительного мутанта etrl-L Эти данные дают веское основание считать, что mg-белки включены в передачу этиленового сигнала. Быстрота изменения активности g-белков может свидетельствовать о близости расположения этих компонентов и рецепторов этилена в цепи передачи этиленового сигнала, если не о прямой их физической связи. Это косвенно подтверждается тем, что оба эти звена пути транедукции сигнала локализованы в одном клеточном комшртменте — эндомембранах.

4, Эффект этилена на экспрессию генов некоторых мономерных G-белков.

Бимодальный характер зависимости активации связывания ГТФ некоторыми mg-бел ками от времени обработки этиленом позволял предполагать, что для этих белков увеличение ГТФ-связывающей активности может быть результатом усиления экспрессии их генов. О возможной регуляции этиленом экспрессии генов mg-белков свидетельствовали данные Zegzouti с соавг. (1999), которые показали, что в зрелых зеленых плодах томатов этилен быстро (15 мин) индуцировал экспрессию гена ER43, который гомологичен гену mg-белка из гороха. Скрининг базы данных показал, что аминокислотные последовательности белков, кодируемых этими генами, наиболее близки белкам Rab8/Ara3 из Arabidopsis. Характерные для mg-белков последовательности, такие как ГТФ-связывающий сайт, ГТФазный сайт и сайт изопрен клирования, являются консервативными и обнаруживаются у всех мй-белков растений. Но домен взаимодействия с мембраной с достаточной степенью надежности был идентифицирован только в АгаЗ и Rab8 (аминокислоты 36-56) из всех mg-белков Rab семейства. Гомологичные последо-

AiRscl

AtRop4

AtXraJ

Cabb»ge

Tonmto ER43

AtRab8

TeroMoypi

Cairot

Pca

Ltxuj/.irvr.rHi

Beetrcm Human AlAra?

Rab-8

■ AlRsblS

А(АЫ

Л1АШ AtRÄl 1: Rab-I

ÄiAftl-

А(Ая7 IUb-11

drlnA м

Рис. 29. Филогенетический анализ аминокислотных последовательностей мв-белков ЯаЬ семейства.

О 10 20 40 мин

\Rop4

\Rac2

Класс

Rab

Rho

Rae

CAD

Рис. 30. Влияние этилена на экспрессию генов некоторых мв-белков листьев растений АгаЬШор$1$ дикого типа.

вательности были также обнаружены в Rac2 и Rop4, но в других местах молекул. Филогенетический анализ аминокислотных последовательностей мС-белков Rab семейства показал, что белки, близкие Rab8, формируют четко очерченную группу (рис. 29). В связи с этим наибольшее внимание при исследовании влияния этилена на экспрессию генов MG-белков было уделено белкам Rab семейства (Rab8, Ага2, АгаЗ, Ага4 и Ага5). Кроме того, в исследовании были использованы представители отдаленных от Rab семейств Rae (Rac2) н Rho (Jtop4). мРНК выделяли из листьев растений Arabidopsis дикого типа, обработанных этиленом (1 мкл/л)втечениеО, 10, 20 и 40 мин. Относительное содержание мРНК индивидуальных мономерных G-белков оценивали методом обратной попнмеразной цепной реакции (RT-PCR) после разделения продуктов RT-PCR в агарозном геле. В качестве внутреннего контроля для нормирования образцов и оценки вариабильности экспрессии использовали экспрессию гена циннамилалкогольлегндрогеназы {CAD). Полученные данные показывают (рис. 30), что 10-мнн обработка этиленом индуцировала экспрессию только АгаЗ и RabS, которая к 40 мин обработки возвращалась к исходному уровню. Ген Ага5 экспресси-ровался наиболее сильно, но его экспрессия не регулировалась этиленом, тогда как экспрессия генов Ага2 и Ага4, происходящая на довольно высоком уровне, ин-гибировалась этиленом при 20- и 40-мин обработке этиленом. Влияния этилена на экспрессию генов Rop4 и Rac2 обнаружено не было. Возможно, что экспрессия Лас2 супресснровалась при 40-мин обработке ткани этиленом. Из проанализированных генов MG-белков наибольшее увеличение экспрессии (более чем в 3 раза) было отмечено для гена RabS (рис. 30).

При исследовании влияния этилена на экспрессию гена RabS в этилен-нечувствител ьном рецептор-

ном мутанте etrl-l и мутанте по МАЛЗК ctrj-l было обнаружено (рис. 31), что конститутивный уровень экспрессии этого гена в etrl-l был значительно ниже, чем в диком типе, тогда как в ctrl-l - значительно выше и сравним с уровнем экспрессии в диком типе после обработки этиленом. Однако ни в etrl-), ни в ctrl-I этилен не влиял на экспрессию RabS.

Таким образом, приведенные данные о регуляции этиленом экспрессии генов некоторых MG-белков показывают, что увеличение активности связывания ГТФ может происходить и за счет синтеза G-белков de novo. Совокупность полученных результатов усиливает доказательную базу высказанного предположения об участии MG-белков в передаче этиленового сигнала. Хотя по сравнению с клетками животных и дрожжей (Lazar et al, 1997; Rommel and Hafen, 1998; Shields et al, 2000) доказательств участия MG-белков в регуляции процессов роста и развития растений ие много, тем не менее, в последние годы интерес к этим белкам неуклонно растет. В растениях при участии представителей этого многочисленного суперсемейства регулируется полярный рост пыльцевых трубок и корневых волосков (Kost et al, 1999; Fu et al., 2001; Moiendijk et al, 200J;Jones et al, 2002; Chen et al, 2003). Имеются также примеры участия MG-белков в ответах клеток на различные патогены и элиситоры (Kawasaki et al., 1999; Potikha et al, 1999; Schiene et ai., 2000; Ono et al, 2001; Schultheiss et al, 2002). MG-белки Rop семейства могут участвовать в процессах роста и развития, регулируемых фитогормонами, в частности, ауксином, брассиностероидами и АБК (Li et al., 2001). Белок Ropl, имеющий иммунодетер-минанты близкие MG-бел кам, был обнаружен в CLAVATA-cк гнальном комплексе, что указывает на возможное участие MG-белков в регуляции развития меристем (Trotochaud étal, 1999).

Результаты недавних исследований Batoko с соавт. (2000), а также Lee С соавт. (2002) показали, что MG-белки растений Rab семейства участвуют в везикулярном транспорте, то есть выполняют функции, сходные с функциями Rab белков животных и дрожжей (Rothman, 1994; Lazar et al., 1997; Jahn and Sudhot 1999). Поскольку MG-белки, ГТФ-связываюшая активность которых регулировалась этиленом, были солюбилизиро-ваны из эндомембран, то можно думать, что они также могут участвовать во внутриклеточном транспорте. В пользу этого свидетельствует также и то, что мы не обнаружили регуляции этиленом связывания ГТФ с MG-белками во фракции, обогащенной плазма* леммой.

Учитывая все сказанное, есть весьма веские основания думать, что в механизм действия этилена, как и других фитогормонов, обладающих плейотропными эффектами, вовлекаются MG-белки. В связи с этим следует отметить, что кроме уже упомянутой ра-

Врена обработки, ник 9 1« И 40

двквй теп

Рис. 31. Влияние этилена на экспрессию гена ЯаЬЗ в растениях А. ¡ИаНапа дикого типа, е!г}-] и с&1-1.

боты Zegzouti с соавт. (1999) недавно появилась работа, где показано, что у растений томатов экспрессия гена Rabil в антнсмысловой ориентации замедляла созревание плодов, то есть продукт этого гена вовлечен в процесс, регулируемый этиленом (Lu et al, 2001).

Получепные в нашей работе результаты наряду с данными других авторов приводят нас к выводу, что влияние этилена на активацию связывания ГТФ с мО-белками и на транскрипцию генов этих белков указывает на то, что эти регуляторные белки участвуют в передаче этиленового сигнала у высших растений.

5. Взаимодействие этилена н цитокнннна на уровне возможных компонентов путей передачи сигналов.

Взаимодействие фитогормонов обуславливает многие аспекты роста и развития растений. Так, обработка ткани ауксином ведет к увеличению продукции этилена (Abeles et al, 1992), что может модифицировать ответ ткани на ауксин (Smalle et al, 1997). Причем ауксин увеличивает продукцию этилена вследствие индукции гена АЦК синтазы - ключевого фермента биосинтеза этилена (Yip et al, 1992). Другими хорошо документированными примерами взаимодействия фитогормонов являются взаимодействие АБК и гиббереллинов в индукции а-амилазы в клетках алейронового слоя ячменя, в регуляции покоя семян и боковых почек (Hetherington and Quatrano, 1991), а также взаимодействие этилена к цитокининов при старении листьев (Gan and Amasino, 1995; Grbic and Bleecker, 1995). Взаимодействие фитогормонов может происходить, в принципе, на одном или нескольких этапах пути передачи их сигналов, начиная с рецепторов и до регуляции транскрипции. Основная проблема исследований возможных точек взаимодействия состоит в том, что изучение путей передачи гормональных сигналов у растений находится в начальной стадии.

Исследование ранних событий в трансакции этиленового сигнала, предпринятое в нашей работе, служило основанием для того, чтобы попытаться выяснить, взаимодействуют ли питокинины и этилен на уровне компонентов возможных путей передачи их сигналов. В качестве объекта для выполнения поставленной задачи были использованы растения Arabidopsis дикого типа и этилен-нечувствительного рецепторного мутанта etrl-1, причем мы изучали ответ на экзогенные этилен и цитокинин (б-БАП) у растений, находившихся на двух различных стадиях онтогенеза: у сформированных зеленых листьев и у этиолированных проростков.

При инкубации в темноте в течение 72 час отсеченных листьев Arabidopsis дикого типа этилен (10 мкл/л) ускорял, а 6-БАП (5 мкМ) задерживал деградацию хлорофилла (таблица 1). При совместном действии цитокинин блокировал действие этилена. 1-МЦП (100 нл/л) задерживал деградацию хлорофилла, а при использовании вместе с этиленом предотвращал влияние последнего на пожелтение листьев. То есть действие этилена и цитокинина на распад хлорофилла было противоположно направлено, тогда как цитокинин и 1-МЦП действовали по отношению к этилену в одном направлении. Следует

Таблица 1. Влияние этилена, 6-БАЛ и 1 -МЦП на содержание хлорофилла в отсеченных листьях А. гкаНапа дикого типа (инкубация в течение 72 час в темноте).

Обработка Содержание хлорофилла, % от начального содержания

мкг/г сыр. веса хлорофилла

Начальное содержание 541 ±36 100

хлорофилла

72 час инкубации в темноте

Контроль 177 ±24 33

б-БАП, 5*10"4 М 368 ±21 68

Этилен, 10 мкл/л 111± 18 21

б-БАП + этилен 346 ±37 64

1-МЦП, 100 нл/л 315 ± 12 58

1-МЦП + этилен 307 ±5 57

добавить, что у двух этилен-нечувствительных мутантов Arabidopsis etrl-l и etiS деградация хлорофилла происходит не только существенно медленнее, чем у растений дикого типа, но и не изменяется при обработке этиленом (Grbic and Btecckcr, 1995; Novikova et а!., 1999). Эти данные согласуются с природой мутаций etri-J и eti5, которые заключаются в повреждении рецепторов этилена, поскольку связывание этилена у этих мутантов снижено на 80 и 60% соответственно (Bleecker et al., 1988; Sanders et al, 1991). Однако листья мутанта eti5 при экспозиции с б-БАП теряли хлорофилл еще медленнее, чем без обработки цитокитшом (Novikova et al, 1999).

При действии этилена на этиолированные проростки Arabidopsis дикого типа наблюдался "тройной ответ", а полумаксимальный ответ достигался при концентрации фитогормона 1 мкя/л (рис. 32А, 7). 1-МЦП в диапазоне концентраций 1-500 нл/л не оказывал влияния на рост гилокотилей (рис. 32Б, 2), но при 100-200 нл/л полностью блокировал влияние 1 мкл/л этилена (рис. 32Б, I). При выращивапии проростков дикого типа на среде, содержащей б-БАП (0,01-10 мкМ), наблюдался эффект, аналогичный действию этилена, то есть б-БАП вызывал сокращение длины гилокотилей (рис. 32В, /). Такое влияние цитокинина Vogel с соавт. (1998) объясняли усилением биосинтеза эндогенного этилена при действии цитокннина. Действительно, авторы продемонстрировали увеличение выделения этилена при выращивании проростков на среде, содержащей цитоки-нин. Если это так, то 1-МЦП должен полностью снимать ингибирующее действие цитокимина на рост этиолированных гипокотилей. Однако 1-МЦП (100 нл/л) лишь частично подавлял эффект б-БАП на рост гипокотилей (рис. 32В, 2). Это показывает, что сокращение длины гипокотиля при выращивании проростков на среде, содержащей цитокн-нин, лишь отчасти может быть объяснено усилением образования эндогенного этилена. Цитокинин сам способен вызывать аналогичный этилену эффект, то есть в этой системе

Рис. 32. Влияние этилена, 1-МЦП и 6-БАП на длину этиолированных гипокотилей АгаЫс1орх1з (Шита, А - влияние этилена на длину гипокотилей растений дикого типа (1) и е1г!-1 (2); Б - влияние 1-МЦП (2) и 1-МЦП в присутствии 1 мкл/л этилена на длину гипокотилей растений дикого типа (/); В - влияние 6-БАП (1 и 5) и 6-БАП в присутствии 100 нл/л 1-МЦП (2) на длину гипокотнлей растений дикого ти-па(/ н^)ие(г/-7 (3).

действие этилена и 6-БАП одноналравлено. Для проверки этого факта мы протестировали реакцию на 6-БАП рецегггорного этилен-нечувствительного мутанта е1г!-1. Этилен не влиял на рост этиолированных шпокотилей мутанта вплоть до концентрации 1000 мкл/л (рис. 32А, 2), однако проростки отвечали на цитокннин сокращением длины гипо-котилей (рис. 32В, 5). Эти данные подтверждают, что сокращение длины этиолированных гипокотилей АгаЬШорзя может быть прямым следствием действия шпокинина, а не опосредовано этиленом.

Обнаруженное взаимодействие этилена и цнтокинина в описанных двух растительных системах позволило предположить, что биологические ответы на эти фитогор-моны могут реализовываться при участии общих систем, в том числе, возможно, и на уровне компонентов путей передачи их сигналов, поскольку маловероятно, что эта фи-тогормоны имеют общие рецепторы.

Ранее было обнаружено, что при действии этилена происходит повышение степени фосфорилирования мембранных белков А. ¡каЯапа дикого типа (№ткоуа е/ а!., 1999). Цитокинш, введенный в буфер при гомогенизации листьев АгаЫИор$& дикого типа, не влиял на степень фосфорилирования мембранных белков (рис. 33), но в значительной степени блокировал активирующий эффект этилена. То есть в листьях растений дикого типа влияние этилена и 6-БАП отражало эффект этой пары гормонов на старение листьев: повышение уровня фосфорилирования белков коррелировало с ускорением старения под действием этилена, а снижение вызванного этиленом увеличения фосфорилирования в присутствии 6-БАП - с задержкой старения. В е(г1~1 конститутивный уровень фосфорилирования мембранных белков был намного ниже, чем в диком типе (ЫоУЙота е/ а1, 1999), причем фосфорилирование не изменялось в ответ на обработку

94 _ кг — « — | " J*;

м —

20,1 —

14,4 — • ■Wi"

Этл лен: — + — +

6-БАП: - - + +

Рис. 33. Влияние этилена (10 мкл/л) и 6-БАП (5 мкМ) на фосфорил нрование мембранных белков листьев A. thaliana дикого типа.

СгН4: - - + +

6-БАП: — + - +

30-

20,1 -

14,4-

Рис. 34. Влияние этилена (10 мкл/л) и цитокиннна (5 мкМ) на активность МАП-киназы ЕКК1 типа из листьев А. IШита дикого типа. МАП-киназную активность оценивали по фосфорилированию основного белка миелина т \itro после преципитации фермента антителами к МАП-киназе ЕЮС1 животных.

этиленом, поскольку etrl-l не способен связывать этилен в результате мутации в гене рецептора этилена ETR1. В отличие от etrl-l мутант ctrl-1, который имеет конститутивный этиленовый фенотип, теряет хлорофилл быстрее, чем дикий тип (Kieber et al, 1993), а уровень фосфорилнровання мембранных белков у этого мутанта примерно в 4 раза выше, чем конститутивный уровень в диком типе, и в 2 раза выше, чем в диком типе после обработки этиленом (Smith et al, 1999). Таким образом, эти результаты демонстрируют взаимодействие двух фитогормонов на уровне регуляции фосфорнлиро-вания мембранных белков.

В листьях Arabidopsis дикого типа и этиолированных проростках гороха этилен стимулировал активность МАП-киназы ERK1 типа (Novikova et al., 2000; Moshkov et al., 2003). Поскольку МАЛ-киназа ERK1 типа вовлечена в транедукцию этиленового сигнала (Hail et al, 2001; Ouaked et al, 2003), было проверено влияние 6-БАП на активность этилен-активируемой МАП-киназы. Как и в случае фосформирования мембранных белков, 6-БАП не влиял на активность МАП-киназы (рис. 34), но при совместном действии этилена и цитокиннна наблюдалось существенное снижение активации этого фермента по сравнению с его активацией при действии этилена. Эти данные показывают, что, действительно, взаимодействие цитокиннна и этилена может происходил, на уровне путей трансакции сигналов, причем это взаимодействие происходит на уровне или раньше МАП-киназного каскада.

У растений Arabidopsis компонентами предполагаемого пути передачи этиленового сигнала,

которые располагаются раньше МАП-киназного каскада, являются мб-белки, о чем свидетельствуют данные настоящей работы. При исследовании взаимодействия 6-БАП и этилена яа уровне мв-белков у растений дикого типа мы обнаружили, что этилен значительно активировал связывание ГТФ, тогда как 6-БАП не влиял на связывание, но при совместном действии этих фитогормонов связывание ГТФ было близким к контрольному уровню (рис. 35). В егг1-1 связывание ГТФ было очень низким и не изменялось ни при обработке этиленом, ни при обработке цнтокнни-

ном (рис. 35). Это указывает на то, что взаимодействие этилена и шпокининов происходит между рецепцией этих гормонов и мС-белками.

Таким образом, данные, приведенные в этом разделе, демонстрируют проявление взаимодействия этилена и ци-токишшд в трех разных процессах: фосфорнлирование мембранных белков, ГТФ-связывающая активность mG-белков и активность МАП-киназы. Несомненно, довольно затруднительно судить о механизмах взаимодействия двух физиологически активных веществ, рассматривая их влияние на тотальный процесс, как это имеет место в случае, например, фосфорилиро-вания мембранных белков. Мы понимаем, что необходимо рассматривать влияние на индивидуальные белки, но в контексте нашей работы важен, прежде всего, сам факт взаимодействия. Расположив MG-белкн и МАП-киназу в том порядке, как они функционируют в предполагаемых путях передачи сигналов, мы приходим к заключению, что взаимодействие этилена и цитокннина происходит на ранних этапах путей трансдукцин сигналов: между рецепторами к/или мв-белками, как это встречается в животных клетках (Denhardt, 1996). Тем не менее, нельзя исключить, что, во-первых, рецепторы разных гормонов могут непосредственно взаимодействовать друг с другом в одной и той же клетке, как это показано у млекопитающих (Kaffitz et al., 1999; Liu et al., 2000). Во-вторых, в клетках животных активация рецептора одного гормона при связывании со своим лигэндом может вести к модификации рецептора другого гормона (Wu et al., 1995). Это делает возможным взаимодействие разных гормонов на уровне их рецепторов и ранних этапов передачи их сигналов (Pawson and Nash, 2000). В настоящее время нет оснований считать, что подобный сценарий не может иметь место и у растений. Кроме того, если принять во внимание, что сами мО-белки могут формировать каскады (Van Aelst and D'Souza-Schorey, 1997; Campbell et al, 1998; Bishop and Hall, 2000) и влиять на активность друг друга, то интерпретация результатов многократно усложняется. Для решения обсуждаемой проблемы прежде всего необходимо понять, на все ли mG-белки, активность которых регулируется этиленом, действует цитокинин, или его действие избирательно. В диком типе 6-БАП вызывал лишь некоторое увеличение ГТФ-связывающей активности полипептидов 22 и 25 кДа, тогда как эффект этилена был существенным. При совместной обработке уровень связывания ГТФ был сходен с таковым при обработке одним 6-БАП для 22-кДа-поли пептидов или с контролем для 25-кДа полипептидов, хотя по сравнению с 6-БАЛ влияние этилена сильнее сказывалось на 22-

Этилен: - - + + — — + +

6-БАП: - + - + - + - +

30— ^ШШк^

20,1 — WWW -

ДИКИЙ тип etrl-1

Рнс. 35. Влияние этилена (10 мкл/л) и 6-БАП (5 мкМ) на связывание ГТФ с мС-белками из листьев ЛгаЫ4орх1з. После реакции аффинного мечения белки разделяли в ДДС-Ыа ПААГ и меченые белки визуализировали авторадиографией.

кДа полипептиды (рис. 35). Полученные результаты показывают, что эффект этой пары фитогормовов, скорее, избирательный. Этсгг вопрос является весьма приншшиальным и требует дальнейших исследований. Но и при его решении мы не будем иметь окончательного ответа, пока не будут идентифицированы все компоненты путей передачи сигналов этилена и цитокинина. Более того, ситуацию значительно усложняет множественность рецепторов этилена, но не известно, активны ли все они одновременно. Есть, кроме того, все основания полагать существование нескольких рецепторов и для цитокинина (Kulaeva el al, 1998; Кулаева, Кузнецов, 2002). Поэтому, с одной стороны, необходимо понимание того, когда, где, при каких обстоятельствах и какие рецепторы активны. С другой стороны, нельзя исключить, что существует не один, а несколько путей передачи сигналов этилена и цитокинина, которые могут взаимодействовать.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования доказывают, что MG-белки вовлечены в транедукцию этиленового сигнала в качестве компонентов, передающих информацию о воспринятом рецептором (рецепторами) сигнале, на активируемый этиленом МАП-кнназный каскад (Novikova et al, 2000; Hall et al, 2001). Основанием для подобного заключения являются следующие факты.

Первое: скорость и кинетика активации MG-белков. Активация ряда MG-белков в ответ на обработку этиленом эпикотилей гороха (рис. 20, 24 и 25) происходит быстрее, чем какой-либо зарегистрированный биохимический эффект этилена в интакгной ткани, но в тех же временных интервалах, что и некоторые биологические ответы, например, ннгибированис роста корней у гороха (Warner and Leopold, 1971). Четырехкратная активация связывания ГТФ с мй-белкамн у Arabidopsis в первые 10 мин обработки листьев представляется также очень быстрой (рис. 23 и 26). Причем в обоих случаях скорость ответа сходна с ситуацией, наблюдаемой в тканях животных (Foschi et al, 1997), И соответствует поведению эффекторных белков, расположенных вблизи рецептора (сайта восприятия сигнала). В связи с этим следует отмстить, что изучение связывания этилена in vivo как в горохе, так и в Arabidopsis показало, что рецепторы этилена у этих растений имеют высокие скорости ассоциации (Sanders et al, 1991), свидетельствуя, что транс-дукция сигнала может включаться очень быстро при экспозиции растений с фитогормоном. Исследования связывания этилена in vivo также показали, что в обоих объектах имеются связывающие компоненты с низкими скоростями ассоциации/диссоциации (Sanders et al, 1991). Кстати сказать, экспрессированньш в дрожжах ETR1 имея низкую скорость ассоциации (Schaller and Bleecker, 1995), тогда как in planta он проявляет свойства "быстрых" сайтов (Bleecker et al, 1988). Это указывает, что оба типа этилен-связывающих сайтов, скорее всего, кодируются одним геном н растению необходимо, чтобы рецептор находился в обеих кинетических формах. При использованных в нашей работе продолжитсяьносгях обработки растений этиленом наблюдаемая активация MG-белков является результатом связывания с "быстрыми" сайтами, поскольку в течение 44

нескольких минут экспонирования растений с фитогормоном лишь очень малая часть "медленных" сайтов может быть оккупирована лигандом. На наш взгляд, важно, что MG-белют, модулируемые этиленом, ассоциированы с эндомембраками, которые, как показано в нашей работе и другими авторами, являются местом локализации рецепторов этилена (Evans et al, 1981, 1982; Schaller and Blcecker, 1995; Schaller et al, 1995; Chen et al, 2002).

Второе: двувершинная кривая активации MG-белков у гороха (рис. 20) сходна с активацией MG-белков в некоторых клетках животных, подвергающихся продолжительному гормональному воздействию (Foschi et al, 1997). Интересно, что в таких случаях первый пик активации связан с инициацией МАП-киназных каскадов (Meloche et al, 1992; Lenormand etal, 1993; Buday et al, 1995; Marshall, 1995; Foschi etal, 1997; York et al, 1998; Egan el al, 2002).

Третье: быстрая активация транскрипции генов некоторых MG-белков напоминает события, развивающиеся в ответ на ауксин, когда наблюдается как активация МАП-киназы (Mockaitis and Howell, 2000), так и усиление транскрипции се гена (Mizoguchi et al, 1994).

Четвертое: у этилен-нечувствительного рецепгорного мутанта etrl-1 ГТФ-связывающая активность MG-бслков, которые активировались в ответ на этилен в диком типе, конститутивно низка (рис. 21,26 и 27), поскольку etrl-1 потерял способность отвечать на обработку этиленом из-за дефекта в рецепторе этилена. Кроме того, у etrl-1 уровень транскрипции гена Rab8, активируемого этиленом в диком типе, очень низок и не активируется этиленом (рис. 31). В отличие от etrl-I у мутанта ctrl-1 уровень транскрипции Rab8 значительно выше, чем в диком типе, но, как и у etrl-1, не изменяется при обработке этиленом (рис. 31). Следует также подчеркнуть, что сильному этиленовому фенотипу ctrl-1 соответствует высокая конститутивная активность ряда MG-белков, тогда как у etrl-1 отсутствие чувствительности к этилену сочетается с низким конститутивным уровнем активности MG-белков.

Пятое: тот факт, что не все MG-белки, активируемые этиленом в диком типе, в ctrl-1 обнаруживаются в активированном состоянии, позволяет выдвинуть гипотезу, что вовсе не обязательно, таз все компоненты, относимые к пути передачи этиленового сигнала, принадлежат одному пути, который оперирует через CTR1. Это соображение согласуется с тем, что рецессивный мутант Arabidopsis по четырем из пяти рецепторов этилена имеет экстремальный этиленовый фенотип (Hua and Meyerowitz, 1998).

Шестое: на ретуляторную роль MG-белков в трасдукции этиленового сигнала указывает антагонизм между этиленом и цитокнннном в модуляции активности MG-белков в листьях Arabidopsis, что соответствует антагонизму этой пары фитогормонов при старении листьев Arabidopsis и указывает на вероятность взаимодействия путей передачи сигналов этилена и цитокиннна на уровне близком к их рецепторам.

Анализ взаимоотношений между активацией MG-белков и активацией МАП-кил азы ERKI типа (Novikova et al, 2000) в ответ на этилен дает все основания думать,

что они функционируют в одном пути. Об этом свидетельствует, в частности, характер зависимости изменения обеих активностей от времени обработки ткани этиленом (рис. 36). Сходства, на наш взгляд, очевидны, и, скорее всего, это может служить доказательством функционирования мО-белков и этилен-активируемой МАП-киназы в одном сигнальном пути.

Тогда возникает вопрос, могут ли MG-белки и МАП-киназа, активность которых регулируется этиленом, функционировать в пути передачи этиленового сигнала, постулированном на основании генетического анализа мутантов АгаЫ-dopsis (рис. 37). Согласно этим представлениям, в отсутствие этилена рецепторы физически связаны с CTR1, что ведет к активации этой протеинкиназы и, следовательно, всего предполагаемого МАП-киназиого каскада. Вследствие работы этого каскада репрессируется активность EIN2 и нижележащих факторов транскрипции и не происходит экспрессии генов ответа на этилен. При связывании этилена с рецепторами нарушается их связь с CTR1, что ведет к инактивации CTR1 и всего МАП-киназного каскада. Снимается репрессирующий блок с EIN2, происходит активация этилен-зависимых факторов транскрипции и экспрессия этилен-регулируемых генов. Этот путь в литературе получил название "линейного пути" передачи этиленового сигнала. Следует отметить, что с линейным путем согласуются представления о рецепторах этилена и CTR1 как негативных регуляторах, поскольку для того чтобы линейный путь функционировал, приводя к ответу на этилен, необходимо, чтобы активность CTRI была выключена или снижена. Однако результаты, полученные в настоящей работе, а также данные других авторов (Voescnek et al, 1997; Vriezen et al, 1997: Lashbrook et al, 1998; Novik-ova et al, 2000; Sato-Nara et al., 1999; Tieman et al, 2000) нельзя объяснить с точки зрения линейного пути передачи этиленового сигнала. Кроме того, в дрожжевой двугиб-ридной системе показано прямое взаимодействие CTR1 и ETR1 (Clark et al, 1998), а также в последовательности CTR1 не обнаружено Ras-связывающего домена (Kieber et al, 1993). То есть, маловероятно, что MG-белки располагаются между ETR1 и CTR1.

280

200 Д

se £ ISO i 3

t 100 //NX

50 I f x

0 ( 1 ^

0 20 40 «0 SO 1» 120

продолжительность обработки, мнк

Рис. 36. Зависимость ГТФ-связывающей и (•) и МАП-киназной активностей (о) этиолированных эпикотилей гороха от времени обработки проростков этиленом (1 мкл/л). Точки на графиках получены сканированием радиоавтографов аффин-номеченых MG-белков и фосфорилиро-ванного основного белка миелина при определении МАП-киназной активности in vitro.

AIR

ел H

ettiytwi*

На основании полученных данных мы приходим к выводу, что кроме CTR1-зависимого пути передачи этиленового сигнала в растениях существует и иной путь передачи этиленового сигнала (рис. 38). Этот путь инициируется теми же рецепторами, что и линейный путь, но в отличие от CTR1 'зависимого пути, предлагаемый нами путь включает модулируемые этиленом MG-белки и этилен-активируемый МАП-киназный каскад. Он не работает в отсутствие этилена, но активируется при связывании этилена с рецепторами, когда происходит инактивация CTR1-зависимого пути.

Обсуждение трамсдукции этиленового сигнала через MG-белки и этилен-активируемый МАП-киназный каскад приводит и к некоторым вопросам. Прежде всего, почему до сих пор не обнаружены мутанты по мв-белкам и МАП-киназам? На наш взгляд, наиболее вероятной причиной этого является функциональная избыточность этих компонентов, что является характерной чертой сигнальных систем клеток животных (Reuther and Der, 2000). В настоящее время не вызывает сомнений, что сказанное в полной мере относится и к некоторым компонентам пути передачи этиленового сигнала у Arabidopsis (Hua and Meyerowitz, 1998) и томатов (Tieman et a/., 2000). Заметам, что гены двух MG-белков АгаЗ и Rab$, транскрипция которых увеличивалась при обработке этиленом (рис. 30), кодируют белки, имеющие 93% гомологии. И если бы не функциональная избыточность, тогда можно было бы ожидать наличие мутантов как по MG-бел кам, так и по МАШ киназе и МАП-киназе, участвующим в передаче этиленового сигнала. Но пока таких мутантов не обнаружено.

Возникает также вопрос, функционирует ли путь передачи этиленового сигнала, предлагаемый нами, полностью независимо от линейного пути или его контроль осуществляется через С TRI. На основании имеющихся данных нельзя исключить, что могут

Ethyltn« RHpontM

Рис. 37. Схема линейного пути трансдук-ции этиленового сигнала в растениях Arabidopsis, основанная на модекулярно-генетическом анализе мутантов с измененной чувствительностью к этилену (Hi-rayama el al, 1999; Schaller and Kieber, 2002; Larsen and Cancel, 2003).

- ЭТИЛЕН

*цитокинин \

Экспрессии

эп*»м-ре[уриру*мых пное

Рис. 38. Схема пути передачи этиленового сигнала у высших растений, включающая мв-белки и этилен-активируемый МАП-киназный модуль. Указан пункт предполагаемого взаимодействия путей передачи этиленового и ци-токи ни нового сигналов.

реализоваться обе возможности. На независимость двух путей передачи этиленового сигнала указывают следующие данные: модуляция активности мв-белков и стимуляция МАП-киназы ЕЙК1 типа при обработке этиленом растений АгаЬШорзЬ дикого типа; конститутивно низкие активности мв-белков и МАП-киназы в е{г1-1, у которого нарушено связывание гормона с рецепторами. В этом случае рецепторы этилена являются позитивными регуляторами предлагаемого нами пути. С другой стороны, у мутанта сГг!-1 активность обоих обсуждаемых компонентов конститутивно высокая. То есть выключение СТЯ1 -зависимого цуги передачи этиленового сигнала привода к активации предлагаемого нами пути, что указывает на возможность его регуляции через активность СТЯК Действительно, МАП-киназы могут регулировать

активность MG-белков, например, путем ф ос формирования факторов ГДФ/ГТФ обмена (Klarlund el al, 1995; Langlois et ai, 1995; Porfiri and McCormik, 1996). Но, каким бы ни оказался ответ на поставленный вопрос, очевидно, что CTR1 играет ключевую роль в возможном взаимодействии этих двух путей передачи этиленового сигнала.

Дальнейшие исследования по идентификации индивидуальных MG-белков и МАП-киназ, активность которых модулируется этиленом, позволят выяснить их роль в трансдукции этиленового сигнала и установить пункты взаимодействия предлагаемого в данной работе пути передачи этиленового сигнала с линейным путем.

ВЫВОДЫ

1, Впервые проанализировано связывание этилена in vitro с мембранами этиолированных эпикотилей гороха. Кинетические параметры связывания in vitro соответствуют таковым, полученным при связывании фитогормона in vivo с интактными этиолированными эпикотилями гороха, и отражают закономерности, обнаруженные на других растительных объектах.

2. Связывание этилена in vitro с мембранами этиолированных проростков гороха зависит от фосфорилирования рецепторов. Фосфорилирование рецепторов может быть механизмом регуляции связывание этилена.

3. В семядолях фасоли идентифицированы пол и пептиды с мол. массами 28 и 26 кДа, обладающие этилеп-связывающей функцией и иммунологическим сходством с мембранным рецептором этилена ETJU из Arabidopsis.

4. Впервые показано, что этилен траязиторно и дифференциально регулирует ГТФ-связывающую активность ряда G-белков в листьях Arabidopsis и этиолированных эпикотилях гороха. Совокупность свойств этилен-регулируемых G-белков позволила классифицировать их как мономерные G-белки Ras суперсемейства, часть которых относится к Rab семейству,

5. Модуляция активности мономерных G-белков рецептор-зависима и этклен-специфична, что доказано с использованием муганггов Arabidopsis н высокоспецифичных ингибиторов действия этилена рецепторного уровня.

6. Этилен дифференциально и транзигорно регулирует экспрессию генов мономерных G-белков Rab семейства.

7. Взаимодействие этилена и шттокинина у Arabidopsis обнаружено на уровне активности мономерных G-белков и МАП-киназ. Этилен и цитокинин проявляют аддитивный эффект при ингибировании роста этиолированных гипокстилей Arabidopsis, причем угнетающее влияние цитокинина на рост этиолированных гипокотнлей Arabidopsis может быть следствием прямого действия цитокинина, а не опосредовано этиленом, что показано с использованием рецепторных этилен-нечувствительных мутантов Arabidopsis и ингибиторов действия этилена рецепторного уровня,

8. Совокупность полученных данных позволяет заключить, что мономерные G-белки вовлечены в передачу этиленового сигнала в качестве промежуточных компонентов, функционирующих между рецепторами этилена и этилен-актив1фуемым МАП-киназ ным каскадом.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Романко Е.Г., Селиванкина С.Ю., Харченко В.И., Мотков ИХ,, Кулаева О.Н.

(1985) Сравнение действия на синтез РНК in vitro комплекса цитокинина с цитоки-пинсвязывающими белками из листьев ячменя и зародышей пшеницы. Физиология растений, 32, 506-512.

2. Романко Е.Г., Селиванкина С.Ю., Мошков И.Е., Новикова Г,В, (1986) Действие выделенных из хлоронластов цитокинннсвязывающих белков на транскрипцию. Физиология растений, 33, 1078-1083.

3. Селиванкина С.Ю., Романко E.J., Каравайко II.Н., Мошков И.Е., Новикова Г.В., Кулаева О.Н. (1988) Гормональная регуляция активности протеинкиназ из ци-тозоля листьев ячменя. Доклады АН СССР, 299, 254-256,

4. Kulaeva O.N., Karavaiko N.N., Moshkov I.E., Selivankina S.Yu., Novikova C.V.

{1990) Isolation of a protein with cytokinin receptor properties by means of anti-idiotype antibodies. FEBSLett261,410-412.

5. Селиванкмна С.Ю., Новикова Г.В., Переверзева И.Н., Мошков И.Е., Кулаева О Н. (1990) Присутствие в листьях ячменя регулируемой цитокинином протеинки-назы С-типа. Физиология растений, 37, 864-872.

6. Каравайко Н.Н., Мошкой И.Е., Новикова Г.В., Селнпамкння СЮ., Кулаева О.Н. (1990) Выделение при помощи антиндиотнпических антител белка со свойствами рецептора цитокининов. Доклады АН СССР, 310,765-767.

7. Кудоирова Г.Р., В«селов С.Ю., Каравайко Н.Н., Гюлн-эаде В.З., Чередова E.IL, Мусгафина А.Р., Мошков И.Е., Кулаева О.Н. (1990) Иммуиофермснтная тсст-система для определения цитокининов. Физиология растений, 37,193-199.

8. Каравайко Н.Н., Мошков И.ЕЧ Кудоярова Г.Р., Кулаева О.Н. (1990) Выявление цитокининсвязываюших белков при помощи иммуно-тест системы для определения цитокининов. В сб.: Иммуноферментный анализ регуляторов роста растений: применение в диагностике растений и экологии, Уфа, УрО ЛН СССР, с. 116.

9. Kulaeva O.N., Novikova G.V., Selivankina S.Yu., Karavaiko N.N., Moshkov I.E. (1992) Protein kinases and cytokinin-binding proteins in plant response to cytokinin. In: Physiology and Biochemistry of Cytokinins in Plants, Kaminek M., Mok D.W.S. and Zazimalova E. (eds.), SPB Academic Publishing: The Hague, pp. 121-125.

10. Selivankina S.Yu., Novikova G.V., Pereverzeva I.N., Moshkov I.E., Kulaeva O.N. (1992) Possible involvement of protein kinase C-type enzyme from barley leaves in cytokinin action, in: Physiology and Biochemistry of Cytokinins in Plants, Kaminek M., Mok D.W.S .and Zazimalova E. (cds.), SPB Academic Publishing: The Hague, pp. 173-175.

11. Hall M.A., Aho H.M., Berry A.W., Cowan D.S., Holland M.G., Moshkov I.E., Novikova G.V., Smith A.R, (1993) Ethylene receptors. In; Cellular and Molecular Aspects of the Plant Hormone Ethylene, Pech J.C., Latche A. and Balagui C. (eds), Dordrecht; Boston, London: Kluwer Academic Publishers, pp. 168-173.

12. Moshkov I.E., Novikova G.V„ Smith A.R, Hall M.A. (1993) In vitro study of ethylene binding sites in pea seedlings. In: Cellular and Molecular Aspects of the Plant Hormone Ethylene, Pech J.C., Latchi A. and Balagui C. (cds), Dordrecht; Boston, London: Kluwer Academic Publishers, pp. 195-196.

13. Novikova G.V., Moshkov I.E., Smith A.R., Hall M.A. (1993) Ethylene and phosphorylation of pea epicotyl proteins. In: Cellular and Molecular Aspects of the Plant Hormone Ethylene, Pech J.C., Latchi A. and Balagui C. (eds), Dordrecht; Boston, London: Kluwer Academic Publishers, pp. 371-372.

14. Hall M.A., Berry A.W., Cowan D.S., Evans J.S., Harpham N.V.J., Moshkov I.E., Novikova G.V., Raskin I., Smith A.R., Tuiner R.J., Xiuqing Z. (1994) Ethylene receptors. In: Biochemical Mechanisms involved in Plant Growth Regulation, Smith C.J„ Galtan J„ Chiatante D. and Zocchi G. (eds.); Oxford: Claredoti Press, pp. 111-122.

15. Kulaeva O.N., Karavaiko N.N., Moshkov I.E., Selivankina S.Yu., Novikova G.V., Pereverzeva I.N., Yakovleva L.A. (1994) Cytokini-binding protein(s) and protein kinases in cytokinin signal transduction. In: Biochemical Mechanisms Involved in Plant Growth Regulation, Smith C.J., Gallan J., Ciiiatante D. and Zocchi G. (eds.); Oxford: Claredon Press, pp. 123-138.

16. Kulaeva O.N., Karavaiko N.N., Selivankina S.Yu., Mosbkov I.E., Novikova G.V., Zemlyachenko Ya.V., ShipUova S,V„ Orudgev E.M. (1996) Cytokinin signalling systems. Plant Growth Regul., 18,29-37.

17. Harpham N.V.J., Berry A.W., Holland M.G., Moshkov I.E., Smith A.R., Hall M.A. (1996) Ethylene binding sites in higher plants. Plant Growth Regul., 18, 71-77.

18. Холланд MX., Берри A3., Кован Д.С., Харфям Н.В.Дж., Хемсли Р.Дж., Мошков И.Е., Новикова Г.В., Смит А.Р., Холл М,А. (1996) Восприятие этилена и передача гормонального сигнала в высших растениях. Физиология растений, 43,22-30.

19. Novikova G.V„ Moshkov I.E., Smith A.R., Hall M.A. (1996) The effect of ethylene on GTP binding in extracts from pea epicotyls. Abstr. Int. Symp. Biology and Biotechnology of the Plant Hormone Ethylene, Chania, Greece, 1996, p. 51.

20. Smith A.R., Berry A.W., Harpham N.V.J., R.J.IIerasley, Holland M.G., Moshkov I.E., Novikova C.V., Hall MA (1997) Ethylene signal perception and transduction. In: Biology and Biotechnology of the Plant Hormone Ethylene, Kanelis A.K., Chang C. and Kende H. (eds.), Dordrecht, Boston, London: Kluwer Academic Publishers, pp. 77-86.

21. Novikova G.V., Moshkov I.E., Smith A.R., Hall M.A. (1997) The effect of ethylene on GTP binding in extracts from pea epicotyls. Planta, 201,1-8,

22. Moshkov I.E., Novikova G.V., Kulaeva O.N., Smith A.R., Hall MA. (1997) Ethylene: signal transduction and interaction with cytokinin. Abstr. Int. Conf. Molecular, Biochemical and Physiological Aspects of Plant Science, Moscow, Russia, 1997, p,15,

23. Hall M.A., Smith A.R., Novikova G.V., Moshkov I.E. (1999) Perception and transduction of ethylene. In: Biochemistry and Molecular Biology of Plant Hormones, llooykaas P.J.J., Hall M.A. and Libbenga k..r. (eds.), Amsterdam, Lausanne, New York, Oxford, Shannon, Singapore, Tokyo: Elsevier, pp. 475-490.

24. Hall M.A., Smith A.R., Moshkov I.E., Novikova G.V. (1999) Ethylcne-cytokinin interactions in signal transduction. In: Advances in Regulation of Plant Growth and Development, Strnad M,, Pec P. and Beck E, (eds.), Prague: Peres Publishers, pp. 111-118.

25. Hall M.A., Smith A.R4 Novikova G.V., Moshkov I.E. (1999) Ethylene signal transduction in relation to hormone sensitivity. Plant Biology, I, 45-56.

26. Novikova G.V., Moshkov I.E., Smith A.R„ Kulaeva O.N., Hall MA (1999) The effect of ethylene and cytokinin on guanosine S'-triphosphate binding and protein phosphorylation in leaves oiArabidopsis thaliana. Planta, 208,239-246.

27. Smith A.R., Moshkov I.E., Novikova G.V., Hall M.A. (1999) The effect of ethylene and cytokinin on GTP binding and MAP kinase activity in Arabidopsis thaliana. In: Biology and Biotechnology of the Plant Hormone Ethylene H, Kanelis Л.К., Chang C„ Klee H.,

Bleecker A.B., Pech J.C. and Grierson D. (eds.), Dordrecht, Boston, London: Kluwer Academic Publishers, 77-83.

28. Novikova G.V., Moshkov I.E., Smith A.R., Hall M.A. (2000) The effect of ethylene on MAPKinase-like activity 'mArabidopsis thaliana. FEBS Lett., 474, 29-32.

29. Novikova G.V., Moshkov I.E., Smith A.R., Hall M.A. (2001) Ethylene on signalling map. Abstr. Int. Symp. Signalling Systems of Plant Cells, Moscow, Russia, 2001, p. 41.

30. Hall M.A., Moshkov I.E., Novikova G.V., Mur L.A.J., Smith A.R. (2001) Ethylene signal perception and transduction: multiple paradigms? Biol Rev., 76, 103-128.

31. Новикова Г.В., Мотков И.Е. (2001) Роль фосфорилирования белков этиолированных проростков гороха в трасдукции этиленового сигнала. Вестник Башкирского университета,Ш2,ч&<лъ2,ъ. 113-116.

32. Moshkov I.E., Novikova G.V., Smith A.iL, Hall M.A. (2001) Monomeric G-proteins are involved in ethylene signalling chain. Abstr. 17IPGSA Int. Conf., Bmo, Czech Rep., 2001, p. 78.

33. Novikova G.V., Moshkov I.E., Smith A.R., Hall M.A. (2001) MAP kinase(s) in ethylene signalling pathway. Abstr. 17IPGSA Int. Conf., Brno, Czcck Rep., 2001, p. 152.

34. Холл М.АЧ Новикова Г.В., Мошков И.Е., Мур Л.АДж., Смит А.Р. (2002) Проте-инкиназы растений в транедукции абиотических и биотических сигналов. Физиология растений, 49, 121-135.

35. Smith A.R^ Moshkov I.E., Mur L.A.J., Novikova G.V., Hall M.A. (2003) Monomeric GTP-binding proteins and MAP kinase on the ethylene signalling map. In: Biology and Biotechnology of the Plant Hormone Ethylene, Vendreli M„ Klee ГГ., Pech J.C., Romojaro F. (eds), Amsterdam: IOS Press, 2003, 15-20.

36. Moshkov I.E., Novikova G.V., Mur L.A.J., Smith A.R., Hall M.A. (2003) Monomeric G-proteins are involved in ethylene transduction pathways). In: Biology and Biotechnology of the Plant Hormone Ethylene, Vendreli M., Klee H., Pech J.C., Romojaro F. (eds), Amsterdam: IOS Press, 2003,41-45.

37. Novikova G.V., Moshkov I.E., Mar L.A.J., Smith A.R., Hall M.A. (2СЮЗ) Protein kinases and the transduction of ethylene signal. In: Biology and Biotechnology of the Plant Hormone Ethylene, Vendreli M., Klee H„ Pech J.C., Romojaro F. (eds), Amsterdam: IOS Press, 2003, 72-73.

38. Moshkov I.E., Mar L.A.J., Novikova G.V., Smith A.R., Hall M.A. (2003) Ethylene regulates monomeric GTP-binding protein gene expression and activity in Arabtdopsis thaliana. Plant Physiol., 131, 1705-1717.

39. Moshkov I.E., Novikova C.V., Mur L.A.J., Smith A.R, Hall M.A. (2003) Ethylene rapidly upregulates the activities of bolh monomeric GTP-binding proteins and protein kinase(s)in epicotyls oiPisum sativum L. Plant Physiol,, 131, 1718-1726.

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 15.10.2003 г. Формат 60x90 1/16, Уел.иеч.л. 3,0. Тираж 120 экз. Заказ S19. Тел. 939-3890, 939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992. ГСП-2, Москва, Ленинские горьг, МГУ им. М.ВЛомоносова.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Мошков, Игорь Евгеньевич

Список сокращений.

I. ВВЕДЕНИЕ.

• II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

II. 1. Биохимические исследования этилен-связывающих сайтов в высших растениях.

11.2. Рецепторы этилена из Arabidopsis thaliana.

11.3. CTR1 - Raf-подобнэя протеинкиназа.

11.4. Рецепторы этилена в растениях томатов.

11.5. ГТФ-связывающие белки: структура, свойства, регуляция, функции

11.5.1. Гетеротримерные G-белки.

11.5.2. Биохимические доказательства присутствия гетеротримерных

G-белков в клетках растений.

II.5.2.1. Использование аналогов ГТФ.

И.5.2.2. Влияние холерного (СТХ) и коклюшного (РТХ) токсинов на связывание ГТФ.

II.5.2.3. Иммунологические доказательства наличия гетеротримерных G-белков в клетках растений.

И.5.2.4. Физиологические и биохимические исследования возможного участия гетеротримерных G-белков в сигнальной трансдукции у растений.

11.5.3. Молекулярно-биологический анализ генов гетеротримерных

G-белков растений.

11.5.4. Мономерные ГТФ-связывающие белки.

II.5.4.1. Общие свойства мономерных G-белков.

11.5.4.1.1. Структура мономерных G-белков.

11.5.4.1.2. Регуляция активности мономерных G-белков.

11.5.4.1.3. Локализация мономерных G-белков.

11.5.4.1.4. Эффекторы мономерных G-белков.

11.5.4.1.5. Каскады мономерных G-белков.

11.5.4.1.6. Взаимодействие (cross-talk) мономерных Gбелков.

II.5.4.2. Мономерные G-белки растений.

11.5.4.2.1. Rop семейство мономерных G-белков.

11.5.4.2.2. Rab семейство мономерных G-белков.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Рецепция этилена и роль мономерных G-белков в передаче этиленового сигнала"

Все аспекты функционирования клеток любого многоклеточного организма, в том числе и растительного, зависят от того, насколько эффективно и адекватно клетки реагируют на изменения внешней и внутренней среды. Одним из важней ших факторов, обеспечивающих и координирующих физиологические функции растений, являются фитогормоны. Наиболее актуальным и интенсивно развивающимся направлением современной фитогормонологии является исследование процессов восприятия, усиления, передачи и преобразования гормональных сигналов. Цегггральное положение в ряду этих проблем занимают процессы специфического узнавания гормона его рецепторами, в результате чего инициируется цепь биохимических реакций необходимых для осуществления конечного эффекта гормона на клетку, включая и процессы передачи гормонального сигнала к месту его реализации. Фитогормон этилен является глобальным регулятором физиологических изменений, происходящих в растениях как при нормальных, так и стрессовых условиях (Abeles et al, 1992). Так, под контролем этилена находятся такие процессы как прорастание семян, созревание климактерических плодов, растяжение клеток, ответы на патогены, образование корневых волосков, старение и опадение листьев и цветов. Этилен и ингибиторы его действия в отличие от остальных фитогормонов широко применяются в сельском хозяйстве и пищевой индустрии. Это кроме академического интереса является причиной того, что на протяжении многих лет исследования механизма действия этого фитогормона были и остаются одной из центральных задач биологии растений. Однако следует отметить, что исследования рецепторов этилена и наиболее ранних событий, происходящих на пост-рецепторном уровне, начались несколько позднее, чем для других фитогормонов. Это связано с тем, что этилен является уникальным фитогор моном, поскольку он является единственным газообразным гормоном растений. Кроме того, уникальность этилена выражается и в том, что это единственный фитогормон, который наряду с биотическим имеет и абиотическое 8 лению у растений конститутивного этиленового фенотипа, который наблюдается как у этиолированных проростков, так и у взрослых растений дикого типа, выращенных в присутствии этилена (Kieber, 1997а, Ь). На основании этих данных было постулировано, что в передачу этиленового сигнала вовлечен МАП-киназный модуль (каскад). В клетках животных и дрожжей МАП-киназные модули (каскады) являются эффекторами ГТФ-связывающих белков (G-белков) как гетеротримерных, так и мономерных (Gilman, 1987; Hall, 1990; Herskowitz, 1995). В указанных системах Gбелки интенсивно исследуются, поскольку не вызывает сомнений их важная роль в сигнальной трансдукции, а также ввиду того, что G-белки могут быть продуктами онкогенов (Hunter, 1997). Иная ситуация наблюдалась с растительными организмами, и к началу нашей работы информация о возможной роли G-белков в передаче сигналов в высших растениях была весьма незначительна и фрагментарна, не смотря на то, что были обнаружены и охарактеризованы гены, кодирующие растительные G-белки, гомологичные G-белкам животных и дрожжей (Terryn et ai, 1993; Ma, 1994). В работах ряда авторов была продемонстрирована возможная роль гетеротримерных G-белков в передаче ауксинового сигнала (Zaina et al, 1990), при световой регуляции (Romero et al, 1991; Warpeha et al, 1991), грибной инфекции (Legendre et al, 1992; Kawakita and Doke, 1994), a также при связывании фузикокцина с его предполагаемым рецептором (De Boer et al, 1994). Гомология между белком CTR1 и МАПЗ киназой Raf, которая в клетках животных регулируется мономерными G-белками Ras суперсемейства (Daum et al, 1994), позволяла предполагать, что G-белки могут участвовать в передаче этиленового сигнала. Правомерность такого предположения подкреплялась тем, что трехмерная структура акцептирующего (receiver) домена рецептора этилена ETR1 (Schaller et al, 1995) сходна со структурой представителей Ras суперсемейства (Bourne et al, 1991). Однако исследований возможного участрм G-белков в трансдукции этиленового сигнала не проводилось. 11 Перечисленные выше проблемы и определили необходимость проведения настоящей работы, поскольку исследования рецепторов этилена и событий, разворачивающихся на пост-рецепторном уровне, являются ключевыми для установления механизма действия фитогормона и приоритетны для выяснения общих принципов восприятия и передачи сигналов в растительной клетке. 12

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Мошков, Игорь Евгеньевич

VI. выводы

Впервые проанализировано связывание этилена in vitro с мембранами этиолированных эпикотилей гороха. Кинетические параметры связывания in vitro соответствуют таковым, полученным при связывании фитогормона in vivo с ин-тактными этиолированными эпикотилями гороха, и отражают закономерности, обнаруженные на других растительных объектах.

Связывание этилена in vitro с мембранами этиолированных проростков гороха зависит от фосфорилирования рецепторов. Фосфорилирование рецепторов может быть механизмом регуляции связывание этилена.

В семядолях фасоли идентифицированы полипептиды с мол. массами 28 и 26 кДа, обладающие этилен-связывающей функцией и иммунологическим сходством с мембранным рецептором этилена ETR1 из Arabidopsis. Впервые показано, что этилен транзиторно и дифференциально регулирует ГТФ-связывающую активность ряда G-белков в листьях Arabidopsis и этиолированных эпикотилях гороха. Совокупность свойств этилен-регулируемых G-белков позволила классифицировать их как мономерные G-белки Ras суперсемейства, часть которых относится к Rab семейству.

Модуляция активности мономерных G-белков рецептор-зависима и этилен-специфична, что доказано с использованием мутантов Arabidopsis и высокоспецифичных ингибиторов действия этилена рецепторного уровня. Этилен дифференциально и транзиторно регулирует экспрессию генов мономерных G-белков Rab семейства.

Взаимодействие этилена и цитокинина у Arabidopsis обнаружено на уровне активности мономерных G-белков и МАП-киназ. Этилен и цитокинин проявляют аддитивный эффект при ингибировании роста этиолированных гипокотилей Arabidopsis, причем угнетающее влияние цитокинина на рост этиолированных гипокотилей Arabidopsis может быть непосредственным следствием действия цитокинина и не опосредоваться этиленом, что показано с использованием рецепторных этилен-нечувствительных мутантов Arabidopsis и ингибиторов действия этилена рецепторного уровня.

Совокупность полученных данных позволяет заключить, что мономерные G-белки вовлечены в передачу этиленового сигнала в качестве промежуточных компонентов, функционирующих между рецепторами этилена и этилен-активируемым МАП-киназным каскадом.

V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенных исследований являются экспериментальным обоснованием того, что мономерные G-белки вовлечены в трансдукцию этиленового сигнала в качестве компонентов, передающих информацию о воспринятом рецеп-♦ тором (рецепторами) сигнале, на активируемый этиленом МАП-киназный каскад модуль). Основанием для подобного заключения являются следующие факты.

Первое: скорость и кинетика активации мономерных G-белков. Активация ряда мономерных G-белков в ответ на обработку этиленом эпикотилей гороха (Рис. 57, 61 и 62) происходит быстрее, чем какой-либо зарегистрированный биохимический эффект этилена в интактной ткани, но в тех же временных интервалах, что и некоторые биологические ответы, например, ингибирование роста корней у гороха (Warner and Leopold, 1971). Четырехкратная активация связывания ГТФ с мономерными G-белками у Arabidopsis в первые 10 мин обработки листьев представляется также очень быстрой (Рис. 60 и 63). Причем в обоих случаях быстрота ответа сходна с ситуацией , наблюдаемой в тканях животных (Foschi et al, 1997), и соответствует поведению сигнальных молекул, расположенных вблизи рецептора (сайта восприятия сигнала). В этой связи следует отметить, что изучение связывания этилена in vivo как в горохе, так и в Arabidopsis показало, что рецепторы этилена у этих растений имеют высокие скорости ассоциации (Sanders et al., 1991а, b), свидетельствуя, что трансдукция сигнала может инициироваться очень быстро после связывания лиганда рецептором. Исследования связывания этилена in vivo также показали, что в обоих объектах имеются связывающие компоненты с очень низкими скоростями ассоциации/диссоциации (Sanders et al., 1991а, b), и, кстати сказать, экспрессированный в дрожжах ETR1 имел низкую скорость ассоциации (Schaller and Bleecker, 1995). Эти факты указывают, что рецептор должен существовать в ^ обеих кинетических формах, поскольку в течение нескольких минут экспонирования с этиленом лишь очень малая часть "медленных" сайтов может быть оккупирована лигандом. На наш взгляд, важно, что мономерные G-белки, модулируемые этиленом, ассоциированы с эндомембранами, которые, как показано в этой работе, а также другими авторами, являются местом локализации рецепторов этилена (Evans et al., 1982а, b; Schaller and Bleecker, 1995; Schaller et al., 1995; Chen et al., 2002).

Второе: двувершинная кривая активации мономерных G-белков у гороха (Рис. 57) сходна с активацией мономерных G-белков в некоторых клетках живот-♦ ных, подвергающихся продолжительному гормональному воздействию (Foschi et al., 1997). Интересно, что в таких случаях первый пик активации связан с инициацией МАП-киназных каскадов (Meloche et al., 1992; Lenormand et al., 1993; Buday et al., 1995; Marshall, 1995; Foschi et al., 1997; York et al., 1998; Egan et al., 2002).

Третье: быстрая активация транскрипции генов некоторых мономерных G-белков напоминает события, развивающиеся в ответ на ауксин, когда наблюдается как активация МАП-киназы (Mockaitis and Howell, 2000), так и усиление транскрипции ее гена (Mizoguchi et al., 1994).

Четвертое: у этилен-нечувствительного рецепторного мутанта etrl-1 ГТФ-связывающая активность мономерных G-белков, которые активировались в ответ Ш на этилен в диком типе, конститутивно низка (Рис. 58, 63 и 64), поскольку etrl-1 потерял способность отвечать на обработку этиленом из-за мутации в рецепторе этилена. Кроме того, у etrl-1 уровень транскрипции гена Rab8, активируемого этиленом в диком типе, очень низок и не активируется этиленом (Рис. 70). В отличие от etrl-1 у мутанта ctrl-1 уровень транскрипции Rab8 значительно выше, чем в диком типе, но, как и у etrl-1, не изменяется при обработке этиленом (Рис. 70). Следует также подчеркнуть, что сильному этиленовому фенотипу ctrl-1 соответствует высокая конститутивная активность ряда мономерных G-белков, тогда как у etrl-1 отсутствие чувствительности к этилену сочетается с низким конститутивным уровнем активности этих белков. Все эти данные свидетельствуют в пользу вовлечения мономерных G-белков в передачу этиленового сигнала.

Пятое: тот факт, что не все мономерные G-белки, активируемые этиленом в диком типе, обнаруживаются в активированном состоянии в ctrl-1, позволяет выдвинуть гипотезу, что вовсе не обязательно, что все компоненты, относимые к пути передачи этиленового сигнала, принадлежат одному пути, который оперирует через CTR1. Это соображение согласуется с тем, что рецессивный мутант Arabidopsis по четырем из пяти рецепторов этилена имеет экстремальный этиленовый фенотип (Hua and Meyerowitz, 1998).

Шестое: на регуляторную роль мономериых G-белков в грасдукции этиленового сигнала указывает антагонизм между этиленом и цитокинином в модуляции акт ивности мономерных G-белков в листьях Arabidopsis, что соответствует антагонизму этой пары фитогормонов при старении листьев Arabidopsis и указывает на вероятность взаимодействия путей передачи сигналов этилена и цитокинина на уровне близком к их рецепторам.

Анализ взаимоотношений между активацией мономерных G-белков и МАП-киназы в ответ на этилен дает основания думать, что они функционируют в одном пути. Об этом свидетельствует, в частности, характер зависимости изменения обеих активностей от времени обработки ткани этиленом (Рис. 75). Сходства, на наш

Рис. 75. Зависимость ГТФ-связывающей и (•) и МАП-киназной активностей (•) этиолированных эпикотилей гороха от времени обработки проростков этиленом (1 мкл/л). Точки на графиках получены сканированием радиоавтографов аффинномеченых мономерных G-белков и фосфорилиро-ванного основного белка миелина при определении МАП-киназной активности in vitro. взгляд, очевидны, и, скорее всего, это может служить доказательством функционирования мономерных G-белков и этилен-активируемой МАП-киназы в одном сигнальном пути.

О 20 40 60 80 100 120

Продолжительность обработки, мин

У животных мономерные G-белки Ras семейства рассматриваются в качестве наиболее важных компонентов в осуществлении контроля МАП-киназных каскадов. Однако Ras семейство мономерных G-белков не обнаружено у Arabidopsis (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000). Более того, в дрожжевой двугибридной системе показано прямое взаимодействие CTR1 и ETR1 (Clark et al., 1998), а также в последовательности CTR1 не обнаружено Ras-связывающего домена (Kieber et al., 1993). То есть, маловероятно, что Ras белки располагаются между рецептором и CTR1. Это позволило Li с соавт. (2001) предположить, что у растений роль Ras выполняют мономерные G-белки Rop (Rho семейство). Но следует помнить, что у животных Rho и Rab белки координируют процессы развития (Imamura et al., 1998), а белок Rab8ip, взаимодействующий с Rab8, является Сер/Тре протеинкина-зой (Takai et al, 2001). Подобно Rab8 эта киназа локализована в АГ, где она регулирует везикулярный транспорт к ПМ в ответ на Rab8. Rab8ip гомологична р21-активируемым протеинкиназам (РАК) животных и Ste20 (МАП4 киназа) дрожжей S. cerevisiae, активность которых стимулируется при связывании с Rac/Cdc42, находящимися в ГТФ-связанной активной конформации (Manser et al., 1994; Leberer et al, 1997).Bce PAK/Ste20, идентифицированные к настоящему времени, содержат CRIB мотив, ответственный за взаимодействие с Rac/Cdc42. Напомним, что у Arabidopsis обнаружены белки (11), содержащие CRIB мотив и взаимодействующие с ГТФ-связанной формой Ropl (Wu et al., 2001), являясь, таким образом, возможным эффектором мономерных G-белков растений. Это исключительно важный факт, поскольку он указывает, что у растений при отсутствии Ras белков мономерные G-белки других семейств могут работать как канонические Ras, которые в некоторых типах клеток в активированном состоянии непосредственно активируют МАП-киназы (Bagrodia et al, 1995; Zhang et al, 1995; Brown et al, 1996). Ситуация становится еще более сложной, если учесть, что РАК активирует МАП-киназу ERK (Lu et al, 1997), активность которой повышается в ответ на обработку этиленом (Novikova et al., 2000; Ouaked et al, 2003). Следует подчеркнуть, что активация

МАП-киназы ERK протеинкиназой РАК является результатом фосфорилирования МАПЗ киназы Rafl (Morrison and Cutler, 1997).

Обнаруженный в нашей работе факт, что несколько мономерных G-белков имеют отношение к пути передачи этиленового сигнала, вносит дополнительный уровень сложности, поскольку потенциально модуляция активности каждого белка может приводить к появлению многих ответов. Следовательно, при помощи мономерных G-белков можно достичь тончайшей регуляции различных ответов на этилен. Однако такой уровень сложности делает задачу идентификации компонентов, вовлеченных в индивидуальный путь при этиленовом сигналинге чрезвычайно трудной, а также существенно осложняет изучение взаимодействий G-белков между собой и другими взаимодействующими путями. Если принять во внимание, что сами мономерные G-белки образуют каскады (Van Aelst and D'Souza-Schorey, 1997; Campbell et al, 1998; Bishop and Hall, 2000), то это может объяснять наличие множества белков, ГТФ-связывающая активность которых регулируется этиленом. Ш

Тогда возникает вопрос, могут ли мономерные G-белки и МАП-киназа, активность которых регулируется этиленом, функционировать в пути передачи этиленового сигнала, постулированном на основании генетического анализа мутантов Arabidopsis (Рис. 76). Согласно этим представлениям, в отсутствие этилена рецепторы физически связаны с CTR1, что ведет к активации этой протеинкиназы и, следовательно, всего предполагаемого МАП-киназного каскада. Вследствие работы этого каскада репрессируется активность EIN2 и нижележащих факторов транскрипции, и не происходит экспрессии генов ответа на этилен. При связывании этилена с рецепторами нарушается их связь с CTR1, что ведет к инактивации CTR1 и всего МАП-киназного каскада. Снимается репрессирующий блок с EIN2, происходит активация этилен-зависимых факторов транскрипции и экспрессия этилен-регулируемых генов. Этот путь в литературе получил название "линейного пути" передачи этиленового сигнала. Следует отметить, что с линейным путем согласуются представления о рецепторах этилена и CTR1 как негативных регуляторах, поскольку для того чтобы линейный путь функционировал, приводя к ответу на

Ethylene Receptors

MAPKKK

MAPKK? МАРК?

Nramp Metal Transporter

EIN3/EIL Transcription Factors

ERF Transcription Factors

Nucleus

Ethylene Responses

Рис. 76. Схема линейного пути трансдукции этиленового сигнала в растениях Arabidopsis, основанная на молекулярно-генетическом анализе мутантов с измененной чувствительностью к этилену (Hirayama et al., 1999; Schaller and Kieber, 2002; Larsen and Cancel, 2003). этилен, необходимо, чтобы активность CTR1 была выключена или снижена. Однако результаты, полученные в настоящей работе, а также данные других авторов (Voesenek et al., 1997; Vriezen et al., 1997; Lashbrook et al., 1998; Sato-Nara et al., 1999; Novikova et al., 2000; Tieman et al., 2000) нельзя объяснить с точки зрения линейного пути передачи этиленового сигнала.

Обсуждение трансдукции этиленового сигнала через мономерные G-белки и этилен-акгивируемый МАП-киназный каскад приводит и к некоторым вопросам. Прежде всего, почему не обнаружены до сих пор мутанты по мономерным G-белкам и МАП-киназам? На наш взгляд, наиболее вероятной причиной этого может быть их функциональная избыточность, что является характерной чертой сигнальных систем клеток животных (Reuther and Der, 2000), а в настоящее время не вызывает сомнений, что сказанное в полной мере относится и к некоторым компонентам пути передачи этиленового сигнала у Arabidopsis (Hua and Meyerowitz, 1998) и томатов (Tieman et al, 2000). Заметим, что гены двух мономерных G-белков АгаЗ и Rab8, транскрипция которых увеличивается при обработке этиленом (Рис. 69), кодируют белки, имеющие 93% гомологии. И если бы не функциональная избыточность, тогда можно было бы ожидать наличие мутантов как по мономерным G-белкам, так и по МАП2 киназе и МАП-киназе, участвующим в передаче этиленового сигнала. Но пока таких мутантов не обнаружено, хотя отметим, что CTR1 и две наиболее близкие к ней Сер/Тре протеинкиназы имеют только 60% гомологии с Raf киназами животных.

Таким образом, на основании наших данных мы приходим к выводу, что кроме CTR1-зависимого пути передачи этиленового сигнала в растениях существует и иной путь передачи этиленового сигнала (Рис. 77). Этот путь инициируется теми же рецепторами, что и линейный путь, но в отличие от CTR1-зависимого пути, предлагаемый нами путь включает модулируемые этиленом мономерные G-белки и этилен-активируемый МАП-киназный каскад. Он не работает в отсутствие этилена, но активируется при связывании этилена с рецепторами, когда происходит инактивация CTR1-зависимого пути.

Но возникает вопрос, функционирует ли путь передачи этиленового сигнала, предлагаемый нами, полностью независимо от линейного пути или его контроль осуществляется через CTR1. На основании имеющихся данных нельзя исключить, что могут реализоваться обе возможности. Тот факт, что в etrl-1, где рецептор "заперт" в активированном состоянии, и CTR1, следовательно, также активна, кон

- ЭТИЛЕН 1

EIN2

EIN3 ЭТИЛЕН

ЦИТОКИНИН \ вшш м G-белки

МЛЕЕК

EIN2 *

EIN3

Эй этиления ируемых

Экспрессия этилен-регул ируемых генов

Рис. 77. Схема пути передачи этиленового сигнала у высших растений, включающая мономерные G-белки и этилен-активируемый МАП-киназный модуль. Указан пункт предполагаемого взаимодействия путей передачи этиленового и цитокининового сигналов. ститутивные активности как МАП-киназы, так и мономерных G-белков очень низки, может свидетельствовать в пользу того, что либо рецептор репрессирует обе эти активности напрямую, либо CTR1 делает это каким-то иным способом. Например, МАП-киназы могут инактивировагь мономерные G-белки путем фосфорили-рования факторов ГДФ/ГТФ обмена, что приводит к снижению активности последних (Klarlund et al., 1995; Langlois et al., 1995; Porfiri and McCormik, 1996). Kaким бы ни оказался ответ на этот вопрос, очевидно, что CTR1 играет ключевую роль в возможном взаимодействии этих двух путей передачи этиленового сигнала, поскольку мутация ctrl приводит к появлению высокой степени фосфорилирования мембранных белков (Smith et al., 1999) и высокой МАП-киназной активности (Novikova et al., 2000), а также конститутивной активации как мономерных G-белков, так и транскрипции их генов. Дальнейшие исследования по идентификации индивидуальных мономерных G-белков и МАП-киназ, активность которых модулируется этиленом, позволят выяснить их роль в трансдукции этиленового сигнала и установить пункты взаимодействия предложенного в данной работе пути передачи этиленового сигнала с линейным путем.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Мошков, Игорь Евгеньевич, Москва

1. Кулаева О.Н., Кузнецов В.В. (2002) Новейшие достижения и перспективы в области изучения цитокининов. Физиология растений, 49, 626-640.

2. Новикова Г.В. (2002) Передача этиленового сигнала в высших растениях: роль фосфорилирования белков и МАП-киназ. Дисс. на соискание уч. ст. докт. биол. наук, Москва.

3. Романко Е.Г., Селиванкина С.Ю., Овчаров А.К. (1982) Участие цитокинин-связывающих белков из листьев ячменя в активации цитокинином синтеза РНК в изолированных ядрах и хлоропластах. Физиология растений, 29, 524531.

4. Романко Е.Г., Селиванкина С.Ю., Овчаров А.К., Кулаева О.Н. (1980) Активация цитокинин-рецепторным комплексом из листьев ячменя синтеза РНК in vitro. Докл. АН СССР, 225, 1009-1011.

5. Селиванкина С.Ю., Романко Е.Г., Куроедов В.А., Каравайко Н.Н., Кулаева О.Н. (1982) Активация цитокинин-рецепторным комплексом РНК-полимеразы из листьев ячменя. Докл. АН СССР, 267, 510-512.

6. Abe Н., Yamaguchi-Shinozaki К., Urao Т., Iwasaki Т., Hosokawa D. and Shinozaki К. (1997) Role of Arabidopsis MYC and MYB homologs in drought- and abscisic acid-regulated gene expression. Plant Cell, 9, 1859-1868.

7. Abeles F.B. (1984) A comparative study of ethylene oxidation in Vicia faba and Mycobacterium parqffinicum. J. Plant Growth Regul, 3, 85-95.

8. Abeles F., Morgan P. and Saltveit M. (1992) Ethylene in Plant Biology. San Diego, California: Academic Press.

9. Alonso J.M., Hirayama Т., Roman G., Nourizadeh S. and Ecker J.R. (1999) EIN2, a bifiinctional transducer of ethylene and stress responses in Arabidopsis. Science, 284,2148-2152.

10. Ando S., Takumi S., Ueda Y., Ueda Т., Mori N. and Nakamura C. (2000) Nicotiana tabacum cDNAs encoding a and p subunits of a heterotrimeric GTP-binding protein isolated from hairy root tissues. Genes Genet. Syst., 75, 211-221.

11. Antonny В., Beraud-Dufour S., Chardin P. and Chabre M. (1997) N-terminal hydro-^ phobic residues of the G-protein ADP-ribosylation factor-1 insert into membranephospholipids upon GDP to GTP exchange. Biochemistry, 36, 4675-4684.

12. Aravind L. and Ponting C.P. (1997) The GAF domain: an evolutionary link between diverse phototransducing proteins. Trends Biochem. Sci., 22, 458-459.

13. Arber S., Barbayannis F.A., Hanser H., Schneider C., Stanyon C.A., Bernard O. and Caroni P. (1998) Regulation of actin dynamics through phosphorylation ofщ)cofilin by LIM-kinase. Nature, 393, 805-809.

14. Armstromg F. and Blatt M. (1995) Evidence for K+ channel control in Vicia guard cells coupled by G-proteins to a 7TMS receptor mimetic. Plant J., 8, 187-198.

15. Arsene F., Kaminski P.A. and Elmerich C. (1996) Modulation of NifA activity by PII in Azospirillum brasilence: evidence for a regulatory role of the NifA N-terminal domain. J. BacterioL, 178, 4830-4838.

16. Assmann S.M. (2002) Heterotrimeric and unconventional GTP binding proteins in plant cell signaling. Plant Cell, 14, S355-S373.

17. Bagrodia S. and Cerione R.A. (1999) РАК to the future. Trends Cell Biol., 9, 350-355.

18. Bagrodia S., Derijard В., Davis R.J. and Cerione R.A. (1995) Cdc42- and PAK-mediated signaling leads to Jun kinase and p38 mitogen-activated protein kinase * activation. J. Biol. Chem., 270, 27995-27998.

19. Bamburg J.R. (1999) Proteins of the ADF/cofilin family: essential regulators of actin dynamics.Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 15, 185-230.

20. Barbier-Brygoo H. (1995) Tracking auxin receptors using functional approaches. Crit. Rev. Plant Sci., 14, 1-25.

21. Barlow P.W. and Baluska F. (2000) Cytoskeletal perspectives on root growth and morphogenesis. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 51, 289-322.

22. Barritt G.J. and Gregory R.B. (1997) An evaluation of strategies available for the identificationof GTP-binding proteins required in intracellular signaling pathways. Cell. Signal., 9,207-218.

23. Bar-Sagi D. and Hall A. (2000) Ras and Rho GTPases: a family reunion. Cell, 103, 227238.

24. Batoko H., Zheng H.Q., Hawes C. and Moore I. (2000) A Rabl GTPase is required for transport between the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus and for normal Golgi movement in plants. Plant Cell, 12, 2201-2217.

25. Batt S. and Venis M.A. (1976) Separation and localization of two classes of auxin binding sites in corn coleoptile membranes. Planta, 130, 15-21.Ш

26. Baum B. (2002) Winging it: actin on the fly. Dev. Cell, 2, 125-126.

27. Baxter-Burrell A., Yang Z.B., Springer P.S. and Bailey-Serres J. (2002) RopGAP4-dependent Rop GTPase rheostat control of Arabidopsis oxygen deprivation tolerance. Science, 296, 2026-2028.

28. Beaudoin N., Serizet C., Gosti F. and Giraudat J. (2000) Interactions between abscisic acid and ethylene signaling cascades. Plant Cell, 12, 1103-1115.

29. Bednarek S.Y., Reynolds T.L., Schroeder M., Grabowski R., Hengst L., Gallwitz D. and Raikhel N.V. (1994) A small GTP-binding protein from Arabidopsis thaliana functionally complements the yeast Ypt6 null mutant. Plant Physiol., 104, 591596.

30. BefTa R., Szell M., Meuwly P., Pay A., Voegeli-Lange R., Metraux J., Neuhaus G.,mm

31. Meins F. Jr. and Nagy F. (1995) Cholera toxin elevates pathogen resistance and induces pathogenesis-related gene expression in tobacco. EMBO J., 14, 57535761.

32. Beggs M.J. and Sisler E.C. (1986) Binding of ethylene analog and cyclic olefins to a Triton X-100 extract from plants: comparison with in vivo activities. Plant Growth Regul., 4, 13-21.

33. Bender A. and Pringle J.R. (1989) Multicopy suppression of the cdc24 budding defect in yeast by CDC42 and three newly identified genes including the ras-related gene RSR1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 9976-9980.

34. Bengochea Т., Dodds J.H., Evans D.E., Jerie P.H., Niepel В., Shari A.R. and Hall M.A. (1980b) Studies on ethylene binding by cell-free preparations from cotyledons of Phaseolus vulgaris L.: separation and characterization. Planta, 148, 397406.

35. Beraud-Dufour S., Paris S., Chabre M. and Antonny B. (1999) Dual interaction of ADP ribosylation factor 1 with Sec7 domain and with lipid membranes during catalysis of guanine nucleotide exchange. J. Biol. Chem., 274, 37629-37636.

36. Berstein G., Blank J.L., Jhon D.-Y., Exton J.H., Rhee S.G. and Ross E.M. (1992) Phospholipase Cpi is a GTPase-activating protein for Gqm, its physiological regulator. Cell, 70,411-418.

37. Beyer E.M. (1977) 14C2H4, its incorporation and oxidation to 14C02 by cut carnations. Plant Physiol., 60, 203-206.

38. Beyer E.M. and Sundin O. (1978) 14C2H4 metabolism in morning glory flowers. Plant Physiol., 61, 896-899.

39. Bibikova T.N., Blancaflor E.B. and Gilroy S. (1999) Microtubules regulate tip growth and orientation in root hairs of Arabidopsis thaliana. Plant J., 17, 657-665.

40. Birnbaumer L. and Birnbaumer M. (1995) Signal transduction by G proteins: 1994 edition. J. Recept. Signal Transdnct. Res., 15, 213-252.

41. BischofT F., Molendijk A., Rajendrakumar C.S. and Palme K. (1999) GTP-binding proteins in plants. Cell. Mol. Life ScL, 55, 233-256.

42. BischofT F., Vahlkamp L., Molendijk A. and Palme K. (2000) Localization of AtROP4 and AtROP6 and interaction with the guanine nucleotide dissociation inhibitor AtRhoGDIl from Arabidopsis. Plant Mol. Biol., 42, 515-530.

43. Bishop A.L. and Hall A. (2000) Rho GTPases and their effector proteins. Biochem J., 348, 241-255.

44. Blankenship S.M. and Sisler E.C. (1989) Ethylene binding changes in apple and morning glory during ripening and senescence. J Plant Growth Regul., 8, 37-44.

45. Bleecker A.B., Estelle M.A., Somerville C. and Kende H. (1988) Insensitivity to ethylene conferred by a dominant mutation in Arabidopsis thaliana. Science, 241, 1086-1089.

46. Blum W., Hisch K.-D., Schultz G. and Weiler E.W. (1988) Identification of GTP-binding proteins in the plasma membrane of higher plants. Biochem Biophys. Res. Commun., 156, 954-959.

47. Boelker M. (1998) Sex and crime: heterotrimeric G proteins in fungal mating and pathogenesis. Fungal Genet. Biol., 25, 143-156.

48. Boevink P., Martin В., Oparka K., Cruz S.S. and Hawes C. (1999) Transport of virally expressed green fluorescent protein through the secretory pathway in tobacco leaves is inhibited by cold shock and brefeldin A. Planta, 208, 392-400.

49. Boevink P., Oparka K., Cruz S.S., Martin В., Betteridge A. and Hawes C. (1998) Stacks on tracks: the plant Golgi apparatus traffics on an actin/ER network. Plant J., 15,441-447.

50. Bogdanove A.J. and Martin G.B. (2000) AvrPto-dependent Pto-interacting proteins and 0 AvrPto-interacting proteins in tomato. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 97, 8836-8840.

51. Boguski M.S. and McCormick F. (1993) Proteins regulating Ras and its relatives. Nature, 366, 643-654.

52. Boguski M.S., Lowe T.M.J. and Tolstoshev C.M. (1993) DBEST database for expressed sequence tags. Nat. Genet., 4, 332-333.

53. Bokoch G.M. (1995) Regulation of the phagocyte respiratory burst by small GTP-binding proteins. Trends Cell Biol., 5, 109-113.

54. Bolte S., Schiene K. and Dietz K.J. (2000) Characterization of a small GTP-binding protein of the rab 5 family in Mesembryanthemum crystallinum with increased level of expression during early salt stress. Plant Mol. Biol., 42, 923-936.Ш

55. Borg S., Podenphant L., Jensen T.J. and Poulsen C. (1999) Plant cell growth and differentiation may involve GAP regulation of Rac activity. FEBS Lett., 453, 341345.

56. Bos J. (2000) Ras. In.GTPases, Hall A. (ed.), Oxford: Oxford University Press, pp. 6788.

57. Bourne H.R., Sanders D.A. and McCormick F. (1990) The GTPase superfamily: a conserved switch for diverse cell functions. Nature, 348, 125-132.

58. Bourne H.R., Sanders D.A. and McCormik F. (1991) The GTPase superfamily: conserved structure and molecular mechanism. Nature, 349, 117-127.

59. Bowler C., Neuhaus G., Yamagata H. and Chua N.-H. (1994a) Cyclic GMP and calcium mediated phytochrome phototransduction. Cell, 77, 73-81.

60. Bowler С., Yamagata H., Neuhaus G. and Chua N.-H. (1994b) Phytochrome signal-transduction pathways are regulated by reciprocal control mechanisms. Genes Dev., 8, 2188-2202.

61. Bradford M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 72, 248-254.

62. Brown A.M. and Birnbaumer L. (1990) Ionic channels and their regulation by G protein subunits. Annu. Rev. Physiol., 52, 197-213.

63. Brown J.L., Stowers L., Baer M., Trejo J., Coughlin S. and Chant J. (1996) Human Ste20 homologue hPAKl links GTPases to the JNK MAP kinase pathway. Curr. Biol., 6, 598-605.

64. Bucci C., Parton R.G., Mather I.H., Stunnenberg H., Simons K., Hoflack B. and Zerial M. (1992) The small GTPase Rab5 functions as a regulatory factor in the early endocytic pathway. Cell, 70, 715-728.W

65. Buday L. and Downward J. (1993) Epidermal growth factor regulates p21ras through the formation of a complex of receptor, Grb2 adapter protein, and Sos nucleotide exchange factor. Cell, 73, 611-620.

66. Buday L., Warne P.H. and Downward J. (1995) Down-regulation of the Ras activation pathway by MAP kinase phosphorylation of Sos. Oncogene, 11, 1327-1331.

67. Burbelo P.D., Drechsel D. and Hall A. (1995) A conserved binding motif defines numerous candidate target proteins for both Cdc42 and Rac GTPases. J. Biol. Chem., 270, 29071-29074.

68. Burbelo P.D., Snow D.M., Bahou W. and Spiegel S. (1999) MSE55, a Cdc42 effector protein, induces long cellular extensions in fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 9083-9088.

69. Cabib E., Drgonova J. and Drgon T. (1998) Role of small G proteins in yeast cell polarization and wall biosynthesis. Annu. Rev. Biochem., 67, 307-333.

70. Campbell S.L., Khosravi-Far R., Rossman K.L., Clark G.J. and Der C.J. (1998) Increasing complexity of Ras signaling. Oncogene, 17, 1395-1413.

71. Capper E.A. and Marshall L.A. (2001) Mammalian phospholipases A2: mediators of inflammation, proliferation, and apoptosis. Prog. Lipid Res., 40, 167-197.

72. Carty D.J. and Iyengar R. (1994) Guanosine 5'-o-(y-thio)triphosphate binding assay for solubilized G proteins. Method. Enzymol., 237, 38-44.

73. Carty D.J., Padrell E., Codina J., Birnbaumer L., Hildebrandt J.D. and Iyengar R.J. (1990) Distinct guanine nucleotide binding and release properties of the three G, proteins. J. Biol. Chem., 265, 6268-6273.

74. Casey P.J. (1994) Lipid modification of G proteibs. Curr. Opin. Cell. Biol., 6, 219-225.

75. Casey P.J. and Seabra M.C. (1996) Protein prenyltransferases. J. Biol. Chem., 271, 5289-5292.

76. Cavalli V., Corti M. and Gruenberg J. (2001) Endocytosis and signaling cascades: a close encounter. FEBS Lett., 498, 190-196.

77. Celis J.E. and Gromov P. (1999) 2D protein electrophoresis: can it be perfected? Curr. Opin. Biotech, 10, 16-21.

78. Cerione R.A. and Zheng Y. (1996) The Dbl family of oncogenes. Curr. Opin. Cell Biol., 8, 216-222.

79. Chan A.M.-L., Fleming T.P., McGovern E.S., Chedid M., Miki T. and Aaronson S.A. (1993) Expression cDNA cloning of a transforming gene encoding the wild-type Gai2 gene product. Mol. Cell. Biol., 13, 762-768.

80. Chang C. and Meyerowitz E.M. (1995) The ethylene hormone response in Arabidopsis: a eukaryotic two-component signaling system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 4129-4133.

81. Chang C. and Shockey J.A. (1999) The ethylene-response pathway: signal perception to gene regulation. Curr. Opin. Plant Biol., 2, 352-358.

82. Chang С., Kwok S.F., Bleecker A.B. and Meyerowitz E.M. (1993) Arabidopsis ethyl-ene-response gene ETR1\ similarity of product to two-component regulators. Science, 262, 539-545.

83. Chao Q., Rothenberg M., Solano R., Roman G., Terzaghi W. and Ecker J. (1997) Activation of the ethylene gas response pathway in Arabidopsis by the nuclear protein ETHYLENE-INSENSITIVE3 and related proteins. Cell, 89, 1133-1144.

84. Chavrier P., Gorvel J.P., Stelzer E., Simons K., Gruenberg J. and Zerial M. (1991) Hypervariable C-terminal domain of Rab proteins acts as a targeting signal. Nature, 353, 769-772.

85. Chen C.Y.H., Cheung A.Y. and Wu H.M. (2003) Actin-depolymerizing factor medi-* ates Rac/Rop GTPase-regulated pollen tube growth. Plant Cell, 15, 237-249.

86. Chen Q.G. and Bleecker A.B. (1995) Analysis of ethylene signal-transduction kinetics associated with seedling-growth responses and chitinase induction in wild-type and mutant Arabidopsis. Plant Physiol., 108, 597-607.

87. Chen Y.-F., Rand left M.D., Findell J.L. and Schaller G.E. (2002) Localization of the ethylene receptor ETR1 to the endoplasmic reticulum of Arabidopsis. J. Biol. С he т., 277, 19861-19866.

88. Cheung A.Y., Chen C.Y.H., Tao L.Z., Andreyeva Т., Twell D. and Wu H.M. (2003) Regulation of pollen tube growth by Rac-like GTPases. J. Exp. Bot., 54, 73-81.

89. Chong L.D., Traynor-Kaplan A., Bokoch G.M. and Schwartz M.A. (1994) The small GTP-binding protein Rho regulates a phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase in mammalian cells. Cell, 79, 507-513.

90. Choy E., Chiu V.K., Silletti J., Feoktistov M., Morimoto Т., Michaelson D., Ivanov I.E. and Philips M.R. (1999) Endomembrane trafficking of Ras: the CAAX motif targets proteins to the ER and Golgi. Cell, 98, 69-80.

91. Ciardi J. A., Tieman D.M., Jones J.B. and Klee H. J. (2001) Reduced expression of the tomato ethylene receptor gene LeETR4 enhances the hypersensitive response to1.

92. Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Mol Plant-Microbe Interactions, 14, 487-495.

93. Ciardi J.A., Tieman D.M., Lund S.T., Jones J.B., Stall R.E. and Klee H. (2000) Response to Xanthomonas campestris pv. vesicatoria in tomato involves regulation of ethylene receptors gene expression. Plant Physiol, 123, 81-92.

94. Clapham D.E. (1995) Calcium signaling. Cell, 80, 259-268.

95. Clapham D.E. (1996) The G-protein nanomachine. Nature, 379, 297-299.

96. Clapham D.E. and Neer E.J. (1993) New roles for G protein (3y dimers in transmembrane signaling. Nature, 365, 403-406.

97. Clark G.B., Memon A.R., Tong C.-G., Thompson G.A. and Roux S.J. (1993) Phyto-chrome regulates GTP binding in the envelope of pea nuclei. Plant J., 4, 399-402.

98. Clark K.L., Larsen P.B., Wang X. and Chang C. (1998) Association of the Arabidopsis CTR1 Raf-like kinase with the ETR1 and ERS ethylene receptors. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 95, 5401-5406.

99. Clark S.E., Running M.P. and Meyerowitz E.M. (1993) CLAVATA1, a regulator of meristem and flower development in Arabidopsis. Development, 119, 397-418.

100. Clark S.E., Williams R.W. and Meyerowitz E.M. (1997) The CLAVATA1 gene encodes a putative receptor kinase that controls shoot and floral meristem size in Arabidopsis. Cell, 89, 575-585.

101. Clarkson J., Finan P.M., Ricart C.A., White I.R. and Millner P.A. (1991) Specific immunodetection of G-proteins in plant cell membranes. Biochem. Soc. Trans., 19, 239S.

102. Codina J. and Birnbaumer L. (1991) Requirement for intramolecular domain interaction in activation of G protein a subunit by aluminum fluoride and GDP but not by GTPyS. J. Biol. Chem., 269, 29339-29342.

103. Collins C.C. and Johnson D.I. (1997) An Arabidopsis thaliana expressed sequence tag cDNA that encodes a Rac-like protein (Accession No. U88402) (PGR 97-060). Plant Physiol., 113, 1463-1465.Ш

104. Conklin B.R. and Bourne H.R. (1993) Structural elements of Ga subunits that interact with GPy, receptors and effectors. Cell, 73, 631-641.

105. Connern C.P., Smith A.R., Turner R. and Hall M.A. (1989) Putative ethylene binding protein from abscission zones of Phaseolus vulgaris. In: Cell Separation in Plants, Osborne D.J. and Jackson M.B. (eds.), Berlin: Springer-Verlag, pp. 351-356.

106. Cook L.A., Schey K.L., Cleator J.H., Wilcox M.D., Dingus J. and Hildebrandt J.D. (2001) Identification of a region in G protein у subunits conserved across species but hypervariable among subunit isoforms. Protein Sci., 10, 2548-2555.

107. Couchy I., Minic Z., Laporte J., Brown S. and Satiat-Jeunemaitre B. (1998) Immunodetection of Rho-like plant proteins with Racl and Cdc42Hs antibodies. J. Exp. Bot., 49, 1647-1659.

108. Crofts A.J., Leborgne-Castel N., Hillmer S., Robinson D.G., Phillipson В., Carlsson L.E., Ashford D.A. and Denecke J. (1999) Saturation of the endoplasmic reticulum retention machinery reveals anterograde bulk flow. Plant Cell, 11, 2233-2247.

109. Dever Т.Е., Glynias M.J. and Merrick W.C. (1987) GTP-binding domain: three consensus sequence elements with distinct spacing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1814-1818.

110. Djordjevic S., Goudreau P.N., Xu Q., Stock A.M. and West A.H. (1998) Structural basis for methylesterase CheB regulation by a phosphorylation-activated domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1381-1386.

111. Downward J. (1998) Mechanisms and consequences of activation of protein kinase B/Akt. Curr. Opin. Cell Biol., 10, 262-267.

112. Drgonova J., Drgon Т., Tanaka K., Kollar R., Chen G.C., Ford R.A., Chan C.S., Takai Y. and Cabib E. (1996) Rholp, a yeast protein at the interface between cell polarization and morphogenesis. Science, 272, 277-279.

113. Dwyer S.C., Legendre L., Low P.S. and Leto T.L. (1996) Plant and human neutrophil oxidative burst complexes contain immunologically related proteins. Biochem. Biophys. Acta, 1289, 231-237.

114. Egan J.E., Hall A.B., Yatsula B.A. and Bar-Sagi D. (2002) The bimodal regulation of epidermal growth factor signaling by human Sprouty proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 6041-6046.

115. Emans N., Zimmermann S. and Fischer R. (2002) Uptake of a fluorescent marker in plant cells is sensitive to brefeldin A and wortmannin. Plant Cell, 14, 71-86.

116. Evans D.E., Bengochea Т., Cairns A.J., Dodds J.H. and Hall M.A. (1982a) Studies on ethylene binding by cell-free preparations from cotyledons of Phaseolus vulgaris L.: subcellular localisation. Plant CellEnv., 5, 101-107.

117. Evans D.E., Dodds J.H., Lloyd P.C., ap Gwynn I. and Hall M.A. (1982b) A study on the subcellular localisation of an ethylene binding site in developing cotyledons of Phaseolus vulgaris L. by high resolution autoradiography. Planta, 154, 48-52.

118. Fairley-Grenot K. and Assmann S.M. (1991) Evidence for G-protein regulation of inward K+ channel current in guard cells of faba beans. Plant Cell, 3, 1037-1044.

119. Fan W.T., Koch C.A., de Hoog C.L., Fam N.P. and Moran M.F. (1998) The exchange factor Ras-GRF2 activates Ras-dependent and Rac-dependent mitogen-activated protein kinase pathways. Curr. Biol, 8, 935-938.

120. Feig L.A., Urano T. and Cantor S. (1996) Evidence for a Ras/Ral signaling cascade. Trends Biochem. Sci., 21, 438-441.

121. Ferro-Novick S. and Jahn R. (1994) Vesicle fusion from yeast to man. Nature, 370, 191-193.

122. Finkelstein R.R., Gampala S.S.L. and Rock C.D. (2002) Abscisic acid signaling in seeds and seedlings. Plant Cell, 14, S15-S45.

123. Fisher D.D. and Cyr R.J. (1998) Extending the microtubule/microfibril paradigm: cellulose synthesis is required for normal cortical microtubule alignment in elongating cells. Plant Physiol, 116, 1043-1051.

124. Fletcher L.C., Brand U., Running M.P., Simon R. and Meyerowitz E.M. (1999) Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems. Science, 283, 1911-1914.

125. Foschi M., Chari S., Dunn M.J. and Sorokin A. (1997) Biphasic activation of $21™ by endothelin-1 sequentially activates the ERK cascade and phosphatidylinositol 3-m kinase. EMBO J., 16,6439-6451.

126. Fox J.E. and Erion J.L. (1975) A cytokinin-binding protein from higher plant ri-bosomes. Biochem. Biophys. Res. Commun., 64, 694-700.

127. Fox J.E., Erion J.L. and McChesney D. (1979) A new intermediate in the synthesis of a tritiated cytokinin with high specific activity. Phytochem., 18, 1055-1056.

128. Franklin-Tong V.E., Drobak B.K., Allan A.C., Watkins P.A.C. and Trewavas A.J.1996) Growth of pollen tubes of Papaver rhoeas is regulated by a slow-moving calcium wave propagated by inositol 1,4,5-trisphosphate. Plant Cell, 8, 13051321.

129. Friml J., Wisniewska J., Benkova E., Mendgen K. and Palme K. (2002) Lateral relocation of auxin efflux regulator PIN3 mediates tropism in Arabidopsis. Nature, 415, 806-809.

130. Fu Y., Li H. and Yang Z.B. (2002) The Rop2 GTPase controls the formation of cortical fine F-actin and the early phase of directional cell expansion during Arabidopsis organogenesis. Plant Cell, 14, 777-794.

131. Fu Y., Wu G. and Yang Z.B. (2001) Rop GTPase-dependent dynamics of tip-localized F-actin controls tip growth in pollen tubes. J. Cell Biol., 152, 1019-1032.

132. Fujisawa Y., Kato Т., Ohki S., Ishikawa A., Kitano H., Sasaki Т., Asahi T. and Iwa-saki Y. (1999) Suppression of the heterotrimeric G protein causes abnormal morphology, including dwarfism, in rice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 7575-7580.

133. Fukui K., Sasaki Т., Imazumi K., Matsuura Y., Nakanishi H. and Takai Y. (1997) Isolation and characterization of a GTPase activating protein specific for the Rab3 subfamily of small G proteins. J. Biol. Chem., 272, 4655-4658.

134. Gamble R.L., Coonfield M.L. and Schaller G.E. (1998) Histidine kinase activity of the ETR1 ethylene receptor from Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 78257829.

135. Gan S. and Amasino R.M. (1995) Inhibition of leaf senescence by autoregulated production of cytokinin. Science, 270, 1986-1988.

136. Garcia-Ranea J.A. and Valencia A. (1998) Distribution and functional diversification of the ras superfamily in Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett., 434, 219-225.

137. Geldner N., Friml J., Stierhof Y.D., Jurgens G. and Palme K. (2001) Auxin transport inhibitors block PIN1 cycling and vesicle traficking. Nature, 413, 425-428.

138. Geyer M. and Wittinghofer A. (1997) GEFs, GAPs, GDIs and effectors: taking a closer (3D) look at the regulation of Ras-related GTPbinding proteins. Curr. Opin. Struct. Biol, 7, 786-792.

139. Ghassemian M., Nambara E., Cutler S., Kawaide H., Kamiya Y. and McCourt P. (2000) Regulation of abscisic acid signaling by the ethylene response pathway in Arabidopsis. Plant Cell, 12, 1117-1126.

140. Gilman A.G. (1987) G-proteins: transducers of receptor-generated signals. Annu. Rev. Biochem., 56, 615-649.

141. Glick J.L., Meigs Т.Е. and Casey P.J. (2000) G proteins II:Gq, Gn, and Gz. In: GTPases, Hall A. (ed.), Oxford: Oxford University Press, pp. 35-66.

142. Glomset J.A. and Farnsworth C.C. (1994) Role of protein modification reactions in programming interactions between ras-related GTPases and cell membranes. Annu. Rev. Cell Biol, 10, 181-205.

143. Goldsmith P., Gierschik P., Milligan G., Unson C.G., Vinitsky R., Malech H.L. and Spiegel A.M. (1987) Antibodies directed against synthetic peptides distinguish between GTP-binding proteins in neutrophil and brain. J. Biol Chem., 262, 1468314688.

144. Goren R. and Sisler E.C. (1984) Ethylene binding: some parameters in excised tobacco leaves. Tobacco Sci., 62, 110-115.

145. Goren R. and Sisler E.C. (1986) Ethylene-binding characteristics in Phaseolus, Citrus, and Ligustrum plants. Plant Growth Regul, 4, 43-54.

146. Gotor C., Lam E., Cejudo F.R. and Romero L.C. (1996) Isolation and analysis of the soybean SGA2 gene (cDNA), encoding a new member of the plant G-protein family of signal transducers. Plant Mol. Biol., 32, 1227-1234.

147. Goud В., Salminen A., Walworth N.C. and Novick P.J. (1988) A GTP-binding protein required for secretion rapidly associates with secretory vesicles and the plasma membrane in yeast. Cell, 53, 753-768.

148. Grbic V. and Bleecker A.B. (1995) Ethylene regulates the timing of leaf senescence in Arabidopsis. Plant J., 8, 595-602.

149. Griffiths G. (2000) Gut thoughts on the Golgi complex. Traffic, 1, 738-745.

150. Groom Q.J., Torres M.A., Fordham-Skelton A.P., Hammond-Kosack K.E., Robinson N.J. and Jones J.D.G. (1996) rbohA, a rice homologue of the mammalian gp91phox respiratory burst oxidase gene. Plant J., 10, 515-522.

151. Gupta S.K., Gallego C. and Johnson G.L. (1992) Mitogenic pathways regulated by G protein oncogenes. Mol. Biol. Cell, 3, 123-128.

152. Guzman P. and Ecker J.R. (1990) Exploiting the triple response of Arabidopsis to identify ethylene-related mutants. Plant Cell, 2, 513-523.

153. Haizel Т., Merkle Т., Pay A., Fejes E. and Nagy F. (1997) Characterization of proteins that interact with the GTP-bound form of the regulatory GTPase Ran in Arabidopsis. Plant J., 11, 93-103.

154. Hall A. (1990) The cellular functions of small GTP-binding proteins. Science, 249, 635640.

155. Hall A. (1998) Rho GTPases and the actin cytoskeleton. Science, 279, 509-514.

156. Hall A., Marshall C.J., Spurr N.K. and Weiss R.A. (1983) Identification of transforming gene in two human sarcoma cell lines as a new member of the ras gene family located on chromosome 1. Nature, 303, 396-400.

157. Hall A.E., Chen Q.G., Findell J.L., Schaller G.E. and Bleecker A.B. (1999) The relationship between ethylene binding and dominant insensitivity conferred by mutant forms of the ETRl ethylene receptor. Plant Physiol., 121, 291-299.

158. Hall A.E., Findell J.L., Schaller G.E., Sisler E.C. and Bleecker A.B. (2000) Ethylene perception by the ERS1 protein in Arabidopsis. Plant Physiol., 123, 1449-1457.

159. Hall M.A., Moshkov I.E., Novikova G.V., Mur L.A.J, and Smith A.R. (2001) Ethylene signal perception and transduction: multiple paradigms? Biol. Rev., 76, 103128.

160. Hall M.A., Smith A.R., Thomas C.J.R. and Howarth C.J. (1984) Binding sites for ethylene. In: Ethylene: Biochemical, Physiological and Applied Aspects, Fuchs Y. and Chalutz E. (eds.), The Hague: Martinus NijhofiEDr. W. Junk, pp. 55-63.

161. Hancock J.F., Magee A.I., Childs J.E. and Marshall C.J. (1989) All ras proteins are polyisoprenylated but only some are palmitoylated. Cell, 57, 1167-1177.

162. Hart M.J., Eva A., Evans Т., Aaronson S.A. and Cerione R.A. (1991) Catalysis of guanine nucleotide exchange on the CDC42Hs protein by the dbl oncogene product. Nature, 354, 311-314.

163. Hart M.J., Jiang X.J., Kozasa Т., Roscoe W., Singer W.D., Gilman A.G., Sternweis P.C. and Bollag G. (1998) Direct stimulation of the guanine nucleotide exchange activity of pi 15 RhoGEF by Ga,3. Science, 280, 2112-2114.

164. Hashim S., Mukherjee K., Raje M., Basu S.K. and Mukhopadhyay A. (2000) Live Salmonella modulate expression of Rab proteins to persist in a specialized compartment and escape transport to lysosomes. J. Biol. Chem., 275, 16281-16288.

165. Hasunuma K. and Funadera K. (1987) GTP-binding protein(s) in green plant, Lemna paucicostata. Biochem. Biophys. Res. Commun., 143, 908-912.

166. Hasunuma K., Furukawa K., Tomita K., Mukai C. and Nakamura T. (1987) GNP-binding proteins in etiolated epicotyls of Pisum sativum (Alaska) seedlings. Biochem. Biophys. Res. Commun., 148, 133-139.

167. Hawes C.R., Brandizzi F. and Andreeva A.V. (1999) Endomembranes and vesicle trafficking. Curr. Opin. Plant Biol., 2, 454-461.

168. He C.J., Morgan P.W. and Drew M.C. (1996) Transduction of an ethylene signal is required for cell death and lysis in the root cortex of maize during aerenchyma formation induced by hypoxia. Plant Physiol., 112, 463-472.

169. Heidecker G., K61ch W., Morrison D.K. and Rapp U.R. (1992) The role of Raf-1 phosphorylation in signal transduction. Adv. Cancer Res., 58, 53-73.

170. Herskowitz I. (1995) MAP kinase pathways in yeast: for mating and more. Cell, 80, 187-197.

171. Hertel R., Thomson K.-St. and Russo V.E.A. (1972) In vitro auxin binding to a particulate cell fraction from corn coleoptiles. Planta, 107, 325-340.

172. Heslop-Harrison J., Heslop-Harrison Y., Cresti M. and Ciampolini F. (1991) Ultra-structural features of pollen tubes of Endymion nonscriptus modified by cyto-chalasin D. Sex. Plant Reprod., 4, 73-80.

173. Hetherington A.M. and Quatrano R.S. (1991) Mechanisms of action of abscisic acid at the cellular level. New Phytol, 119, 9-32.

174. Higashijima Т., Burnier J. and Ross E.M. (1990) Regulation of Gi and Go by masto-paran, related amphiphilic peptides, and hydrophobic amines. J. Biol. Chem., 265, 14176-14186.

175. Higashijima Т., Uzu S., Nakajima T. and Ross E.M. (1988) Mastoparan, a peptide toxin from venom, mimics receptors by activating GTP-binding regulatory proteins (G proteins). J. Biol. Chem., 263, 6491-6494.

176. Hobbie L. and Estelle M. (1994) Genetic approaches to auxin action. Plant Cell Environ., 17, 525-540.

177. Holdaway-Clarke T.L., Feijo J.A., Hackett G.R., Kunkel J.G. and Hepler P.K.1997) Pollen tube growth and the intracellular cytosolic calcium gradient oscillate in phase while extracellular calcium influx is delayed. Plant Cell, 9, 1999-2010.

178. Homann U. and Thiel G. (1999) Unitary exocytotic and endocytotic events in guard-cell protoplasts during osmotically driven volume changes. FEBS Lett., 460, 495-499.

179. Hooykaas P.J.J., Hall M.A. and Libbenga K.R. (eds.) (1999) Biochemistry and Molecular Biology of Plant Hormones. Amsterdam: Elsevier Science B.V.

180. Horazdovsky B.F., Busch G.R. and Emr S.D. (1994) Vps21 encodes a Rab5-like GTP-binding protein that is required for the sorting of yeast vacuolar proteins. EMBO J., 13, 1297-1309.

181. Hornberg C. and Weiler E.W. (1984) High affinity binding sites for abscisic acid on the plasmalemma of Vicia faba guard cells. Nature, 310, 321-324.

182. Hua J. and Meyerowitz E.M. (1998) Ethylene responses are negatively regulated by a receptor gene family in Arabidopsis thaliana. Cell, 94,261-271.

183. Hua J., Chang C., Sun Q. and Meyerowitz E.M. (1995) Ethylene insensitivity conferred by the Arabidopsis ERS gene. Science, 269, 1712-1714.

184. Hua J., Sakai H., Nourizadeh S., Chen Q.G., Bleecker A.B., Ecker J.R. and Mey-erowitz E.M. (1998) EIN4 and ERS2 are members of the putative ethylene receptor gene family in Arabidopsis. Plant Cell, 10, 1321-1332.

185. Huang H., Weiss C.A. and Ma H. (1994) Regulated expression of the Arabidopsis Ga * gene GPA1. Int. J. Plant Sci., 155, 3-14.

186. Twasaki Y., Kato Т., Daidoh Т., Ishikawa A. and Asahi T. (1997) Characterization of the putative a subunit of a heterotrimeric G protein in rice. Plant Mol. Biol., 34, 563-572.

187. Jacob Т., Ritchie S., Assmann S.M. and Gilroy S. (1999) Abscisic acid signal trans-0 duction in guard cells is mediated by phospholipase D activity. Proc. Natl. Acad.

188. Sci. USA, 96, 12192-12197.

189. Jacobs M., Thelen M.P., Farndale R.W., Astle M.C. and Rubery P.H. (1988) Specific guanine nucleotide binding by membranes from Cucurbita pepo seedlings. Bio-chem. Biophys. Res. Commun., 155, 1478-1484.

190. Jahn R. and Sudhof Т.О. (1999) Membrane fusion and exocytosis. Annu. Rev. Bio-chem., 68, 863-911.

191. Janmey P.A. (1994) Phosphoinositides and calcium as regulators of cellular actin assembly and disassembly. Annu. Rev. Physiol., 56, 169-191.

192. Jedd G., Richardson C., Litt R. and Segev N. (1995) The YPT1 GTPase is essential forфthe first two steps of the yeast secretory pathway. J. Cell Biol, 131, 583-590.

193. Jelsema C.L. and Axelrod J. (1987) Stimulation of phospholipase A2 activity in bovine rod outer segments by the (3y subunits of transducin and its inhibition by the a subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3623-3627.

194. Jerie P.H. and Hall M.A. (1978) The identification of ethylene oxide as a major metabolite of ethylene in Vicia faba L. Proc. Royal Soc., London, Series B, 200, 8794.

195. Joberty G., Perlungher R.R. and Macara I.G. (1999) The Borgs, a new family of Cdc42 and TC10 GTPase-interacting proteins. Mol. Cell. Biol., 19, 6585-6597.

196. Johnson D.I. and Pringle J.R. (1990) Molecular characterization of Cdc42, a Sac-charomyces cerevisiae gene involved in the development of cell polarity. J. Cell m Biol., Ill, 143-152.

197. Jones H.D., Smith S.J., Desikan R., Plakidou-Dymock S., Lovergrove A and Holley R. (1998) Heterotrimeric G-proteins are implicates in gibberellin induction of a-amilase gene expression in wild oat aleurone. Plant Cell, 10, 245-253.

198. Jones M.A., Shen J.J., Fu Y., Li H., Yang Z.B. and Grierson C.S. (2002) The Arabidopsis Rop2 GTPase is a positive regulator of both root hair initiation and tip growth. Plant Cell, 14, 763-776.

199. Kahn R.A. (1991) Fluoride is not an activator of the smaller (20-25 kDa) GTP-binding proteins. J. Biol. Chem., 266, 15595-15597.

200. Katz A., Wu D. and Simon M.I. (1992) Subunits py of heterotrimeric G protein activate (32 isoform of phospholipase C. Nature, 360, 686-689.

201. Kawakita К. and Doke N. (1994) Involvement of a GTP-binding protein in signal transduction in potato tubers treated with the fungal elicitor from Phytophthora in-festans. Plant Sci., 96, 81-86.

202. Kawasaki Т., Hen mi К., Ono E., Hatakeyama S., Iwano M., Satoh H. and Shima-moto K. (1999) The small GTP-binding protein Rac is a regulator of cell death in plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 10922-10926.

203. Kaziro Y. (1990) Molecular biology of G-protein. In: G-Proteins as Mediators of Cellular Signalling Processes, Honslay M.D. and Milligan G. (eds.), Chichester: Wiley and Sons Ltd., pp.47-66.

204. Kaziro Y., Itoh H., Kozasa Т., Nakafuku M. and Satoh T. (1991) Structure and functions of signal-transducing GTP-binding proteins. Annu. Rev. Biochem., 60, 349400.

205. Keith В., Foster N.A., Bonettemaker M. and Srivastava L.M. (1981) In vitro gibberel-lin A4 binding to extracts of cucumber hypocotyls. Plant Physiol., 68, 344-348.

206. Keller Т., Damude H.G., Werner D., Doerner P., Dixon R.A. and Lamb C. (1998) A plant homolog of the neutrophil NADPH oxidase gp91phox subunit gene encodes a plasma membrane protein with Ca2+ binding motifs. Plant Cell, 10, 255-266.

207. Kelly W.B., Esser J.E. and Schroeder J.I. (1995) Effects of cytosolic calcium and limited, possible dual, effects of G protein modulators on guard cell inward potassium channels. Plant J., 8,479-489.

208. Khosravi-Far R., Solski P.A., Clark G.J., Kinch M.S. and Der C.J. (1995) Activation of Rac 1, RhoA, and mitogen-activated protein kinases is required for Ras transformation. Mol. Cell Biol, 15, 6443-6453.

209. Khwaja A. (1999) Apoptosis: Akt is more than just a Bad kinase. Nature, 401, 33-34.

210. Kieber J.J. (1997a) The ethylene response pathway in Arabidopsis. Anrtu. Rev. Plant Physiol., 48, 277-296.

211. Kieber J.J. (1997b) The ethylene signal transduction pathway in Arabidopsis. J. Exp. Bot., 48, 211-218.

212. Kieber J.J., Rothenberg M., Roman G., Feldmann K.A. and Ecker J.R. (1993) CTR1, a negative regulator of the ethylene response pathway in Arabidopsis, encodes a member of the Raf family of protein kinases. Cell, 72, 427-441.

213. Kieffer F., Simon-Plas F., Maume B.F. and Blein J.P. (1997) Tobacco cells contain a protein, immunologically related to the neutrophil small G-protein Rac2 and involved in elicitor-induced oxidative burst. FEBSLett., 403, 149-153.

214. Kim D., Lewis D.L., Graziadei L., Neer E.J., Bar-Sagi D. and Clapham D.E. (1989) G-protein J3y subunits activate the cardiac muscarinic K+ channel via phospholi-pase A2. Nature, 337, 557-560.

215. Kim W.Y., Cheong N.E., Lee D.C., Je D.Y., Bahk J.D., Cho M.J. and Lee S.Y. (1995) Cloning and sequencing analysis of a full-length cDNA encoding a G protein a subunit, SGA1, from soybean. Plant Physiol., 108, 1315-1316.

216. Kirchhausen T. (2000) Three ways to make a vesicle. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 1, 187198.

217. Klarlund J.K., Cherniack A.D. and Czech M.P. (1995) Divergent mechanisms for homologous desensitization of p21ras by insulin and growth factors. J. Biol. Chem., 270, 23421-23428.

218. Klee H. and Tieman D. (2002) The tomato ethylene receptor gene family: form and function. Physiol. Plantarum, 115, 336-341.

219. Klee H.J. (2002) Control of ethylene-mediated processes in tomato at the level of receptors. J. Exp. Bot., 53, 2057-2063.

220. Knaus U.G., Heyworth P.G., Evans Т., Curnutte J.T. and Bokoch G.M. (1991) Regulation of phagocyte oxygen radical production by the GTP-binding protein Rac 2. Science, 254, 1512-1515.

221. Knight L.I., Rose R.C. and Crocker W. (1910) Effects of various gases and vapors upon etiolated seedlings of the sweet pea. Science, 31, 635-636.

222. Kodama A., Takaishi K., Nakano K., Nishioka H. and Takai Y. (1999) Involvement of Cdc42 small G protein in cell-cell adhesion, migration and morphology of MDCK cells. Oncogene, 18, 3996-4006.

223. Корка J., Pical C., Hetherington A.M. and Muller-Rober B. (1998) Ca2+/phospholipid-binding (C2) domain in multiple plant proteins: novel components of the calcium-sensing apparatus. Plant Mol. Biol., 36, 627-637.

224. Korolkov S.N., Garnovskaya M.N., Basov A.S., Chunaev A.S. and Dumler I.L. (1990) The detection and characterization of G-proteins in the eyespot of Chlamy-domonas reinhardtii. FEBSLett., 270, 132-134.

225. Kost В., Spielhofer P. and Chua N.H. (1998) A GFP-mouse talin fusion protein labels plant actin filaments in vivo and visualizes the actin cytoskeleton in growing pollen tubes. Plant J., 16, 393-401.

226. Kovtun Y., Chiu W.L., Zeng W.K. and Sheen J. (1998) Suppression of auxin signal transduction by а МАРК cascade in higher plants. Nature, 395, 716-720.

227. Kozasa Т., Jiang X.J., Hart M.J., Sternweis P.M., Singer W.D., Gilman A.G., Bollag G. and Sternweis P.C. (1998) pi 15 RhoGEF, a GTPaseactivating protein for Ga 12 and Ga13. Science, 280, 2109-2111.

228. Kozma R., Ahmed S., Best A. and Lim L. (1995) The Ras-related protein Cdc42Hs and bradykinin promote formation of peripheral actin microspikes and filopodia in Swiss 3T3 fibroblasts. Mol Cell Biol, 15, 1942-1952.

229. Kropf D.L., Bisgrove S.R. and Hable W.E. (1998) Cytoskeletal control of polar growth in plant cells. Curr. Opin. Cell Biol, 10, 117-122.

230. Kulaeva O.N., Zagranichnaya Т.К., Brovko F.A., Karavaiko N.N., Selivankina S.Y., Zemlyachenko Y.V., Hall M., Lipkin V.M. and Boziev K.M. (1998) A new family of cytokinin receptors from Cereales. FEBSLett., 423, 239-242.

231. Kumar D. and Klessig D.F. (2000) Differential induction of tobacco MAP kinases by the defense signals nitric oxide, salicylic acid, ethylene, and jasmonic acid. Mol Plant-Microbe Interact., 13, 347-351.

232. Kusnetsov V.V. and Oelmueller R. (1996a) Isolation and characterization of cDNAs encoding the subunit p of heterotrimeric G proteins from N. tabacum (accession No. X98161). Plant Physiol, 111, 948.

233. H., Lin Y.K., Heath R.M., Zhu M.X. and Yang Z.B. (1999) Control of pollen tube tip growth by a Rop GTPase-dependent pathway that leads to tip-localized calcium •influx. Plant Cell, 11, 1731-1742.

234. H., Shen J.J., Zheng Z.L., Lin Y.K. and Yang Z.B. (2001) The Rop GTPase switch controls multiple developmental processes in Arabidopsis. Plant Physiol, 126, 670-684.

235. H., Wu G., Ware D., Davis K.R. and Yang Z.B. (1998) Arabidopsis Rho-related GTPases: differential gene expression in pollen and polar localization in fission yeast. Plant Physiol, 118, 407-417.

236. W.G., Katz S., Gupta R. and Mayer B.J. (1997) Activation of Рак by membrane localization mediated by an SH3 domain from the adaptor protein Nek. Curr. Biol, 1, 85-94.

237. Ma H. (1994) GTP-binding proteins in plants: new member of an old family. Plant Mol Biol, 26, 1611-1636.

238. Ma H., Yanofsky M.F. and Huang H. (1991) Isolation and sequence analysis of TGAJ cDNAs encoding a tomato G protein a subunit. Gene, 107, 189-195.

239. Ма H., Yanofsky M.F. and Meyerowitz E.M. (1990) Molecular cloning and characterization of GPA1, a G protein a subunit gene from Arabidopsis thaliana. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 87, 3821-3825.

240. Ma L., Xu X., Cui S. and Sun D. (1999) The presence of a heterotrimeric G protein and its role in signal transduction of extracellular calmodulin in pollen germination and tube growth. Plant Cell, 11, 1351-1363.

241. Mackay D.J.G. and Hall A. (1998) Rho GTPases. J. Biol Chem., 273, 20685-20688.

242. Maekawa M., Ishizaki Т., Boku S., Watanabe N., Fujita A., Iwamatsu A., Obinata Т., Ohashi K., Mizuno K. and Narumiya S. (1999) Signaling from rho to the ac-tin cytoskeleton through protein kinases ROCK and LIM-kinase. Science, 285, 895-898.

243. Magee A.I., Newman C.M., Giannakouros Т., Hancock J.F., Fawell E. and Armstrong J. (1992) Lipid modifications and function of the ras superfamily of proteins. Biochem. Soc. Trans., 20, 497-499.

244. Malho R. (1998) Role of 1,4,5-inositol triphosphate-induced Ca2+ release in pollen tube orientation. Sex. Plant Reprod., 11, 231-235.

245. Malho R. and Trewavas A.J. (1996) Localized apical increases of cytosolic free calcium control pollen tube orientation. Plant Cell, 8, 1935-1949.

246. Malho R., Read N.D., Trewavas A.J. and Pais M.S. (1995) Calcium channel activity during pollen tube growth and reorientation. Plant Cell, 7, 1173-1184.

247. Manser E., Leung Т., Salihuddin H., Zhao Z.S. and Lim L. (1994) A brain serine/threonine protein kinase activated by Cdc42 and Racl. Nature, 367, 40-46.

248. МАРК Group (Ichimura К et al.) (2002) Mitogen-activated protein kinase cascades in plants: a new nomenclature. Trends Plant Sci., 7, 301-308.

249. Marin-Rodriguez M.C., Orchard J. and Seymour G.B. (2002) Pectate lyases, cell wall degradation and fruit softening. J. Exp. Bot., 53, 2115-2119.

250. Marsh J.F. Ill and Kaufman L.S. (1999) Cloning and characterization of PGA1 and PGA2: two G protein a-subunits from pea that promote growth in the yeast Sac-charomyces cerevisiae. Plant J., 19, 237-247.

251. Marshall C.J. (1994) MAP kinase kinase kinase, MAP kinase kinase, and MAP kinase. Curr. Opin. Genet. Dev., 4, 82-89.

252. Marshall C.J. (1995) Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. Cell, 80, 179-185.

253. Martin C., Bhatt K. and Baumann K. (2001) Shaping in plant cells. Curr. Opin. Cell Biol., 4, 540-549.

254. Martin T.F.J. (1997) Phosphoinositides as spatial regulators of membrane traffic. Curr. Opin. Neurobiol., 7, 331-338.

255. Martinez O. and Goud B. (1998) Rab proteins. Biochim. Biophys. Acta, 1404, 101-112.

256. Martinez О., Antony С., Pehau-Arnaudet G., Berger E.G., Salamero J. and Goud B.1997) GTP-bound forms of rab6 induce the redistribution of Golgi proteins into the endoplasmic reticulum. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 1828-1833.

257. Mason M.G. and Botella J.R. (2000) Completing the heterotrimer: isolation and characterization of an Arabidopsis thaliana G protein y-subunit cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 14784-14788.

258. Mason M.G. and Botella J.R. (2001) Isolation of a novel G-protein у subunit from Arabidopsis thaliana and its interaction with G|3. Biochim. Biophys. Acta, 1520, 147-153.

259. Matsui Y., Kikuchi A., Araki S., Hata Y., Kondo J., Teranishi Y. and Takai Y.1990) Molecular cloning and characterization of a novel type of regulatory protein (GDI) for smg p25A, a ras p21-like GTP-binding protein. Mol. Cell. Biol., 10, 4116-4122.

260. Mayo M.W., Wang C.Y., Cogswell P.C., Rogers-Graham K.S., Lowe S.W., Der C.J. and Baldwin A.S. (1997) Requirement of NF-кВ activation to suppress p53-independent apoptosis induced by oncogenic Ras. Science, 278, 1812-1815.

261. Mazur P. and Baginsky W. (1996) In vitro activity of 1,3-p-D-glucan synthase requires the GTP-binding protein Rhol. J. Biol. Chem., 271, 14604-14609.

262. McCormick F. and Wittinghofer A. (1996) Interactions between Ras proteins and their effectors. Curr. Opin. Biotechnol., 7, 449-456.

263. McElver J., Patton D., Rumbaugh M., Liu C., Yang L.J. and Meinke D. (2000) The TITAN5 gene of Arabidopsis encodes a protein related to the ADP ribosylation factor family of GTP binding proteins. Plant Cell, 12, 1379-1392.

264. Mehdy M.C., Sharma Y.K., Sathasivan K. and Bays N.W. (1996) The role of activated oxygen species in plant disease resistance. Physiol. Plant., 98, 365-374.

265. Melan?on P., Glick B.S., Malhotra V., Weidman P.J., Serafini Т., Gleason M.L., Orci L. and Rothman J.E. (1987) Involvement of GTP-binding G proteins in transport through the Golgi stack. Cell, 51, 1053-1062.

266. Mellman I. and Warren G. (2000) The road taken: past and future foundations of membrane traffic. Cell, 100, 99-112.

267. Meloche S., Seuwen K., Pagds G. and Pouyssegur J. (1992) Biphasic and synergistic activation of p44mapk (ERK1) by growth factors: correlation between late phase activation and mitogenicity. Mol Endocrinol, 6, 845-854.

268. Merke Т., Haizel Т., Matsumoto Т., Harter K., Dallmann G. and Nagy F. (1996) Phenotype of the fission yeast cell cycle regulatory mutant piml-46 is suppressed by a tobacco cDNA encoding a small, Ran-like GTP-binding protein. Plant J., 6, 555-565.

269. Milburn M.V., Tong L., Devos A.M., Brunger A., Yamaizumi Z., Nishimura S. and Kim S.H. (1990) Molecular switch for signal transduction: structural differences between active and inactive forms of protooncogenic ras proteins. Science, 247, 939-945.

270. Milligan G. (1988) Techniques used in the identification and analysis of function of periltussis toxin-sensitive guanine-nucleotide binding-proteins. Biochem. J., 255, 1-13.

271. Millner P.A. (1987) Are guanine nucleotide-binding proteins involved in regulation of thylakoid protein kinase activity? FEBSLett., 226, 155-160.

272. Millner P.A. and Robinson P.S. (1989) ADP-ribosylation of thylakoid membrane polypeptides by cholera toxin is correlated with inhibition of thylakoid GTPase activity and protein phosphorylation. Cell. Signal., 1, 421-433.

273. Millner P.A., Groarke D.A. and White I.R. (1996) Synthetic peptides as probes of plant cell signaling: G-proteins and the auxin signalling pathway. Plant Growth Regul., 18, 143-147.

274. MinkoffR., Bales E.S., Kerr C.A. and Struss W.E. (1999) Antisense oligonucleotide blockade of connexin expression during embryonic bone formation: evidence of functional compensation within a multigene family. Devel. Genet., 24, 43-56.

275. Mira J.-P., Benard V., Groffen J., Sanders L.C. and Knaus U.G. (2000) Endogenous, hyperactive Rac3 controls proliferation of breast cancer cells by a p21-activated kinase-dependent pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 185-189.

276. Miura Y., Kikuchi A., Musha Т., Kuroda S., Yaku H., Sasaki T. and Takai Y. (1993) Regulation of morphology by rho p21 and its inhibitory GDP/GTP exchange protein (rho GDI) in Swiss 3T3 cells. J. Biol. Chem., 268, 510-515.

277. Mockaitis K. and Howel S.H. (2000) Auxin induces mitogenic activated protein kinase (МАРК) activation in roots of Arabidopsis seedlings. Plant J., 24, 785-796.

278. Molendijk A.J., Bischoff F., Rajendrakumar C.S.V., Friml J., Braun M., Gilroy S. and Palme K. (2001) Arabidopsis thaliana Rop GTPases are localized to tips of root hairs and control polar growth. EMBO J., 20, 2779-2788.

279. Moodie S.A. and Wolfman A. (1994) The 3Rs of life: Ras, Raf and growth regulation. Trends Genet., 10, 44-48.

280. Moore I., Diefenthal Т., Zarsky V., Schell J. and Palme K. (1997) A homolog of the mammalian GTPase Rab2 is present in Arabidopsis and is expressed predominantly in pollen grains and seedlings. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 762-767.

281. Morre D.J. and Andersson B. (1994) Isolation of all major organelles and membranous cell components from a single homogenate of green leaves. Method. Enzymol., 228,412-419.

282. Morris A.J. and Malbon C.C. (1999) Physiological regulation of G protein-linked signaling. Physiol. Rev., 79, 1373-1430.

283. Moshkov I.E., Mur L.A.J., Novikova G.V., Smith A.R. and Hall M.A. (2003) Ethylene regulates monomelic GTP-binding protein gene expression and activity in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol., 131, 1705-1717.

284. Morrison D.K. and Cutler R.E., Jr. (1997) The complexity of Raf-1 regulation. Curr. Opin. Cell Biol., 9, 174-17.

285. Moss J. and Vaughan M. (1995) Structure and function of ARF proteins: activators of cholera toxin and critical components of intracellular vesicular transport processes. J. Biol. Chem., 270, 12327-12330.

286. Mount S.M. and Chang C. (2002) Evidence for a plastid origin of plant ethylene receptor genes. Plant Physiol., 130, 10-14.

287. Moutinho A., Trewavas A.J. and Malho R. (1998) Relocation of a Ca2+-dependent protein kinase activity during pollen tube reorientation. Plant Cell, 10, 1499-1509.

288. Mfiller-Dieckmann H.-J., Grantz A. A. and Kim S.-H. (1999) The structure of the signal receiver domain of the Arabidopsis thaliana ethylene receptor ETR1. Structure, 7, 1547-1556.

289. Mulligan G.J., Wong J. and Jacks T. (1998) pi30 is dispensable in peripheral T lymphocytes: evidence for functional compensation by pi07 and pRB. Mol. Cell. Biol., 18, 206-220.

290. Mumby S.M. (2000) G proteins I: Gs and Gj. In: GTPases, Hall A. (ed.), Oxford: Oxford University Press, pp. 1-34.

291. Mumby S.M., Kahn R.A., Manning D.R. and Gilman A.G. (1986) Antisera of designed specificity for subunits of guanine nucleotide-binding regulatory proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 265-269.

292. Munnik Т., Arisz S.A., de Vrije R. and Musgrave A. (1995) G protein activation stimulates phospholipase D signaling in plants. Plant Cell, 7, 2197-2210.

293. Muschietti J.P., Martinetto H.E., Coso O.A., Farber M.D., Torres H.N. and Flawia M.M. (1993) G-proteins from Medicago sativa: functional association to photoreceptors. Biochemical J., 291, 383-388.

294. Nebenfuhr A. and Staehelin L.A. (2001) Mobile factories: Golgi dynamics in plant cells. Trends Plant Sci., 6, 160-167.

295. Neer E.J. (1994) G proteins: critical control points for transmembrane signals. Protein Sci., 3, 3-14.

296. Neer E.J. (1995) Heterotrimeric G proteins: organizers of transmembrane signals. Cell, 80, 249-257.

297. Neljubow D. (1901) Uber die horizontale Nutation der Stengel von Pisum sativum und einiger anderer Pflanzen. Beih. Bot. Zentralle, 10, 128-139.

298. Nern A. and Arkowitz R.A. (2000) G proteins mediate changes in cell shape by stabilizing the axis of polarity. Moll. Cell, 5, 853-864.

299. Neuhaus G., Bowler C., Kern R. and Chua N.-H. (1993) Calcium/calmodulin-dependent and -independent phytochrome signal transduction pathways. Cell, 73, 937-952.

300. Nimnual A.S., Yatsula B.A. and Bar-Sag! D. (1998) Coupling of Ras and Racguanosine triphosphatases through the Ras exchanger Sos. Science, 279, 560-563.

301. Niwa R., Nagata-Ohashi K., Takeichi M., Mizuno K. and Uemura T. (2002) Control of actin reorganization by Slingshot, a family of phosphatases that dephosphory-late ADF/cofilin. Cell, 108, 233-246.

302. Nobes C.D. and Hall A. (1995) Rho, rac, and cdc42 GTPases regulate the assembly of multimolecular focal complexes associated with actin stress fibers, lamellipodia, and filopodia. Cell, 81, 53-62.

303. Novick P. and Zerial M. (1997) The diversity of Rab proteins in vesicle transport. Curr. Opin. Cell Biol, 9, 496-504.

304. Novikova G.V., Moshkov I.E., Smith A.R. and Hall M.A. (2000) The effect of ethylene on MAPKinase-like activity in Arabidopsis thaliana. FEBS Lett., 474, 29-32.

305. Novikova G.V., Moshkov I.E., Smith A.R., Kulaeva O.N. and Hall M.A. (1999) The effect of ethylene and cytokinin on guanosine 5'-triphosphate binding and protein phosphorylation in leaves of Arabidopsis thaliana. Planta, 208, 239-246.

306. Nuoffer C. and Balch W.E. (1994) GTPases: multifunctional molecular switches regulating vesicular traffic. Annu. Rev. Biochem., 63, 949-990.

307. O'Farrell P.H. (1975) High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol Chem., 250, 4007-4021.

308. Offermanns S. (2000) Mammalian G-protein function in vivo: new insights through altered gene expression. Rev. Physiol Biochem. Pharmacol, 140, 63-133.

309. Olkkonen V.M. and Stenmark H. (1997) Role of Rab GTPases in membrane traffic. Int. Rev. Cytol., 176, 1-85.

310. Olson M.F., Paterson H.F. and Marshall C.J. (1998) Signals from Ras and Rho GTPases interact to regulate expression ofp21Wafl/Cipl. Nature, 401,295-299.

311. Ono E., Wong H.L., Kawasaki Т., Hasegawa M., Kodama O. and Shimamoto K.2001) Essential role of the small GTPase Rac in disease resistance of rice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 759-764.

312. Ortiz D., Medkova M., Walch-Solimena C. and Novick P. (2002) Ypt32 recruits the Sec4p guanine nucleotide exchange factor, Sec2p, to secretory vesicles: evidence for a Rab cascade in yeast. J. Cell Biol., 157, 1005-1015.

313. Ostin A., Kovalyczk M., Bhalerao R.P. and Sandberg G. (1998) Metabolism of in-dole-3-acetic acid in Arabidopsis. Plant Physiol, 118, 285-296.

314. Ouaked F., Rozhon W., Lecourieux D. and Hirt H. (2003) А МАРК pathway mediates ethylene signaling in plants. EMBOJ.,22, 1282-1288.Ф

315. Ozes O.N., Mayo L.D., Gustin J.A., Pfeffer S.R., Pfeffer L.M. and Donner D.B.1999) NF-кВ activation by tumour necrosis factor requires the Akt serine-threonine kinase. Nature, 401, 82-85.

316. Pai E.F., Kabsch W., Krengel U., Holmes K.C., John J. and Wittinghofer A. (1989) Structure of the guanine-nucleotide-binding domain of the Ha-ras oncogene product p21 in the triphosphate conformation. Nature, 341, 209-214.

317. Palme K., Diefenthal Т., Vingron M., Sander C. and Schell J. (1992) Molecular cloning and structural analysis of genes from Zea mays (L.) coding for members of the Ras-related ypt gene family. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 89, 787-791.

318. Paris N., Stanley C.M., Jones R.L. and Rogers J.C. (1996) Plant cells contain two functionally distinct vacuolar compartments. Cell, 85, 563-572.

319. Park J., Choi H.T., Lee S., Lee Т., Yang Z.B. and Lee Y. (2000) Rac-related GTP-binding protein in elicitor-induced reactive oxygen generation by suspension-cultured soybean cells. Plant Physiol., 124, 725-732.

320. Parkinson J.S. (1993) Signal-transduction schemes of bacteria. Cell, 73, 857-871.

321. Parkinson J.S. and Kofoid E.C. (1992) Communication modules in bacterial signalling proteins. Annu. Rev. Genet., 26, 71-112.

322. Pei Z.M., Ghassemian M., Kwak C.M., McCourt P. and Schroeder J.I. (1998) Role of farnesyltransferase in ABA regulation of guard cell anion channels and plant water loss. Science, 282, 287-290.

323. Pelham H.R.B. (2002) Insights from yeast endosomes. Curr. Opin. Cell Biol., 14, 454462.

324. Pennington S.R. (1994) GTP-binding proteins: heterotrimeric G proteins. Protein Profile, 1, 169-234.

325. Peranen J., Auvinen P., Virta H., Wepf R. and Simons K. (1996) Rab8 promotes polarized membrane transport through reorganization of actin and microtubules in fibroblasts. J. Cell Biol., 135, 153-167.

326. Perdue D.O. and Lomax T.L. (1992) Characterization of GTP binding and hydrolysis in plasma membranes of zucchini. Plant Physiol. Biochem., 30, 163-172.

327. Pereira-Liel J.B. and Seabra M.C. (2000) The mammalian Rab family of small GTPases: definition of family and subfamily sequence motifs suggests a mechanism for functional specificity in the Ras superfamily. J. Mol. Biol., 301, 10771087.

328. Pereira-Liel J.B. and Seabra M.C. (2001) Evolution of the Rab family of small GTP-binding proteins. J. Mol. Biol., 313, 889-901.

329. Perroud P.F., Diogon Т., Crevecoeur M. and Greppin H. (2000) Molecular cloning, spatial and temporal characterization of spinach SOGA1 cDNA, encoding an a subunit of G protein. Gene, 248, 191-201.

330. Persson В. and Argos P. (1994) Prediction of transmembrane segments in proteins utilizing multiple sequence alignments. J. Mol. Biol., 237, 182-192.

331. Porfiri E. and McCormick F. (1996) Regulation of epidermal growth factor receptor signaling by phosphorylation of the Ras exchange factor hSOSl. J. Biol. Chem., 271,5871-5877.

332. Posas F., Wurgler-Murphy S.M., Maeda Т., Witten E.A., Thai T.C. and Saito H.1996) Yeast HOG1 MAP kinase cascade is regulated by a multistep phosphorelay mechanism in the SLN1-YPD-SSK1 "two component" osmosensor. Cell, 86, 865875.

333. Potikha T.S., Collins C.C., Johnson D.I., Delmer D.P. and Levine A. (1999) The involvement of hydrogen peroxide in the differentiation of secondary walls in cotton fibers. Plant Physiol., 119, 849-858.

334. Poulsen C., Mai X.M. and Borg S. (1994) A Lotus japonicus cDNA encoding an a sub-unit of a heterotrimeric G-protein. Plant Physiol., 105, 1453-1454.

335. Price A., Seals D., Wickner W. and Ungermann C. (2000) The docking stage of yeast vacuole fusion requires the transfer of proteins from a cis-SNARE complex to a Rab/Ypt protein. J. Cell Biol., 148, 1231-1238.

336. Qadota H., Python C.P., Inoue S.B., Arisawa M., Anraku Y., Zheng Y., Watanabe Т., Levin D.E. and Ohya Y. (1996) Identification of yeast Rholp GTPase as a regulatory subunit of 1,3-P-glucan synthase. Science, 272, 279-281.

337. Qiu R.G., Abo A., McCormick F. and Symons M. (1997) Cdc42 regulates anchorage-independent growth and is necessary for Ras transformation. Mol. Cell. Biol., 17, 3449-3458.

338. Qiu R.G., Chen J., Kirn D., McCormick F. and Symons M. (1995a) An essential role for Rac in Ras transformation. Nature, 374, 457-459.

339. Qiu R.G., Chen J., McCormick F. and Symons M. (1995b) A role for Rho in Ras transformation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 11781-11785.

340. Quilliam L.A., Khosravi-Far R., Huff S.Y. and Der C.J. (1995) Guanine nucleotide exchange factors: activators of the Ras superfamily of proteins. BioEssays, 17, 395-404.

341. Reddy M.M., Sun D. and Quinton P.M. (2001) Apical heterotrimeric G-proteins activate CFTR in the native sweat duct. J. Membr. Biol., 179, 51-61.

342. Regad F., Bardet C., Tremousaygue D., Moisan A., Lescure B. and Axelos M. (1993) cDNA cloning and expression of an Arabidopsis GTP-binding protein of the ARF family. FEBSLett, 316, 133-136.

343. Ren X.D., Bokoch G.M., Traynor-Kaplan A., Jenkins G.H., Anderson R.A. and Schwartz M.A. (1996) Physical association of the small GTPase Rho with a 68-kDa phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase in Swiss 3T3 cells. Mol. Biol. Cell, 7,435-442.

344. Reuther G.W. and Der C.J. (2000) The Ras branch of small GTPases: Ras family members don't fall far from the tree. Curr. Opin. Cell Biol., 12, 157-165.

345. Ridley A.J. and Hall A. (1992) The small GTP-binding protein rho regulates the assembly of focal adhesions and actin stress fibers in response to growth factors. Cell, 70, 389-399.

346. Ridley A.J., Paterson H.F., Johnston C.L., Diekmann D. and Hall A. (1992) The small GTP-binding protein rac regulates growth factor-induced membrane ruffling. Cell, 70,401-410.

347. Ritchie S. and Gilroy S. (2000) Abscisic acid stimulation of phospholipase D in the barley aleurone is G-protein-mediated and localized to the plasma membrane. Plant Physiol., 124, 693-702.

348. Robinson D.G., Rogers J.C. and Hinz G. (2000) Post-Golgi, pre-vacuolar compartments. Annu.Plant Rev., 5, 270-298.

349. Rodman J.S. and Wandinger-Ness A. (2000) Rab GTPases coordinate endocytosis: commentary. J. Cell Sci., 113, 183-192.

350. Rodriguez F.I., Esch J.J., Hall A.E., Binder B.M., Schaller G.E. and Bleecker A.B.1999) A copper cofactor for the ethylene receptor ETR1 from Arabidopsis. Science, 283, 996-998.

351. Rodriguez-Concepcion M., Yalovsky S. and Gruissem W. (1999) Protein prenylation in plants: old friends and new targets. Plant Mol. Biol., 39, 865-870.

352. Roman G., Lubarsky В., Kieber J.J., Rothenberg M. and Ecker J.R. (1995) Genetic analysis of ethylene signal transduction in Arabidopsis thaliana: five novel mutant loci integrated into a stress response pathway. Genetics, 139, 1393-1409.

353. Romashkova J. A. and Makarov S.S. (1999) NF-кВ is a target of АКТ in anti-apoptotic PDGF signaling. Nature, 401, 86-90.

354. Romero L.C., Sommer D., Gotor C. and Song P.S. (1991) G-proteins in etiolated Avena seedlings. Possible phytochrome regulation. FEBSLett., 282, 341-346.

355. Rommel C. and Hafen E. (1998) Ras: a versatile cellular switch. Curr. Opin. Genet. Dev., 8, 412-418.

356. Rothman J.E. (1994) Mechanism of intracellular protein transport. Nature, 372, 55-63.

357. Rothman J.E. and Wieland F.T. (1996) Protein sorting by transport vesicles. Science, 272, 227-234.

358. Rutherford S. and Moore I. (2002) The Arabidopsis Rab GTPase family: another enigma variation. Curr. Opin. Plant Biol, 5, 518-528.

359. Saalbach G., Natura В., Lein W., Buschmann P., Dahse I., Rohrbeck M. and Nagy F. (1999) The a-subunit of a heterotrimeric G-protein from tobacco, NtGPal, functions in K+ channel regulation in mesophyll cells. J. Exp. Bot., 50, 53-61.

360. Sagi M. and Fluhr R. (2001) Superoxide production by plant homologues of the gp9.phox NADPH oxidase Modulation of activity by calcium and by tobacco mosaic virus. Plant Physiol, 126, 1281-1290.

361. Sahai E., Olson M.F. and Marshall C.J. (2001) Cross-talk between Ras and Rho signalling pathways in transformation favours proliferation and increased motility. EMBOJ., 20, 755-766.

362. Sakai H., Hua J., Chen Q.G., Chang C., Medrano L.J., Bleecker A.B. and Meyerowitz E.M. (1998) ETR2 is an ETRl-Wke gene involved in ethylene signalling in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 5812-5817.

363. Salminen A. and Novick P.J. (1987) A Ras-like protein is required for a post-Golgi event in yeast secretion. Cell, 49, 527-538.

364. Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T. (1989) Molecular Cloning, Noland C. (ed.), Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

365. Sanders I.O., Harpham N.V.J., Raskin I., Smith A.R. and Hall M.A. (1991a) Ethylene binding in wild-type and mutant Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Ann. Bot., 68, 97-103.

366. Sanders I.O., Ishizawa K., Smith A.R. and Hall M.A. (1990) Ethylene binding and action in rice seedlings. Plant Cell Physiol., 31, 1091-1099.

367. Sanders I.O., Smith A.R. and Hall M.A. (1989) The measurement of ethylene binding and metabolism in plant tissue. Planta, 179, 97-103.

368. Sanders I.O., Smith A.R. and Hall M.A. (1991b) Ethylene binding in Pisum sativum L. cv. Alaska. Planta, 183,209-217.

369. Santagata S., Boggon T.J., Baird C.L., Gomez C.A., Zhao J., Shan W.S., Myszka D.G. and Shapiro L. (2001) G-protein signaling through tubby proteins. Science, 292, 2041-2050.

370. Sato-Nara K., Yuhashi K., Higashi K., Hosoya K., Kubota M. and Ezura H. (1999) Stage- and tissue-specific expression of ethylene receptor homolog genes during fruit development in muskmelon. Plant Physiol., 120, 321-329.

371. Scatchard G. (1949) The attraction of proteins for small molecules and ions. Ann. N. Y. Acad. Sci., 51,660-672.

372. Schaller G.E. and Bleecker A.B. (1995) Ethylene binding sites generated in yeast expressing the Arabidopsis ETRl gene. Science, 270, 1809-1811.

373. Schaller G.E. and Kieber J.J. (2002) Ethylene. In: The Arabidopsis Book, Somerville C.R. and Meyerowitz E.M. (eds.), American Society of Plant Biologists, Rock-ville, MD, doi/10.1199/tab.0071, http://www.aspb.org/publications/arabidopsis/

374. Schaller G.E., Ladd A.N., Lanahan M.B., Spanbauer J.M. and Bleecker A.B. (1995) The ethylene response mediator ETRl from Arabidopsis forms a disulfide-linked dimer. J. Biol. Chem., 270, 12526-12530.

375. Scherer G.F. (1994) Phospholipid signaling by phospholipase A2 in plants: the role of mastoparan and lysophospholipids as weak "auxin-like" agonists. Soc. Exp. Biol. Symp., 48, 229-242.

376. Scherer G.F. and Andre B. (1989) A rapid response to a plant hormone: auxin stimulates phospholipase A2 in vivo and in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun., 163, 111-117.

377. Scherer G.F.E. (1992) Stimulation of growth and phospholipase A2 by the peptides mastoparan and melittin and by the auxin 2,4-dichlorophenoxyacetic acid. Plant Growth Regul., 11, 153-157.

378. Scherer G.F.E. and Andre B. (1993) Stimulation of phospholipase A2 by auxin in microsomes from suspension-cultured soybean cells is receptor-mediated and influenced by nucleotides. Planta, 191, 515-523.

379. Scheres B. and Heidstra R. (1999) Digging out roots: pattern formation, cell division, and morphogenesis in plants. Curr. Top. Dev. Biol., 45, 207-247.

380. Schimmoller F., Simon I. and Pfeffer S.R. (1998) Rab GTPases, directors of vesicle docking. J. Biol. Chem., 213, 22161-22164.

381. Schmidt A. and Hall M.N. (1998) Signaling to the actin cytoskeleton. Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 14, 305-338.

382. Schroeder J.I. and Hagiwara S. (1989) Cytosolic calcium regulates ion channels in the plasma membrane of Vicia faba guard cells. Nature, 410, 327-330.

383. Schultheiss H., Dechert C., Kogel K.H. and Huckelhoven R. (2002) A small GTP-binding host protein is required for entry of powdery mildew fungus into epidermal cells of barley. Plant Physiol, 128, 1447-1454.

384. Schumacher K., Vafeados D., McCarthy M., Sze H., Wilkins T. and Chory J. (1999) The Arabidopsis det3 mutant reveals a central role for the vacuolar fT-ATPase in plant growth and development. Genes Dev., 13, 3259-3270.

385. Scita G., Nordstrom J., Carbone R., Tenca P., Giardina G., Gutkind S., Bjarnegard M., Betsholtz C. and Di Fiore P.P. (1999) EPS8 and E3B1 transduce signals from Ras to Rac. Nature, 401, 290-293.

386. Seack J., Kruse M. and Muller W.E. (1998) Evolutionary analysis of G-proteins in early metazoans: cloning of a and P subunits from the sponge Geodia cydonium. Biochim. Biophys. Acta, 141, 93-103.

387. Seek! M.J., Morri N., Narumiya S. and Rozengurt E. (1995) Guanosine 5'-3-o-(thio)triphosphate stimulates tyrosine phosphorylation of pl25FAK and paxillin in permeabilized Swiss 3T3 cells. J. Biol Chem., 270, 6984-6990.

388. Segal A.W. and Abo A. (1993) The biochemical basis of the NADPH oxidase of phagocytes. Trends Biochem. Sci., 18,43-47.

389. Segev N. (2001) Ypt and Rab GTPases: insight into functions through novel interactions. Curr. Opin. Cell Biol., 13, 500-511.

390. Sells M.A. and ChernofF J. (1997) Emerging from the РАК: the p21-activated protein kinase family. Trends Cell Biol., 7, 62-167,

391. Seo H., Choi C.H., Lee S.-Y., Cho M.-J. and Bahk J.-D. (1997) Biochemical characteristics of a rice (Oryza sativa L. IR-36) G-protein a-subunit expressed in Escherichia coli. Biochem. J., 324, 273-281.

392. Seo H.-S., Kim H.-Y., Jeong J.-Y., Lee S.-Y., Cho M.-J. and Bahk J.-D. (1995) Molecular cloning and characterization of RGA1 encoding a G protein a subunit from rice {Oryza sativa L. IR-36). Plant Mol. Biol., 27,1119-1131.

393. Settleman J., Albright С.Г., Foster L.C. and Weinberg R.A. (1992a) Association between GTPase activators for Rho and Ras families. Nature, 359, 153-154.

394. Settleman J., Narasimhan V., Foster L.C. and Weinberg R.A. (1992b) Molecular cloning of cDNAs encoding the GAP-associated protein pl90: implications for a signaling pathway from ras to the nucleus. Cell, 69, 539-549.

395. Seuwen K. and Pouyssgur J. (1992) G protein controlled signal transduction pathways and the regulation of cell proliferation. Adv. Cancer Res., 58, 75-94.

396. Seymour G.B., Manning K., Eriksson E.M., Popovich A.H. and King G.J. (2002) Genetic identification and genomic organization of factors affecting fruit texture. J. Exp. Bot., 53, 2065-2071.

397. Shields J.M., Pruitt K., McFall A., Shaub A. and Der C.J. (2000) Understanding Ras: 'it ain't over 'til it's over'. Trends Cell Biol, 10, 147-154.

398. Shih T.Y., Williams D.R., Weeks M.O., Maryak J.M., Vass W.C. and Scolnick E.M. (1978) Comparison of the genomic organization of Kirsten and Harvey sarcoma viruses. J. Virol, 17,45-55.

399. Shimizu К., Goldfarb M., Perucho M. and Wigler M. (1983) Isolation and preliminary characterization of the transforming gene of a human neuroblastoma cell line. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 383-387.

400. Short В., Preisinger C., Korner R., Kopajtich R., Byron O. and Barr F.A. (2001) A GRASP55-rab2 effector complex linking Golgi structure to membrane traffic. J. Cell Biol, 155, 877-883.

401. Simon M.I., Strathmann M.P. and Gautam N. (1991) Diversity of G-proteins in signal transduction. Science, 252, 802-808.

402. Singer W.D., Brown H.A. and Sternweis P.C. (1997) Regulation of eukaryotic phos-phatidylinositol-specific phospholipase С and phospholipase D. Annu. Rev. Biochem., 66, 475-509.

403. Singer-Kriiger В., Stenmark H. and Zerial M. (1995) Yeast Ypt51p and mammalian Rab5 counterparts with similar function in the early endocytic pathway. J. Cell Sci., 108, 3509-3521.

404. Sisler E.C. (1979) Measurement of ethylene binding in plant tissue. Plant Physiol, 64, 538-542.

405. Sisler E.C. (1980) Partial purification of an ethylene-binding component from plant tissue. Plant Physiol, 66, 404-406.

406. Sisler E.C. (1982a) Ethylene binding properties of a Triton X-100 extract of mung bean sprouts. J. Plant Growth Regul., 1, 211-218.

407. Sisler E.C. (1982b) Ethylene binding in normal, rin, and nor mutant tomatoes. J. Plant Growth. Regul, 1, 219-225.

408. Sisler E.C. (1984) Distribution and properties of ethylene-binding component from plant tissue. In: Ethylene: Biochemical, Physiological and Applied Aspects, Fuchs Y. and Chalutz E. (eds.), The Hague: Martinus Nijhoff/Dr. W. Junk, pp. 45-54.

409. Sisler E.C. (1991) Ethylene-binding components in plants. In: The Plant Hormone Ethylene, Mattoo A.K., Suttle J.C. (eds.), Boca Raton: CRC Press, pp. 81-99.

410. Sisler E.C. and Wood C. (1987) Ethylene binding and evidence that binding in vivo and in vitro is to physiological receptor. In: Plant Hormone Receptors, Klambt D. (ed.), Berlin: Springer-Verlag, pp. 239-248.

411. Sisler E.C. and Wood C. (1988) Competition of unsaturated compounds with ethylene for binding and action in plants. Plant Growth Regul., 7, 181-191.

412. Sisler E.C. and Wylie P. A. (1978) In vivo measurement of binding to the ethylene binding site. Plant Physiol., 61, S-131.

413. Sisler E.C., Dupille E. and Serek M. (1996) Effect of 1-methylcyclopropene and me-thylenecyclopropane on ethylene binding and ethylene action on cut carnations. Plant Growth Regul., 18, 79-86.

414. Sisler E.C., Reid M.S. and Fujino D.W. (1983) Investigation of the mode of action of ethylene in carnation senescence. Acta Hort., 141, 229-234.

415. Sisler E.C., Reid M.S. and Yang S.F. (1986) Effect of antagonists of ethylene action on binding of ethylene in cut carnations. Plant Growth Regul., 4, 213-218.

416. Smalle J. and Van Der Straeten D. (1997) Ethylene and vegetative development. Physiol. Plant., 100, 539-605.

417. Smalle J., Haegman M., Kurepa J., Van Montagu M. and Van Der Straeten D. (1997) Ethylene can stimulate Arabidopsis hypocotyl elongation in the light. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 2756-2761.

418. Smith A.R., Robertson D., Sanders I.O., Williams R.A.N. and Hall M.A. (1987) Ethylene binding sites. In: Plant Hormone Receptors, KlSmbt D. (ed.), Berlin: Springer-Verlag, pp. 229-238.

419. Solano R., Stepanova A., Chao Q. and Ecker J.R. (1998) Nuclear events in ethylene signalling: a transduction cascade mediated by ETHYLENE INSENSITIVE3 and ETHYLENE RESPONSE FACTOR 1. Genes Dev., 12, 3703-3714.

420. Somers D.A., Nourse J.P., Manners J.M., Abrahams S. and Watson J.M. (1995) A gene encoding a cinnamyl alcohol dehydrogenase homolog in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol, 108, 1309-1310.

421. Sontag E., Fedorov S., Kamibayashi C., Robbins D., Cobb M. and Mumby M. (1993) The interaction of SV40 small tumor antigen with protein phosphatase 2A stimulates the MAP kinase pathway and induces cell proliferation. Cell, IS, 887897.

422. Sprang S.R. (1997) G protein mechanisms: insights from structural analysis. Annu. Rev. Biochem., 66, 639-678.

423. Steinmann Т., Geldner N., Grebe M., Mangold S., Jackson C.L., Paris S., Gaiweiler L., Palme K. and JOrgens G. (1999) Coordinated polar localization of auxin efflux carrier PIN1 by GNOM ARF GEF. Science, 286, 316-318.

424. Stenmark H. and Olkkone V.M. (2001) The Rab GTPase family. Genome Biol, 2, 3007.1-3007.7.

425. Storrie В., Pepperkok R. and Nilsson T. (2000) Breaking the COPI monopoly on Golgi recycling. Trends Cell Biol, 10, 385-391.

426. Sudhof T.C. (1995) The synaptic vesicle cycle: a cascade of protein-protein interactions. Nature, 375, 645-653.

427. Sumi Т., Matsumoto K., Takai Y. and Nakamura T. (1999) Cofilin phosphorylation and actin cytoskeletal dynamics regulated by Rho- and Cdc42-activated LIM-kinase 2. J. Cell Biol, 147,1519-1532.

428. Sussman M.R. and Firn R.D. (1976) The synthesis of a radioactive cytokinin with high specific activity. Phytochem., 15, 153-155.

429. Swanson R.V., Alex L.A. and Simon M.I. (1994) Histidine and aspartate phosphorylation: two-component systems and the limits of homology. Trends Biochem. Sci., 19,485-490.

430. Swarup R., Friml J., Marchant A., Ljung K., Sandberg G., Palme K. and Bennett

431. M. (2001) Localization of the auxin permease AUX1 suggests two functionally distinct hormone transport pathways operate in the Arabidopsis root apex. Genes Dev., 15, 2648-2653.

432. Symons M., Derry J.M.J., Karlak В., Jiang S., Lemahieu V., McCormick F., Francke U. and Abo A. (1996) Wiskott-Aldrich syndrome protein, a novel effector for the GTPase Cdc42Hs, is implicated in actin polymerization. Cell, 84, 723734.

433. Takai Y., Kaibuchi K., Kikuchi A. and Kawata M. (1992) Small GTP-binding proteins./и*. Rev. Cytol., 133, 187-230.

434. Takai Y., Sasaki T. and Matozaki T. (2001) Small GTP-binding proteins. Physiol. Rev., 81, 153-208.

435. Takai Y., Sasaki Т., Shirataki H. and Nakanishi H. (1996) Rab3A small GTP-binding protein in Ca -dependent exocytosis. Genes Cells, 1, 615-632.

436. Takai Y., Sasaki Т., Tanaka K. and Nakanishi H. (1995) Rho as a regulator of the cy-toskeleton. Trends Biochem. Sci., 20, 227-231.

437. Tao L.Z., Cheung A.Y. and Wu H.M. (2002) Plant Rac-like GTPases are activated by auxin and mediate auxin-responsive gene expression. Plant Cell, 14, 2745-2760.

438. Terryn N., Vanmontagu M. and Inze D. (1993) GTP-binding proteins in plants. Plant Mol. Biol., 22,143-152.

439. The Arabidopsis Genome Initiative (2000) Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature, 408, 796-815.

440. Thiel G., Blatt M.R., Fricker M.D., White I.R. and Millner P.A. (1993) Modulation of K+ channels in Vicia guard cells by peptide homologies to the auxin-binding protein С terminus. Proc. Natl. acad. Sci. USA, 90, 11493-11497.

441. Thomas C.J.R., Smith A.R. and Hall M.A. (1984) The effect of solubilization on the character of an ethylene-binding site from Phaseolus vulgaris L. cotyledons. Planta, 160, 474-479.

442. Thomas C.J.R., Smith A.R. and Hall M.A. (1985) Partial purification of an ethylene-binding site from Phaseolus vulgaris L. cotyledons. Planta, 164, 212-211.

443. Thompson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F. and Higgins D.G. (1997) The ClustalX Windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res., 24, 4876-4882.

444. Tieman D. and Klee H. (1999) Differential expression of two novel members of the tomato ethylene-receptor family. Plant Physiol, 120, 165-172.

445. Tieman D.M., Taylor M.G., Ciardi J.A. and Klee H.J. (2000) The tomato ethylene receptors NR and LeETR4 are negative regulators of ethylene response and exhibit functional compensation with a multigene family. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 97, 5663-5668.

446. Tocque В., Delumeau I., Parker F., Maurier F., Multon M.C. and Schweighoffer F.1997) Ras-GTPase activating protein (GAP): a putative effector for Ras. Cell Signal, 9, 153-158.

447. Toker A. (1998) The synthesis and cellular roles of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate. Curr. Opin. Cell Biol, 10, 254-261.

448. Torres M.A., Onouchi H., Hamada S., Machida C., Hammond-Kosack K.E. and Jones J.D.G. (1998) Six Arabidopsis thaliana homologues of the human respiratory burst oxidase (gp91phox). Plant J., 14, 365-370.

449. Towbin H., Staehelin T. and Gordon J. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 76,4350-4354.

450. Trotochaud A.E., Нао Т., Wu G., Yang Z.B. and Clark S.E. (1999) The CLAVATA1 receptor-like kinase requires CLAVATA3 for its assembly into a signaling complex that includes KAPP and a Rho-related protein. Plant Cell, 11, 393-405.

451. Trotochaud A.E., Jeong S. and Clark S.E. (2000) CLAVATA3, a multimeric ligand for the CLAVATA1 receptor-kinase. Science, 289, 613-617.

452. Ueda Т., Matsuda N., Uchimiya H. and Nakano A. (2000) Modes of interaction between the Arabidopsis Rab protein, Ara4, and its putative regulator molecules revealed by a yeast expression system. Plant J., 21, 341-349.

453. Ueda Т., Yamaguchi M., Uchimiya H. and Nakano A. (2001) Агаб, a plant-unique novel type Rab GTPase, functions in the endocytic pathway of Arabidopsis thaliana. EMBO J., 20, 4730-4741.

454. Ulmasov Т., Murfett J., Hagen G. and Guilfoyle T.J. (1997) Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements. Plant Cell, 9, 1963-1971.

455. Urao Т., Yamaguchi-Shinozaki K., Urao S. and Shinozaki K. (1993) An Arabidopsis MYB homolog is induced by dehydration stress and its gene product binds to the conserved MYB recognition sequence. Plant Cell, 5, 1529-1539.

456. Valencia A., Chardin P., Wittinghofer A. and Sander C. (1991) The ras protein family: evolutionary tree and role of conserved amino acids. Biochemistry, 30, 46374648.

457. Valster A.H., Hepler P.K. and ChernofT J. (2000) Plant GTPases: the Rhos in bloom. Trends Cell Biol., 10, 141-146.

458. Van Aelst L. and D'Souza-Schorey C. (1997) Rho GTPases and signalling networks. Genes Dev., 11,2295-2322.

459. Venis M.A. and Napier R.M. (1995) Auxin receptors and auxin binding proteins. Crit. Rev. Plant Sci., 14, 27-47.

460. Vera-Estrella R., Barkla B.J., Higgins V.J. and Blumwald E. (1994a) Plant defense response to fungal pathogens. I. Activation of host-plasma membrane H^ATPase by elicitor-induced enzyme dephosphorylation. Plant Physiol., 104, 209-215.

461. Vera-Estrella R., Higgins V.J. and Blumwald E. (1994b) Plant defense response to fungal pathogens. II. G-Protein-mediated changes in host plasma membrane redox reactions. Plant Physiol., 106, 97-102.

462. Vernoud V., Horton A.C., Yang Z. and Nielsen E. (2003) Analysis of the small GTPase gene superfamily of Arabidopsis. Plant Physiol., 131, 1191-1208.

463. Vida T.A. and Emr S.D. (1995) A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J. Cell Biol., 128, 779-792.

464. Vitale A. and Raikhel N.V. (1999) What do proteins need to reach different vacuoles? Trends Plant Sci., 4, 149-15 5.

465. Vogel J.P., Schuerman P., Woeste K.E., Brandstatter I. and Kieber J.J. (1998a) Isolation and characterization of Arabidopsis mutants defective in the induction of ethylene biosynthesis by cytokinin. Genetics, 149, 417-427.

466. Voyno-Yasenetskaya T.A. (1998) G proteins and Na+/H* exchange. Biol. Signals Re-cept.,1, 118-124.

467. Voyno-Yasenetskaya T.A., Conklin B.R., Gilbert R.L., Hooley R., Bourne H.R. and Barber D.L. (1994) Ga13 stimulates Na+-H+ exchange. J. Biol. Chem., 269, 47214724.

468. Vriezen W., van Rijn C., Voesenek A. and Mariani C. (1997) A homolog of the Arabidopsis thaliana ERS gene is actively regulated in Rumex palustris upon flooding. Plant J., 11, 1265-1271.

469. Wada M., Nakanishi H., Satoh A., Hirano H., Obaishi H., Matsuura Y. and Takai Y. (1997) Isolation and characterization of a GDP/GTP exchange protein specific for the Rab3 subfamily small G proteins. J. Biol. Chem., 272, 3875-3878.

470. Walter H. and Larsson C. (1994) Partitioning procedures and techniques: cells, organelles, and membranes. Method. Enzymol., 228, 42-63.

471. Wang K.L.C., Li H. and Ecker J.R. (2002) Ethylene biosynthesis and signaling networks. Plant Cell, 14, S131 -S151.

472. Wang M., Sedee N.J.A., Heidekamp F and Snaar-Jagalska B.E. (1993) Detection of GTP-binding proteins in barley aleurone protoplasts. FEBSLett., 329, 245-248.

473. Warner H.L. and Leopold A.C. (1971) Timing of growth regulator-responses in peas. Biochem. Biophys. Res. Commun., 44, 989-999.

474. Warpeha K.M.F., Hamm H.E., Rasenick M.M. and Kaufman L.S. (1991) A blue-light-activated GTP-binding protein in the plasma membranes of etiolated peas. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 8925-8929.

475. Warpeha K.M.F., Kaufman L.S. and Briggs W.R. (1992) A flavoprotein may mediate the blue light-activated binding of guanosine 5'-triphosphate to isolated plasma membrane of Pisum sativum. Photochem. Photobiol, 55, 595-603.

476. Weiss С.A., Garnaat C.W., Mukai K., Hu Y. and Ma H. (1994) Isolation of cDNAs encoding guanine nucleotide-binding protein p-subunit homologues from maize (ZGB1) and Arabidopsis (AGB1). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 9554-9558.

477. Welch M., Chinardet N., Mourey L., Birch C. and Samama J.P. (1998) Structure of the Chey-binding domain of histidine kinase CheA in complex with CheY. Nat. Struct. Biol., 5,25-28.

478. White I.R., Wise A., Finan P.M., Clarkson J. and Millner P.A. (1992) GTP-binding proteins in higher plant cells. In: Transport and Receptor Proteins in Plant Membranes, Cooke D.T. and Clarkson D.T. (eds.), New York: Plenum Press, pp. 185192.

479. White J., Johannes L., Mallard F., Girod A., Grill S., Reinsch S., Keller P., Tzschaschel В., Echard A., Goud B. and Stelzer E.H.K. (1999) Rab6 coordinates a novel Golgi to ER retrograde transport pathway in live cells. J. Cell Biol, 147, 743-759.

480. Wilkie T.M. and Yokoyama S. (1994) Evolution of the G protein a subunit multigene family. Soc. Gen. Physiol, 49, 249-270.

481. Wilkinson J.Q., Lanahan M.B., Yen H.-C., Giovannoni J.J. and Klee H.J. (1995) An ethylene-inducible component of signal transduction encoded by Never-ripe. Science, 270,1807-1809.

482. Williams N.T. and Roberts T.M. (1994) Signal transduction pathways involving the Raf proto-oncogene. Cancer Metastasis Rev., 13, 105-116.

483. Williams R.A.N., Smith A.R. and Hall M.A. (1987) Characterization and purification of an ethylene binding component from developing cotyledons of Phaseolits vulgaris L. In: Plant Hormone Receptors, Klambt D. (ed.), Berlin: Springer-Verlag, pp. 303-309.

484. Wilson B.S., Nuoffer C., Meinkoth J.L., McCaffery M., Feramisco J.R., Balch W.E. and Farquhar M.G. (1994) A Rabl mutant affecting guanine nucleotide exchange promotes disassembly of the Golgi apparatus. J. Cell Biol, 125, 557-57.

485. Winge P., Brembu T. and Bones A.M. (1997) Cloning and characterization of Rac-like cDNAs from Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol, 35, 483-495.

486. Wise A. and Millner P. A. (1992) Evidence for the presence of GTP-binding proteins in tobacco leaf and maize hypocotyls plasmalemma. Biochem. Soc. Trans., 20, 7S.

487. Wise A., Thomas P.G., Carr Т.Н., Murphy G.A. and Millner P.A. (1997) Expression of the Arabidopsis G-protein GPal: purification and characterization of the recombinant protein. Plant Mol Biol, 33, 723-728.

488. Woeste K.E. and Kieber J.J. (2000) A strong loss-of-function mutation in RANI results in constitutive activation of the ethylene response pathway as well as a rosette-lethal phenotype. Plant Cell, 12, 443-455.

489. Woeste K.E., Vogel J.P. and Kieber J.J. (1999) Factors regulating ethylene biosynthesis in etiolated Arabidopsis thaliana seedlings. Physiol Plant., 105, 478-484.

490. Wu G., Gu Y., Li S.D. and Yang Z.-B. (2001) A genome-wide analysis of Arabidopsis Rop-interactive CRIB motif-containing proteins that act as Rop GTPase targets. Plant Cell, 13,2841-2856.

491. Wu G., Li H. and Yang Z. (2000) Arabidopsis RopGAPs are a novel family of Rho GTPase-activating proteins that require the Cdc42/Rac-interactive binding motif for Rop-specific GTPase stimulation. Plant Physiol, 124, 1625-1636.

492. Wu W.H. and Assmann S.M. (1994) A membrane-delimited pathway of G-protein regulation of the guard-cell inward K+ channel. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 91, 6310-6314.

493. Xia G., Ramachandran S., Hong Y., Chan Y.S., Simanis V. and Chua N.H. (1996) Identification of plant cytoskeletal, cell cycle-related and polarity-related proteins using Schizosaccharomycespombe. Plant J., 10, 761-769.

494. Xing Т., Higgins V.J. and Blumwald E. (1997a) Identification of G proteins mediating fungal elicitor-induced dephosphorylation of host plasma membrane FT-ATPases. J. Exp. Bot., 48,229-237.

495. Xing Т., Higgins V.J. and Blumwald E. (1997b) Race-specific elicitors of Cladospo-rium fulvum promote translocation of cytosolic components of NADPH oxidase to the plasma membrane of tomato. Plant Cell, 9, 249-259.

496. Yaku H., Sasaki T. and Takai Y. (1994) The Dbl oncogene product as a GDP/GTP exchange protein for the Rho family: its properties compared with those of Smg GDS. Biochem. Biophys. Res. Commun., 198, 811-817.

497. Yamada M., Tachibana Т., Imamoto N. and Yoneda Y. (1998) Nuclear transport factor plO/NTF2 functions as a Ran-GDP dissociation inhibitor (Ran-GDI). Curr. Biol., 8, 1339-1342.

498. Yang N., Higuchi O., Ohashi K., Nagata K., Wada A., Kangawa K., Nishida E. and Mizuno K. (1998) Cofilin phosphorylation by LIM-kinase 1 and its role in Rac-mediated actin reorganization. Nature, 393, 809-812.

499. Yang S.F. and Hoffman N.E. (1984) Ethylene biosynthesis and its regulation in higher plants. Annu. Rev. Plant Physiol, 35, 155-189.

500. Yang Z. (2002) Small GTPases: versatile signaling switches in plants. Plant Cell, 14, S375-S388.

501. Yang Z.B. (1998) Signaling tip growth in plants. Curr. Opin. Plant Biol, 1, 525-530.

502. Yang Z.B. and Watson J.C. (1993) Molecular cloning and characterization of Rho, a Ras-related small GTP-binding protein from the garden pea. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 90, 8732-873.

503. Yip W.-K., Moore T. and Yang S.F. (1992) Differential accumulation of transcripts for four tomato 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase homologs under various conditions. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 89, 2475-2479.

504. York R.D., Yao H., Dillon Т., Ellig C.L., Eckert S.P., McCleskey E.W. and Stork P.J.S. (1998) Rapl mediates sustained MAP kinase activation induced by nerve growth factor. Nature, 392, 622-626.

505. Yoshida K., Nagano Y., Murai N. and Sasaki Y. (1993) Phytochrome-regulated expression of the genes encoding the small GTP-binding proteins in peas. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 6636-6640.

506. Yoshida S. (1994) Isolation of smooth endoplasmic reticulum and tonoplast from etiolated mung bean hypocotyls. Method. Enzymol., 228, 482-489.

507. Zaina S., Breviario D., Mapelli S., Bertani A. and Reggiani R. (1994) Two putative G-protein a subunits dissociate from rice coleoptile membranes after GTP stimulation. J. Plant Physiol., 143, 293-297.

508. Zaina S., Mapelli S., Reggiani R. and Bertani A. (1991) Auxin and GTPase activity in membrane from aerobic and anaerobic rice coleoptile. J. Plant Physiol., 138, 760762.

509. Zaina S., Reggiani R. and Bertani A. (1990) Preliminary evidence for involvement of GTP-binding protein(s) in auxin signal transduction on rice (Oriza sativa L.) coleoptile. J. Plant Physiol., 136, 653-658.

510. Zerial M. and McBride H. (2001) Rab proteins as membrane organizers. Nat. Rev. Mol. Cell Biol, 2, 107-117.

511. Zhang F.L. and Casey P.J. (1996) Protein prenylation: molecular mechanisms and functional consequences. Annu. Rev. Biochem., 65, 241-269.

512. Zhang S.J., Han J.H., Sells M.A., Chernoff J., Knaus U.G., Ulevitch R.J. and Bokoch G.M. (1995) Rho family GTPases regulate p38 mitogen-activated protein kinase through the downstream mediator PAK1. J. Biol Chem., 270, 2393423936.

513. Zheng Y., Bender A. and Cerione R.A. (1995) Interactions among proteins involved in bud-site selection and bud-site assembly in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol Chem., 270, 626-630.

514. Zheng Z.-L. and Yang Z.B. (2000a) The Rop GTPase switch turns on polar growth in pollen. Trends Plant Sci., 5, 298-303.

515. Zheng Z.-L. and Yang Z.B. (2000b) The Rop GTPase: an emerging signaling switch in plants. Plant Mol. Biol, 44, 1-9.

516. Zhou D„ Kalaitzis P., Mattoo A. and Tucker M. (1996a) The mRNA for an ETRl homologue in tomato is constitutively expressed in vegetative and reproductive tissue. Plant Mol Biol, 30, 1331-1338.

517. Zhou D., Mattoo A. and Tucker M. (1996b) Molecular cloning of a tomato cDNA encoding an ethylene receptor. Plant Physiol, 110, 1435-1436.

518. Zhu X., Jiang M.S., Peyton M., Boulay G., Hurst R., Stefani E. and Birnbaumer L. (1996) trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capaci-tative Ca2+ entry. Cell, 85, 661-671.

519. Zhulin I.B. (2001) The superfamily of chemotaxis transducers: from physiology to genomics and back. Adv. Microb. Physiol, 45, 157-198.

520. Zondag G.C.M., Evers E.E., ten Klooster J.P., Janssen L., van der Kammen R.A. and Collard J.G. (2000) Oncogenic Ras downregulates Rac activity, which leads to increased Rho activity and epithelial-mesenchymal transition. J. Cell Biol., 149, 775-782.

521. JT никогда не забуду Майка, Фжилл и Сэйру Холл. Юля меня большая честь и счастье быть принятыми в замечательной семье.

Информация о работе

Мошков, Игорь Евгеньевич
доктора биологических наук
Москва, 2003
ВАК 03.00.12

Диссертация

Рецепция этилена и роль мономерных G-белков в передаче этиленового сигнала - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы