Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка тест-систем на основе ПЦР и латекс-агглютинации для идентификации возбудителя сибирской язвы

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка тест-систем на основе ПЦР и латекс-агглютинации для идентификации возбудителя сибирской язвы"

На правах рукописи

КОНВИСАРЕВ Андрей Петрович

РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМ НА ОСНОВЕ ПЦР И АТЕКС-АГГЛЮТИНАЦИИ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ

03. 00. 23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Щелково - 2000

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательсю институте ветеринарной вирусологии и микробиологии и на Федерал ном государственном унитарном предприятии «Покровский завод б и препаратов».

Научные руководители:

доктор ветеринарных наук, профессор

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук доктор ветеринарных наук Ведущее учреждение:

Всероссийский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (г. Москва)

Защита диссертации состоится " /¿Г " декабря 2000 г. года в часов на заседании диссертационного совета К120.17.01

по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, п/о Кашинцево, ВНИТИБП.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке института .

Автореферат разослан " " ноября 2000 г.

B.А. Гаврилов Ю.О. Селянинов

C.В. Кузнецова В.С. Русалеев

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Ю.Д. Фролов

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1.1. Актуальность темы

Среди болезней, продолжающих наносить значительный ущерб ивотноводству, апгакже представляющих угрозу жизни и здоровью гловеку, важное место принадлежит зооантропонозным инфекциям , прежде всего, сибйрской язве. Снижение числа неблагополучных унктов - результат усиления общих противоэпизоотических меро-риятий, проводимых' в очагах инфекции, и, главным образом, раз-аботки и внедрения в практику более эффективных вакцин, а еже-эдная регистрация спорадических случаев обусловлена биологиче-кими особенностями возбудителя (самостоятельный паразитиче-кий вид сохранивший свойства сапрофитов), что придает сибиркой язве характер почвенно-очаговой инфекции, носящей стацио-арный характер, которая раз возникнув в какой-либо местности кореняется, сохраняя . на многие десятилетия угрозу повторных спышек. ; ,

■ Для России указанная болезнь также остается чрезвычайно шйсной и требует постоянного внимания, так как несмотря на зна-|йт'ельные успехи в деле предупреждения и искоренения сибирской звы в России, в последние годы прослеживается тенденция к обострению эпизоотической и эпидемической ситуации, что связано с 'сложнившимися хозяйственно-экономическими условиями ведения

кивотноводства, особенно при круглогодовом отгонно-пастбищном

а • -

«держании животных (Н.Г. Ипатенко, 1998; И.А. Ургуев, 1999; И.А

Увеличение в отдельных пунктах числа животных, заболевши и павших от сибирской язвы, обусловлено запоздалой постановко диагноза и не своевременным проведением профилактических м( роприятий, что является результатом роста числа мелких ферм увеличения поголовья в личных подворьях, где животных иногда н вакцинируют против сибирской язвы.

В настоящее время для выявления и идентификации возбудк теля сибирской язвы широко используют серологические, биохимг ческие, микробиологические методы, определение чувствительнс сти к различным антибиотикам и бактериофагам, а также постаноЕ ку биопробы на лабораторных животных. Продолжительный комплексный характер исследований при идентификации предш значен для исключения диагностических ошибок, которые могу иметь место из-за таксономической схожести представителей рс да Bacillus.

Длительность, трудоемкость, недостаточная специфичность чувствительность применяемых в настоящее время методов застаЕ ляет исследователей обратить особое внимание на разработку и вш дрение в ветеринарную практику новых высокочувствительных специфичных методов диагностики возбудителя сибирской язвь основанных на анализе генома и антигенных детерминант, позвс ляющих надежно выявлять возбудитель в объектах ветеринарноп надзора.

Эффективные диагностические препараты при сибирской язв могут быть созданы и на основе разработки серологических мего дов с использованием препаратов очищенного протективного анги

ена или его иммуногенных доменов, а применение генетического 1аркирования детерминант сибиреязвенного токсина живых бакте->иальных вакцин позволит, в перспективе, разработать лаборатор-1ые тесты, позволяющие дифференцировать вакцинные штаммы от 1ирулентных и авирулентных изолятов Вас. апШгаЫв, а также дру-их непатогенных бацилл.

Таким образом, указанные обстоятельства свидетельствуют о [еобходимости изучения структурно-функциональной организации енома и разработки чувствительных и специфичных тест-систем [а основе методов клеточной биотехнологий и генной инженерии ¡ля выявления возбудителя сибирской язвы, позволяющих диффе-юнцировать его от других непатогенных представителей рода ба-1илл, особенно при изучении атипичных и смешанных культур, вы-[елеиных из проб почвы.

1.2. Цель и задачи исследования

Основной целью данной работы являлась разработка тест-истем для идентификации возбудителя сибирской язвы и определе-[ие их значимости при проведении комплексных диагностических [сследований на сибирскую язву.

Для достижения указанной цели необходимо было решить сле-[ующие задачи:

- выбрать праймеры для избирательной амплификации различных участков генома и оптимизировать условия постановки ПЦР для об-тружения фрагментов генома возбудителя сибирской язвы;

- отработать условия получения концентрированных, очищеннь антигенов возбудителя сибирской язвы и оптимизировать услов! постановки латекс-агглютинации для обнаружения специфичесю антигенов и антител при сибирской язве;

- изучить морфологические, культуральные и патогенные свойс ва культур микроорганизмов, выделенных из патматериала и прс

ПОЧВ СКОТОМОГИЛЬНИКОВ В БурЯТИИ И ОЦеНИТЬ ПРИГОДНОСТЬ ПЦР Д1

идентификации возбудителя сибирской язвы.

1.3. Научная новизна работы

Разработана чувствительная и специфичная тест-система на о нове ПЦР с использованием праймеров, комплементарных нукле< тидным последовательностям плазмид, определяющих вирулентнь свойства и определены оптимальные условия ее проведения при вь явлении ДНК возбудителя сибирской язвы.

Изучен в сравнительном аспекте полипептидный состав ра> творимых антигенов вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ и В. сегеи Установлено, что полипептидный состав антигенов, выделенных I вегетативных клеток, спор и культуральной жидкости различают« между собой в зависимости от состава питательной среды и времен культивирования.

При изучении культурально-морфологических свойств и и( следований с помощью ПЦР 12 культур бацилл, выделенных из прс почв скотомогильника в местности Иркана Северобайкальского ра1 она Республики Бурятия, установлена изменчивость вирулентны свойств у выделенных сибиреязвенных штаммов.

1.4. Практическая значимость работы

Разработана тест-система на основе ПЦР для обнаружения фрагментов ДНК генов протективного антигена и капсульного оперона, рйгодная для идентификации возбудителя сибирской язвы и диффе-енциации вирулентных капсулообразующих штаммов от бескап-улЬных вакцинных штаммов. Разработанная тест-система может ытИ использована в качестве сигнального метода при исследовании гйПичных несмешанных культур микроорганизмов, выделяемых из роб патологического материала, почвы, воды при подозрении на ^бирскую я^ву.

Отработана реакция латекс-агглютинации для выявления анти-:л к Вас.атЬгаая, пригодная для серологических исследований ри определении эффективности вакцинации животных.

На основании проведенных исследований разработаны Методические указания по выявлению ДНК возбудителя сибиркой язвы полимеразной цепной реакцией" рассмотренные на засе-

■ I '.

ании ученого совета института (протокол №.10 от 13.10.2000 г.) и гвержденные директором ВНИИВВиМ.

1.5. Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты исследований по разработке тест-системы на ос-ове поЛймеразной цепной реакции, позволяющие идентифициро-пъ'Вае.апШгаЫз в пробах патматериала, почв и дифференцировать "о от других непатогенных представителей рода бацилл;

- результаты исследований по очистке растворимых антигено! вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ и использованию их в разра ботке тест-системы на основе латекс-агглютинации, позволяющее выявлять специфические антитела против сибирской язвы в сыю-ротках вакцинированных и переболевших животных;

- изучение морфологических, культуральных и патогенны свойств бацилл, выделенных из патматериала и проб почв с котом с гильника в Бурятии и оценка пригодности ПЦР для идентификаци возбудителя сибирской язвы.

1.6. Апробация и публикация результатов

Материалы исследований доложены и обсуждены на: научно-практической конференции, посвященной 30-летию Прикаспийско го ЗНИВИ "Современное состояние и перспективы интеграции ве теринарной науки и практики в условиях реформирования прикас пийского региона", г. Махачкала, 1997 г.; международной научно практической конференции, посвященной 40-летию ВННИИВи\

; I

"Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными и эк зотическими болезнями животных", г. Покров 1998 г.; Всероссий ской научно-практической конференции, посвященной 30-летик ВНИТИБП "Научные основы производства ветеринарных бцологи ческих препаратов", г. Щелково, 2000 г.; Международной конфе ренции посвященной 75-летию со дня рождения И.А. Бакулова, г Покров, 2000 г.

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных рабог.

1.7. Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 105 страницах машино-исного текста и включает: введение, обзор литературы, собствен-ые исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, рактические предложения и список литературы (160 источник, в эм числе 73 отечественных). Работа иллюстрирована 5 таблицами, рисунками и дополнена приложением.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

Штаммы. В работе использовали следующие капсульные и ескапсульные штаммы возбудителя сибирской язвы и штаммы из ода Bacillus: Вас. anthracis - 55 ВНИИВВиМ, СТИ-1, М-71, 71/12, 4F2; Вас. cereus № 8035; Вас. subtilis № 6633; Вас. pseudoanthracis !й 104; Вас. anthracoides № 1213; Вас. mesentericus № 66; Вас. lycoides и полевые изоляты.

Питательные среды. Ростовые: МПА; МПБ; LB; МППБ под азелиновым маслом; агар Хоттингера; агар Сабуро. Дифференци-льно-диагностические: питательная среда для выделения и культи-ирования сибиреязвенного микроба сухая (СВК); МПА с 5% крови арана. Споруляционно-ростовые: дрожжепептонная среда (ДПС).

Культивирование сибиреязвенных бацилл проводили на [лотных питательных средах в пробирках, чашках Петри и в жидких [итательных средах в пробирках. Чувствительность сибиреязвенных

бацилл к антибиотикам проверяли методом диффузии в агар с пр менением дисков.

Изучение культурально-морфологических свойств, подвижное! и патогенности исследуемых культур микроорганизмов проводили соответствии с "Методическими указаниями по лабораторной диа ностике сибирской язвы у животных и людей и обнаружению во будителя сибирской язвы в сырье животного происхождения и об' ектах внешней среды" (1986 г.).

Выделение ДНК из бактериальных клеток осуществляли ф нольно-детергентным методом. Клетки, отмытые от остатков пит тельной среды, ресуспендировали в буфере (0,05 М трис HCl, р 8,0), содержащем 20% сахарозы, добавляли лизоцим до конечно концентрации 15 мг/мл и инкубировали при 37°С 1,5-2 часа. Зате добавляли растворы ЭДТА Na2 и SDS до конечной концентрации 50 мМ и 1% соответственно. ДНК из лизата клеток выделяли ф| нольной экстракцией (Маниатис Т. и др., 1984) с дополнительно обработкой хромосомной ДНК РНК-азой и протеиназой К в коне' ной концентрации 10 и 100 мкг/мл соответственно в течение 3 мин при 37°С.

Полимеразную цепную реакцию проводили в термоцикле]: "Touch Down", Hybaid (Англия), в 20-50 мкл реакционной смеа содержащей 1-кратный буфер для ПЦР, 3 мМ MgCl, 0,2 мМ смес дезоксинуклеозидтрифосфатов, 1-2 ед. Taq-полимеразы (Promeg USA), по 1 мкМ каждого из праймеров, 1-10 нг исследуемой ДН1 Амплификацию осуществляли 30-кратным повторением последов;

:льности следующих стадий: денатурация (94°С, 1-2 мин), отжиг

0 - 65°С, 1-2 мин) и полимеризация (70 - 72°С, 1-3 мин) с исполь->ванием Taq-полимеразы и dNTP фирм (Pharmacia, Швеция, omega, США).

Результаты ПЦР учитывали путем анализа продуктов амплифи-1ции методом электрофореза в 2 % гелях агарозы. Электрофорез юводили при напряжении 100 В в течение 30 - 60 мин. Результа-

1 электрофореза учитывали в проходящем ультрафиолетовом свете длиной волны 312 нм на приборе «трансиллюминатор».

При разделении полипептидов использовали метод электрофона в 10% ПААГ в присутствии ионного детергента SDS по lemmli (1970).

Электроперенос полипептидов из полиакриламиддного геля на процеллюлозную мембрану осуществляли по методу Kyhse-nderson (1984).

При постановке иммуноблотинга использовали конъюгат про-ина А , меченого пероксидазой хрена и субстрат о-дианизидин.

Выделение полипептидов в антигенно-активной форме проводи методом препаративного электрофореза.

Реакцию диффузионной преципитации в агаровом геле (РДП) авили по методу Оухтерлони в микромодификации.

Реакцию латекс-агглютинации (PJIA) ставили с 1 % латексом 1 ь

iK с блокированием нейтральным белком (БСА) избыточных групп :нсибилизированного антигеном или IgG латекса, так и без него.

Обработку информации по первичной структуре нуклеотиднь последовательностей генов токсина и капсульного оперона пров дили с использованием пакетов прикладных програм DNAS1S/PROSIS версия 5.0 (Pharmacia, Швеция). Расчет олигону леотидных праймеров, вероятных схем спаривания праймеров ос ществляли по методу определения оптимальных вторичных стру тур нуклеиновых кислот с учетом соответствующих энергетическ1 правил в программе "OLIGO". Синтез олигонуклеотидов провед» Н-фосфонатным методом кандидатом химических наук А.И. Лом киным (ВНИИЗЖ).

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Разработка ПЦР для идентификации и дифференциации возбудителя сибирской язвы

На первом этапе работы анализировали данные о первичнс структуре генов трехкомпонентного токсина и капсульного onepoi кодируемых на плазмидах рХ01 и рХ02.

Было подобрано и синтезировано 10 праймеров комплемента ных нуклеотидным последовательностям летального фактора, пр тективного антигена и капсульного оперона (САР-В).

Условия проведения полимеразной цепной реакции (темпер туру отжига праймеров, время денатурации, отжига и синтеза, ко центрацию праймеров и дезоксинуклеозидтрифосфатов, количест ДНК) подбирали в предварительных экспериментах с использован ем в качестве матрицы очищенной ДНК, выделенной из беска

¡ульного (55-ВНИИВВиМ) и капсулообразующего (М-71) штаммов юзбудителя сибирской язвы и ДНК рекомбинантных плазмид, не-;ущих гены протективного антигена и капсульного оперона. После троверки нескольких вариантов для амплификации каждого из фрагментов были выбраны оптимальные режимы проведения ПЦР, 1ри которых синтезировались специфические фрагменты ДНК с размерами, соответствующими расчетному значению и гибридизо-$авшиеся как с тотальной ДНК бацилл, так и ДНК рекомбинантных тлазмид. Дальнейшие исследования проводили с праймерами, фланкирующими продукт из 800 и.о. гена протективного антигена и >22 п.о. САР-В гена.

В связи с тем, что выявление возбудителя сибирской язвы в объектах внешней среды и особенно сырье животного происхожде-1ия сопряжено с большими трудностями, поэтому с целью повышения чувствительности реакции, для реамплификации фрагмента в области САР-В гена была использована пара "внутренних" прайме-юв, фланкирующих фрагмент из 340 п.о.

Оценку чувствительности разработанной тест-системы для вы-5вления возбудителя сибирской язвы с помощью ПЦР проводили 1вумя способами. В первом из них готовили серии десятикратных зазведений вакцинного бескапсульного штамма 55-ВНИИВВиМ. Лосле выделения ДНК каждую пробу исследовали в ПЦР. Специфические фрагменты гена протективного антигена обнаруживали в 1робах, содержащих 100 - 1000 микробных тел. Во втором исполь-ювали патматериал (селезенка) от морских свинок, зараженных

капсулообразующим штаммом М-71, из которого готовили 10% суспензию. Из суспензии готовили пятикратные разведения и параллельно с титрованием на чашках с МПА ставили ПЦР. В результате экспериментов установлено, что разработанный метод позволял обнаруживать в пробах патматериала ДНК штамма М-71, в концентрации 100-1000 клеток, а при использовании "внутренних" праймеров метод ПЦР позволял достоверно определять до 10-100 бактериальных клеток в пробе. ^

При определении специфичности тест-системы для испытаний было подготовлено 13 образцов различных материалов (8 музейных культур, в их числе 5 культур Вас. anthracis; 5 культур спорообра-зующих сапрофитов рода Bacillus и патматериал от зараженных v здоровых морских свинок). В качестве патматериала использовали пробы сердца, селезенки и печени 4-х морских свинок, зараженных культурой штамма М-71 Вас. anthracis и павших на 3 - 4 сутки после

заражения. Результаты испытаний тест-системы для диагности-

/

ки сибирской язвы методом полимеразной цепной реакции представлены в таблице 1.

Испытания показали, что из 8 музейных культур тест-системг на основе праймеров к гену протективного антигена давала положительный результат с 2 культурами, а с использованием праймеров к капсульному оперону с 1 культурой. Из 5 образцов патмате риалов павших от сибирской язвы и здоровых животных об« тест-системы давали положительный результат с 3 образцами.

Таким образом, в результате проведенных испытаний былс установлено, что тест-система ПЦР, на основе праймеров компле

Таблица 1.

Результаты проверки специфичности тест-снстем для выявления возбудителя сибирской язвы на основе ПЦР

п=6

№ Результаты исследований Наименование материала

праймеры к гену протективного антигена праймеры к капсульному оперону

1 + - Вас. агиЬгааэ 55, бескапсульный

2 + + Вас. апШгаси М-71 капсульный

3 - - Вас. сегеив N 8035

4 - - Вас. ап111гасо1^ез N 1213

5 - - Вас. БиЫШэНббЗЗ

6 - - Вас. РБеисЬатЬгаЫз N 104

7 - - Вас. теБег^епсиз N 66

8 - - Вас. тусо1с1е8

9 - - Кровь здоровой морской свинки

10 - - Селезенка здоровой морской свинки

11 + + Печень зараженных морских свинок

12 + + Сердце зараженных морских свинок

13 + + Селезенка зараженных морских свинок

ментарных генам протективного антигена и капсульного оперона позволяет выявлять бескапсульные (55-ВНИИВВиМ)

и капсулообразующие (М-71) штаммы B.anthracis как в куль-туральном, так и в патологическом материале зараженных животных. Полученные отрицательные результаты с пробам* культур других близкородственных микроорганизмов свидетельствуют о возможности дифференциации B.anthracis от спорообразующих сапрофитов рода Bacillus.

2.2.2. Получение растворимых антигенов Вас. anthracis и изучение их специфической активности

С целью получения специфических антигенов, пригодных дл* разработки диагностических тест-систем, был изучен состав полипептидов вегетативной и споровой форм штамма 55-ВНИИВВиМ возбудителя сибирской язвы, выращенных в различных питательных средах (LB и ДПС), а также культуральной среды. Для сравнения параллельно получали препараты полипептидов близкородственной бациллы - Вас. cereus № 8035. Пробы микроорганизмов отбирали в различные сроки культивирования штаммов (18 и 42 часа).

При сравнении спектров исследуемых белков установлено, чтс профили клеточных белков Вас. cereus и Вас. anthracis, выращенных на питательной среде LB имеют до 90% белков сходной молекулярной массы, а общее количество мажорных полос превышает 40.

При исследовании полипептидного состава споровых и клеточных белков Вас. anthracis, культивируемых на среде ДПС выявлено от 10 и 14 мажорных полос соответственно, причем мажорная полоса с молекулярной массой 90 - 110 кДа была выражена в наи-

олее значительной степени. Полипептидный состав антигена, вы-гленного из культуральной жидкости, имел 7 и 8 мажорных по-эс соответственно.

Все препараты растворимых антигенов, выделенных из вегета-шных клеток и спор лнтракоидов, включая и Вас. сегеив, формиро-1ли одну полосу преципитации со стандартной антисибиреязвен-)й сывороткой. Антигены Вас. апШгаыв, выделенные из культу-шьной жидкости формировали от двух (18 час культивирования) ) трех (42 часа культивирования) полос преципитации, а соответ-вующие антигены Вас. сегеиБ преципитатов не образовывали.

Для определения полипептидной специфичности белки, разде-нные электрофорезом в ПААГ, переносили на нитроцеллюлозные ;мбраны и исследовали с помощью иммунноблота со стандартной тисибиреязвенной сывороткой. Установлено, что антисибиреяз-нные антитела реагировали только с двумя белками - 70 и 90 (, причем полипептид с молекулярной массой 70 кД выявлялся лько в пробах выделенных из вегетативных клеток и культураль-й жидкости.

Иммуногенную активность препаратов культурального, кле-чного и спорового антигенов проверяли путем иммунизации мор-IX свинок и последующего заражения через 26 суток сибиреяз-шой референс-культурой (штамм М-71).

В результате исследований было установлено, что все испытан-е препараты растворимых специфических антигенов В.аЩЬга^з цищают от 75 до 100 % привитых животных от контрольного за-

ражения при 100 % выживаемости привитых споровой культуре животных и 100 % -ной гибели непривитых морских свинок.

2.2.3. Разработка реакции латекс-агглютинации для выявлени специфических антител к возбудителю сибирской язвы

2.2.3.1. Получение очищенных антигенов и иммуноглобулинов

Для постановки реакции латекс-агглютинации (РЛА) необход мы очищенные специфические антигены и соответствующие имм ноглобулины

Исходный сибиреязвенный антиген из культуральной жидкое штамма 55-ВНИИВВиМ концентрировали сульфатом аммония далее очищали хроматографией в колонке 60 х 1.8 см с Сефароз< 6-В. В результате чего получали антиген, очищенный по сравнени с исходным по белку на 96 %, а по удельной активности в 12 раз.

Для получения специфических сывороток кроликов 4-крат иммунизировали спорами и очищенным антигеном штамма 5 ВНИИВВиМ сибирской язвы. Из специфических сывороток, по; ченных на споры (титр в РДП 1:256) и на очищенный антиген (ти в РДП 1:160) выделяли афинной хроматографией ^С.

2.2.3.2. Отработка реакции латекс-агглютинации для выявления антител к возбудителю сибирской язвы

Для постановки РЛА использовали полистироловые латекс сенсибилизированными исходным и очищенным сибиреязвенны

[тигенами, у которых после сенсибилизации оставшиеся функцио-льные группы блокировали обработкой 0.1 % БСА. Оптимальная >нцентрация сибиреязвенного антигена составляла 300 мкг/ мл. лет реакции осуществляли через 1 час по образованию видимой глютинации при отсутствии ее в контроле.

Для проверки необходимости блокировки свободных функ-юнальных групп сенсибилизированных латексов РЛА ставили алогичным способом с блокированными БСА и неблокированны-I сенсибилизированными антигенами латексами. В результате бы-| установлено, что при постановке РЛА для выявления антител к збудителю сибирской язвы нет необходимости в дополнительной окировке свободных функциональных групп латексов.

Для сравнительной оценки методов РНГА и РЛА были иссле->ваны сыворотки крови морских свинок, иммунизированных Разиными сибиреязвенными антигенами. Уровень титров в РЛА юностью коррелировал с результатами РНГА и составляли от 1:5 | 1:160, причем титр антител зависел от препарата используемого я иммунизации и способа иммунизации.

Таким образом, результаты проведенных исследований покажи, что РЛА является специфичным методом и может быть ис-шьзован для быстрого обнаружения специфических антител в сы-ротках иммунизированных или переболевших сибирской язвой

1В0ТНЫХ.

Результаты разработки латекс-агглютинации для дифферен-[ации возбудителя сибирской язвы от спороообразующих бацилл

показали, что использованный в работе кроличий полученны на полный споровый антиген и очищенный антиген не обладал достаточной степенью специфичности, необходимой для дифф< ренциации испытанных бацилл сибирской язвы и спорообразук щих сапрофитов.

2.2.4. Изучение возбудители сибирской язвы, выделенного из органов павших животных и проб почв

В связи с проведением больших по объему земляных работ зоне озера Байкал в Республике Бурятия при строительстве БАМа нарастанием вредных воздействий хозяйственной деятельносп ухудшающих экологическую обстановку, в этом регионе создалис условия проявления активности ранее выявленных почвенных оч; гов сибирской язвы. В местности Иркана в 3 км от села Кумора О веробайкальского района у фермера, занимающегося индивидуал ным разведением крупного рогатого скота, был зарегистрировс случай заболевания крупного рогатого скота сибирской язвой. Пр выяснении причин возникновения инфекции установлено, что г данным архива Иркутского противочумного института в 1907-19С годах были зарегистрированы случаи сибирской язвы среди скота местности Иркана и Кумора. Три года подряд перед вспышкой этой местности происходили наводнения, что могло явиться пр чиной смыва почвы со скотомогильников с захоронениями живо ных больных сибирской язвой. Поэтому нами были исследован культурально-морфологические свойства полевого изолята и таю:

различных бацилл, выделенных из проб почв скотомогильника.

2.2.4.1. Биологические свойства полевого изолята № 14 возбудителя сибирской язвы

Нами были изучены культурально-морфологические и патоген-ые свойства полевого изолята возбудителя сибирской язвы (эпизо-тический № 14), выделенного из патологического материала рупного рогатого скота в Северобайкальской районной ветеринар-ой лаборатории.

Идентификация возбудителя сибирской язвы проводили по педующим признакам: морфология микроба, включая наличие кап-ул в мазках из исходного патологического материала и органов

I

авших подопытных животных; культуральные свойства; патоген-ость для лабораторных животных, с последующим выделением ее з органов мыши; определяли чувствительность культуры к сибире-звенным бактериофагам и пенициллину.

Кроме того, выделенный изолят № 14 исследовали методом ДР. С этой целью было использовано 4 праймера, комплементар-ых нуклеотидным последовательностям капсульного оперона, по-юляющих дифференцировать бескапсульные и капсулообразую-;яе штаммы возбудителя сибирской язвы.

Для сравнения ПЦР параллельно проводили с культурами кап-/лообразующего штамма М-71, бескапсульных штаммов 55-НИИВВиМ и СТИ-1 и штамма N2 8035 В. сегеиэ. Электрофорети-гский анализ продуктов ПЦР показал, что специфические продук-

ты амплифицировались в пробах культур изолята № 14 и штамма М 71. Полученные фрагменты имели размеры, соответствующие рас четному значению и гибридизовались с рекомбинантной плазмидой несущей ген капсулообразования.

Используемые пары праймеров не гибридизовались с ДШ бескапсульных вакцинных штаммов (55-ВНИИВВиМ, СТИ-1) ] непатогенной бациллы (В. сегеив).

Таким образом, изучение культурально-морфологических 1 биологических свойств изолята № 14 показали, что он имеет типич ные характеристики капсулообразующего вирулентного изолят возбудителя сибирской язвы, а метод ПЦР позволил четко отличат ДНК капсулообразующего вирулентного полевого изолята № 14 штамма М-71 от ДНК вакцинных бескапсульных штаммов Е агЛЬгаЫБ и сапрофитов.

2.2.4.2. Изучение диагностической ценности ПЦР для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы в пробах почвы скотомогильников

Нами были изучены культурально-морфологические, ферме] тативные и патогенные свойства 12 культур микроорганизмов, В1 деленных из проб почв скотомогильников в местности Иркана С веробайкальского района.

Известно, что микроорганизмы, обитающие в почве, постояш подвергаются воздействию различных физико-химических фактора среды, что может приводить к изменению ряда их свойств. Идент

фикацию микробных изолятов рода Bacillus, выделенных из почв скотомогильников с захоронениями сибиреязвенных трупов животных проводили на основании анализа полученных результатов исследований и их сравнения с данными "Определителя бактерий Берги".

Морфологические свойства. При микроскопическом исследовании изучаемые микроорганизмы представляли собой грамопложи-гельные палочки, которые в мазках располагались одиночно или в виде коротких цепочек. Длинные цепочки были выявлены в микробных культурах № 8 и № 10. Капсулобразование во всех культурах отсутствовало, споры располагались центрально. Неподвижными были бактериальные клетки микробных культур № 3 и № 10.

Кулътуральные свойства. На МПА рост в виде колоний мелких и средних размеров, округлой формы с неровными локончатыми <раями, поверхность шероховатая, молодые колонии в виде пушистых снежинок давали культуры № 2, № 3, № 10, № 12. Края коло-тй остальных культур были ровными, за исключением культуры Vb 1, поверхность матовая, кроме культур № 1 и 9, имеющих бле-;тящую поверхность колоний. В МПБ - надосадочная жидкость лутнела при росте культур № 4, 5 и 9. Осадок в виде пуговки наблюдался в культурах № 6, 7, 9, в виде хлопьев - № 1, 2, 3, 10, в виде сомка № 8, 11, 12 (при встряхивании разбивается). Пристеночное сольцо формировалось в культуре № 4, а пленка - № 2 и 5. На картельном агаре рост в виде сухого серого налета наблюдали у ;ультур № I, 2, 3, 9, в виде коричневых влажных колоний с углуб-

лением - № 4 и 5. На среде для выделения сибиреязвенного микроба рост дали только культуры № 1, 3, 10, 12. На кровяном агаре гемолиз отсутствовал у культур № 2, 3, 10, 12, частичный гемолиз далр культуры № 4, 5, 6, 8, 11, а полный гемолиз - № 1 и 9.

Серологические исследования. В РДП со стандартной преципи тирующей сибиреязвенной сывороткой положительно реагировал! антигены культур № 2, 3, 10, 12. Аналогичные результаты получень в реакциях кольцепреципитации и иммунофлюоресценции, причем 1 РДП и РП наблюдалась задержка (по сравнению с другими пробам! и контролем) формирования преципитата с антигеном культурь № 2, а в РИФ слабое свечение по периферии клеток культуры № 2 1 № 1.

Биологические свойства. В связи с тем, что на основании мор фологических, культуральных и серологических исследовани только культуры № 2, 3, 10 и 12 могли быть отнесены к сибирея: венным, эти культуры были использованы для заражения белы мышей, которым внутрибрюшинно вводили суточную культуру дозе 0,5 мл. В течение первых 5-ти дней после заражения видимы изменения в поведении мышей отсутствовали, их состояние был удовлетворительным. К концу 6-х суток, животное заражение культурой №10 погибло. При вскрытии в подкожной клетчатке пр вой паховой области был обнаружен студенистый геморрагичесм инфильтрат. Внутренние органы видимых патологических измен ний не имели. Из паренхиматозных органов были сделаны маз1 отпечатки, а также произведен посев на МПА и МПБ. Культурал

з-морфологические свойства выделенной культуры полностью со-гветствовали исходной.

Оставшиеся, мыши были усыплены, вскрыты и из паренхима-1зных органов сделаны мазки-отпечатки и посевы на МПА и МПБ. цнако рост микробных клеток наблюдался только в посевах из [утренних органов мыши, зараженной культурой № 3. Проведение ех перемежающихся пассажей этой культуры позволило восста-1вить ее вирулентность и мышь, зараженная культурой 3-го пас-жа, погибла уже через 10 часов. Культурально-морфологические ойства выделенной из внутренних органов погибшей мыши куль-ры микроорганизмов полностью соответствовали исходной. Кап-льные клетки отсутствовали.

Из 12 культур микроорганизмов, выращенных на МПБ (вегета-шые клетки) была выделена ДНК и доставлена во ВНИИВВиМ. следование проб на наличие фрагментов ДНК плазмид рХ01 и 02 проводили с использованием праймеров комплементарных к 1сткам гена протрктивного антигена и капсульного оперона. В [естве контрольных матриц использовали препараты ДНК штам-зМ-71 и 55-ВНИИВВиМ.

Праймеры, фланкирующие фрагмент ДНК размером 800 п.о. тлементарный.гену протективного антигена, гибридизовались ько с ДНК, выделенными из культур № 2, 3, 10, 12 и контроль-вакцинных штаммов (55-ВНИИВВиМ, М-71) в результате чего 1лифицир0вался специфический ПЦР продукт, свидетельствуя о ичии у данных изолятов плазмиды рХ01.

Результаты выявления фрагментов ДНК капсульного оперон; возбудителя сибирской язвы методом полимеразной цепной реакцш показали, что из 12 исследованных микроорганизмов только на ДШ культуры №10 синтезировался специфический ПЦР продукт разме ром 340 п.о., аналогичный ПЦР продукту капсулообразующеп штамма М-71, имеющему плазмиды pXOl и рХ02.

Таким образом, комплексные исследования 12 проб почв применением культурально-морфологических, серологических биологических методов позволили установить широкий диапазо изменчивости выделенных изолятов вплоть до полной утраты им вирулентных свойств, но с сохранением отдельных признаков, хг рактерных для возбудителя сибирской язвы и идентифицироват культуры № 2, 3, 10 и 12 как сибиреязвенные, относящиеся к ат» пичным. Культуры № 2 и 12 как бескапсульные авирулентные, а J 3 и 10 как бескапсульные с остаточной вирулентностью. Подвш ность бацилл в культурах № 2 и 12 объясняется тем, что культу! была смешанной. Остальные микробные изоляты, относящиеся роду Bacillus были идентифицированы как Вас. anthracoides, Ва mesentericus и Вас. megaterium, некоторые из которых были таю атипичны. Исследование этих же культур ПЦР показало, что мет( является чувствительным, специфичным и экспрессным и мож быть использован в качестве сигнального, особенно при изучен смешанных и атипичных культур. Выявление с помощью полил разной цепной реакции наличия участков САР-В гена у микроор] низмов культуры № 10 (при отсутствии капсулы на питательн

редах и мазках-отпечатках из органов павших мышей) может яв-яться свидетельством присутствия в бацилле плазмиды рХ02, не-олноценного гена капсулообразования. Подобного рода дополни-гльная характеристика может представлять определенную цен-ость при изучении полевых изолятов, проведении эпизоотологиче-кого мониторинга и исследовании эволюции возбудителя сибиркой язвы.

3. ВЫВОДЫ

3.1. Отработаны оптимальные условия постановки полиме-азной цепной реакции с праймерами, комплементарными последо-ггельностям плазмиды рХ01 и рХ02 возбудителя сибирской яз->1, позволяющие при температуре отжига 50° С для праймеров ротективного антигена и 55°С для праймеров капсулообразова-ия выявлять ДНК вакцинных и капсулоообразующих штаммов воз-/дителя сибирской язвы.

3.2. Разработанная модификация ПЦР с использованием [ездовых праймеров позволяет обнаружить ДНК капсулообразую-их штаммов возбудителя сибирской язвы в патологическом мате-1але и бульонных культурах, что соответствует 10-100 КОЕ 50/мл.

3.3. Сравнительный анализ растворимых антигенов вакцин-эго штамма 55-ВНИИВВиМ и В.сегеия показал, что полипептид->ш состав антигенов, выделенных из вегетативных клеток и спор, а 1кже из культуральной жидкости различаются между собой в за-(симости от состава питательной среды и времени культивирова-

1Я.

3.4. Результаты исследований показали, что реакция латск агглютинации может быть использована для обнаружения спец фических антител в сыворотках иммунизированных или переболе ших животных. Уровень титров в РЛА полностью коррелировал результатами РНГА и составлял от 1:5 до 1:160, причем титр ант тел зависел от препарата используемого для иммунизации и спосо иммунизации.

3.5. При изучении культурально-морфологических свойс и исследований с помощью ПЦР 12 бацилл, выделенных из пр почв скотомогильника установлено, что четыре идентифицирова! как атипичные сибиреязвенные культуры (№2, № 3 , №10, №12) две из которых ( № 3, № 10) как бескапсульные с остаточной ви( лентностью. Полученные данные свидетельствуют о широком Д1 пазоне изменчивости, выделенных из проб почвы бацилл вплоть полной утраты ими вирулентных свойств, но с сохранением отде.1 ных признаков, характерных для возбудителя сибирской язвы.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработанные «Методические указания по выявлению Д1 возбудителя сибирской язвы с помощью полимеразной цепной ] акции», утвержденные директором ВНИИВВиМ от 14.10.2000г. » гут быть использованы в качестве сигнального теста для выявлсь возбудителя сибирской язвы в патологическом материале, про? почвы при проведении лабораторных исследований.

Разработанные условия получения растворимого антигена из сультуральной жидкости вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ, мо-■ут быть использованы для постановки латекс-агглютинации для (ыявления специфических антител.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Цыбанова Л.Я., И.Ф. Вишняков, Конвисарев А.П., Цыды-юв В.Ц. Генотипирование хромосомной ДНК вакцинных штаммов ибирской язвы с помощью ПЦР // Современное состояние и пер-пективы интеграции ветеринарной науки и практики в условиях сформирования сельскохозяйственного производства прикаспий-кого региона. Тезисы докладов международной конференции - Ма-ачкала, 1997, с.32-34

2. Цыбанова Л.Я., Селянинов Ю.О., Конвисарев А.П., Цыды-эв В.Ц. Разработка набора препаратов для выявления ДНК возбу-1теля сибирской язвы методом ПЦР. //Диагностика, профилактика меры борьбы с особоопасными и экзотическими болезнями жи-)тных. Мат. Междун. научно-практ. конф./ ВНИИВВиМ, Покров, >98, с. 315-316.

3. Цыбанова Л.Я., Селянинов Ю.О., Колбасов A.B., Конвиса-■в А.П., Цыдыпов В.Ц. Дифференциация вакцинных штаммов си-фской язвы с помощью ПЦР. //Диагностика, профилактика и меры |рьбы с особоопасными и экзотическими болезнями животных, ат. Междун. научно-практ. конф./ ВНИИВВиМ, Покров, 1998, с. 3-314.

4. Муруева Г.Б., Конвисарев А.П., Цыдыпов В.Ц., Колбасо! Д.В., Цыбанова Л.Я., Селянинов Ю.О. Характеристика сибиреязвен ного микроба, выделенного из органов павших животных // Диагно стика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзотиче скими и зооантропонозными болезнями животных. Сборник стате! международной научно-практической конференции. - Покров, 200С с.246-248.

5. Муруева Г.Б., Конвисарев А.П., Цыдыпов В.Ц., Колбасо Д.В., Цыбанова Л.Я., Селянинов Ю.О. Биологическая характернее ка микробов, выделенных из проб почв // Диагностика, ирофилаь тика и меры борьбы с особо опасными, экзотическими и зооантрс понозными болезнями животных. Сборник статей международно научно-практической конференции. - Покров, 2000, с.248-251.

6. Колбасов A.B., Цыбанова Л .Я., Конвисарев А.П., Селяш нов Ю.О., Цыдыпов В.Ц. Выявление ДНК сибиреязвенных штамме методом ПЦР. //Научные основы производства ветеринарных би> логических препаратов. Тез. докладов Всеросс. научно-практ. кон» ВНИТИБП, Шелково, 2000. с. 244 - 246.

7. Селянинов Ю.О., Конвисарев А.П., Гаврилов В.А., Муру ва Г.Б. Идентификация возбудителя сибирской язвы с помощь ПЦР в пробах почв // В печати.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Конвисарев, Андрей Петрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Эпизоотическая ситуация по сибирской язве.

2.2. Общая характеристика возбудителя сибирской язвы.

2.3. Патогенез и клинические проявления болезни.

2.4. Характеристика природных плазмид бацилл.

2.5. Диагностика сибирской язвы.

2.6. Применение реакции латекс-агглютинации в диагностике инфекционных болезней.

2.7. Идентификация возбудителя сибирской язвы на основе анализа генома.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Материалы.

3.1.1. Штаммы.

3.1.2. Ферменты.

3.1.3. Реактивы.

3.1.4. Растворы и питательные среды. 46

3.1.5. Животные.

3.1.6. Лабораторное оборудование.

3.2. Методы.

3.2.1. Выращивание бактерий.

3.2.2. Определение культурально-морфо логических свойств возбудителя сибирской язвы.

3.2.3. Выделение хромосомной ДНК.

3.2.4. Электрофорез ДНК и полипепшдов.

3.2.5. Иммуноблоттинг.

3.2.6. Постановка полимеразной цепной реакции.

3.2.7. Постановка реакции латекс агглютинации.

3.2.8. Серологические исследования.

3.2.9. Компьютерный анализ, сравнение первичных структур нуклеиновых кислот и расчет олигонуклеотидов.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

4.1. Идентификация сибиреязвенных штаммов методом полимеразной цепной реакции.

4.1.1. Разработка ПЦР для индикации возбудителя сибирской язвы. 51 4.1.1.1. Выявление капсулообразующих штаммов возбудителя сибирской язвы методом ПЦР.

4.1.1.2. Выявление возбудителя сибирской язвы методом ПЦР на основе праймеров, комплементарных гену токсина.

4.2. Получение растворимых антигенов Вас. апйигашв.и изучение их специфической активности.

4.3. Разработка реакции латекс-агглютинации для выявления специфических антител и антигенов к возбудителя сибирской язвы.

4.3.1. Получение очищенных антигенов и

4.3.2. Отработка реакции латекс-агглютинации для выявления специфических антител к возбудителя сибирской язвы

4.3.3. Отработка реакции латекс-агглютинации для дифференциации бацилл.

4.4. Изучение возбудителя сибирской язвы, выделенного из органов павших животных и проб почв.

4.4.1. Биологические свойства полевого изолята сибирской язвы.

4.4.2.Изучение диагностической ценности ПЦР для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы в пробах почвы скотомогильника.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

6. ВЫВОДЫ.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка тест-систем на основе ПЦР и латекс-агглютинации для идентификации возбудителя сибирской язвы"

Актуальность работы. Сибирская язва - опасная инфекционная болезнь большинства видов животных и человека, характеризующаяся признаками септицемии, тяжелой интоксикации и образованием специфических карбункулов. Сибирская язва относится к почвенно-очаговым заболеваниям и носит стационарный характер. В настоящее время она реже проявляется эпидемиями и эпизоотиями с массовым поражением людей и животных, но часто напоминает о себе спорадическими случаями и вспышками, сопровождающимися гибелью животных и людей, т.е. не утратила своего эпидемиологического значения.

По данным Всемирной организации здравоохранения в мире ежегодно заболевает сибирской язвой около миллиона голов скота и до 2000 человек (Н.Г.ИпатенкоД982; Б.Л.Черкасский, 1983; В.А.Гаврилов, И.А. Бакулов, 2000).

Для России указанная болезнь также остается чрезвычайно опасной и требует постоянного внимания, так как несмотря на значительные успехи в деле предупреждения и искоренения сибирской язвы в России в последние годы прослеживается тенденция к обострению эпизоотической и эпидемической ситуации, что связано с усложнившимися хозяйственно-экономическими условиями ведения животноводства, особенно при круглогодовом отгонно-пастбищном содержании животных (Ургуев И.А., 1999; Бакулов И.А, Гаврилов В.А., 2000).

Увеличение в отдельных пунктах числа животных, заболевших и павших от сибирской язвы, обусловлено запоздалой постановкой диагноза и не своевременным проведением профилактических мероприятий, что является результатом роста числа мелких ферм и увеличения поголовья в личных подворьях, где животных иногда не вакцинируют против сибирской язвы. Вспышки сибирской язвы в основном регистрируют с июня по сентябрь, а пик заболеваемости во всех регионах приходится на июль-август.

В настоящее время для выявления и идентификации возбудителя сибирской язвы широко используют серологические, биохимические, микробиологические методы, определение чувствительности к различным антибиотикам и бактериофагам, а также постановку биопробы на лабораторных животных. Продолжительный и комплексный характер исследований при идентификации предназначен для исключения диагностических ошибок, которые могут иметь место из-за таксономической схожести представителей рода Bacillus, когда отдельные идентификационные критерии различных видов бацилл могут совпадать. Достоверным отличительным признаком вирулентных штаммов B.anthracis является положительный результат биологической пробы: выявление капсулообразущих бацилл in vitro и гибель лабораторных животных. Однако постановка биопробы - это наиболее продолжительный по времени и не всегда доступный идентификационный тест, а, кроме того, этот метод не позволяет идентифицировать бескапсульные штаммы возбудителя.

Длительность, трудоемкость, недостаточная специфичность и чувствительность применяемых в настоящее время методов заставляет исследователей обратить особое внимание на разработку и внедрение в ветеринарную практику новых высокочувствительных и специфичных методов диагностики возбудителя сибирской язвы, основанных на анализе генома и антигенных детерминант, позволяющих надежно выявлять возбудитель в объектах ветеринарного надзора.

Нуклеотидные последовательности генов, связанных с патогенностью бактерий, используются при разработке ПЦР-диагностикумов. Исследования в области молекулярной биологии сибиреязвенного микроба показали присутствие в клетках вирулентных штаммов плазмид с молекулярной массой 60 и 110 МДа, на которых локализованы гены двух факторов патогенности - капсулообразования и трехкомпонентного токсина, соответственно. Так как применяемые в России вакцинные штаммы лишены плазмиды с молекулярной массой 60 МДа, то это может служить основой для разработки тест-систем для идентификации вирулентных и вакцинных бескапсульных штаммов сибиреязвенного микроба с использованием нуклеотидных последовательностей, гомологичных сар-оперону и гену токсина.

Эффективные диагностические препараты при сибирской язве могут быть созданы путем разработки серологических методов, основанных на использовании протективного антигена или его иммуногенных доменов, а применение генетического маркирования детерминант сибиреязвенного токсина живых бактериальных вакцин позволит, в перспективе, разработать лабораторные тесты позволяющие дифференцировать вакцинные штаммы от вирулентных и авирулентных изолятов Вас. апШгашз, а также других непатогенных бацилл.

Таким образом, указанные обстоятельства свидетельствуют о необходимости изучения структурно-функциональной организации генома и разработки чувствительных и специфичных тест-систем на основе методов клеточной биотехнологии и генной инженерии для выявления возбудителя сибирской язвы, позволяющих дифференцировать его от других непатогенных представителей рода бацилл, особенно при изучении атипичных и смешанных культур, выделенных из проб почвы.

Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы являлась разработка тест-систем для идентификации возбудителя сибирской язвы и определение их значимости при проведении диагностических исследований на сибирскую язву.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- выбрать праймеры для избирательной амплификации различных участков генома и оптимизировать условия постановки ПЦР для обнаружения фрагментов генома возбудителя сибирской язвы;

- отработать условия получения концентрированных, очищенных антигенов возбудителя сибирской язвы и оптимизировать условия постановки латексагглютинации для обнаружения специфических антигенов и антител при сибирской язве;

- изучить морфологические, культуральные и патогенные свойства микробов, выделенных из патматериала и проб почв скотомогильников в Бурятии и оценить пригодность ПЦР для идентификации возбудителя сибирской язвы.

Научная новизна работы. Разработана чувствительная и специфичная тест-система на основе ПЦР с использованием праймеров, комплементарных нуклеотидным последовательностям плазмид, определяющих вирулентные свойства и определены оптимальные условия ее проведения при выявлении ДНК возбудителя сибирской язвы.

Изучен в сравнительном аспекте полипептидный состав растворимых антигенов вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ и В. сегеш. Установлено, что полипептидный состав антигенов, выделенных из вегетативных клеток и спор, а также из культуральной жидкости различаются между собой в зависимости от состава питательной среды и времени культивирования.

При изучении культурально-морфологических свойств и проведении исследований с помощью ПЦР 12 бацилл, выделенных из проб почв скотомогильника в местности Иркана Северобайкальского района Республики Бурятия, установлена изменчивость вирулентных свойств у выделенных сибиреязвенных штаммов.

Практическая значимость работы. Разработана тест-система на основе ПЦР для обнаружения фрагментов ДНК генов протективного антигена и капсульного оперона, пригодная для идентификации возбудителя сибирской язвы и дифференциации вирулентных капсулообразующих штаммов от бескапсульных вакцинных штаммов. Разработанная тест-система может быть использована в качестве сигнального метода при исследовании смешанных культур микроорганизмов, выделяемых из проб патологического материала, почвы, воды при подозрении на сибирскую язву.

Отработана реакция латекс-агглютинации для выявления антител к Вас.апЙиж^, пригодная для серологических исследований при определении эффективности вакцинации животных.

На основании проведенных исследований разработаны "Методические указания по выявлению ДНК возбудителя сибирской язвы полимеразной цепной реакцией" рассмотренные на заседании ученого совета института (протокол №.10 от 13.10.2000г.) и утвержденные директором ВНИИВВиМ.

Основные положения, выносимые на защиту.

- результаты исследований по разработке тест-системы на основе полимеразной цепной реакции, позволяющие идентифицировать Вас.апЙнж^ в пробах патматериала, почв и дифференцировать его от других непатогенных представителей рода бацилл;

- результаты исследований по очистке растворимых антигенов вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ и использованию их в разработке тест-системы на основе латекс-агглютинации, позволяющей выявлять специфические антитела против сибирской язвы в сыворотках вакцинированных и переболевших животных.

- изучение морфологических, культуральных и патогенных свойства бацилл, выделенных из патматериала и проб почв скотомогильников в Бурятии и оценка пригодности ПЦР для идентификации возбудителя сибирской язвы.

Апробация и публикация результатов. Материалы исследований доложены и обсуждены на: международной научно-практической конференции, посвященной 30-летию Прикаспийского ЗНИВИ «Современное состояние и перспективы интеграции ветеринарной науки и практики в условиях реформирования сельскохозяйственного производства прикаспийского региона», г. Махачкала, 1997 г.; международной научно-практической конференции, посвященной 40-летию ВНИИВиМ «Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными и экзотическими болезнями животных», г.Покров, 1998г; Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 30-летию ВНИиТИБП "Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов", г. Щелково, 2000 г., Международной научно-практической конференции «Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзотическими и зооантропонозными болезнями животных», г. Покров, 2000г.

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Исследования по диссертационной работе выполнены в 1995-2000 г.г.: в лабораториях "Биофизики" и "Экспериментальной микробиологии" ВНИИВВиМ, на базе центральной заводской лаборатории Федерального Государственного Унитарного Предприятия "Покровский завод биопрепаратов" (ФГУП, "ПЗБ") и на кафедре вирусологии, микробиологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Бурятской Государственной сельскохозяйственной академии, г. Улан-Удэ.

Объем и структура работы. Материалы диссертации изложены на 105 страницах машинописного текста и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, список литературы, содержащий 161 источник (из них 73 отечественных). Диссертация иллюстрирована 5 таблицами и 7 рисунками.

Исследования по диссертационной работе выполнены в 1995-2000 г.г. в лабораториях Биофизики и Экспериментальной микробиологии ВНИИВВиМ в соответствии с утвержденными плановыми заданиями НИР Российской академии сельскохозяйственных наук по теме 01.06. «Разработать и усовершенствовать средства и методы дифференциальной диагностики вирусных болезней крупного рогатого скота, свиней, овец и бактериальных болезней животных».

В выполнении отдельных разделов работы принимали участие заведующий лабораторией «Экспериментальной микробиологии»

11

ВНИИВВиМ кандидат биологических наук Селянинов Ю.О., старший научный сотрудник лаборатории «Биофизики», кандидат биологических наук Цыбанова Л.Я., аспирант лаборатории «Биофизики» Колбасов Д.В., зав. кафедрой микробиологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Бурятской государственной сельскохозяйственной академии имени В.Р.Филиппова доктор ветеринарных наук, профессор Цыдыпов В.Ц., доцент кафедры микробиологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Бурятской государственной сельскохозяйственной академии имени В.Р. Филиппова кандидат ветеринарных наук Муруева Г.Б., которым автор выражает искреннюю признательность.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Конвисарев, Андрей Петрович

6. ВЫВОДЫ

6.1. Отработаны оптимальные условия постановки полимеразной цепной реакции с праймерами , комплементарными последовательностям плазм иды рХО 1 и рХ02 возбудителя сибирской язвы, позволяющие при температуре отжига 50° С для праймеров протективного антигена и 55° С для праймеров капсулообразования выявлять ДНК вакцинных и капсулоообразующих штаммов возбудителя сибирской язвы.

6.2. Разработанная модификация ГТЦР с использованием гнездовых праймеров позволяет обнаружить ДНК капсулообразующих штаммов возбудителя сибирской язвы в патологическом материале и бульонных культурах, что соответствует 10-100 КОЕ 50/мл.

6.3. Сравнительный анализ растворимых антигенов вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ и В.сегеш показал, что полипептидный состав антигенов, выделенных из вегетативных клеток и спор, а также из культуральной жидкости различаются между собой в зависимости от состава питательной среды и времени культивирования.

89

6.4. Результаты исследований показали, что реакция латекс-агглютинации может быть использована для обнаружения специфических антител в сыворотках иммунизированных или переболевших животных. Уровень титров в РЛА полностью коррелировал с результатами РИГА и составлял от 1:5 до 1:160, причем титр антител зависел от препарата используемого для иммунизации и способа иммунизации.

6.5. При изучении культурально-морфологических свойств и исследований с помощью ПЦР 12 бацилл, выделенных из проб почв скотомогильника установлено, что четыре идентифицированы как атипичные сибиреязвенные культуры (№2, № 3 , №10, №12), а две из которых ( № 3, № 10) как бескапсульные с остаточной вирулентностью. Полученные данные свидетельствуют о широком диапазоне изменчивости, выделенных из проб почвы бацилл вплоть до полной утраты ими вирулентных свойств, но с сохранением отдельных признаков, характерных для возбудителя сибирской язвы.

90

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработанные "Методические указания по выявлению ДНК возбудителя сибирской язвы с помощью полимеразной цепной реакции утвержденные директором ВНИИВВиМ от 14.10.2000г. могут быть использованы в качестве сигнального теста для выявления возбудителя сибирской язвы в патологическом материале, пробах почвы при проведении лабораторных исследований.

Разработанные условия получения растворимого антигена из культуральной жидкости вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ, могут быть использованы для постановки латекс-агглютинации для выявления специфических антител.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Конвисарев, Андрей Петрович, Щелково

1. Ахмедзянов Ю.А., Найманов П.И. Использование плазмидного скрининга для дифференциации штаммов Bac.anthracis от близкородственных видов почвенных бацилл.//Журнал микроб.эпидем.и иммунологии. 1989,11, с. 26-28. М. " Медицина

2. Александер С.К., Лукин Ю.В., Юминова Н.В., Краснова В.П., Анджарпаридзе О.Г. Использование теста латекс-агглютинации для определения титров противокоревых антител.//Вопр. вирусологии, 1995, 5, с. 231-234.

3. Александер С.К., Лукин Ю.В., Фидлер Л.М. Приготовление IgG -диагноетикума на основе окрашенных полиакролеиновых латексов для применения в реакции латексной агглютинации.//ЖМЭИ, 1990, 6, с. 8488

4. Асеева В.Г., Падюков Л.Н. Латекс агглютинация и коагглютинация для диагностики инфекционных заболеваний .//ЖМЭИ, 1994,1, с. 107-113.

5. Балаева Н.М., Артемьев М.И., Игнатович В.Ф. Генотипическая характеристика штаммов Rickettsia sibirica.// Мол. ген. мик. и вир.,1993, 4, с.15-18. М." Медицина

6. Бакулов И.А., Гаврилов В.А. Иммунопрофилактика сибирской язвы животных.//Вестник с-х наук, 1991, 8, с.128-132.

7. Бакулов И.А., Гаврилов В.А., Караханов А.Г. Опыт использования эритроцитарного сибиреязвенного диагностикума.//Ветеринария, 1987, 7, с. 40-42.

8. Бакулов И.А. Законы и категории эпизоотологии //Вестник РАСХН,1994, 1, с.44-46.

9. Ю.Бакулов И.А., Гаврилов В.А. Оценка эффективности 10-летнего применения вакцины против сибирской язвы животных из шт. 55-ВНИИВВиМ//Ветеринария, 1994, 8, с.11-15.

10. П.Бакулов И.А. Современные проблемы эпизоотологии// Ветеринария, 1991, 7, с.32-36.

11. Бакулов И.А., Макаров В.В. О роли патогенности микроорганизмов в инфекционной паразитарной системе//Вестник РАСХН, 1990, 7, с.92-98.

12. Бакулов И.А., Ведерников В.А., Харкевич А.А., Гаврилов В.А., Селиверстов В.В. Дальнейшее совершенствование системы мероприятий по профилактике и борьбе с сибирской язвой животных.//Ветеринария, 1997, 5, с.7-12

13. Бакулов И.А., Гаврилов В.А., Косяченко Н.С. Изучение штаммов возбудителя сибирской язвы, выделенных на территории России.// Доклады РАСХН, 1997, 2, с.42-43.

14. Бакулов И.А., Гаврилов В.А., Косяченко Н.С. Современные воззрения на безопасность живых сибиреязвенных вакцин.// Ветеринария,- 1993,- 1. с. 22-25.

15. Бортюк Я.А. Молекулярное клонирование ДНК M.bovis, БЦЖ. Ветеринарная иммунология и биотехнология.// Труды ВИЭВ, 1988, том 66, с. 26-28. М.

16. Брода П. Плазмиды// 1982, с.Ю, М. " Мир"

17. Буланцев A.JI., А.В.Липницкий. Влияние гетерологических бацилл на инфекционный процесс при сибирской язве в эксперименте.// Микробиология эпидемиология и иммунология, 2000, 3, с. 24-27.

18. Булат С.А. Геноидентификация видов и сероваров бактерий методом ПЦР с универсальными олигонуклеотидами: реидентификация ранее выделенных штаммов Yersinia pseudotuberculosis.// ЖМЭИ, 1994, Т 12, с. 2-7. М." Наука ".

19. Ведерников В.А., Бакулов И.А., Гаврилов В.А. Эпизоотологическая обстановка по сибирской язве животных в РФ.//Вестник РАСХН, 1996, 2, с.68-71.

20. Вернер О.М., Синяк К.М., Волкова В .П. Состав жирных кислот Вас. anthracis и других почвообитающих бацилл.// Изв. АН СССР. Сер.биология. 1988, 1, с. 36-41.

21. Воробьева З.Г., Лазовская А.Л., Лукин Ю.В. Реакция латекс-агглютинации для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота.//Ветеринария, 1996, 4, с, 27-28.

22. Воробьева З.Г., Лазовская А.И. Диагностика чумы плотоядных. //Ветеринария, 1996, 6, с. 53-54.

23. Гаврилов В. А. Иммуногенетические аспекты разработки противосибиреязвенных вакцин. //Ветеринария. 1987, 10, с.27-29.

24. Гаврилов В.А., Матвеева Н.Б. Бациллоносительство у свиней, роль бациллоносителей в распространении сибирской язвы .//Съезд паразитоценологов, Харьков, 1995, с.36-37.

25. Гаврилов В.А., Матвеева Н.Б. Диагностика сибирской язвы.//Съезд паразитоценологов, Харьков, 1995, с.35-36.

26. Гаврилов В.А., Сафонов Г.А. Симпозиум по особо опасным инфекционным болезням животных//Вестник РАСХН, 1996, 3, с.13-15.

27. Гаврилов В.А., Бакулов И.А., Селиверстов В.В., Числов Ю.В. Концепция применения и производства сибиреязвенных вакцин.//Материалы межрегионального рабочего совещания ВОЗ/ФАО по сибирской язве, Казахстан, 1997, с.41-43.

28. Гаврилов В.А. Иммуноморфологическая и ветеринарно-санитарная экспертиза мясопродуктов от овец, привитых вакциной из штамма 55-ВНИЙВВиМ.//Научные основы технологии пром. произв. вет. биол. препаратов. Щелково, 1996, с.287-288.

29. Гинцбург А.Л., Брюханов А.Ф., Янишевский Н.В. Определение гена холерного токсина у штаммов холерных вибрионов методом ДНК-ДНК-гибридизации.// Молек.генетика, 1987, №11. с. 9-13.

30. Гинцбург А.Л., Грижебовский Г.М., Токарская О.Н. Изучение полиморфизма штаммов холерного вибриона разного происхождения методом геномной " дактилоскопии".//Генетика, 1989, 25, с. 1320-1324.

31. Гинсбург Я.Я. //Живые вакцины. — М., 1969.

32. Гинцбург А.Г., Шагинян И.А. Геномный полиморфизм возбудителей бактериальных инфекций.//Молек. ген. мик. вир., 1991, № 12, с. 3-9.

33. Голубинский Е.П., Тафелыптейн Э.Е. О динамике сибиреязвенного токсина в организме.// ЖМЭИ, 1989, 3, с, 98-100.

34. Езепчук Ю.В.// Патогенность как функция биомолекул. М.,1985, с. 6773.

35. Еремин С.А, Ежов И.Н., Костюкова Т.А. Определение плазмидного профиля у штаммов сибиреязвенного микроба методом электрофореза в агарозном геле.// Микробиол. иммунология и биохимия особо опасных инфекций. Саратов, 1987, с.91-95.

36. Еремин С.А., Ежов И.Н., Костюкова Т.А. Конструирование и изучение штаммов сибиреязвенного микроба, обладающих различным набором собственных плазмид.// Мол. ген. микр. вирус., 1989,10, с.35.

37. Ипатенко Н.Г., Гущин В.Н., Маничев A.A. Профилактика сибирской язвы.// Ветеринария, 1992, 2, с. 31-32.

38. Ипатенко Н.Г., Маничев A.A., Саленко A.C., Гаврилов В.А. Иммуногенные свойства вакцины против сибирской язвы из штамма 55. // Ветеринария, 1993, 3, с. 17-19.

39. Ипатенко Н.Г., Гаврилов В.А., Зелепукин B.C. и др.// Сибирская язва. М. Колос, 1996, 335 с.

40. Ипатенко Н. Г., Маничев A.A., Шморгун В. Л., Тихонов Ю. А. Дифференциация Вас. anthracis от спорообразующих почвенных бацилл.// Ветеринария, 1999,

41. Ипатенко Н.Г. Яковлева И.А., С.И.Бахтаров. Лечение животных, больных сибирской язвой.//Ветеринария, 1999, с. 18-23.

42. Ипатенко Н.Г. Патогенез сибирской язвы у свиней.// Ветеринария, 3, 1999, с, 15-17.

43. Ипатенко Н.Г. Испытание сибиреязвенных бактериофагов. //Ветеринария. 2000, 6, с. 22-23.

44. Ипатенко Н.Г., Б.И.Шморгун, Л.С.Саленко. Компоненты для реакции преципитации при сибирской язве.// Ветеринария, 10,1999, с. 15-17.

45. Мазин A.B., Кузнеделов К.Д., Краев A.C. и др. //Методы молекулярной генетики и генной инженерии // 1990, с.116.

46. Мальков И.Г., Артюшин С.К., Фомин Б.А., Коромыслов Г.Ф. Разработка метода идентификации микобактерий человеческого и бычьего видов с использованием ПЦР.// Молек. генетика микроб. вирусол.1993, 2., с. 3-9.

47. Мальков И.Г. Идентификация M.tuberculosis и М. bovis от атипичных видов микобактерий методами ДНК-ДНК гибридизации и полимеразной реакции.//Автореф. дисс. 1993, с. 8-16. Москва.

48. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж.// Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. 1984, с. 102-103, М. «Мир».

49. Маничев A.A., Шморгун Б.И. Производство стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена из вакцинных штаммов Bac.anthracis. // Ветеринария, 1991, 7, с. 30-31.

50. Маренникова С.С., Носков Ф.С., Шелухина Э.М. Выявление антигена ВИЧ и антител к нему с помощью теста агглютинации с отечественным латексом.//Вопросы вирусологии, 1990, 3, с. 245-248.

51. Монахова Е.В., Власов В.П., Вуцан В.Н., Е.И.Седых, Н.К.Михась.// Видоспецифический ДНК-зонд для идентификации холерных вибрионов.//Молекул. генетика микроб, вирусол. 1993, 4, с.8-11.

52. Никшис Н.И., Степанов A.C. Питательные потребности штаммов Bacillus anthracis //Актуал. пробл. и задачи биохимии, диагностики и иммунопрофилактики особо опасных инфекций. /Всес. н-и противочум. ин-т "Микроб", Саратов, 1991, с. 122-127.

53. Проскурина В.А. Скрининг плазмидной ДНК сибиреязвенного микроба //Совр. Аспекты природной очаговости, эпидемиол. и профилактики особо опасных инф. болезней: Тез. докл. науч. конф., Омск, окт. 1993 г. Ставрополь, 1993,- с.347-348.

54. Пехов А. // Плазмиды бактерий. 1986, с.7, М," Мир

55. Романова Л.В., Мишанкин Б.Н.,Сучков И.Ю. Полимеразная цепная реакция: генотип ический скрининг штаммов Fran.tularensis с использованием неспецифических праймеров.// Биотехнология, 1993, № 6, с. 8-9.

56. Рысков А.П., Токарская О.Н., Вербовая Л.В. Геномная дактилоскопия микроорганизмов. Использование в качестве гибридизационного зонда ДНК фага М-13.// Генетика, 1988, № 7, т. 24, с.1310-1313.

57. Рысков А.Р., Джинчарадзе А.Г., Просняк М.И. Геномная "дактилоскопия" организмов различных таксономических групп. Использование в качестве гибридизационной пробы ДНК фага М-13. // Генетика, 1988, № 2, т. 24, с. 227-238.

58. Степанов A.C., Пузанова О.Б., Гаврилов C.B. Глицинзависимая криотрансформация Вас. anthracis ДНК различных плазмид.// Мол. ген. микроб, и вирус., 1989, № 12, с.39-44.

59. Степанов A.C. О молекулярной природе токсина Вас.anthracis.// Мол. ген. микроб, и вирус., 1991, 1, с. 3-8.

60. Тедиков В.М., Добрица А.П. Клонирование и экспрессия детерминанты протективного антигена Вас. anthracis в клетках E.coli, Вас. subtilis, Вас. anthracis. // Мол. ген. микроб, и вирус., 1993, № 2, М. с.3-8.

61. Тимошин В.Б., Замараев B.C., Антонов В.А., Липницкий A.B. Видоспецифический ДНК-зонд для обнаружения токсигенных штаммов возбудителя сибирской язвы.// Молек. ген. микроб, виру со л., 1994, 1, с. 30-32.

62. Шагинян И.А., Токарская О.Н., Грижебовский Г.М. Современные направления медицинских диагностикумов.//М.1990.с.80.

63. Шагинян И.А, Романова Ю.М, Уткин В.В и др. Изучение геномного полиморфизма штаммов Shigella Flexneri, изолированных в разных географических регионах.//Мол. ген. микроб, и вирус.,1993, № 1.- с. 8.

64. Шагинян И.А., Ананьина Ю.В., Токарская О.Н. Геномная "дактилоскопия" возбудителей сапронозов.// Журн.микробиол, 1991, № 6. с. 25-31.

65. Шишкина О.Г., Попов Ю.А., Кириллина О.А. Конструирование видоспецифического ДНК-зонда на основе плазмиды pFra чумного микроба.// Мол. ген. вир. микроб., 1991, №10, с. 16-19.

66. Шубин Ф.Н., Сибирцев Н.Т., Рассказов В.А. Плазмиды Yersinia pseudotuberculosis и их значение в реализации эпидемического процесса при псевдотуберкулезе.// Ж. микробиологии, 1985, № 12, с.53-56.

67. Ургуев К.Р., М.И.Нажалов, З.М.Джамбулатов Эпизоотическая обстановка по сибирской язве животных в Дагестане. //Ветеринария, 1999, 2, с,22-25.

68. Andersen G., Simshock J.M., Wilson К.Н. Identification of a region of genetic variability among Вас. Anthraeis strains and related species.// J.Bacter., 1996, 178, p.377-384.

69. Ash C., Collins D. Comparative analysis of 23 S ribosomal RNA gene sequences of Вас. Anthraeis and emetic Вас. Cereus determined by PCR-direct sequencing.//FEMS Microbiol., 1992, 94, p.75-80

70. Ash C., Farrow A., Dorsh M., Stackebrandt E., Collins D. Comparative analysis of Вас. Anthraeis, Вас. Cereus and related species on the basis ofreverse transcriptase sequencing 16S rRNA.//Int J. Syst. Bacterid, 1991, 41, p.45-50

71. Baillie-LWJ, Jones-M.N, Turnbull-P.C.B, Manchee-R.J. Evaluation of the Biolog. System for the Identification of Bacillus Anthracis.// Letters Appl. Microbiology,1995, Vol 20, p. 209-211

72. Beal F.A., Taylor M.J.,Thome C.B. Rapid lethal effect in rats of a third component found upon fractionating the toxin of Bac. anthracis.//J. Bact-1961. Vol.83. P.1274-1280.

73. Beyer W., Glockner P., Otto J., Bohm R. A nested PCR method for the detection of Bac. Anthracis in environment samples collected from former tannery sites.//Microbiol. Res., 1995, 150,179-186.

74. Bergey' s Manual of Determinative Bacteriology.- 8th ed. The Williams and Wilkins Co.- Baltimore. 1974. P. 529-550.

75. Bernet C, Carret M., de Barbeyrac B. Detection of Mycoplasma pneumoniae by Using the Polymerase chain Reaction.// J. clin. Microbiol. 1989. Vol. 27. № 11. P. 2492-2495.

76. Belak S., Ballagi-Pordany A. Experiences on the application of the polymerase chain reaction in diagnostic laboratory.//Mol.Cell.Probes, 1993, 7,241-248

77. Bhatnagar R.,Singh Y.,Leppla S.H.,Friedlander A.M. Calcium is Reguired for the Expression of Anthrax Lethal Toxin Activity in the Macrophage like Cell Line J 774 A 1.// Infect.Immun. 1989. Vol.57. P.2107-2114.

78. Bragg T.S., Robertson D.L. Nucleotide sequence and analysis of the lethal factors gene (lef) from Bac.anthracis.// Gene, 1989, 81, p.343-346.

79. Brightwell G., Pearce M., Leslie D. Development of internal controls for the PCR detection of Bac. Anthracis.//Mol.Cell.Probes, 1998,12, 367-377

80. Carlton B.C., Smith V.W. Size Distribution of the Closed Circular Deoxyribonucleic Acid Molecules of Bacillus megaterium: Sedimentation Velocity and Electron Mikroscope Measurements. //J. Bact, 1974, Vol.117, P.1201-1209.

81. Carl M., Hawkins R., Coulson N., Sowe J., Titball W. Detection of spores of Bac. Anthracis using polymerase chain reaction.// J. Infect. Disease, 1992, 165, p. 1145-1148

82. Cataldi A., Labruyere F.//International Workshop on Anthrax.-Winchester, 1989. P.87.

83. Craescu-C.T, Barzu-O. Characterization of a Synthetic Caimodulin-Binding Peptide Derived from Bacillus-Anthracis Adenylate-Cyclase.// J. Biol. Chemistry, 1993, Vol 268, p. 1695-1701.

84. Drobnewski F. Bacillus and related species.// Clin. Microbiol. Rew., 1993, 6, p.324-338

85. Doganay-M, Aydin-N. Antimicrobial Susceptibility of Bacillus Anthracis.// Scand. J. Infect. Disease. 1991, Vol 23, p. 333-335

86. Eisenstein B. New molecular techniques for microbial epidemiology and the diagnosis of infectious diseases.//J. Infect. Dis., 1990,161, 595-602.

87. Ekwunife-FS, Singh-J, Taylor-KG, Doyle-RJ. Isolation and Purification of Cell-Wall Polysaccharide of Bacillus-Anthracis (Delta-Sterne).// FEMS Microb. Letters. 1991, Vol 82, p. 257-262

88. Ezeel J.W., Abshire T.G.//International Workshop on Anthrax. Winchester. 1988. P. 87-90.

89. Fish D.C., Mahlandt B.G., Dobbs J.P., Linkoln R.E. Purification and Properties of in vitro-produced Anthrax Toxin Components.// J. Bact. 1968. Vol.95. P.907-918.

90. Fitzgerald D., Morris R.E., Saelinger C.B. Essential Role of Calcium in Cellular Internalization of Pseudomonas Toxin.// Infect.Immunol. 1982.-Vol.35.P.715-720.

91. Friedlander A.M. Macrophages are sensitive to anthrax lethal toxin through an acid-dependent process. //J.biol.Chem.1986. Vol.261. P.7123-7126.

92. Friedlander A.M., Bhatnagar R., Leppla S., Singh Y. //International Workshop on Anthrax. Winchester. 1989. P.51.

93. Friedlander A.M., Bhatnagar-R, Leppla-SH, Johnson-L, Singh-Y. Characterization of Macrophage Sensitivity and Resistance to Anthrax Lethal Toxin.// Infection Immunity. 1993, Vol. 61, p. 245-252.

94. Freer J.H. Virulence Mecchanism Bacterial Pathogenecity.// Washington-1988.-P.264-288. Antlirax. Winchester, 1989. P.43.

95. Guignot-J, Mock-M, Fouet-A. Atxa Activates the Transcription of Genes Harbored by Both Bacillus-Anthracis Virulence Plasmids.//FEMS Microb. Letters. 1997, Vol 147, p. 203-207

96. Green B.D., Battisty L., Koehler T.M. Demonstration of capsule plasmid in Bac. anthracis.// Infect, and Immun. 1985. Vol. 49. № 2. P. 291297.

97. Gryczan T.J., Dunau D. Construction and properties of chimeric plasmids in Bacillus subtilis. // Proc.nat.Acad.Sci.USA. 1978. Vol.7. P. 1428-1432.

98. Hawkins R., Coulson N., Lowe J. et al. Detection of spores of Bacillus anthracis using the Polimerase Chain Peaction // J. Infec. Diseases.-1992. Vol.165, №6. P. 1145.

99. Harrel L., Andersen G., Wilson K. Genetic variability of Bac.anthracis and related species.// J. Clin. Microbiol., 1995, 33, p. 1847-1850.

100. Henderson I., Duggleby C., Turnbull P. Differentiation of Bac.anthracis from other Bac.cereus group bacteria with the PCR.// Int. J. Syst. Bacterid., 1994, 44, p.99-105.

101. Hanna-PC, Kruskal-BA, Ezekowitz-RAB, Bloom-BR, Collier-RJ. Role of Macrophage Oxidative Burst in the Action of Anthrax Lethal Toxin.//Molecular Medicine. 1994, Vol 1, p. 7-18

102. Hoflack-L, Seurinck-J, Mahillon-J. Nucleotide-Sequence and Characterization of the Cryptic Bacillus-Thuringiensis Plasmid Pgi3 Reveal a New Family of Rolling Circle Replicons.//J. Bacteriol., 1997, Vol 179, p. 5000-5008

103. Haima P., Bron S., Venema G. The effect of restriction on shotgan cloning and plasmid stability in Bac. subtilis Marburg. // Molec. Gen. Genet. 1987. Vol.209. P. 335-342.

104. Haima P., Bron S., Venema G. Cloning plasmid in Bac.subtilis. // Molec. Gen.Genet. 1990. V.86. P. 63-69.

105. Hatt C., Ward M.E., Clarke I.N. Analysis of tlie entire nucleotide sequence of the cryptic plasmid of Chlamidia trachomatis serovar L 1. Evidence for involvement in DNA replication. // Nucl. Acid. Res. 1988. V.16. P.4053-4067.

106. Hector J.S.R., Johnson A.R. Determination of genome size of Pseudomonas aeroginosa by PFGE: analysis of restriction fragmens // NAR, 1990, Vol.18, P. 3171-3174.

107. Hoshino T., Ikeda T., Narushima H., Tomizuka N. The nucleotide seguence of pUB 110: some salient features in relation to replication and its regulation.//Plasmid. 1986. V.15. P.93-103.

108. Hutson R., Duggleby C. DNA probes for anthracis detection .//In: Proc. Int. Workshop on Anthrax, 1990, 27-28

109. Imanaka T., Fujii M., Aiba S. Isolation and characterization of antibiotic resistance plasmids from thermophilic bacilli and construction of deletion plasmids.//J.Bact. 1981. Vol.146. P. 1091-1097.

110. Ivins B.E., Welkos S.L. Cloning and Expression of the Bac.anthracis Protective Antigen Gene in Bac. subtilis.//Infect, Immun. 1986. Vol.54. P.537-542.

111. Johns M., Harrington L., Titball R., Leslie D. Improved methods for the detection of Bac.anthracis spores by the polymerase chain reaction.// Lett. Appl. Microbiol., 1994, 18, 236-238

112. Koehler T„ Thome C. Bacillus subtilis (natto) Plasmid pLS 20 Mediates Interspecies Plasmid Transfer.//J.Baet.-1987. Vol.169. P.5271-5278.

113. Le Gegarat J.C., Anagnostopoulos C. Detection and characterization of naturally occuring plasmids in Bacillus subtilis.// Mol.Gen.Genet. 1977. Vol.157. P.167-174.

114. Leighton T. First Int. Workshop on Molecular Biology of B.cereus, B.anthracia and B.thuringiensis.//Oslo, 23-25 May, 1997

115. Leppla S.H., Friedlander A.M., Singh Y.//International Workshop on Anthrax.-Winchester. 1989. P.49-50.

116. Leppla S.H. Anthrax toxin edema factor: A bacterial adenylatecyclase that increases cyclic AMP concentrations in eukaryotic cells.// Proc.nat.Acad. Sci.USA. 1982. Vol.79. P.3162-3166.

117. Leppla S.H. Bacillus anthracis calmodulin-dependent adenylate cyclase: chemical and enzymatic properties and interactions with eucaryotic cells. // Advanc. Cycl.Nucl.Prot. Phosphoryl.Res. 1984. Vol.17. P.189-198.

118. Leppla S.H. Purification and Characterization of Adenylyl Cyclase from Bacillus Anthracis.// Methods Enzymology, 1991, Vol 195, pp 153168

119. Liu-PYF, Ke-SC, Chen-SL. Use of Pulsed-Field Gel-Electrophoresis to Investigate a Pseudo-Outbreak of Bacillus-Cereus in a Pediatric Unit.// J. Clin. Microbiol., 1997, Vol 35, p. 1533-1535

120. Makino-S, Iinumaokada-Y, Maruyama-T, Ezaki-T, Sasakawa-C, Yoshikawa-M. Direct Detection of Bacillus Anthracis DNA in Animals by Polymerase Chain-Reaction.// J.Clin. Microb. 1993, Vol 31, p. 547-551

121. Maslow J., Mulligan M., Arbeit R. Molecular Epidemiology: Application of Contemporary Techniques to the Typing of Microorganisms.//Clin.Infectious Disease, 1993, 17,153-164

122. Maslow J., Slutsky M., Arbeit R. The application of pulsed field electrophoresis to Molecular Epidemiology.// In: Diagnostic molecular Microbiology. Washington, 1993, 563-572

123. Miksell P., Ivins B.E., Ristroph J.D. Evidence for plasmid-mediated toxin production in Bacillus anthracis.// Infect. Immun. 1983. Vol. 39. P. 371-376.

124. Odendaal-MW, Pieterson-PM, Devos-V, Botha-AD. The Biochemical, Morphological and Virulence Profiles of Bacillus Anthracis Isolated in the Kruger National-Park.// Onder. J. Veter. Res., 1991, Vol 58, p. 21-26

125. Pallen M., Puckey L., Wren B. A rapid, simple method for detection PCR failure.// PCR Methods and Applic. 1992, 2, 91-92

126. Prevost G., Jaulhac B., Piemont Y. DNA fingerprinting by pulsed-field gel electrophoresis is more effective than ribotyping in distingquishing among methicilin-resistant Staph. Aureus isolates.// J. clin. Microbiol., 1992, 30, 967-973.

127. Projan S., Monod M., Narayanan C., Dubnau D. Replication Properties of pL M13, a Naturally Occurring Plasmid Found in Bacillus subtilis, and of its Close Relative pE5, a Plasmid Native to Staphylococcus aureus//J. Bact.1987. Vol. 169. P. 5131-5139.

128. Ramisse V., Patra G., Garrigue H., Guesdon J., Mock M. Identification and characterization of Bac.anthracis by multiplex PCR analysis of sequence on plasmids pXOl and pX02 and chromosomal DNA.// FEMS Microb. Lett, 1996,145, 9-16.

129. Reif T., Johns M., Pillai S., Carl M. Identification of Capsule-Forming Bac.anthracis spores with the PCR and Novel Dual-Probe Hybridization Format.// Appl.Envir.Microbiol. 1994,60, 1622-1625

130. Robertson D.L., Tippets M.T., Leppla S.H. Nucleotide sequence of the Bac.anthracis edema factor gene (cya):a calmodulin dependent adenylate cyclase.//Gene. 1989. V.73.P. 363-371.

131. Robertson D.L., Leppla S.L. Molecular cloning and expression in E.coli of the lethel factor gene of Bacillus anthracis. // Gene. 1986. Vol.44. P.71-78.

132. Robertson D., Bragg T.S. International Workshop on Anthrax. Winchester, 1989. P.88-89.

133. Rossen L., Norskow P., Holmstrem K., Rasmussen O. Inhibition of PCR by components food samples, microbial diagnostic assay and DNA extraction solutions.//J.Clin.Microbiol.,1992, 17, 37-45

134. Sjostedt A., Eriksson U., Ramisse V., Garrigue H. Detection of Bacillus Anthracis Spores in Soil by PCR././ FEMS Microb. Ecology. 1997, Vol 23, p. 159-168

135. Shlyakhov E., Rubinstein E. Evaluation of the Anthraxin Skin-Test for Diagnosis of Acute and Past Human Anthrax.// EUR J. Clin. Microb. & Infect. Disease. 1996, Vol 15, p. 242-245

136. Shishido K., Noguchi N., Kim C., Ando T. A restriction Map of Bacillus subtilis Tetracycline-Resistance Plasmid pNS 1981.// Plasmid.-1983. Vol. 10. P.224-234.

137. Stanley J.L., Smith H. Purification of factor I and recognition of a third factor of anthrax toxin.//J. gen.Microbiol. -1961. Vol.26.-P.49-66.

138. Tanaka T., Kochikawa T. Isolation and characterization of four types of plasmids from Bac. subtilis (Natto).//J.Bact. 1977. Vol.131. P.699-701.

139. Thorne C.B. Genetics of Bacillus anthracis.// Microbiology. 1985,-American Society for Microbiology. Washington D.C. P. 56-62.

140. Titball-RW, Turnbull-PCB, Hutson-RA. The Monitoring and Detection of Bacillus Anthracis in the Environment .// J. Appl. Bacterid., 1991, Vol 70, p. S9-S18

141. Tippets M.T., Robertson D.L. Molecular cloning and expression of the Bac.anthracis edema factor toxin gene: a calmodulin- dependent adenylate cyclase.//Bact. 1988. Vol.170. P.2263-2266.

142. Turnbull P.C.B., Hutson R., Ward M. Bac. anthracis but not always anthrax. // Abstr. Hyg. Trop. Dis. 1986. V. 61. P.R1-R13.

143. Uchida J., Sekizaki T., Hashimoto K., Terakado N. Association of the encapsulation of Bac. anthracis with a 60 MD plasmid //J. Gen. Microbiol.-1985. Vol. 131. P. 363-367.

144. Uchida I., Hornung J., Thorne C., Klimpel K., Leppla S. Cloning and Characterization of a Gene Whose Product Is a Transactivator of Anthrax Toxin Synthesis.// J.Bacteriology, 1993, Vol 175, p. 5329-5338

145. Uchida I., Makino S., Sekizaki T., Terakado N. Cross-Talk to the Genes for Bacillus Anthracis Capsule Synthesis by Atxa, the Gene Encoding the Transactivator of Anthrax Toxin Synthesis.// Molec. Microbiol., 1997, Vol 23, p. 1229-1240

146. Vodkin M.H., Leppla S.H. Cloning of the Protective Antigen Gene of Bacillus anthracis.//Cell. 1983. Vol.34. P. 693-697.

147. Walker J., Dougan G. DNA probes: a new role in diagnostic microbiology.//J.Appl.Bacteriol., 1990, 67, 229-238

148. Welkos S.L., Becker D., Friedlader A.,Trotter R. //Internatinal Workshop on Anthrax.- Winchester,1989. P.54-55.105

149. Welkos S.L., Lowe J., Vodkin M., Leppla S., Schmidt J. Sequence and analysis of the DNA encoding protective antigen of Bac.anthracis. //Gene, 1990, 69, p.287-300.

150. Welkos S. Plasmid-Associated Virulence Factors of Nontoxigenic (PxOl-) Bacillus-Anthracis.// Microb. Pathogenesis, 1991, Vol 10, p. 183198.

151. Welkos S., Vietry N., Gibbs P. Non-toxigenic derivates of the Ames strain of Bac.anthracis are fully virulent for mice: role of the plasmid pX02 and chromosome in strain-dependent virulence.// Microb. Pathogenesis, 1993, 14, p.381-388.

152. Wilson I. Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification.//Appl. and Environ. Microbiol., 1997, 63, 3741-3751

153. Yoshimura K., Yamamoto O., Seki T., Oshima Y. Distribution of heterogeneous and homologous plasmids in genus Bacillus.// App. environm. Microbiol., 1983, Vol. 46, P. 1268-1275.

154. РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

155. ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ ВИРУСОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ1. УТВЕРЖДАЮ1. Директор^ЩЩ^еринарной1. Хк"ОЛОГИИ1. Котляров 2000 г.

156. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ВЫЯВЛЕНИЮ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИЕЙ1. Покров 2000 г.

157. Д.В. Колбасов А.П. Конвисарев1. Н.С. Косяченко1. С.Ж. Цыбанов

158. Материалы по разработке * методических указаний рассмотрены и одобрены на заседании ученого совета ВНИИВВиМ

159. Протокол № /С от ./:^:./С1.2000 г.

160. Ученый секретарь ^^¿ ¿й.^ В.Я.Савукова