Развитие иммунной системы в онтогенезе крыс: нейроэндокрино-иммунные взаимодействия

Афанасьева, Марина Алексеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Развитие иммунной системы в онтогенезе крыс: нейроэндокрино-иммунные взаимодействия
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Развитие иммунной системы в онтогенезе крыс: нейроэндокрино-иммунные взаимодействия"

На правах рукописи

АФАНАСЬЕВА Марина Алексеевна

РАЗВИТИЕ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ В ОНТОГЕНЕЗЕ КРЫС: НЕЙРОЭНДОКРИНО-ИММУННЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

Специальность 03.00.13 - физиология человека и животных

ии^4Ь0241

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2009

003480241

Работа выполнена в лаборатории гистогенеза Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

МЕЛЬНИКОВА Виктория Ильинична

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

МАНУХИН Борис Николаевич

кандидат биологических наук СВИРЩЕВСКАЯ Елена Викторовна

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение

«Научно-исследовательский институт физико-химической медицины» Федерального медико-биологического агентства

Защита диссертации состоится « 2009 г. в часов на

заседании диссертационного совета Д 002.238.01 в Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26. Сайт: http://idbras.comcor.ru e-mail: idbras@bk.ru.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Автореферат разослан </£ » 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук e-mail: ele0806@yandex.ru

Е.Б. Абрамова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Актуальность исследования взаимодействий нейроэндокринной и иммунной систем в онтогенезе определяется их ключевой ролью в поддержании гомеостаза и интеграции развивающегося организма.

Формирование отдельных структурно-функциональных элементов иммунной системы и становление специфических взаимодействий между ними не являются процессами, строго детерминированными генетически. Они характеризуются высокой функциональной лабильностью и чувствительностью ко многим регуляторным факторами, что открывает возможности для коррекции нарушений процесса развития. Исследования в этой области позволят расширить представление о механизмах развития иммунной системы и будут способствовать пониманию причин как врожденных, так и приобретенных патологий, связанных с нарушением нейроэндокрино-иммунных взаимодействий.

Согласно современным представлениям, нейромедиаторы и нейрогормоны, участвующие в регуляции определенной функции в постнатальный период, могут влиять на формирование этой функции в ходе перинатального онтогенеза. И хотя регуляторное влияние медиаторов нейроэндокринной системы на иммунитет в постнатальном онтогенезе доказано многочисленными экспериментальными и клиническими данными (Besedovsky, del Rey, 1996; Barnard et al., 2008), их роль в развитии иммунной системы освещена лишь в единичных работах. Известно, что удаление в раннем онтогенезе надпочечников или щитовидной железы приводит к необратимому подавлению тимус-зависимых функций. Подобные изменения не развиваются, если операция проведена на половозрелых животных (Fabris et al., 1995). Неонатальная блокада синтеза гонадотропин-рилизинг гормона или его рецепторов у крыс и приматов вызывает долгосрочное снижение количества лимфоцитов в тимусе, селезенке и общей циркуляции, подавление гуморального и клеточного иммунитета (Morale et al., 1991; Gould et al., 1998). В то же время установлено, что гонадотропин-рилизинг гормон включается в регуляцию иммунного ответа уже в пренатальном онтогенезе (Zakharova et al.,

Остается открытым вопрос о формировании и функционировании иммунной и нейроэндокринной систем у млекопитающих с интенсивными физиологическими и биохимическими перестройками организма, в частности, в отсутствие гипоталамического аргинин-вазопрессина у мутантных крыс Вгаи1еЬого. Известно, что у крыс Вгаи1еЬого развиваются существенные морфофункциональные отклонения в системе иммунитета: ускорение возрастной инволюции тимуса и селезенки, подавление антителогенеза, подавление функциональной активности макрофагов (Захарова и др. 2001; Хегай и др., 2003). С другой стороны, в отсутствие аргинин-вазопрессина отмечено усиление активности естественных клеток-киллеров (У1ггшуа й а1.,

2000).

1989). В то же время формирование и функционирование Т-системы иммунитета у этих крыс остается неизученным.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось изучение особенностей развития Т-системы иммунитета и влияния медиаторов нейроэндокринной системы на эти процессы в перинатальном онтогенезе крыс. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние гипоталамо-гипофизарной системы и тимических пептидов на основные механизмы регуляции численности клеточных популяций тимуса и селезенки, такие как апоптоз и пролиферация.

2. Исследовать в тимусе в перинатальном периоде развития динамику экспрессии иммунных протеасом как показателя становления отрицательной селекции Т-лимфоцитов.

3. Изучить в раннем онтогенезе особенности миграции Т-лимфоцитов из тимуса в белую пульпу селезенки для их созревания.

4. Оценить пролиферативный ответ Т-клеток тимуса и селезенки, индуцированный митогеном, у крыс Brattleboro с наследственным дефицитом гипоталамического аргинин-вазопрессина.

5. Изучить молекулярные механизмы усиления противоопухолевого иммунитета у крыс Brattleboro: экспрессию основных молекул главного комплекса гистосовместимости класса I и иммунных протеасом в динамике роста опухоли Walker 256.

6. Исследовать влияние дефицита моноаминов в пренатальном периоде развития на формирование Т- и B-клеточного иммунитета.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые показано, что моноамины могут являться морфогенами в критичесикий период развития иммунной системы. Было установлено, что пренатальный дефицит серотонина приводит к достоверному повышению пролиферативного ответа Т-лимфоцитов тимуса и селезенки на митоген у половозрелых животных, а также к десятикратному увеличению количества антителообразующих клеток селезенки в ответ на иммунизацию тимус-зависимым антигеном; пренатальный дефицит катехоламинов вызывает подавление пролиферативного ответа на митоген Т-лимфоцитов тимуса и селезенки половозрелых животных.

Изучена возрастная динамика спонтанного апоптоза и пролиферации лимфоцитов тимуса и селезенки и впервые выявлена роль гипоталамо-гипофизарной системы в регуляции этих процессов. Показано, что выключение гипоталамуса у плодов крыс in utero приводит к усилению пролиферации клеток селезенки, а выключение гипоталамуса и гипофиза приводит к увеличению уровня пролиферации в тимусе и снижению уровня апоптоза в селезенке.

Впервые исследована динамика экспрессии иммунных протеасом в тимусе в перинатальном онтогенезе у крыс и проведен гистологический анализ их

распределения. Было показано, что иммунные протеасомы начинают экспрессироваться в тимусе уже с 18-го дня пренатального развития и к 21-му дню достигают уровня, характерного для взрослых животных. Полученные данные позволили сделать заключение о том, что становление отрицательной селекции лимфоцитов в тимусе может происходить уже в конце пренатального периода развития.

Получены новые данные об особенностях первичной миграции Т-лимфоцитов из тимуса в развивающуюся селезенку в раннем онтогенезе. Было обнаружено, что у животных в неонатальном периоде развития, в отличие от половозрелых, Т-лимфоциты, покидающие тимус, первично заселяют красную пульпу селезенки и только потом мигрируют в соответствующие зоны белой пульпы.

Обнаружены отклонения в Т-системе иммунитета у крыс Brattleboro с отсутствием гипоталамического аргинин-вазопрессина, а именно, снижение пролиферативного ответа Т-лимфоцитов на митоген в 2 раза в тимусе и в 2-4 раза в селезенке на протяжении всего постнатального периода развития. Кроме того, были выявлены новые механизмы усиления противоопухолевого иммунитета у крыс Brattleboro: в опухоли Walker 256, развивающейся у крыс Brattleboro с дефицитом аргинин-вазопрессина, восстанавливается экспрессия молекул главного комплекса гистосовместимости класса I и образуется уникальный пул протеасом, приводящие к ее регрессии.

Результаты выполненной работы могут найти практическое применение в медицине при разработке подходов к лечению патологий у беременных женщин, в частности в вопросах о возможности применения тех или иных лекарственных средств на определенных сроках беременности и их безопасности для плода. Полученные данные могут быть использованы в экспериментальной и клинической иммунологии при изучении патогенеза иммунодефицитных состояний, связанных с нарушениями секреции нейромедиаторов и нейрогормонов. Кроме того, понимание механизмов морфогенетического влияния нейромедиаторов на развитие иммунной системы открывает новые возможности для коррекции врожденных нарушений системы иммунитета на ранних этапах онтогенеза.

Результаты исследования могут быть использованы при чтении курсов лекций по физиологии развития, иммунологии, а также учитываться при проведении биомедицинских исследований.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на Иммунологическом Форуме с международным участием (Санкт-Петербург, 2008), VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007), 11-й международной Пущин ской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века» (Пущино, 2007), 5-м Симпозиуме с международным участием «Физиология иммунной системы. Перспективные подходы к диагностике и терапии иммунопатологии и аллергических заболеваний» (Москва, 2006), Конференциях молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Москва, 2005, 2006, 2007, 2008), XV школе «Актуальные проблемы биологии развития»

(Звенигород, 2008), VI European Congress of Reproductive Immunology (Moskow, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ. Статей в журналах - 8, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК - 7, тезисов докладов в материалах конференций - 12.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 114 страницах, содержит 24 рисунка и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 185 цитируемых источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. В экспериментах были использованы крысы Wistar (питомник "Столбовая" РАН), Brattleboro и WAG (Институт цитологии и генетики, СО РАН, Новосибирск). Для получения самок с датированным сроком беременности использовали 3-4-х месячных крыс. День обнаружения спермы в мазке считали первым днем эмбрионального развития (Э1).

У части плодов проводили in utero декапитацию методом, разработанным А. Jost (Jost, 1947) или энцефалэктомию методом, разработанным в ИБР РАН (Мицкевич и др., 1970).

Уровень апоптоза и пролиферации клеток тимуса и селезенки в онтогенезе крыс Wistar оценивали с помощью проточной цитометрии после окрашивания фиксированных клеток йодистым пропидием (PI) у плодов на Э18 и Э21, а также на 7-й день постнатального развития (П7), П15 и ПЗО. В отдельных экспериментах плодов на Э18 подвергали эцефалэктомии или декапитации. У этих животных уровень апоптоза и пролиферации клеток тимуса и селезенки на Э21 также определяли методом проточной цитометрии.

Для изучения влияния тимических пептидов на уровень апоптоза тимоцитов in vitro суспензии клеток тимуса крыс Wistar на ПЗО культивировали в течение 2 часов в присутствии коммерческого препарата тимических пептидов, Тактивина (Arion, 1989), в концентрациях 0,01, 0,1, 1, 10 и 50 мкг/мл, и без препарата. Затем в культуру тимоцитов добавляли дексаметазон в концентрации 10"6М. Через 4, 6 или 8 часов клетки фиксировали, окрашивали PI и оценивали уровень апоптоза методом проточной цитометрии.

Определение уровня апоптоза и пролиферации методом проточной цитометрии. Клетки тимуса и селезенки фиксировали охлажденным 70%-ным этанолом, отмывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ), и инкубировали с рибонуклеазой А (100 мкг/мл, Sigma, США) при 37°С в течение 20 мин, затем с PI (1 мкг/мл, Sigma, США) 20 мин при комнатной температуре. Анализ внутриклеточного содержания ДНК осуществляли с помощью проточного цитофлуориметра «Coulter EPICS XL-MCL». С использованием программы «MultiCycle» определяли количество апоптотических и пролиферирующих клеток.

Для фармакологического подавления синтеза серотонина у плодов беременным самкам Wistar ежедневно с Э13 по Э17 вводили ингибитор триптофангидроксилазы пара-хлорфенилаланин (п-ХФА) в/б в дозе 100мг/кг. Для фармакологического подавления синтеза катехоламинов у плодов беременным самкам Wistar ежедневно с Э13 по Э17 вводили ингибитор тирозингидроксилазы а-метил-п-тирозин (а-МПТ) в/б в дозе 100мг/кг. Контрольной группе вводили равный объем 0,9% р-ра NaCl. У потомства на Э21, ПЗ, П18, П70 и П90 оценивали индуцированный Конканавалином А (Кон А) пролиферативный ответ лимфоцитов тимуса, а на ПЗ, П18, П70 и П90 -лимфоцитов селезенки. Количество антителообразующих клеток (АОК) к эритроцитам барана (ЭБ) оценивали на П18 и П70. Для этого в указанные сроки крыс иммунизировали внутрибрюшинно 50% взвесью ЭБ в 0,5 мл 0,9% раствора NaCl однократно. На 5-е сут после иммунизации получали суспензию клеток селезенки. Количество АОК определяли модифицированным методом Каннингхама (Cunningham, 1965). В отдельных экспериментах ингибитор синтеза серотонина или катехоламинов вводили взрослым крысам в течение 3-х дней и затем оценивали пролиферативный ответ на Кон А и гуморальный иммунный ответ на ЭБ на 1-й, 10-й и 43-й дни после последней инъекции.

Исследование динамики содержания различных субъединиц протеасом и молекул главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) класса I в опухоли Walker 256 проводили на самцах крыс Brattleboro и WAG в возрасте 3 мес. Суспензию клеток линейнонеспецифической карциносаркомы Walker 256 вводили крысам в мышцу бедра в дозе 8x105 клеток. Через 7, 14, 17 и 24 сут фрагменты опухоли извлекали из крыс, промывали 0,01 M ФСБ, взвешивали и хранили при -70°С. Затем готовили осветленные гомогенаты и определяли содержание различных субъединиц протеасом и основных молекул ГКГ класса I методом Вестерн-блоттинга.

Культивирование клеток тимуса и селезенки проводили в атмосфере 5% С02 при 37°С в среде RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки плодов крупного рогатого скота, 2 мМ L-глютамина, 80 мкг/мл гентамицина. Плотность клеток составляла 1x106 ядросодержащих клеток в 1 мл среды.

Оценка пролиферативного ответа лимфоцитов на митоген in vitro. Клетки тимуса и селезенки культивировали в течение 72 часов в присутствии Кон А (2,5 мкг/мл), как описано ранее (Захарова и др., 2000).

Иммуногистохимическое окрашивание. Были использованы поликлональные антитела кролика к иммунным субъединицам LMP2 и LMP7 протеасом (Affiniti, Великобритания, 1:2500), моноклональные антитела мыши к CD3 (BD Biosciences, США, 1:500), смесь моноклональных антител мыши к цитокератинам 10,14,18,19 (Novocastra, Великобритания, 1:25), антитела овцы к IgG кролика, меченные СуЗ (Sigma, США, 1:500), антитела козы к IgG мыши, меченные FITC (Sigma, США, 1:100). Ткань фиксировали 4% раствором параформальдегида, иммуногистохимическое окрашивание проводили на на криостатных срезах толщиной 10 мкм в соотвествии с протоколом, описанным Соза с соавт. (Soza et al., 1997). Для контроля специфичности реакцию

проводили в отсутствие первых антител. Анализ изображения проводили с помощью флуоресцентного микроскопа Leica DMRXA2 (Германия).

Анализ содержания иммунных протеасом в тимоцитах методом проточной цитометрии. Образцы, содержащие 1x106 тимоцитов в 100 мкл буфера для цитометрии, содержащем 0,02М ФСБ, 0,05% азида натрия (Amresco, США) и 2% бычьего сывороточного альбумина (Amresco, США), инкубировали с антителами к CD90 (1:10000), конъюгированными с фикоэритрином (BD Biosciences, США), 30 мин при +4°С. Клетки фиксировали 4% параформальдегидом (30 мин, Ьшмн), инкубировали с поликлональными антителами кролика к LMP7 или LMP2 (Affiniti, Великобритания, 1:2500) в течение ночи при +4°С, затем с антителами овцы к IgG кролика, конъюгированными с А1еха488 (Invirtogen, США, 1:1000) в течение 2.часов при комнатной температуре. Мечение клеток анализировали на цитофлуориметре Cell Lab Quanta с помощью прилагаемого к прибору программного обеспечения (Beckman Coulter, США).

Вестерн-блоттинг. Осветленные гомогенаты получали методом, описанным ранее (Астахова, Шарова, 2006). Электрофорез белков в полиакриламидном геле проводили в соответствии с методом Лэммли (Laemmli, 1970). Для полусухого переноса полипептидов из геля на нитроцеллюлозную мембрану использовали прибор Trans-Blot SD (Bio-Rad), придерживаясь протокола производителя. Для выявления молекул ГКГ класса I использовали мокрый перенос с помощью прибора Mini Trans-Blot Cell (BioRad). Мембрану окрашивали ранее описанным способом (Астахова, Шарова, 2006), используя поликлональные антитела кролика к LMP7, моноклональные антитела мыши к LMP2, Rpt6 или al,2,3,5,6,7 в разведении 1:2500 (Affiniti, Великобритания) или моноклональные антитела мыши к a-цепи основных молекул ГКГ класса I крыс - RT1A - в разведении 1:100 (BD Biosciences, США). В качестве вторичных антител использовали антитела к IgG кролика или IgG мыши, конъюгированные с пероксидазой, в разведении 1:2500 (Amersham, Великобритания). Окрашенные мембраны подвергали стандартной обработке системой ECL (Amersham, Великобритания). Для анализа оптической плотности полос на рентгеновской пленке использовали компьютерную программу Image J.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью непараметрического критериия Вилкоксона.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Возрастная динамика уровня естественного апоптоза и пролиферации в тимусе и селезенке крыс. Программированная гибель клеток и их пролиферация - два процесса, контролирующие численность клеточных популяций в иммунной системе. Без поддержания сбалансированного соотношения различных популяций лимфоцитов невозможно нормальное функционирование иммунной системы. Апоптоз, кроме того, является основой

положительного и отрицательного отбора лимфоцитов в тимусе. Во вторичном лимфоидном органе - селезенке - апоптозу по окончании иммунного ответа подвергается избыточный пул лимфоцитов, образовавшийся путем пролиферации нескольких активированных предшественников.

Согласно полученным данным, уровень апоптоза в тимусе плодов на Э18 достигал 25%, затем падал до 4-5% на Э21 и оставался приблизительно на том же уровне в ходе последующего развития (рис. 1, а). Количество делящихся клеток в тимусе достоверно не отличалось на всех исследованных сроках развития и составляло 20-25% (рис. 1, б). Согласно данным литературы, около 20% всех тимоцитов, содержащихся в тимусе 5-недельных мышей, также составляют делящиеся клетки (Egerton et al., 1990).

Уровень апоптоза в селезенке плодов на Э18 достигал 15%, на Э21 увеличивался до 25% и на П30 - до 37% (рис. 1, а). Количество делящихся клеток в селезенке было максимально на Э18 и составляло 32% (рис. 1, б). На Э21 их численность падала в два раза и составляла около 17%. На П7 пролиферация клеток вновь повышалась до 22% и затем постепенно убывала до 7% к П30. Выявленная динамика пролиферации клеток селезенки коррелирует с изменениями интенсивности в ней гемопоэза (Van Den Heuvel et al„ 1987). С П7 по П15 пролиферация клеток селезенки снижается, а апоптоз увеличивается, по-видимому, в основном за счет кроветворных клеток.

Рис. 1. Уровень естественного апоптоза (а) и пролиферации (б) клеток тимуса (0) и селезенки (И ) крыс в перинатальном онтогенезе. По оси ординат - количество клеток, вступивших в апоптоз (а) и пролиферирующих клеток (б), % от общего количества проанализированных клеток. * р <0,05 между указанными значениями.

Влияние гипоталамо-гинофизарной системы на уровень апоптоза и пролиферации в тимусе и селезенке в пренатальном периоде развития. После энцефалэктомии плодов in utero на Э18 (выключение гипоталамуса) уровень апоптоза в тимусе на Э21 оставался таким же, как и у ложнооперированных плодов и составлял около 9-10% (рис. 2, а). Однако у интактных плодов процент клеток, подвергшихся апоптозу, был в два раза ниже (4%), чем у ложнооперированных и энцефалэктомированных плодов (рис. 2, а). В селезенке уровень апоптоза у ложнооперированных и энцефалэктомированных плодов увеличивался на треть по сравнению с неоперированными плодами (рис. 2, а). Наблюдаемое увеличение численности

апоптозных клеток в тимусе и селезенке связано, по-видимому, с влиянием хирургического стресса.

тимус селезенка тимус селезенка

Рис. 2. Уровень естественного апоптоза (а) и пролиферации (б) клеток тимуса и селезенки у интактных ( С] ), ложнооперированных ( ЕЦ ) и энцефалэктомированных ( В ) плодов крыс. По оси ординат - количество клеток, вступивших в апоптоз (а) и пролиферирующих клеток (б), % от общего количества проанализированных клеток. * р <0,05 между указанными значениями, **р <0,05 по сравнению с предыдущим столбиком.

Количество делящихся клеток в тимусе ложнооперированных и энцефалэктомированных плодов также было достоверно выше по сравнению с интактными плодами (рис. 2, б). Количество делящихся клеток в селезенке энцефалэктомированных плодов оставалось на том же уровне, что и у интактных (около 18%), но выше, чем у ложнооперированных плодов (около 13%), (рис. 2, б).

тимус селезенка тимус селезенка

Рис. 3. Уровень естественного апоптоза (а) и пролиферации (б) клеток тимуса и селезенки у интактных (□ ), ложнооперированных (Щ)п декапитированных ( ■ ) плодов крыс. Далее см. рис. 2.

После декапитации плодов in utero на Э18 (выключение одновременно гипоталамуса и гипофиза) количество апоптозных клеток в тимусе на Э21 оставалось на одном уровне у всех исследованных групп животных и составляло 4-5% (рис. 3, а). Количество пролиферирующих клеток при этом

повышалось (на 18%) по сравнению с контрольной группой (рис. 3, б). В селезенке декапитированных плодов уровень апоптоза снижался почти в два раза, тогда как пролиферативная активность клеток не менялась (рис. 3).

Таким образом, выключение гипоталамуса у плодов крыс in utero приводит к усилению пролиферации клеток селезенки, а выключение гипоталамуса и гипофиза приводит к увеличению уровня пролиферации в тимусе и снижению уровня апоптоза в селезенке. Полученные данные показывают, что численность клеток в тимусе и селезенке в эмбриональном развитии контролируется гипоталамо-гипофизарной системой.

Влияние тимических пептидов на уровень апоптоза тимоцитов in vitro. Предполагается, что дифференцировка лимфоцитов находится под контролем гормонов тимуса, имеющих пептидную природу. В последние годы получены данные о регуляторном влиянии тимических пептидов на апоптоз лимфоцитов селезенки крыс, а также лейкоцитов периферической крови человека (Иванова и др., 2000; Хавинсон, Кветной, 2000).

Нами было исследовано влияние тимических пептидов (Тактивина) на естественный апоптоз тимоцитов крыс на ПЗО в модели in vitro. Тактивин представляет собой смесь пептидов с молекулярной массой от 1200 до 6000 Да, выделенных из тимуса крупного рогатого скота и обладающих иммунокорригирующей активностью, а также регулирующих ряд важных биологических процессов (Arion, 1989). Ни в одной из исследованных концентраций (0,01-50 мкг/мл) Тактивин не оказывал влияния на уровень естественного апоптоза. Ранее было показано, что Тактивин также не влияет на апоптотическую гибель клеток селезенки у взрослых особей in vivo (Захарова и др., 2004).

Однако при индукции апоптоза дексаметазоном предварительное добавление в культуру тимоцитов Тактивина значительно снижало уровень апоптоза через 8 часов культивирования. Протекторные свойства Тактивина не зависели от использованной концентрации, что позволяет предположить, что в реализации его действия участвует целый ряд пептидов, одним из которых может являться ai-тимозин (Baumann et al., 2000). На основании полученных данных можно заключить, что тимические пептиды предотвращают развитие индуцированного апоптоза и не влияют на уровень естественной гибели клеток.

Динамика содержания иммунных протеасом в тимусе в перинатальном онтогенезе крыс. На разных этапах дифференцировки в тимусе лимфоциты подвергаются процессам селекции. Не прошедшие селекцию тимоциты элиминируются по механизму апоптоза. Выявленная стабильность уровня естественного апоптоза в тимусе, начиная с Э21 (рис. 1, а), позволяет предположить, что и процесс селекции тимоцитов может устанавливаться еще до рождения. В связи с этим было исследовано содержание внутриклеточных участников процесса отрицательной селекции -иммунных протеасом - в перинатальном онтогенезе.

С помощью Вестерн-блоттинга иммунные субъединицы LMP7 и LMP2 обнаружены уже на Э18 (рис. 4). На Э21 и П1 их количество возрастало в 2—4 раза и практически не менялось до П19. Увеличение количества иммунных

протеасом в конце пренатального периода развития связано, по-видимому, с тем, что именно на этом этапе происходит активная дифференцировка и формирование функционально зрелых эпителиальных клеток кортикальной и медуллярной зон тимуса, способных обеспечивать положительную и отрицательную селекцию (№яие!е! а!., 1999; Мап1еу, 2000).

LMP7 LMP2

О ш . Ш Ш-.-Ш___\Ш__У"Л 0 —И4Я—«¡¡¡и—шл—тл-^ша^-иаа-

Э18 Э21 П1 ПЗ П5 П8 П19 Э18 Э21 П1 ПЗ П5 П8 П19

Рис. 4. Содержание иммунных субъединиц протеасом LMP7 и LMP2 в тимусе крыс в перинатальном онтогенезе. * р <0,05 между указанными значениями.

Иммуногистохимически субъединицы LMP2 и LMP7 также обнаружены в тимусе крыс всех исследованных возрастов (рис. 5). Наибольшее их количество было локализовано в клетках стромы тимуса. При помощи двойного

иммунофлуоресцентного мечения LMP2- и LMP7-субъединицы выявлены в эпителиальных клетках тимуса как в корковой, так и в медуллярной зоне. Рис. 5. Иммуногистохимическое выявление LMP7, LMP2

и цитокератинов. Стрелками указаны клетки с двойным мечением.

Функция иммунных протеасом генерировать как собственные, так и чужеродные антигенные олигопептиды для последующего их представления Т-лимфоцитам не единственная и, по-видимому, не первичная. С использованием антител к иммунным субъединицам протеасом и антигену Т-лимфоцитов CD3 субъединицы LMP2 и LMP7 обнаружены и в лимфоцитах тимуса. При этом количество иммунопозитивного материала в лимфоцитах было ниже, чем в эпителиальных клетках. Наличие иммунных протеасом в тимоцитах было подтверждено методом проточной цитометрии, с помощью двойного мечения на иммунные субъединицы протеасом (LMP2, LMP7) и маркер Т-лимфоцитов (CD90) как в эмбриональном, так и в постнатальном периоде (рис. 6). Известно, что Т-клетки мышей с нокаутом генов субъединиц LMP7 и LMP10 обладают

LMP2

Цитокератины

50 мкм

повышенной пролиферативной активностью в ответ на поликлональные митогены, что не связано с функцией генерации антигенных эпитопов (СаисНП е1 а1., 2006). В связи с этим можно предположить, что наряду с представлением антигенных эпитопов иммунные протеасомы в тимоцитах также могут выполнять и другие важные функции, например, участвовать в образовании биологически активных пептидов.

Э19 ПЗО

С090+1_МР7 С090+1_МР2 С090+1_МР7 С090+1-МР2

Ш !

О- "

о|' о>= Q • О

LMP7-LgAlexa488 LMP2-LgÂîexa488 LMP7-tgÂTéxa488 LMP2-LgAIexa488

Рис. 6. Цитофлуориметрический анализ содержания иммунных субъединиц протеасом LMP7 и LMP2 в клетках тимуса на Э19 и ПЗО. CD90 - маркер тимоцитов.

Таким образом, экспрессия иммунных протеасом, вовлеченных в представление аутоантигенов тимоцитам при отрицательной селекции, наблюдается в тимусе крыс не только в половозрелом возрасте, но и в раннем онтогенезе. Становление процесса отрицательной селекции у крыс происходит, по-видимому, уже в пренатальном периоде развития.

Особенности миграции Т-лимфоцитов в белую пульпу селезенки в раннем постнатальном онтогенезе. Как известно, наивные Т-лимфоциты мигрируют в селезенку из первичного лимфоидного органа - тимуса - для завершения их дифференцировки и осуществления эффекторных функций. Нами было изучено заселение белой пульпы селезенки Т-лимфоцитами в процессе ее формирования в раннем онтогенезе. Метод двойного иммунофлуоресцентного мечения с использованием антител к субъединице LMP7, а также маркеру Т-клеток CD3 позволил установить, что миграция Т-лимфоцитов в белую пульпу селезенки в процессе ее формирования в онтогенезе происходит характерным способом, не свойственным взрослым животным. У половозрелых животных Т-лимфоциты поступают из первичных лимфоидных органов с током крови и лимфы непосредственно в белую пульпу (Düllmanna et al., 2000), тогда как в развивающейся селезенке лимфоциты сначала заселяют красную пульпу и только потом непосредственно мигрируют в специфические зоны белой пульпы. Кроме того, показано, что иммунные субъединицы протеасом экспрессируются на всех стадиях дифференцировки Т-лимфоцитов. По-видимому, в Т-лимфоцитах иммунные протеасомы участвуют в регуляции пролиферации или осуществляют другие неизвестные функции.

Пролиферативный ответ Т-клеток тимуса и селезенки на митоген у крыс Brattleboro с дефицитом гипоталамического аргинин-вазопрессина (АВП). АВП является одним из гормонов, участвующих в нейроэндокрино-иммунных взаимодействиях. Исследование роли АВП в формировании и

функционировании иммунной системы на протяжении всего периода жизни проводили на мутантных крысах линии Brattleboro с дефицитом синтеза АВП в гипоталамусе. Известно, что у крыс Brattleboro развиваются существенные морфофункциональные отклонения в системе иммунитета (Захарова и др., 2001; Хегай и др., 2003).

Согласно полученным данным, у мутантных крыс всех изученных возрастов отсутствие АВП приводило к снижению индуцированного Кон А пролиферативного ответа лимфоцитов тимуса в 2 раза и селезенки в 2-4 раза по сравнению с нормальными крысами WAG (рис. 7). Сниженный пролиферативный ответ в тимусе и селезенке крыс Brattleboro, вероятно, обусловлен уменьшением количества функционально зрелых Т-лимфоцитов в этих органах, поскольку, как известно, возрастная инволюция тимуса у крыс Brattleboro протекает быстрее, чем у крыс WAG (Хегай и др., 2003).

Очевидно, что снижение пролиферативной активности Т-лимфоцитов не обусловлено быстрым гормональным эффектом. Согласно данным литературы, хроническое системное введение АВП взрослым крысам Brattleboro нормализует у них водно-солевой баланс, но не влияет на повышенную активность естественных клеток-киллеров и сниженный уровень кортикостерона в крови (Yirmiya et al., 1989). Таким образом, дефицит АВП в онтогенезе у крыс Brattleboro, приводит к необратимым изменениям в иммунной системе.

„ 70000

(В

s о 60000 s в

2 §50000 £»

40000

".30000 s т.

5 §20000

2 §10000 5 s

m о

6 8 12 Возраст, мес.

Возраст, мес.

Рис. 7. Возрастная динамика индуцированного Кон А пролиферативного ответа лимфоцитов тимуса (а) и селезенки (б) у крыс Brattleboro (Н) и WAG (0). *р <0,05 по сравнению с предыдущим столбиком.

Молекулярные механизмы усиления противоопухолевого иммунитета у крыс Brattleboro с дефицитом гипоталамического АВП. Крысы Brattleboro характеризуются усилением как активности естественных клеток-киллеров (эффекторных клеток врожденного иммунитета), так и адаптивного противоопухолевого иммунитета (Yirmiya et al., 1989; Хегай и др., 2006). Согласно полученным ранее данным, у крыс Brattleboro наблюдается регрессия линейно-неспецифической карциносаркомы Walker 256. Для нормальных крыс характерен непрерывный рост этой опухоли, приводящий к летальному исходу в среднем через 4 недели после прививки, У крыс Brattleboro увеличение

опухоли выражено слабо и продолжается только в течение первых 15-18 сут, после чего наблюдается регрессия и полное исчезновение опухоли. При повторном введении клеток Walker 256 опухоль не возникает. Это свидетельствует о непосредственном участии иммунной системы в обнаруженном феномене и формировании клеток памяти (Хегай и др., 2006).

Специфический иммунный ответ невозможен без эффективного представления опухолевых антигенов. Важнейшими этапами этого процесса являются, во-первых, протеолитическое расщепление белков с участием протеасом, во-вторых, представление образовавшихся антигенных пептидов на поверхности клетки в комплексе с молекулами ГКГ класса I.

Можно предположить, что у крыс Brattleboro распознавание опухоли иммунной системой происходит более эффективно. В связи с этим нами был проведен сравнительный анализ динамики содержания множественных форм протеасом, а также исследована экспрессия молекул ГКГ класса I в опухоли Walker 256 у нормальных крыс и крыс Brattleboro с дефицитом АВП.

Особенности экспрессии различных пулов протеасом в опухоли Walker 256 у крыс Brattleboro. В опухоли у крыс WAG с нормальной секрецией АВП уровень тотального пула протеасом не изменялся в ходе ее роста. У мутантных крыс Brattleboro наблюдалось повышение тотального пула на 20% с 1-х по 14-е сут и двукратное его падение в промежутке между 17-ми и 24-ми сут. Следует отметить, что на 24 сут регрессия опухоли у крыс Brattleboro практически завершена, с чем, по-видимому, связано падение общего содержания протеасом.

Rpt6 LMP2

__ WAG Brattleboro -55кДа - WAG Brattleboro -28кДа

Сутки после трансплантации Сутки после трансплантации

Рис. S. Вестерн-блоты белков осветленных гомогенатов опухоли Walker 256, выделенной на разных сроках после трансплантации крысам Brattleboro (В) и WAG (0), с использованием антител к субъединицам Rpt6 и LMP2. * р <0,05 между указанными значениями, **р <0,05 по сравнению с предыдущим столбиком.

Субъединица Rpt6 (маркер 198-субчастицы 268-протеасом) практически не выявлялась иммуноблоттингом в опухоли крыс Brattleboro на 24-е сут после трансплантации, тогда как в опухоли у контрольных животных ее содержание

было практически неизменно (рис. 8). 198-субчастица является необходимой частью 26S-npoTeacoM, с помощью которой осуществляется распознавание и подготовка убиквитинированных белков к гидролизу (DeMartino, Gillette, 2007). В ее отсутствие, к 24-м сут, в клетках опухоли у крыс Brattleboro нарушена регуляция многочисленных процессов, в том числе, клеточного цикла.

Уровень иммунных протеасом оставался практически неизменным в ходе роста опухоли у крыс WAG. У крыс Brattleboro на 7-е сут после прививки содержание иммунных субъединиц протеасом LMP2 и LMP7 было снижено на четверть по сравнению с крысами WAG. Однако в промежутке с 7-ых по 14-е сут количество LMP2 и LMP7 возрастало и оставалось на том же уровне на 17-е сут. При этом количество LMP2 в опухоли у крыс Brattleboro почти вдвое превышало таковое в опухоли у крыс WAG (рис. 8), количество же LMP7 было лишь незначительно выше. Поскольку иммунные протеасомы более эффективны для генерации антигенных эпитопов, чем конститутивные, увеличение их доли в общем пуле протеасом к 14-м сут должно способствовать распознаванию опухолевых клеток иммунной системой и развитию иммунного ответа. Это согласуется с тем, что регрессия опухоли начинается на 15-е - 18-е сут после прививки.

Экспрессия молекул ГКГ класса I в опухоли Walker 256 в динамике роста у крыс Brattleboro. Анализ содержания основной молекулы класса I - RT1A -показал, что в опухоли у крыс WAG на всех этапах ее развития наблюдается чрезвычайно слабая экспрессия этого белка. У крыс Brattleboro на 7-е сут после прививки выявить экспрессию RT1A не удалось, однако на 14-е сут наблюдалась выраженная экспрессия, сохранявшаяся и на 17-е сут, когда опухоль уже находится в процессе регрессии.

Таким образом, в опухоли Walker 256, развивающейся у крыс Brattleboro в отсутствие гипоталамического АВП, восстанавливается экспрессия молекул ГКГ класса I и образуется уникальный пул протеасом, приводящие к ее регрессии.

Морфогенетнческое влияние пренатального дефицита серотонина на иммунитет. Наряду с АВП, одним из регуляторов развития различных тканей плода является серотонин (Buznikov et al., 1999). Однако данные об его участии в развитии иммунной системы отсутствуют. Было исследовано влияние пренатального дефицита серотонина на клеточный и гуморальный иммунный ответ в онтогенезе крыс. Согласно полученным данным, пренатальный дефицит серотонина приводил к существенным изменениям в Т-системе иммунитета в постнатальном периоде развития.

У крысят на ПЗ пренатальный дефицит серотонина приводил к снижению пролиферативного ответа тимоцитов, индуцированного Кон А, в 2 раза по сравнению с контролем, в то время как во все последующие сроки наблюдалось достоверное увеличение этого параметра (рис. 9, а). Пролиферативный ответ клеток селезенки не менялся по сравнению с контролем на ПЗ и П18 и значительно усиливался в последующие сроки развития (рис. 15, б).

. 60000 I *

s ° 50000 3 о

80000

¡„5 40000

i X 30000

i i 20000 I I 10000

Э21 ПЗ П18 П70 П90 Возраст, дни

ПЗ П18 П70 П90 Возраст, дни

Рис. 9. Индуцированный Кон А пролиферативный ответ лимфоцитов тимуса (а) и селезенки (б) крыс, у которых с Э13 по Э17 был подавлен синтез серотонина.

П - Контроль. В - п-ХФА. *р <0,05 по сравнению с предыдущим столбиком.

Наблюдаемое изменение функциональной активности Т-лимфоцитов связано, по-видимому, с тем, что пренатальный дефицит серотонина приводит к стойким морфогенетическим изменениям стромальных элементов тимуса. Первая волна миграции предшественников Т-лимфоцитов в эпителиальную закладку тимуса происходит на Э13-16 (Brelinska, Malinska, 2005), и от взаимодействия с первыми лимфопоэтическими предшественниками принципиальным образом зависит дифференцировка стромы тимуса (Anderson et al., 2006). В использованной модели синтез серотонина был подавлен в этот период.

В трактовке полученных данных следует учитывать также природу Т-клеток, населяющих тимус и селезенку на разных этапах онтогенеза. На ПЗ в тимусе дифференцируются клетки, предшественники которых мигрировали в тимус с первой волной из эмбриональной печени в период дефицита серотонина. У грызунов к П14 потомки первой волны миграции предшественников полностью покидают тимус (Anderson et al., 2006), поэтому на П18 и позднее тимус населяют предшественники Т-лимфоцитов, которые мигрируют уже из костного мозга. Именно с этим может быть связано наблюдаемое подавление пролиферативного ответа тимоцитов у крысят на ПЗ, в отличие от его повышения у более взрослых животных.

Влияние дефицита серотонина на пролиферативный ответ Т-лимфоцитов в селезенке не наблюдалось до П18 в связи с тем, вероятно, что селезенка формируется в онтогенезе как полноценный лимфоидный орган лишь к 3-ей неделе после рождения. Таким образом, пролиферативная активность клеток селезенки с запаздыванием отражает изменения, наблюдаемые в тимусе.

Оценка содержания АОК в селезенке после иммунизации ЭБ показала, что пренатальный дефицит серотонина приводит к достоверному увеличению числа АОК к ЭБ в 6 раз у крыс на П18 и в 10 раз у крыс на П70 (рис. 10). Механизмы этого эффекта пока не ясны. Наиболее вероятно, что дефицит серотонина оказал морфогенетическое влияние на дифференцировку Т-лимфоцитов CD4 фенотипа в тимусе, которые в постнатальном периоде

осуществляют функцию клеток-помощников в кооперации с В-лимфоцитами селезенки при ответе на тимус-зависимый антиген - эритроциты барана.

Рис. 10. Количество АОК к ЭБ в селезенке крыс, у которых с Э13 по Э17 был подавлен синтез серотонина. П - Контроль. | - п-ХФА. Иммунизацию ЭБ проводили на П18 и П70.

*р <0,05 по сравнению с предыдущим столбиком.

В отличие от плодов, подавление синтеза серотонина у половозрелых животных приводило лишь к обратимым изменениям в пролиферативной активности клеток селезенки, что подтверждает морфогенетическую роль серотонина в критический период онтогенеза иммунной системы.

Необходимо принимать во внимание, что серотонин в ходе эмбрионального развития стимулирует дифференцировку структур мозга, которые у взрослых животных получают серотонинергическую иннервацию (Lauder et al., 1981; Butkevich et al., 2003). Таким образом, недостаток серотонина может опосредованно влиять на развитие иммунной системы через стойкое изменение в других компонентах нейроэндокринной системы. Нельзя также исключить, что кроме прямого и опосредованного гормонального действия серотонин может осуществлять в развитии тимуса локальную ауто- и паракринную регуляцию.

Морфогенетическое влияние пренатального дефицита катехоламинов на иммунитет. Не только серотонин, но и другие моноамины могут выполнять морфогенетические функции в раннем развитии (Bernabe et al., 1996; Beltramo et al., 1997). У взрослых животных катехоламины являются регуляторами функций иммунной системы. Было исследовано влияние пренатального дефицита катехоламинов на индуцированный Кон А пролиферативный ответ лимфоцитов тимуса и селезенки, а также на количество АОК селезенки в ответ на иммунизацию ЭБ в различные периоды онтогенеза.

Введение ингибитора синтеза катехоламинов, а-МПТ, в критический период развития тимуса, на Э13-Э17, привело к двукратному снижению пролиферативного ответа на Кон А в тимусе уже на Э21, которое сохранялось на ПЗ, П18 и П70 (рис. 11, а). В селезенке пренатальное подавление синтеза катехоламинов приводило к снижению пролиферативного ответа на митоген на П18 и П70, но не на ПЗ (рис. 11,6). Как было описано выше, пролиферативная активность клеток селезенки с запаздыванием отражает изменения, наблюдаемые в тимусе.

3000

П18

П70

Ч I

120000 100000 8000 6000 4000 2000 0

гЬ

16000 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 . 0

гЬ

Г"Ь|

I ' УЯЛ

Э21

ПЗ

П18

П70

ПЗ

П18

П70

Рис. 11. Индуцированный Кон А пролиферативный ответ лимфоцитов тимуса (а) и селезенки (б) крыс, у которых с Э13 по Э17 был подавлен синтез катехоламинов.

I I - Контроль. Щ - а-МПТ. *р <0,05 по сравнению с предыдущим столбиком.

Введение а-МПТ беременным самкам на Э13-Э17 не оказало влияния на количество АОК к ЭБ у потомства на П18 и П70.

В отличие от плодов, внутрибрюшинное введение а-МПТ половозрелым животным не повлияло на индуцированный Кон А пролиферативный ответ лимфоцитов тимуса и селезенки, а также на количество АОК к ЭБ в селезенке. Таким образом, полученные данные указывают на особую значимость катехоламинов именно в развитии иммунной системы плода.

По данным литературы, в общей циркуляции плодов обнаружена высокая концентрация Ь-ДОФА и дофамина, которая значительно снижается в постнатальном развитии (Лаврентьева и др., 2006; Мельникова и др., 2006). Преобладающими катехоламинами в крови и в мозгу плодов являются именно Ь-ДОФА и дофамин, при этом уровень норадреналина и адреналина значительно ниже (Ре^ е1 аЦ 1984). Таким образом, вероятно, именно Ь-ДОФА и дофамин ответственны за обнаруженные эффекты. Об этом свидетельствует и отсутствие нарушений в развитии иммунной системы у мышей с нокаутом гена дофамин-Р-гидроксилазы, необходимой для синтеза норадреналина и адреналина (А1ашг е1 а1., 1999). Учитывая приведенные факты и то, что пренатальный дефицит катехоламинов отражается на Т-клетках половозрелых животных, можно считать, что Ь-ДОФА и/или дофамин выполняют морфогенетическую функцию в развитии иммунной системы.

В оценке полученных результатов необходимо принимать во внимание также возможность непрямого действия ингибирования синтеза катехоламинов на развитие иммунной системы, поскольку этот дефицит способен оказать влияние на дифференцировку пептидергических структур мозга, также участвующих в иммуномодуляции у половозрелых животных.

Таким образом, дефицит катехоламинов в критический период онтогенеза приводит к необратимым морфогенетическим изменениям в Т-клеточном звене иммунитета.

выводы

1. Дефицит серотонина в пренатальном периоде развития оказывает морфогенетическое влияние на формирование клеточного и гуморального иммунитета, в то время как дефицит катехоламинов - на формирование только клеточного иммунитета у крыс.

2. Численность клеточных популяций тимуса и селезенки в пренатальном периоде развития контролируется гипоталамо-гипофизарной системой. Выключение гипоталамуса у плодов крыс in utero приводит к усилению пролиферации клеток селезенки, а одновременное выключение гипоталамуса и гипофиза приводит к увеличению уровня пролиферации в тимусе и снижению уровня апоптоза в селезенке.

3. Экспрессия иммунных протеасом, участвующих в представлении собственных антигенов Т-лимфоцитам при их обучении, наблюдается в тимусе плодов уже на 18-й день и достигает характерного для взрослых животных уровня к 21-му дню эмбрионального развития.

4. У животных в неонатальном периоде развития, в отличие от половозрелых животных, Т-лимфоциты, покидающие тимус, первично заселяют красную пульпу селезенки и только потом мигрируют в соответствующие зоны белой пульпы.

5. У крыс Brattleboro с наследственным дефицитом гипоталамического аргинин-вазопрессина наблюдается снижение пролиферативного ответа Т-лимфоцитов на митоген в 2 раза в тимусе и в 2-4 раза в селезенке на протяжении всего постнатального периода развития.

6. Усиление противоопухолевого иммунитета у крыс Brattleboro может быть обусловлено повышением эффективности представления опухолевых антигенов за счет повышения содержания иммунных протеасом и восстановления экспрессии основных молекул главного комплекса гистосовместимости класса I в динамике роста опухоли Walker 256.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в журналах, соответствующих Перечню ВАК:

1. Мельникова В.И., Афанасьева М.А., Сапожников A.M., Захарова JI.A. Динамика апоптоза и пролиферации в тимусе и селезенке крыс в перинатальном онтогенезе// Онтогенез. 2006. Т. 37. №4. С. 286-291.

2. Арион В.Я., Мельникова В.И., Афанасьева М.А., Москвина С.Н., Захарова JI.A. Тактивин в регуляции апоптоза тимоцитов, индуцированного дексаметазоном // Бюл. Эксперим. Биол. и Мед. 2007. Приложение 2. Сборник научных трудов, посвященных 25-летию создания НИИ Физико-Химической Медицины. С. 109-111.

3. Афанасьева М.А., Мельникова В.И., Воронова С.Н., Хегай И.И., Попова H.A., академик РАН Иванова Л.Н., Захарова J1.A. Пролиферативный ответ лимфоцитов тимуса и селезенки, активированных Конканавалином А, в онтогенезе крыс Brattleboro с генетическим дефектом синтеза вазопрессина // ДАН. 2008. Т. 420. №2. С. 1-2.

4. Шарова Н.П, Мельникова В.И., Хегай И.И., Карпова Я.Д., Дмитриева С.Б., Астахова Т.М., Афанасьева М.А, Попова H.A., Иванова JI.H., Захарова Л.А. Особенности экспрессии протеасом в клетках опухоли Walker 256 после их трансплантации крысам Brattleboro с генетическим дефектом синтеза аргинин-вазопрессина // ДАН. 2008. Т. 419. № 6. С. 833-837.

5. Мельникова В.И., Афанасьева М.А., Шарова Н.П.,. Захарова Л.А. Иммунные протеасомы в развивающемся тимусе крысы // Биохимия. 2008. Т. 73. Вып. 4. С. 553-561.

6. Мельникова В.И., Карпова Я.Д., Афанасьева М.А., Захарова Л.А., Шарова Н.П. Иммунные протеасомы в формирующейся селезенке крысы // Изв. Акад. Наук. Серия биологическая. 2008. № 2. С. 163-168.

7. Афанасьева М.А., Извольская М.С., Воронова С.Н., Захарова Л.А., Мельникова В.И. Влияние дефицита серотонина на развитие иммунной системы крыс // ДАН. 2009. Т. 427. №4. С. 563-565.

Статьи:

1. Шарова Н.П., Астахова Т.М., Дмитриева С.Б., Мельникова В.И., Афанасьева М.А., Карпова Я.Д., Захарова Л.А. Роль иммунных протеасом в молекулярных механизмах становления иммунитета // Известия Национальной Академии Наук Белоруссии. Серия медицинских наук. 2008. № 1.С. 106-111.

Тезисы конференций:

1. Мельникова В.И., Афанасьева М.А., Арион В.Я., Захарова Л.А. Функциональное значение тимуса и гипоталамо-гипофизарной системы в регуляции апоптоза и пролиферации в иммунокомпетентных органах крыс в перинатальном онтогенезе // Материалы 5 Симпозиума с международным участием «Физиология иммунной системы. Перспективные подходы к диагностике и терапии иммунопатологии и аллергических заболеваний». Физиология и патология иммунной системы. 2006. № 10, приложение 1. С. 48-49.

2. Афанасьева М.А. Динамика спонтанного апоптоза и пролиферации в иммунокомпетентных органах крыс в перинатальном онтогенезе И Тезисы докладов Конференции молодых ученых ИБР РАН. Онтогенез. 2006. Т. 37. №4. С. 311.

3. Шарова Н.П., Астахова Т.М., Дмитриева С.Б., Мельникова В.И., Бондарева Л.А., Афанасьева М.А., Карпова Я.Д. Изменение пулов 26S- и 20Б-протеасом и становление иммунитета в постнатальном развитии

млекопитающих // Тезисы докладов VI симпозиума «Химия протеолитических ферментов». Москва. 2007. С. 43.

4. Мельникова В,И., Афанасьева М.А., Шарова Н.П., Захарова JI.A. Иммунные протеасомы в развивающемся тимусе крысы // Сборник тезисов 11-й международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века». Пущино. 2007. С. 230.

5. Афанасьева М.А. Особенности селекции тимоцитов на ранних этапах их дифференцировки в перинатальном онтогенезе крыс // Тезисы докладов Конференции молодых ученых ИБР РАН. Онтогенез. 2007. Т. 38. № 4. С. 313-314.

6. Афанасьева М.А. Влияние вазопрессина и серотонина на созревание Т-системы иммунитета в онтогенезе крыс // Тезисы докладов Конференции молодых ученых ИБР РАН. Онтогенез. 2008. Т. 39. № 4. С. 309.

7. Афанасьева М.А. Особенности развития опухоли Walker 256 после трансплантации крысам Brattleboro // Тезисы докладов Конференции молодых ученых ИБР РАН. Онтогенез. 2009. Т. 40. № 4. С. 307.

8. Афанасьева М.А., Мельникова В.И. Особенности экспрессии протеасом в клетках опухоли Walker 256 после их трансплантации крысам Brattleboro с генетическим дефектом синтеза вазопрессина // XV школа «Актуальные проблемы биологии развития». Тезисы стендовых докладов молодых ученых. Звенигород. 2008. С. 5-7.

9. Захарова JI.A., Шарова Н.П., Мельникова В.И., Афанасьева М.А. Иммунные протеасомы и их роль в развитии иммунитета // Иммунологический Форум с международным участием. Российский иммунологический журнал. 2008. Т. 2. № 2-3. С. 121.

10. Афанасьева М.А., Извольская М.С., Мельникова В.И. Морфогенетическое влияние дефицита серотонина на иммунную систему крыс // Иммунологический Форум с международным участием. Российский иммунологический журнал. Т. 2. № 2-3. 2008. С. 152.

1 l.Afanasyeva М.А., Melnikova V.l., Izvolskaia M.S., Zakharova L.A. Early-life serotonin depletion alters humoral and cellular immunity // Vlth European Congress of Reproductive Immunology. Moskow. 2008. 19-20.

12. Melnikova V.l., Afanasyeva M.A., Sharova N.P., Zakharova L.A. Proteasomes and immunity: immune proteasomes in developing thymus and spleen // Vlth European Congress of Reproductive Immunology. Moscow. 2008. 18-19.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты № 05-0448830, 08-04-00276) и ФЦП (шифр: 2009-02-1.2-04-45-048).

В работе было использовано оборудование «Центра коллективного пользования по биологии развития на основе использования клеточных технологий и оптических методов исследования» на базе Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Заказ № 107-а/09/09 Подписано в печать 16.09.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30; (495) 778-22-20 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Афанасьева, Марина Алексеевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Влияние нейроэндокриниой системы на функционирование иммунной системы.

1.1.1. Нейропептиды гипоталамуса.

1.1.2. Гормоны гипофиза.

1.1.3. Гормоны надпочечников.

1.1.4. Тиреоидные гормоны.

1.1.5. Половые гормоны.

1.1.6. Нейромедиаторы.

1.2. Влияние нейроэндокриниой системы на развитие иммунной системы.

1.2.1. Развитие иммунной системы у крыс.

1.2.2. Перинатальное программирование.

1.2.3. Морфогенетическая роль гормонов и нейромедиаторов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Динамика уровня естественного апоптоза и пролиферации клеток тимуса и селезенки в пренатальном и раннем постнатальном онтогенезе крыс и влияние гипоталамо-гипофизарной системы и тимических пептидов на эти процессы.

3.1.1. Возрастная динамика уровня апоптоза и пролиферации в тимусе и селезенке крыс.

3.1.2. Влияние гипоталамо-гипофизарной системы на уровень апоптоза и пролиферации в тимусе и селезенке в пренатальном периоде развития.

3.1.3. Влияние тимических пептидов на уровень апоптоза тимоцитов in vitro.

3.2. Динамика содержания иммунных протеасом в тимусе в перинатальном онтогенезе крыс.

3.3. Особенности миграции Т-лимфоцитов в белую пульпу селезенки в раннем постнатальном онтогенезе.

3.4. Роль аргинин-вазопрессина в развитии и функционировании иммунной системы у крыс.

3.4.1. Пролиферативный ответ Т-клеток тимуса и селезенки у крыс Brattleboro с наследственным дефицитом гипоталамического аргинин-вазопрессина.

3.4.2. Молекулярные механизмы усиления противоопухолевого иммунитета у крыс Brattleboro с наследственным дефицитом гипоталамического аргинин-вазопрессина.

3.5. Роль серотонина в развитии и функционировании иммунной системы.

3.5.1. Морфогенетическое влияние пренатального дефицита серотонина на иммунитет.

3.5.2. Влияние серотонина in vitro на пролиферативный ответ Т-клеток, индуцированный Кон А.

3.6. Морфогенетическое влияние пренатального дефицита катехоламинов на иммунитет.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Развитие иммунной системы в онтогенезе крыс: нейроэндокрино-иммунные взаимодействия"

Актуальность проблемы Актуальность исследования взаимодействий нейроэндокринной и иммунной систем в онтогенезе определяется их ключевой ролью в поддержании гомеостаза и интеграции развивающегося организма.

Согласно современным представлениям, нейромедиаторы и нейрогормоны, участвующие в регуляции определенной функции в постнатальный период, могут влиять на формирование этой функции в ходе перинатального онтогенеза. И хотя регуляторное влияние медиаторов нейроэндокринной системы на иммунитет в постнатальном онтогенезе доказано многочисленными экспериментальными и клиническими данными (Besedovsky, del Rey, 1996; Kelley et al., 2007; Barnard et al., 2008), их роль в развитии иммунной системы освещена лишь в единичных работах. Известно, что удаление в раннем онтогенезе надпочечников или щитовидной железы приводит к необратимому подавлению тимус-зависимых функций. Подобные изменения не развиваются, если операция проведена на половозрелых животных (Fabris, 1981; Fabris et al., 1995). Неонатальная блокада синтеза гонадотропин-рилизинг гормона или его рецепторов у крыс и приматов вызывает долгосрочное снижение количества лимфоцитов в тимусе, селезенке и крови, подавление гуморального и клеточного иммунитета (Morale et al., 1991; Gould et al., 1998). В то же время установлено, что гонадотропин-рилизинг гормон включается в регуляцию иммунного ответа уже в пренатальном онтогенезе (Zakharova et al., 2000).

Остается открытым вопрос о формировании и функционировании иммунной и нейроэндокринной систем у млекопитающих с интенсивными физиологическими и биохимическими перестройками организма, в частности, в отсутствие гипоталамического аргинин-вазопрессина у мутантных крыс Brattleboro. Известно, что у крыс Brattleboro развиваются существенные морфофункциональные отклонения в системе иммунитета: ускорение возрастной инволюции тимуса и селезенки, подавление антителогенеза, подавление функциональной активности макрофагов (Захарова и др. 2001; Хегай и др., 2003). С другой стороны, в отсутствие аргинин-вазопрессина отмечено усиление активности естественных клеток-киллеров (Yirmiya et al., 1989). В то же время формирование и функционирование Т-системы иммунитета у этих крыс остается неизученным.

Цель и задачи исследования

Научная новизна и практическая значимость работы

Изучена возрастная динамика спонтанного апоптоза и пролиферации лимфоцитов тимуса и селезенки и впервые выявлена роль гипоталамо-гипофизарной системы в регуляции этих процессов. Показано, что выключение гипоталамуса у плодов крыс in utero приводит к усилению пролиферации клеток селезенки, а одновременное выключение гипоталамуса и гипофиза приводит к увеличению уровня пролиферации в тимусе и снижению уровня апоптоза в селезенке.

Впервые исследована динамика экспрессии иммунных протеасом в тимусе в перинатальном онтогенезе у крыс и проведен гистологический анализ их распределения. Было показано, что иммунные протеасомы начинают экспрессироваться в тимусе уже с 18-го дня пренатального периода развития и к 21-му дню достигают уровня, характерного для взрослых животных. Полученные данные позволили сделать заключение о том, что становление отрицательной селекции лимфоцитов в тимусе может происходить уже в конце пренатального периода развития.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы были представлены на Иммунологическом Форуме с международным участием (Санкт-Петербург, 2008), VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007), 11-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века» (Пущино, 2007), 5-м Симпозиуме с международным участием «Физиология иммунной системы. Перспективные подходы к диагностике и терапии иммунопатологий и аллергических заболеваний» (Москва, 2006), Конференциях молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Москва, 2005, 2006, 2007, 2008), XV школе «Актуальные проблемы биологии развития» (Звенигород, 2008), VI European Congress of Reproductive Immunology (Moskow, 2008).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ. Статей в журналах - 8, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК - 7, тезисов докладов в материалах конференций - 12.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Афанасьева, Марина Алексеевна

выводы

5. У крыс Brattiebor о с наследственным дефицитом гипоталамического аргинин-вазопрессина наблюдается снижение пролиферативного ответа Т-лимфоцитов на митоген в 2 раза в тимусе и в 2-4 раза в селезенке на протяжении всего постнатального периода развития.

6. Усиление противоопухолевого иммунитета у крыс Brattiebor о может быть обусловлено повышением эффективности представления опухолевых антигенов за счет повышения содержания иммунных

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Афанасьева, Марина Алексеевна, Москва

1. Абрамов В.В. Интеграция иммунной и нервной систем. Новосибирск.: Наука. 1991. 168 с.

2. Астахова Т.М., Шарова Н.П. Исключение иммунных протеасом из асцитной карциномы Krebs-II мыши. Изв. РАН. Сер. Биол. 2006. № 3. С. 275-283.

3. Иванова A.A., Дейгин Е.В., Владимирская Е.И., Осипова Е.Ю., Захаров М.В. Влияние тимических пептидов на апоптоз клеток крови человека. Гематол. и трансфузиол. 2000. Т. 45. № 4. С. 9-10.

4. Захарова J1.A., Карягина А.Ю., Попова H.A., Хегай И.И., Иванова JI.H. Гуморальный иммунный ответ в онтогенезе крыс Браттлеборо с наследственным дефектом синтеза вазопрессина. Докл. АН. 2001. Т. 376. №2. С. 283-285.

5. Захарова JI.A., Арион В.Я., Ермилова И.Ю. Функциональное значение гипоталамо-гипофизарной системы и тимуса в регуляции иммунитета в раннем онтогенезе млекопитающих. Аллергол. и иммунол. 2004 Т. 5. №4. С. 542-547.

6. Мицкевич Н.С., Румянцева О.Н., Прошлякова Е.В., Сергеенкова Г.П. Энцефалэктомия зародышей млекопитающих (крыса, кролик, морская свинка). Онтогенез. 1970. Т. 1. С. 612-615.

7. Потапова А.А., Малюкова И.В., Прошлякова Е.В., Захарова Л.А. Гипоталамо-гипофизарная система контролирует развитие гуморального иммунного ответа у крыс в пренатальном онтогенезе. Онтогенез. 2002. Т.ЗЗ. №2. С. 124-129.

8. Райцина С.С., Чуич Н.А., Рябчиков О.П., Незлин P.C. Свойства и кинетика популяции В-лимфоцитов в онтогенезе крысы. Бюлл. Эксп. Биол. и Мед. 1977. Т. 84. № 10. С. 491-494.

9. Хавинсон В.Х., Кветной И.М. Пептидные биорегуляторы ингибируют апоптоз. Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2000. Т. 130. № 12. С. 657-659.

10. Хегай И.И., Гуляева М.А., Попова Н.А. Захарова Л.А., Иванова Л.Н. Особенности системы иммунитета в онтогенезе у крыс с дефектом синтеза вазопрессина. Бюл. экспер. биол. и мед. 2003. Т. 136. № 11. С. 505-508.

11. Хегай И.И., Попова Н.А., Захарова Л.А., Иванова Л.Н. Особенности роста опухоли Walker 256 у крыс с наследственным дефектом синтеза вазопрессина. Бюл. экспер. биол. и мед. 2006. Т. 142. № 3. С. 344-346.

12. Ярилин А.А. Основы иммунологии. М.: Медицина. 1999. 607 с.

13. Aggio M.С., Giusto N.G., Bruzzo М.Т. The participation of spleen and bone marrow in mice erythropoiesis as a fonction of âge. Acta Physiol. Lat. Am. 1972. V. 22. P. 1-5.

14. Alaniz R.C., Thomas S.A., Perez-Melgosa M., Mueller K., Farr A.G., Palmiter R.D., Wilson C.B. Dopamine beta-hydroxylase deficiency impairs cellular immunity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999.V. 96. N. 5. P. 22742278.

15. Anderson G., Jenkinson E.J. Lymphostromal interactions in thymic development and function. 2001 Nat. Rev. Immunol. V. 1. N. 1. P. 31-40.

16. Anderson G., Lenkinson W.E., Jones Т., Parnell S.M., Kinsella F.A., White A.J., Pongracz J.E., Rossi S.W., Jenkinson E.J. Establishment and functioning of intrathymic microenvironments. Imm. Rev. 2006. V. 209. P. 10-27.

17. Arion V.Ya. Thymic Peptides as Immunoregulators, with Special Reference to Tactivin. Harwood Academic Publisher. 1989. T. 2. C. 1-57.

18. Ashwell J.D., King L.B., Vacchio M.S. Cross-talk between the T cell antigen receptor and the glucocorticoid receptor regulates thymocyte development. Stem Cells. 1996. V. 14. N. 5. P. 490-500.

19. Azad N., Emanuele N.V., Halloran M.M., Tentler J., Kelley M.R. Presence of luteinizing hormone-releasing hormone (LHRH) mRNA in rat spleen lymphocytes. Endocrinology. 1991. V. 128. N. 3. P. 1679-1681.

20. Azad N., LaPaglia N., Agrawal L. Steiner J., Uddin S., Williams D.W., Lawrence A.M., Emanuele N.V. The role of gonadectomy and testosterone replacement on thymic luteinizing hormone-releasing hormone production. J. Endocrinol. 1998. V. 158. P. 229-235.

21. Barker D.J. The fetal origins of adult disease. Fetal and Maternal Medicine Review. 1994. V. 6. P. 71-80.

22. Barker D.J., Osmond C., Rodin I., Fall C.H., Winter P.D. Low weight gain in infancy and suicide in adult life. Br. Med. J. 1995. V. 311. N. 7014. P. 1203.

23. Barker D.J. The developmental origins of chronic adult disease. Act. Paediatr. 2004. V. 93(Suppl). P. 26-33.

24. Barnard A., Layton D., Hince M., Sakkal S., Bernard C., Chidgey A., Boyd R. Impact of the neuroendocrine system on thymus and bone marrow function. Neuroimmunomodulation. 2008. V. 15. P. 7-18.

25. Batticane N., Morale M.C., Gallo F., Farinella Z., Marchetti B. Luteinizing hormone-releasing hormone signaling at the lymphocyte involves stimulation of interleukin-2 receptor expression. Endocrinology. 1991. V. 129. P. 277286.

26. Basu S., Dasgupta P.S. Dopamine, a neurotransmitter, influences the immune system. J. Neuroimmunol. 2000. V. 102. P. 113-124.

27. Baumann C.A., Badamchian M., Goldstein A.L. Thymosin al is a time and dose-dependent antagonist of dexamethasone-induced apoptosis of murine thymocytes in vitro. Int. J. Immunopharmacol. 2000. V. 22. N. 12. P. 1057-1066.

28. Baxter J.B., Blalock J.E., Weigent D.A. Expression of immunoreactive growth hormone in leukocytes in vivo. J. Neuroimmunol. 1991. V. 33. N. 1. P. 43-54.

29. Beltramo M., Calas A., Chernigovskaya E., Thibault J., Ugrumov M. Long-lasting effect of catecholamine deficiency on differentiating vasopressin and oxytocin neurons in the rat supraoptic nucleus. Neuroscience. 1997. V. 79. N. 2. P. 555-561.

30. Bergquist J., Tarkowski A., Ekman R., Ewing A. Discovery of endogenous catecholamines in lymphocytes and evidence for catecholamine regulation of lymphocyte function via an autocrine loop. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 91. P. 12912-12916.

31. Bernabe J., Proshlyakova E., Sapronova A., Trembleau A., Calas A., Ugrumov M. Pharmacological model of catecholamine depletion in the hypothalamus of fetal and neonatal rats and its application. Cell. Mol. Neurobiol. 1996.V. 16. N. 6. P. 617-624.

32. Besedovsky H.O., del Rey A. Immune-neuro-endocrine interactions: facts and hypotheses. Endocr. Rev. 1996. V. 17. N. 1. P. 64-102.

33. Bhasin N., Kernick E., Luo X., Seidel H.E., Weiss E.R., Lauder J.M. Differential regulation of chondrogenic differentiation by the serotonin2B receptor and retinoic acid in the embryonic mouse hindlimb. Dev. Dyn. 2004. Y. 230. N. 2. P. 201-209.

34. Brelinska R., Malinska A. Homing of hemopoietic precursor cells to the fetal rat thymus: intercellular contact-controlled cell migration and development of the thymic microenvironment. Cell. Tissue Res. 2005. V. 322. P. 393-405

35. Bouchard B., Ormandy C.J., Di Santo J.P., Kelly P.A. Immune system development and funciton in prolactin receptor-deficient mice. J. Immunol. 1999. V. 163. P. 576-582.

36. Burd L., Severud R., Kerbeshian J., Klug M.G. Prenatal and perinatal risk factors for autism. J Perinat Med. 1999. V. 27. N. 6. P. 441-450.

37. Buznikov G.A., Shmukler Yu.B., Lauder J.M. Changes in the physiological roles of neurotransmitters during individual development. Neurosci. Behav. Physiol. 1999. V. 29. N. 1. P. 11-21.

38. Carr L., Tuckera A., Fernandez-Botran R. The enhancement of T cell proliferation by L-dopa is mediated peripherally and does not involve interleukin-2. J. Neuroimmunol. 2003. V. 142. P. 166-169.

39. Carreño P.C., Sacedón R., Jiménez E., Vicente A., Zapata A.G. Prolactin affects both survival and differentietion of T-cell progenitors. J. Neuroimmunol. 2005. V. 160. N. 1-2. P. 135-145.

40. Castro J.E. Orchidectomy and immune response. Ann. R. Coll. Surg. Engl. 1976. V. 58. P. 359-367.

41. Caudill C., Jayarapu K., Elenich L., Monaco J., Colbert R., Griffin T. T cells lacking immunoproteasome subunits MECL-1 and LMP7 hyperproliferate in response to polyclonal mitogens. J. Immunol. 2006. V. 176. N. 7. 4075-4082.

42. Chrousos G.P. The hypothalamic-pituitary-adrenal axis and immunemediated inflammation. The New England J. Med. 1995. V. 332. N. 20. P. 1351-1362.

43. Cloéz-Tayarani I., Changeux J.P. Nicotine and serotonin in immune regulation and inflammatory processes: a perspective. J. Leukoc. Biol. 2007. V. 81. N. 3. P. 599-606.

44. Cosgrove D., Chan S.H., Waltzinger C., Benoist C., and Mathis D. The thymic compartment responsible for positive selection of CD4+ T cells. Int. Immunol. 1992. V. 4. N. 6. P. 707-710.

45. Csaba G., Kovacs P., Pallinger E. Immunologically demonstrable hormones and hormone-like molecules in rat white blood cells and mast cells. Cell. Biol. Int. 2004. V. 28. N. 6. P. 487-490.

46. Csaba G., Kovacs P. Perinuclear localization of biogenic amines (serotonin and histamine) in rat immune cells. Cell. Biol. Int. 2006. V. 30. N. 11. P. 861865.

47. Csaba G., Pallinger E. Thyrotropic hormone (TSH) regulation of triiodothyronine (T(3)) concentration in immune cells. Inflamm. Res. 2009. V. 58. N. 3. P. 151-154.

48. Cunningham A.J. A method of increased sensitivity for detecting single antibody-forming cells. Nature. 1965. V. 207. N. 5001. P. 1106-1107.

49. Dardenne M., Smaniotto S., de Mello-Coelho V., Villa-Verde D.M., Savino W. Growth hormone modulates migration of developing T cells. Ann. NY Acad. Sci. 2009. V. 1153. P. 1-5.

50. Dardenne M., Mello-Coelho V., Gagnerault M.C., Postel-Vinay M.C. Growth hormone receptors and immunocompetent cells. Ann. NY Acad. Sci. 1998. V. 840. P. 510-517.

51. Del Rey A.E., Besedovsky H.O., Sorkin E., Da Prada M. Endogenous blood levels of corticosterone control the immunologic cell mass and B cell activity in mice. J. Immunol. 1984. V. 133. P. 572-575.

52. DeMartino G.N., Gillette T.G. Proteasomes: machines for all reasons. Cell. 2007. V. 129. N. 4. P. 659-662.

53. Donner K.J., Becker K.M., Hissong B.D. Comparison of multiple assays for kinetic detection of apoptosis in thymocytes exposed to dexamethasone or diethylstilbesterol. Cytometry. 1999. V. 35. N. 1. P. 80-90.

54. Egerton M., Scollay R., Shortman K. Kinetics of mature T-cell development in the thymus. Proc. Natl. Acad. Sci. 1990. V. 87. P. 2579-2582.

55. Elands J., Resink A., De Kloet E.R. Neurohypophyseal hormone receptors in the rat thymus, spleen, and lymphocytes. Endocrinology. 1990. V. 126. N. 5. P. 2703-2710.

56. Elenkov I.J., Wilder R.L., Chrousos G.P., Vizi E.S. The sympathetic nerve—an integrative interface between two supersystems: the brain and the immune system. Pharmacol. Rev. 2000. V. 52. N. 4. P. 595-638.

57. Fabris N. Ontogenetic and phylogenetic aspects of neuroendocrine-immune network. Develop. Comp. Immunol. 1981. V. 5. P. 49-60.

58. Fabris N., Mocchegiani E., Provinciali M. Pituitary-thyroid axis and immune system: a reciprocal neuroendocrine-immune interaction. Horm. Res. 1995. V. 43. P. 29-38.

59. Faraj B.A., Olkowski Z.L., Jackson R.T. Expression of a high-affinity serotonin transporter in human lymphocytes. Int. J. Immunopharmacol. 1994. V. 16. N. 7. P. 561-567.

60. Fazzino F., Urbina M., Cedeno N., Lima L. Fluoxetine treatment to rats modifies serotonin transporter and cAMP in lymphocytes, CD4+ and CD8+ subpopulations and interleukins 2 and 4. Int. Immunopharmacol. 2009.V. 9. N. 4. P. 463-467.

61. Felten D.L., Felten S.Y., Bellinger D.L., Carlson S.L., Ackerman K.D., Madden K.S., Olschowki J.A., Livnat S. Noradrenergic sympathetic neural interactions with the immune system: structure and function. Immunol. Rev. 1987. V. 100. P. 225-260.

62. Flierl M.A., Rittirsch D., Nadeau B.A., Sarma J.V., Day D.E., Lentsch A.B., Huber-Lang M.S., Ward P.A. Upregulation of phagocyte-derived catecholamines augments the acute inflammatory response. PLoS ONE. 2009. V. 4.N. 2. P. e4414.

63. Fowden A.L., Forhead A.J. Endocrine mechanisms of intrauterine programming. Reproduction. 2004. V. 127. P. 515-526.

64. Grasso G., Massai L., De Leo V., Muscettola M. The effect of LHRH and TRH on human interferon-gamma production in vivo and in vitro. Life Sci. 1998.V. 62. P. 2005-2014.

65. Greene R.M., Garbarino M.P. Role of cyclic AMP, prostaglandins, and catecholamines during normal palate development. Curr. Top. Dev. Biol. 1984. V. 19. P. 65-79.

66. Hu S.B., Zhao Z.S., Yhap C., Grinberg A., Huang S.P., Westphal H., Gold P. Vasopressin receptor la-mediated negative regulation of B cell receptor signaling. J. Neuroimmunol. 2003. V. 135. N. 1-2. P. 72-81.

67. Izvolskaia M., Duittoz A.H., Tillet Y., Ugrumov M.V. The influence of catecholamine on the migration of gonadotropin-releasing hormone-producing neurons in the rat foetuses. Brain Struct. Funct. 2009. V. 213. N. 3. P. 289300.

68. Jackson J.C., Cross R.J., Walker R.F., Markesbery W.R., Brooks W.H., Roszman T.L. Influence of serotonin on the immune response. Immunology. 1985. V. 54. P. 505-512.

69. Jackson J.C., Walker R.F., Brooks W.H., Roszman T.L. Specific uptake of serotonin by murine macrophages. Life Sci. 1988. V. 42. P. 1641-1650.

70. Jacobson J.D., Crofford L.J., Sun L., Wilder R.L. Cyclical expression of GnRH and GnRH receptor mRNA in lymphoid organs. Neuroendocrinology. 1998.V. 67. N. 2. P. 117-125.

71. Joel D.D., Chanana A.D., Cottier H., Cronkite E.P., Laissue J.A. Fate of thymocytes: studies with 1251-iododeoxyuridine and 3H-thymidine in mice. Cell Tis. Kinet. 1977. V. 10. P. 57-69.

72. Johnson H.M., Torres B.A. Regulation of lymphokine production by arginine vasopressin and oxytocin: modulation of lymphocyte function by neurohypophyseal hormones. J. Immunol. 1985. V. 135. N. 2(Suppl). P. 773s-775s.

73. Josefsson E., Bergquist J., Ekman R.J., Tarkowski A. Catecholamines are synthesized by mouse lymphocytes and regulate function of these cells by induction of apoptosis. Immunology. 1996. V. 88. P. 140-146.

74. Jost A. Experiences de decapitation de l'embryon de lapin. Comp. Rend. Acad. Sci. Colon. 1947. V. 225. P. 322-324.

75. Kasson B.G., Hsueh A.J. Arginine vasopressin as an intragonadal hormone in Brattleboro rats: presence of a testicular vasopressin-like peptide and functional vasopressin receptors. Endocrinology. 1986. V. 118. N. 1. P. 23-31.

76. Kelley K.W., Weigent D.A., Kooijman R. Protein Hormones and Immunity. Brain Behav Immun. 2007. V. 21. N. 4. P. 384-392.

77. Kooijman R., Gerlo S., Coppens A., Hooghe-Peters E.L. Growth hormone and prolactin expression in the immune system. Ann. NY Acad. Sci. 2000. V. 917. P. 534-540.

78. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970. V. 227. N. 5259. P. 680-685.

79. Langley-Evans S.C. Developmental programming of health and disease. Proc. Nutr. Soc. 2006. V. 65. P. 97-105.

80. Lauder J.M., Bloom F.E. Ontogeny of monoamine neurons in the locus coeruleus, Raphe nuclei and substantia nigra of the rat. I. Cell differentiation. J. Comp. Neurol. 1974. V. 155. N. 4. P. 469-481.

81. Lauder J.M., Wallace J.A., Krebs H. Roles for serotonin in neuroembryogenesis. Adv. Exp. Med. Biol. 1981. V. 133. P. 477-506.

82. Lauder J.M. Neurotransmitters as growth regulatory signals: role of receptors and second messengers. Trends Neurosci. 1993. V. 16. N. 6. P. 233

83. León-Ponte M., Ahern G.P., O'Connell P.J. Serotonin provides an accessory signal to enhance T-cell activation by signaling through the 5-HT7 receptor. Blood. 2007. V. 109. N. 8. P. 3139-3146.

84. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951. V. 193. N. l.P. 265-275.

85. Lucas A. Programming by early nutrition in man. Ciba Foundation Symposium. 1991. V. 156. P. 38-50.

86. Madden K.S., Felten D.L. Experimental basis for neural-immune interactions. Physiol. Rev. 1995. V. 75. N. 1. P. 77-106.

87. Manley N.R. Thymus organogenesis and molecular mechanisms of thymic epithelial cell differentiation. Immunology. 2000. V. 12. P. 421-428.

88. Marchetti B., Gallo F., Farinella Z., Tirolo C., Testa N., Romeo C., Morale M.C. Luteinizing hormone-releasing hormone is a primary signaling molecule in the neuroimmune network. Ann. NY Acad. Sci. 1998. V. 840. P. 205-248.

89. Marino F., Cosentino M., Bombelli R., Ferrari M., Lecchini S., Frigo G. Endogenous catecholamine synthesis, metabolism storage, and uptake in human peripheral blood mononuclear cells. Exp. Hematol. 1999. V. 27. N. 3. P. 489-495.

90. Markwick A.J., Lolait S.J., Funder J.W. Immunoreactive arginine vasopressin in the rat thymus. Endocrinology. 1986.V. 119. N. 4. P. 16901696.

91. Mascanfroni I., Montesinos M.del M., Susperreguy S., Cervi L., Ilarregui J.M., Ramseyer V.D., Masini-Repiso A.M., Targovnik H.M., Rabinovich

92. G.A., Pellizas C.G. Control of dendritic cell maturation and function by triiodothyronine. FASEB J. 2008. V. 22. N. 4. P. 1032-1042.

93. McPhee D., Pye J., Shortman K. The differentiation of T lymphocytes. Y. Evidence for intrathymic death of most thymocytes. Thymus. 1979. V. l.P. 151-162.

94. Meazza C., Pagani S., Travaglino P., Bozzola M. Effect of growth hormone (GH) on the immune system. Pediatr. Endocrinol. Rev. 2004. V. 1. Suppl. 3. P. 490-495.

95. Metcalf D. The Thymus: Experimental and clinical studies. Eds. G.W.E. Wolstenholme, R. Porter. L.: Churchill. 1966. P. 242-263.

96. Miller G.E., Rohleder N., Stetler C., Kirschbaum C. Clinical depression and regulation of the inflammatory response during acute stress. Psychosom. Med. 2005. V. 67. N. 5. P. 679-687.

97. Misu Y., Goshima Y., Ueda H., Okamura H. Neurobiology of L-DOPAergic systems. Prog. Neurobiol. 1996. V. 49. N. 5. P. 415-454.

98. Moore M.A.S. Embryologic and phylogenetic development of the hematopoietic system. Adv. Biosci. 1975. V. 16. P. 87-103.

99. Moser M., De Smedt T., Sornasse T., Tielemans F., Chentoufi A.A., Muraille E., Van Mechelen M., Urbain J., Leo O. Glucocorticoids down-regulate dendritic cell function in vitro and in vivo. Eur. J. Immunol. 1995. V. 25. P. 2818-2824.

100. Mossner R., Lesch K. Role of serotonin in the immune system and in neuroimmune interactions. Brain Behav. Imm. 1998. V. 12. P. 249-271.

101. Mossner R., Daniel S., Schmitt A., Albert D., Lesch K.P. Modulation of serotonin transporter function by interleukin-4. Life Sci. 2001. V. 68. N. 8. P. 873-880.

102. Naquet P., Naspetti M., Boyd R. Development, organization and function of the thymic medulla in normal, immunodeficient or autoimmune mice. Semin. Immunol. 1999. V. 11. N. 1. P. 47-55.

103. Nedergaard J., Herron D., Jacobsson A., Rehnmark S., Cannon B. Norepinephrine as a morphogen?: its unique interaction with brown adipose tissue. Int. J. Dev. Biol. 1995. V. 39. N. 5. P. 827-837.

104. Nussey S.S., Ang V.T., Jenkins J.S., Chowdrey H.S., Bisset G.W. Brattleboro rat adrenal contains vasopressin. Nature. 1984.V. 310. N. 5972. P. 64-66.

105. O'Connell P.J., Wang X., Leon-Ponte M., Griffiths C., Pingle S.C., Ahern G.P. A novel form of immune signaling revealed by transmission of the inflammatory mediator serotonin between dendritic cells and T cells. Blood. 2006. V. 107. N. 3.P. 1010-1017.

106. Offen D., Ziv I., Gorodin S., Barzilai A., Malik Z., Melamed E. Dopamine-induced programmed cell death in mouse thymocytes. Biochem. Biophys. Acta. 1995. V. 1268. P. 171-178.

107. Olsen N.J., Kovacs W.J. Gonadal Steroids and Immunity. Endocr. Rev. 1996. V. 17. N. 4. P. 369-384.

108. Olsen N.J., Olson G., Viselli S.M., Gu X., Kovacs W.J. Androgen receptors in thymic epithelium modulate thymus size and thymocyte development. Endocrinology. 2001a. V. 142. N. 3. P. 1278-1283.

109. Olsen N.J., Gu X., Kovacs W.J. Bone marrow stromal cells mediate androgenic suppression of B lymphocyte development. J. Clin. Invest. 2001b. V. 108. P. 1697-1704.

110. Pallinger E., Csaba G. A hormone map of human immune cells showing the presence of adrenocorticotropic hormone, triiodothyronine and endorphin in immunophenotyped white blood cells. Immunology. 2007. V. 123. P. 584589.

111. Peleg D., Arbogast L.A., Peleg E., Ben-Jonathan N. Predominance of L-dopa in fetal plasma and the amniotic fluid during late gestation in the rat. Am. J. Obstet. Gynecol. 1984. V. 149. N. 8. P. 880-883.

112. Petrovsky N. Towards a unified model of neuroendocrine-immune interaction. Imm. Cell Biol. 2001. V. 79. P. 350-357.

113. Provinciali M., Fabris N. Models and mechanisms of neuroendocrine-immune interactions during ontogeny. Adv. Neuroimmunol. 1991. V. 1. P. 124-138.

114. Raber J., Bloom F.E. IL-2 induces vasopressin release from the hypothalamus and the amygdala: role of nitric oxide-mediated signaling. J. Neurosci. 1994. V. 14. N. 10. P. 6187-6195.

115. Razia S., Maegawa Y., Tamotsu S., Oishi T. Histological changes in immune and endocrine organs of quail embryos: exposure to estrogen and nonylphenol. Ecotoxicol. Environ. Saf. 2006. V. 65. P. 364-371.

116. Ribeiro-Carvalho M.M., Smaniotto S., Neves-dos-Santos S., Mou<?o T., Savino W., Mello-Coelho V. Triiodothyronine modulates differential homing of recent thymic emigrants to peripheral lymphoid organs. Scand. J. Immunol. 2007. V. 66. N. l.P. 8-16.

117. Rock K.L., Goldberg A.L. Degradation of cell proteins and the generation of MHC class I-presented peptides. Annu. Rev. Immunol. 1999. V. 17. P. 739-779.

118. Rundle S.E., Funder J.W. Ontogeny of corticotropin-releasing factor and arginine vasopressein in the rat. Neuroendocrinology. 1988. V. 47. N. 5. P. 374-378.

119. Sacedón R., Vicente A., Varas A., Jiménez E., Muñoz J.J., Zapata A.G. Role of glucocorticoids in early T-cell differentiation. Ann. NY Acad. Sci. 2000. V. 917. P. 732-740.

120. Sakabe K., Seiki K., Sakai N., He W. Establishment of "crosstalk" between the thymus and brain at an early stage of fetal life in the rat. Med. Sci. Res. 1996. V. 24. P. 439-442.

121. Schanoski A.S., Cavalcanti T.C., Campos C.B., Viera-Matos A.N., Rettori0., Guimaráes F. Walker 256 tumor MHC class I expression during the shift from A variant to the immunogenic AR variant. Cancer Lett. 2004. V. 211. N.1.P. 119-127.

122. Sempere T., Urbina M., Lima L. 5-HT1A and beta-adrenergic receptors regulate proliferation of rat blood lymphocytes. Neuroimmunomodulation. 2004. V. 11. N. 5. P. 307-315.

123. Shibasaki T., Hotta M., Sugihara H., Wakabayashi I. Brain vasopressin is involved in stress-induced suppression of immune function in the rat. Brain Res. 1998. V. 808. N. 1. P. 84-92.

124. Shortman K., Scolly R. Death in the thymus. Nature. 1994. V. 372. P. 4445.

125. Singal D.P., Ye M., Qiu X. Molecular basis for lack of expression of HLA class I antigens in human small-cell lung carcinoma cell lines. Int. J. Cancer. 1996. V. 68. N. 5. P. 629-636.

126. Slominski A., Paus R. Are L-tyrosine and L-dopa hormone-like bioregulators? J. Theor. Biol. 1990. V. 143. P. 123-138.

127. Soza A., Knuehl C., Groettrup M., Henklein P., Tanaka K., Kloetzel P. Expression and subcellular localization of mouse 20S proteasome activator complex PA28. FEBS Letters. 1997. V. 413. P. 27-34.

128. Staples J.E., Gasiewicz T.A., Fiore N.C., Lubahn D.B., Korach K.S., Silverstone A.E. Estrogen receptor alpha is necessary in thymic development and estradiol-induced thymic alterations. J. Immunol. 1999. V. 163. P. 41684174.

129. Stefulj J., Jernej B., Cicin-Sain L., Rinner I., Schauenstein K. mRNA expression of serotonin receptors in cells of the immune tissues of the rat. Brain Behav. Immun. 2000. V. 14. N. 3. P. 219-224.

130. Stefulj J., Cicin-Sain L., Schauenstein K., Jernej B. Serotonin and immune response: effect of the amine on in vitro proliferation of rat lymphocytes. Neuroimmunomodulation. 2001. V. 9. N. 2. P. 103-108.

131. Sternberg E.M. Neural regulation of innate immunity: a coordinated nonspecific host response to pathogens. Nat. Rev. Immunol. 2006. V. 6. N. 4. P. 318-328.

132. Suniara R.K., Jenkinson E.J., Owen J.J.T. An essential role for thymic mesenchyme in early T cell development. J. Exp. Med. 2000. V 191. N. 6. P. 1051-1056.

133. Surh C.D., Sprent J. T-cell apoptosis detected in situ during positive and negative selection in the thymus. Ibid. 1994. V. 372. P. 100-103.

134. Svennilson J., Aperia A. Dopamine in the developing kidney. Int. J. Dev. Biol. 1999. V. 43. N. 5. P. 441-443.

135. Tanriverdi F., Silveira L.F.G., MacColl G.S., Bouloux P.M.G. The hypothalamic-pituitary-gonadal axis: immune function and autoimmunity. Journal of Endocrinology. 2003. V. 176. P. 293-304.

136. Tomassoni D., Bronzetti E., Cantalamessa F., Mignini F., Ricci A., Sabbatini M., Tayebati S.K., Zaccheo D. Postnatal development of dopamine receptor expression in rat peripheral blood lymphocytes. Mech. Ageing Dev. 2002. V. 123. N. 5. P. 491-498.

137. Tsao C.W., Lin Y.S., Cheng J.T. Effect of dopamine on immune cell proliferation in mice. Life Sci. 1997. V. 61. N. 24. P. 361-371.

138. Tsao C.W., Lin Y.S., Cheng J.T. Inhibition of immune cell proliferation with haloperidol and relationship of tyrosine hydroxylase expression to immune cell growth. Life Sci. 1998. V. 62. N. 21. P. 335-344.

139. Turnbull A.V., Rivier C.L. Regulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis by cytokines: actions and mechanisms of action. Physiol. Rev. 1999. V. 79. N. l.P. 1-71.

140. Ugrumov M.V., Trembleau A., Roche D., Calas A. Monoamine influence on neuropeptide gene expression during ontogenesis. Acta Biol. Hung. 1994. V. 45. N. 2-4. P. 441-450.

141. Vacchio M.S., Lee J.Y.M., Ashwell J.D. Thymus-derived glucocorticoids set the thresholds for thymocyte selection by inhibiting TCR-mediated thymocyte activation. J. Immunol. 1999. V. 163. P. 1327-1333.

142. Van Den Heuvel R.L., Versele S.R.M., Schoeters G.E.R., Vanderborght O.L.J. Stromal stem cells (CFU-S) in yolk sac, liver, spleen and bone marrow of pre- and postnatal mice. British J. Hematol. 1987. V. 66. P. 15-20.

143. Van der Sluis P.J., Boer G.J., Swaab D.F. Vasopressin and oxytocin in the developing rat brain as shown by isoelectric focusing of radioimmunoassayable peptides. Brain Res. 1986. V. 391. N. l.P. 85-90.

144. Van Rees E.P., Dijkstra C.D., Sminia T. Ontogeny of the rat immune system: an immunohistochemical approach. Dev Comp Immunol. 1990. V. 14. N. l.P. 9-18.

145. Veerman A.J. The postnatal development of the white pulp in the rat spleen and the onset of immunocompetence against a thymus-independent and a thymus-dependent antigen. Z. Immunitatsforsch. Exp. Klin. Immunol. 1975. V. 150. N. l.P. 45-59.

146. Vicente A., Varas A., Sacedon R., Jiménez E., Muñoz J.J., Zapata A.G. Appearance and maturation of T-cell subsets during rat thymus ontogeny. Dev.Imm. 1998. V. 5. P. 319-331.

147. Viret C., Sant'Angelo D.B., He X., Ramaswamy H., Janeway C.A. Jr. A role for accessibility to self-peptide-self-MHC complexes in intrathymic negative selection. J. Immunol. 200l.V. 166. N. 7. P. 4429-4437.

148. Viselli S.M., Olsen N.J., Shults K. Steizer G, Kovacs WJ. Immunochemical and flow cytometric analysis of androgen receptor expression in thymocytes. Mol. Cell Endocrinol. 1995. V. 109. P. 19-26.

149. Webster J.I., Tonelli L., Sternberg E.M. Neuroendocrine regulation of immunity. Annu. Rev. Immunol. 2002. V. 20. P. 125-163.

150. Weigent D.A., Blalock J.E. The production of growth hormone by subpopulations of rat mononuclear leukocytes. Cell Immunol. 1991. V. 135. N. l.P. 55-65.

151. Welberg L.A., Seckl J.R. Prenatal stress, glucocorticoids and the programming of the brain. J. Neuroendocrinol. 2001. V. 13. P. 113-128.

152. Welniak L.A., Sun R., Murphy W.J. The role of growth hormone in T-cell development and reconstitution. J. Leukoc. Biol. 2002. V. 71. N. 3. P. 381387.

153. Wick M. Inhibition of transformation by levodopa-carbidopa in lymphocytes derived from patients with melanoma. 1987. J. Invest. Derm. V. 88. P. 535-537.

154. Yin J., Albert R.H., Tretiakova A.P., Jameson B.A. 5-HT(lB) receptors play a prominent role in the proliferation of T-lymphocytes. J. Neuroimmunol. 2006. V. 181. N. 1-2. P. 68-81.

155. Yirmiya R., Shavit Y., Ben-Eliyahu S., Martin F.C., Weiner H., Liebeskind J.C. Natural killer cell activity in vasopressin-deficient rats (Brattleboro strain). Brain Res. 1989. V. 479. N. 1. P. 16-22.

156. Yu-Lee L. Prolactin modulation of immune and inflammatory responses. Recent Prog. Horm. Res. 2002. V. 57. P. 435-455.

157. Zacharchuk C.M., Mercep M., Chakraborti P.K., Simons S.S. Jr, Ashwell J.D. Programmed T lymphocyte death. Cell activation- and steroid-induced pathways are mutually antagonistic. J. Immunol. 1990. V. 145. N. 12. P. 4037-4045.

Информация о работе

Афанасьева, Марина Алексеевна
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.13

Диссертация

Развитие иммунной системы в онтогенезе крыс: нейроэндокрино-иммунные взаимодействия - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы