Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция активности бактериальной каталазы в межмикробных взаимодействиях

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сгибнев, Андрей Викторович

Страница

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. РЕГУЛЯЦИЯ МЕЖКЛЕТОЧНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В МИКРОБНЫХ БИОЦЕНОЗАХ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1. Регуляция метаболизма у бактерий.

1.2. Факторы межмикробного взаимодействия.

1.2.1. Литические ферменты.

1.2.2. Бактериоцины.

1.2.3. Феромоны.

1.2.4. Антибиотики.,-. —.

1.2.5. Органические кислоты.

1.2.6. Пероксид водорода.

1.3. Бактериальная каталаза.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДА ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Общая характеристика, методы выделения и идентификации штаммов, использованных в работе.

2.1.1. Характеристика штаммов микроорганизмов, использованных в работе.

2.1.2. Методы выделения микроорганизмов.

2.1.3. Методы идентификации выделенных штаммов микроорганизмов.

2.2. Методы изучения биологических свойств бактерий.

2.2.1. Метод получения супернатантов культуральной жидкости и клеточных экстрактов бактерий.

2.2.2. Метод изучения влияния клеточных и внеклеточных микробных метаболитов на ростовые характеристики бактерий.

2.3. Методы изучения влияния клеточных и внеклеточных микробных метаболитов на активность каталазы S. aureus.

2.3.1. Метод определения начальных скоростей ферментативной реакции разложения пероксида водорода каталазой S. aureus.

2.3.2. Метод определения типов ингибирования каталазы S. aureus микробными метаболитами.

2.4. Методы статистической обработки полученных результатов.

ГЛАВА 3. ХАРАКТЕРИСТИКА МИКРОФЛОРЫ РАЗЛИЧНЫХ ЭКОТОПОВ ТЕЛА ЧЕЛОВЕКА ПО СПОСОБНОСТИ ИНГИБИРОВАТЬ КАТАЛАЗУ МИКРООРГАНИЗМОВ.

3.1 Разработка метода определения каталазной активности микроорганизмов.

3.2 Разработка способа выявления у бактерий ингибиторов каталазы микроорганизмов.

3.3 Распространенность способности ингибирования каталазы микроорганизмов у бактерий различных групп, выделенных из биотопов тела человека.

3.3.1 Распространенность и выраженность способности ингибирования каталазы микроорганизмов у бактерий, выделенных из женского репродуктивного тракта.

3.3.2 Распространенность и выраженность способности ингибирования каталазы микроорганизмов у бактерий, выделенных из переднего отдела уретры мужчин.

3.3.3 Распространенность и выраженность способности ингибирования каталазы микроорганизмов у бактерий, выделенных из переднего отдела носа.

3.3.4 Распространенность и выраженность способности ингибирования каталазы микроорганизмов у бактерий, выделенных с кожи локтевой ямки.

3.4. Характеристика гетерогенности популяций микроорганизмов, выделенных из различных биотопов тела человека, по способности ингибировать каталазу микроорганизмов.

3.5. Клеточные и внеклеточные метаболиты бактерий как ауторегуляторы собственной каталазы клетки.

ГЛАВА 4. БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ МИКРОБНЫХ ИНГИБИТОРОВ

БАКТЕРИАЛЬНОЙ КАТАЛАЗЫ.

4.1. Влияние микробных метаболитов на выживание бактерий в условиях перекисного окисления.

4.2. Влияние микробных метаболитов на ростовые характеристики бактерий.

4.3. Влияние хлорида железа (II) на продукцию ингибитора бактериальной каталазы клетками

Corynebacterium minutissimum.

4.4. Клеточные и внеклеточные метаболиты бактерий как регуляторы и ауторегуляторы функционального состояния клетки.

ГЛАВА 5. МЕХАНИЗМЫ И УСЛОВИЯ ДЕЙСТВИЯ МИКРОБНЫХ

ИНГИБИТОРОВ БАКТЕРИАЛЬНОЙ КАТАЛАЗЫ.

5.1. Динамика торможения активности каталазы S. aureus супернатантами культуральной жидкости С. minutissimum.

5.1.1. Динамика торможения активности каталазы в зависимости времени инкубирования. клеток S. aureus с супернатантами С. minutissimum.

5.1.2. Динамика торможения активности каталазы в зависимости от температуры инкубирования клеток

S. aureus с супернатантами С. minutissimum./.

5.1.3. Динамика торможения активности каталазы клеток S. aureus супернатантами С. minutissimum в зависимости от смены среды.

5.1.4. Динамика торможения активности каталазы клеток S. aureus супернатантами С. minutissimum в зависимости от введения ионов железа (И).

5.1.5. Динамика торможения активности каталазы клеток S. aureus супернатантами С. minutissimum в зависимости от насыщенности субстратом.

5.2. Типы ингибирования каталазной активности клеток S. aureus внеклеточными метаболитами различных микроорганизмов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляция активности бактериальной каталазы в межмикробных взаимодействиях"

Микробный биоценоз, являясь совокупностью популяций различных видов бактерий, существует как надорганизменная система, функционально представляющая собой совокупность механизмов, обеспечивающих воспроизведение организмов, оптимизацию их распределения по поверхности экотопа, а также трофические и иные связи особей различных видов, лежащие в основе образования видовых сообществ. Становление и развитие микробных биоценозов, вероятно, происходит с формированием систем, части которых связаны между собой разнообразными отношениями, носящими антагонистический, симбиотический или иной характер. Регуляция и формирование микробного биоценоза обеспечивается явлением межмикробного антагонизма: продукцией бактериями биологически активных веществ (Pahlson С., Larsson P.G., 1991.). Механизмы действия этих факторов, обусловлены продукцией лизоцима (Усвяцов Б.Я., 1986), органических кислот (Митрохин С.Д., Иванов A.A., 1995), бактериоцинов (Егоров Н.С., Баранова И.П., 1999.), перекиси водорода (Hillier с соавт., 1992), достаточно изучены и описаны как, безусловно, антагонистические, направленные на прямое повреждение бактериальной клетки. Кроме того, бактерии и другие прокари-отные организмы синтезируют химические вещества-феромоны, регулирующие различные процессы, связанные с межклеточными взаимодействиями в популяции'одного вида или даже штамма и регулирующие клеточные ферменты (Quirantes с соавт., 1994; Nakayama с соавт., 1995).

В связи с этим возникает вопрос о возможности существования регуляторных механизмов межмикробного взаимодействия, влияющих на состояние не только популяции-продуцента, но и на состояние других членов микробного биоценоза. Например, показана двойственная природа действия лизоцима бактерий, который, способствуя процессу деления, усиливает интенсивность размножения популяции-продуцента, но также может исполнять роль ингибитора на отдельных фазах развития популяции или сообщества (Бухарин О.В., 1985, Кислухина О.В. с со-авт., 1990). Не вполне ясным является знание о влиянии метаболитов бактерий не на функциональную систему клетки в целом, а на отдельные ферменты, обеспечивающие защиту бактерий от каких-либо стрессовых воздействий со стороны, как микробного биоценоза, так и макроорганизма. Одним из таких ферментов микроорганизмов является каталаза (ЕС 1.11.1.6) - фермент, защищающий бактериальную клетку от действия Н202 (Уэбб Д., 1966), как эндогенного, так и экзогенного происхождения (Menendez с соавт., 1997; МоЫеу, 1997; Zemser, Martin, 1998).

Решение вопроса о способности бактерий влиять на активность ка-талазы позволило бы расширить представления о роли различных видов микроорганизмов, как автохтонных, так и аллохтонных, в формировании микробных биоценозов биотопов тела человека, а также разработать дополнительные критерии выявления состояния биоценозов, что определило цель и задачи настоящего исследования.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящего исследования явилось изучение способности микроорганизмов ингибировать бактериальную каталазу и оценка биологической роли этого признака в межмикробных взаимодействиях.

Задачи исследования:

1. Разработка методического подхода к определению эффекта влияния микробных метаболитов на активность бактериальной ката-лазы и изучение распространённости и выраженности этого признака у микроорганизмов различных групп.

2. Определение биологической роли бактериальных ингибиторов каталазы микроорганизмов в системе прокариот-прокариот.

3. Определение условий и механизмов действия бактериальных ингибиторов каталазы микроорганизмов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые обнаружено новое свойство микроорганизмов, заключающееся в способности ингибировать бактериальную каталазу клеточными и внеклеточными метаболитами, для оценки которого предложен «Способ выявления у бактерий ингибиторов каталазы микроорганизмов» (Патент РФ на изобретение № 2180353 от 10.03.2002), основанный на определении активности каталазы тест-штамма Staphylococcus aureus АТСС 6538Р до и после обработки клеток бактерий супернатантами культуральных жидкостей и клеточными экстрактами исследуемых видов микроорганизмов.

Установлено, что факторы, определяющие изучаемое свойство, направлены на регуляцию активности фермента, как во внутривидовых, так и в межвидовых взаимодействиях микроорганизмов.

В результате изучения распространённости и выраженности изучаемого признака показано, что способностью ингибировать бактериальную каталазу обладает большинство изученных штаммов, при этом распространенность исследуемого признака выше у представителей нормофлоры экотопов тела человека по сравнению с аллохтонными видами.

Представители нормальной микрофлоры различных (репродуктивный тракт женщин, передний отдел уретры мужчин, передний отдел носа, кожа локтевой ямки) экотопов - Lactobacillus spp., Corynebacterium spp., коагулазоотрицательные стафилококки обладают наибольшей выраженностью ингибирования бактериальной каталазы метаболитами, тогда как виды Staphylococcus aureus и Е. coli, являющиеся аллохтонными, не обладают высокой выраженностью исследуемого признака.

Показано, что каталазная активность микроорганизмов - представителей нормофлоры в меньшей степени угнетается микробными метаболитами по сравнению с таковой бактерий относимых к аллохтонным видам изученных экотопов.

Оценена роль способности метаболитов бактерий ингибировать каталазу микроорганизмов. Установлено, что снижение уровня каталаз-ной активности микроорганизмов при воздействии бактериальных метаболитов увеличивает повреждающий эффект активных форм кислорода, что определяет их выживание в условиях перекисного окисления.

Отмечено, что наличие у бактериальных клеток собственного или эндогенного ингибитора каталазы и связывание им ионов железа снижает гибель бактерий в условиях окислительного стресса, вызванного малыми концентрациями пероксида водорода, путем предотвращения участия ионов Fe в реакции Фентона.

Установлено, что ингибирование каталазной активности S. aureus метаболитами носит обратимый характер и не является конкурентным.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Полученные результаты о способности бактерий клеточными и внеклеточными продуктами метаболизма ингибйровать каталазу микроорганизмов расширяют знания в области микробной экологии, способствуя пониманию механизмов формирования микробных биоценозов человека.

Практическая ценность работы характеризуется возможностью использования выявленного свойства как дополнительного критерия оценки и изучения состояния микробных биоценозов.

Предложенный «Способ выявления у бактерий ингибиторов каталазы микроорганизмов» (Патент РФ на изобретение № 2180353 от 10.03.2002) может быть использован в микробиологической практике для выявления дополнительных механизмов взаимодействия микроорганизмов в микробных биоценозах.

Методический подход к выявлению определяемого свойства позволяет выявить закономерности новых регуляторных и антагонистических механизмов межбактериальных взаимодействий, как внутрипопуляционных, так и межвидовых, определяющих формирование микробиоценозов.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Способность бактерий ингибировать каталазу является полифункциональным признаком индигенной микрофлоры, ведущая биологическая роль которого определяется регуляцией функционального состояния бактериальной клетки.

2. Механизмы действия вторичных метаболитов микроорганизмов разных групп свидетельствуют о различной природе факторов, регулирующих ферментативные процессы бактерий в системе прокариот-прокариот.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты проведенных исследований доложены на конференциях «Репродуктивное здоровье населения, микробиологические и иммунологические аспекты» (Оренбург, 1999, 2001), III Российской конференции "Персистенция микроорганизмов" (Оренбург, 2000).

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, получен Патент РФ на изобретение № 2180353 от 10.03.2002 «Способ выявления у бактерий ингибиторов каталазы микроорганизмов».

ОБЪЁМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Сгибнев, Андрей Викторович

Выводы

1. Разработан методический подход, выявляющий новое свойство микроорганизмов по ингибированию бактериальной каталазы клеточными и внеклеточными метаболитами, пригодный для оценки межмикробных взаимодействий в биоценозе.

2. Способностью ингибировать бактериальную каталазу обладают к'ак грамположительные, так и грамотрицательные микроорганизмы. Распространенность и выраженность этого признака выше у представителей нормофлоры, чем у аллохтонных микроорганизмов.

3. Каталазная активность автохтонных видов микроорганизмов менее подвержена ингибированию бактериальными метаболитами в сравнений с каталазной активностью аллохтонных видов. Популяции микроорганизмов неоднородны по степени выраженности ингибирования бактериальной каталазы. Среди индигенной микрофлоры преобладают штаммы с высоким и средним уровнем исследуемого признака, у аллохтонных видов - с низким уровнем.

4. Воздействие бактериальных ингибиторов каталазы увеличивает повреждающий эффект пероксида водорода, снижая уровень каталазной активности микроорганизмов, что определяет их выживание в условиях перекисного окисления. 1

5. Наличие у бактериальных клеток собственного или экзогенного ингибитора каталазы и связывание им ионов железа препятствует гибели бактерий в условиях окислительного стресса, вызванного малыми концентрациями пероксида водорода, путем предотвращения участия ионов I V2 в реакции Фентона.

6. Ингибирование каталазной активности золотистого стафилококка супернатантами культуральной жидкости бактерий является обратимым и не является конкурентным. Механизмы и условия действия вторичных метаболитов микроорганизмов разных групп свидетельствуют о различной природе факторов, регулирующих активность бактериальной каталазы.

135

Заключение

Биологические системы регулируются и имеют сложную организацию, которая развивается, начиная от микрокомпартментов, содержащих несколько молекул, через клеточные частицы, к целым живым организмам, таким, например, как микроскопические прокариоты и их популяции, образующие микробные биоценозы. Функционирование подобных сложных структур возможно только при наличии строго регулируемых и координированных процессов. Регулироваться должны активности индивидуальных ферментов по отношению друг к другу, концентрация промежуточных метаболитов при их переносе из одного компар-тмента в другой, множественные взаимосвязи метаболических процессов во времени и пространстве (Stadtmän E.R., .1970; Курганов Б.И., 1986; ГоттшалкГ., 1982).

В настоящее время известен обширный круг микроорганизмов, обитающих в различных экологических нишах тела человека и составляющих устойчивые во времени биоценозы. Микробный биоценоз, являясь совокупностью популяций различных видов бактерий, существует как надорганизменная система, функционально представляющая собой совокупность механизмов, обеспечивающих воспроизведение организмов, оптимизацию их распределения по поверхности экотопа, а также трофические и иные связи особей различных видов, лежащие в основе образования видовых сообществ. Становление и развитие микробных биоценозов, вероятно, происходит с формированием систем, части которых связаны между собой разнообразными отношениями, носящими антагонистический или симбиотический характер. Одним из факторов формирования микробных биоценозов являются антагонистические отношения между микроорганизмами (Pahlson С., Larsson P.G., 1991.). И если механизмы действия этих факторов, обусловленных продукцией лизоцима (Усвяцов Б.Я., 1986), органическими кислотами (Митрохин С.Д., Иванов A.A., 1995), бактериоцинами (Егоров Н.С., Баранова И.П.,

125. ■

1999.), перекисью водорода (НПНег Б.Ь., КгЫт М.А., К1еЬапоН' 8.1., Еб-сЬе-пЬас-Ь Э.А., 1992) и другие, достаточно изучены и описаны как, безусловно, антагонистические, направленные на прямое повреждение бактериальной клетки, то возникает вопрос о возможности существования других, регуляторных, механизмов межмикробного взаимодействия, влияющих на состояние популяции в микробном биоценозе. Например, показано, что лизоцим бактерий, способствуя процессу деления, усиливает интенсивность размножения популяции, но также может исполнять роль ингибитора на отдельных фазах развития популяции или сообщества (Бухарин О.В., 1985, Кислухина О.В. с соавт., 1990). Не вполне ясным является знание о влиянии метаболитов бактерий не на функциональную систему клетки в целом, а на отдельные ферменты, обеспечивающие защиту бактерий от каких-либо стрессовых воздействий со стороны, как микробного биоценоза, так и макроорганизма. Одним из таких ферментов микроорганизмов является каталаза (ЕС 1.11.1.6) - фермент, защищающий бактериальную клетку от действия Н202, как эндогенного, так и экзогенного происхождения.

Решение данного вопроса позволило бы расширить представления о функционировании ферментативных систем в условиях межбактериальных взаимодействий и о роли различных видов микроорганизмов, как автохтонных, так и аллохтонных, в формировании микробных биоценозов биотопов тела человека, а также разработать дополнительные критерии выявление их состояния, что определило цель и задачи настоящего исследования.

Целью исследования явилось изучение способности микроорганизмов ингибировать бактериальную каталазу и оценка биологической роли этого признака в межмикробных взаимодействиях.

Для достижения данной цели были поставлены и решены следующие задачи: разработан методический подход к определению эффекта влияния микробных метаболитов на активность бактериальной каталазы и изучение распространённости и выраженности этого признака у мик

126 : роорганизмов различных групп, определены биологическая роль и механизмы действия ингибиторов каталазы микроорганизмов в внутри- и межвидовых взаимоотношениях микроорганизмов.

Материалом для исследования послужили 613 штаммов микроорганизмов, из них 255 штаммов были выделены из вагинального отделяемого от 68 обследованных здоровых небеременных женщин, 235 - из переднего отдела уретры 81 клинически здорового мужчины, 84 - из переднего отдела носа 31 клинически здорового ребенка в возрасте от 8 до 12 лет, 39 - с поверхности кожи локтевой ямки левой руки. Выделение и идентификацию микроорганизмов осуществляли общепринятыми методами на основании морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических свойств. Изучение биологических свойств микроорганизмов проводили по стандартным методикам. Полученные результаты обработаны с помощью статистических методов!

На первом этапе исследования был разработан методический подход к определению эффекта влияния микробных метаболитов на активность бактериальной каталазы, заключающийся в обработке клеток тест-штамма Staphylococcus aureus АТСС 653 8Р супернатантами культуральных жидкостей и клеточными экстрактами исследуемых видов микроорганизмов и определении активности каталазы тест-штамма в опыте и контроле. В результате изучения распространённости и выраженности признака установлено, что способностью ингибировать бактериальную катал азу обладают большинство изученных штаммов, при этом встречаемость исследуемого признака выше у представителей нормофлоры экотопов тела человека.

Отсутствие различий в распространенности и выраженности признака в средних величинах у аналогичных видов микроорганизмов, выделенных из исследуемых экотопов, свидетельствует о том, что эффект ингибирования микробной каталазы бактериальными метаболитами является видовым признаком и не всегда зависит от места обитания выделенного микроорганизма. Популяции автохтонных микроорганизмов, несмотря на высокую распространенность и выраженность способности ингибировать каталазу тест-штамма, являются неоднородными по экспрессии изучаемого признака. Представители нормальной микрофлоры изученных экотопов обладают наибольшей выраженностью ингибиро-вания бактериальной каталазы метаболитами, тогда как виды бактерий, являющиеся аллохтонными для них, не обладают высокой выраженностью исследуемого признака. Высокая выраженность исследуемого признака является характеристикой представителей автохтонной микрофлоры.

С общебиологической точки зрения представляется вполне закономерной способность микроорганизмов ингибировать бактериальную каталазу, так как в микробиоценозах присутствуют и другие, ранее описанные системы «фермент-ингибитор», классическим представителем которых является система «лизоцим - антилизоцимная активность», которая рассматривается и как фактор формирования микробных биоценозов и как фактор внутрипопуляционной регуляции, также направленный на поддержание гомеостаза биоценоза (Бухарин О.В., 1985, 1999; Гриценко В.А., 2001).

Таким образом, обнаружено новое свойство микроорганизмов, заключающееся в способности ингибировать бактериальную каталазу клеточными и внеклеточными метаболитами - дополнительный критерий, позволяющий характеризовать один из видов межмикробных взаимодействий, определяющих состояние биоценоза, характеризующийся ре-гуляторной направленностью влияния в взаимоотношениях прокариот-прокариот.

На следующем этапе исследования была изучена биологическая роль изучаемого признака.

Показано, что каталазная активность микроорганизмов - представителей нормофлоры в меньшей степени угнетается микробными метаболитами по сравнению с таковой микроорганизмов относимых к аллох-тонным видам изученных экотопов. Установлено, что снижение уровня каталазной активности микроорганизмов при воздействии бактериальных метаболитов увеличивает повреждающий эффект активных форм кислорода, что определяет их выживание в условиях перекисного окисления.

Добавление к бактериальной Культуре пероксида водорода или су-пернатантов не изменяло характер кривой развития популяции во времени по сравнению с контролем, но снижала удельную скорость роста культуры. В тоже время совместное влияние обоих факторов вызывала значительный сдвиг развития периодической культуры. Губительное действие на начальных периодах развития популяции на клетки золотистого стафилококка супернатантов С. minutissimurrv вероятно, объясняется гибелью клеток из-за инактивации каких либо антиоксиданТных систем S. aureus. Наличие у бактериальных клеток собственного или эндогенного ингибитора каталазы и связывание им ионов железа в некоторой степени объясняет снижение скорости гибели бактерий в условия окислительного стресса, вызванного малыми концентрациями пероксида 2

Водорода, путем предотвращения участия ионов Fe в реакции Фентона.

Полученные данные свидетельствуют о том, что выявленное свойство бактерий, заключающееся в способности ингибировать каталазу микроорганизмов, является не уникальным в своей многоплановости биологической роли, так, например, ранее показано, что лизоцим и другие гидролазы, продуцируемые представителями нормальной микрофлоры, не только являются аутолитическими ферментами, ускоряющими развитие бактериальной популяции - продуцента фермента,,но и ее аутоингибиторами и ингибиторами других членов микробного биоценоза (Ленцнер A.A., 1975; Бухарин О.В., 1999).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что микробные метаболиты могут выполнять ряд функций, как в бактериальной клетке, так и в межвидовом взаимодействии бактерий и изучение подобных регуляторных и антагонистических функций позволяют выявить закономерности механизмов межбактериальных взаимодействий, как внутрипопуляционных, так и межвидовых, определяющих формирование микробиоценозов,

В ходе дальнейших исследований было установлено, что характер взаимодействия внеклеточных метаболитов с каталазой S. aureus является эндотермическим, то есть торможение активности фермента повышается с повышением температуры, удаление действующего фактора, то есть многократная смена среды, производимая путем отмывки бактерий центрифугированием, и добавление солей Fe+2 к супернатантам корйне-бактерий с увеличением концентрации приводит к снятию эффекта торможения, увеличение концентрации субстрата не снимает ингибирова-ние фермента метаболитами С. minutissimum. Показано, что торможение активности каталазы S. aureus также зависит и от времени инкубации бактериальных клеток с метаболитами, сначала возрастая, а затем, после часа инкубирования, убывая.

На основании выше полученных результатов установлено, что ин-гибирование каталазной активности S. aureus супернатантами С. minutissimum носит обратимый характер и не является конкурентным, то есть по своей структуре выявленный ингибитор не подобен субстрату изучаемого фермента - пероксиду водорода. Это предположение подтвердилось тем, что максимально достижимая скорость реакции разложения пероксида водорода каталазой в присутствии ингибитора из су-пернатанта культуральной жидкости С. minutissimum меньше, чем в его отсутствие, не изменяется кажущаяся константа Михаэлиса, как в присутствии, так и отсутствие ингибитора. В тоже время установлено, что ингибирование каталазной активности золотистого стафилококка супернатантами лактобацилл является смешанным, что подтверждается тем, что максимально достижимая скорость реакции разложения пероксида водорода каталазой в присутствии ингибитора меньше, чем в его отсутствие, и кажущаяся константа Михаэлиса при йнгибировании увеличивается.

Наличие ингибиторов ферментов у микроорганизмов было показ-но и ранее, так, например, пирофосфатазы Bacillus subtilis, Mycobacterium butyricum, Proteus spp, в нормальной бактериальной клетке тесно связаны с ингибиторами белковой природы (Swartz M.N. с соавт., 1957),

Полученные результаты по типам торможения активности бактериальной каталазы клеточными и внеклеточными метаболитами позволяют расширить знания о конкретных точках приложения ингибитора, о механизмах его действия, направленных на регуляцию клеточных и по-пуляционных структур, и, соответственно, о возможных последствиях этой регуляции в формировании сообществ микроорганизмов.

Применение ингибиторов для регуляции клеток или системы клеток является одним из путей управления биологической системой и превращениями в ней. Сущность такого управления состоит в поддержании или нарушении нормальной деятельности регулируемой Системы.

Изучение биосинтетической активности бактерий привело к открытию регуляции по механизму обратной связи как наиболее эффективного способа самоконтроля метаболизма (Stadtman E.R., 1970; Курганов Б.И., 1986). В общих чертах этот механизм может быть объяснен влиянием, оказываемым на соответствующие ферменты веществами с малой молекулярной массой, которые являются продуктами рассматриваемого метаболического процесса. Несомненно, представляет интерес возможность подобных механизмов регуляции в системе микробного биоценоза. Так, например, в механизмах взаимоотношений между микроорганизмами играет роль не только продукция членами биоценоза антагонистических веществ, но и возможность защиты от них, одним из примеров этому является повышение у бактерий резистентности к факторам микробного антагонизма, рассматриваемое как показатель способности к колонизации биотопа (Бухарин О.В., 1999). Таким образом, и. свойство бактерий ингибировать каталазу является полифункциональным, направленным не только на регуляцию активности фермента, но и на функции клеток и всего микробного биоценоза.

Безусловно, способность "ингибирования каталазы микроорганизмов является одним из антагонистически направленных регуляторных свойств бактерий в смешанных биоценозах, направленных на снижение ростового потенциала и уменьшением выживаемости бактериальных клеток в условиях перекисного окисления в результате ингибирования каталазы.

Небезынтересен факт, заключающийся в способности бактериальных метаболитов снижать гибель микробных клеток при обработке их малыми концентрациями перекиси водорода. Причиной гибели бактерий в этом случае считают возникновение разрывов в ДНК под действием пероксида водорода, опосредованное через свободный тидроксильный радикал ОН0, образующийся при одноэлектронном восстановлении перекиси ионами Ре+2 в реакции Фентона (1т1ау ГА. с соавт., 1988). Бактериальная клетка может защищаться от подобного повреждения рядом способов, которые заключаются или в дополнительной стабилизации ДНК или удалением веществ, участвующих в реакции Фентона (Ткачен-ко А.Г. с соавт., 1999). В тоже время показана низкая эффективность антиокислительных ферментов, в частности каталазы и пероксидазы, в защите клетки от окислительного разрыва ДНК (Д/ИгшЫта Т. с соавт., 1997). Таким образом, вероятно понижение концентрации ионов Ге+2, путем его связывания, приводит к уменьшению разрушительных эффектов перекиси водорода в реакции Фентона.

Данный вывод косвенно подтверждается рядом моментов: так, в настоящей работе показано, что предварительная обработка солями железа инактивировала ингибирующее действие бактериальных метаболитов, что добавление Ре+2 к клеткам бактерий с ингибированным ферментом снимало торможение активности последнего и, наконец, продукция ингибитора снижалась при добавлении в среду культивирования солей железа. По всей видимости, наличие у бактериальных клеток собственного или эндогенного ингибитора каталазы и связывание им ионов железа в некоторой степени объясняет снижение скорости гибели бактерии от окислительного разрыва ДНК при малых концентрациях перекиси водорода.

Если рассматривать выявленное свойство как фактор предотвращения реакции Фентона, то становится очевидной причина яркой выраженности признака у представителей нормальной микрофлоры, в частности репродуктивного тракта женщин, микробный биоценоз которого находится в условиях постоянного окислительного стресса, вызванного продукцией пероксида водорода лактобациллами (НППег 8.Ь. с соавт., 1992). С другой стороны, учитывая, что каталазная активность аллох-тонных для исследуемых экотопов микроорганизмов угнетается бактериальными метаболитами в большей степени, чем автохтонных, вероят-; но следует говорить об обнаруженном признаке как об антагонистическом, направленном на снижение жизнеспособности чужеродных видов.

Остается невыясненным вопрос о первичной роли изучаемого признака, то есть, являются ли выявленные ингибиторы истинными ингибиторами каталазы аллохтонных видов или же средством защиты вида-продуцента от окислительного разрыва ДНК, или же выявленный фак-тбр изначально существует у микроорганизмов как бактериальный хела-тор железа, например, как ранее описанные ферредоксины.

Особый интерес представляет то, что различные микроорганизмы угнетают активность каталазы по различным типам, так, например, если метаболиты коринебактерий ингибируют фермент по неконкурентному типу, то лактобациллы по смешанному, что свидетельствует, вероятно, не только о разных действующих веществах, но и об их числе. То есть, неконкурентное ингибирование каталазы метаболитами коринебактерий можно объяснить присутствием у них одного типа действующего фактора, а смешанный метаболитов лактобацилл наличием нескольких действующих факторов с различной природой.

Выявленный эффект ингибирования активности каталазы метаболитами нормальной микрофлоры человека можно рассматривать как один из возможных механизмов межмикробных взаимоотношений, определяющих формирование и/или стабилизацию микробиоценозов за счет подавления защитных систем каталазопозитивных микроорганизмов от токсического действия перекиси водорода. Это достигается регуляцией уровня каталазной активности, как представителей нормальной микрофлоры, так и аллохтонных микроорганизмов. Снижение уровня антиоксидантной защиты микроорганизмов при воздействии бактериальных ингибиторов каталазы увеличивает повреждающий эффект активных форм кислорода, что может определять их выживание и численность в микробиоценозе.

Наличие у бактериальных клеток собственного или эндогенного ингибитора каталазы и связывание им ионов железа в некоторой степени объясняет снижение скорости гибели бактерий в условия окислительного стресса, вызванного малыми концентрациями пероксида водорода, путем предотвращения участия ионов Ге+2 в реакции Фентона.

Таким образом, проведенные исследования позволяет выделить три момента:

• выявлено новое свойство микроорганизмов, заключающееся в их способности ингибировать каталазу бактерий и наиболее выраженное у автохтонных видов.

• исследуемый признак является как фактором антагонизма в межмикробных взаимодействиях, так и фактором защиты самого продуцента от окислительного повреждения ДНК активными формами кислорода.

• природа выявленного фактора различна у микроорганизмов и объясняет как механизм действия и точки его приложения.

134

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сгибнев, Андрей Викторович, Оренбург

1. Ашмарин А.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Д.: Медицина, 1962. - 160 с.

2. Бигон М., Харпер Дж., Таунсенд К. Экология. Особи, популяции и сообщества: В 2-х т. Т. 2: Пер. с англ.- М.: Мир, 1989,- С. 118-121.

3. Бондаренко В.М., Петровская В.Г., Яблочков А.Л. Антилизоцимный фактор Klebsiella pneumoniae: природа, биологические функции и генетический контроль// Журн. микробиол,- 1994.- Приложение.- С.22-28.

4. Бухарин О. В. Персистенция патогенных бактерий. /М.: Медицина; Екатеринбург: УрО РАН. 1999. - 365 с.

5. Бухарин О. В., Васильев Н. В., Усвяцов Б. Я. Лизоцим микроорганизмов. Томск: Изд-во Томского ун-та, 1985.

6. Бухарин О.В. Биомедицинские аспекты персистенции бактерий //Журн. микробиол,- 1994,-Приложение.-С. 4-13.

7. Бухарин О.В., Литвин В.Ю. Патогенные бактерии в природных экосистемах,-Екатеринбург: УрО РАН, 1997.-227 с.

8. Бухарин О.В., Немцева Н.В., Валышев А.В. Популяционная характеристика факторов персистенции кишечных палочек, выделенных из различных экониш //Бюлл. экспер.- биол. мед.- 1996.- № 9.- С. 356-358.

9. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я. Бактерионосительство (медико-экологический аспект).- Екатеринбург: УрО РАН, 1996.-207с.

10. Емельянов И.Г. Разнообразие и устойчивость биосистем //Усп. со-времен. биол., 1994.-т.144.-вып. З.-с. 304-318.

11. Карки Т.В., Ленцнер Х.П., Ленцнер A.A. Количественный состав лак-тофлоры и методика его определения //Журн. микроб и о. к- 1994- №6-С.16-18.

12. Келети Т. Основы ферментативной кинетики: Пер. с англ.- М.: Мир, 1990,- С. 131-142.

13. Костюковская О.Н., Гладкая Е.А. Идентификация недифтерийных бактерий рода Corynebacterium и определение их антибйотикочувстви-тельности//Журн. микробиол,- 1992,-№ 9-10.-С.29-31.

14. Лакин Г.Ф. Биометрия.-М.: Высш. шк., 1990,- 352 с,

15. Ленцнер A.A., Ленцнер Х.П., Микельсаар М. Э. и др. Лактофлора и колонизационная резистентность. //Антибиотики и химиотерапия. -1987,-№ З.-С. 42-45.

16. Ленцнер A.A., Ленцнер Х.П., Тоом М.А. О способности лактобацилл микрофлоры человека продуцировать лизоцим //Журн. микробоил:-1975,-№8.-С. 77-81.

17. Ляшенко И.Э. Факторы персистенции Е. coli. Автореф. дис.канд. мед. наук. Оренбург, 1995.-23 с.

18. Мартикайнен З.М., Чуранова 3;И. Биохимическая дифференциация коринебактерий женского мочеполового тракта. // Клин. лаб. диагно-стика.-1992.- №3-4.- С.4-6.

19. Окунь Я. Факторный анализ.-М., 1974.- 356с.

20. Сурикова Е.В. Факторы персистенции клебсиелл //Автореф. дисс. канд. мед. наук.-Челябинск.- 1992.-20 с.

21. Фельдман Ю.М., Маханева Л.Г., Шапиро A.B., Кузьменко В.Д. Количественное определение бактерий в клинических материалах// Лаб. дело,- 1984,- №10.- С.616-619. '

22. Филиппов В.А. Роль бактериоциногении в регуляции динамики полости рта//Антибиотики.-1981.-№1.-С. 33-37.

23. Филиппов В.А., Рубаненко О.Б. Бактериоциногения Lactobacillus aci-dophilusZ/Микробиол. Ж.- 1975.-№1.-С.55-57.

24. Шеенков Н.В. Роль аитилизоцимиой активности бактерий в развитии инфекционного процесса и пути ее регуляции: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Челябинск.- 1993.-20 с.

25. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. М.: Грантъ.- 1998. Т.1.- 288 с.

26. Allison C., Macfarlene G.T. Regulation of protease production in Clostridium sporogenes //Appl. Environ. Microbiol.- 1990,- Vol.- 56, N 11.- P. 34853490.

27. Barnard J.P., Stinson M.W. The alpha-hemolysin of Streptococcus gor-donii is hydrogen peroxide.// Infect. Immun.- 1996. -№9. P. 3853-3857.

28. Berg J.O. Cellular location of glycoside hydrolases in Bacteroides fragilis //Gurr.Microbiol. 1981. - Vol.5. - p. 13-17.

29. Bhatia S.J., Kochar N., Abraham P., Nair N.G., Mehta A.P. Lactobacillus acidophilus inhibits growth of Campylobacter pylori in vitro.// J Clin Microbiol.-1989.-№ 27.-P. 2328-2330.

30. Bishai W.R., Smith H.O., Barcak G.J. A përoxide/ascorbate-indücible catalase from Haemophilus influenzae is homologous to the Escherichia coli katE gene product.// J. Bacteriol.- 1994,- №10. P. 2914-2921.

31. Bogovic-Matijasic B., Rogelj I., Nes I.F., Holo H. Isolation and characterization of two bacteriocins of Lactobacillus acidophilus LF221.// Appl.Microbiol.Biotechnol.- 1998,-№49(5).-P.606-612.

32. Brashears M.M., Reilly S.S., Gilliland S.E. Antagonistic action of cells of Lactobacillus lactis toward Escherichia coli 0157:H7 on refrigerated raw chicken meat.// J. Food. Prot.- 1998,- № 61(2).-P. 166-170.

33. Bravo J., Fita I., Ferrer J.C., Ens W., Hillar A., Switala J., Loewen P.C. Identification of a novel bond between a histidine and the essential tyrosine in catalase HPII of Escherichia coli//. Protein Sci.- 1997,- №6(5).-P. 1016-1023,

34. Bravo J., Verdaguer N., Tormo J., Betzel C., Switala J., Loewen P.C., Fita I. Crystal structure of catalase HPII from Escherichia coli.// Structure.- 1995.-' №3(5).-P.491-502.

35. Brunder W., Schmidt H., Karch H. KatP, a novel catalase-peroxidase encoded by the large plasmid of enterohaemorrhagic Escherichia coli 0157:H7// Microbiology. 1996. - №142 ( Pt 11).- P.3305-3315.

36. Cai Y., Benno Y., Ogawa M., Ohmomo S., Kumai S., Nakase I'. Influence of lactobacillus spp. from An inoculant and of weissella and leuconostoc spp. from forage crops on silage fermentation.// Appl. Environ. Microbiol.- 1998.-№64(8).- P.2982-2987.

37. Casillas-Martinez L., Setlow P. Alkyl hydroperoxide reductase, catalase, MrgA, and superoxide dismutase are not involved in resistance of Bacillussubtilis spores to heat or oxidizing agents.// J. Bacterid. 1997. - №179(23). -P.7420-7425.

38. Chen L., Keramati L., Hehmnn J.D. Coordinate regulation of Bacillus subtilis peroxide stress genes by hydrogen peroxide and metal ions.// Proc. Natl. Acad .Sci. U S A. 1995.-№92(18).-P.8190-8194.

39. Cohen G. The regulation of cell metabolism. Paris: Hermann. - 1968.

40. Cummings N.J., Connerton I,F. The Bacillus subtilis 168 chromosome from sspE to katA.// Microbiology. 1997. - №143 ( Pt 6), - P. 1855-1859.

41. DeShazer D., Wood G.E., Friedman R.L. Molecular characterization of catalase from Bordetella pertussis: identification of the katA promoter in an upstream insertion sequence.// Mol. Microbiol. 1994. - №14(1). - P. 123130.

42. Diep D.B., Axelsson L., Grefsli C., Nes I.F. The synthesis of the bacterio-cin sakacin A is a temperature-sensitive process regulated by a pheromone peptide through a three-component regulatory system. //Microbiology.- 20G0.-№146 (9).- P.2155-2160.

43. El-Soda M., Bergere J.L., Desmazeaud M.J. Detection and localization of peptide hydrolases in Lactobacillus casei //J. Dairy Res.- 1978,- Vol. 45,- N 3.- P. 519-524.

44. Engelmann S., Hecker M. Impaired oxidative stress resistance of Bacillus subtilis sigB mutants and the role, of katA and katE.// FEMS Microbiol. Lett. 1996.-№145(1).-P. 63-69.

45. Felix J.V, Papathanasopoulos M.A., Smith A.A., von Holy A., Hastings J.W. Characterization of leucocin B-Talla: a bacteriocin from Leuconostoc carnosum Talla isolated from meat.// Curr. Microbiol. 1994: - №29(4). P.207-212.

46. Fernandes A.I., Gregoriadis G. Synthesis, characterization and properties of sialylated catalase.// Biochim. Biophys. Acta. 1996.- № 1. • P.90-96.

47. Fiorenza S., Ward C.H. Microbial adaptation to hydrogen peroxide and biodégradation of aromatic hydrocarbons.// j. Ind. Microbiol. Biotechnol. -1997.-№18(2-3).-P.140-151.

48. Fondren L.M., Sloan G.L., LeBlanc P.A., Heath HE. Plasmi'd-encoded catalase of Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus.// FEMS Microbiol. Lett.-1994. №2. - P.231-235.

49. Franz C.M., Du Toit M., von Holy A., Schi'llinger U., Holzapfel W.H. Production of nisin-like bacteriocins by Lactococcus lactis strains isolated from vegetables.// J. Basic Microbiol.- 1997.- №3. -P. 187-196.

50. Franz C.M., Schillinger U., Holzapfel W.H. Production and characterization of enterocin 900, a bacteriocin produced by Enterococcus faecium BFE 900 from black olives.// Int. J. Food. Microbiol.- 1996,- №29(2-3). P.255-270.

51. Gharbia S.E., Shah H.N. Hydrolytic enzymes liberated by black-pigmented gram-negative anaerobes. //FEMS Immunol. Med. Microbiol.-1993,-Vol. 6,-N2-3,-P. 139-145.

52. Gibson S.A.W., Macfarlane G.T. Studies oft the proteolytic activity of Bacteroides fragilis //J.Gen.Microbiol. 1988. - Vol.134. - p. 19-27.

53. Gonzalez-Flecha B., Demple B. Homeostatic regulation of intracellular hydrogen peroxide concentration in aerobically growing Escherichia coli.// J. Bacteriol.- 1997,-№2. P.382-388/

54. Gonzalez-Flecha B., Demple B. Transcriptional regulation of the Escherichia coli oxyR gene as a function of cell growth.// J. Bacteriol. 1997.-№19.-P. 6181-6186.

55. Gouet P., Jouve H.M. Williams P.A., And'ersson I.,' Andreoletti P., Nus-saume L., Hajdu J. Ferryl intermediates of catalase captured by time-resolved Weissenberg crystallography and UV-VIS spectroscopy.// Nat. Struct. Biol. -1996. -№ll. -P.951-956

56. Haavik H.I. On the function of the polypeptide antibiotic Bacitracin in the producer strain Bacillus licheniformis.// Act. Pathol. Microbiol. 1975. -№83. - P.519-524.

57. Hartford O.M., Dowds B.C. Isolation and characterization of a hydrogen peroxide resistant mutant of Bacillus subtilis.// Microbiology.- 1994,- №2. -P.297-304.

58. Hastings J.W., Stiles M.E., von Holy A. Bacteriocins of leuconostocs isolated from meat.// Int. J.Food.Microbiol. 1994,- №1-2. - P.75-81.

59. Herouart D., Sigaud S., Moreau S., Frendo P., Touati D., Puppo A. Cloning and characterization of the katA gene of Rhizobium meliloti encoding a142 ■ \ .hydrogen peroxide-inducible catalase.// J. Bacteriol.- 1996,- №23. P.6802-6809.

60. Hillier S.L. The role of naturally occurring and exogenously supplied lac-tobacilli in human vagina.// Microbial ecology in health and disease.-1998,-№10.-P.158-204.

61. Hillier S.L., Krohn M.A., Klebanoff S.J., Eschenbach D.A. The relationship of hydrogen peroxide- producing lactobacilli to bacterial vaginosis and genital microflora in pregnant women // Obstet. Gynecol,-1992.-Vol.7.9 .-№3,-P 369-373.

62. Hillier S.L., Krohn M.A. Rabe L.K., Klebanoff S.J. Eschenbach D.A. The normal vaginal flora, H202-producing lactobacilli, and bacterial vaginosis in pregnant women.// Clin. Infect. Dis.- 1993.-№16 (Suppl.4) .- P. S273-281.

63. Hsu C.Y., Wiseman G.M. Antibacterial substances from staphylococci././ Can. J. Microbiol. 1967. - №13. - P.947-951.

64. Hsu C.Y., Wiseman G.M. Purification of epidermidiris, new antibiotics from staphylococci.// Can. J. Microbiol. 1971. - №17. - P. 1223-1231.

65. Ivanova A., Miller C., Glinsky G., Eisenstark A. Role of rpoS (katF) in oxyR-independent regulation of hydroperoxidase I in Escherichia coli.// Mol. Microbiol.- 1994. №4,-P.571-578.

66. Jin L.Z.; Ho Y.W., Abdullah N., Ali M.A., Jalaludin S. Antagonistic effects of intestinal Lactobacillus isolates on pathogens of chicken.//Lett. Appl. Microbiol.- 1996.-№ 23.-P.67-71.

67. Jouve H.M., Andreoletti P., Gouet P., Hajdu J., Gagnon J. Structural analysis of compound I in hemoproteins: study on Proteus mirabilis catalase. //Biochimie. 1997. - № 11. - P.667-671.

68. Khanduja V., Kang G., Rajan D.P., Balasubramafrian K.A. Oxidative stress response in Shigella and nonpathogenic gut bacteria.// Indian. J. Med. Res. 1998,-№3.-P.7-9.

69. Khelef N., DeShazer D., Friedman R.L. Guiso N. In vivo and in vitro analysis of Bordetella pertussis catalase and Fe-superoxide dismutase mutants.// FEMS Microbiol. Lett. 1996. - №2-3. - P.231-235. i

70. Khetmalas M.B. Transposon-induced catalase-deficient Agrobacterium tumefaciens.// Curr. Microbiol. 1997. - №3. -P. 145-150.

71. Kim Y.C., Miller C.D., Anderson A.J. Identification of adjacent genes encoding the major catalase and a bacterioferritin from the plant-beneficial bacterium Pseudomonas putida.// Gene. 1997. - № 1-2. - P.219-224.

72. Klebanoff S.J., Smith D.C. Peroxidase-mediated antimicrobial activity of rat uterine fluid//Gynecol. Invest.- 1970. №1.- P.21-23.

73. Klotz M.G., Klassen G.R. Loewen P.C. Phylogenetic relationships among prokaryotic and eukaryotic catalases.// Mol. Biol. Evol. -1997.- №9. P.951-958.

74. Kobayashi C., Suga Y., Yamamoto K., Yomo T., Ogasahara K., Yutani K., Urabe I. Thermal conversion from low- to high-activity forms of catalase 1 from Bacillus stearothermophilus.// J. Biol. Chem. 1997. - №>37. - P.23011 -23016.

75. Koga T., Mizobe T., Takumi K. Antibacterial activity of Lactobacillus species against Vibrio species.//Microbiol. Res.- 1998.- №153.-P.271 -275.

76. Koshland D.E. Conformational aspects of enzyme regulation// Curr. Top. Cell. Regul.-1969. №1. - P. 1-28.

77. Kusano K., Yamada H., Niwa M., Yamasato K. Propionibacterium cyclo-hexanicum sp. nov., a new acid-tolerant omega-cyclohexyl fatty acid-containing Propionibacterium isolated from spoiled orange juice.// Int. J. Syst. Bacteriol.- 1997.- №3. -P.825-831

78. Li Z, Kelley C, Collins F, Rouse D, Morris S Expression of katG in Mycobacterium tuberculosis is associated with its growth and persistence in mice and guinea pigs. J Infect Dis 1998 Apr; 177(4): 1030-.5.

79. Lilly D. M., Stillwell R. N. Growth promoting factor produced by microorganisms //Science.- 1965,- Vol. 147.- P. 747-748.

80. Liu WK, Brown MR, Elliott TS Mechanisms of the bactericidal activity of low amperage electric current (DC). J Antimicrob Chemother 1997 Jun;39(6):687-95.

81. Loewen P Probing the structure of catalase HPII of Escherichia coli. Gene 1996 Nov 7;179(l):39-44

82. Loprasert S, Vattanaviboon P, Praituan W, Chamnongpol S, Mongicol-suk S Regulation of the oxidative stress protective enzymes, catalase and superoxide dismutase in Xanthomonas. Gene 1996 Nov 7; 179(1 ):33L7.

83. Love DN, Redwin J Characterization of the catalase of the genus Por-phyromonas isolated from cats. J Appl Bacteriol 1994 Oct;77(4J:421-5.

84. Macfarlane G.T., Hay S., Macfarlane S., Gibson G.R. Effect of different carbohydrates on growth, polysaccharidase and glycosidase production by Bacteroides ovatus, in batch and continuosus culture //J. Appl. Bacteriol.-1990,-Vol. 68,-p. 179-187.

85. Macfarlane G.T., Macfarlane S., Gibson G.R. Synthesis and release of proteases by Bacteroides fragilis //Curr. Microbiol.- 1992b.- Vol.24.- p. 5559.

86. Maciver I, Hansen EJ Lack of expression of the global regulator OxyR in Haemophilus influenzae has a profound effect on growth phenotype. Infect Immun 1996 Nov;64(l 1 ):4618-29.145 ,

87. Maj M, Nicholls P, Obinger C, Hillar A, Loewen PC Reaction of E.coli catalase HPII with cyanide as ligand and as inhibitor. Biochim Biophys Acta 1996 Dec 5;1298(2):241-9.

88. Mares A, Neyts K, Debevere J Influence of pH, salt and nitrite on the heme-dependent catalase activity of lactic acid bacteria. Int J Food Microbiol 1994 Dec;24(l-2): 191-8.

89. Menendez MC, Ainsa JA, Martin C, Garcia MJ katGI and katGII en-' code two different catalases-peroxidases in Mycobacterium fortuitum. J Bacterid 1997 Nov; 179(22):6880-6.

90. Miller CD, Kim YC, Anderson AJ Cloning and mutational analysis of the gene for the stationary-phase inducible catalase (catC) from Pseudomonas putida. J Bacterid 1997 Aug;179(16):5241-5.

91. Miller MA, Lipscomb JD Homoprotocatechuate 2,3-dioxygenase from Brevibacterium fuscum. A dioxygenase with catalase activity. J Biol Chem 1996 Mar 8;271(10):5524-35.

92. Minagawa K. Significance of lysozyme in infant nutrition. Synthesis of lysozyme by Lactobacillus bifidus. //Nippon. Shonika. Gakkai. Zasshi.-1970,-Vol. 74, N8,-P. 761-767.,.

93. Mobley HL Helicobacter pylori factors associated with disease development. Gastroenterology 1997 Dec; 113(6 Suppl):S21-8.

94. Mukhopadhyay S, Schellhorn HE Induction of Escherichia coli hydroperoxidase I by acetate and other weak acids. J Bacteriol 1994 Apr; 176(8):2300-7.

95. Munimbazi C, Bullerman LB Inhibition of allatoxin production of Aspergillus parasiticus NRRL 2999 by Bacillus pumilus. Mycopathologia 199798; 140(3): 163-9.

96. Mutsuda M, Ishikawa T, Takeda T, Shigeoka S The catalase-peroxidase of Synechococcus PCC 7942: purification, nucleotide sequence analysis and expression in Escherichia coli. BiocheirfJ 1996 May 15;316 ( Pt 1):251-7.

97. Nagy JM, Cass AE, Brown KA Purification and characterization of recombinant catalase-peroxidase, which confers isoniazid sensitivity in Mycobacterium tuberculosis. J Biol Chem 1997 Dec 12;272(50):31265-71.

98. Obinger C, Regelsberger G, Strasser G, Burner U, Peschek GA Pùrifi-cation and characterization of a homodimeric catalase-peroxidase from the cyanobacterium Anacystis nidulans. Biochem Biophys Res Commun 1997 Jun 27;235(3):545-52

99. Oda T, Nakamura A, Shikayama M, Kawano I, Ishimatsu A, Mu-ramatsu T Generation of reactive oxygen species by raphidophycean phyto-plankton. Biosci Biotechnol Biochem 1997 Oct;61 (10): 1658-62.

100. Olsen A, Halm M, Jakobsen M The antimicrobial activity of lactic acid bacteria from fermented maize (kenkey) and their interactions during fermentation. J Appl Bacteriol 1995 Nov;79(5):506-12.

101. Ouwehand A.C., Kirjavainen P.V., Shortt C., Sälminen S. Probiotics: mechanisms and established effects.// International diary journal.- 1999.-№ 9.-P. 43- 52.

102. Oyarzun A, Smith P Ultracytochemical localization of hydrogen peroxide production by dental plaque bacteria. Arch Oral Biol 1998 Nov;43(l 1):907-10

103. Pahlson C., Larsson P.G. The ecologically wrong vaginal lactoba-cilli. // Med. Hypotheses.- 1991.-'Vol. 36, № 2,- P. 126-130.

104. Papathanasopoulos MA, Hastings JW, von Holy A Antibacterial activity of three Leuconostoc strains isolated from vacuum-packaged processed meats. J Basic Microbiol 1994;34(3): 173-82.

105. Parente E, Ricciardi A Production, recovery and purification of bacte-riocins from lactic acid bacteria.// Appl.Microbiol. Biotechnol.-1999 .-№ 52(5).-P.628-638.

106. Peschkov J. The autoingibition activity of some microbial species.// ZentralblattBacteriolog. 1976. - №235.-P.521.

107. Phadnis SH, Parlow MH, Levy M, liver D, Caulkins CM, Connors JB, Dunn BE Surface localization of Helicobacter pylori urease and a heat shock protein homolog requires bacterial autolysis. Infect Immun 1996 Mar;64(3):905-12

108. Roberts B, Hirst R Identification and characterisation of a superoxide dismutase and catalase from Mycobacterium ulcerans. J Med Microbiol 1996 Nov;45(5):383-7.

109. Rocha ER, Selby T, Coleman JP, Smith CJ Oxidative stress response in an anaerobe, Bacteroides fragilis: a role for catalase in protection against hydrogen peroxide. J Bacterid 1996 Dec; 178(23):6895-903.

110. Rocha ER, Smith CJ Biochemical and genetic analyses of a catalase from the anaerobic bacterium Bacteroides fragilis. J i Bacterid 1995 Jun; 177(1 I ):31 1 1-9.

111. Rocha ER, Smith CJ Regulation of Bacteriodes fragilis katB mRNA by oxidative stress and carbon limitation. J Bacteriol 1997 Nov;179(22):7033-9.

112. Ryser ET, Maisnier-Patin S, Gratadoux JJ, Richard J Isolation and identification of cheese-smear bacteria inhibitory to Listeria spp. Int J Food Microbiol 1994 Feb;21(3):237-46.

113. Sanwal B.D. Allosteric controls of amphibolic pathways in bacte-ria.//Bacteriol. Rev. 1970. -№34. - P. 20-39.

114. Schellhorn HE Regulation of hydroperoxidase (catalase) expression in Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 1995 Sep 1;131(2):113-9.

115. Schnell S, Steinman HM Function and stationary-phase induction of periplasmic copper-zinc superoxide dismutase and catalase/peroxidase in Caulobacter crescentus. JBacteriol 1995 Oct;177(20):5924-9.

116. Segal H.L. Enzymatic interconversion of active and inactive forms of enzymes.//Science. 1973. - №180. P.25-32.

117. Selwyn S. Natural antibiosis among skin bacteria as a primary defence against infection.//Brit. J. Derm. 1975. - №93. -P.487.

118. Sevinc MS, Ens W, Loewen PC The cysteines of catalase HPII of Escherichia coli, including Cys438 which is blocked, do not have a catälytic role. Eur J Biochem 1995 May 15;230(1): 127-32.

119. Sha Z, Stabel TJ, Mayfield JE Brucella abortus catalase is a periplasmic protein lacking a standard signal sequence. J Bacteriol 1994 Dec; 176(23 ):7375-7.

120. Shoji J. Recent chemical studies on peptide antibiotics from the genus Bacillus.//Appl. Microbiol. 1978. -№24. - P. 187.

121. Solas MT, Vicente C, Xavier L, Legaz ME Ionic adsorption of catalase on bioskin: kinetic and ultrastructural studies. J Biotechnol 1994 Mar 15;33(l):63-70.

122. Stadtman E.R. Mechanisms of enzyme regulation in metabolism. // In: The Enzymes (ed. Boyer P.D.).- vol. 1. Academic Press, New York and London. - 1970. - pp. 398-459.

123. Stecchini ML, Aquili V, Sarais I Behavior of Listeria monocytogenes in Mozzarella cheese in presence of Lactococcus lactis. Int J Food Microbiol 1995 May;25(3):301-10.

124. Steinman HM, Fareed F, Weinstein L Catalase-peroxidase of Caulobacter crescentus: function and role in stationary-phase survival. J Bacteriol 1997 Nov; 179(21):6831-6

125. Suma K, Misra MC, Varadaraj MC Plantaricin LP84, a broad spectrum heat-stable bacteriocin of Lactobacillus plantarum NCIM 2084 produced in a simple glucose broth medium. Int J Food Microbiol 1998 Mar 3;40(1 -2): 1725. .

126. Tagg J.R., Dajani A.S., Wannamaker L.W. Bacteriocins of gram positive bacteria //Bacterid. Rev.- 1976.- Vol. 40.- P. 722-756.

127. Villani F, Pepe O, Mauriello G, Salzano G, Moschetti G, Coppola S Antilisterial activity of thermophilin 347, a bacteriocin produced by Streptococcus thërmophilus. Int J Food Microbiol 1995 Apr,25(2): 179-90.

128. Visick JE, Clarke S RpoS- and OxyR-independent induction of HP! catalase at stationary phase in Escherichia coli and identification of rpoS mutations in common laboratory strains. J Bacteriol 1997 Jul; 179(13):4158-63.

129. Visick KL, Ruby EG The periplasmic, group III catalase of Vibrio fischeri is required for normal symbiotic competence and is induced both by oxidative stress and by approach to stationary phase. J Bacteriol 1998 Apr; 180(8):2087-92.

130. Voordouw JK, Voordouw G Deletion of the rbo gene increases thé oxygen sensitivity of the sulfate-reducing bacterium Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. Appl Environ Microbiol 1998 Aug;64(8):2882-7.

131. Wahren A., Berholm K., Holme T. Formation of proteolytic activity in continuous culture of Sphaerophorus necrophorus //Acta Pathol. Microbiol. Scand. B. Microbiol. Immuol.- 1971.- Vol. 79, N 3,- P. 391-398.

132. Wang P, Schellhorn HE Induction of resistance to hydrogen peroxide and radiation in Deinococcus radiodurans. Can J Microbiol 1995 Feb;41(2): 170-6.

133. Yildirim Z, Johnson MG Characterization and antimicrobial spectrum of bifidocin B, a bacteriocin produced by Bifidobacterium bifidum NCFB 1454. J Food Prot 1998 Jan;61(l):47-51150

134. Yildirim Z, Johnson MG Detection and characterization of a bacterio-cin produced by Lactococcus lactis subsp. cremoris R isolated from radish. Lett Appl Microbiol 1998 Apr;26(4):297-304

135. Zemser RB, Martin SE Heat stability of virulence-associated enzymes from Listeria monocytogenes SLCC 5764. J Food Prot 1998 Jul;61(7):899-902.

136. Zhu W.M., Liu W., Wu D.Q. Isolation and characterization of a new bacteriocin from Lactobacillus gasseri KT7.// J. Appl. Microbiol.- 2000.-№88(5).-P.877-886.