Развитие стекловидного тела глаза человека

Панова, Ина Георгиевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Развитие стекловидного тела глаза человека
ВАК РФ 03.03.05, Биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации по теме "Развитие стекловидного тела глаза человека"

005012027

На правах рукописи

^У^и^¿сі

Панова Ина Георгиевна

РАЗВИТИЕ СТЕКЛОВИДНОГО ТЕЛА ГЛАЗА ЧЕЛОВЕКА -МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ

Специальность 03.03.05 - биология развития, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 2 МАР Ш

Москва 2012

005012027

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, лаборатория проблем регенерации

Научный консультант:

Доктор биологических наук, профессор Строева Ольга Георгиевна

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Бродский Всеволод Яковлевич (ИБР

Доктор биологических наук, Каламкаров Григорий Рафаэльевич (ИБХФ РАН) Доктор биологических наук, профессор Зуева Марина Владимировна (ФГБУ «МНИИ ГБ им. Гельмгольца» Минздравсоцразвития России)

Ведущая организация: Российский государственный медицинский университет имени Н.И. Пирогова, г. Москва

Защита состоится 28 марта 2012 г. в 14 час на заседании диссертационного совета Д002.238.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, 26

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН и на сайте http://idbras.comcor.ru/

Автореферат разослан февраля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

РАН)

кандидат биологических наук ele080@yandex.ru

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Механизмы, лежащие в основе морфогенеза глаза, до сих пор остаются до конца не выясненными и являются актуальной проблемой биологии развития. Стекловидное тело - это один из важнейших факторов, участвующих в регуляции морфогенеза и роста тканей глаза. Создаваемое им внутриглазное давление осуществляет в раннем развитии корреляцию правильного соотношения структур глаза, характеризующихся разными скоростями роста и временем их созревания, обеспечивает функциональное соответствие всех частей этого органа на протяжении онтогенеза.

Все данные о роли фактора натяжения в развитии глаза, занимающие значительное место в экспериментальной эмбриологии, были получены в опытах, в которых тем или иным путём достигались нарушения условий для формирования и накопления массы стекловидного тела (Coulombre, 1956, 1969; Строева и др., 1989). При этом изучению молекулярных компонентов стекловидного тела в развитии глаза, за небольшим исключением, практически не уделялось внимания. Всестороннее исследование, в том числе на молекулярном уровне, периодов развития стекловидного тела как важного компонента становления структуры и функции глаза, и особенно глаза человека, лежит в русле актуальных проблем биология развития.

Несмотря на обилие работ, посвященных исследованиям глаза, стекловидное тело все еще остается наименее изученной структурой. Пока нет полного представления о процессах преобразования его матрикса в норме и при патологии. Практически отсутствуют представления о том, какие из белков сложной системы внеклеточного матрикса стекловидного тела играют первостепенную роль на каждом этапе его развития и дифференцировки клеток, окружающих его тканей (сетчатки и хрусталика). И хотя для изучения стекловидного тела применяются разные методы, они, как правило, трудоемки, требуют больших затрат времени и часто связаны с приемами, приводящими к значительным изменениям макромолекул, вплоть до их денатурации. Поэтому необходим поиск новых методов, которые бы обеспечивали быстрый и удобный анализ отдельных компонентов стекловидного тела. К настоящему времени достаточно хорошо изучены такие компоненты стекловидного тела глаза человека как коллагены, гиалуроновая кислота (Bishop, 2000), цитокины (Tripathi et al., 1991) и др. Однако такие важные белки как альбумин -транспортный белок, и альфа-фетопротеин (АФП) - специфический эмбриональный белок, в стекловидном теле в пренатальном развитии глаза человека не исследовали. Каротиноиды, которые характерны для тканей глаза взрослого человека, в глазах плодов человека также практически не изучались.

Перспективным подходом для выявления молекул во внеклеточном матриксе является применение спектрально-флуоресцентных зондов -соединений, изменяющих спектры поглощения и флуоресцентные свойства при нековалентном взаимодействии с макромолекулами. Характерным свойством таких зондов обычно является резкий рост флуоресценции при связывании в комплексе с макромолекулами. В качестве спектрально-флуоресцентных зондов могут быть использованы полиметиновые (цианиновые) и близкие к ним скварилиевые красители, т.к. известно, что фотофизические и фотохимические свойства данных красителей сильно зависят от свойств окружающей их среды. Эти красители обладают уникальной особенностью образовывать агрегаты различного строения (в частности, димеры, Н- и J-агрегаты), свойства которых также определяются молекулярным окружением (Herz, 1977). Изучение взаимодействия подобных красителей-зондов с различными компонентами биологических систем может дать ценную информацию о типах присутствующих молекул, а также их содержании в изучаемой системе. Поиск и разработка новых красителей-зондов для прицельного и быстрого исследования компонентов стекловидного тела в состоянии, близком к нативному, является важной и актуальной проблемой.

Цель работы: изучение молекулярных компонентов стекловидного тела глаза человека и функционально связанных с ним тканей - сетчатки и хрусталика в пренатальном развитии.

Достижение цели требовало решения следующих задач:

1) провести комплексное исследование важнейших компонентов стекловидного тела (альбумина и коллагенов) глаза человека и ряда позвоночных животных на основе разработанных спектрально-флуоресцентных зондов;

2) исследовать динамику изменения содержания альбумина в стекловидном теле глаза человека в пренатальном развитии с помощью спектрально-флуоресцентного зонда, специфичного для альбумина человека;

3) исследовать влияние ряда гидролитических ферментов на молекулы альбумина и коллагена в стекловидном теле глаза плодов человека при помощи разработанного зонда;

4) провести анализ состава стекловидного тела на присутствие в нем специфического эмбрионального белка АФП;

5) исследовать присутствуют ли в стекловидном теле и хрусталике глаза плодов человека каротиноиды;

6) исследовать локализацию рековерина, ß-III тубулина и TGFbeta2 в сетчатке, а также ß-III тубулина и TGFbeta2 в хрусталике, в пренатальном развитии человека.

Научная новизна и теоретическая значимость работы.

- Разработаны спектрально-флуоресцентные зонды на основе полиметиновых красителей, один из которых (пиридиниевая соль 3,3'-ди-(у-сульфопропил)-4,5,4' ,5' -дибензо-9-этилтиакарбоцианин-бетаина (ДЭЦ)) является специфичным только для сывороточного альбумина человека.

- Зонд ДЭЦ способен различать коллагены разных типов, но не взаимодействует с АФП и гиалуроновой кислотой, входящих в состав стекловидного тела плодов человека.

- Впервые в стекловидном теле у плодов человека выявлен альбумин и исследована динамика его содержания в пренатальном развитии глаза.

- Выявлено, что наряду с альбумином в стекловидном теле глаза плодов человека присутствует АФП.

- Впервые в стекловидном теле и хрусталике в пренатальном развитии глаза человека обнаружены каротиноиды (в стекловидном теле - лютеин и его окисленные формы; в хрусталике - окисленные формы лютеина).

- Исследована динамика изменения локализации белков рековерина, р-Ш тубулина и ростового фактора ТвРЬе1а2 в сетчатке и (З-Ш тубулина и ТСИэе1а2 в хрусталике по мере развития глаза.

Научная и практическая значимость работы.

Результаты работы имеют фундаментальное значение и практический выход для биологических и экспериментально-медицинских исследований и могут быть использованы широким кругом исследователей в различных областях биологической и медицинской науки. В частности, они могут быть применены в следующих научных и практических областях:

- для качественной и количественной оценки альбумина и коллагена во внеклеточных средах организма и для оценки молекул внеклеточного матрикса в условиях эксперимента с помощью разработанных красителей-зондов;

- для оценки коллагена и альбумина в стекловидном теле в экспериментах после воздействия гидролитических ферментов, применяемых в хирургической практике и ферментной терапии;

- результаты работы способствуют расширению знаний о функционально значимых молекулах стекловидного тела (альбумине, АФП, каротиноидах), что важно для более глубокого изучения развития глаза человека;

- сопоставление стадий развития стекловидного тела и соответствующая характеристика дифференцировки сетчатки и хрусталика необходимы для понимания основных этапов развития глаза на молекулярном уровне;

- полученные результаты могут быть использованы в лекционных курсах по биологии развития, эмбриологии, клеточной биологии, физиологии развития, биофизике, развитию глаза человека.

Вклад автора. Результаты работы получены автором или при его непосредственном участии в планировании, проведении и обсуждении экспериментов и подготовке публикаций. Автором обоснованы и поставлены цели и задачи исследования, определены подходы к их решению, разработаны методики проведения экспериментов, предложены модели, интерпретированы полученные экспериментальные результаты, сформулированы основные выводы и научные положения. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Положения, выносимые на защиту:

1. Зонд ДЭЦ селективен по отношению к сывороточному альбумину человека и способен взаимодействовать с основными типами коллагенов позвоночных.

2. Содержание альбумина в стекловидном теле глаза плодов человека имеет максимальное значение на 17-22-й неделях и снижается к 28-й неделе. АФП в стекловидном теле глаза плодов человека обнаруживается одновременно с альбумином на тех же стадиях развития.

3. В стекловидном теле присутствуют каротиноиды (лютеин) и его окисленные формы, в то время как в хрусталике - только окисленные формы лютеина. Наблюдается корреляция между содержанием альбумина и каротиноидов в стекловидном теле.

4. Специфический белок фоторецепторных клеток - рековерин выявляется в сетчатке начиная с 10-й недели пренатального развития.

5. Выявленные изменения локализации P-III тубулина отражают структурные и функциональные процессы, происходящие в сетчатке и хрусталике в пренатальном развитии.

6. Ростовой фактор TGFbeta2 в сетчатке и хрусталике локализован преимущественно на границе со стекловидным телом на всех исследованных сроках пренатального развития.

Школа по эволюционной физиологии» (Санкт-Петербург, 2006); International Symposium on Molecular Photonics Devoted to the Memory of Acad. A.N. Terenin (St. Petersburg, Russia, 2006); 2-я Научная конференция с участием стран СНГ «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (Петрозаводск, 2007); XXIII International Conference on Photochemistry (Cologne, Germany, 2007); Симпозиум с международным участием «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза» (Москва, 2007); International Conference on Molecular and Nanoscale Systems for Energy Conversion (Moscow, Russia, 2007); Научно-практическая конференция «Нанотехнологии в диагностике и лечении патологии органа зрения» (Москва,

2008); V и VI Съезды Российского фотобиологического общества (Пущино, 2008, Шепси, 2011); VI Сибирский физиологический съезд (Барнаул, 2008); IV и V Российские симпозиумы «Белки и пептиды» (Казань, 2009, Петрозаводск, 2011); International Conference "Organic Nanophotonics" (ICON-Russia 2009); III и IV Международные научно-практические конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2009, 2011); Российский общенациональный офтальмологический форум с международным участием (Москва, 2009); Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино,

2009); SPIE Photonics West. BIOS. Conf.: Ophthalmic Technologies (USA, 2009,

2010); XXI Съезд физиологического общества имени И.П. Павлова (Калуга, 2010); Седьмой международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2011).

Публикации. По теме диссертации публиковано 29 статей, в том числе в списке работ, соответствующих Перечню ВАК, и в рецензируемых иностранных изданиях - 25, в сборниках научных трудов - 4.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Материалов и методов, Результатов, Обсуждения, Выводов, Списка литературы. Работа изложена на 273 страницах, содержит 87 рисунков, 12 таблиц. Список цитируемой литературы включает 323 наименования, из них 296 иностранных источников.

Работа выполнялась при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты № 05-04-48026, № 08-04-00462, № 09-04-01054-а, № 10-03-00647-а, 11-04-00728а).

Выражаю благодарность моему учителю и научному консультанту профессору О.Г. Строевой, академику Г.Т. Сухих за предоставление материала глаз для исследования, H.A. Ивановой - моему доброму и чуткому помощнику, а также всем своим соавторам и тем, кто оказывал мне поддержку и помощь в работе.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Разработанные спектрально-флуоресцентные зонды были апробированы на стекловидном теле глаз различных позвоночных животных (быка, свиньи, крысы, эмбрионов кур и травяной лягушки) и человека для выявления специфичности взаимодействия молекул стекловидного тела с красителями (подробно см. Результаты, раздел 1). Для детального исследования стекловидного тела нами был выбран зонд ДЭЦ, а материалом служили глаза человека и, в ряде экспериментов, травяной лягушки.

Абортивный материал глаз человека (эмбрион 5.5 недель, плоды 8-12 недель, 13-14 недель и 16-20 недель гестации), а также аутопсийный материал, полученный при вскрытии мертвых плодов, нежизнеспособных после преждевременных родов по 31-ю неделю, получали из НЦ акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова РАМН. Возраст плодов соответствует срокам, установленным врачом-акушером. Работа была выполнена на материале глаз от 181 плода человека. Кадаверные глаза взрослых людей получали из Института глазных болезней им. Гельмгольца после забора роговицы. Исследовали стекловидное тело, сетчатку, эпителий цилиарного тела и хрусталик.

Альбумин и коллаген в стекловидном теле глаз плодов человека с 9-й по 31-ю неделю определяли спектрально-флуоресцентным зондом ДЭЦ. В водный раствор ДЭЦ в 1-см измерительной кювете (концентрация красителя составляла обычно около (0.7-1.3) х Ю-6 моль/л, объем раствора - 3 мл) вводили нативное стекловидное тело, перемешивали и регистрировали спектр поглощения несколько раз до прекращения его изменения во времени. Регистрировали также спектры флуоресценции и возбуждения флуоресценции раствора. Контролем служил водный раствор красителя в присутствии сывороточного альбумина человека (Sigma). Концентрацию альбумина в стекловидном теле определяли в супернатантах после центрифугирования нативного стекловидного тела (12500 об/мин, eppendorf centrifuge 5417R, 4°С, 30 мин). Супернатант (от 30 до 100 мкл) вводили в раствор красителя ДЭЦ, перемешивали и по его взаимодействию с красителем определяли концентрацию альбумина по калибровочной кривой. Калибровочную кривую получали путем введения определенных концентраций коммерческого альбумина (Sigma) в раствор красителя и измерения интенсивности полосы поглощения с максимумом 612 нм, соответствующей транс-форме красителя, которая образуется при взаимодействии с альбумином. Спектры поглощения измерялись в диапазоне 400-800 нм на спектрофотометре Shimadzu UV-3101РС, спектры флуоресценции и возбуждения флуоресценции - на спектрофлуориметре Aminco-Bowman.

Концентрацию АФП в супернатантах стекловидного тела измеряли на диагностическом автоматическом хемилюминесцентном анализаторе закрытого типа «Advia Centaur CP» с диагностическим набором реагентов и антител к АФП фирмы «Siemens».

Для исследования внутренних сред глаза нами был адаптирован и применен фотохимический зонд, позволяющий оценить в них содержание веществ-доноров электрона с помощью триплетного состояния рибофлавина, которое, как известно, эффективно тушится донорами электрона. Рибофлавин, вводимый в исследуемые образцы, переводили в возбужденное триплетное состояние на установке лазерного импульсного фотолиза с возбуждением азотным лазером и измеряли константу скорости гибели триплетного состояния. Сравнение этой константы с константой скорости в воде давало нам оценку суммарной концентрации доноров электрона (мочевой и аскорбиновой кислот, некоторых аминокислот и др.) в жидких средах глаза.

Гель-электрофорез проводили по общепринятой методике для контроля содержания альбумина в стекловидном теле плодов человека, травяной лягушки и новорожденных крыс. Для дополнительного подтверждения присутствия альбумина в стекловидном теле плодов человека проводили Вестерн-блот анализ с антителами против альбумина человека (Sigma).

Ферментному анализу подвергали супернатант стекловидного тела 19/20-недельных плодов. В отобранные аликвоты (по 100 мкл) соответственно добавляли по 10 мкл: 1) протеиназу К (25 мг/мл, Boehringer,Germany), 2) трипсин (0.25%, Sigma), 3) коллагеназу (220 U/мг, Sigma) в смеси с гиалуронидазой (64 U/мг, Sigma), 4) смесь всех ферментов и 5) аликвота без добавления ферментов (контроль). Все приготовленные аликвоты инкубировали на водяной бане при 37°С в течение 1 ч. и затем анализировали зондом ДЭЦ.

Каротиноиды в стекловидном теле определяли по спектрам поглощения (в 1-мм кювете, с использованием юоветного отделения для малых образцов) и методом ВЭЖХ (хроматограф Knauer), а в хрусталике - методом ВЭЖХ. При ВЭЖХ-анализе в качестве стандарта были использованы растворы лютеина (La Roch, Швейцария), так как известно, что преобладающим каротиноидом сетчатки у человека до 2-х лет является лютеин.

Гистологические препараты глаз готовили по стандартной методике.

Для иммунохимического анализа глаза фиксировали и проводили по стандартной методике. Готовили криостатные срезы 12-16 мкм. Использовали антитела против белков рековерина (МГУ, Москва), ß-III тубулина (Abeam, Великобритания) и TGFbeta2 (Abeam, Великобритания). Окрашивали срезы вторичными антителами ФИТЦ-конъюгированными (США, Sigma), Antimouse Alexa 488 или Antimouse Alexa 586 (Molecular Probes, США). Для окраски ядер

использовали Hoechst 42333 (Leica, Германия). Локализацию белков анализировали в сетчатке, внутреннем эпителии цилиарного тела и хрусталике. В качестве отрицательного контроля реакцию проводили в отсутствие первичных антител.

Краситель ДЭЦ был использован также для анализа стекловидного тела и жидкости передней камеры глаза лягушки Rana temporaria L.

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Разработка спектрально-флуоресцентных зондов для исследования внеклеточных сред организма.

Был проведен отбор красителей, наиболее эффективных для изучения внеклеточных сред. Такими красителями оказались анионный цианиновый краситель ДЭЦ и скварилиевый краситель с сульфогруппами - производный ЗН-индолия (СКК).

При взаимодействии водного раствора красителя ДЭЦ с коллагенами и сывороточным альбумином человека наблюдается резкое изменение спектра поглощения красителя и резкий рост флуоресценции. В частности, исходная полоса поглощения с максимумом при 535 нм и плечом при -570 нм, обусловленная поглощением соответственно димеров и г/мс-мономеров красителя, в присутствии коллагенов заменяется на полосу с максимумом при 642-652 нм вследствие образования 1-агрегатов ДЭЦ на молекулах коллагенов (рис. 1), а в присутствии альбумина- на полосу с максимумом при 612 нм,

й 0.1

= 0.06

ДЭЦ (J-агрегаты)

Молекула коллагена

600 650, 700 л, нм

Рис. 1. Спектры поглощения красителя ДЭЦ в водном растворе без добавок (1) и в присутствии коллагена типа I в концентрации 3.8 (2), 7.7 (5) и 11 мг/л (4). Приведены также спектры флуоресценции (5, Хм = 600 нм) и возбуждения флуоресценции (б, = 700 нм) красителя ДЭЦ в присутствии 11 мг/л коллагена типа I. Справа дана схема образования I-агрегатов ДЭЦ на молекуле коллагена.

450 500 550 600 650 700 750

Л, нм

Рис. 2. Спектры поглощения красителя ДЭЦ в водном растворе в отсутствие (/) и в присутствии (2) сывороточного альбумина человека (6 х Ю-6 моль/л) ("Sigma"). Спектры флуоресценции (3, Х.ех = 580 нм) и возбуждения флуоресценции (4, XTsg = 670 нм) красителя ДЭЦ, связанного с альбумином. Справа - схематическое изображение комплекса молекулы ДЭЦ (розовая полоса) с молекулой альбумина.

обусловленную поглощением транс- мономера красителя, связанного с альбумином (рис. 2) и обладающего интенсивной флуоресценцией (квантовый выход 0.57), в то время как исходный краситель практически не флуоресцирует. Флуоресценцией обладают также J-агрегаты ДЭЦ (рис. 1).

J-агрегаты, образующиеся в присутствии различных коллагенов, отличаются по спектральным свойствам: спектры поглощения J-агрегатов ДЭЦ с коллагеном типа III несколько более широкие, более коротковолновые и имеют более низкий коэффициент экстинкции, а спектры с коллагеном типа II более узкие и более длинноволновые, чем с коллагеном типа I (табл. 1).

Таблица 1. Максимумы спектров поглощения (^а/1115, нм), коэффициенты экстинкции (е х 1(У5, л моль-1 см-1) и полуширина полос (Av;/2, см-1) J-агрегатов ДЭЦ на коллагенах различных типов и желатине

Коллаген типа I (из хвостов крыс) Коллаген типа II (стекловидное тело быка) Коллаген типа III (из кожи теленка) Желатина (Sigma)

^4naxal>S, НМ 646-648 656-657 642-643 657-658

е х 10~5, л моль-1 см-1 0.76 1.5 0.55 1.6

ÄVi/2, см"1 970 660 1340 533

Различие в свойствах J-агрегатов было использовано для оценки типа коллагена. При определении коллагена с помощью J-агрегатов ДЭЦ чувствительность метода составляет около 1 мг/л (в растворе, содержащем ДЭЦ в концентрации около Ю-6 моль/л). Если коллаген определяется из флуоресценции J-агрегатов, чувствительность может быть выше.

Анализ стекловидного тела и жидкости передней камеры травяной лягушки Rana temporaria L. с помощью зонда ДЭЦ позволил выявить, что в состав обеих тканей входит коллаген, по своему характеру близкий к коллагену типа I. О близости содержания некоторых компонентов в составе стекловидного тела и жидкости передней камеры свидетельствуют также данные, полученные с помощью фотохимического зонда - рибофлавина.

В присутствии значительных концентраций альбумина чувствительность метода по коллагену может значительно понизиться вследствие того, что ДЭЦ связывается с альбумином более прочно, чем с коллагеном. Для определения коллагена в этих условиях требуется использовать более высокие концентрации ДЭЦ, чтобы его избыток мог взаимодействовать с коллагеном.

Возможность красителя ДЭЦ взаимодействовать с альбумином и коллагенами была проверена на внеклеточной среде - стекловидном теле глаза плодов человека, и было показано присутствие в нем альбумина и коллагена. Специфичность данного красителя была исследована на стекловидном теле плодов свиньи, куриных эмбрионов, новорожденных и взрослых крыс, взрослого быка и взрослой травяной лягушки, где, по литературным данным, содержится альбумин. Анализ стекловидного тела глаз крыс, свиней и лягушек методом гель-электрофореза показал, что в стекловидном теле выявляется полоса с массой близкой к 66 кДа (в случае свиней - 68 кДа), соответствующей молекулярной массе альбумина. Однако зонд ДЭЦ реагирует только с коллагенами, присутствующими в стекловидном теле глаз этих животных, давая полосу J-агрегатов в области около 650 нм, а полоса в области 612 нм, которая возникала бы при взаимодействии с альбумином, не наблюдается. Не наблюдается и полосы флуоресценции, которую можно было бы ожидать при взаимодействии ДЭЦ с альбумином (в области около 630 нм). С гиалуроновой кислотой и АФП краситель ДЭЦ также не взаимодействует. Таким образом, из альбуминов краситель ДЭЦ эффективно взаимодействует только с сывороточным альбумином человека, что свидетельствует о его высокой селективности. Чувствительность метода определения сывороточного альбумина человека по спектрам поглощения соответствует концентрации альбумина в растворе ДЭЦ около 10~7 моль/л. При определении альбумина из спектров флуоресценции чувствительность метода существенно повышается и достигает 10~9 моль/л, поскольку /я/?анс-мономер, связанный с альбумином, обладает интенсивной флуоресценцией.

Исследование нативного стекловидного тела с помощью красителя ДЭЦ давало нам качественные и полуколичественные характеристики присутствия альбумина и коллагена в стекловидном теле. Для количественной оценки содержания альбумина мы готовили супернатанты стекловидного тела. При расчете концентраций альбумина в стекловидном теле учитывался объем супернаганта, вводимого в раствор ДЭЦ, и коэффициент разбавления при таком введении.

Уникальная селективность красителя ДЭЦ, из альбуминов эффективно взаимодействующего только с сывороточным альбумином человека, не позволяет применять его для работы с альбуминами других представителей позвоночных. Для расширения круга исследований была поставлена задача разработать зонд, который эффективно взаимодействует с сывороточными альбуминами различных представителей позвоночных. С этой точки зрения интерес представляют близкие аналоги цианинов - скварилиевые красители (сквараины). В настоящей работе был использован скварилиевый краситель СКК, в молекулу которого были введены сульфогруппы с целью повышения его растворимости в воде.

При введении возрастающих концентраций альбумина в водный раствор красителя СКК происходит падение интенсивности исходной полосы поглощения сквараина с максимумом 624 нм, появление и рост длинноволновой полосы с максимумом 637-641 нм, принадлежащей красителю, связанному с альбумином. Наряду с изменениями в спектрах поглощения, при связывании с альбумином происходит рост интенсивности флуоресценции (рост квантового выхода от 0.03 до 0.4-0.6) и длинноволновый сдвиг ее полосы. Сходным образом сквараин СКК взаимодействует с сывороточными альбуминами человека, быка и крысы.

Таким образом, спектрально-флуоресцентные зонды ДЭЦ и СКК могут быть использованы как адекватный метод для изучения внутренних сред глаза позвоночных.

2. Исследование глаз плодов человека.

2.1. Спектроскопический анализ стекловидного тела зондом ДЭЦ. Зонд ДЭЦ использовали для исследования содержания альбумина в стекловидном теле глаза плодов человека с 9-й по 31-ю недели. Работ по исследованию альбумина в стекловидном теле глаза человека в пренатальном развитии к настоящему времени нами обнаружено не было. В связи с тем, что альбумин является белком-переносчиком биологически активных молекул, было важно исследовать его содержание в период, когда происходит наиболее интенсивный рост глаза и дифференцировка его клеток.

Спектроскопический анализ нативного стекловидного тела глаз плодов человека показал, что на сроках от 9 до 12.5 недель в стекловидном теле

обнаруживается коллаген (по полосе поглощения с максимумом около 650 нм, обусловленной образованием Х-агрегатов красителя на коллагене, рис. 3 А, Б).

С 13-й по 15-ю неделю стекловидное тело вызывает в растворе ДЭЦ появление двух полос поглощения: как 1-агрегатов (в виде плеча), так и трансмономера красителя (рис. 3 В, Г). Спектрально-флуоресцентные свойства образующегося транс-мономера (интенсивная флуоресценция с Х^ = 623 нм, спектр возбуждения флуоресценции с Атоах и 615 нм примерно соответствует спектру поглощения транс-мономера с = 612 нм) близки к свойствам транс-мономера, образующегося в присутствии сывороточного альбумина человека, что свидетельствует о его наличии в стекловидном теле на этих стадиях.

С 16-й по 22/24-ю неделю в растворе с красителем наблюдается только полоса поглощения (и интенсивная флуоресценция) транс-мономера красителя с Хтоах =612 нм, что указывает на присутствие в стекловидном теле этих стадий сывороточного альбумина в высокой концентрации (рис. 3 Д, Е, Ж). Присутствующий в стекловидном теле коллаген не способствует образованию .Г-агрегатов красителя, поскольку весь краситель перехватывается центрами сильного связывания альбумина, что приводит только к появлению полосы транс-мономера красителя. Чтобы показать присутствие коллагена в стекловидном теле, были взяты растворы с более высокими концентрациями красителя ДЭЦ (2.4 х 10^ и 4.7 х Ю-6 моль/л), в которые помещали стекловидное тело 21/22-недельных плодов (рис. 4). Если низкие концентрации ДЭЦ ((0.7-1.3) х Ю-6 моль/л) были недостаточны для выявления коллагена, то использование более высоких концентраций ДЭЦ, обеспечивающих избыток красителя по отношению к альбумину, приводило к появлению в спектре поглощения полосы .Г-агрегата, указывающей на присутствие коллагена.

С 24-й по 27/28-ю неделю стекловидное тело вызывает в растворе ДЭЦ появление полос поглощения как .Г-агрегатов, соответствующих коллагену, так и транс-мономера красителя, соответствующего альбумину (рис. 3 3), что свидетельствует об уменьшении количества альбумина.

Данные по измерению флуоресценции красителя ДЭЦ в присутствии стекловидного тела глаз плодов человека с 10-й по 27/28-ю неделю (флуоресценции транс-мономера, связанного с альбумином, и .Г-агрегатов, образующихся на коллагене) хорошо согласуются с данными, полученными из спектров поглощения.

Гель-электрофорез и Вестерн-блот анализ подтвердили присутствие альбумина в стекловидном теле на исследуемых стадиях развития.

Рис. 3. Спектры поглощения красителя ДЭЦ в водном растворе в отсутствие (!) и в присутствии (2) стекловидного тела глаза 9.5- (А), 10/11- (Б), 13- (В), 15- (Г), 16- (Д), 19- (Е), 21/22- (Ж) и 27/28- (3) недельных плодов человека. Приведены также спектры флуоресценции (3, = 600 нм) и возбуждении флуоресценции (4, = 700 нм) ДЭЦ в присутствии стекловидного тела. Красными стрелками обозначены полосы транс-мономера ДЭЦ, связанного с альбумином, синими стрелками - полосы ^агрегатов ДЭЦ на молекулах коллагена.

Рис. 4. Спектры поглощения красителя ДЭЦ в водном растворе в отсутствие (/) и в присутствии (2) стекловидного тела глаза 21/22-недельных плодов человека при повышенных концентрациях ДЭЦ: 2.4 х 10~6 (А) и 4.75 х 1СГ6 (Б) моль/л. Красными стрелками обозначены полосы транс-мономера ДЭЦ, связанного с альбумином, синей стрелкой - полоса 1-агрегатов ДЭЦ на молекулах коллагена.

Таким образом, нами была качественно охарактеризована динамика содержания альбумина и коллагена в стекловидном теле глаза плодов человека. Для количественной характеристики мы измерили динамику изменения концентрации и общего содержания альбумина в супернатанте стекловидного тела с учетом увеличения его объема по мере роста глаза.

2.2. Концентрация и общее содержание альбумина в стекловидном теле плодов человека. Измерение содержания альбумина в стекловидном теле глаз плодов человека проводили с 16-й по 31-ю неделю с помощью красителя ДЭЦ. Вес и объем стекловидного тела непрерывно возрастают и с 16-й по 31-ю неделю увеличиваются приблизительно в 22 раза. На 17-й неделе концентрация альбумина достигает максимальной величины, равной 2.1 х КГ4 моль/л. После 17-й недели концентрация альбумина снижается, достигая минимального значения 0.029 х 10"4 моль/л на 28-й и 31-й неделях, и сохраняется на этом уровне в стекловидном теле глаза взрослого человека (рис. 5 А). Общее содержание альбумина в стекловидном теле достигает своего максимального значения 1.4 мг на 20-21-й неделе пренатального развития и затем снижается к 31-й неделе до 0.12 мг (рис. 5 Б).

2.3. АФП в стекловидном теле глаза плодов человека. АФП, в отличие от сывороточного альбумина человека, практически не взаимодействует с красителем ДЭЦ (спектры поглощения в присутствии АФП не изменялись, а флуоресценция практически не возрастала). Таким образом, данный краситель не подходит для анализа АФП. Для выявления этого белка в стекловидном теле глаза плодов человека был использован диагностический хемилюминесцентный метод с применением антител к АФП. Это позволило

12.0

1-5

¿4.0

§0.5

В о.о

25 30

Возраст, недели

и 1 5

г ю

1 -

І0-5 "І се £ о. и

ч о

♦ ♦

♦

25 30

Возраст, недели

Рис. 5. Динамика изменения концентрации (А) и общего содержания (Б) альбумина в стекловидном теле глаза плодов человека с 16-й по 31-ю неделю развития.

выявить присутствие АФП в стекловидном теле глаз человека в раннем плодном периоде развития. Измерение альбумина в этих же образцах стекловидного тела с помощью красителя ДЭЦ показало одновременное присутствие в них сывороточного альбумина (рис. 6).

Рис. 6. Концентрации АФП и сывороточного альбумина в стекловидном теле глаз плодов человека на различных стадиях пренатального

развития.

16 17 20/21 21/22 22 22/23 24 Возраст плодов, недели

2.4. Влияние ферментов на компоненты стекловидного тела. Выбор ферментов (коллагеназа с гиалуронидазой, трипсин и протеиназа К) был обусловлен тем, что структурными компонентами стекловидного тела являются коллаген и гиалуроновая кислота, а также присутствием в стекловидном теле альбумина. Исследовали стекловидное тело 19/20-недельных плодов человека, где, как было показано ранее, концентрация альбумина в стекловидном теле достаточно высока. Краситель ДЭЦ использовали в качестве зонда на коллаген и альбумин.

При помещении в водный раствор красителя ДЭЦ (1.1 х 10 ^ моль/л, 3 мл) контрольной аликвоты (30 мкл) стекловидного тела, не подвергавшегося

ферментативной обработке, весь краситель был перехвачен центрами сильного связывания альбумина, что иллюстрируется интенсивной полосой трансмономера (с Яша* = 612 нм). Концентрация альбумина при этом составила 1.1 х КГ1 моль/л (рис. 7 А). Чтобы показать присутствие коллагена в стекловидном теле, для исследования были взят раствор красителя ДЭЦ с более высокой концентрацией (4.3 х КГ6 моль/л), обеспечивающей избыток красителя по отношению к альбумину, что привело к появлению в спектре поглощения полосы ,1-агрегатов, указывающей на присутствие коллагена (рис. 7 Б). После обработки стекловидного тела протеиназой К и последующего введения его в раствор ДЭЦ полоса транс-мономера в спектре поглощения раствора ДЭЦ (1.1 х КГ6 моль/л) резко упала по отношению к контролю (рис. 7 В). Концентрация альбумина, рассчитанная из этого спектра, снизилась более чем в два раза по сравнению с контролем и составила 0.4 х 10"4 моль/л, а в спектре появилась интенсивная полоса .1-агрегатов (-650 нм), соответствующая коллагену, поскольку уменьшенной концентрации альбумина стало недостаточно для перехватывания всего красителя, и избыток красителя взаимодействовал с коллагеном. Следовательно, под действием протеиназы К происходит значительное ферментативное переваривание альбумина. Коллаген при этом не подвергался воздействию протеиназы К, о чем свидетельствует сравнение интенсивности полос поглощения 1-агрегатов из рис. 7 Б и 7 В. Видно, что в обоих случаях концентрация коллагена приблизительно одинакова.

Две аликвоты стекловидного тела, одна из которых была обработана трипсином, а другая коллагеназой в смеси с гиалуронидазой, при помещении в раствор красителя ДЭЦ показали присутствие высокой концентрации альбумина, близкой к контролю (рис. 7 Г, Д). Это свидетельствует о том, что ни трипсин, ни гиалуронидаза с коллагеназой не оказывают заметного ферментативного влияния на альбумин. Вероятно, это может быть связано либо с тем, что для данных ферментов альбумин не является субстратом, либо со свойством альбумина ингибировать активность этих ферментов. Стекловидное тело, обработанное смесью всех вышеперечисленных ферментов, при помещении в раствор ДЭЦ вызывает малоинтенсивные полосы поглощения, соответствующие как альбумину, так и коллагену (рис. 7 Е). Характер спектров свидетельствует о резком понижении концентрации альбумина в стекловидном теле - до 0.09 х 10"4 моль/л, что примерно в 12 раз меньше по сравнению с контролем. Содержание коллагена в системе после обработки смесью ферментов также резко снизилось, что видно по падению полосы поглощения .1-агрегатов. Таким образом, с помощью зонда ДЭЦ было показано

450 500 550 600 650 700 450 500 550 600 650 700

X, нм Я, нм

0.14 10.12 I »-і І 0.08 I 0.06

1 0.04 Ё0.02

450

л 0.08 о

¡0.06 50.04 -

и и

; о.о2 -

¡50.08

ёо.об

¡0.04

§0.02

0.12

8 о.]

| 0.08

5 0.06 ¡л

| 0.04

Ё 0.02 о

450

Рис. 7. Спектры поглощения красителя ДЭЦ в водном растворе в отсутствие (1) и в присутствии (2) стекловидного тела глаза 19/20-недельных плодов человека без обработки ферментами (А, Б) и после обработки стекловидного тела протеиназой К (В), трипсином (Г), коллагеназой с гиалуронидазой (Д) и смесью всех ферментов (Е). Концентрация ДЭЦ составляла 1.1 х Ю-6 (А, В, Г,Д,Е) и 4.3 х 10 6 (Б) моль/л. Красными стрелками обозначены полосы транс-мономера ДЭЦ, связанного с альбумином, синими стрелками - полосы 1-агрегатов ДЭЦ на молекулах коллагена.

Рис. 8. Концентрация альбумина в стекловидном теле без

ферментативной обработки

(контроль - 1) и после ферментативной обработки

протеиназой К (2), трипсином (3), коллагеназой + гиалуронидазой (4) и смесью всех ферментов (5).

избирательное действие данных ферментов на альбумин и коллагены: протеиназа К переваривает молекулы альбумина, а трипсин и коллагеназа с гиалуронидазой не действуют на молекулы альбумина, но переваривают коллаген. Концентрации альбумина после ферментативной обработки указаны на рис. 8.

Применение зонда ДЭЦ к исследованию стекловидного тела позволило успешно оценить изменения молекулярного состава стекловидного тела под действием протеолитических ферментов. Полученные данные по ферментативной деградации компонентов стекловидного тела являются важными в свете нового направления в фармакологической терапии и лазерной хирургии при лечении некоторых заболеваний глаза. Краситель ДЭЦ в качестве спектрально-флуоресцентного зонда на альбумин и коллагены в этом плане оказался полезным для экспериментальных подходов при подборе ферментативных смесей направленного действия. Несмотря на то, что ферменты, используемые в настоящей работе (за исключением коллагеназы и гиалуронидазы), отличаются от ферментов, применяемых в хирургии, показаны принципиальные возможности исследования дозо-зависимого характера ферментативного витреолиза. Краситель ДЭЦ для такого исследования оказался удобным аналитическим инструментом.

Представленные результаты мы рассматриваем в качестве доклинических исследований, а предложенный метод как перспективный в дальнейших поисках в этом направлении. Вопрос о том, как применяемые с терапевтической целью ферменты влияют на функциональное состояние стекловидного тела, требует дальнейшего изучения.

2.5. Исследование состава стекловидного тела и жидкости передней камеры. Зонд ДЭЦ, наряду с БОБ-электрофорезом, лазерным фотолизом и автоматическим биохимическим анализатором, был использован для сравнительного исследования состава стекловидного тела и жидкости передней камеры на примере глаза травяной лягушки. В совокупности данные методы показали близость состава обеих внеклеточных сред по таким показателям, как содержание альбумина, коллагена, а также молекул-доноров электрона. На это же указывает и близость спектров поглощения обеих внеклеточных сред.

2.6. Определение каротиноидов в стекловидном теле плодов человека. Широкие спектры поглощения в области 450-470 нм стекловидного тела с 15-й по 2612%-ю недели и профили ВЭЖХ (рис. 9 А) свидетельствуют о присутствии в этот период в стекловидном теле каротиноидов (лютеина; на хроматограмме стекловидного тела присутствуют также его окисленные формы). Максимальное поглощение в области 450-470 нм наблюдалось на 16/18-й неделях и резко снижалось последовательно на стадиях 24 и 26/28 недель гестации. На 31-й неделе поглощение в этой области отсутствовало. В

стекловидном теле взрослых поглощение в области, характерной для каротиноидов, также отсутствовало, что согласуется с данными литературы об отсутствии каротиноидов в стекловидном теле глаза взрослого человека.

Сравнение возрастной динамики изменения концентраций альбумина и лютеина (рис. 5 А и 10 А), и динамики изменения их общего содержания (рис. 5 Б и 10 Б), а также совпадение стадии, на которой они достигают максимального значения, свидетельствуют о коррелятивных взаимоотношениях между альбумином и лютеином в стекловидном теле глаза плодов человека. При этом концентрация альбумина значительно превышает концентрацию лютеина, что подтверждает высказанное предположение о том, что альбумин осуществляет в стекловидном теле депонирование каротиноидов для их последующего переноса в ткани-мишени развивающегося глаза человека, в частности, в сетчатку и, возможно, в хрусталик. Избыток альбумина может обеспечивать наилучшее его связывание с каротиноидами (лютеином) для сохранения и транспортировки в ткани-мишени развивающегося глаза. Основываясь на известных фактах, что во взрослых хрусталиках присутствуют каротиноиды, мы провели исследование хрусталиков в пренатальном развитии на присутствие в них каротиноидов.

2.7. Определение каротиноидов в хрусталиках плодов человека.

Сопоставление хроматограмм хлороформ-метанольных экстрактов из нативных хрусталиков (рис. 9 Б) с хроматограммой стандарта - раствора лютеина в метаноле (рис. 9 Г) не выявило, в отличие от стекловидного тела, присутствия лютеина в хрусталиках, поскольку пики, которые давали экстракты хрусталиков, отличались от пика стандарта лютеина.

В силу способности лютеина подвергаться окислению кислородом мы предположили, что полученные хроматографические пики могут соответствовать окисленным формам лютеина.

Для проверки были проведены опыты получения окисленных форм лютеина: раствор лютеина в метаноле облучали видимым светом в течение 15 мин. При этом кислородом, присутствующим в растворе, происходило окисление лютеина с образованием его окисленных форм. Хроматограмма облученного раствора, наряду с пиком лютеина (несколько меньшей интенсивности, чем исходного раствора), содержала два дополнительных пика, положение которых соответствовало положению пиков экстрактов хрусталиков (рис. 9 В). Это свидетельствует о том, что в хрусталиках содержится не сам лютеин, а его окисленные формы.

В контрольном опыте, перед освещением, воздух из раствора лютеина в метаноле вытесняли пропусканием тока аргона в течение 10 мин, после чего облучали видимым светом в течение 30 и 90 минут. В этом опыте при

Лютеин

Окисленные формы лютеина

I ..

О 4 8

Время, мин

Рис. 9. Профили ВЭЖХ стекловидного тела (А), хрусталика (Б), раствора лютеина в метаноле, облученного видимым светом (В) и темнового лютеина (стандарт) (Г).

и 0.05 й

I 0.04

:-о.оз I

о 0.02 г

|о.о1

■х

| 0.00 о И

Ъ.

4-« _

Я«

25 30

Возраст, недели

300 п

§ 200 £

I юо ^

25 30

Возраст, недели

Рис. 10. Динамика изменения концентрации (А) и общего содержания (Б) лютеина в стекловидном теле глаза плодов человека с 16-й по 31-ю неделю развития.

фотооблучении не наблюдалось расходования лютеина и образования продуктов его окисления.

Таким образом, впервые в хрусталиках глаза плодов человека обнаружены окисленные формы каротиноидов (лютеина), тогда как неокисленных каротиноидов в хрусталиках не обнаружено.

Физиологическое значение присутствия окисленных форм лютеина в хрусталике глаза в пренатальном развитии пока не ясно. Возможно, окисление лютеина происходит в процессе выполнения им защитной антиоксидантной функции, предохраняя развивающийся хрусталик от свободно-радикального окисления. Действительно, каротиноиды образуют окисленные формы, реагируя с активными формами кислорода, выполняя антиоксидантную функцию защиты ткани от окислительного стресса. В развивающемся хрусталике человека опасность окислительного повреждения достаточно высока. Известно, что нормальная жизнеспособность хрусталика протекает в условиях окружающей его физиологической гипоксии, и потребление кислорода хрусталиком в норме сниженное. В случае если в хрусталик поступает избыток кислорода, он может вызвать кислородный стресс и генерацию активных форм кислорода, что может привести к помутнению хрусталика.

Близость гиалоидных капилляров сосудистой сумки к хрусталику создает опасность его повреждения активными формами кислорода. Возможно, лютеин, находящийся в стекловидном теле вблизи развивающегося хрусталика, предохраняет его от действия активных форм кислорода за счет их потребления в процессе собственного окисления, и поступает в хрусталик уже в окисленной форме.

2.8. Иммунохимическая характеристика сетчатки и хрусталика.

ß-III тубулин. Белки семейства ß-тубулина являются специфическими для нейробластов, отростков нейронов и формирующихся синапсов. В связи с этим ß-тубулин активно используют как ранний маркер дифференцирующихся нейронов при изучении процессов развития мозга и сетчатки. Так, о начале дифференцировки клеток сетчатки по нейрональному типу на ранних стадиях эмбрионального развития свидетельствует появление белков-тубулинов (Hatanaka, Jones, 1998). На глазу взрослого человека было показано, что белки семейства ß-тубулина являются также специфическими для связывания каротиноидов в клетках сетчатки и хрусталика. На сегодняшний день ß-тубулин рассматривается как главный каротиноид-связывающий белок в клетке и ему отводят главную роль в физиологии макулы, сетчатки и хрусталика (Li et al., 2010).

Сетчатку и хрусталик плодов человека с 12-й по 24-ю неделю, а также сетчатку и хрусталик взрослого человека, исследовали используя специфические антитела к одной из изоформ ß-тубулина к ß-III тубулину.

У 12-недельных плодов интенсивная флуоресцентная метка на Р-Ш тубулин вьивлена во всех внутренних слоях сетчатки от внутренней пограничной мембраны до внутренней границы наружного ядерного слоя (рис. 11). Следует отметить, что область специфического окрашивания распространяется и на периферию сетчатки вплоть до зубчатого края. Выше зубчатого края, в эпителиях презумптивного цилиарного тела и презумптивной радужки Р-Ш тубулин не обнаруживался. Наружный нейробластический слой и пигментный эпителий на всем своем протяжении также не имел иммунохимического сигнала (рис. 11).

У 22/23-недельных плодов ярко выраженный иммунохимический сигнал свидетельствует о локализации р-Ш тубулина в слое нервных волокон, слое ганглиозных клеток и во внутреннем сетчатом слое. Во внутреннем и наружном ядерных слоях, в наружном сетчатом слое, в пигментном эпителии, а также в эпителиях сформированного цилиарного тела и в радужке метка не обнаружена.

В сетчатке взрослого человека (рис. 12) иммунохимическое окрашивание строго ограничено слоем нервных волокон. Зубчатый край является границей, где обрывается иммунохимический сигнал и далее в эпителиях цилиарного тела и радужки не обнаруживается.

В хрусталике 12-недельных плодов иммунохимический сигнал, соответствующий белку р-Ш тубулину, присутствует во всех составляющих эмбриональное ядро волокнах, кортикальных слоях и во вновь формирующихся волокнах транзиторной зоны в экваториальной области плодного хрусталика (рис. 13 А). У 12-недельных плодов (рис. 13 А) и на всех последующих исследованных стадиях (рис. 13 Б, В, Г, Д) в клетках эпителия хрусталика иммунохимическая реакция на Р-Ш тубулин отсутствует.

В центральной части хрусталика (эмбриональное ядро) 15/16-недельных плодов белок практически отсутствует. Иммунопозитивное мечение присутствует в кортикальных слоях в области формирующихся, удлиняющихся и молодых волокон хрусталика (рис. 13 Б). У 18/19-недельных плодов в ядре хрусталика иммунохимическая реакция также отсутствует, в то время как в кортикальных слоях и в транзиторном слое формирующихся волокон присутствует положительный иммунохимический сигнал на р-Ш тубулин (рис. 13 В). У 22/24-недельных плодов в хрусталике иммунохимическое окрашивание на Р-Ш тубулин все дальше смещается к периферии и выявляется в наружном эпителиально-кортикальном слое волокон хрусталика и на экваторе в формирующихся волокнах транзиторной зоны (рис. 13 Г). В хрусталике взрослого человека Р-Ш тубулин иммунохимически определяется в узкой эпителиально-кортикальной части и в клетках, вступивших на путь формирования волокон в экваториальной области (рис. 13 Д).

Рис. 11. Локализация белка ß-III тубулина в сетчатке 12-недельных плодов человека: А, Б, В - в центральной области; Г, Д, Е - на периферии. А, Г - Antimouse Alexa 586; Б, Д - Hoechst 42333; В, Е - совмещенные.

Рис. 12. Локализация белка ß-III тубулина в сетчатке взрослого человека: А - Antimouse Alexa 488; Б - Hoechst 42333; В - совмещенные.

А Б В Г Д

Рис. 13. Локализация белка ß-III тубулина в волокнах хрусталика плодов человека. В переднем эпителии хрусталика иммунохимическая реакция отсутствует на всех стадиях: А -12 недель; Б - 15/16-недель; В - 18/19 недель; Г - 22/24 недели; Д - хрусталик взрослого человека (А - Antimouse Alexa 586 + Hoechst 42333; Б, В, Д - Antimouse Alexa 488 + Hoechst 42333; Г - Antimouse Alexa 488).

Таким образом, в эмбриональном и плодном развитии человека нами показана локализация Р-Ш тубулина в хрусталике и сетчатке, что позволило выявить динамику экспрессии данного белка в ходе развития этих структур глаза. В хрусталике и сетчатке взрослого человека Р-Ш тубулин также присутствует.

Тубулин является белком цитоскелета, который полимеризуется с образованием микротрубочек, необходимых для внутриклеточных процессов: формирования митотического аппарата, клеточной миграции, внутриклеточного транспорта, поляризации клеток, удлинения клеток, роста аксонов. Сохранение экспрессии Р-П1 тубулина в слое нервных волокон во взрослой сетчатке отражает функцию нервных волокон, связанную с проведением нервных импульсов.

Известно, что тубулины выполняют также шапероноподобные функции и предотвращают агрегацию белков хрусталика, включая Р- и у-кристаллины (СиЬа а1., 1998). Более того, существуют данные о взаимодействии тубулинов с другими молекулярными шаперонами, в частности, а-кристаллином. Показано, что а-кристаллин проявляет функцию молекулярного шаперона и относительно молекул тубулина, предотвращая их агрегацию (Аш, АШпи, 1997). Полученные нами результаты о характере паттерна экспрессии Р-Ш тубулина позволяют предположить, что Р-Ш тубулин может являться специфическим молекулярным шапероном для эмбрионального и раннего плодного развития глаза человека, обеспечивая прозрачность самых ранних волокон, формирующих эмбриональное ядро хрусталика.

В настоящей работе впервые показано присутствие каротиноидов в стекловидном теле и хрусталике. Тубулин, недавно идентифицированный как главный каротиноид-связывающий белок в клетке, возможно, играет роль в физиологии макулы, сетчатки и хрусталика. Можно предполагать с большой долей вероятности, что в раннем плодном развитии глаза человека Р-Ш тубулин выполняет функцию связывания каротиноидов в раннем периоде формирования сетчатки, ее макулярной области, и функцию связывания каротиноидов в хрусталике.

Рековерин. Иммунохимическое исследование распределения рековерина у плодов человека в сетчатке проводили с 8/9 по 22/23 недели.

Первые единичные рековерин-положительные клетки в сетчатке нами обнаружены на 10-й неделе. Эти клетки были локализованы как в наружном, так и во внутреннем нейробластических слоях и в клетках, прилегающих к наружной пограничной мембране (рис. 14 А, Б, В). Эти клетки почти всегда имели форму, вытянутую вдоль апикально-базальной оси, и равномерное окрашивание по всей цитоплазме. Форма и распределение рековерин-

вне

ннс

пэ

\в.х20

Рис. 15. Локализация белка рековерина в сетчатке 22/23-недельных плодов человека: А, Б, В - на крайней периферии сетчатки; Г, Д, Е - в экваториально-периферийной области. А, Г -Antimouse Alexa 488; Б, Д-Hoechst 42333; В, Е - Antimouse Alexa 488 + Hoechst 42333.

положительных клеток в нейробластических слоях сетчатки и проспективном ганглиозном слое на стадии 10 недель свидетельствуют об их миграции по направлению к внутренней пограничной мембране и, возможно, об экспрессии этого белка в клетках в области ганглиозного слоя. Клетки, расположенные в наружном нейробластическом слое, имеют длинные и короткие отростки, также рековерин-положительные (рис. 14 В). Длинные отростки тянутся далеко по

Рис. 14. Локализация белка рековерина в клетках сетчатки 10-недельных плодов человека: А - гистология, азокармин; Б, В - рековерин-положительные клетки. Стрелки указывают на отростки, содержащие белок - рековерин.

направлению к передней пограничной мембране. Таким образом, характерной особенностью этой стадии развития сетчатки является начало появления и накопления рековерина в отдельных клетках, что, соответственно, может быть связано с начальными процессами дифференцировки клеток развивающейся сетчатки по пути как фоторецепторов, так и других типов клеток, расположенных в других слоях сетчатки. Эти данные свидетельствуют о времени появления первых клеток, содержащих рековерин. Столь раннее обнаружение рековерин-положительных клеток в сетчатке нами показано впервые.

На последующих стадиях число рековерин-положительных клеток увеличивается, и у 12-12.5-недельных плодов эти клетки расположены в слое фоторецепторных клеток в один слой вблизи границы наружной пограничной мембраны на всем протяжении pars optica retinae. Рековерин-положительные клетки продолжают встречаться и в слое ганглиозных клеток. В центральной области сетчатки меченые клетки расположены с большой частотой; по направлению к периферии частота рековерин-положительных клеток несколько снижается, а на границе с ora serrata и далее в эпителиях презумптивной цилиарной области рековерин-положительные клетки не обнаруживаются.

В сетчатке у 20- и 22/23-недельных плодов весь слой фоторецепторов интенсивно помечен антителами против рековерина (рис. 15 Г, Д, Е); интенсивное мечение наблюдается на протяжении всей pars optica retinae, включая ее периферическую часть. На границе с ora serrata метка обрывается и далее в эпителиях цилиарного тела и радужки не обнаруживается (рис. 15 А, Б, В). В ганглиозном слое и слое нервных волокон также обнаружены рековерин-положительные клетки (рис. 15 Г, Д, Е). Ганглиозный слой на этой стадии состоит из нескольких рядов клеток; на окрашенных антителами срезах видны либо отдельные, как бы случайно разбросанные рековерин-положительные клетки, либо небольшие ряды клеток, расположенные один под другим. Рековерин-положительные клетки, обнаруживаемые во внутреннем ядерном слое и среди ганглиозных клеток, либо могут принадлежать клеткам, мигрирующим из наружного ядерного слоя, либо среди ганглиозных клеток существует популяция клеток, экспрессирующая рековерин. На вопрос, какая из этих возможностей имеет место, мы не можем пока дать исчерпывающего ответа. Выявленные рековерин-положительные клетки в апоптозе указывают на вероятную гибель клеток в ганглиозном слое сетчатки.

Кальций-связывающий внутриклеточный белок рековерин, специфичный для фоторецепторов, как известно, играет важную физиологическую роль в регуляции зрительных процессов (играет главную роль в свето- и темновой адаптации через регуляцию фосфорилирования и дефосфорилирования родопсина Са2+-зависимым образом) (Каламкаров, Островский, 2002).

Обнаружение рековерина в клетках сетчатки у плодов человека с 10-й недели, т.е. на более ранней стадии, чем это было описано в литературе (с 13-й недели) (Yan, Wiechmann, 1997), вероятно, характеризует начальные этапы дифференцировки фоторецепторов (колбочек). Присутствие рековерин-содержащих клеток в ганглиозном слое может быть связано с депонированием Са2+, необходимого для направленного роста аксонов глазного нерва и начальных стадий синаптогенеза в формирующейся сетчатке, а в более поздний период, с 14-й недели, и для направленного роста кровеносных сосудов сетчатки.

TGFbeta2. Иммунохимическое исследование сетчатки и хрусталика с антителами против TGFbeta2 проводили у плодов с 8-й по 31-ю неделю. Локализацию белка анализировали во внутренних слоях сетчатки, внутреннем эпителии цилиарного тела и хрусталике, т.е. тканях, непосредственно граничащих со стекловидным телом.

В сетчатке 8-недельных плодов иммунохимический сигнал был выявлен на всем протяжении от центра к периферии. Интенсивность иммунохимической окраски была наиболее выражена в узкой полосе во внутреннем (краевом) безъядерном слое на границе со стекловидным телом. Эта область сетчатки соответствует внутренним окончаниям (подошвам) Мюллеровых клеток. Край глазного бокала, который соответствует цилиарно-радужному зачатку, также имеет иммунохимическую окраску (рис. 16 А, Б). Данные по локализации белка TGFbeta2, полученные нами для 8-недельных плодов, хорошо согласуются с данными литературы по локализации мРНК TGFbeta2 в опытах с использованием in situ гибридизации (Gatherer et al., 1990).

Иммунопозитивная окраска на белок TGFbeta2 у 10-12-недельных плодов человека выявляется от внутренней пограничной мембраны до наружного нейробластического слоя сетчатки, с интенсивной окраской во внутренних слоях: слое формирующихся ганглиозных клеток, слое нервных волокон и, как и у 8-недельных плодов, по линии внутренней границы сетчатки (рис. 16 А, Б). На последующих стадиях у 15/16-, 17-, 24- и 31-недельных плодов во внутренних слоях сетчатки иммунохимическая окраска локализована в слое ганглиозных клеток и слое нервных волокон (рис. 16 В, Г).

У 12-недельных плодов человека уже появляются первые складки в цилиарном эпителии. Иммунопозитивный сигнал выявляется во внутреннем непигментированном эпителии этих складок (рис. 17 В, Г). У 17- и 31-недельных плодов складки цилиарного эпителия по глубине приближены к дефинитивному состоянию. В непигментированном эпителии цилиарных складок на всех этих стадиях развития наблюдается иммуноспецифическое окрашивание, свидетельствующее о присутствии в клетках TGFbeta2 (рис. 17 Д, Е).

Рис. 16. Локализация белка TGFbeta2 в сетчатке глаз человека: А, Б - у 10-; В, Г - у 31-недельных плодов. А, В, -Antimouse Alexa 586; Б, Г, - Antimouse Alexa 586 + Hoechst 42333. Масштаб -100 мкм.

)-В'Ш

Рис. 17. Локализация белка TGFbeta2 во внутреннем цилиарном эпителии и хрусталике глаз человека на разных стадиях пренатального развития.

А, Б - край глазного бокала 8-недельного плода; В, Г -цилиарно-радужный край 12-недельного плода; Д, Е -цилиарные складки 17-недельного плода; Ж -хрусталики 10- и 3 - 17-недельных плодов. А, В, Д — Antimouse Alexa 586; Б, Г, Е, Ж, 3 - Antimouse Alexa 586 + Hoechst 42333. Масштаб- 100 мкм.

В хрусталике 10-недельных плодов обнаруживается равномерное окрашивание в эпителии хрусталика и волокнах (рис. 17 Ж). У 12-недельных плодов иммунохимическая окраска в эпителии хрусталика в центральной части эпителия отсутствует, и выявляется на периферии эпителия, в пролиферативной и транзиторной зонах эпителия экваториальной области и в волокнах. На стадиях 17, 24 и 31 недель беременности иммунопозитивное окрашивание было локализовано в эпителии экваториальной области (в пролиферативной и транзиторной зонах) и в формирующихся волокнах хрусталика. При этом в переднем эпителии хрусталика иммунопозитивная окраска полностью отсутствует (рис. 17 Ж, 3).

Важную роль в эмбриональном развитии глаза играют эпителиально-мезенхимные взаимоотношения. Дифференцировка клеток - производных нервного гребня, которые мигрируют между хрусталиком и эпителием роговицы, а также развитие первичного стекловидного тела, регулируются через TGFbeta-сигнальный путь, и центральную роль в этом процессе играет хрусталик. Наши данные на протяжении всего исследованного периода свидетельствуют об экспрессии TGFbeta2 в хрусталике плодов человека.

Важнейшей функциональной характеристикой TGFbeta2 является его участие в регуляции васкулогенеза и контроле ангиогенеза, а также в формировании и обновлении внеклеточного матрикса (Zhao, Overbeek, 2001). Характерным признаком раннего развития глаза человека является формирование транзиторной гиалоидной сосудистой сети. К ней относятся главная гиалоидная артерия, ее разветвления в полости первичного стекловидного тела, сосуды задней и передней сосудистой сумки хрусталика, которые соединяются латеральными анастомозами. Эти сосуды, необходимые для роста, питания, метаболизма и созревания внутренних частей развивающегося глаза (хрусталика, сетчатки, стекловидного тела), выполнив свое назначение, постепенно подвергаются регрессии. Регрессия гиалоидных сосудов начинается с 10-й недели и полностью завершается в третьем триместре. Нарушение механизмов, контролирующих развитие и регрессию гиалоидных сосудов, приводит к врожденным аномалиям глаза, таким как персистирующая гиалоидная артерия, персистирующее гиперпластическое первичное стекловидное тело, врожденные катаракты и ретинопатия недоношенных (Saint-Geniez, D'Amore, 2004). В сетчатке, которая до 14-й недели была полностью аваскулярна, начинается формирование сосудов, и этот процесс активно продолжается до 24-й недели пренатального развития (Sandercoe et al., 1999). Все процессы, связанные с ростом и регрессией кровеносных сосудов, находятся под контролем ангиогенных (VEGF, FGF) и антиангиогенных (TGFbeta2, PDGF, TSP-1) факторов, основным регулятором которых является TGFbeta2 (Eichler et al., 2004). TGFbeta-сигнальный путь

является определяющим в процессах роста и регрессии сосудов, формировании и обновлении внеклеточного матрикса. Так, у ТСРЬе1а2-нулевых мышей наблюдаются аномалии развития глаза, среди которых следует отметить нарушения в развитии стекловидного тела, формировании и регрессии гиалоидных сосудов (Ба&а е! а1., 2001).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При системном подходе к изучению стекловидного тела глаза человека в пренатальном периоде развития (9-31 недель беременности) особое внимание было уделено исследованию содержания в этой структуре белков (альбумина, альфа-фетопротеина и коллагена) и каротиноидов в сопоставлении с динамикой роста глаза, с одной стороны, и процессами дифференцировки сетчатки и хрусталика, с другой. С помощью специально разработанных зондов (цианинового красителя ДЭЦ и скварилиевого красителя СКК) впервые было показано, что между 17-22 неделями стекловидное тело характеризуется высоким содержанием альбумина, значительно превышающим уровень альбумина в стекловидном теле глаза взрослого организма. После 24 недель беременности содержание альбумина в стекловидном теле резко снижается и к 28-й неделе достигает уровня, характерного для взрослого глаза. В этот же период пренатального развития в стекловидном теле постоянно присутствует АФП. Отсутствие связывания ДЭЦ с АФП и с гиалуроновой кислотой доказывает, что полученные результаты основаны на специфическом связывании ДЭЦ именно с альбумином человека. Оба зонда - ДЭЦ и СКК специфически связываются с альбумином стекловидного тела человека, но с альбуминами стекловидного тела изученных животных (быка, эмбрионов свиньи, новорожденных и взрослых крыс, зародышей кур, травяной лягушки) связывается только СКК, но не ДЭЦ. Это указывает на видовые отличия альбумина человека от альбуминов изученных животных.

В стекловидном теле глаза плодов человека (15-28 недель беременности) впервые обнаружено присутствие каротиноидов - лютеина, отсутствующего в стекловидном теле глаза взрослого человека. Содержание каротиноидов снижается к 28-й неделе, и у 30-недельных плодов человека каротиноиды не обнаруживаются. В стекловидном теле глаза изученных животных каротиноиды не вьивляются ни у плодов, ни у взрослых особей. Отметим, что среди изученных позвоночных только сетчатка человека и приматов обладает макулярной зоной, обогащенной каротиноидами. Выявлена корреляция между содержанием альбумина и каротиноидов в стекловидном теле в исследуемый период пренатального развития человека. Повышенное содержание этих компонентов стекловидного тела только в пренатальном периоде, совпадающем с периодом интенсивного роста глаза, дает основание предполагать, что этот

подъём должен быть связан с морфогенетическими процессами. Свойства альбумина, АФП и каротиноидов позволяют высказать ряд предположений о функциональном значении этих компонентов стекловидного тела для развития глаза. Альбумин и АФП, являясь белками-переносчиками, могут быть рассмотрены в качестве поставщиков необходимых строительных материалов и биологически активных молекул для сетчатки и хрусталика. Полиненасыщенные жирные кислоты, необходимые для формирования клеточных мембран развивающейся сетчатки и хрусталика, переносятся к тканям-мишеням посредством АФП и альбумина. Несомненно, что свойство альбумина и АФП создавать онкотическое давление, определяет их значение для установления внутриглазного давления развивающегося глаза. При этом усиливается напряжение в стенках глаза, необходимое для дальнейшего его роста и формирования нормальной организации слоев сетчатки.

На стадиях развития глаза, для которых характерно высокое содержание в стекловидном теле альбумина, АФП и каротиноидов, в сетчатке выявляются р-Ш тубулин, ТвРЬе1а2 и рековерин, а в хрусталике выявляются Р-Ш тубулин и ТСРЬе1а2 - белки, необходимые для морфогенеза и дифференцировки этих структур глаза.

Р-Ш тубулин необходим как для развития нейробластов сетчатки по нейрональному пути и роста аксонов, так и для физиологических функций связывания каротиноидов. Рековерин в пренатальном развитии определяет развитие фоторецепторов и направленный рост аксонов. Присутствие на всех исследованных стадиях фактора роста ТОРЬе1а2 в сетчатке и хрусталике свидетельствует о его важной роли в контроле роста и дифференцировки клеток этих структур, а также в контроле ангиогенеза и ремоделирования внеклеточного матрикса тканей глаза. Согласно литературным данным, ТСРЬе1а2 и каротиноиды относятся к контролирующим факторам, определяющим в сетчатке границы макулы, путем ингибирования прорастания кровеносных сосудов в эту зону. Обнаружение в настоящей работе каротиноидов в стекловидном теле открывает новые возможности для исследования морфогенетической роли каротиноидов в дифференцировке макулы.

Таким образом, стекловидное тело, являясь внутриглазной средой (уникальным внеклеточным матриксом), играет важную контролирующую роль в развитии и функциональном становлении глазного яблока (рис. 18). К 28-30 неделям пренатального развития завершаются морфогенетические процессы, связанные с альбумином и каротиноидами, необходимые для общего развития глаза. В результате завершения этих процессов глаз достигает такой степени зрелости, которая достаточна, чтобы у преждевременно рождающихся 7-месячных младенцев в дальнейшем зрение развивалось нормально.

Рис. 18. Схема взаимоотношений между стекловидным телом, сетчаткой и хрусталиком развивающегося глаза человека в пренатальном развитии на основе данных, полученных в настоящей работе.

Качественные и количественные данные по содержанию альбумина и каротиноидов, полученные в настоящей работе, задают временную шкалу развития стекловидного тела, на которую могут опираться исследователи этой структуры глаза. Результаты, полученные в настоящей работе, представляют

интерес для офтальмологии и позволяют обогатить существующие представления об этиологии врожденных патологий глаза.

ВЫВОДЫ

1. Для изучения молекулярного состава стекловидного тела глаза позвоночных разработаны спектрально-флуоресцентные зонды ДЭЦ (цианиновый краситель) и СКК (скварилиевый краситель). ДЭЦ эффективно и специфически взаимодействует с альбумином человека, а также с коллагенами позвоночных, позволяя выявлять коллагены разных типов. ДЭЦ не взаимодействует с АФП и гиалуроновой кислотой, что позволяет в их присутствии определять альбумин и коллагены. С альбумином человека специфически связываются оба зонда. СКК эффективно взаимодействует с сывороточными альбуминами изученных животных.

2. Содержание альбумина в стекловидном теле глаз плодов человека на 17-22-й неделях значительно превышает его содержание в стекловидном теле глаза взрослого человека, а затем снижается к 28-30 неделям пренатального развития до уровня взрослого. На всех исследованных стадиях одновременно с альбумином в стекловидном теле плодов человека обнаружен альфа-фетопротеин.

3. В стекловидном теле плодов человека обнаружены каротиноиды (лютеин) и окисленные формы лютеина с максимальным содержанием на 16-22-й неделях. Количество каротиноидов снижается к 28-й неделе, и с 30-й недели в стекловидном теле они не обнаруживаются. В хрусталике обнаружены только окисленные формы лютеина.

4. Между содержанием альбумина и каротиноидов в стекловидном теле наблюдается корреляция. Повышенное содержание альбумина и каротиноидов совпадает с периодом интенсивного роста глаза.

5. Разработанный зонд ДЭЦ позволил выявить селективное действие гидролитических ферментов на компоненты стекловидного тела - альбумин и коллаген. Обоснована возможность применения ДЭЦ для оценки состояния стекловидного тела после ферментативного вмешательства при лазерной хирургии и различных фармакологических воздействиях.

6. На стадиях развития, для которых характерно высокое содержание в стекловидном теле альбумина, АФП и каротиноидов, в сетчатке выявляются Р-III тубулин, ТОРЬе1а2 и рековерин, а в хрусталике выявляются Р-Ш тубулин и ТСЕЬе1а2 - белки, необходимые для морфогенеза и дифференцировки этих структур глаза. Изменение локализации этих белков в процессе дифференцировки сетчатки и хрусталика отражает морфогенетические события в этих структурах.

7. Морфогенетические процессы в развитии глаза, в регуляции которых принимают участие альбумин и каротиноиды, завершаются на 28-й неделе.

Важность и завершенность этих процессов подтверждается возможностью нормального развития глаза у преждевременно рожденных 7-месячных младенцев.

Список работ в журналах, соответствующих Перечню ВАК, и в рецензируемых иностранных изданиях.

1. Панова И.Г. Цитоструктура и цитохимия пигментного эпителия сетчатки. // Известия РАН. Серия биологическая 1993. № 2. С. 165-190.

2. Панова И.Г. Межфоторецепторный матрикс: развитие, состав и функциональное значение. // Онтогенез. 1994. Т. 25. № 1. С. 5-13.

3. Кочеткова Е.А., Сдобникова C.B., Панова И.Г., Гаврилова Б.А. Эмбриогенез стекловидного тела // Офтальмология. 2004. Т. 1. № 3. С. 38-42.

4. Панова И.Г., Сдобникова C.B., Гаврилова Б.А. Провизорные структуры в эмбриональном развитии глаза // Офтальмология. 2005. Т. 2. № 1. С. 25-30.

5. Рожкова Г.И., Панова И.Г., Хохлова Т.В., Орлов О.Ю. // Механизмы фокусировки изображений в глазах камерного типа у позвоночных животных. Сенсорные системы. 2005. Т. 19. № 3. С. 181-211.

6. Татиколов A.C., Панова И.Г. Спектроскопическое изучение взаимодействия полиметиновых красителей с коллагенами // Химия высоких энергий. 2005. Т. 39. № 4. С. 275-279.

7. Панова И.Г., Татиколов A.C. Обнаружение альбумина в стекловидном теле глаза человека с использованием цианинового красителя в качестве зонда // Докл. АН. 2005. Т. 402. № 5. С. 709-711.

8. Панова И.Г., Подгорный О.В., Вердиев Б., Смирнова Ю.А., Полтавцева P.A., Григорян Э.Н., Зиновьева Р.Д., Александрова М.А., Сухих Г.Т., Миташов В.И. Пролиферативные и дифференцировочные потенции клеток сетчатки плода человека in vivo и in vitro // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2005. № 2. С. 103-109.

9. Панова И.Г., Подгорный О.В., Маркитантова Ю.В., Смирнова Ю.А., Милюшина JÏ.B., Полтавцева P.A., Григорян Э.Н., Александрова М.А., Зиновьева Р.Д., Филиппов П.П., Сухих Г.Т., Миташов В.И. Экспрессия специфического белка фоторецепторов рековерина на ранних стадиях пренатального развития сетчатки человека: иммуноспецифическое и молекулярно-биологическое исследование // Офтальмология. 2006. Т. 3. № 1. С. 20-25.

10. Строева О.Г., Панова И.Г. Особенности клеточной пролиферации в период роста и становления специфической дифференцировки пигментного эпителия сетчатки (на модели лабораторных животных). // Российская педиатрическая офтальмология. 2007. № 4. С. 53-55.

11. Яковлева М.А., Панова И.Г., Фельдман Т.Б., Зак П.П., Татиколов A.C., Сухих Г.Т., Островский М.А. Обнаружение каротиноидов в стекловидном теле

глаза человека в ходе его пренатального развития // Онтогенез. 2007. Т. 38. № 5. С. 380-385.

12. Panova I.G., Sharova N.P., Dmitrieva S.B., Poltavtseva R.A., Sukhikh G.N., Tatikolov A.S. The use of a cyanine dye as a probe for albumin and collagen in the extracellular matrix // Anal. Biochem. 2007. V. 361. No. 2. P. 183-189.

13. Панова И.Г., Татиколов A.C., Сухих Г.Т. Корреляция между содержанием альбумина и каротиноидов в стекловидном теле глаза человека в пренатальном развитии // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2007. Т. 144. № 11. С. 522-525.

14. Панова И.Г., Маркитантова Ю.В., Фирсова Н.В., Подгорный О.В., Смирнова Ю.А., Сухих Г.Т., Зиновьева Р.Д., Миташов В.И. Исследование экспрессии ß-III тубулина в тканях глаза человека в пренатальном развитии // Изв. РАН. Сер. биол. 2008. № 2. С. 146-150.

15. Panova I.G., Sharova N.P., Dmitrieva S.B., Levin P.P., Tatikolov A.S. Characterization of the composition of the aqueous humor and the vitreous body of the eye of the frog Rana temporaria L. И Comp. Biochem. Physiol. Part A. 2008. V. 151. P. 676-681.

16. Татиколов A.C., Панова И.Г., Ищенко A.A., Кудинова M.А. Спектрально-флуоресцентное изучение взаимодействия скварилиевых красителей -производных ЗЯ-индолия - с альбуминами // Биофизика. 2010. Т. 55. № 1. С. 46-53.

17. Татиколов A.C., Акимкин Т.М., Кашин A.C., Панова И.Г. Мезо-замещенные полиметиновые красители - эффективные спектрально-флуоресцентные зонды для биомакромолекул // Химия высоких энергий. 2010. Т. 44. № 3. С. 224-227.

18. Татиколов A.C., Ищенко A.A., Кудинова М.А., Панова И.Г. Исследование нековалентного взаимодействия скварилиевых красителей с сывороточными альбуминами // Химия высоких энергий. 2010. Т. 44. № 4. С. 333-339.

19. Панова И.Г., Милюшина Л.А., Фирсова Н.В., Маркитантова Ю.В., Сухих Г.Т., Зиновьева Р.Д. Иммунофлуоресцентное исследование локализации ß-III тубулина в хрусталике глаза человека II Офтальмология. 2010. Т. 7. № 4. С. 1923.

20. Сухих Г.Т., Панова И.Г., Смирнова Ю.А., Милюшина JI.A., Фирсова Н.В., Маркитантова Ю.В., Полтавцева P.A., Зиновьева Р.Д. Экспрессия TGFbeta2 в стекловидном теле и тканях, с ним пограничных, в пренатальном развитии глаза человека // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2010. № 3. С. 132-137.

21. Панова И.Г., Татиколов A.C., Полтавцева P.A., Сухих Г.Т. Альфа-фетопротеин в стекловидном теле глаза плодов человека // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2010. Т. 150. № 10. С. 391-393.

22. Panova I.G., Tatikolov A.S. Characterization of the vitreous body of the human eye using a cyanine dye as a spectral and fluorescent probe. // Proc. SPIE. 2009. V. 7163. P. 716310-1-716310-7.

23. Panova I.G., Tatikolov A.S. Sharova N.P. Use of a cyanine dye probe to estimate the composition of the vitreous body after enzymatic treatment. // Proc. SPIE. 2010. V. 7550. P. 75501W-1-75501W-7.'

24. Панова И.Г., Татиколов A.C. Исследование содержания альфа-фетопротеина и сывороточного альбумина в стекловидном теле глаза плодов человека // Изв. РАН. Сер. биол. 2011. № 2. С. 235-239.

25. Яковлева М.А., Панова И.Г., Татиколов А.С., Фельдман Т.Б., Полтавцева Р.А., Сухих Г.Т., Островский М.А. Обнаружение окисленных форм каротиноидов в хрусталике глаза в ходе пренатального развития человека // Катарактальная и рефракционная хирургия. 2011. Т. 11. № 3. С. 40-43.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АФП - альфа-фетопротеин

ДЭЦ - цианиновый краситель - пиридиниевая соль 3,3'-ди-(у-сульфопропил)-

4,5,4',5'-дибензо-9-этилтиакарбоцианин-бетаина СКК - скварилиевый краситель с сульфогруппами (производный ЗН-индолия) вне - внутренний нейробластический слой всс - внутренний сетчатый слой вяс - внутренний ядерный слой вхр- волокна хрусталика вэцт - внутренний эпителий цилиарного тела гк - слой ганглиозных клеток кгб - край глазного бокала кс - краевой слой сетчатки нв - слой нервных волокон ннс - наружный нейробластический слой нее - наружный сетчатый слой няс - наружный ядерный слой пэ - пигментный эпителий сетчатки с - сетчатка

ссхр - сосудистая сумка хрусталика хр - хрусталик

црк - цилиарно-радужный край эпхр - эпителий хрусталика

Подписано в печать 16.02.2012 г.

Формат 60x90/16. Заказ 1521. Тираж 100 экз.

Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов.

Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, Ленинский пр. 42, тел. 774-26-96

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Панова, Ина Георгиевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Обзор литературы.

1.1. Общая характеристика стекловидного тела глаза позвоночных.

1.2. Развитие стекловидного тела глаза человека.

1.2.1. Клетки стекловидного тела.

1.3. Значение стекловидного тела в развитии глаза.

1.4. Биохимическая характеристика стекловидного тела.

ГЛАВА 2. Материалы и методы.

2.1. Исследование глаз человека.

2.1.1. Препарирование глаз.

2.1.2. Исследование стекловидного тела с применением спектрально-флуоресцентного зонда ДЭЦ.

2.1.3. Измерение концентраций АФП и альбумина в стекловидном теле.

2.1.4. Гель-электрофорез и Вестерн блот анализ.

2.1.5. Ферментативная обработка стекловидного тела.

2.1.6. Высокоэффективная жидкостная хроматография.

2.1.7. Гистология.

2.1.8. Иммунохимия.

2.2. Исследование внутренних сред глаза амфибий.

ГЛАВА 3. Результаты.

3.1. Разработка спектрально-флуоресцентных зондов для исследования внеклеточных сред организма.

3.2 Исследование стекловидного тела и жидкости передней камеры у травяной лягушки Rana temporaria L.

3.3. Исследование глаз плодов человека в развитии.

3.3.1. Спектроскопический анализ стекловидного тела с применением зонда ДЭЦ.

3.3.2. Гель-электрофорез и Вестерн блоттинг.

3.3.3. Концентрация и общее содержание альбумина в стекловидном теле плодов человека.

3.3.4. АФП в стекловидном теле глаза плодов человека.

3.3.5. Влияние ферментов на компоненты стекловидного тела.

3.3.6. Определение каротиноидов в стекловидном теле и хрусталике плодов человека.

3.3.7. Концентрация и общее содержание каротиноидов в стекловидном теле плодов человека.

3.3.8. Корреляция между содержанием альбумина и каротиноидов в стекловидном теле глаза человека в пренатальном развитии.

3.4. Гистологическое исследование стекловидного тела, сетчатки и хрусталика.

3.4.1. Гистогенез стекловидного тела, цилиарных складок и сетчатки.

3.4.2. Митозы в сетчатке у плодов человека.

3.4.3. Гистогенез хрусталика.

3.5. Иммунохимическая характеристика сетчатки и хрусталика.

3.5.1. Локализация p-III тубулина в сетчатке и хрусталике.

3.5.2. Локализация рековерина в сетчатке.

3.5.3. Трансформирующий фактор роста бета 2 (TGF-P2).

ГЛАВА 4. Обсуждение.

4.1. Стекловидное тело человека.

4.1.1. Альбумин и АФП.

4.1.2. Каротиноиды.

4.1.3. Каротиноиды и развитие макулы.

4.1.4. Роль каротиноидов в предохранении сетчатки от повреждающих факторов.

4.1.5. Каротиноиды и развитие хрусталика.

4.1.6. Р"Ш тубулин как депонирующая и стабилизирующая молекула для каротиноидов в сетчатке и хрусталике.

4.1.7. Тубулины как шапероны.

4.1.8. ТвРЬе1а2 в сетчатке и хрусталике как фактор регуляции зародышевого и дефинитивного кровоснабжения.

4.1.9. Перспективы использования зондов в последующих доклинических исследованиях глаза.

4.2. Сравнительные исследования стекловидного тела.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Развитие стекловидного тела глаза человека"

Все данные о роли фактора натяжения в развитии глаза, занимающие значительное место в экспериментальной эмбриологии, были получены в опытах, в которых тем или иным путём достигались нарушения условий для формирования и накопления массы стекловидного тела (Сои1ошЬге, 1956, 1969; Строева и др., 1989). При этом изучению молекулярных компонентов стекловидного тела в развитии глаза, за небольшим исключением, практически не уделялось внимания. Всестороннее исследование, в том числе на молекулярном уровне, периодов развития стекловидного тела как важного компонента становления структуры и функции глаза, и особенно глаза человека, лежит в русле актуальных проблем биология развития.

Достижение цели требовало решения следующих задач:

4) провести анализ состава стекловидного тела на присутствие в нем специфического эмбрионального белка АФП;

5) исследовать, присутствуют ли в стекловидном теле и хрусталике глаза плодов человека каротиноиды;

6) исследовать локализацию рековерина, Р-Ш тубулина и ТСРЬе1а2 в сетчатке, а также Р-Ш тубулина и ТОБЬе1а2 в хрусталике, в пренатальном развитии человека.

Научная новизна и теоретическая значимость работы. - Разработаны спектрально-флуоресцентные зонды на основе полиметиновых красителей, один из которых (пиридиниевая соль 3,3'-ди-(у-сульфопропил)-4,5,4',5'-дибензо-9-этилтиакарбоцианин-бетаина (ДЭЦ)) является специфичным только для сывороточного альбумина человека.

- Зонд ДЭЦ способен различать коллагены разных типов, но не взаимодействует с АФП и гиалуроновой кислотой, входящими в состав стекловидного тела плодов человека.

- Выявлено, что наряду с альбумином в стекловидном теле глаза плодов человека присутствует АФП.

- Исследована динамика изменения локализации белков рековерина, Р-Ш тубулина и ростового фактора ТвРЬе1а2 в сетчатке и Р-Ш тубулина и ТОРЬе1а2 в хрусталике по мере развития глаза.

Научная и практическая значимость работы.

Положения, выносимые на защиту:

5. Выявленные изменения локализации [3-1П тубулина отражают структурные и функциональные процессы, происходящие в сетчатке и хрусталике в пренатальном развитии.

Апробация работы. Результаты работы были представлены и обсуждены на более чем 20 российских и международных форумах, съездах, симпозиумах, конференциях и коллоквиумах, включая следующие: Международная научно-практическая конференция «Пролиферативный синдром в офтальмологии» (Москва, 2004, 2006, 2008, 2010); Международный симпозиум «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия» (Санкт-Петербург, 2004); Конференция молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Москва, 2004, 2005, 2006); Научно-практическая конференция «Регенеративная медицина и трансплантация тканей в офтальмологии» (Москва, 2005); I и III Съезды физиологов СНГ (Сочи, 2005, Ялта, 2011); FRIS-2005 (Chester, Great Britain, 2005); Конференция «Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты» (Москва, 2005); III Международное совещание и VI Школа по эволюционной физиологии» (Санкт-Петербург, 2006); International Symposium on Molecular Photonics Devoted to the Memory of Acad. A.N. Terenin (St. Petersburg, Russia, 2006); 2-я Научная конференция с участием стран СНГ «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (Петрозаводск, 2007); XXIII International Conference on Photochemistry (Cologne, Germany, 2007); Симпозиум с международным участием «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза» (Москва, 2007); International Conference on Molecular and Nanoscale Systems for Energy Conversion (Moscow, Russia, 2007); Научно-практическая конференция «Нанотехнологии в диагностике и лечении патологии органа зрения» (Москва, 2008); V и VI Съезды Российского фотобиологического общества (Пущино, 2008, Шепси, 2011); VI Сибирский физиологический съезд (Барнаул, 2008); IV и V Российские симпозиумы «Белки и пептиды» (Казань, 2009, Петрозаводск, 2011); International Conference "Organic Nanophotonics" (ICON-Russia 2009); III и

IV Международные научно-практические конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2009, 2011); Российский общенациональный офтальмологический форум с международным участием (Москва, 2009); Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино,

2009); SPIE Photonics West. BIOS. Conf.: Ophthalmic Technologies (USA, 2009,

Заключение Диссертация по теме "Биология развития, эмбриология", Панова, Ина Георгиевна

ВЫВОДЫ

6. На стадиях развития, для которых характерно высокое содержание в стекловидном теле альбумина, АФП и каротиноидов, в сетчатке выявляются ß-III тубулин, TGFbeta2 и рековерин, а в хрусталике выявляются ß-III тубулин и TGFbeta2 - белки, необходимые для морфогенеза и дифференцировки этих структур глаза. Изменение локализации этих белков в процессе дифференцировки сетчатки и хрусталика отражает морфогенетические события в этих структурах.

7. Морфогенетические процессы в развитии глаза, в регуляции которых принимают участие альбумин и каротиноиды, завершаются на 28-й неделе. Важность и завершенность этих процессов подтверждается возможностью нормального развития глаза у преждевременно рожденных 7-месячных младенцев.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Панова, Ина Георгиевна, Москва

1. Авдеева В.И., Шапиро Б.И. J-агрегация тиакарбоцианина в водно-желатиновых растворах. Химия высоких энергий. 2005. Т. 39. № 6. С. 467471.

2. Авдонин П.В., Ткачук В.А. Рецепторы и внутриклеточный кальций. М.: Наука, 1994. С. 168-171.

3. Бордюгова Г.Г. Замещение стекловидного тела в хирургии глаза. 1973. Москва. Медицина. 160 с.

4. Воробьев И.А., Григорьев И.С. Динамика и жизненный цикл микротрубочек в клетке. Цитология и генетика. 2003. Т. 37. № 2. С. 22-38.

5. Воротеляк Е.А., Шихвердиева А.Ш., Васильев A.B., Терских В.В. Фибробласты стимулируют эпителизацию коллагенового геля. Изв. РАН. Сер. биол. 2002. № 4. С. 421-426.

6. Давиденко H.A., Ищенко A.A., Кувшинский Н.Г. Фотоника молекулярных полупроводниковых композитов на основе органических красителей. Киев: Наукова думка. 2005. 296 с.

7. Даниличев В.Ф. Патология глаз. Ферменты и ингибиторы. Санкт-Петербург: «Стройпечать». 1996. 240 с.

8. Дижур A.M., Некрасова Э.Н., Филиппов П.П., Новый специфичный для фоторецепторных клеток белок с молекулярной массой 26 кДа, способный связываться с иммобилизованным делипидизированным родопсином. Биохимия. 1991. Т. 56. С. 225-229.

9. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. М.: Наука, 1989. 277 с.

10. Добрецов Г.Е. Развитие исследований связывающих центров альбумина. В кн. «Альбумин сыворотки крови в клинической медицине». Под. ред. Ю.А. Грызунова и Г.Е. Добрецова. «ГЭОТАР», Москва, 1998. С. 20-27.

11. Зорин H.A., Рыков В.А., Потехин В.К., Савиных В.И., Чирикова Т.С. Сравнительная характеристика белков стекловидного тела глаза упозвоночных. Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 1985. Т. 21. №2. С. 130-133.

12. Каламкаров Г.Р., Островский М.А. Молекулярные механизмы зрительной рецепции. Москва, «Наука», 2002. 280 с.

13. Комарова М.Н., Грызунов Ю.А. Строение молекулы альбумина и ее связывающих центров. В кн.: Альбумин сыворотки крови в клинической медицине. Ред. Ю.А. Грызунов и Г.Е. Добрецов. Книга 2. Москва, «ГЭОТАР», 1998. С. 28-51.

14. Молдогазиева Н.Т., Терентьев A.A. Альфа-фетопротеин и факторы роста. Структурно-функциональные взаимоотношения и аналогии. Успехи биологической химии. 2006. Т. 46. С. 99-148.

15. Наумов С.П. Зоология позвоночных. Москва, «Просвещение», 1973. С. 126-129.

16. Николаева Т.И., Тиктопуло Е.И., Ильясова E.H., Кузнецова С.М. Структурно-термодинамические аспекты упаковки коллагеновых фибрилл. Биофизика. 2007. Т. 52. Вып. 5. С. 899-911.

17. Панова И.Г., Маркитантова Ю.В., Фирсова Н.В., Подгорный О.В., Смирнова Ю.А., Сухих Г.Т., Зиновьева Р.Д., Миташов В.И. Исследование экспрессии ß-III тубулина в тканях глаза человека в пренатальном развитии. Изв. РАН. Сер. биол. 2008. № 2. С. 146-150.

18. Пири А., ван Гейнинген Р. Биохимия глаза. Москва, «Медицина», 1968. 400 с.

19. Примова Л.А., Высоцкий И.Ю. Каротиноиды: структура, метаболизм, биологические функции, http://rudocs.exdat.com/docs/index-251113.html

20. Пэттен Б.М. Эмбриология человека. Москва, Медгиз, 1959. С. 386-406.

21. Степуро И.И. Воздействие свободных радикалов на сывороточный альбумин. В кн. «Альбумин сыворотки крови в клинической медицине». Под. ред. Ю.А. Грызунова и Г.Е. Добрецова. Москва, «ГЭОТАР», 1998. С. 187-201.

22. Строева О.Г. Морфогенез и врожденные аномалии глаза млекопитающих. Москва, Наука. 1971. 244 с.

23. Строева О.Г., Дольникова А.Э., Сологуб А.А., Белкин В.М. Иммуногистохимическое исследование локализации фибронектина при формировании сосудистой оболочки под влиянием пигментного эпителия у куриных зародышей. Онтогенез. 1989. Т.20. № 4. С. 350-356.

24. Толмачев А.И., Ильченко А.Я. Скварилиевые красители. Журнал научной и прикладной фотографии. 2000. Т. 45. № 6. С. 5-26.

25. Фениш X. Карманный атлас анатомии человека на основе Международной номенклатуры. Минск, «Высшая школа», 1996. С. 354-368.

26. Черешнев В.А., Родионов С.Ю., Черкасов В.А., Малютина Н.Н., Орлов О.А. Альфа-фетопротеин. Екатеринбург, УрО РАН, 2004. 376 с.

27. Adinolfi A., Adinolfi М., Lessof М.Н. Alpha-feto-protein during development and in disease. J. Med. Genetics. 1975. V. 12. P. 138-151.

28. Akiya S., Uemura Y., Saga U. Morphological study on glycosaminoglycans in the developing human vitreous. Ophthalmic Res. 1984. V. 16. P. 145-149.

29. Albe' E., Chang J-H., Azar N.F., Ivanov A.R., Azar D.T. Proteomic analysis of the hyaloid vascular system regression during ocular development. Journal of Proteome Research. 2008. V. 7. P. 4904^1913.

30. Allen W.S., Otterbein E.C., Wardi A.H. Isolation and characterization of the sulfated glycosaminoglycans of the vitreous body. Biochim. Biophys. Acta. 1977. V. 498. P. 167-175.

31. Allende M.A. Blood vessel growth in primate retinal development: relationship of retinal maturation with choriocapillaris growth and a role for TGF-B in the retina. A thesis submitted in fulfillment of the requirements for the degree of

32. Doctor of Philosophy. Department of Clinical Ophthalmology and Save Sight Institute, University of Sydney, 2008. 243 p.

33. Alves-Rodrigues A., Shao A. The science behind lutein. Toxicology Lett. 2004. V. 150. P. 57-83.

34. Amaya L., Taylor D., Russell-Eggitt I., Nischal K.K., Lengyel D. The morphology and natural history of childhood cataracts. Surv. Ophthalmol. 2003. V. 48. P. 125-144.

35. Arai H., Atomi Y. Chaperone activity of aB-crystallin suppresses tubulin aggregation through complex formation. Cell Structure and Function. 1997. V. 22. P. 539-544.

36. Arciniegas A., Amaya L.E. Bio-structural model of the human eye. Ophthalmologica. 1980. V. 180. P. 207-211.

37. Aubin M.L., Gionfriddo J.R., Khursheed R.M., Powell C.C. Analysis of aqueous humor obtained from normal eyes of llamas and alpacas. Am. J. Vet. Res. 2001. V. 62. P. 1060-1062.

38. Aussel C., Uriel J., Mercier-bodard C. Rat alpha-fetoprotein: isolation, characterization and estrogen-binding properties. Biochimie. 1973. V. 55. P. 14311437.

39. Ayad S., Weiss J.B. A new look at vitreous-humor collagen. Biochem J. 1984. V. 218. P. 835-840.

40. Azuma N., Tajima S., Konomi H., Hida T., Akiya S., Uemura Y. Glycosaminoglycan and collagen distribution in the developing human vitreous. Graefe's Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 1998. V. 236. P. 679-687.

41. Balazs E.A. Fine structure of the developing vitreous. Int. Ophthalmol. Clin. 1975. V. 15. P. 53-63.

42. Balazs E.A. The vitreous. In: The Eye. H. Davson, Ed. Academic Press. London. 1984. P. 533-589.

43. Balazs E.A., Denlinger J.L. Aging changes in the vitreous. In: Aging and human visual function (eds. N. Dismukes, R. Sekular). Alan R. Liss. New York. 1982. P. 45-47.

44. Balazs E.A., Laurent T.C., Laurent U.B.G. Studies on the structure of the vitreous body VI. Biochemical changes during development. J. Biol. Chem. 1959. V. 234. No. 2. P. 422-430.

45. Balazs E.A., Sundblad L. Studies on the structure of the vitreous body. V. Soluble protein content. J. Biol. Chem. 1960. V. 235. № 7. P. 1973-1978.

46. Balazs E.A., Toth L.Z., Ozanics V. Cytological studies on the developing vitreous as related to the hyaloid vessel system. Graefe's Arch. Clin. Exp. Opthalmol. 1980. V. 213. No. 2. P. 71-85.

47. Barber A.N. Embryology of the human eye. London. Kimpton. 1955. 236 p.

48. Bassnett S., McNulty R. The effect of elevated intraocular oxygen on organelle degradation in the embryonic chicken lens. J. Exp. Biol. 2003. V. 206. P. 43534361.

49. Baudouin C., Fredj-Reygrobellet D., Brignole F., Negre F., Lapalus P., Gastaud P. Growth factors in vitreous and subretinal fluid cells from patients with proliferative vitreoretinopathy. Ophthalmic Res. 1993. V. 25. No. 1. P. 52-59.

50. Beebe D.C. Maintaining transparency: a review of the developmental physiology and pathophysiology of two avascular tissues. Semin. Cell Dev. Biol. 2008. V. 19. No. 2. P. 125-133.

51. Beebe D., Garcia C., Wang X., Rajagopa R., Feldmeier M., Kim J.-Y., Chytil A., Moses H., Ashery-Padan R., Rauchman M. Contributions by members of the TGFbeta superfamily to lens development. Int. J. Dev. Biol. 2004. V. 48. P. 845856.

52. Bian Z.M, Elner S.G, Elner V.M. Regulation of VEGF mRNA expression and protein secretion by TGF-beta2 in human retinal pigment epithelial cells. Exp. Eye Res. 2007. V. 84. No. 5. P. 812-822.

53. Birnholz J.C., Farrell E.E. Fetal hyaloid artery: timing of regression with US. Radiology. 1988. V. 166. N3. P. 781-783.

54. Bishop P.N. Structural macromolecules and supramolecular organization of the vitreous gel. Progress in Retinal and Eye Res. 2000. V. 19. No. 3. P. 323-344.

55. Bishop P.N., Ayad S., Reardon A.J., McLeod D., Sheehan J.K., Kielty C. Type VI collagen is present in human and bovine vitreous. Graefe's Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 1996. V. 234. P. 710-713.

56. Bishop P.N., Crossman M.V., McLeod D., Ayad S. Extraction and characterization of the tissue forms of collagen types II and IX from bovine vitreous. Biochem. J. 1994. V. 299. P. 497-505.

57. Bishop P.N., Holmes D.F., Kadler K.E., McLeod D., Bos K.J. Age-related changes on the surface of vitreous collagen fibrils. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2004. V. 45. No. 4. P. 1041-1046.

58. Bishop P.N., Takanosu M., Le Goff M., Mayne R. The role of the posterior ciliary body in the biosynthesis of vitreous humour. Eye. 2002. V. 16. P. 454-460.

59. Bernstein P.S. New insights into the role of the macular carotenoids in age-related macular degeneration. Resonance Raman studies. 2002. Pure Appl. Chem., Vol. 74. No. 8. P. 1419-1425.

60. Bernstein P.S., Balashov N.A., Tsong E.D., Rondo R.R. Retinal tubulin binds macular carotenoids. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1997. V. 38. No. 1. P. 167-175.

61. Bernstein P.S , Khachik F., Carvalho L.S. Muir G.J., Zhao D.Y., Katz N.B. Identification and quantitation of carotenoids and their metabolites in the tissues of the human eye. Exp. Eye Res. 2001. V. 72. P. 215-223.

62. Bertazolli-Filho R., Laicine E.M., Haddad A., Synthesis and secretion of transferrin by isolated ciliary epithelium of rabbit. Biochem. Biophys. Res. Comm. 2003. V. 305. P. 820-825.

63. Blobe G.C., Schiemann W.P., Lodish H.F. Role of transforming growth factor b in human disease. N. Engl. J. Med. 2000. V. 342. P. 1350-1358.

64. Bone R.A., Landrum J.T., Fernandez L., Tarsis S.L. Analysis of the macular pigment by HPLC: retinal distribution and age study. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1988. V. 29. No. 6. P. 843-849.

65. Bone R.A., Landrum J.T., Friedes L.V., Gomez C.M., Kilburn M.D., Menendez E., Vidal I., Wang W. Distribution of lutein and zeaxanthin stereoisomers in the human retina. Exp. Eye Res. 1997. V. 64. No. 2. P. 211-218.

66. Boswell B.A., VanSlyke J.K., Musil L.S. Regulation of lens gap junctions by TGFp. Mol. Biol. Cell. 2010. V. 21. No. 10. P. 1686-1697.

67. Bozanic D., Bocina I., Sagara-Babic M. Involvement of cytoskeletal proteins and growth factor receptors during development of the human eye // Anat. Embryol. 2006. V. 211. P. 367-377.

68. Bremer F.M., Rasquin F. Histochemical localization of hyaluronic acid in vitreous during embryonic development. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1998. V. 39. P. 2466-2469.

69. Bringmann A., Pannicke Th., Grosche J, Francke M., Wiedemann P., Skatchkov S.N., Osborne N.N., Reichenbach A. Muller cells in the healthy and diseased retina. Progress in Retinal and Eye Research. 2006. V. 25. P. 397^424.

70. Brown L., Rimm E.B., Seddon J.M., Giovannucci E.L., Chasan-Taber L., Spiegelman D., Willett W.C., Hankinson S.E. A prospective study of carotenoid intake and risk of cataract extraction in US men. Am. J. Clin. Nutr. 1999. V. 70. P. 517-524.

71. Cagianut B., Wunderly C. Protein studies on the human vitreous body. Brit. J. Ophthalmol. 1953. V. 37. P. 229-233.

72. Campian J.L., Qian M., Gao X., Eaton J.W. Oxygen tolerance and coupling of mitochondrial electron transport. J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 46580-46587.

73. Campochiaro P.A. Retinal and choroidal neovascularization. J. Cell. Physiol. 2000. V. 184. P. 301-310.

74. Carail M., Caris-Veyrat C. Carotenoid oxidation products: From villain to saviour? Pure Appl. Chem. 2006. V. 78. No. 8. P. 1493-1503.

75. Cardoso D.R., Franco D.W., Olsen K., Andersen M.L., Skibsted L.H. Reactivity of bovine whey proteins, peptides, and amino acids toward triplet riboflavin as studied by laser flash photolysis. J. Agric. Food Chem. 2004. V. 52. P. 66026606.

76. CelentanoJ.C., Burke J.D., Hammond B.R. In vivo assessment of retinal carotenoids: macular pigment detection techniques and their impact on monitoring pigment status. J. Nutr. 2002. V. 132. P. 535S-539S.

77. Chai Y., Ito Y., Han J. TGF-32 signaling and its functional significance in regulating the fate of cranial neural crest cells. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 2003. V. 14. No. 2. P. 78-88.

78. Chan-Ling T., McLeod S.D., Hughes S., Baxter L., Chu Y., Hasegawa T., Lutty G.A. Astrocyte-endothelial cell relationships during human retinal vascular development. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2004. V. 45. P. 2020-2032.

79. Chen C., Michelini-Norris B., Stevens S., Rowsey J., Ren X., Goldstein M., Schultzl G. Measurement of mRNAs for TGFb and extracellular matrix proteins in corneas of rats after PRK. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2000. V. 41. P. 41084116.

80. Chen Y.G., Hata A., Lo R.S., Wotton D., Shi Y., Pavletich N., Massague J. Determinants of specificity in TGF-beta signal transduction. Genes Dev. 1998. V. 12. P. 2144-2152.

81. Clark J.I., Matsushima H., David L.L., Clark J.M. Lens cytoskeleton and transparency: a model. Eye. 1999. V. 13. P. 417-424.

82. Collett T.S., Udin S.B. Frog use retinal elevation as a cue to distance. J. Comp. Physiol. A. 1988. V. 163. P. 677-683.

83. Consigli S.A., Lyser K.M., Joseph-Silverstein J. The temporal and spatial expression of basic fibroblast growth factor during ocular development in the chicken. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1993. V. 34. No. 3. P. 559-566.

84. Coulombre A.J. The role of intraocular pressure in the development of the chick eye. I. Control of eye size. J. Exp. Zool. 1956. V. 133. No. 2. P. 211-226.

85. Coulombre A.J. Regulation of ocular morphogenesis. Invest. Ophthalmol. 1969. V. 8. No. l.P. 25-30.

86. Coulombre A.J., Herrmann H. Lens development. III. Relationship between the growth of the lens and the growth of the outer eye coat. Exp. Eye Res. 1965. V. 4. P. 302-311.

87. Coulombre A.J., Steinberg S.N., Coulombre J.L. The role of intraocular pressure in the development of the chick eye. V. Pigmented epithelium. Invest. Ophthal. 1963. V. 2. P. 83-89.

88. Cousins S.W., McCabe M.M., Danielpour D., Streilein W. Identification of transforming growth factor-beta as an immunosuppressive factor in aqueous humor. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1991. V. 32. P. 2201-2211.

89. Davanger M. The suspensory apparatus of the lens. The surface of the ciliary body. Acta Ophthalmologica. 1975. V. 53. P. 19-33.

90. Davanger M., Ringvold A. The ciliary body and the suspension of the lens in a monkey (Cercopithecus aethiops). A scanning electron microscopic study. Acta Ophthalmologica. 1977. V. 55. No. 6. P. 965-975.

91. Delaey E., van Laar F., De Vos D., Kamuhabwa A., Jacobs P., de Witte P. A comparative study of the photosensitizing characteristics of some cyanine dyes. J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 2000. V. 55. P. 27-36.

92. Delaey E.M., Vantieghem A.M., Derycke A., Agostinis P.M., de Witte P.A.M. In vitro photobiological evaluation of Rhodac, a new rhodacyanine photosensitizer. Photochem. Photobiol. 2001. V. 74. No. 2. P. 331-338.

93. Denlinger J.L., Eisner G., Balazs E.A. Age-related changes in the vitreus and lens of rhesus monkeys (Macaca mulatta). Exp. Eye Res. 1980. V. 31. P. 67-79.

94. De Raad S., Comte M., Nef P., Lenz S.E., Gundelfinger E.D., Cox J.A. Distribution pattern of three neural calcium-binding proteins (NCS-1, VILIP and recoverin) in chicken, bovine and rat retina. Histochem. J. 1995. V. 27. No. 7. P. 524-535.

95. Diaz-llopis M., Cervera E. Posterior vitreous detachment and pharmacologic vitreolysis: the new age of enzymatic vitrectomy. Arch. Soc. Esp. Ophtalmol. 2007. V. 82. P. 465-466.

96. Diez-Roux, G., Lang, R. A. Macrophages induce apoptosis innormal cells in vivo. Development. 1997. V. 124. No. 18. P. 3633-3638.

97. Djano J., Griffin B., van Brüggen I., McMenamin P.G. Environmental scanning electron microscopic study of macrophages associated with the tunica vasculosa lentis in the developing rat eye. Br. J. Ophthalmol. 1999. V. 83. P. 1384-1385.

98. Durchschlag H., Fochler C., Abraham K., Kulawik B. Radiation effects on eye components. Radiation Physics and Chemistry. 1999. V. 55. P. 691-697.

99. Dziegielewska K.M., Evans C.A.N., Lai P.C.W., Lorscheider F.L., Malinowska D.H., Mollgard K., Saunders N.R. Proteins in cerebrospinal fluid and plasma of fetal rats during development. Dev. Biol. 1981. V. 83. Issue 1. P. 193-200.

100. Easterbrook M., Sloan A. Anomalies of the human hyaloid system. Can. J. Ophthalmol. 1978. V. 13. P. 283-286.

101. Edqvist P-H.D., Hallböök F. Newborn horizontal cells migrate bi-directionally across the neuroepithelium during retinal development. Development. 2004. V. 131. P. 1343-1351.

102. Eichler W., Yafai Y., Wiedemann P., Reichenbach A. Angiogenesis-related factors derived from retinal glial (Muller) cells in hypoxia. NeuroReport. 2004. V. 15. P. 1633-1637.

103. Eisenstein R, Grant-Bertacchini D. Growth inhibitory activities in avascular tissues are recognized by anti-transforming growth factor beta antibodies. Curr. Eye Res. 1991. V. 10. P. 157-162.

104. El-Hifnawi E., El-Hifnawi A., Frankenberg C., Keeler C. Ultrastructure and regression of the tunica vasculosa lentis in newborn wistar rats. Ann. Anat. 1994. V. 176. P. 143-149.

105. Falbe-Hansen I., Ehlers N., Degn J.K. Development of the human foetal vitreous body. 1. Biochemical changes. Acta Ophthalmol. 1969. V. 47. P. 39-43.

106. Farnsworth P.H., Mauriello J.A., Burke-Cadomski P., Kulyk T., Cinnotti A.A. Surface ultrastructure of the human lens capsule and Zonula attachment. Invest. Ophthalmol. 1976. V. 13. P. 36-40.

107. Fatt I. Hydraulic flow conductivity of the vitreous gel. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1977. V. 16. No. 6. P. 565-568.

108. Fautsch M.P., Johnson D.H. Second ARVO/Pfizer Research Institute Working Group, 2006. Aqueous humor outflow: what do we know? Where will it lead us? Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2006.V. 47. P. 4181^187.

109. Fitch J.M., Mentzer A., Mayne R., Linsenmayer T.F. Acquisition of type IX collagen by the developing avian primary corneal stroma and vitreous. Dev. Biol. 1988. V. 128. P. 396-405.

110. Flugel-Koch C., Ohlmann A., Piatigorsky J., Tamm E. R. Disruption of anterior segment development by TGF-pi overexpression in the eyes of transgenic mice. 2002. Dev. Dyn.V. 225 .P. 111-125.

111. Forrester J.V., Edgar W., Prentice C.R., Forbes C.D., Williamson J. The effect of fibrinolytic inhibition in the resolution of experimental vitreous hemorrhage. Am. J. Ophthalmol. 1977. V. 84. No. 6. P. 810-814.

112. Fraser J.R.E., Laurent T.C., Laurent U.B.G. Hyaluronan: its nature, functions and turnover. J. Intern. Med. 1997. V. 242. P. 27-33.

113. Freeman M.I., Jacobson B., Toth L.Z., Balazs E.A. Lysosomal enzymes associated with vitreous hyalocyte granules. 1. Intracellular distribution patterns of enzymes. Exp. Eye Res. 1968. V. 7. P. 113-120.

114. Friedman J.S., Ducharme R., Raymond V., Walter M.A. Isolation of a novel iris-specific and leucine-rich repeat protein (oculoglycan) using differential selection. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2000. V. 41. P. 2059-2066.

115. Friedman J.S., Faucher M., Hiscott P., Biron V.L., Malenfant M., Turcotte P., Raymond V., Walter M.A. Protein localization in the human eye and genetic screen ofopticin. Human Molecular Genetics. 2002. V. 11. No. 11. P. 1333-1342.

116. Gallop P.M., Seifter S. Preparation and properties of soluble collagens. Meth. Enzymol. 1963. V. 6. P. 635-641.

117. Gariano R.F., Iruela-Arispe M.L., Hendrickson A.E. Vascular development in primate retina: comparison of laminar plexus formation in monkey and human. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1994. V. 35. P. 3442-3455.

118. Gatherer D., Duke P.T., Baird D.T., Akhurst R.J. Expression of TGF-3 isoforms during first trimester human embryogenesis. Development. 1990. V. 110. P. 445460.

119. Gordon-Thompson C., de Iongh R.U., Hales A.M. et al. Differential cataractogenic potency of TGFbetal, -beta2, and -beta3 and their expression in the postnatal rat eye. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1998. V. 39. P. 1399-1409.

120. Gould D.B, Smith R.S, John S.W.M. Anterior segment development relevant to glaucoma. Int. J. Dev. Biol. 2004. V. 48. P. 1015-1029.

121. Gregora Z. Creatinine and urea in the vitreous body. Soud. Lek. 1984. V. 29. No. 4. P. 55-59.

122. Grimshaw J, Kane A., Trocha-Grimshaw J, Douglas A, Chakravarthy U, Archer D. Quantitative analysis of hyaluronan in vitreous humor using capillary zone electrophoresis. Electrophoresis. 1994. V. 15. P. 936-940.

123. Gude C, Rettig W. Radiative and nonradiative excited state relaxation channels in squaric acid derivatives bearing differently sized donor substituents: a comparison of experiment and theory. J. Phys. Chem. A. 2000. V. 104. P. 80508057.

124. Guha S, Manna T.K, Das K.P, Bhattacharyya B. Chaperone-like activity of tubulin. J. Biol. Chem. 1998. V. 273. No. 46. P. 30077-30080.

125. Hagins W.A, Yoshikami S. A role for Ca in excitation of retinal rods and cones. Exp. Eye Res. 1974. V. 18. P. 299-300.

126. Halfter W, Dong S., Schurer B, Ring C, Cole G.J, Eller A. Embryonic synthesis of the inner limiting membrane and vitreous body. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2005. V. 46. No. 6. P. 2202-2209.

127. Hardy P, Dumont I, Bhattacharya M, Hou X, Lachapelle P, Varmab D.R, Chemtoba S. Oxidants, nitric oxide and prostanoids in the developing ocular vasculature: a basis for ischemic retinopathy. Cardiovascular Research. 2000. V. 47. P. 489-509.

128. Hatanaka Y, Jones E.G. Early region-specific gene expression during tract formation in the embryonic rat forebrain. J. Comp. Neurol. 1998. V. 395. P. 296309.

129. Hawkins K.N. Contribution of plasma proteins to the vitreous of the rat. Curr. Eye Res. 1986. V. 5. № 9. P. 655-63.

130. Hayashi K, Nakashima Y, Sueishi K, Tanaka K, Fibrinolytic activity and localization of plasminogen activator in bovine vitreous body and aqueous humor. Jpn. J. Ophthalmol. 1989. V. 33. No. l.P. 66-75.

131. Herz A.H. Aggregation of sensitizing dyes in solution and their adsorption onto silver halides. Adv. Coll. Interf. Sci. 1977. V. 8. P. 237-298.

132. Hindson V.J., Gallagher J.T., Halfter W., Bishop P.N. Opticin binds to heparan and chondroitin sulfate proteoglycans. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2005. V. 46.1. P. 4417-4423.

133. Hogan V.J., Alvarado J.A., Weddel J.E. Histology of the human eye. 1971. W.B. Saunders Company. Philadelphia, USA. 687 p.

134. Holekamp N.M., Shui Y.B., Beebe D.C. Vitrectomy surgery increases oxygen exposure to the lens: a possible mechanism for nuclear cataract formation. Am. J. Ophthalmol. 2005. V. 139. P. 302-310.

135. Hollenberg M.J., Spira A.W. Human retinal development: ultrastructure of the outer retina. Am. J. Anat. 1973. V. 137. No. 4. P. 357-385.

136. Hughes D. A. Effects of dietary antioxidants on the immune function of middle-aged adults. Proceedings of the Nutrition Society. 1999. V. 58. P. 79-84.

137. Hyatt G.A., Beebe D.C. Regulation of lens cell growth and polarity by an embryo-specific growth factor and by inhibitors of lens cell proliferation and differentiation. Development. 1993. V. 117. P. 701-709.

138. Iozzo R.V. The biology of the small leucine rich proteins functional network of interactive proteins. J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 18843-18846.

139. Jack R.L. Ultrastructural aspects of hyaloid vessel development. Arch. Ophthalmol. 1972 a. V. 87. P. 427-437.

140. Jack R.L. infrastructure of the hyaloid vascular system. Arch. Ophthalmol. 1972 b. V. 87. P. 555-567.

141. Jacobson B., Dorfman T., Basu P.K., Hasany S.M. Inhibition of vascular endothelial cell growth and trypsin activity by vitreous. Exp. Eye Res. 1985. V. 41. P. 581-595.

142. Jamieson P.N., Shaw D.G. Levels of albumin, a-fetoprotein, and IgG in human fetal cerebrospinal fluid. Arch. Dis. Child. 1975. V. 50. P. 484-485.

143. Jampel H.D., Roche N., Stark W.J, Roberts A.B. Transforming growth factor-(3 in human aqueous humor. Curr. Eye Res. 1990. V. 9. P. 963-969.

144. Jewell V.C., Northrop-Clewes C.A., Tubman R., Thurnham D.I. Nutritional factors and visual function in premature infants. Proc. Nutrition Soc. 2001. V. 60. P. 171-178.

145. Jotwani G., Wadhwa S., Nag T.C., Singhal S. Localization of glutamate in the human retina during early prenatal development. JBiosci. 1998. V. 23. P. 15-18.

146. Kaczurowski M.J. Zonular fibers of the human eye. Am. J. Ophthalmol. 1964. V. 58. P. 1030-1047.

147. Kaila K., Voipio J., Akerman K.E. Free extracellular Ca2+. at photoreceptor level equals that in vitreous in frog and carp eyes. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1984. V. 25. No. 12. P. 1395-1401.

148. Kaluzny J., Kaluzny J. J., Raukuc D. Uric acid level in aqueous humor of patients with cataract. Klin. Oczna. 1996. V. 98. No. 4. P.271-273.

149. Kim T.Y., Kim W.I., Smith R.E., Kay E.D. Role of p27(Kipl) in cAMP- and TGF-beta2-mediated antiproliferation in rabbit corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2001. V. 42. No. 13. P. 3142-3149.

150. Kekomakmi M., Seppalac M., Ehnholma C., Schwartz L., Raivio K. Perfusion of isolated human fetal liver: synthesis and release of a-fetoprotein and albumin. Int. J. Cancer. 1971. V. 8. P. 250-258.

151. Kessel R.G., Kardon R.H., Tissues and organs: a text-atlas of scanning electron microscopy. W.H. Freeman and Co., USA, UK, 1979.

152. Khachik F., Bernstein P.S., Garland D.L. Identification of lutein and zeaxanthin oxidation products in human and monkey retinas. Invest. Ophthalmol. Visual Sci. 1997. V. 38. N9. P. 1802-1811.

153. Ko M.-K., Chi J.G., Chang B.-L. Hyaloid vascular pattern in the human fetus. J. Pediatric Ophthalmol. Strabismus. 1985. V. 22. No. 5. P. 188-193.

154. Kovalska V.B., Losytskyy M.Yu., Yarmoluk S.M. Luminescence spectroscopic studies of trimethinecyanines substituted in polymethine chain with nucleic acids and proteins. Spectrochim. Acta Part A. 2004. V. 60. P. 129-136.

155. Krebs I., Brannath W., Glittenberg C., Zeiler F., Sebag J., Binder S. Posterior vitreomacular adhesion: a potential risk factor for exudative age-related macular degeneration? Am. J. Ophthalmol. 2007. V. 144. No. 5. P. 741-746.

156. Krinsky N.I. Carotenoids protection against oxidation. Pure and Appl. Chem. 1979. V. 51. P. 649-660.

157. Krinsky N.I. The biological properties of carotenoids. Pure and Appl. Chem. 1994. V. 66. No. 5. P. 1003-1010.

158. Krinsky N.I., Russett M.D., Handelman G.J., Snodderly D.M. J. Nutr. 1990. V. 120. No. 12. P. 1654-1662.

159. R.F. Kubin, A.N. Fletcher. Fluorescence quantum yields of some rhodamine dyes. J. Lumin. V. 27, No.4. December 1982-February 1983. P. 455^162.

160. Kubinyiova M., Pospisilova E. Role of apoptosis and proliferation in differentiation of human retina, regio olfactoria and region respiratoria. Biomed. Papers. 2001. V. 145. No. 2. P. 65-68.

161. Landrum J.T., Bone R.A., Joa H., Kilburn M.D., Moore L.L., Sprague K.E. A one year study of the macular pigment: the effect of 140 days of a lutein supplement. Exp. Eye Res. 1997 a. V. 65. P. 57-62.

162. Landrum J.T., Bone R.A., Kilburn M.D. The macular pigment: a possible role in protection from age-related macular degeneration. Adv. Pharmacol. 1997 b. V. 38. P. 537-556.

163. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970. V. 227. No. 5259. P. 680-685.

164. Lang R.A. Which factors stimulate lens fiber cell differentiation in vivo? Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1999. V. 40. P. 3075-3078.

165. Lang R.A., Bishop J.M. Macrophages are required for cell death and tissue remodeling in the developing mouse eye. Cell. 1993. V. 74. No. 3. P 453-462.

166. Latker C.H., Kuwabara T. Regression of the tunica vasculosa lentis in the postnatal rat. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1981. V. 21. No. 5. P. 689-699.

167. Lazarus H.S., Hageman G.S. In situ characterization of the human hyalocyte. Arch. Ophthalmol. 1994. V. 112. No. 10. P. 1356-1362.

168. Le A.-C. N., Musil L.S. A novel role for FGF and extracellular signal-regulated kinase in gap junction-mediated intercellular communication in the lens. J. Cell Biol. 2001. V. 154. P. 197-216.

169. Lee P.-F., Fox R., Henrick I., Lam W.K.W. Correlation of aqueous humor ascorbate with intraocular pressure and outflow facility in hereditary buphthalmic rabbits. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1978. V. 17. P. 799-802.

170. Li B., Vachali P., Bernstein P.S. Human ocular carotenoid-binding proteins. Photochem. Photobiol. Sci. 2010. No. 9. P. 1418-1425.

171. Li S.-Y., Lo A.C.Y. Lutein protects RGC-5 cells against hypoxia and oxidative stress. Int. J. Mol. Sci. 2010. V. 11. P. 2109-2117.

172. Liang G.N., Chakrabarti B. Spectroscopic studies on pepsin-solubilized vitreous and cartilage collagens. Current Eye Res. 1981. V. 1. No. 3. P. 175-181.

173. Liebler D.C., McClure T.D. Antioxidant reactions of (3-carotene: Identification of carotenoid-radical adducts. Chem. Res. Toxicol. 1996. V. 9. No. 1. P. 8-11.

174. Loeliger M., Rees S. Immunocytochemical development of the guinea pig retina. Exp. Eye Res. 2005. V. 80. P. 9-21.

175. Lovicu F.J., McAvoy J.W. Growth factor regulation of lens development. Dev. Biol. 2005. V. 280. P. 1-14.

176. Lutty G.A., Mello R.J., Chandler C., Fait C., Bennett A., Patz A. Regulation of cell growth by vitreous humour. J. Cell Sci. 1985. V. 76. P. 53-65.

177. Lutty G.A., Merges C., Threlkeld A.B., Crone S., McLeod D.S. Heterogeneity in localization of isoforms ofTGF-P in human retina, vitreous, and choroids. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1993. V. 34. No. 3. P. 477-487.

178. Lyu J., Joo C.-K. Wnt signaling enhances FGF2-triggered lens fiber cell differentiation. Development. 2004. V. 131. P. 1813-1824.

179. Mann I. The development of the human eye. London. Brit. Med. Assoc. 1949. 313 p.

180. Mann I. Developmental abnormalities of the eye. Second Ed., B.M.A. House, Tavistock Square, W.C.I., 1957. 419 p.

181. Marc R.E. The Structure of Vertebrate Retinas. In: The Retinal Basis of Vision. Toyoda et al., Eds., Elsevier, Amsterdam, 1999. P. 3-19.

182. Mares-Perlman J.A., Millen A.E., Ficek T.L., Hankinson S.E. The body of evidence to support a protective role for lutein and zeaxanthin in delaying chronic disease. Overview. J. Nutr. 2002. V. 132. P. 518S-524S.

183. Massague J. TGF-beta signal transduction. Annu. Rev. Biochem. 1998. V. 67. P. 753-791.

184. Mattson M.P., Kater S.B. Calcium regulation of neurite elongation and growth cone motility. J. Neurosci. 1987. V. 7. P. 4034-4043.

185. Mayne R., Cook T., Takanosu M. Vit-1 is synthesized by the lens during the development of the mouse eye. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2000. V. 41. P. S868.

186. Mayne R., Ren Z.-X., Liu J., Cook T., Carson M., Narayana S. VIT-1: the second member of a new branch of the vWFA superfamily. Biochem. Soc. Trans. 1999. V. 27. P. 832-835.

187. McAvoy J.W. Induction of the eye lens. Differentiation. 1980. V. 17. P. 137149.

188. McCabe K.L., Gunther E.C., Reh T.A. The development of the pattern of retinal ganglion cells in the chick retina: mechanisms that control differentiation. Development. 1999. V. 126. P. 5713-5724.

189. McGinnis J.F., Stepanik P.L., Jariangprasert S., Lerious V. Functional significance of recoverin localization in multiple retina cell types. J. Neurosci. Res. 1997. V. 50. P. 487^95.

190. Mignone J.L., Kukekov V., Chiang A.-S., Steindler D., Enikolopov G. Neural stem and progenitor cells in nestin-GFP transgenic mice. J. Comp. Neurol. 2004. V. 469. V. 311-324.

191. Milam A.H., Hendrickson A.E., Xiao M., Smith J.E., Possin D.E., John S.K., Nishina P.M. Localization of tubby-like protein 1 in developing and adult human retinas. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2000. V. 41. P. 2352-2356.

192. Miyazono K., Ichijo H., Heldin C.-H. Transforming growth factor-3: latent forms, binding proteins and receptors. Growth Factors. 1993. V. 8. P. 11-22.

193. Miyazono K., Kusanagi K., Inoue H. Divergence and convergence of TGF-beta/BMP signaling. J. Cell Physiol. 2001. V. 187. P. 265-276.

194. Mizejewski G.J. Alpha-fetoprotein structure and function: relevance to isoforms, epitopes, and ocnformational variants. Exp. Biol. Med. 2001. V. 226. P. 377^08.

195. Mizejewski G.J. Biological roles of alpha-fetoprotein during pregnancy and perinatal development. Exp. Biol. Med. 2004. V. 229. P. 439-463.

196. Muller-Eberhard U., Liem H.H., Cox K.H., Conway T.P. Hemopexin synthesis in vitro by human fetal tissues. Pediat. Res. 1975. V. 9. P. 519-521.

197. Multu F., Leopold I.H. The structure of fetal hyaloid system and tunica vasculosa lentis. Arch. Ophthalmol. 1964. V. 71. P. 102-110.

198. Nag T.C., Wadhwa S. Differential expression of syntaxin-1 and synaptophysin in the developing and adult human retina. J. Biosci. 2001. V. 26. No. 2. P. 179191.

199. Nag T.C., Wadhwa S. Morphological and neurochemical development of the human neural retina. Neuroembryol. Aging. 2007. V. 4. P. 19-30.

200. Napier H.R.L., Kidson S.H. Molecular events in early development of the ciliary body: A question of folding. Exp. Eye Res. 2007. V. 84. P. 615-625.

201. Neath P., Roche S.M., Bee J.A. Intraocular pressure-dependent and -independent phases of growth of the embryonic chick eye and cornea. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1991. V. 32. No. 9. P. 2483-2491.

202. Newman E.A. Membrane physiology of retinal glial (Muller) cells. J. Neurosci. 1985. V. 5. No. 8. P. 2225-2239.

203. Newsome D.A., Linsenmayer T.F., Trelstad R.L. Vitreous body collagen: evidence for a dual origin from the neural retina and hyalocytes. J. Cell Biol. 1976. V. 71. P. 59-67.

204. Nishimura M., Ikeda T., Ushiyama M., Nanbu A., Kinoshita S., Yoshimura M. Increased vitreous concentrations of human hepatocyte growth factor in proliferative diabetic retinopathy. J. Clin. Endocrinol. Met. 1999. V. 84. No. 2. P. 659-662.

205. Noda Y., Hata Y., Hisatomi T., Nakamura Y., Hirayama K., Miura M., Nakao S., Fujisawa K., Sakamoto T., Ishibashi T. Functional properties of hyalocytes under PDGF-rich conditions. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2004. V. 45. No. 7. P. 2107-2114.

206. Norose K., Clark J.I., Syed N.A., Basu A., Heber-Katz E., Sage E.H., Howe C.C. SPARC deficiency leads to early-onset cataractogenesis. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1998. V. 39. P. 2674-2680.

207. Noulas A.V., Skandalis S.S., Feretis E., Theocharis D.A., Karamanos N.K. Variations in content and structure of glycosaminoglycans of the vitreous gel from different mammalian species. Biomed. Chromatogr. 2004. V. 18. P. 457-461.

208. Palmquist B.M, Philipson B, Barr P.O. Nuclear cataract and myopia during hyperbaric oxygen therapy. Br. J. Ophthalmol. 1984. V. 68. P. 113-117.

209. Pasquale L.R, Dorman-Pease M.E, Lutty G.A, Quigley H.A, Jampel H.D. Immunolocalization of TGF-ßl,TGF-ß2, and TGF-ß3 in the anterior segment of the human eye. Invest. Ophthalmol. Vis. Sei. 1993. V. 34. P. 23-30.

210. Pena J.D.O, Taylor A.W, Ricard C.S, Vidal I, Hernandez M.R. Transforming growth factor beta. isoforms in human optic nerve heads. Brit. J. Ophthalmol. 1999. V. 83.No. 2. P. 209-218.

211. Peress N.S, Perillo E. TGF and TGF-ß3 immunoreactivity within the ciliary epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sei. 1994. V. 35. No. 2. P. 435-457.

212. Peters Jr.T. All about albumin: biochemistry, genetics, and medical application. N.Y.: Acad. Press, 1996. 432 p.

213. Piek E, Heldin C.-H, ten Dijke P. Specificity, diversity, and regulation in TGF-ß superfamily signaling. FASEB J. 1999. V. 13. P. 2105-2124.

214. Ponsioen T.L, van der Worp R.J, van Luyn M.J.A, Hooymans J.M, Los L.I. Packages of vitreous collagen (type II) in the human retina: an indication of postnatal collagen turnover? Exp. Eye Res. 2005. V. 80. No. 5. P. 643-650.

215. Ponsioen T.L, van Luyn M.J.A, van der Worp R.J, Pas H.H., Hooymans J.M.M, Los L.I. Human retinal Müller cells synthesize collagens of the vitreous and vitreoretinal interface in vitro. Mol. Vision. 2008. V. 14. P. 652-660.

216. Prasain J.K, Moore R, Hurst J.S, Barnes S, van Kuijk F.J.G.M. Electrospray tandem mass spectrometric analysis of zeaxanthin and its oxidation products. J. Mass Spectrom. 2005. V. 40. P. 916-923.

217. Preis I, Langer R, Brem H, Folkman J. Inhibition of neovascularization by an extract derived from vitreous. Am. J. Ophthalmol. 1977. V. 84. No. 3. P. 323-328.

218. Provis J.M., Billson F.A., Russell P. Ganglion cell topography in human fetal retinae. Invest. Ophthalmol. 1983. V. 24. N. 9. P. 1316-1320.

219. Provis J.M., Hendrickson A.E. The foveal avascular region of developing human retina. Arch. Ophthalmol. 2008. V. 126. №. 4. P. 507-511.

220. Provis J.M., Leech J., Diaz C.M., Penfold P.L., Stone J., Keshet E. Development of the human retinal vasculature: cellular relations and VEGF expression. Exp. Eye Res. 1997. V. 65. No. 4. P. 555-568.

221. Provis J.M., Penfold P.L., Cornish E.E., Sandercoe T.M., Madigan M.C. Anatomy and development of the macula: specialization and the vulnerability to macular degeneration. Clin. Exp. Optometry. 2005. V. 88. No. 5. P. 269-281.

222. Ramesh S., Bonshek R.E., Bishop P.N. Immunolocalisation of opticin in the human eye. Br. J. Ophthalmol. 2004. V. 88. P. 697-702.

223. Reardon A.J., Heinegard D., McLeod D., Sheehan J.K., Bishop P.N. The large chondroitin sulphate proteoglycan versican in mammalian vitreous. Matrix Biol. 1998. V. 17. P. 325-333.

224. Ringvold A., Anderssen E., Jellum E., Bjerkas E., Sonerud G.A., Haaland P.J., Devor T.P., Kj0nniksen I. UV-absorbing compounds in the aqueous humor from aquatic mammals and various non-mammalian vertebrates. Ophthalmic Res. 2003. V. 35. P. 208-216.

225. Roche M., Rondeau P., Singh N.R., Tarnus E., Bourdon E. The antioxidant properties of serum albumin. FEBS Letters. 2008. V. 582. P. 1783-1787.

226. Rock C.L., Thornquist M.D., Neuhouser M.L., Kristal A.R., Neumark-Sztainer D., Cooper D.A., Patterson R.E., Cheskin L.G. Diet and lifestyle correlates of lutein in the blood and diet. Nutr. 2002. No. 3. P. 525S-530S.

227. Rodrigues M.L., Filho R.B., Laicine E.M., Haddad A. Transferrin production by the ciliary body of rabbits: a biochemical and immunocytochemicfl study. Curr. Eye Res. 1998. V.17. P. 694-699.

228. Sabah J., McConkey E., Welti R., Albin K., Takemoto L.J. Role of albumin as a fatty acid carrier for biosynthesis of lens lipids. Exp. Eye Res. 2005. V. 80. P. 3136.

229. Saika S. TGFb pathobiology in the eye. Lab. Invest. 2006. V. 86. P. 106-115.

230. Saika S., Liu C.Y., Azhar M., Sanford L.P., Doetschman Т., Gendron R.L., Kao C.W., Kao W.W. TGFbeta2 in corneal morphogenesis during mouse embryonic development. Dev. Biol. 2001. V. 240. No. 2. P. 419-432.

231. Saint-Geniez M., D'Amore P.A. Development and pathology of the hyaloid, choroidal and retinal vasculature. Int. J. Dev. Biol. 2004. V. 48. P. 1045-1058.

232. Salerno C., Crifo C., Capuozzo E., Sommerburg O., Langhansc C.-D., Siems W. Effect of carotenoid oxidation products on neutrophil viability and function. BioFactors. 2005. V. 24. P. 185-192.

233. Salit P.W. Calcium content of the aqueous and vitreous humors and serum. J. Biol. Chem. 1934. V. 104. P. 275-280.

234. Salu P., Claeskens W., DeWilde A., Hijmans S.W., Wisse E. Light and electron microscopic studies of the rat hyalocyte after perfusion fixation. Ophthalmic Res. 1985. V. 17. No. 3. P. 125-130.

235. Sanders E.J., Walter M.A., Parker E., Aramburo C., Harwey S. Opticin binds retinal growth hormone in the embryonic vitreous. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.2003. V. 44. No. 12. P. 5404-5409.

236. Schulz M.W., Chamberlain C.G., de Iongh R.U., McAvoy J.W. Acidic and basic FGF in ocular media and lens: implications for lens polarity and growth patterns. Development. 1993. V. 118. P. 117-126.

237. Sebag J. Age-related changes in human vitreous structure. Graefe's Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 1987. V. 225. P. 89-93.

238. Sebag J. The vitreous: structure, function and photobiology. Springer-Verlag. New York. 1989.

239. Sebag J. Classifying posterior vitreous detachment a new way to look at the invisible. Brit. J. Ophthalmol. 1997. V. 81. P. 521-522.

240. Sebag J. Seeing the invisible: the challenge of imaging vitreous. J. Biomed. Opt.2004. V. 9. P. 38—46.

241. Sebag J. Molecular biology of pharmacologic vitreolysis. Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 2005. V. 103. P. 473-494.

242. Sebag J., Ansari R.R. Suh K.I. Pharmacologic vitreolysis with microplasmin increases vitreous diffusion coefficients. Graefe's Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 2007. V. 245. P. 576-580.

243. Sen A., Roy R., Mukherjee K.L. Ascorbic acid concentration in developing human fetal vitreous humor. Indian J. Ophthalmol. 1983. V. 31. P. 73-74.

244. Sharma R.K., O'Leary T.E., Fields C.M., Johnson D.A. Development of the outer retina in the mouse. Dev. Brain Res. 2003. V. 45. P. 93-105.

245. Shui Y-B., Fu J-J., Garcia C., Dattilo L.K., Rajagopal R., McMillan S., Mak C., Holekamp N.M., Lewis A., Beebe D.C. Oxygen distribution in the rabbit eye andoxygen consumption by the lens. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2006. V. 47. P. 1571-1580.

246. Siddigi N.J., Sharma B., Alhomida A.S. A study on distribution of different hydroxyproline fractions in the bovine ocular tissues. Mol. Cell Biochem. 2001. V. 317. P. 67-71.

247. Soreg H., Miskin R. Plasminogen activator in the rodent brain. Brain Res. 1981. V. 216. P. 361-374.

248. Spector A. Oxidative stress induced cataract: Mechanism of action. FASEB

249. Stromland K., Miller M, Cook C. Ocular teratology. Surv. Ophthalmol. 1991. V. 35. No. 6. P. 429-446.

250. Swann D.A., Constable I.J. Vitreous structure. I. Distribution of hyaluronate and protein. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1972. V. 11. No. 3. P. 159-163.

251. Sydorova M., Lee M.S. Vascular endothelial growth factor levels in vitreous and serum of patients with either proliferative diabetic retinopathy or proliferative vitreoretinopathy. Ophthalmic Res. 2005. V. 37. P. 188-190.

252. Takanosu M., Boyd T.C., Le Goff M., Henry S.P., Zhang Y., Bishop P.N., Mayne R. Structure, chromosomal location and tissue-specific expression of the mouse opticin gene. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2001. V. 42. P. 2202-2210.

253. Tatikolov A.S., Costa S.M.B. Effects of normal and reverse micellar environment on the spectral properties, isomerization and aggregation of a hydrophilic cyanine dye. Chem. Phys. Lett. 2001. V. 346. P. 233-240.

254. Tatikolov A.S., Costa S.M.B. Complexation of polymethine dyes with human serum albumin: a spectroscopic study. Biophys. Chem. 2004. V. 107. P. 33-49.

255. Taylor C.M., Weiss J.B. Partial purification of a 5.7K glycoprotein from bovine vitreous which inhibits both angiogenesis and collagenase activity. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1985. V. 133. No. 3. P. 911-916.

256. Timtcheva I., Maximova V., Deligeorgiev T., Zaneva D., Ivanov I. New asymmetric monomethine cyanine dyes for nucleic-acid labelling: absorption and fluorescence spectral characteristics. J. Photochem. Photobiol. A: Chem. 2000. V. 130. P. 7-11.

257. Tinoco J., Babcock R., Hincenbergb I., Medwadowski B., Miljanich P., Williams M.A. Linoleic acid deficiency. Lipids. 1976. V. 14. P. 166-173.

258. Townes-Anderson E., Raviola G. Morphology and permeability of blood vessels in the prenatal rhesus monkey eye: how plasma components diffuse into the intraocular fluids during development. Exp. Eye Res. 1982. V. 35. No. 3. P. 203230.

259. Tripathi R.C., Millard C.B., Tripathi B.G. Protein composition of human aqueous humor: SDS-PAGE analysis of surgical and post-mortem samples. Exp. Eye Res. 1989. V. 48. P. 117-130.

260. Tripathi B.J., Tripathi R.C., Livingston A.M., Borisuth N.S.C. The role of growth factors in the embryogenesis and differentiation of the eye. Am. J. Anatomy. 1991. V. 192. P. 442-471.

261. Tripathi R.C., Tripathi B.J., Park J. Localization of urokinase-type plasminogen activator in human eyes: an immunocytochemical study. Exp. Eye Res. 1990. V. 51. No. 5. P. 545-552.

262. Turrens J.F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J. Physiol. (Lond.). 2003. V. 552. P. 335-344.

263. Ugocsai K., Varga A., Molnar P., Antus S., Molnar J. Effects of selected flavonoids and carotenoids on drug accumulation and apoptosis induction inmultidrug-resistant colon cancer cells expressing MDR1/LRP. In Vivo. 2005. V. 19. No. 2. P. 433-438.

264. Uriel J., de Nechaud B., Dupiers M. Estrogen-binding properties of rat, mouse and man fetospecific serum proteins. Demonstration by immuno-autoradiographic methods. Biophys. Biochim. Res. Commun. 1972. V. 46. P. 1175-1180.

265. Uriel J., Trojan J., Moro R., Pineirob A. Intracellular uptake of alpha-fetoprotein: a marker of neural differentiation. Annals New York Academy of Sciences. 1983. V. 417. P. 321-329.

266. Van Bockxmeer F.M., Martin C.E., Constable I.J. Iron-binding proteins in vitreous humour. Biochim. Biophys. Acta. 1983. V. 758. P. 17-23.

267. Van Houwelingen A.C., Puis J., Hornstra G. Fetal essential fatty acid (EFA) status during early human development: relationchip with maternal EFA status. Am. J. Clin. Nutr. 1993. V. 57 (suppl). P. 814S.

268. Vidal R. M. Selective localization of alpha-fetoprotein and serum albumin within the sensory ganglia cells of developing chicken. Neuroscience Letters. 1983. V. 41. No. 3. P. 253-257.

269. Volkova K.D., Kovalska V.B., Losytskyy M.Yu., Bento A., Reis L.V., Santos P.F., Almeida P., Yarmoluk S.M. Studies of benzothiazole and benzoselenazole squaraines as fluorescent probes for albumins detection. J. Fluoresc. 2008. V. 18. P. 877-882.

270. Wadhwa S., Jotwani G., Bijlani V. Human retinal ganglion cell development in early prenatal period using carbocyanine dye Dil. Neurosci. Lett. 1993. V. 157. P. 175-178.

271. Walls G.L. The vertebrate eye and its adaptive radiation. Cranbrook Press, Bloomfield Hills (Mich.), 1942.

272. Wang F., Wang Z., Sun X., Wang F., Xu X., Zhang X. Safety and Efficacy of Dispase and Plasmin in Pharmacologic Vitreolysis. Inv Ophthalmol Vis Sci. 2004. Vol. 45. No. 9. P. 3286-3290.

273. Weale R.A. Guest editorial: notes on the macular pigment. Ophthalmol. Physiol. Opt. 2007. V. 27. P. 1-10.

274. Welder F., Paul B., Nakazumi H., Yagi S., Colyer C.L. Symmetric and asymmetric squarylium dyes as noncovalent protein labels: a study by fluorimetry and capillary electrophoresis. J. Chromatogr. B. 2003. V. 793. No. 1. P. 93-105.

275. Wells J.A. Levels of vascular endothelial growth factor are elevated in the vitreous of patients with subretinal neovascularisation. Br. J. Ophthalmol. 1996. V. 80. No. 4. P. 363-366.

276. Wiechamann A.F., Hammarback J.A. Molecular cloning and nucleotide sequence of a c DNA encoding recoverin from human retina. Exp. Eye Res. 1993 a. V. 56. P. 463-470.

277. Wiechamann A.F., Hammarback J.A. Expression of recoverin mRNA in the human retina: localization by in situ hybridization. Exp. Eye Res. 1993 b. V. 57. P. 763-769.

278. Wilkie J.W., Bellamy L.E.C. Estimation of antemortem serum electrolytes and urea concentrations from vitreous human collected postmortem. Can. J. Comp. Med. 1982. V. 46. P. 146-149.

279. Williams G. Pharmacologic manipulation of the vitreous during pars plana vitrectomy. In: Alfaro D., Liggett P., eds. Vitreoretinal Surgery of the Injured Eye. Philadelphia: Raven, 1998. P. 141-150.

280. Wolff E. The anatomy of the eye and orbit. London, 1954.

281. Wordinger R.J., Clark A.F. Bone morphogenetic proteins and their receptors in the eye. Exp. Biol. Med. 2007. V. 232. P. 979-992.

282. Wormstone I.M, Tamiya S., Anderson I., Duncan G. TGF-beta2-induced matrix modification and cell transdifferentiation in the human lens capsular bag. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2002. V. 43. No. 7. P. 2301-2308.

283. Yamamoto Y. Growth of lens and ocular environment: role of neural retina in the growth of mouse lens as revealed by an implantation experiment. Dev. Growth Differ. 1976. V. 18. P. 273-278.

284. Yamane K., Minamoto A., Yamashita H., Takamura H., Miyamoto-Myoken Y., Yoshizato K., Nabetani T., A.Tsugita A., Mishima H.K. Proteome Analysis of Human Vitreous Proteins. Mol. Cell. Proteom. 2003. V. 2. P. 1177-1187.

285. Yan Q., Clark J.I., Sage E.H. Expression end characterization of SPARC in human lens and in the aqueous and vitreous humors. Exp. Eye Res. 2000. V. 71. No. l.P. 81-90.

286. Yan X-X., Wiechmann A.F. Early expression of recoverin in a unique population of neurons in the human retina. Anat. Embryol. 1997. V. 195. P. 51-63.

287. Yang J., Klassen H., Pries M., Wang W., Nissen M.H. Vitreous humor and albumin augment the proliferation of cultured retinal precursor cells. J. Neurosci. Res. 2009. V. 87. No. 2. P. 495-502.

288. Yeum K.J., Shang F.M., Schalch W.M., Russell R.M., Taylor A. Fast-soluble nutrient concentrations in different layers of human cataractous lens. Curr. Eye Res. 1999. V. 19. No. 6. P. 502-505.

289. Yeum K.J., Taylor A., Tang G., Russell R.M. Measurement of carotenoids, retinoids, and tocopherols in human lenses. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1995. V. 36. P. 2756-2761.

290. Yoneya S., Saito T., Komatsu Y., Koyama I., Takahashi K., Duvoll-Young J. Binding properties of indocyanine green in human blood. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1998. V. 39. No. 7. P. 1286-1290.

291. Zhao S., Overbeek P.F. Elevated TGFb signaling inhibits ocular vascular development. Dev. Biol. 2001. V. 237. P. 45-53.

292. Zhu M., Madigan M.C., van Driel D., Maslim J., Billson F.A., Provis J.M., Penfold P.L. The human hyaloid system: cell death and vascular regression. Exp. Eye Res. 2000. V. 70. No. 6. P. 767-776.

293. Zhu M., Penfold P.L., van Drie D., Provis J.M., Billson F.A. Neuropeptide expression in the human fetal hyaloid vasculature and vitreous. Australian and New Zealand Journal of Ophthalmology. Suppl. 1996. V. 24. No. 2. P. 72-74.

294. Zhu M., Provis J.M., Penfold P.L. The human hyaloid system: cellular phenotypes and inter-relationships. Exp. Eye Res. 1999. V. 68. No. 5. P. 553-563.

295. Zimmer J.P., Hammond B.R. Possible influences of lutein and zeaxanthin on the developing retina. Clin. Opthalmol. 2007. V. 1. No. 1. P. 25-35.

Информация о работе

Панова, Ина Георгиевна
доктора биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.03.05

Диссертация

Развитие стекловидного тела глаза человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Развитие стекловидного тела глаза человека ВАК РФ 03.03.05, Биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации по теме "Развитие стекловидного тела глаза человека"

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Панова, Ина Георгиевна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Развитие стекловидного тела глаза человека"

Заключение Диссертация по теме "Биология развития, эмбриология", Панова, Ина Георгиевна

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Панова, Ина Георгиевна, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Развитие стекловидного тела глаза человека
ВАК РФ 03.03.05, Биология развития, эмбриология