Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция активности экзогенных ферментов путем их иммобилизации

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Регуляция активности экзогенных ферментов путем их иммобилизации"

р Г 6 Л ЬвОЛьКА АКАДЕМ1Я ВЕТЕРИНАРН01 МЕДИЦИНИ

I и CííT tó~3

На правах рукопису

СЕЛЕЗНЬОВА Олександра Олександртна

УДК 577.15 + 636.52/58:612.015.»

РЕГУЛЯЦ1Я АКТИВНОСТ1 ЕКЗОГЕННИХ ФЕРМЕНТ1В ШЛЯХОМ IX 1ММОБ1Л13АЦ11

(03.00.04 — 6¡ox¡MÍfl)

АВТОРЕФЕРАТ дисергацп на здобуття вченого ступеня кандидата бшлопчних наук

ЛЬВ1В - 1993

Робота виконапа в проблемна! еколого-бютехнолопчшй лабораторп Бш церктського сшьськогосподарського шституту.

Науковий кершник — члеп-кореспондент УААН, доктор бюлопчних па\] професор Герасименко В. Г.

Офщнпн опопенти: доктор бюлопчних наук Лазарев А. П.

доктор бюлогччнмх наук Масляпко Р. П.

Провипа установа — Дншропетрозський Державин» аграрии» ушверсите

Захист дисертацГГ вщбудсться « _1903 р.

о / % годнш на зааданш спец1ал1зовапо1 ради Д.120.17.01 при Льв1всью акадеыц встерштрпоГ мсдицини.

Адреса: 290010, м. Льв1в, вул. Пекарська, 50.

3 дисертащею можна ознайомнтись в б1блютеи1 Львшсько!' академп остер! парно! медицини.

Автореферат розюланнй « 1993 р.

Вчепий секретар спец1ал1зованоТ ради, доцент

е. м. маку:

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальтсть теми. Одшего ¡з осповних проблем тваринництва е пошук шлях1в шдвшденпя засвоюванпост1 пожнвних речовин корму. Недостатня актившеть еидогенних травиих фермешпв ком-пенсуеться введениям в ращони пльськогосподарських тварин i птищ екзогешшх пдролш!чних фермент1в. Проте, ферментш препарат», що застосовуються, вданачаються иестабьчыпстю дп вна-сл1док частково! або повно! ix шахтивацп в шлунково-кишковому трак-п шд д1ею сильпокнслого середовища, inriöiTopiB, протеаз.

Збкпьшити ефектившеть екзогенних ферме1тв можливо за ра-хунок створенпя стабк^зовапих форм 6ionpenapaTiß з використан-ням принцншв i метод1в шженерно! ензимологй' (I. В. Березш та in., 1976, 1982, 1990; М. Тривен, 1984; Дж. Вудворд, 1988; Дж. Бейл!, Д. Оллю, 1989; J. Rogalski et al., 1985; К. Mosbach, 1976; М. Kitaoka et al., 1989).

Модифнсоваш шляхом ¡ммобиизацп ферментн знайшли широкс застосування в бютехнолопчпнх виробппцтвах i медициш, проте в тварннншгт та ветерннаршй медициш щлеспрямованих ДОСЛ1Д-жень по створенню стабК^зованих препарате практично не про-воднлося.

В зв'язку з зазначеннм внще, копетруювапня стшких до зовшш-пього впливу бюкатал1затор1в пролонговано! та спрямовано! дй перспективне для шдвнщення резистентности, продуктивное^ та вадтворювалыю! здатност1 альськогосподарських тварин i птищ. Безперечний штерес становнть також вивчення мехашзму дй' iM-мобшзованих фермент1в в умовах in vivo.

Мета i завдання досл!джень. ¿Метою наших дослщжень було створення стабшзованих шляхом ¡ммобшзацп ферментних пре-парат1в та вивчення ix впливу на метабол!чш продеси та продук-тивн1сть курчат-бройлер1в. Для досягнеиня uiei" мети були поставлен! так1 завдання:

•— вивчити вплив ф!знко-Х1М1Ч1П1Х параметр'ш на процее ¡ммобшзацп ферментних препара'пв;

— датн пор1вняльну характеристику властивостеи патнвних та ¡ммобшзовапих ферметтв в умовах in vilro;

— вивчити вплив згодовувалнл ¡ммобшзованих ферметтв на процеси трансформадп пожнзних ргчовпн корму в оргашзм1 кур-чат-бройлер1в;

— скласти рекомендаци по ефективному використанню фер-ментних препарат1в.

Наукова новизна. Вперше проведена ¡ммобЫзащя екзогешшх фермегтв протосубтилш Г20х та целотерин ГЗх з метою викорнс-тання Тх в год1вл1 тварин 1 птицк В- результат! провсдених досл1д-жень визначеш оптпыалып умовн для адсорбци на цеолт вище-згаданнх ферме1тв. Показано збшлиеипя стабьтыюст! ¡з збере-женням високо'1 каталттчко! активност! одержаних препарата. Установлено, що ¡ммобшзоваш бюкатал!затори шдвищують р1-вень викорпстання поживних речовин корму, сприяють штепсн-фжаци обмшних процеав та збкчыпенню продуктивное^ курчат-бройлер1в.

Практичне значения роботи. Розроблена технология приготу-вання ¡ммобШзованнх ферментннх препарат1в. В науково-госпо-дарському дослш на курчатах-бройлерах установлено, що засто-сування стабшзованнх фермецпв ¡з розрахунку 5,6 од. нротеоль тично! активное™ для протосубтилшу Г20х та 30 од. целюлолтщ-но1 активное^ для целотерину ГЗх на 1 кг корму шдвшцуе при-р1ст жив01 маси та знижуе витрати корму на одиницю продукци.

Апробацдя роботи. Результат» дослщжеиь допов1далнся на Рес-публпсанськш науково-практичши конференци «Викорпстання природнпх цеолтв Сокирницького родовища в народному госпо-дарствЬ (м. Внноградово ЗакарпатськоТ обл., 1990), на VI Укра-Тнському бюх1м1чному з'1зд1 (Кит, 1992), па науковш конференци, присвяченш 70-р1ччю Дншропетровського с1льськогосподарсь-кого шетитуту (Дшпропетровськ, 1993), на науково-практичши конференци «Бютехнолопя ветеринарних препарате» (Харюв, 1993).

Публшацп. Матер1али дисертацп викладеш в п'яти роботах, в тому числ1 в двох опублшованих роботах, одному патент! на вп-нах!д.

Об'ем 1 структура роботи. Дисертащя викладена на 152 сто-ршках машинописного тексту 1 складаеться з вступу, огляду л1-тературп, власних дослщжень 1 обговорення Тх результате, заключения, висновюв, пропознцш виробнпцтву та списку викорис-таноТ лп-ературн (270 джерел, в т. ч. — 109 заруб1жних). Робота ¡люстрована 17 таблицями та 11 малюнками.

МАТЕР1АЛ I МЕТОДИКА ДОСЛЩЖЕНЬ

ДослЦжения проводили в еколого-бютехнолопчнш лаборато-ри та вивар1уип Б1лоцерк1вського сшьськогосподарського ¡нституту протягом 1987—1991 роюв.

Для ¡ммобшзаци використовували ферментш препарата протосубтилш Г20х та целотерин ГЗх Ладижннського бшх1м1чного заводу, в якост1 нос1я був викорнстаний цеол1т тонкого помелу сорту А Сокирницького родовища ЗакарпатськоТ область

lMMo6Lii3auiio протосубтилша Г20х проводили при рН 7,2 в 10 мл фосфатного буферу протягом двох годин при постпшому псремнпуванш з розрахунку 60 мг ферменту на 1 г ноа'я. ГммобГ л1заппо цслотсрнну ГЗх проводили в 10 мл води протягом 0,5 годин при nocTinnoMy ncpcMiшуйаш11 та иаваптажсшп 200 мг ферменту на 1 г посмя. Одержан! прспаратп вииилялп фиьтруванням з подальшим просушуванням при 20—25 °С.

Залежшсть каталтнпюТ активное^ гид pll впзначалн при 30 °С шкубуючи на нротя-и' двох годнн нативш та ¡ммобшзоваш фермептн з однаковою початкового актпвшстю п буфсрннх роз-чннах ¡з значениям рН вщ 1,5 до 8,0 (крок 1 од.). Величину рН внзначали на рН-метр1 «М-120». Залежшсть каталтнию! актив-HOCTi в1д температура оцшювалп в штервал1 20—100 °С, витри-муючп розчнни пативних та ¡ммобЫзованих ферменпв в буфер! при заданш температур! протягом 30 хв. К!лы<!сть б]'лка на носи впзначалн за зппженням його концентрацп в реакшйнш cyMiuii, яка вишрювалася за О. Н. Lowry et al. (1951). Максимальну 1нвпдк!сть фермеитативно! реакцп та константу А'Ихаелка знахо-дпли граф!чним методом Лайму!вера-Берка.

Каталпнчну активгпсть протосубтнл!па Г20х впзначалн за про-теолггичною актпвшстю модпф!кованим методом Ансопа за ГОСТом 20264.2—88. Каталкичну активш'егь цслотсрнну ГЗх впзначалн за целюлол!тнчного актпвшстю, використовугачи як субстрат ф!'лырувальшш па nip i впзначагочн киьшеть вшгавлених цук-piB фернщашднпм методом Т. Ghose et al. (1981), який описании А. П. Синицишш та in. (1990).

В науково-господарському дослШ внвчалн вплпв ¡ммебшзо-ваиих фермеплв па 6ioxiMi4iii показники та продуктнвшеть кур-чат-броилер1в кроса «Бройлер-6». Групп формувалнея ¡з добових курчат, по 50 голт в rpyni. Утрнмання — клккове. Год1влю зд1йс-нювалп за нормами ВАСГШЛ (1983) для а'льськогосподарсько! птищ. Ферментн вводили в корми ступшчасто, в дозах, як1 рекомендован! методнчшгаи вказ1вкамн ВНД1Т1П (1986), зпдно 3i схемою досл»ду (табл. 1).

В 56-денному Biui курчат через 2 годнгш шеля год1'вл1 декаш-тували, выбирали проби тканин грудного, стегнового м'яз1в, пе-4ifiKH, кров!, BMicry вола, залозпетого шлунка, xiMyca дванадця-тнпалоТ кншкп, слизовоТ тонкого кишечника. Первннну обробку досл)'джуваного материалу проводили на холод]'.

У вшбраних пробах впзначалн вмют загального бьчка за О. Н. Lowry el al. (1951), амиолпичну актнв!п'ст1> за кьчьюстю розщеплепого крохмалю за ГОСТом 20261.4—89 (1989), протео-лггпчну та целюлолкнчну акшвшеть методами, що оннсаш ви-ще для ферментнпх npenapaiiB, актнвшеть амшотрансфераз — за Т. С. Пасхшога (О. О. Покровськпп, 1969), активн1сть лужно! фосфатази — за A. Bodansky (О. О. Покровськнй, 1969), РНК та

Т а б л и ц я 1

Схема науково-господарського дослщу, п = 50

Групп

Добавки, що вводилися в основпнп рад!сн (OP)

К.1лы:1сть на 1 кг корму

Контроль I ОР —

Досл1дш': II OP-f-цеолЬ" 2,5 г

III ОР+лротосубгил'ш Г20х наишшш 5,0 од. про'геол1тично1 пост! акпт-

IV OP-j-npoTocyonuiin Г20х ¡ммобшзований 5,0 од. протеолиичцо? ПОСТ! актив-

V ОР+цслотерип ГЗх натнвшш 30 ОД. ЦеЛЮЛЭЛШПЦо! iiocii актив-

VI ОР+целотер'Ш ГЗх ¡ммобшзовашш 30 СД. Ц('-Л!ОЛ')ЛГП1Ч1Ю1' HCdi актнв-

VII ОР+протссубтнлш Г20.х нативш'й+целотернп ГЗх натнвшш 5,6 од. прогеолшпшо! актив-,ност1-)-30 од. целюлолЬ тично! актпвнэсп

VIII ОР+ПрОГОСубтИЛШ Г20х ¡ммобшзованнй+ целотсрии ГЗх ¡ммобь л!зованнй 5,0 од. иротсолЬичнсм актпв-nocTi-f-ЗО од. цслюлол!-тмчпо! актизпост!

ДНК — за Р. Г. Цансвим 1 Г. Г. Марковпм (1960), загалын, битков} та сульфпдрильш групп кнзькомолекулярних сполук спектро-фотометрично на СФ-16 за Е. Ь. ЕПгпап (1959), гликоген — «прямим методом», я кий впкладено Н. П. Мешковою та С. Е. Северь ним (1979), глюкозу — фсрментатпвно бютестом ЬасЬета (Че-хословаччнна) на ФЕК-50М. Вщпоспу пожнвиу цшшсть м'яса ви-значали з допомогою тест-об'екта Тетрахгаепа пнриформю за методикою, що описапа В. Я. Шаблш та ш. (1983).

Одержан! цифров1 даш оброблялп бюметричним методом (В. М. Мончевичюте-Ершгсме, 1964).

РЕЗУЛЬТАТ И ДОСЛЩЖЕНЬ ТА IX ОБГОВОРЕННЯ '

1. Модслын дослан по оптим!зацп умов для ¡ммобшзаци ферментннх препарат!«

В досл'иах in vitro нами впзначеш оптнмальш умовн для ста-бшзацп ферменгнпх препаратов прстосубтилшу Г20х та целоте-рину ГЗх вшювшш протеолггичпого та целюлолкичного спектр1в Aii. ¡ммобшзацпо фермитв здшенювалп адсорбщйним методом з впкористанням у якоеп нос1я природного алюмоашкату — цео-л!ту. Обрашш пол!анюншш nocift мае bhcoiu адсорбуюч] власти-

юст1 1, що суттево, впкористовуеться в годш.'м альськогосподар-:ько'1 птнщ.

Процес адсорбаип ферменту на носно вщбуваеться, в основному, !а рахунок елсктростатпчноТ взаемоди м1:к макромолекулою 65л-са та поверхпею ноа'я, тому мл вивчплп ряд чпшшкш (значения >Н, температур», складу та юшкл гили розчппу, часу шкубадп, С!льк1'сного сгивш'дношеиня носш, фермента га розчппу), пра-шлыпш впб1р когрпх обумовлюе уешшне проведения ¡ммобкги-¡au.iT.

В табл. 2 наведет' оптималып ф1зико^м1чш иараметрн для 1ДсорбщТ фермеипв, при якнх нротосубшлш Г20х збер1г 85,7%, 1 целотерин ГЗх — 68% каталпично! активное™ натнвних попс-)едннк1в. При цьому нами встановлено, ¡до актившеть моднфшо-заного протосубтнлшу Г20х змсншуеться в ряду буфср1в: фосфат-пин, дитратннй. боратний, адетатнии, а модифшоваиого делотери-ну ГЗх в ряду: ацетатний, фосфатннй, боратний. 1з збкпыиснням ¡онноТ силн розчпну, незалежно в1д його складу, фермеитатнвна активность препарате, ят булн одержан!, знижувалася. ДоСлщи, ироведе1Й нами, показали збереження впеоко! каталггичпо! актив-пост! (65%) целотернну ГЗх при !ммобшзанЛ Гюго у водь що дозволило значно спростити та здешевнтн технологию прнготуван-[щ ¡ммоб!л!зованого препарату. Протосубтилш Г20х при ¡ммобь":!-зацц у вод! втрачав 80% початково! активность

Т а б л н ц я 2

Ф13ико-х1м!ч1п параметри ¡ммобЫзашУ ферменп'в (носи"! — цеолп)

Показншчи

'Рсрментш прспара гн

прогосуотнлт Г20х

цело 1 ершт ГЗх

Середовшце фоссЬатшш буфер ацетатний буфер

рН '7,0—7,4 5,8—6,2

Температура, "С 20—25 20—25

Концентраш'я ферменту, мг/10 ил 60 200

ЕмЮСТЬ НОС1Я, мг/1 г . .

максимальна 29,8 23,0

оптимальна 22,5 19,6

Час, хп 120 30

СпоЫб перемннуванпя перемпиувагшя

Актившсть ферменту: од/г 3,6 8,7

% 85,7 68,0

В результат! дослЦжень по визмаченшо.максимально! юлькосп бика, здагного адсорбуватися гга поверх»! ноа'я, нами була знай-дена оптимальна емк!сть цеол!ту, яка виповЬтае найб!льшому ви-ходу фермеитативпо! активиост! (табл. 2). При максимальному

навантаженш ноЫя вщбувалося зниження питомо! активное™ фер-

мент!в.

j

2. Вивчення властивостей ¡ммобЫзованих фермент!в в умовах in vitro

Результати модельних дослшв по пор1вняльному вивченшо властивостей нативних та {ммобШзованнх фсрмснт1в дозволили внявитн переваги стабшзованих препарате щодо таких денату-руючих miHHHKiB як рН i температура.

ГПсля двогодинно! шкубацп в буферннх розчинах в штервал1 рН bU 1,5 до 8,0 ¡ммобипзоваш ферментн збереглн достатню ка-талГгичну aKTiiBHicTb при значениях рН, критичних для нативних препарат1в. Граф!чне зображення рН-залежнос™ активное™ на-тивпого та ¡ммобЫзованого протосубтнлшу Г20х показало значне розширення рН-профичю в 6iK кисло!" зонн для стабшзованого ферменту (мал. 1), що особливо важливо при використанш його в ф1зюлопчних умовах. Для нативного та ¡ммобшзованого проти-субтшпну Г20х рН-оптимуми зб1галися i вщповшали значению 7,2. При рН 4,0 нативний фермент необоротньо шактивувався, в той час, як 1ммоб1л1зований збер1гав 42% свое'1 початково!' активность

Для ¡ммобЫзованого целотернну ГЗх спостер^али розширення рН-профшю як в кислу, так i в лужну зонн (мал. 2), i при значениях рН 2,0 i 8,0 вщбувалося зниження катал!тнчно!" активное™ лише на 14 i 8% в1дпов1дно. Нативний целотерин при рН 2,0 36epir 20% активность а при рН 8,0 — 30%. рН оптимум для нативного целотернну знаходиться в штервал} 4,8—5,8, для ¡ммо-бупзованого ферменту Bin був зм1щений на одиницю в лужну зону.

Крив! термошактиваци нативного та ¡ммобшзованого прото-субтилшу Г20х евщчать про те, що теля 20-годинно! шкубаш!" фермен™в при 60 °С стабк^зованин протосубтилш Г20х втрачав 50% активность нативний — 90% (мал. 3).

KpuBi термошактиваци нативного та 1ммобшзованого целотернну ГЗх мали р1зний характер (мал. 4), що можна пояснити складом целотернну ГЗх, до якого входить комплекс целюлолпнч-них ферментш, що мають pi3tiy адсорбуючу здатшеть при ¡ммобь 'Л1зацп. Нативний целотерин шактивувався шеля 15-годинно!" in-кубацп при 60 °С; ¡ммобшзований збер1г 40% активное™ шеля 20-годинно! ¡нкубаци при 60 °С.

Константа Мнхаелка та максимальна швпдюсть ферментатнв-ноТ реакцп при 1ммобшзаци протосубтилшу Г20х не змшилнея. 1ммобшзащя целотернну ГЗх сприяла зб1лыпенню уявно! кон-станти Михаелка в 1,4 рази i зменшенню швндкосп розкладу фермент-субстратного комплексу в 2,2 рази.

so

бa

w го

8 Ю

m to

sa to га

s ю

-pH

Мал. l. рН-залсжпкть активное-tí нативиого (I) та шмобшзо-ваного (2) протосубтилину.

Мал. 2. pi I-залежшеть актнвнос-tí нативного (I) та ¡ммобЫзо-ваного (2) целотерину.

'О 15 20

70 is за

Мал. 3. KpuBi TcpMoiiiaKTimauiï протосубтилину нативного (1) та iMMo6i,iÍ30Banoro (2).

Мал. 4. Крит термошактнваци целотерину нативного (1) та ¡м-мобЫзованого (2).

3. Вплив згодовування ¡ммобшзованих препарате на актившсгь травних ферментш курчат-бройлер*1в

Вивчення мехашзыу д!Т ¡ммобшзованих фермент1в важлнво як з теоретично! так \ з практично! сторш, тому нами був постав-лений науково-господарськнй дослит, на бройлерах, результата якого свичать про ефектившсть засгосувания ¡ммобшзованих бюпрепарат1в.

Д]'я протеолггичннх та целюло.;итнчних фермент ¡в повинна бути опосередкована шляхом шдвищення ферментативно! активность тобто поснленням пдрол1зу бшюв та вуглевод1в корму в шлун-ково-кншковому трактк

3 наведеннх в таблиц! 3 дапих видно, що згодовування екзо-генних фермент1в обуыовило шдвшцення протсолтшно!' активнос-Т1 (Р<0,05) в х!мус1 дванадцятипалоТ кишки бройлер!в. Виявле-ш суттев1 «¡жгрупов! вщмишосп дають шдставу стверджуватн, то ¡ммобшзоваш фермеити функцюнально актившнп ш'ж натнв-т. В х1мусп курчат, як1 одержувалп нативннй та ¡ммобшзованнй протосубтнлш Г20х, протеолкична актнвшсть збьтьшилась в1дпо-В1дно на 55,2% (Р<0,02) та 75,2% (Р<0.05). а патпвннй та ш-мобшзований целотерин ГЗх — па 50,1% (Р<0,05) та 78,7% (Р<0,02). Значне збьтынення прогеолшшноТ активное^ шд впли-вом ¡ммобшзованого целотерину ГЗх, фермента целюлолш1чного спектра ди, викликано, на пашу думку, шдвищенням доступност! компоненте деградованих ним рослпнних клтш дп ендогенних протеаз. ГПдтвердженпям цьому е наведет в табл. 3 да\п визиа-чення целюлолтпто! активность Целюлолшнша активность х!муса дванадцятнпалоТ кшнки бройлер1в, в ращоп яких входив ¡ммобш-зованнй целотерин ГЗх, збишшена на 94,2% в пор!внянш з гру-пою, яка одержувала нативний фермент. Оид визначитн тдвн-щення целюлазного фону в х1мус1 курчат, котрнм згодовували як нативний, так { ¡ммобшзованпй протосубтилш Г20х, а також ферментш композицп.

Таблица 3.

Ферментативна активность вм!сту шлунково-кишкового тракту бройлер1в

(М+т; п =5)

Групп Прогеолтшна, мк-скв. т!р/хв. Пелюлол!тична, од/мл Лмкчскктпчна, мг розщепленого крохмалю/мл Лужна фосфатаза, мг % Р

I 0,315+0,016 II 0,313+0,020 III 0.489+0.038" IV 0.552+0,052* V 0.473 + 0,049* VI 0.563-^0.050* VII 0,450+0,056* VIII 0,465+0,041* *Р<0,05. 0,098+0,045 0,106+0,049 0,442+0,088 0,774 + 0.0614 1.350+0.072* 2,428+0,144* 0,860+0,066* 0,984 + 0,165* 255,1+20,06 256,7+20,03 285,0+16,32 3?1.1 + 12Я0г 292,9+17,79 327,9 + 19.25* 287,8+12,93 301.8+26,25 1588,5+59,05 1505,0+37,85 1817,2+51.11* 2180,0+113.50* 2400,2+39,19* 2723,5+49,05* 1916,5+37,58* 2504,7+51,97*

Введения в ращон бройлер1в натнвппх формата не впкликало у'ттевнх змш в амйтолшщнш активное™ (табл. 3). Вфопдне эктьшсння цього показннка (Р<0,05) в!дм!чено при згодовуваиш урчатам ¡ммобшзоваиих препаратпв.

Додавапня в корм мультиепзнмноТ композпци, яка складаеть-I ¡з нативнпх ! 1'ммоб1Л1'зоваш1х фермат'в, вплннуло на актив/петь равпих фермат'в манною ¡трою, шж окремо взя™ ферментн, № можиа пояенптп як автол1зом, так 1 протеол!зом бктковпх мо-екул, що знаходяться иоряд.

4. Показники обмшних процеав в кров1 та тканинах курчат-бройлер!в

Внвчнлн комплекс б!ох!м!чиих показнию'в, ¡до характеризують тан бюсинтетичннх нродеав з метою збереження напруженос™ [етабол!чннх реакции як! вщбуваються в оргашзм! птиц! при вве-енш в корм ¡ммобЬЛзованнх фермент!в.

В результат! проведенпх дослшкень (табл. 4) остановили, що м'сг загального бика в зимуЫ дванадцятипалоТ кишки курчат, к! одержали ¡ммобкЛзованни протосубтнл!п Г20х зменшився па 7,4% (Р<0.05). а при внкорпсташн ¡ммобшзованого целотернну "Зх на 32,4% (Р<0,05), що корелюе ¡з зб!льшенням протеол!тнч-юТ актнвност! в них трупах ! св!дчать про шдвищення швидкост! ¡дрол!з_у бьткш корму та посплсния вс.моктування продукт1В роз-ичпленнн. Згодовувапня нативнлх ферметчв суттево не вплннуло [а р!веиь 61'лка у вш'сп' кишечника.

Т а б л и ц я 4

Виист бкчка ! актившеть амжотрансфераз в Х1муа дпанадцятипалоТ кишки бройлер!в (М+т; п=5)

Акгивтсть амжотрансфераз, мкМ гпрувату

Групп Биток, мг °!а АсТ АлТ

I 3447 + 193,1 239+14,7 45+3,4

11 3323+219,6 244+14,6 41+3,0

III 3423+247,1 284+12,3* 49+3,8

IV 2687+219,1* 305+9,7* 55+2,5*

V 3743+283,7 310+15,8* 48+4,2

VI 2585+263,8* 310+11,6* 60+2.8*

VII 3374+304,0 266+13.5 . 45+3,4

VIII 2890+163,9 320+13,6* 48+3,4

ЛР<0,05.

В сйроватщ KpOBi 6poi'mepiB дослшшх груп (табл. 6) концентрация бшка не вЦр1знялась вщ контролю. Змнш в бкчковом) спектр! печшкп та м'яз1в (табл. 5, 7) вщбувалнся неоднозначно, певно, в наслЦок спецпф1чност1 цнх тканин. Проте, ¡ммобшзоваш ферменти сприяли збиьшенню вмюту битка в печшщ та стсгно-вому м'яз1 на Biporiдну величину (Р<0,05).

Односпрямовашсть 3miii метабол1зму битка та нуклеТновнх кислот, зокрема РНК. епостерп'алася нами при впзначеши кон-центрацп РНК та ДНК в печшш бройлерт (табл. 5). Найбиьша б'1лок-синтезуюча здатшсть була встаповлена в трупах курчат, як! одержувалн {ммобшзоваш ферменти. Вмкт РНК в печшщ збиь-шнвся при додаванш ¡ммобшзованого протосубтилшу Г20х на 48,9% (Р<0,01), шмобшзованого целотерпну ГЗх — на 49,5% (Р<0,001); HaTHBHi протосубтилш Г20х та целотернн ГЗх виклп-кали збитыпення концентрацп РНК вшкшдно на 26,3% (Р< <0,02) та 29,0% (Р<0,01).

Введения 1ммобшзоваиих препарате шдвшцило актившсть фермеьтв переамшування, особливо аспартатамшотрансферази, в слизовП! тонкого кишечника бройлер1в (табл. 4), пом1тно не вплн-ваючн при цьому на 'fx актившсть в Kpoei (табл. 6). В печшщ курчат, що одержували {ммобшзоваш ферменти, внявлено в1ропд-не зб1льшення активное™ амшотрансфераз (табл. 5), проте в такому пол1функщональному oprani, як печшка, актив1защя фермен-т1в переамшування може бути викликана не т1льки синтезом 61л-ка, але i ¡ншими процесами, як1 в шй вщбуваються.

AKTHBHicTb лужноГ фосфатази (табл. 3) в слнзов1й тонкого кишечника була зб!лыиена у Bcix трупах бройлер1в, котрнм згодо-вували ферментш препарати. Найбмьша фосфатазна актившсть була встановлена в елнзовш кишечника курчат, яю одержували як нативнпй (Р<0,001), так i ¡ммобшзований (Р<0,001) целотернн ГЗх.

В сйроватщ Kpofii курчат, в ращон яких включали ¡ммобшзо-ваннй целотерин ГЗх, актившсть лужно! фосфатази була також шдвшцена (Р<0,005); в peuiTi дослиних груп вона залишалася на piBHi контролю (табл. 6).

Отримацц нами даш свЦчать про актшпзашю npouecis пдро-л1зу вуглевод1в, як1 надходять з кормом, ццо м!стнть ¡ммобшзо-Baiii ферменти. 1ммобшзоваш препарати впклнкали в^ропдне збитыпення глюкозн в енроватш Kpoei (табл. 6); в шших доелм-них трупах с.постер1гали тендеишю до ii збишшення. Поснлення целюлолп"пчно\' активное™ спримло пакопиченню гликогену в печшщ курчат (табл. 5). що одержували ¡ммобшзований протосубтилш Г"20х. на 8,6% (Р<0,05), ¡ммобшзований целотерин ГЗх — на 22,8% (Р<0,001) та мультнензнмну композпщю ¡ммобшзованих фермен™в на 4,1%) (Р<0,05).

Eiox¡m¡4h¡ показннки печшки бройлер1В

(M+m; л =5)

Групп Б]лок, мг/г сиро!" тканшш Иуклсм'нов! кислоти, M г % Р Актпвшсть ачшслрансфераз, мк.\\ ni пункту Г.ъкогсн, M г %

ДНК РНК ЛсТ ЛлТ

I 148,6+5,45 4,3 + 0,37 21,5+0,88 417+26,4 57,6+4,28 1738+67,8

II 145,4+7,46 4,5+0,39 21,9+0,78 393-и 16,7 55,2+2,78 1630^-48,3

III 163,4+6,23 4,9+0,36 27,1 ±1,01* 477±32,7 56,4+2,20 18814-43,7

IV 183,6+9,77* 4,6+0,54 31,9+1,17* 580-^-31,0* 70,2+3,09* 2032±54,6*

V 174,4+5,97* 3,9+0,31 27,7+1,03* 532+20,3* 76,8+6,19* 2005+44,3*

VI 182,6+6,05* 6,6+0,53* 32,1+0,82* 559+40,9* 86,4+3,47* 2104+48,7*

VII 153,4+9,44 4,5+0,41 22,7+0,88 453+25,8 76,8+5,16* 1771=41,8

VIII 180,2+13,28 4,2+0,37 22,1+0,99 549+31,2* 78,6-1-7.96* 1942-49,2*

*Р<0,05.

Т а б л и ц я 6

BíoxímWhí показники сироватки кров! бройлерт

(M+m; п=5)

Акт ив niel ь амшотрапсфераз,

1ллок, Глюкоза, мкМ трувату Лужна

Групп

г 7о м г % ЛсТ АлТ Фисфа газа, M г Si Р

I 3,65+0,13 218,7+6,47 1,12+0,069 0,24+0,018 27,3+0,95

II 3,69+0,08 226,0+19,04 1,12+0,040 0,25+0,022 26,6+0,55

III 3,91+0,04 247,3 + 12,32 1,20+0,079 0,28+0,022 29,3+1,22

IV 3,95+0,08 277,3+15,55* 1,31+0,118 0,31+0,019* 28,8+0,81

V 3,67+0,09 252,8+24,01 1,35+0,088 0,27+0,027 29,3+1,88

VI 3,94+0,11 265,6+12,19* 1,30+0,074 0,34+0,095 33,3+1,18*

VII 3,74+0,06 247,1+20,74 1,24+0,106 0,27+0,021 27,0-^0,81

VIII 3,88+0,12 254,1+24,77 1,24+0,134 0,30+0,027 29,2-+-0,75

*Р<0,05.

Т а б л и ц я

Продуктивнкть I яюсть м'яса бройлер1в

(М+т; п=5—50)

Юлььлсть Слдку в м'язах, мг/г сироЧ тканини Маса на кшець доелда, г В^дносна Витратн

Групп груднин стспювий пожнвна цшшеть, % корму II 1 кг при росту, к

I 233,4+6,35 195,4+8,21 1358,0+43,04 100,0 2,57

II 235,0+9,67 198,4+8,18 1318,0+41,67 106,8 2,63

III 222,6±10,20 225,4+7,74* 1471,5+54,40 105,1 2,44

IV 256,4+13,69 230,6±6,67* 1566,0+61,77* 110,9 2,32

V 234,8+ 18,25 194,0+5,77 1487,5+54,96 106,8 2,41

VI 254,0+10,08 230,2+8,13* 1634,0+56,85* 99,6 2,30

VII 233,6+6,82 207,2+4.65 1309,5+56,73 101,0 2,63

VIII 246,8+11,18 232,4+7,35* 1605,5+56,83* 105,4 2,33

*Р<0,05.

5. Вплнв !ммобшзованих ферментов на живу масу бройлеров та нитрату корлив

Наведет в табл. 7 дат св1дчать, що найбиьша продуктивп;ст була одержана в трупах курчат, яю отрпмували шмобшзова1 ферментп. Включения в ращон ¡ммобшзованого протосубтилш Г20х, як ни мютить 5,6 од. протеолггично! активности забезпечил збЬтьшення приросту живо! масп на 15,3% (Р<0,05), ¡ммобшзс ваного целотернну ГЗх, я кий М1стить 30 од. целюлолпичноТ эктне ноет!, на 20,3% (Р<0,01). При цьому витратн корму на 1 кг прт росту були зменшет на 10,7% при введенш ¡ммобшзованог прогосубтнлшу Г20х та на 11,1% — {ммобшзованого целотерин ГЗх. Використання в год1вл1 бройлеров мультиензимно! композг цп ¡з ¡ммобшзованнх фермашв призвело до збктьшення живс масп на 18,2% (Р<0,01) та зменшенню витрат корму на 10,3%

Вшюсна пожнвна цшнюгь м'яса курчат-бройлер1в не зменши лась при введенш в корми як нативних, так 1 1ммобшзованн ферменпв (табл. 7).

висновки

1. Встановлена можлнв1сть одержання стабшзованпх фермент них препарате протосубтилшу Г20х иротеолшпшого спектру Д11 целотерину ГЗх целюлолтппюго спектру Д11 з використанням якосп нос1я цеолпу.

2. Визпачеш оптималып ф1зико-х]м1чш параметри (рН, тем

перйтура, час, склад та ionna сила розчину, концентращя ферменту, сшввщношення шгред1еттв) процесу ¡ммобЫзацй', при якпх В1шд aKTHBHOCTi для ' протосубтилшу Г20х складае 85,7%, для целотерину ГЗх — 68%.

3. Внвчеш кшетико-термодинам1чш характеристики нативпнх i ¡ммобЫзованнх протосубтнлшу Г20х i целотерину ГЗх, як-i cbí,t-чать про впсоку стабкпьшсть i каталп-пчну актившсть модифжо-вапнх npenapaTÍB в умовах, критнчних для нативних форм.

4. СтабЫзоваш фермсптш препаратп, при введешн íx в ком-б'жорм курчат-бройлср1В, штенспфжують i иоглиблюють пдроль th4hí процесп в шлунково-кишковому трактй що проявляешься зпиженням р1вня бшка, збиьшениям протеолтпшо!, а?.плол1тнч-iío'í та и.елюлол1тп,:по1 активностей, гндвищеиням активное™ aMi-иотраисфераз та лужпо! фосфагази.

5. Збагачення комбжорму броплер1в ¡ммобЫзоваипмп ферментами актив1зуе процесп ¿Носпнтезу за рахунок шдвшцеиого пад-ходжения продукпв катабол1зму, про що свЦчать збиьшення концентрацм бижа, PIIK i глжогену в печшш, накопнчення бика в м'язах.

6. Введения ¡ммобй'пзованнх ферменпв в комбжорма пс вплн-вае на актившсть фермегтв иереамшування в Kpoei i м'язах, pi-вень бижа в кров!, що може бути свечениям регуляци метабол1ч-ного забезпеченпя анабол1чпнх nponeeiB.

7. Згодовування курчатам-бройлерам комб(корм1'в, збагачених ¡ммобшзозаними ферментами в дозах 5,0 од. иротеолттюТ ак-thbhoctí та 30 од. целюлол1тично1 активное™ на 1 кг корму, гпд-вищуе npupicT живо! маси на 15—20% i знижуе внтратн корму на 10—11%.

ПРАКТИЧН1 ПРОПОЗИЦИ

3 метою ефективного використанпя дорогокоштуючих фермен-тних npenapaTÍB, а також для гпдвищенпя продуктивное™ i знижен-пя витрат корму па одипнцю продукци рскомендуеться збагачува-ти комбжорм курчат-бройлер1в ¡ммобшзоваинми протосубтилшом Г20х в доз1 5,6 од. протеолп'ично! активное™ i целотерииом ГЗх в доз1 30 од. целюлолп'ичноТ aKTHBHOCTi на 1 кг корму.

СПИСОК ОПУБЛ1КОВАНИХ РОБ1Т ПО TEMI ДИСЕРТАЦИ

1. Герасименко В. Г., Битюцкий В. С., Селезнева А. А. Способ получения иммобилизованного препарата с глюкоамилазной активностью, используемого, предпочтительно для кормления цыплят. Заявка № 4844414/13 (045982) СССР, приоритет 23.04.90 г. Признана изобретением 16.12.91 г.

2. Герасименко В. Г., Битюцкий В. С., Распутний А. И., Девеча И. А., Селезнева А. А.,Прокопишш1а Т. Б. Использование цеолитовых пород Сокпрниц-кого месторождения для стабилизации биологически активных веществ //Ма-

териалы Республиканской научпо-практической конференции «Использование природных цеолитов Сокирнпцкого месторождения в народном хозяйстве». — Виноградово, 23—24 окт. 1990 г. — Черкассы, 1991 г. — С. 76—77.

3. Герасименко В. Г., Селезньова О. О. Використання екзогенного прото-субтилшу Г20.\ в кормових шлях //Тезн допопией VI Украшського бюх1м1чно-го зЧзду. — Киш, 1992. — Ч. 2. — С. 18.

4. Герасименко В. Г., Девеча I. О., Селезньова О. О. 1ммобшзац1я фер-ментних препаратш иротосубтилшу Г20х I целотерину ГЗх для використання у тваришшцтв1 //Тезн допов1'дей иауковш конференци, присвячешй 70-р1ччю Дшпропетровського сйчьськогосподарського ¡нституту. — Дшпропетровськ, 1993 (в друку).

5. Герасименко В. Г., Селезньова О. О. Стабшзацш ферментного препарату протосубтнлш Г20х з метою використання його в тваринництв! та ветеринара //Тезн доповдай науково-практично! конференци «Бттехнолопя ветеринар-них препарате». — Харюв, 25—26 травия, 1993 (в друку).

Здано до набору 26. 07. 93. ГПдписано до друку 12. 08. 93. Формат 60Х84'/16. Бумага друк. Друк високий. Ум. друк. арк. 0,93. Тираж 120 пр. Зам. 1730.

МПП «Биюцеркшмтькдрук», 256400, м. Б. Церква, бул. ОлександрШський, 22а.