Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ресурсный запас флавоноидов природных и экспериментальных популяций цмина песчаного (Helichrysum arenarium (L.)Moench) в Саратовской области

ВАК РФ 03.02.01, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Ресурсный запас флавоноидов природных и экспериментальных популяций цмина песчаного (Helichrysum arenarium (L.)Moench) в Саратовской области"

На правах рукописи

Машурчак Николай Владимирович

РЕСУРСНЫЙ ЗАПАС ФЛАВОНОИДОВ ПРИРОДНЫХ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ ЦМИНА ПЕСЧАНОГО (НеИсИгуяит агепагшт (Ь.) МоепсЬ) В САРАТОВСКОЙ ОБЛАСТИ

03.02.01-ботаника 03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

0046И32УУ

Саратов-2010

004603299

Работа выполнена в государственном образовательном учреяздении высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» на кафедре биохимии и биофизики и в Учебно-научном центре «Ботанический сад» СГУ

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор,

Кашин Александр Степанович доктор биологических наук, профессор, Игнатов Владимир Владимирович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Антонюк Людмила Петровна

кандидат биологических наук, доцент Забалуев Анатолий Петрович

Ведущая организация ГОУ ВПО «Саратовский государственный

медицинский университет им. В.И. Разумовского»

Зашита состоится «¿¿>» 2010 г. в часов на заседании диссертаци-

онного совета Д 212.243.13 при государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Астраханская, д. 83, Е-таП: bi050vet@sgu.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке имени В.А. Артасевич ГОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского»

Автореферат разослан г.

Ученый секретарь лШйда5^

диссертационного совета / С.А. Невский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время в ассортименте лекарственных средств гепатопротекторного, желчегонного, антиоксидантного, антирадиационного, иммуномодулирующего и адаптогенного спектров действия, представленных на фармацевтическом рынке Российской Федерации, сложилась неблагоприятная ситуация при абсолютном доминировании зарубежных препаратов. В связи с этим совершенно необходимым становится расширение ассортимента отечественных препаратов указанного спектра действия (Куркина, 2007). что, в свою очередь, требует углубленного изучения химического состава лекарственного растительного сырья. Одним из перспективных источников фенольных соединений вышеперечисленного действия является лекарственное растительное средство - цветки цмина песчаного (Helichrysum arenarium (L.) Moench) (Asteraceae). Однако основные запасы сырья данного вида после распада СССР остались за пределами России: в Украине, Белоруссии (Атлас..., 1983). В связи с этим возникла острая необходимость поиска новых районов, пригодных для организации его заготовок, и отбора для введения в культуру растений, наиболее продуктивных в отношении количества и качества действующих веществ.

До последнего времени исследования по выявлению содержания флаво-ноидов у Н. arenarium в регионе не проводились. Более того, не было обнаружено данных литературы об исследованиях межпопуляционной и внутрипопу-ляционной изменчивости содержания этих веществ у Н. arenarium в каком-либо районе в пределах его ареала. Все исследования по изучению изменчивости содержания флавоноидов у растений данного вида касались динамики накопления их в онтогенезе или динамики сезонного накопления (Минаева, 1978; За-прометов, 1993; Даргаева, 1994; Копнин, 2007; Карпова и др., 2008; Горюнова, 2009).

Цель исследования. Выявление закономерностей изменчивости содержания и ресурсного запаса веществ флавоноидного комплекса Я. arenarium в различных условиях произрастания на территории Саратовской области и в культуре.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ качественного и количественного состава веществ флавоноидного комплекса в растениях Н. arenarium из различных районов Саратовской области, разных типов биотопов и органов растений;

2. Выявить динамику изменчивости содержания флавоноидов в растениях Я. arenarium при произрастании их в различных и сходных условиях внешней среды;

3. Оценить по содержанию флавоноидов в сырье Я. arenarium перспективность использования Саратовской области в качестве региона, пригодного для организации промышленных заготовок лекарственного сырья данного вида.

Научная новизна. Впервые исследована межпопуляционная и внутрипо-пуляционная изменчивость содержания флавоноидов в растениях Я. arenarium.

з

Показано, что качественный состав флавоноидов не зависит от условий произрастания. Обнаружено, что содержание флавоноидов у Н. arenarium в ценопо-пуляциях из различных районов Саратовской области и разных биотопов определяется не столько генотипической изменчивостью, сколько различающимися условиями произрастания и воздействием факторов внешней среды. Выявлено, что по уровню флавоноидов в качестве лекарственного сырья можно использовать не только соцветия, но и листостебельную часть растений. Впервые по ресурсному запасу флавоноидов оценена перспективность промышленных заготовок сырья Н. arenarium в Саратовской области.

Практическая значимость работы. Установлено, что по уровню содержания флавоноидов в сырье Н. arenarium Саратовская область перспективна для его промышленных заготовок. Результаты исследования могут быть использованы в качестве рекомендаций по заготовке растительного сырья Н. arenarium в различных районах области, для отбора высокопродуктивных растений при введении вида в культуру, а также в курсах фармакогнозии, ботанических и биохимических основ ресурсоведения, экологии и охраны природы. Результаты работы будут полезны в природоохранной деятельности и для мониторинга состояния популяций цмина песчаного в Саратовской области.

Связь работы с научными программами, темами. Работа выполнялась в рамках ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы (2006-2008 годы)» (проект РНП.2.2.3.1.2435).

Апробация работы. Основные положения и результаты работы были представлены на: VII Международном Симпозиуме по фенольным соединениям: фундаментальные и прикладные аспекты (Москва, 2009); VIII Международной научно-практической конференции «Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии» (Барнаул, 2009); Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов «Исследования молодых учёных в биологии и экологии» (Саратов, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ, одна из которых в журнале, рекомендованном Перечнем ВАК РФ.

Декларация личного участия автора. Автор лично провёл в 2007 -2009 гг. экспедиционные исследования на территории Саратовской области по сбору материалов для изучения. Анализ полученных результатов осуществлен автором самостоятельно по плану, согласованному с научными руководителями. Материалы диссертации изложены в работах, опубликованных в соавторстве. Доля личного участия автора в подготовке и написании публикаций составляет 50-70%.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов и списка литературы. Общий объем работы 142 страницы, содержит 9 таблиц и 22 рисунка. Список литературы включает 159 источников отечественных и зарубежных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Качественный состав основных веществ флавоноидного комплекса Н. arenarium на территории Саратовской области постоянен вне зависимости от

4

условий района произрастания и типа биотопа.

2. Суммарное содержание флавоноидов в растениях Я. агепапит из различных районов Саратовской области определяется не столько генотипической изменчивостью, сколько различающимися условиями произрастания и воздействием факторов внешней среды. В условиях культуры суммарное содержание флавоноидов в растениях снижается.

3. Территория Саратовской области по уровню содержания флавоноидов в единице растительного сырья потенциально пригодна для организации промышленных заготовок Я. агепапит. Наиболее перспективными для заготовки растительного сырья этого вида являются центральные районы Правобережья.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. ФЛАВОНОИДЫ РАСТЕНИЙ: РАЗНООБРАЗИЕ, ЗНАЧЕНИЕ, ОСОБЕННОСТИ НАКОПЛЕНИЯ У РЕСУРСНЫХ ВИДОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

В главе дается обзор литературных данных по исследованию флавоноидов в растениях различных семейств покрытосеменных, дано описание некоторых биологически активных веществ, встречающихся у Я. агепапит. Анализируются методы выделения и анализа флавоноидов, их применение в медицине. Приведена всесторонняя характеристика Я. агепапит как ресурсного вида.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Дана характеристика природно-климатических условий Саратовской области: рельефа, климата, почвы, погодных условий в годы проведения исследований. Дана ботаническая характеристика изучаемого объекта исследования -Я. агепапит и краткая характеристика мест произрастания исследованных це-нопопуляций.

Исследовались растения, взятые из 30-ти естественных ценопопуляций двух типов биотопов (степного и остепнённого бора) 18 районов Саратовской области (рис. 1). Сбор растений проводился в период массового цветения растений данного вада с 23 июня по 1 августа. В каждой ценопопуляции случайным образом производили выборку 30 растений зрелого возрастного состояния (С2). Кроме того, в 2007 г. из ценопопуляций обоих типов биотопов с контрастными условиями произрастания (Базарно-Карабулакского, Аткарского, Рти-щевского, Озинского, Красноармейского, Краснокугского, Хвалынского и Марксовского районов) было взято по двадцать растений. Выборка растений из каждой ценопопуляции была высажена в ботаническом саду СГУ в одинаковые условия произрастания в виде самостоятельных экспериментальных популяций. При этом тип почв и условия освещённости были типичными для естественных мест обитания растений данного вида. Уход за растениями этих популяций включал искусственное орошение и комплекс агротехнических мероприятий.

5

В 2008 г. с растений этих экспериментальных популяций был взят материал для анализа на трёх стадиях развития: отрастание (май), начало цветения -бутонизация (июнь) и окончание цветения - начало плодоношения (июль). В 2009 г. растения каждой из экспериментальных популяций выращивались в различных условиях освещения. Растения одной половины произрастали в условиях искусственного затенения, а растения второй половины - в контрольных условиях естественного освещения. Сбор материала для анализа осуществляли на тех же трёх стадиях развития, что и в 2008 г.

Изъятые для биохимического анализа растения, независимо от времени или места сбора, разделяли на 3 фракции: соцветия, листостебельный побег и корни. Каждую фракцию измельчали и помещали в 95% этанол. Экстракты для исследования готовили по методикам М.Н. Запрометова (1974) и Е.Я. Ладыгиной и др. (1983). Все манипуляции проводили с водным экстрактом. Для анализа экстрактов использовали метод ТСХ (Запрометов, 1974; Кирхнер, 1981; Ши-лина и др., 2004) и УФ-спектрофотометрию (Запрометов, 1974; Копнин, 2007). Хроматография в тонком слое сорбента проводили на пластинах "БогЬШ" ПТСХ-АФ-В-УФ в трёх повторностях по каждому образцу. В качестве подвижной фазы для выделения нарингенина на спектрофотометрический анализ использовали систему растворителей - бутанол : уксусная кислота (2 : 3) (элюент получен экспериментальным путем), для определения качественного состава флаваноидного комплекса - этилацетат : уксусная кислота : вода (5:1:1) (Ши-

Иасогаа чгамш

Рис. I. Местонахождение исследованных популяций НеЧсИ^ит агепагтт: 1 -Хвалынский, 2 - Ршщевский (Рпц), 3 - Базарно-Карабулакский (Б.Кар), 4 - Петровский (Птр), 5 - Воскресенский (Век), 6 - Аткарский (Атк), 7 - Татшцевский (Ттщ), 8 -Балаковский (Блк), 9 - Марксовский (Мрк), 10 - Саратовский (Сар), 11 - Калиниский (Клн), 12-Лысогорский (Лег), 13 - Балашовский (Блш), 14-Энгельсский (Энг), 15-Озинский Озн), 16 - Красноармейский (КрА), 17 - Краснокутский (КрК), 18 - Ровенский (Рвн) районы

лина и др., 2004). УФ-спектрофотометрию проводили на спектрофотометре "Бресог«! 40". Процентное содержание суммы флавоноидов определяли по методике В.П. Георгиевского и др. (1990).

При выборе рабочего стандартного образца для количественного определения флавоноидов методом спектрофотометрии апробировали рутин и на-рингенин после проведения реакции комплексообразования с ацетатом натрия (Запрометов, 1993). В качестве рабочего стандартного образца был выбран раствор нарингенина, так как содержание этого флавоноида у Н. агепагтт значительно выше, чем содержание рутина, а область длин волн, в которой лежит максимум поглощения данного вещества, находится вне области длин волн максимума поглощения сопутствующих веществ нефенольной природы, таких как хлорофилл. Кроме того при сходных концентрациях стандартов рутина и нарингенина чувствительность последнего к УФ-излучению выше. Максимум поглощения спектра нарингенина и совпадающего с ним извлечения из травы Я. агепагтт приведён на рис. 2.

Фенологические наблюдения за растениями Я агепагтт проводили при произрастании их в условиях экспериментальных популяций на территории ботанического сада СГУ. Обработка данных фенологических наблюдений проводилась по общепринятой методике (Шилова и др., 2007).

Глава 3. СОСТАВ ФЛАВОНОИДОВ В РАСТЕНИЯХ НеНскгузит агепагтт ИЗ ЕСТЕСТВЕННЫХ ЦЕНОПОПУЛЯЦИЙ

При использовании в качестве подвижной фазы раствора этилацетат: уксусная кислота: вода (5 : 1 :1) в экстрактах из соцветий Я. агепагтт обнаружено от 10 до 14, в побегах - от 7 до И, а в корнях - от 3 до 6 зон адсорбции. Однако существенных различий в качественном составе основных компонентов флаваноидного комплекса в растениях из различных районов области не выявлено. Качественные различия касаются лишь флавоноидов, присутствующих в следовых количествах. Качественный состав флавоноидов в экстрактах трёх лет (2007 - 2009 гг.) исследования был идентичен. Среди основных компонентов флаваноидного комплекса по веществам-свидетелям идентифицированы на-рингенин (ЯГ = 0.97), рутин (К^Г = 0.29), по данным о величине ИГ и цвету зон адсорбции (Даргаева, 1994; Шилина и др., 2004; Куркина, 2007) идентифицированы гиперозид = 0.39), лютеолин-7- гликозид (¡У = 0.42) и нарингенин-5-гликозид (ЯГ = 0.53).

При этом максимальное число флавоноидов обнаружено в экстракте из соцветий Я. агепагтт ценопопуляции степного биотопа из Ртищевского района (14 зон адсорбции). Высоким был этот показатель у растений ценопопуля-ций степного биотопа из Татищевского и Аткарского районов и остепнённого бора из Аткарского и Балашовского районов (13 зон адсорбции), т. е. из районов с умеренно-континентальным климатом (западная и центральная часть

Рис. 2. Спектр поглощения стандарта нарингашна (верхняя кривая), извлечения из цветков НеИсЬгужп агепапит (нижняя кривая). По оси абсцисс - длина волны, нм; по оси ординат - оптическая плотность

Правобережья Саратовской области). Однако такое же количество зон адсорбции обнаружено и в соцветиях растений из ценопопуляций, произрастающих в более аридных левобережных районах области (степные биотопы Краснокут-ского, Озинского и Марксовского районов). Следовательно, строгой зональной приуроченности качественного состава флавоноидов не обнаружено.

Показано, что в 2007 г. процентное содержание флавоноидов в растениях на межпопуляционном уровне варьировало в широких пределах. Амплитуда изменчивости содержания их в соцветиях в ценопопуляциях обоих типов биотопов фактически совпадала (1.60 - 9.20% - в ценопопуляциях биотопа остеп-нённого бора и 2.15 - 9.16% - степного биотопа), при этом превышение максимального значения параметра над минимальным было почти шестикратном. Ещё больший разброс между ценопопуляциями наблюдался по процентному содержанию флавоноидов в побегах при почти девятикратном различии между максимальным и минимальным значениями данного параметра. В биотопе ос-тепнённого бора минимальный и максимальный значения параметра были несколько ниже (0.73 - 5.82% при восьмикратном различии), чем в степном (1.11 - 6.27% при менее чем шестикратном различии) (рис. 3-4). Максимальное процентное содержание флавоноидов в соцветиях Я. агепагшт в этот год было отмечено у растений ценопопуляций обоих типов биотопов из Аткарского, Калининского и Татищевского районов, т.е. из центральных районов саратовского Правобережья. Минимальное содержание веществ флавоноидного комплекса в соцветиях отмечено у растений из ценопопуляций обоих типов биотопов Ба-зарно-Карабулакского, степного биотопа Красноармейского, Энгельсского, Петровского, Саратовского, Озинского районов, остепнённого бора Краснокут-ского и Балаковского районов, т.е. в основном из районов саратовского Левобережья и северных, южных или восточных районов Правобережья.

Содержание флавоноидов во всех экстрактах из побегов растений

Б. Кар. Пхр Век Атк Бяк Мрк Кля Блш Лег Эиг КрК Рис. 3. Суммарное содержание флавоноидов (%) в пересчете на нарингенин в экстрактах растений Н. агепаг^ит из ценопопулящщ осгепиёяного бора. По оси абсцисс - рай-опы произрастания ценопопуляяий; по оси ординат - процентное содержание флавоноидов в пересчете на нарянгенин. Сокращения те же, что на рис. 1. Бары означают стандартную ошибку средней

соц»егкж, 2007 ЖпоФег. 2007 *соивехнд. 2008 ВгЫЧг, 2008 Осоцветп*. 2009 ЕЭпоАсг. -^0119

Рис. 4. Суммарное содержание флавоноидов (%) в пересчете на нарингенин в экстрактах растений Н. агегшг1ит из ценопопулядий степного биотопа. По оси абсцисс - районы произрастания ценопопулядий; по оси ординат - процентное содержание флавоноидов в пересчете на нарингенин. Сокращения те же, что на рис. 1. Бары означают стандартную ошибку средней

Я. агепагтт в 2007 г. было ниже, чем из соцветий растений тех же ценопопу-ляций (чаще всего в 1.5 - 8.0 раза) (рис. 3-4). Средние значения различались в 1,5— 2,0 раза (табл. 1). Однако в ряде ценопопуляций процентное содержание фла-воноидов в листостебельных побегах было достаточно высоким. В ценопо-пуляциях обоих биотопов из Аткарского и Калининского районов и степных биотопов из Ртшцевского района, а в ряде случаев и Хвалынского района этот показатель был близок к 6%. Средний уровень веществ флавоноидного комплекса по ценопопуляциям обоих типов биотопов в 2007 г. не различался и составил в соцветиях 5.05±0.51%, а в побегах - 3.2б±0.45% (см. табл. 1).

В 2008 г. процентное содержание флавоноидов в экстрактах из растений Я. агепагшт на межпопуляционном уровне варьировало также широко(1.14 -

10.86 %), как и в 2007 г.. При этом содержание их в экстрактах из соцветий в ценопопуляциях степного биотопа варьировало в интервале 3.32 - 10.86%, в то время как в ценопопуляциях остепнённого бора - от 3.32 - 5.14%. В целом минимальные и максимальные значения параметра в ценопопуляциях степного биотопа различались более чем в три раза, а остепнённого бора - лишь в 1.5 раза. При этом минимальные значения были значительно выше, чем в 2007 г. Средний уровень содержания флавоноидов в ценопопуляциях степного биотопа и остепнённого бора достоверно не различался. Не отличались они достоверно и от аналогичных показателей по 2007 г. наблюдений.

В 2008 г. по процентному содержанию флавоноидов в экстрактах из побегов ценопопуляции различались почти пятикратно (1.14 - 5.52%). Разброс значений хотя и был менее выраженным, чем в 2007 г., однако был значительно шире, чем по содержанию флавоноидов в соцветиях. При этом по ценопопуля-циям остепнённого бора минимальный и максимальный значения различались лишь трёхкратно (1.26 - 4.21%, в то время как по ценопопуляциям степного биотопа - почти пятикратно (1.14 - 5.52%) (рис. 3-4). Максимальное содержание флавоноидов в экстрактах из соцветий отмечено у растений ценопопуляции степных биотопов Лысогорского, Калининского и Татищевского районов, т.е. опять же в популяциях, произрастающих в центральных районах Правобережья. Минимальное содержание флавоноидов наблюдалось у растений ценопо-пуляций Озинского, Энгельского, Саратовского районов, остепнённого бора Марксовского района и ценопопуляции №2 степного биотопа Хвалынского района, - в районах Левобережья и в северном и восточном районах Правобережья. В остальных ценопопуляциях содержание флавоноидов в соцветиях было на уровне средних значений (4.00 - 5.14%).

В экстрактах из соцветий растений в абсолютном большинстве ценопо-пуляций, так же как в 2007 г., наблюдалось более высокое содержание флаво-

Таблица 1

Средние значения содержания флавоноидов по совокупности исследованных цено-__популяций Heiichrysum arenarium_

Год исследования Тип биотопа Суммарное содержание флавоноидов в %, в пересчете на нарингенин

Соцветия Побег

2007 Остепнённый бор 4.45±0.82 2.68±0.65

Степной биотоп 5.26±0.68 3.59±0.62

Совокупно по обоим биотопам 5.05±0.51* 3.26±0.45*

2008 Остепнённый бор 4.51±0.24 2.5Ш.34

Степной биотоп 5.01±0.43 2.51±0.32

Совокупно по обоим биотопам 4.81±0.27' 2.53±0.23*

2009 Остепнённый бор 6.4б±0.65 5.03±0.59

Степной биотоп 6.18±0.43 4.08±0.18

Совокупно по обоим биотопам 6.36±0.36*' 4.43±0.26*'

Примечание: * в каждом столбце при попарном сравнении различия достоверны при Р < 0.05. Аналогичная достоверность различий имеет место и при сравнении данных в пределах каждого столбца отдельно по каждому биотопу

Ю

ноидов, чем в экстрактах из побегов растений той же популяции (до трёхкратного превышения), и лишь в популяции из Краснокутского района в экстрактах из соцветий и побегов суммарное содержание флавоноидов достоверно не различалось, а в ряде цекопопуляций (остепнённого бора из Воскресенского и Лы-согорского районов, степного биотопа Калининского, Лысогорского и Краснокутского районов) - различалось незначительно. При этом содержание флавоноидов в побегах растений некоторых ценопопуляций из ряда районов (по степным биотопам - ценопопуляции Калининскиого, Лысогорского районов, по остепнёиным борам - ценопопуляции Лысогорского, Краснокутского и Воскресенского районов) было на уровне средних значений (4.07 - 5.52%). Однако в большинстве остальных ценопопуляций содержание флавоноидов в экстрактах из побегов было незначительным (около 1.5-3.0%) {см. рис. 3-4).

Таким образом, в 2007 и 2008 гг. максимальное содержание суммы флавоноидов наблюдалось в растениях из центральных районов Правобережья Саратовской области, т.е. на границе лесостепной и степной зон. В пределах одного района произрастания Н. агепатгит сумма веществ флавоноидного комплекса у растений ценопопуляций степных биотопов чаще всего была выше, чем у растений остепнённых боров. В большинстве ценопопуляций процентное содержание суммы флавоноидов в соцветиях превышало таковое в побегах, причём в некоторых случаях значительно (в 2 и более раз). Однако при этом процентное содержание флавоноидов в побегах в ряде популяций Правобережья было относительно высоким и достигало 5.5 - 6.0% от сухой массы растений. В 2007 г. наблюдался более существенный, чем в 2008 г., разброс значений по це-нопопуляциям, что говорит о более нестабильном проявлении факторов, сказывающихся на процессе накопления флавоноидов, на территории области в 2007 г. Средний уровень содержания флавоноидов в 2007 и 2008 гг. как по це-нопопуляциям отдельных биотопов, так и совокупно по ценопопуляциям обоих типов биотопов достоверно не отличался.

В 2009 г. процентное содержание флавоноидов в экстрактах из растений Я aremrium на межпопуляционном уровне варьировало в более узких пределах, чем в 2007 и 2008 гг. (1.93 - 10.71%). При этом содержание их в экстрактах из соцветий в ценопопуляциях степных биотоповварьировало в интервале 4.44 - 10.71%, а в ценопопуляциях остепнённых боров - в интервале 3.79 - 10.01%, т.е. в весьма близких пределах. В целом максимальные значения в ценопопуляциях обоих типов биотопов превышало минимальное примерно в 2.5 раза. Имел место минимальный за все годы наблюдений разброс значений по ценопопуляциям, что говорит о меньшей, чем в предыдущие годы, нестабильности проявления факторов, сказывающихся на процессе накопления флавоноидов на территории области. Средние значения содержания флавоноидов в ценопопуляциях степных биотопов и остепнённых боров достоверно не различалось (в соцветиях - 6.18±0.43 и 6.4б±0.65%, соответственно, а в побегах - 4.08±0.18 и 5.03±0.59%, соответственно). Но они были достоверно выше аналогичных показателей по 2007 и 2008 гг.

В 2009 г. по содержанию флавоноидов в экстрактах из побегов ценопо-

п

пуляции различались почти пятикратно (1.93- 9.14%). Как и в 2008 г., разброс значений хотя и был менее выраженным, чем в 2007 г., однако оказался значительно шире, чем по содержанию флавоноидов в соцветиях (см. рис. 3-4).

Максимальное содержание флавоноидов в экстрактах из соцветий отмечено в этот год у растений ценопопуляций степных биотопов Лысогорского, Татищевского и Петровского районов, т.е. опять же в основном в ценопопуля-циях, произрастающих в центральных районах Правобережья. Минимальное содержание флавоноидов наблюдалось у растений ценопопуляций остепнённо-го бора Петровского района, а также степных биотопов Марксовского, Ртшцев-ского, Озинского и Калининского районов, относящихся как к центральным, так и к краевым районам Саратовской области. Следовательно, в данный год наблюдений картина изменчивости содержания флавоноидов в растениях, по крайней мере, в части минимального содержания этих веществ, не полностью подчинялась той закономерности, которая имела место в два предыдущих года наблюдений.

В экстрактах из соцветий растений в абсолютном большинстве ценопопуляций, так же как в 2007 - 2008 гг., наблюдалось более высокое содержание флавоноидов, чем в экстрактах из побегов растений той же ценопопуляций (до пятикратного превышения). Однако в гораздо большем числе ценопопуляций из различных районов области в экстрактах из соцветий и побегов суммарное содержание флавоноидов либо достоверно не различалось, либо различалось незначительно. При этом процентное содержание флавоноидов в побегах в ряде ценопопуляций как Правобережья, так и Левобережья было высоким и достигало 9.1% от сухой массы растений, будучи максимальным по всем годам наблюдения. Только в четырёх ценопопуляциях содержание флавоноидов в экстрактах из побегов было незначительным (около 2.0 - 3. %) (рис. 3-4).

Средний уровень веществ флавоноидного комплекса по ценопопуляци-ям обоих типов биотопов в 2009 г. составил в соцветиях 6.36±0.3б%, а в побегах - 4.43±0.26%, т.е. был достоверно выше соответствующих средних показателей по ценопопуляциям обоих типов биотопов предыдущих лет наблюдений (см. табл. 1). В большинстве ценопопуляций содержание флавоноидов было близко к среднеарифметическому значению по данному году.

Сумма веществ флавоноидного комплекса у растений ценопопуляций степных биотопов в пределах одного района произрастания, также как в предыдущие годы наблюдения, чаще всего была несколько выше, чем у растений из популяций остепнённых боров (см. рис. 3-4). Однако среднеарифметические величины этого параметра по совокупности исследованных ценопопуляций того и другого типа биотопа достоверно не различались (см. табл. 1).

Из вышеизложенного очевидно, что наиболее контрастным по амплитуде изменчивости флавоноидов в ценопопуляциях области из трёх лет был 2007 г. При этом именно в данный год наблюдался наиболее выраженный градиент снижения содержания флавоноидов в растениях в направлении от центральных районов Правобережья области к её 1раницам. Средний уровень веществ флавоноидного комплекса по ценопопуляциям как отдельных типов биотопов, так

12

и суммарно по обоим типам биотопов в 2007 и 2008 гг. достоверно не различался. Наиболее благоприятными для накопления флавоноидов в растениях Я. аге-narium из трёх лет наблюдений были климатические условия 2009 г. При этом они сказывались таким образом, что существенно нивелировали действие локальных по проявлению факторов внешней среды.

Глава 4. ОСОБЕННОСТИ НАКОПЛЕНИЯ ФЛАВОНОИДОВ Helichrysum arenarium В ЕСТЕСТВЕННЫХ ЦЕНОПОПУЛЯЦИЯХ И В УСЛОВИЯХ ИНТРОДУКЦИИ

Эксперименты с переносом случайной выборки растений из 11 исследованных нами естественных ценопопуляций, произраставших в контрастных условиях внешней среды обоих типов биотопов, в сходные условия произрастания в ботаническом саду СГУ показали следующее. В 2008 г. в начале цветения у растений из различных ценопопуляций содержание флавоноидов в соцветиях варьировало в узком интервале 3.12 - 3.65% (крайние значения различались в 1.2 раза), в то время как при произрастании в этот же год в естественных условиях - в интервале 3.32 - 6.88% (более чем в 2 раза), а в побегах - 1.60 - 1.80% (в 1.1 раза) и 1.14 - 4.21% (в 3.7 раза), соответственно (см. рис. 3-5). В 2009 г. содержание флавоноидов в соцветиях при произрастании растений в условиях ботанического сада варьировало в интервале 3.17 - 4.10% (менее чем в 1.3 раза), а в естественных ценопопуляциях - 4.54 - 7.71% (в 1.7 раза), а в побегах -1.15 - 1.54% (в 1.3 раза) и 2.41 - 4.68(почти в 2 раза), соответственно (см. рис. 3, 4, 6). При этом в большинстве случаев в растениях экспериментальных популяций содержание флавоноидов в различные годы наблюдения было очень близким, т.е. варьирования признака по годам почти не наблюдалось, в то время как в растениях естественных ценопопуляций в 2009 и 2008 гг. содержание флавоноидов достоверно различалось, причём 2009 г. был более благоприятным для накопления флавоноидов в них, чем 2008 г.

Это приводит к заключению, что в Саратовской области факторы внешней среды, т.е. экотапические факторы, в большей мере, чем генотипические, сказываются на содержании флавоноидов в растениях Я. arenarium.

Климатические условия в период вегетации в исследуемые годы (2007 -2009 гг.) при сходстве по большей части месяцев со среднемноголетними характеризовались следующими особенностями. В 2007 г. среднемесячная температура мая была более чем на 3°С выше среднемноголетней, а среднемесячное количество осадков в мае составляло лишь одну треть от среднемноголетнего. В 2008 г. в апреле наблюдалось значительное превышение (более чем на 4°С) среднемесячной температуры над среднемноголетней, а в мае количество выпавших осадков составило лишь две трети от нормы. Однако июнь и июль этого года были чрезвычайно влажными (при полутора - двукратном превышении количества выпавших осадков над среднемноголетней нормой). При этом2009 г. характеризовался чрезвычайной аридностью условий обитания июня и

■отрагпвдю, побег ■плодоношение, соцветия

В бутонигга*и> соцаетия О плодоношение, побег

«буто«гж*#и,побег

I

I < 1

= я 5 2 и 2 5 я ( т ■ ■ Ь

111111111 I I

Г-М' ■ м.

& К.>|*

'Л,

Л п. ("Т. Лп. ' КГ Гни К|.ь«т. КрКЧ'кГ.

г, 1> л I и Г(.к ( г.;

Рис. 5. Суммарное содержание флавоновдов (%) в пересчете на нарингенин в экстрактах из соцветий и побегов на разных стадиях онтогенеза растений НеИсЬутт агепапит, перенесённых из различных естественных ценопопуляций в одинаковые условия произрастания на территории ботанического сада СГУ. Накопление флавоноидов отслеживалось в 2008 г. при произрастании в естественных условиях освещённости. По оси абсцисс - районы произрастания ценопопуляций; по оси ординат - процентное содержание флавоновдов в пересчете на нарингешш. Сокращения те же, что на рис. 1. СБ - степной биотоп, ОсБ - биотоп остепнённого бора. Бары означают стандартную ошибку средней

в отраспвдие, по£сг В пяодонотоя соцяетя

В бутонюздек. соцзепи а пло доношаак, повег

в я, побгг

Б.Кар. ОсБ

Рис. 6. Суммарное содержание флавоновдов (%) в пересчете на нарингенин в экстрактах из соцветий и побегов на разных стадиях онтогенеза растений НеНсЬушп агепагтт, перенесённых из различных естественных ценопопуляций в одинаковые условия произрастания на территории ботанического сада СГУ. Накопление флавоноидов отслеживалось в 2009 г. при произрастании в естественных условиях освещённости. По оси абсцисс -районы произрастания ценопопуляций; по оси ординат - процентное содержание флавоноидов в пересчете на нарингенин. Сокращенна те же, что на рис. 1,5. Бары означают стандартную ошибку средней

июля. Учитывая, что именно 2009 г. из всех лет наблюдений был наиболее благоприятным для накопления флавоноидов в растениях данного вида, а в 2007 г. наблюдался максимальное варьирование параметра у растений из различных ценопопуляций, обоснованно предположить, что для накопления флавоноидов в растениях Я агепапит лимитирующим фактором в регионе выступает степень аридности условий обитания в июне - июле, и напротив, возможно, негативно сказывается на накоплении флавоноидов высокая аридность условий обитания в апреле и, особенно, в мае.

Фенологические наблюдения, проведённые нами на экспериментальных популяциях ботанического сада СГУ, в целом подтверждают литературные сведения о наступлении отдельных фенофаз Я. агепапит (Исайкина, 1974).

При этом зачаточное соцветие из терминальной почки роста у Я. arenarium формируется после перезимовки. Однако отрастание в условиях г. Саратова начинается не во второй, а в первой половине апреля. В июне происходит интенсивный рост генеративных побегов и в конце июня - начале июля генеративные побеги зацветают. Массовое цветение наблюдается в условиях г. Саратова с первой половины июля (см. табл. 2). Учитывая различия по среднемесячным температурам и количеству выпавших осадков в апреле - мае 2008 и 2009 гг., более оправданно полагать, что лимитирующими факторами для накопления флавоноидов в растениях Н. arenarium в большей мере выступают аридные условия июня-июля, чем апреля-мая. Именно в этот период происходит наиболее интенсивный рост растений, особенно генеративных побегов, которые, собственно и являются органами, накапливающими флавоноиды, а максимальная их концентрация обнаруживается в соцветиях, окончательно формирующихся в конце июня - начале июля (см. рис. 5,6).

С периодом интенсивного роста побегов и формированием генеративных органов связан, прежде всего, синтез флавоноидов (Запрометов, 1993; Harborn, 1976; Grisebach, 1980). Это подтверждает динамика накопления флавоноидов в побегах и соцветиях Я. arenarium, отслеженная на протяжении 2008 -2009 гг. при произрастании растений на экспериментальном участке ботанического сада СГУ (см. рис. 5,6). В целом она совпадала с динамикой накопления флавоноидов, установленной на других растительных объектах (Минаева, 1978; Запрометов, 1993; Карпова и др., 2008). А именно, в период отрастания содержание флавоноидов в растущих частях побега было минимальным (на уровне 2.0 - 2.5% от сухой массы побега). Затем в период начала цветения (июнь) содержание флавоноидов в побегах незначительно снижалось, но большая их концентрация обнаруживалась в соцветиях, что говорит уже само по себе о максимальном синтезе флавоноидов в этот период. К началу плодоношения, т.е. к завер- шению периода цветения (конец июля), содержание флавоноидов как в побегах, так и в соцветиях Н. arenarium начинало снижаться.

В пользу того, что лимитирующим фактором для накопления флавоноидов в растениях Я. arenarium являются аридные условия июня-июля, говорит и

Таблица2

Феноритм Hdichrysum arenarium в условиях г. Саратова_

~——_Л0Д Фенофаза " -—____ В экспериментальных ценопопуляциях

2008 2009

Отрастание Начало 14.03 06.04

Продолжительность 83 66

Бутонизация Начало 05.06 11.06

Продолжительность 11 6

Зацветание Начало 16.06 17.06

Продолжительность 9 9

Массовое цветение Начало 25.06 26,06

Продолжительность 15 18

Отцветание Начало 10.07 14.07

тот факт, что искусственный полив при произрастании их в условиях ботсада СГУ в 2009 г., характеризующемся чрезвычайной аридностью климатических условий этих месяцев, привёл к тому, что в искусственно созданных популяциях в растениях содержание флавоноадов было существенно ниже, чем в большинстве естественных ценопопуляций в этот год наблюдений (см. рис. 5-6)

На роль освещённости в интенсивности и уровне накопления флавонои-дов указывают как литературные данные (Минаева, 1978; Залрометов, 1993; Даргаева, 1994; Копнин, 2007; Карпова и др., 2008; Горюнова, 2009), так и результаты нашего эксперимента с искусственным затенением растений, поставленного на экспериментальном участке ботанического сада в 2009 г. (рис. 7). При этом в опыте и в контроле общая динамика накопления флавоноидов была сходной, но в каждый отдельный период развития процентное содержание флавоноидов в «затененных» растениях было более чем в 2 раза ниже, чем в растениях контрольной группы.

Однако низкая освещённость не могла быть лимитирующим фактором для накопления флавоноидов, как в естественных ценопопуляциях на большой территории Саратовской области, так и на экспериментальном участке ботанического сада без искусственного затенения. Она локально, да и то с очень низкой вероятностью, могла сказываться лишь в отдельных популяциях среди других локальных по характеру проявления факторов, таких как степень антропогенного воздействия, состав почв, структура растительных сообществ и т.п.

Суммарное содержание флавоноидов в растениях, произрастающих в один и тот же год в естественных ценопопуляциях существенно выше, чем в выборках растений из этих же ценопопуляций, перенесённых в ботанический сад СГУ (до 2 раз) (см. табл. 3).

ь

отрастание, побег П плодоношение, соцвсттся

Вбутонкгшда, соцветия О плодоношегаю, побег

■ бутогапяцня, побег

II П I Г11 П 11 жп ГГТТПП

4 "I "I "I "|'"1:П Ч-Ч ч Ч

I I I ■ I I 11111

БЛСар. ОсБ

Б.Кар. СБ

Атк. СБ Атк. ОсБ Ртщ КрКСБ КрКОсБ Озн Хва2 КрА1 МркСБЯ

Рис. 7. Суммарное содержание флавоноидов (%) в пересчете на нарингеяин в экстрактах из соцветий и побегов на разных стадиях онтогенеза растений НеНсИгузит аггпапит, перенесённых из различных естественных ценопопуляций в одинаковые условия произрастания на территории ботанического сада СГУ. Накопление флавоноидов отслеживалось в 2009 г. при произрастании в условиях затенения. По оси абсцисс - районы произрастания ценопопуляций; по оси ординат - процентное содержание флавоноидов в пересчете на нарингеяин. Сокращения те же, что на рис. 1, 5. Бары означают стандартную ошибку средней

ТаблинаЗ

Суммарное содержание флавоноидов в соцветиях при произрастании растений в естественных ценопопуляциях различных районов области и в случайной выборке из тех же

ценопопуяяций, перенесённых в ботанический сад СГУ

Район обитания исходной ценопопуляции и тип биотопа* Суммарное содержание флавоноидов (%) в соцветиях в пересчете на нарингенин при произрастании в

2008 г. 2009 г.

исходной ценопопуляции1 ботаническом саду1 исходной ценопопуляции2 ботаническом саду2

Б,Кар ОсБ 4.70*0.11 3.70*0.04 4.54*0.25 3.90*0.06

Б.Кар СБ 4.67*0.14 3.65*0.05 5.18*0.21 3.80*0.06

АткСБ 4.82±0.17 3.29*0.05 6.12*0.31 4.10*0.06

АткОсБ 4.98*0.11 3.12*0.06 4.80*0.21 3.80*0.04

Рид СБ 4.49*0.18 3.60*0.05 4.80*0.21 3.85*0.04

КрКСБ 4.50*0.25 3.25*0.05 5.48*0.20 3.17*0.06

КрК ОсБ 4.24*0.17 3.38*0.04 5.91*0.31 3.32*0.06

ОзнСБ 3.86*0.25 3.30*0.04 4.95*0.15 3.60*0.06

ХваСБ2 3.32*0.15 3.12*0.03 7.71*0.57 3.35*0.04

КрДСБ 4.07*0.25 3.29*0.04 5.14*0.24 3.39*0.06

Мрк СБ2 4.62*0.24 3.30*0.06 5.63*0.15 3.78*0.04

Среднее 4.39*0.24 3.36*0.06 5.48*0.41 3.64*0.09

Примечание: * сокращения те же, что на рис 3-4; 1 при попарном сравнении параметра растений при произрастании в исходной ценопопуляции и в ботаническом саду в каждый год наблюдения во всех случаи различия достоверны при Р < 0.05

Глава 5. ОЦЕНКА РЕСУРСНОГО ПОТЕНЦИАЛА Helichrysum arenarium В

САРАТОВСКОЙ ОБЛАСТИ ПО СОДЕРЖАНИЮ ФЛАВОНОИДОВ

В соответствии с принятым стандартом (Государственная..., 1990) содержание флавоноидов в лекарственном растительном средстве - цветки Я. arenarium должно быть не ниже 6%. Как следует из полученных нами результатов, в 2007 г. в 11 ценопопуляциях 7 районов области, а в 2009 г. в 14 ценопопуляциях 11 районов содержание флавоноидов в пересчёте на нарингенин в соцветиях Я. arenarium превышено 6%. Только 2008 г. был в этом отношении неблагоприятным: превышение по содержанию флавоноидов в соцветиях 6 % отмечено в этот год лишь в 3 ценопопуляциях 3 районов (см. рис. 3, 4). В 2009 г. среднее значение показателя содержания флавоноидов в соцветиях совокупно по всем ценопопуляциям было выше уровня 6%, в целом ряде ценопопуляции достигая уровня 8-12% (см. табл. 1).

Растения Н. arenarium произрастают, по крайней мере, в 18 административных районах области (см. рис. 1). Эксплуатационные запасы сырья данного вида растений, по некоторым оценкам, составляют около 8 т. (Забалуев, 2000). Это сравнимо со средними объёмами заготовок (в границах СНГ до 1991 г.) в наиболее богатых запасами сырья Я arenarium районах Украины и Бедаруссии (Атлас..., 1983). С учётом среднего содержания флавоноидов в соцветиях Я. arenarium на уровне 4.81 - 6.36% (см. табл. 1) ресурсный запас флавоноидов в природных популяциях данного вида растений на территории Саратовской об-

17

ласти составляет 0.385 - 0.509 т.

Таким образом, территория Саратовской области с точки зрения содержания флавоноидов в единице растительного сырья потенциально пригодна для организации промышленных заготовок Я агепагшт. Наиболее перспективными для заготовки этого растительного сырья являются центральные районы Правобережья на границе лесостепной и степной зон. Однако следует учитывать определённую нестабильность уровня содержания флавоноидов в растениях ценопопуляций данного вида растений и, по сути, нецелесообразность сбора растительного сырья Я. агепагшт на территории области в годы с низкими температурами в июне - июле и, особенно, с большим количеством осадков, выпадающим на этот период. В ценопопуляциях ряда центральных районов Правобережья, а также Балаковского района в отдельные годы содержание флавоноидов в листостебельных побегах достигало 6% и более, что потенциально позволяет в этих районах использовать для заготовок в фармацевтических целях не только соцветия Я. агепагшт, но и его листостебельные побеги. Результаты культивирования растений Я агепагшт на экспериментальном участке ботанического сада СГУ (см. табл. 3) показывают, что с точки зрения содержания флавоноидов в единице массы растительного сырья на территории области целесообразен сбор растений в естественных ценопопуляциях, а не выращивание их с этими целями в культуре.

ВЫВОДЫ

1. При отсутствии различий в качественном составе основных компонентов флавоноидного комплекса, в растениях из различных районов области наблюдались различия по числу флавоноидов, присутствующих в следовых количествах. Однако строгой зональной приуроченности их качественного состава не обнаружено. Среди основных компонентов фдаваноидного комплекса идентифицированы нарингенин = 0.97), рутин (ЯГ = 0,29), гиперозид (ЯГ = 0,39), лютеолин-7-гликозид (Rf= 0,42) и нарингенин-5-гликозвд (ЯТ= 0,53).

2. Максимальное содержание веществ флавоноидного комплекса во все годы, как правило, наблюдалось в ценопопуляциях из центральных районов Саратовского Правобережья, т.е. на границе лесостепной и степной зон. В западных, северных и южных районах Саратовского Правобережья содержание веществ флавоноидного комплекса снижалось. Особенно низким оно было у растений из степных и полупустынных районов Саратовского Левобережья, достигая минимума на крайнем востоке области. Однако эти различия нивелировались в год с экстремально засушливыми климатическими условиями июня - июля.

3. Лимитирующим фактором для накопления флавоноидов у Я. агепапит на территории области являются климатические условия июня- июля. Чем ариднее условия этого периода вегетации, тем выше содержание флавоноидов в растениях.

4. В пределах отдельных районов содержание флавоноидов чаще всего

18

было выше у растений ценопопуляций степных биотопов и соответственно ниже - у растений ценопопуляций остепнённых боров. Однако средние значения содержания флавоноидов совокупно в ценопопуляциях степных биотопов и це-нопопуляцкях остепнённых боров достоверно не различались.

5. В ценопопуляциях ряда центральных районов Правобережья, а также Балаковского района в отдельные годы допустимо в качестве растительного сырья как источника флавоноидов использовать не только соцветия, но листо-стебельные побеги Н. arenarium. Суммарное содержание флавоноидов в них достигает 6% и более и сравнимо с концентрацией флавоноидов в соцветиях.

6. На территории области с точки зрения содержания флавоноидов более целесообразен сбор сырья Я. arenarium в естественных ценопопуляциях, чем выращивание их с этими целями в культуре. Ресурсный запас флавоноидов в природных популяциях данного вида растений на территории Саратовской области составляет около 400 - 500 кг.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

* публикации в изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК РФ

1. Кашин A.C., Шилова И.В., Панин A.B., Жулидова Т.В., Машурчак

H.В., Бердников A.B. Растения Государственной фармакопеи в ботаническом саду Саратовского университета. - Саратов: ИЦ «Наука», 2007. - 73 с.

2. *Кашин A.C., Машурчак Н.В., Игнатов В.В. Зависимость состава фла-воноидного комплекса Heiichrysum arenarium (L) Moensh. от условий произрастания в Саратовской области // Поволжский экологический журнал. - 2009. - №

I.-С. 54-61.

3. Кашин A.C., Машурчак Н.В. Зависимость содержания флавоноидов у Heiichrysum arenarium (L.) Moench от условий произрастания в Саратовской области // Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии: Матер. 8 Между-нар. науч.-практич. конф., Барнаул, 19-22 окт. 2009 г. - Барнаул, 2009. - С. 414417.

4. Кашин A.C., Машурчак Н.В., Игнатов В.В. Зависимость состава фла-воноидного комплекса соцветий Heiichrysum arenarium (L.) Moench от условий произрастания в Саратовской области // Бюллетень ботанического сада СГУ. -Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2009. - Вып. 8. - С. 71-76.

5. Машурчак Н.В. Зависимость количественного состава флавоноидного комплекса Heiichrysum arenarium (L.) Moench от условий произрастания в Саратовской области // Матер. VII Междунар. симп. по фенольным соединениям: фундаментальные и прикладные аспекты, 19-23 окт. 2009г. - Москва, 2009. - С. 324.

6. Машурчак Н.В. Изменчивость содержания веществ флавоноидного комплекса Heiichrysum arenarium (L.) Moench в зависимости от местообитания в Саратовской области // Исследования молодых ученых в биологии и экологии: сб. науч. тр. - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2009. - Вып. 7. - С. 67 - 71.

ал

Подписало в печать 23.04.2010. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Roman. Печать RISO. Объем 1 печ. л. Тираж 100 экз. Заказ № 061.

Отпечатано с готового оригинал-макета Центр полиграфических и копировальных услуг Предприниматель Серман Ю.Б. Свидетельство № 3117 410600, Саратов, ул. Московская, д. 152, офис 19, тел. 26-18-19,51-16-28