Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка теоретических основ и методов использования миллисекундной замедленной флуоресценции хлорофилла для анализа фотосинтетической продуктивности и устойчивости растений

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Разработка теоретических основ и методов использования миллисекундной замедленной флуоресценции хлорофилла для анализа фотосинтетической продуктивности и устойчивости растений"

И 0 и 8 9 %

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НШ ОРДЕНА ЛЯН'/НА ОЗИРСЖЗ ОТДЕЛЕШЗ :-3':с?1пут бгофшики

мз гграпех рухогскс»? УДК 577.355

Моргун Василий Николаева

РАЗРАБОТКА ТТОРЕТИЧЯСКЖ ОСНОВ И МЕТОДОВ ПОЛЬЗОВАНИЯ ЧИП'ИЗВШУШ ЗАМЕДЛЕННОЙ ЭДУОРЕСЦЕНЦИК ХД0Р00ЖЛ/, ДЛЯ ДШШ Я)ТСС»ЛЕТШЕСИОа ПРОДУКТИВНОСТИ и УСТОЙЧИВОСТИ РАСЧЕШИ

ОЗ.00.02 - Анофкзикп

Автореферат диссертация на соисявнич уччкой етчпенй дпкторп биологических нпук

Кяясн^ятз^я -

Работа выполнена в Красноярском государственном аграрном университете

Официальные оппоненты: доктор биологических наук ' Н.Г.Бухов (г. Москва)

доктор биологических наук

Д.А.Джацумов

(г. Москва)

доктор физико-математических наук В.Н.Лопат ш 1 (г. Красноярск)

Ведущая организация: Московский государственный университет имени М. Б Ломоносова

Зацита состоится "__"_ 1992 г. в часов

на заседании Специализированного созета Д.003.45.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биофизики СО РАН (660036, Красноярск, Академгородок). С диссертацией можно ознакомиться а библиотеке Института биофизики СО РАН.

Автореферат разослан "_"__ 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

канд. физ.-ыат. наук ^.¿р Л.Г.Косолапова

РОССИЙСКАЯ БИБЛИОТЕКА

Ш | ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

I Актуальность проблемы. В настоящее время большое внимание уделяется совершенствованию методов диагностики состояния растений, основанных на измерении люминесценции хлорофилла. Интерес к люминесцентным методам обусловлен высокой чувствительностью, оперативностью измерений, большим объемом получаемой информации о фотосинтетических процессах, а также относительной простотой и компактностью аппаратуры. За последние года значительный прогресс достигнут в области практического применения переменной и постоянной (нулевой) флуоресценции хлорофилла. Разработаны базовые методические подхода, основанные на измерении фотохимического и энергозависимого компонентов тушения флуоресценции, предложены показатели, количественно связанные с фотосинтезом, созданы соответствующие технические средства (Schreiber at al, I9b9). В то же время заметное отставание наметилось в области применения замедленной флуоресценции хлорофилла. Такое положение сложилось как в исследованиях механизма фотосинтеза, так и в работах, посвященных решению задач прикладной физиологии (стресса, продуктивности, развития и'др.).

Накопленные к сегодняшнему дню данные позволяют говорить о том, что наиболее привлекательной с точки зрения ближайших перспектив практического использования является миллисекундная замедленная флуоресценция хлорофилла, тесно связанная с запасанием энергии в виде мембранного потенциала тилакоидов. Несмотря на это, диапазон применения миллисекундной замедленной флуоресценции остается гораздо более узким, чем переменной флуоресценции. Среди основных причин этого, во-первых, интегральный характер замедленной флуоресценции как показателя фотосинтеза и ее многокомпонентный состав. Бо-вторых, отсутствие детально проработанных представлений о связи замедленной флуоресценции с процессами фотосинтесм. Современный уровень этих представлений по основным положениям обеспечен исследованиями, проведенными еще до конца семидесятых годов. В-третьих, несформированность теоретических основ замедленной флуоресценции как самостоятельного метода исследований. В-четвертых, наибольшая среди люминесцентных методов сложность аппаратуры, ее неунифицированность, возможность альтернативных режимов регистрации замедленной флуоресценции. Ьсе это обусловливает необходимость проведения в боль-

шинстве случаев предварительных исследований для адаптации метода к решению конкретных задач. В других случаях замедленная флуоресценция используется в качестве вспомогательного показателя, интерпретация данных которого ограничивается качественными оценками и приводит к заключениям общего характера. Тем не менее, результаты проведенных ранее теоретических исследований и работ прикладного направления говорят о возможности и целесообразности применения замедленной флуоресценции для решения самых различных задач в качестве самостоятельного метода.

Но сравнению с переменной флуоресценцией, метод замедленной флуоресценции имеет некоторые особенности, придающие ему самостоятельное значение в группе люминесцентных методов. Ь числе этих особенностей - качественно иной механизм связи свечения с мембранным потенциалом тилакоидов и отличная от флуоресценции форма индукционной кривой, легко измеряемая кинетика затухания, позволяющая оценивать скорость переноса электронов в различных условиях;' более информативные термоиндуцированные изменения в области низких физиологических температур и ряд других. Как и переменная флуоресценция, замедленная флуоресценция является чувствительным инструментом для сравнительной оценки параметров фотоскнтетического аппарата с целью выявления их внутривидовой изменчивости при отборе форм культурных растений. В частности, кинетические и амплитудные параметры свечения могут быть использованы без привязки к содержанию хлорофилла, внутривидовые различия которого до настоящего времени не удается ввести в рамки причинно-следственных связей с продуктивностью. В плане совместного использования люминесцентных методов в области .физиологии и экологии большие возможности обещает привлечение замедленно!! флуоресценции как показателя, свлзанн го с концентрацией активных реакционных центров фотосистемы '¿. Наконец, качественных сдвигов в области применения метода замедленной флуоресценции следует ожидать в связи с внедрением новой технической, базы измерений: твердотельных источников модулированного света и электронных систем модуляции возбуждения и регистрации свечения. Такое усовершенствование делает реальным проведение измерений замедленной флуоресценции в полевых условиях. Наряду с использованием уже имеющейся полевой аппаратуры для регистрации переменной флуоресценции, это придаст люминесцентным методам комплексный и более объективный характер.

- Л -

Цель и задачи. Целью работы явилось развитие теоретических основ замедленной флуоресценции хлорофилла как показателя функционирования фотосинтетического аппарата, его чувствительности к стрессовым воздействиям, а также разработка общих методических подходов фотолюминесцентного анализа устойчивости и продуктивности растений. Ь связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать современное состояние проблемы и обобщить имеющиеся литературные данные в рамках развиваемой теоретической концепции замедленной флуоресценции.

2. Выяснить механизм возникновения замедленной флуоресценции в миллисекундном интервале кривой затухания, доступной для регистрации при помощи наиболее распространенных и простых технических средств.

3. Изучить явление светоиндуцированных изменений замедленной флуоресценции в его взаимосвязи с переходными процессами фотосинтеза.

4. Установить связь количествен^!; х параметров замедленной флуоресценции с фотосинтезом, в первую очередь с транспортом электронов и величиной мембранного, потенциала. Исследовать, как реализуется эта связь при изменении таких факторов как свет, температура, содержание воды в листе.

Ь. Определить параметры замедленной флуоресценции, связанные с продуктивностью и устойчивостью фотосинтетического аппарата к стрессу, оптимальные-условия их измерения, природу межвидовых и межсортовых различий этих параметров.

Научная новизна. В широком диапазоне условий у различных фо-тосинтезирующих объектов измерены амплитуды и времена жизни 200--микросекундного и миллисекундного компонентов затухания замедленной флуоресценции, индукционные изменения этих параметров и соотношение квантовых выходов компонентов. Показано, что микросекундный компонент отражает кинетику безизлучательной рекомбинации в jеакционных центрах фотосистемы 2 с донорным комплексом в высшем стабильном окисленном состоянии. ¡Лиллисекундный компонент в натшых системах происходит в результате обратной реакции между донорами электронов в той же части реакционных центров.

показано, что в начальный период освещения после переноса 5-6 элйктроноь и до восстановления лластохинона оборот, фотосистемы

2 лимитируется реакциями донорной стороны. Выяснено происхождение лимитирующего эвена, предложен новый механизм, объясняющий усиление дезактивации энергии при поглощении света фотосистемой 2 с невыделенной молекулой кислорода.

Впервые показано, что выделение кислорода у хлореллы имеет более быструю кинетику по сравнению с хлоропластами листьев высших растений, в то время как квантовый выход замедленной флуоресценции хлореллы ниже. Дается новое объяснение природы быстрой фазы индукции замедленной флуоресценции, в том числе впервые описанной ее более быстрой субфазы. Детально изучен механизм медленной фазы индукции. Показано, что связь выхода миллисекундного компонента замедленной флуоресценции с мембранным потенциалом тилакоида опосредована внутримембранной разностью электрических потенциалов, выявлены тонкие механизмы этой связи. Установлена роль знерго-пот-ребляющих темновых ферментативных реакций хлоропласта в формировании медленной фазы индукции.

С использованием растений, выросших в различных световых условиях, изучена видовая специфика параметров замедленной флуоресценции и выявлены особенности структуры фотосинтетического аппарата, лежащие в ее основе. Обоснован количественный показатель для определения эффективности сопряжения световых и темновых реакций фотосинтеза. Показано, что наибольшая эффективность использования мембранного потенцийда в темновых реакциях имеет место при полунасыщающей фотосинтез облученности, обнаружено ее увеличение у тенелюбивых и теневыносливых растений.

Определены параметры замедленной флуоресценции, отражающие влияние факторов, среды на транспорт электронов и мембранный потенциал тилакоидов. Установлено, что ранним ответом на водный ст;^сс является замедление транспорта электронов в фотосистеме I вследствие снижения рН в строме хлоропласта, приводящее к усилению фо-тоингибирования и безизлучательных потерь энергии в фотосистеме 2. Показано, что универсальным ответом фотосингетического аппарата на стресс, является увеличение потребления мембранного потенциала в темновых реакциях. На примере пшеницы установлено наличие внутривидового разнообразия в норме и при стрессе по величине расходования мембранного потенциала. Предложен альтернативой определению скорости фотосинтеза подход для оценки фотосинтетическои п;">- 6 -

дуктивности, в этой связи обсуждены причины неудач селекции растений по параметрам фотосинтеза.

Практическая значимость. Выявленные в результате исследований механизмы связи параметров затухания и Светоиндуцированных изменений замедленной флуоресценции могут быть использованы в рамках обратного подхода, то есть- изучения отдельных процессов фотосинтеза и особенностей структуры фотосинтетического аппарата в различных условиях и у различных объектов по данным замедленной флуоресценции. При этом показатели замедленной флуоресценции, отражающие относительную энергизованность мембран, долю мембранного потенциала, расходуемую в темновых реакциях, кинетику лимитирующей транспорт электронов реакции могут быть использованы в качестве сравнительных характеристик фотосинтеза у различных, объектов. В работе определены параметры замедленной флуоресценции и оптимальные условия их регистрации для оценки потенциальной фотосинтетической продуктивности растения в ценозе и его потенциальной устойчивости к стрессу. На основе разработанной методологии совместно с НЛП "Тест" создана базовая автоматизированная модель фосфороскопа для лабораторных исследований и анализа селекционного материала растений, разработана модель устройства для контактных полевых измерений замедленной флуоресценции.

Основные положения, выносимые на защиту. ■

1. Миллисекундная замедленная флуоресценция растений формируется двумя кинетическими компонентами и происходит в нормально функционирующих реакционных центрах фотосистемы 2 в условиях, когда скорость поступления квантов превышает скорость оборота этой фотосистемы. Скорость оборота фотосистемы 2 лимитируется последним этапом окисления водоразлагающего комплекса.

2. Быстрая и медленная фазы индукции замедленной флуоресценции отражают изменения квантовых выходов различных кинетических компонентов. Кинетика быстрой фазы определяется изменением вероятности состояния фотосистемы 2 с водоразлагающим комплексом в высимм стабильном окисленном состоянии в ходе его ступенчатого окисления и выделения молекулы кислорода. Кинетика медленной фазы индукция определяется лимитирующим транспорт электронов процессом окисления пластохинона в ходе восстановления кислорода и включения цикла фиксации углекислого газа. Влияние мембранного потенци-

ала тилакоида на квантовый выход миллисекундного компонента замедленной флуоресценции в процессе индукции опосредовано внутри-мембранной разностью электрических потенциалов.

3. Максимальное потребление мембранного потенциала тилакоида в темновых реакциях наблюдается при полунасыщающей фотосинтез облученности. У растений в результате приспособления к росту в условиях недостатка света или селекции высокопродуктивных форм наблюдаются сходные изменения индукционных кривых замедленной флуоресценции, отражающие увеличение потребления анергии в темновых реакциях фотосинтеза. В основе этих изменений лежит перераспределение световой анергии в пользу фотосистемы 2.

4. Наиболее чувствительным к водному стрессу звеном фотосинтеза является транспорт электронов в фотосистеме 1. Вследствие его замедления при уменьшении содержания воды в листе усиливается фо-тоингибирование и безизлучательные потери энергии в фотосистеме 2.

Ь. Оптимальной для определения фотосинтетической продуктивности и чувствительности фотосинтеза к стрессовым воздействиям является регистрация индукции замедленной флуоресценции при полунасыщающей фотосинтез облученности.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены и обсуждеш на 6 Всесоюзной конференции по фотоэнергетике растений (Львов, 19В0); I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1902); Всесоюзной конференции "Согосингетическое выделение кислорода" (Пущино, 1903); Всесоюзной конференции "Устойчивость к неблагоприятным факторам среды и продуктивность растений" (Иркутск, 19о4); Всесоюзном симпозиуме "Связь метаболизма азота и углерода при фотосинтезе" (Пущино, 1906); Всесоюзном совещании "Люминесцентные катоды исследования в сельском хозяйстве и перерабатывающей промышленности" (Минск, 198&); Ь Всесоюзной конференции "Биология клетки" (Тбилиси, 1987); Всесоюзной конференции "Структурная динамика' биологических' мембран и ее роль в регуляции фотобиологических и рецепторных процессов" (Минск, 1980); 2й 1/билейном совещании и симпозиуме стран СЭВ "Исследование биогенеза, структуры и функции фотосинтетического аппарата в связи с преобразованием солнечной энергии" (Толбухин, 1908); Международной школе "Электромагнитные поля и биомембраны" (Плевей, 1909); Всесоюзном совещании "Спектральный состав света и продукционный процесс в упранля>. >'нх

- О -

условиях" (Красноярск, 1990); Всесоюзно!! школе-семинаре "Биотер-мохемилюминесценция" (Суздаль, 1990); Международной конференции "Фотосинтез и фотобиотехнология" (Пущино, 1991); 37 Практической конференции биомедицинского общества "Молекулярная и структурная основа регуляции фотосинтеза" (Лондон, 1991); Научном семинаре отдела биофизики лаборатории Хойгенса Лейденского университета (Лейден, 1991); 1Ь-20 Конференциях молодых ученых биологического факультета МГУ (Москва, 1964-1990) и.других конференциях.

Результаты диссертационной работы изложены в 4Ь публикациях в журналах Биофизика, Физиология растений, Биологические мембраны, РЪс^оеуп-ЬЬе-Ыса и других изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, семи глав, заключения, общих выводов и списка литературы (По названий работ на русском и 235 на английском языках); включает 103 рисунка, 4 схемы и 7 таблиц. Полный объем диссертации - 306 страниц, текста (без списка литературы) - 220 страниц.

ОСНОВНОЕ СОДКРЬШМЕ РАБОТЫ

В главе I рассмотрены основные теоретические положения, вытекающие из рекомбинационной теории происхождения вамедленной флуоресценции хлорофилла, а также проанализировано их соответствие имеющимся в литературе экспериментальным данным. Большое внимание уделено факторам, определяющим квантовый выход замедленной флуоресценции, изложены теоретические соображения, свидетельствующие о влиянии структуры светособирающей антенны фотосистемы 2 на выход люминесценции. Детально обсуждаются данные, касающиеся кинетики затухания замедленной флуоресценции и ее связи с процессами стабилизации и дезактивации энергии в первичных и вторичных реакциях переноса электронов. Совместно рассмотрены литературные данные о механизмах светоиндуцированных изменений переменной и замедленной флуоресценции с целью привлечения сведений о природе индукции переменной флуоресценции для объяснения индукционных явлений замедленной флуоресценции. В главе 2 более кратко изложен материал о действии факторов среды на замедленную флуоресценцию, при этом внимание акцентировано на методологических аспектах, в том числе использования замедленной флуорес-

цонции для оценки продуктивности растений. Проведенный анализ теоретических представлений и экспериментальных данных позволил выделить ряд вопросов, нуждающихся в дальнейшем изучении. Основными из них явились: (I) природа IbO-микросекундного компонента затухания ЗФ и причины высокого квантового выхода дезактивации энергии первичной донорно-акцепторной пары в фотосистеме 2; (2) происхождение милллсекундного компонента 'затухания замедленной флуоресценции и предшествующие состояния реакционного центра фотосистемы 2; (3) механизм влияния мембранного потенциала тилакоидов на замедленную флуоресценцию; (4) механизм светоиндуцированных изменений замедленной флуоресценции.

Б главе 3 приводится описание объектов, аппаратуры и методов исследования.

Для измерений использовали листья гороха, огурца, редиса, пшеницы и шпината, выращенных в гидропонной культуре, а также листья комнатных и диких травянистых растений, суспензии микроводорослей, выделенных хторопластов и мембран фотосистемы '¿. Ьодоросль сЫогяЗ-la vulgarie выращивали на среде Тамия, синезеленке водоросли Splrullna pictorials и Anabaona vnriabilln на средах Зарроука и Громова К- G. Хлоропласты класса С из листьев гороха выделяли по методу Веста и Вискича (Vieot, Y/lekich, 19СЪ ), из листьев шпина,-по методу, описанному в работе (Moiburg st al, 1Su4). Мембраны фотосистемы 2 ("BBY-particles") готовили из хлоропластов шпината при помощи модифицированного метода Бертольда (Chapman ot al, l9bb). Оптическая плотность суспензий микроводорослей при измерениях составляла 0.2/10 мм при 6о0 нм, концентрация хлорофилла в суспензнях хлоропластов и мембран - Ъ-20"мкг мл~*.

Замедленную флуоресценцию хлорофилла регистрировали при i омо-щи различных моделей автоматизированных фосфороскопов (Гехман, 19ВО) с задержками регистрации от 70 мке до О.Ь мс и сквачностлми возбуждения b, I и 0.2, сопряженных с ЭВД "i.^RA-60" или 1Ы ГС. Флуоресценцию от измерительного света или от актиничного света регистрировали одновременно с замедленной, флуоресценцией. Управление температурным режимом в процессе измерений осуществлялось программными средствами с точностью до О.Ь градусов, »¡сточниками возбуждающего света служили лампы hTIJ-lbO или hl'J-7o.

Измерения изменений поглощения при переходах темнота-сп-.т г

оптическом или ближнем ультрафиолетовом диапазоне регистрировали на однолуче-вом спектрофотометре, сопряженном, с ЭВМ 1РЛ РС вместе с флуоресценцией от возбуждающего света. Изменения светорассеива-ния под углом около ^0° измеряли непосредственно в кюветном отделении фосфороскопа, используя канал регистрации флуоресценции. Скорость транспорта электронов оценивали по изменениям выхода флуоресценции после добавления порции феррицианида (Раевский, 1575), кинетику транспорта электронов в начальный период освещения определяли по изменению поглощения ЙСИР в области 630 нм и ИРРИ в области 5Ъ0 нм.

Для импульсного возбуждения насыщающими вспышками использовали разрядную лампу с полушириной импульса 30 икс или лазер (532 нм,' 15 не).

Выделение кислорода измеряли электродом Кларка или модифицированным открытым платиновым электродом Полно с электродом сравнения при слабой поляризации в анаэробных условиях ( РИ^ег еЬ а1, 19Ьсз). Поглощение углекислого газа 1 меряли одновременно с индукцией замедленной флуоресценции при помощи радиоизотопного метода (Гладыиева, 1986) или в отдельных опытах на газоанализаторе "Цифра лит -4".

Количество повторностей при измерениях составляло 3-5 (люминесценция, газовый анализ), 10-15 (кинетика выделения кислорода), 20-50 (изменения поглощения). Количество повторностей при сравнительном анализе замедленной флуоресценции сортов пшеницы составляло 10-12 при трех.биологических повторностях. На рисунках представлены кинетические кривые, полученные в результате компьютерного усреднения. Точки на световых, температурных зависимостях и др. соответствуют средним значениям, в виде отрезков показаны стандартные отклонения.

В 4-7 главах иелоасеш и обсуждены результаты экспериментов.

1 лапа 4. Кижякка затухания замедленной флуоресценции в

миллим купоном диапазоне к ее связь с транспортом элекгроноп

Киньтиг.а затухания- замедленной флуоресценции (35) листьев го-рихи, хл^еллы, анабеин и хлссопластов гороха з стационарных ус-л:,м:л,< быть представлена в гиде су;:гм двух Экспоненциальных

><■'■ ¡сн-:Н? ;■. лмшгуди и кинетики затухания этих кемпочентоп у пе~

речисленных объектов были измерены в различных экспериментальных условиях при насыщающих фотосинтез облученностях. Время жизни микросекундного компонента увеличивалось в ряду: анабена, хлорелла, листья гороха, изменяясь от 150 до 350 мкс. У выделенных хлорол-ластов гороха время жизни микросекундного компонента ЗФ не менялось при добавлении акцептора электронов феррицианида, разобщителей или диурона, демонстрируя во всех условиях слабую зависимость от температуры (Е^ 0.05 эВ). Амплитуда этого компонента увеличивалась при ускорении оттока электронов от фотосистемы 2 (401). Она была наименьшей в среде с диуроном и наибольшей,- с феррицианидом и грамицидином. При нагревании суспензии хлоропластов амплитуда микросекундного компонента ЗФ и величина переменной флуоресценции снижались. Наклон температурной зависимости амплитуды микросекундного компонента в координатах Аррениуса не менялся в ответ на исменание скорости оттока электронов от ФС2 (Е^ 0.32 эЬ), но различался для величины переменной флуоресценции. В отличие от хло--ропластов, температурная зависимость амплитуды микросекундного компонента ЗФ нативнкх объектов была немонотонной с максимумом в области 20-30°С.

Действие температуры на время жизни миллисекундного компонента хлоропластов практически отсутствовало в среде с феррицианидом и грамицидином, но при замедлении оттока электронов от 4С2 в отсутствие разобщителя или искусственного акцептора становилось более выраженным, (рис. 1). Температурная зависимость этого параметра у нативнкх объектов была сходна с таковой хлоропластов в среде без акцептора электронов и демонстрировала чувствительность к удалению СО^ из газовой фазы. Амплитуда миллисекундного компонента в ; словиях, способствующих накоплению мембранного потенциала, гче-ла одновершинную температурную зависимость и снижалась под действием разобщителей (рис. I).

Сходная с амплитудой микросекундного компонента ЗФ температурная зависимость, по данным литературы, характерна для заключительной стадии окисления водоразлагающего комплекса (переход Эта реакция является наиболее медленной в СС2 и имеет характерное время в пределах 1-2 мс. Кроме того, температурная чувствительность обнаружена нами у кинетики выделения кислорода хлоропласта-ми, измеренной после третьей насыщающей вспышки света (¿0~ С.30 эВ)

<С, мс

16

24

ьг

А, о.е.

16 24 32 1:, °С

Рис. I. Температурные зависимости времени иизни и амплитуды мил-•лисекундного компонента кривой затухания 3$ хлоропластов гороха в среде без добавок (I), с 10~о»1 феррицианида (2), с феррици-

анида и Ю_ЬМ нигерицина; листа гороха (4). Облученность -ПО Вт м-2.

Ь

Ь

Изучение световой зависимости амплитуды микросекундного компонента ЗФ в условиях нелимитированного оттока электронов от <1С2 показало, что его появление наблюдается, когда время между попаданиями квантов в реакционный центр меньше чем 2.9 мс у хлореллы ц 6.3 мс у листа гороха и шпината. В дополнение к этим заметным различиям квантового выхода дезактивации было установлено, что поело насыщающей вспышки кинетика выделения кислорода более медленная у хлоропластов шпината, чем у суспензии хлореллы (время полувозрастания сигнала 35 и 15 мс, соответственно). При величина световой константы до 1500 наблюдался линейный рост амплитуды микросекундного компонента ЗФ (рис. 2).

Анализ полученнък данных позволил сделать заключение о том, что микросекундныГ и миллисекундннй компоненты ЗФ происходят в реакционных центрах ФС2, находящихся перед захватом кванта в состоянии Б-) (схема). С учетом изменения соотношения квантовых выходов компонентов в различных условиях транспорта электронов можно говорить о том, что их происхождение альтернативно и связано с различными переходами реакционного центра. Сделан вывод, что кинетика затухания быстрого компонента отражает рекомбинацию в паре фО^Г, протекающую по безизлучательному пути с квантовым выходом

Л, о.е.

Рис. 2. Амплитуда микросекундного компонента 31> после Ь мс освещения как функция константы скорости поступления квантов в реакционный центр (рассчитана по кинетике возрастания флуоресценции в среде с диуроном). 1 - клетки хлореллы, 2 - хлоропласта гороха. На вставке: кинетика выделения кислорода после насыщающей вспышки.

. <1мкс Ф _ 0.5мс

З'мс

' 5 но

-а

(5)

г мо

(6)

I

-о

ЧгГсц

Схеш, Перехода состояний реакционного центра йС2, в результата которых происходят ыикросекундный и миллисекундный компоненты 31.

более 0,9. ¡¡икетнка млллисекундноге компонента в условиях, когда скорость стабилизации энергии лимитируется реакциями донорной стороны &С2, отражает кинетику уменьшения количества реко!.'.би!!ируюи1,их пар при окпелошш хинонкого акцептора электронов. В случае, когда транспорт электронов лимитируется их оттоком от 102 (восстановленный пул пластохинона, облученность выше полунасищающсй (¡отоекг-тоз), кинетика затухания миллисекундного компонента замедляется и определяется обратной реакцией мо;::г.у первичны;.! и вторичном донорами электронов 'Ю2 при сохранении некоторого вклада прямо;", реа-ции. Последнее обстоятельство определяет уменьшение времени уиэни мил-лисе1ундного компонента за счет изменения вклада обеих констант скоростей при ускорении транспорта электронов. Сделано предположение о существовании связи между усилением дезактивации энергии у листьев при высокой плотности потока квантов и медленно!', кинетикой выделения кислорода. Этим обстоятельством мог.ет определяйся болзо высокий квантовый выход ЗЬ хлороиластов и лисп он по сравним® с хлореллой, что проявляется по относителшо более нппьоку соотношению сигнал/шум у носледней при сходных условиях ртч'п: I. г. .

Ь главе 4 приведены также данные, полученные при изучении ЗФ хлороаластов, трансаорт электронов п которых блокирован диуроноп. Обнаружено существование в этих условиях компонента затухания с ьшллиеекуйдным временем жизни, амплитуда которого возрастала при восстановлении Цд после включения света. Кинетика медленной фазы увеличения переменной флуоресценции в индукционный период, которая связывается с функционированием р-центров £С2, была сходной с кинетикой снижения амплитуды 1Ы)-микросекундного компонента Зф. Полученные результаты приводят к выводу о существовании стабилизации энергии в присутствии диурона и предположений о связи медленной фазы возрастания переменной флуоресценции после включения света со снятием тушащего действия PgbO'

Глава Ь. Механизм светоиндуцированных изменений замедленной флуоресценции и их связь с фотосинтезом

После включения прерывистого возбуждающего света выход 35 про-терпевает немонотонные светоиндуцироьанные изменения перед достижением стационарного уровня. Время жизни микросекундного компонента в( ходе индукции оставалось постоянным, а изменения амплитуды заканчивались после достижения интегральным сигналом фазы D . Время жизни миллисекундного компонента претерпевало немонотонные изменения, различающиеся по характеру у хлоропластов и листа. Различия индукционных кривых параметров 3S этих объектов начинались уже с фазы D (рис. 3). Таким образом, выход Зф в быструю фазу индукции имел больший вклад микросекундного компонента, чем в медленную фазу. Наличие ферментов и интермедиатов цикла фиксации CÜ£ в нагивных хлоролластах отражалось на индукции Зй с начала медленной фазы DPS .

Связь быстрой ¿азы индукции 35 с фотосинтезом. При измерении световой зависимости индукции било установлено, что выраженная быстрая ({аза появляется при величине световой константы более 360

у хлореллы и IVO у листа гороха. В начале индукции била зарегистрирована более быстрая субфаза с максимумом около 10-20 мс (I'). Ь результате одновременных измерений 35 и флуоресценции был'.1 обнаружено, что максимум субфагы I1 совпадает с промежуточ-m.'.v минимумом D флуоресценции, а положение основного максимума Gl,-'' i'i ой фа зн I ( 1Ь0 мс) - с фазой I., индукции флуоресценции

и миллисекундного (Я) компонентов ЗФ, времени жизни миллисекундно-го компонента (3) и переменной флуоресценции (4) хлоропластов (А) и листьев (Б) гороха. Облученность 90 Вт м , использована нелинейная шкала времени.

('Schreiber, Keubnuer, I9bb). Таким образом, начальное увеличение выхода ЗФ после включения света происходило на фоне реокисления U^. Измерение кинетики изменений поглощения в максимуме дифференциального спектра поглощения семихинона (32¡j нм) у препаратов мембран ФС2 и суспензии хлореллы показало, что Цд полностью восстановлен к моменту достижения максимума -I индукции флуоресценции. В ходе реокисления (фазаЮ) скорость выделения кислорода замедлялась. У хлореллы это Замедление имело ярко выраженный немонотонный характер и протекало в противофазе с изменением выхода 3$ в ходе быстрой фазы индукции (рис. 4). фаза ID индукции флуоресценции наблюдалась и в присутствии липофильного свободного радикала dfph , способного принимать электроны прямо от йд и сильно снижающего квантовый' выход восстановления пула пластохинона. В этих условиях но-лимитированного оттока электронов от ФС2 индукционная кривая скорости выделения кислорода не менялась.

Измерения состояния водоразлагапцего комплекса ФС2 по изменению поглощения марганца в области 295 и 300 нм показали сохранники степени окисленности, близкой к максимальной в течение по крайн'.ч. мере 200 мс после включения света.

На основании полученных данных было сделано заключение о тем, что фаза ID флуоресценции определяется замедлением дон;'.)íрпннч электронов и связанным с этим окислением Цд. 1а я: у и; ичит i V 1 1

Рис. 4. Светоиндуцированные изменения ЗФ (1), флуоресценции (2), поглощения в области 325 нм (3) и скорости выделения кислорода (4) клеток хлореллы. Облученность - 2Ь0 Вт м~ .

Рис. Ь. Светоиндуцированные изменения поглощения ЮРРН в зависимости от числа предварительных вспышек в суспензии мембранных частиц ФС2.

ливает и увеличение выхода .ЗФ.

С целью определения скорости оборота и выяснения природ лимитирующего в начале освещения транспорт электронов звена, была исследована зависимость кинетики увеличения количества выделенного кислорода от частоты импульсного освещения короткими насыщающими вспышками и от величины световой константы при освещении постоянным светом. Полученные в результате гиперболической экстраполяции полунасыщающие значения световых констант равнялись 2Ь0 для хлореллы и 140 с-* для хлоропластов шпината, тогда как при импульсном освещении эти значения оказались равными непосредственно константам скоростей выделения кислорода после одной вспышки. При этом минимальное время полувозрастания количества выделенного кислорода было одинаковым для данного объекта в разных режимах возбуждения. для объяснения наблюдаемых различий у хлореллы и хлоропластов было сделано предположение о влиянии кинетики выделения кислорода на скорость оборота 4€2 и привлечен предложенный ранее механизм ( ризгег et а1, : попадание квантов света в ФС2 раньше, чем закончится выделение молекулы кислорода, неэффективно с точки зрения выделения следующей молекулы. Именно это допущение, положенное в основу модельных рассчетов индукционных изменений концентраций гз и Б4 -состояний, а такие 0.д после включения света, позволило получить хорошее соответствие с экспериментальными данными об индукции флуоресценции и скорости выделения кислорода.

Измерение кинетики фотоиндуцированного восстановления свободного радикала DPPH в области ЬЬО нм и начальной кинетики электро-хромного сдвига поглощения каротиноидов при Ь20 нм в зависимости от числа предварительных вспышек, подтвердило предположение о том, что после переноса Ь-б электронов происходит резкое замедление транспорта. Мы считаем, что такое замедление связано с достижением З3 в ходе второго S-цикла. Необходимым условием является большая величина световой константы, достаточная для того, чтобы переходы Sq.,.-«-. „. S3 во втором цикле проходили быстрее, чем выделение молекулы кислорода (рис. Ь).

Амплитуда быстрой фазы индукции ЗФ имела сходную с амплитудой микросекундного компонента температурную зависимость и снижалась при добавлении ссср в 3-4 раза, в том числе в присутствии грамицидина. Кинетика, снижения амплитуда быстрой фазы напоминала кинетику распада S.3-состояний под действием FCCP ( Voo, 1990) с временем полуспада порядка секунд. Выключение света в момент времени, соответствующий максимуму быстрой фазы ЗФ, сопровождалось наиболее быстрой релаксацией фд/оросценщш от измерительного света, отри-г::ах>цаИ реокисление Од с участием высших окисленных состояний во-доразлагающего комплекса.

Соглисно предложенному объяснению полученных результатов, пи-нетика быстрой фазы индукции 3$ отражает изменение квантового выхода излучательной дезактивации состояния F^q^A' связанное с появлением и распадом G3-состояний после включения света. Субфаза 011 отражает увеличение вероятности S3-состояния в ходе первого цикла, a основная фаза,- в ходе второго цикла. Спад 1С связан с уменьшением вероятности S3-состояний донорного комплекса дг стационарной величины при восстановлении пластохинона и замедлении оттока электронов от SC2.

Связь медленной фазы индукции 35 с процессами фотосинтеза. Период увеличения выхода 34 в медленную фазу индукции (dp ) начинался вместе с завершающей фазой возрастания флуоресценции (i-jp), отражающей снятие тушения со стороны CCI ( Schrei^er ot al.li'VO). В это же время наблюдалось увеличение поглощения в области БСО нм и уменьшение выделения кислорода (рис. 6). Время полувозрастанил 31 в фазе dp имело наиболее раннее световое насыщение (около ненасыщающей фотосинтез облученности). Сделан вывол о то::, что тика фазы dp отражает окисление пула пластихинона m и уч:»"". \w. • v:- lb -

изменений поглощения в области 560 им (3) и выделения кислорода (4) клеток хлореллы. Облученность - 250 Вт

Рис. 7. Световая зависимость максимального (I), стационарного (2) уровней индукции ЗФ листа гороха, а также амплитуды индукционного спада PS (3) и стационарных изменен..Л светорассеивания в области 520 ни (4).

тохромного комплекса и ФС1 в ходе транспорта электронов на кислород. Ке раннее световое насыщение соответствует представлениям о том, что эта реакция является лимитирующей стадией транспорта электронов.

Время полуспада Зф п фазу РЗ имело сходнуз с временем полувозрастания световую зависимость. У выделенных хлоропластов фаза РЭ наблюдалась при высокой скорости транспорта электронов, в этих условиях выход Зф на медленной фазе индукции снижался под действием вачинсмицина. Нигерицин также уменьшал выход свечения, но без изменения кинетики к дленной фазы. Кинетика изменений светорассеивания в индукционный период была существенно медленнее, чем фазы ЗФ, и более соответствовала кинетике фазы РЗ или увеличения выхода ЗФ до стационарного уровня в среде с валиномицином. При изменении рН скорость возрастания 35 на фазе ЕР изменялась так же, как и скорость поглощения протонов тилакоидами и достигала максимального значения при рН б.ь. Температурная зависимость времени полуспа-

31 на фаге Рг у хлоропластов совпадала с зависимостью времени : распада диффузионного потенциала, возникающего вследствие до-

<.■ .¡'-пуп к суспензии на свету соли ^ЭО^.

- -

В разобщенных условиях выход ЗФ увеличивался при снижении рН, амплитуда этого увеличения была больше в Ке+^-содержащей среде. Действие Ие'1"1" на выход 32; было наиболее спльиыы при рН б.ь. В ответ на снижение концентрации в среде инкубации хлоропластов, кпнетнка фаза Р5 ускорялась. Изучение действия ионной силы и ионного состава среды на параметры индукции 34 показало участие поверхностного потенциала тилакоида, возникающего вблизи отрицательно заряженных групп спетособирающего хлорофилл-белкового комплекса, в индуцируемом солями изменении выхода Связь выхода З'Ь с величиной поверхностного потенциала определяется влиянием последнего пи виутримембракную разность электрических потенциалов тилакоида (Моргун, 19с!Ь). Данные о действии солей на выход ЗФ фиксированных глутаровым альдегидом хлоропластов позволили предположить, что изменения внутримембранной разности электрически потенциалов в ответ на изменение потенциалов водных фаз, опосредовано конформаци-онной подвижностью белков, несущих отрицательно заряженные группы. Ото обстоятельство, наряду с импульсным освещением, может быть, причиной замедления кинетики внутримембранной разности потенциалов (и выхода 35) по сравнению с кинетикой разности потенциалов между бодными фазами, измеряемой микроэлзктродным методом.

Сделано заключение о том, что изменение выхода миллисекундного компонента ЗФ в ходе медленной фазы индукции, отражает кинетику внутршембранной разности потенциалов. Увеличение этой разности при окислении пула плаетохинона связано с заполнением протонами буферной емкости тилакоида н высвобождением электростатически связанных ка'П'.онсс магния во внутреннею фазу тилакоида. Последующий осмос катиона о ^з тилакоида приводит к снижению внутримекОранной р .зиости потенциалов и выхода 35.

В отличие от хлоропластов, в ходе фазы РН ЗФ листа происходил., не только снижение амплитуды, но и уменьшение времени жизни миллисекундного компонента (рис. 3). Это связано с включением реакций темповой фиксации СОр. Тем не менее, как и у выделенных хлоропластов, спад РЗ листа определялся самой причиной этих процессов, то есть изменением ионного состава стромы хлоропласта. Об этом, в частности, свидетельствовало ускорение спида Г" при удалении СХ,1^. Амплитуда фазы РЯ листа (отношение Г:Ь' ) была значите; ль не болк.ж, чем хлоропластов. ¿е максимальное значение наблюдалось при по луня-сыщагсц«!! фотосинтез облученности. Увеличение облученности иь7- ¡1. •• ду насыщающей приоодило к ее снижению, ого было сшшаио с релл:

стационарной величины мембранного потенциала, приводиввкм к увеличению изменений спеторбссенвашш (рис. V). При отсутствии СО^ световая говпсглость отнии;инил Г:" листа становилась, как и у выделенных хлоропластоп, монотонной.

Сделан вывод о том, что амплитуда файл РЗ отражает потребление мембранного потенциала на осмотическую ц химическую работу. Максимальная о'1'{-'итпв:!ост1) иго использования в темповых реакциях фиксации СО^ имеет место при полунасыщающий фотосинтез облученности. С учетом экспоненциальной связи выхода 33) с величиной мембранного нотештала подлогам показатель доли мембранного потенциала, используемой и темнот« реакциях ( 4 ):

1п(Р:5)ц 1л(Г!т:Пп)

'> = 1 ~ ТТТП^ТГ.Г " * ~ Т.Н1РЙ7§^Т ' где иццекст "н" и 0.0 означает насшцшлую и полунасыщлгаую фотосинтез облученность (величина отношения Р:3 в последнем сяута г.'лк-сипая: на). Ег>и:я годурсграстлния 3"5 на .*зэя ПР мсу;т емть исполь-аовано для ои'.'екп сгехиснстрш переносчиков на лш/итируицей тргне-порт олектренов стадии (пйвсгохииоп/щгго.-.ром).

Сравнении спетгечх зависимостей отношения "Р«3 г, стационарной кинетики затухании 31 (по отношения интенсивности стечения в начале и концу кр;;зсй рщухзнпл) •/ раенцх оЗгоктсп. подтвердила заключение, что значение (Р«з)( наблыдсотся при по.ч^тстп'йЮ'яоИ скорость поглощения СО., п выделения кислорода облученности. В свою очередь, (¡ор1,;а соетовоГ. зависимости стационарной кинетики езтуго-нил '¿7/ Сила сходной со световьси крквкли фотосинтеза. Изучение световое .зависимости амплитуды спада ГЭ 35 хлореллы вместе с ин-иукцией флуоресценции показало, что при облученностях выч:е лолупа-сьттт?;} {огесинтез, увеличение стационарного выхода и снижение В'>Л!1М(ШУ отношения I'гЗ наблюдаются после прекращения фотохимпиес-к'н о тув-едая флуоресценции. 0 эти:; условиях добавление диурсиа не пыякпало увеличение выхода флуоресценции, а се энергозлвнеимоо тушение усиливалось. С учетом того, что восстановление пластохинона инпугирует процесс '[осфорилировапип белков светособирающего комп-г "кса и |н>( вход фотееинтетнческого аппарат") в состояние 2, было спр?;аюл1»хеьяв, что снижение оффективности использовании ме кГц янмог') потенциала в темповых реакциях и увеличение стационарн'Ч' "н ! I вяшюстя мембраны сряаано с перераспределением световой ..О' н I, ;,:,яу 4 СI.

- -Л -

I «ы £ Влиянии факторов среди на замедленную флуоресценцию ■.'!••[ ил ли

Ьчгинпо температуры. Приведены данные о действии температуры , 1-1 ■ . - II. при низкой облученности, когда ми л ли секундный компо-. 1Н' опухания отсутствует, при насыщающей облученности и иолу на-

■ ицающсй фотосинтез облученности (для нативных систем). При низкой

■ оиученности температурная зависимость ЗФ хлоропластом гороха была 1'лидной с зависимостью переменной флуоресценции. Онишме выходы ■)Ф при нагревании определялось ускорением оттока электронов от

Возрастание ЗФ при температурах выше 35°С наблюдалось у листа гороха и выделенных хлоропластов в среде с диуроном. У хлороплас-4ив оно было чувствительно к действию веществ, влияющих на работу донорной стороны ФС2 (гидроксилашш, ссср ). Сделан вывод о том, что увеличение выхода ЗФ при высоких температурах связано с нарушением допирования электронов к &С2, а дальнейший спад, наблюдаемый параллельно с ростом нулевой флуоресценции,- необратимым разрушением комплекса ФС2.

При насыщающей облученности температурная зависимость выхода ЗФ в максимуме и на стационарном уровне индукционной кривой хлоропластов определялась изменением амплитуда миллисекундного компонента затухания в связи с изменением величины мембранного потенциала. Снижение его выхода при нагревании при температурах выше 30° было связано с разобщающим действием температуры. Стационарная кинетика затухания ЗФ имела оптимум, соответствующий максимальной скорости транспорта электронов (около 40°С). Сходная зависимость наблюдалась и для соотношения амплитуд микросекундного и миллисе-кундного компонентов затухания. Положение максимума этого отношения сдвигалось у хлореллы и анабены в область более высоких температур при увеличении облученности и концентрации СС^ в среде. Относительная амплитуда фазы рз (р:в) индукции ЗФ хлоропластсв имела, как и скорость транспорта электронов, 'максимум при 40°С. У нативных объектов сходная температурная зависимость наблюдалась при насыщающей фотосинтез облученности, в то время как при полунасыщающей облученности температурный максимум отношения р;5 был сдвинут в область более низких (оптимальных для фотосинтеза) температур по сравнению с кинетикой атухания ЗФ.

В заключение раздела обсуждаются требования к условиям определения температурных зависимостей фото синтетических процессор, тем- 22 -

пературшого оптимума и температурной устойчивости фотосинтеза при помощи 3$ и режиме измерения индукции и изменений выхода в ходе сканирования температуры.

Влияние световых условий произрастания на индукцию замедленной флуоресценции хлорофилла. При обсуждении данных литературы намечены точки соприкосновения вопросов о механизмах приспособления к росту а условиях пониженного притока световой энергии и структурных особенностях фотосинтетического аппарата растений, опреде-лянцих высокий уровень фото синтетической продуктивности. Сделано предположение о том, что произрастание в условиях недостатка энергии должно сопровождаться не только повышением эффективности све-'• тосбора, но и эффективности использования энергии за-счет ее перераспределения между основными потребителями.

Для выяснения связи между изменениями структуры ¿[отосинтетичо-ского аппарата п параметра)/.и Эй, проводили исследования-свечения микроводорослей, выращенных при различных спектрах облучения и плотностях нотою! квантов. Объектами служили сннезеленые водоросли сиирулипа ц анабека, а такке хлорелла. Показано, что выращивание синззелокых водорослей при облучении синим сгзетом, поглощаемым преимущественно <101, приводит к перестройкам пигментного аппарата и перераспределен)!» световой энергии и пользу £С2. Следствием этого явилось увеличение потребления мембранного потенциала в темповых реакциях (параметров (Р:3)макс и 1 )» особенно при облучении светом '¿. Кроме того, полунасищающая фотосинтез облученность и световой оптимум отношения (Г:й)макс сдвигались в сторону гюнит.о-ния плотностей потока квантов. Наоборот, выращивание водорослей при облучении желтым светом приводило к преимущественному развитию сьетосборщиков ФС1, уменьшению указанных параметров 35 за счет увеличения стационарного мембранного потенциала и увеличению полунасищающей фотосинтез плотности потока квантов. Поскольку у выращенных на желтом свету водорослей при облучении синим светом снижался квантовый выход выделения кислорода и скорость нециклического трансаорта электронов, сделан вывод об увеличении вклада в мембранный потенциал циклического Потока электронов в ФС1.

ибнярулеМо, что выращивание синезеленых водорослей при низкой и(..|уч"нности приводит к изменениям индукции ЗФ, сходным с таковыми .-I ,.,'ц сл1'1', ьыращенных на синем свету, а при высокой кблуч'-иг-. • . 1 .- • ;> • сь->ту. Аналогичные по направленности ипм.ч|»1и>ч им

дукции 335 наблюдались у хлореллы. Кроме увеличения потребления мембранного потенциала при пониженной полунасыщающей плотности потока квантов у "теневой" хлореллы отмечено ускорение кинетики медленной фазы индукции..

Анализ полученных данных позволил заключить, что следствием приспособления водорослей к росту при низких плотностях потока квантов является перераспределения светосбора в пользу ФС2 за счет снижения количества реакционных центров ФС2. Зто приводит к увеличению отношения при полунасыщающей облученности и его уменьшению при насыщающей облученности. Уменьшение времени достижения максимума индукции (фазы СР ) связано, вероятно, с уменьшением пула пластохинона.

Проведено сравнительное изучение параметров люминесценции видов растений, постоянно произрастающих в сильно затененных (Гру-шаика малая, Майник двулистный и др.) и на открытых местах и склонах южной экспозиции (Вероника седая, осот, лебеда и др). Кроме этого, сравнивались параметры люминесценции листьев растений одного вида, взятых из различных мест обитания (Подорожник средний, Одуванчик лекарственный) и параметры люминесценции при их регистрации с разных сторон листа некоторых комнатных растений, ибнару-женные особенности 3® хлоропластов, функционирующих в условиях недостатка солнечной энергии, во всех вариантах сравнения были качественно сходными и соответствовали таковьм, наблюдавшимся у микроводорослей. К числу этих особенностей относится сдвиг светового оптимума амплитуды фазы РБ в сторону низких облученностей, увеличение отношения 'Р:3)ыакс 11 уменьшение отношения .^'^цин» увеличение параметра р и ускорение 1Р , СР и РБ- фаз индукции. Имело место также более высокое отношение выхода ЗФ в максимумах индукции £ Рг3), характеризующее удельную энергизованность мембраны тилакоида. После инфильтрации диурона в лист выход ЗФ и величина отношения выходов флуоресценции и ЗФ были выше у "теневых" растений (наибольшие различия были отмечены у тенелюбивых и светолюбивых растений). Диапазон значений параметра ^ простирался от 0.4Ь у майника до 0.2в у лебеды и осота. Увеличение стационарной энер-гиз-шанности мембран при насыщающей облученности у "теневых" растений сопровождалось замедлением скорости транспорта электронов, иб этом говорила более низкая скорость поглощения С0£ и пропорционально более низкое отношение интенсивностей ЗФ по кривой затухания на стационарном уровне индукции.

На основании анализа полученных результатов сделано заключение, что наблюдаемые особенности ЗФ "теневых" растений вызваны тем, что их фотосинтетический аппарат обеспечивает преимущественное поступление световой энергии к ФС2 за счет увеличения эффективного соотношения фотосистем »2 [псг]/Н1 [пси] (где и - число молекул светосборщиков данной фотосистемы, [пс]- концентрация реакционных центров). При этом соотношение самих реакционных центров изменяется в пользу ФС1 у"теневых" растений, в результате чего у них наблюдается повышенный уровень стационарной энергиэо-оанности мембран тилакоидоа в условиях светового насыщения.

Действие водного стресса на замедлэннуи Флуоресценции хлорофилла. Механизм действия водного стресса на ЗФ листа был исследован с целью выявления наиболее чувствительных к изменению содержания воды реакций фотосинтеза и параметров ЗФ. Водный стресс вызывали подсушиванием листьев на воздухе или путем прекращения полива растений. В первом случае использовали листья растений, обладающие различной водоудерживающей способностью (листья пшеницы, гороха, редиса, огурца). Действие подсушивания наблюдали при трех уровнях облученности: слабой, полунасыщающей и насыщающей. При слабой облученности уменьшение относительного содержания воды (ОСЬ) в листе до ~30% приводило к увеличению выхода ЗФ и переменной флуоресценции до уровня ниже наблюдаемого после инфильтрации диурона, за которым следовал спад свечения. При полунасыщающей облученности начальное снижение ОСВ сопровождалось ускорением кинетики индукции ЗФ, а также ИР -фазы индукции переменной флуоресценции при уменьшении максимального выхода свечения. Ь дальнейшем до ОСВ "Ь0% происходило увеличение выхода ЗФ в максимуме индукции с последующим спадом. При насыщающей облученности спад наблюдался при ОСВ менее 60$ без начального возрастания выхода ЗФ (за исключением листа огурца, выход ЗФ которого увеличивался при начальном обезвоживании на насыщающем свету). Сходный сдвиг начала снижения максимальной интенсивности в сторону больших значений ОСВ при увеличении об^ченности наблюдался и у переменной флуоресценции (рис. В). Это снижение было наиболее выраженным в случае использования длительных световых экспозиций при регистрации свечения (до Ь минут), но но сопровождалось замедлением фазы 1)Р переменной флуоресценции до ОСВ менее

Стационарный выход оФ на полунасьщающем свету увеличивался - -

I л

И О)

а о-« -

я

X

со 3

.(1.1

80 60

40 20

(2.0 ЪСи\»

1зо 60

осв,

Рис. 8. Интенсивность Зф и переменной флуоресценции в индукционном максимуме как функция относительного содержания воды в листе. Облученность (Вт м ): I - 4; 2 - 20; 3, 4 - 400 (продолжительность освещения в последнем случае & с и 3 мин, соответственно). Кривые нормированы по максимальному значению.

при обезвоживании до 40^ ОСВ. При насыщающей облученности наблюдался только спад 33 при снижении ОСВ менее Стационарная кинетика затухания ЗФ замедлялась сходным образом при обоих уровнях облученности.

Качественно сходные с листьями наземных растений изменения интенсивности ЗЬ на ыаксишльном и стационарном уровнях индукции на--блядаллсь у побегов водного растения Е1ог1еа садасИегш в ответ на увеличение кощентрации сахарозы. Немонотонные .изменения выхода Зф у вкделешшх хлоропластов гороха, одинаковые по направленно-сти с изменениями выхода 30 листа при подсушивании, вызывались уменьшением рН среда (с максимумом при рН 6.о). В этих условиях скорость восстановления ф>еррицианида снижалась. Увеличение ионной силы среды сопровождалось монотонным сни-дением выхода ЗФ.

Полученные данные привели к заключению о том, что наблюдаемые при подсушивании листа изменения ЗФ (за исключением исходного ускорения кинетиш) связаны с замедлением транспорта электронов в 4С1 ."* Причиной этого замедления является увеличение концентрации протонов в стреме хлоропластов после истощения ее буферной емкости вследствие потери воды. Замедление транспорта электронов может

лежать п основе неустьичного ингибирования фотосинтеза при увеличении водного дефицита листа. Кроме этого, оно является причиной усиления фютоингибированил и бесизлучагелыя« потерь энергии по механизму энергооависимого тушения флуоресценции в ¿'С2.

С учетом результатов исследования действия подсушивания на 3$ было изучено действие водного стресса, вызываемого прекращением полива. Объектами служили листья растений редиса и пшеницы. Ла 3—4 сутки после прекращения полива при полупасыщявшей фотосинтез облученности происходило увеличение отношения Г:8 . которое достигало максимального значения на 6-Ь сутки. -В дальнейшем в некоторых биологических повторностях величина »того, отношения ешка-лась, при этом на листьях растений наблюдались признаки отмирания тканей, ¡(осле прекращения полива возрастало значение показателя ij, что говорило сб увеличении потребления энергии в тепновкх реакциях фотосинтеза.

Действие мкнзшльюго голода на индумцда ряквллогеюй флуоресценции. Были измерены индукционные кривые 31- при полунасыщ.'Ш'-'.еЛ фотосинтез обдучзнности у листьеп редиса, выращенного на коп;, це-ьом песке, цеолитнок песке или их смеси при полире рпстпорог Кно-ua или водой. Между вариантами обнаружены различии по «едичш»? от--ношения (г:"),.акс» оиуеловлешют рззшчляуи стоцссиариого зкхорл Si1. Наибольшее потребление кам.^анногэ потенциала наблюдалось а варианте с наиболее напряженными усяошшки нглюрчльпого питания (кварцевый песок при полипа водой). В этом варианте листья растений характеризовались каиСольркк у д.; л ими (на площадь листа пли но отношении к флуоресценции) выходом 3S после инфильтрации дну-ропи. Сделано предположение, что причиной увеличения потребления кемЗриниою потенциала тндакокдос при миниральном голоде ялля-этол усиление расходования продукте;; tkuhoploc реакций фотосинтеза. С цель» проверки этого предположения наблюдались изменения индукцчи Ъй/ в условиях, способствующих усиленному потреблению продуктов фч.-тосш.тсза. й качество таких модельных условий использовали выдерживание ¡астений в темноте после длительного периода постоянного освещения, а также частичное удаление листьев. Было показано, чти поели выключения света у 35 листьев пшеница в течение нескольких часов происходит увеличение отношения Р:3 и сокращение периода времени появления вторичного максимума ЗФ в процессе ин-

н, . ¿¡¡шчтелыюн увеличение потреблении мембранного потенцп-

...... хлоронлистов наблюдалось по индукции ЗС третьего листа !ии-

1.1Ни поели удаления двух нижних листьев. При этом различия с кон-Ц'члом становились менее выриженними аосло 4 часоь ьыдерлиьания и п-мните но сравнению с 15-минутной темноьсй инкубацией перед р<листрацпей индукции 34. Кромо этого, наблюдались различия формы и амплитуда индукционной кривой высечек листа, взятых на разном расстоянии от его основания (для измерений брали листья через несколько дней после окончания роста).

Сделано заключение, что увеличение нагрузки на фотосинтети-чекий аппарат при стрессе и увеличении количества аттрагирующих центров оказывает влияние на индукцию ЗФ в 'основе которого лежит уменьшение пулов богатых энергией интермедиатов и продуктов фотосинтеза. Полученные результаты показывают, что выявление межвидовых и межсортовых различий ЗФ, адекватных структурным особенностям фотосинтетического аппарата, следует проводить утром или через несколько часоь выдерживания в темноте. Такая предварительная подготовка позволит избежать различий, связанных с внутритканевыми и межъярусными градиентами интермедиатов и продуктов фотосинтеза, способных по механизму обратной связи влиять на работу фотосинтетического аппарата.

Глава 7. Межсортовые различия индукции люминесценции

листьев пшениц.

Изученные сорта пшеницы имели различия по нескольким параметрам индукции ЗФ, а также стационарной кинетике затухания свечения (табл.). В частности, довольно большие различия были отмечены для амплитуды индукционного спада РЭ при гюлунасыщанцей фотосинтез облученности, тогда 1сак в условиях светового насыщения они были незначительны или отсутствовали. У некоторых сортов был обнаружен сдвиг светового положения отношения (Р!Э)макс в сторону низких обдученностей. В целом особенности индукции более продуктивных сортов пшеницы (увеличение отношений Р:Б , и величины показателя £ ) находятся в соответствии с особенностями индукции БФ растений, выросших в условиях недостатка света. Качественно сходные изменения у разных сортов наблюдались для таких показателей как скорость поглощения СО^ и кинетика затухания ЗФ в условиях светового насыщения, при отсутствии видимой

Таблица

Параметры фотосинтеза и ЗФ различных по продуктивности сортов пшеницы

Оя лртышанка 10 lipa с нояp-ская-ЬЗ Стала Ноэ

Урожайность, % 100 УЬ 94 86 73

поглощение (Х)р мг/г ср.в. час 4.7 5.1 4.2 4.6 4.2

хлорофилл общ. мг/г ср.в. i.47 1.76 1.44 l.bb 1.4В

отношение по кривой затухания 5.9Í0.7 9.1+1.2 4.9+0.3 Ь.6+0.6 5.0+0.4

<PtSW.c 12.6+1.0 il.0+1.6 10.7+1.1 9.О+0.7 9.2+0.6

(Г: 3) 1 мин ó.b 3.6 3.6 3.7 • 3.6

(Р: I} v 'макс o.i V.b 7.2 6.9 6.7

стационарная интененвн. 31 ü.O tí.O 10.2 11.2 12.1

облученность v (Í'-.S) b'"/¡Á <5 10 Ib ■ 10 ib

связи этих показателей с продукгивностьп у изученных сортов.

Исследование действия водного стресса при воздушном обезвоживании и прекращении полива у контрастных по устойчивости к засухе сортов Помпе.!! Саратовская-2У па индукцию ЗФ при полунасыщамдей

фотосинтез облученности показали, что величина отношения (PiS),,„„,

мак*

через 3 часа подсушивания снижается в больпей степени у неустойчивого сорта Помпа. После прекращения полива величина этого показателя возрастала значительно больсе у засухоустойчивого сорта Сарато вская-29. Сравнительное изучение действия водного стресса на индукции ЗФ одиннадцати сортов и селекционных номеров пшеницы показало, чти имеется хорошее, но не полное соответствие между [-есультатами определения чувствительности фотосинтеза к водноцу стргссу при воздушном подсушивании и прекращении полива. Отмечено, что примерно через неделю после прекращения полива, когда р< ;;ич;;нп отноо'М'.ич P:S у разных сортов достигала ероеп мякг-и-

аального значения, вариабельность отого показателя уменьшалась по сравнению с контрольными условиями, Увеличении величины отношения

Р i S вследствие прекращения полива у низкопродуктивпых сортов как правило было большим, чем у высокопродуктивных (интенсивных) сортов.

Обсуждение полученных результатов привело к заключению об определяющей роли устойчивости первичных фотосинтетических процессов к обезвоживанию в реакции на водный стресс целого растения. Изученные copra пшеницы демонстрировали нормальное распределение по оцениваемой методом 35 относительной устойчивости к водноцу стрессу, при этом один copt, характеризующийся высокой полевой засухоустойчивостью, оказался в группе сортов' с пониженной по сравнению со средним уровнем устойчивостью к водному стрессу. Сделан вывод о том, что устойчивость фотосинтетического аппарата к водному стрессу является удобным для селекции, но не достаточным условием засухоустойчивости пшеницы. Результаты изучения внутривидовых различии продуктивности и устойчивости показали, что повышенные по сравнению со средними значения соответствующих показателей являются альтернативными качествами фотосинтетического annapaïa и что функции продуктивности и устойчивости конкурируют за высокоэнергетические продукты фотосинтеза.

ЗАШЛаНИЕ

Положенный и работе материалы показывают, что замедленная флуоресценция хлорофилла является инструментом исследования фотосинтеза с широким спектром приложения. Параметры кривых затухания и индукционных криви;;; 35 могут быть использованы для определения км-нетики переноса электронов на разных стадиях зтого процесса, кинетики и относительных изменений мембранного потенциала тилакои-дов, а также изменений транспорта электронов и уровня энергизован-ности мембран под действием температуры, облученности и водного стресса. Что касается испольэопг'шг. 33 для сценки интегрального (физиологического) состояния растения, то при этом следует учитывать, насколько структурные или функциональные характеристики фо-тс,;г»:нтетичеС!<ого аппарата d конкретных условиях могут бить испол!-зеваш в качестве гг. азателя отого состояния. Ь большинстве случаев, определение активности и устойчивости процессов ¡^.тосинтеза 1.0030ЛЯ2Т дагь лишь обкую характеристику продукционного (рторут-

ла растения. Большие возможности метод замедленной флуоресценции предоставляет для наблюдения за динамикой состояния растения. Об этом, в частности, свидетельствует выявленная взаимосвязь параметров свечения с изменением напряженности работы фотосинтетического аппарата вследствие сдвигов в общем энергетическом балансе растения.

Результаты проведенных исследований дают основание говорить о возможности уложить все разнообразие экспериментальных данных в рамки едЛной концепции связи процессов стабилизации и излуча-тельной дезактивации энергии в ходе ее превращений при фотосинтезе. JJpn этом вопрос о природе процессов, ответственных за понижение эффективности стабилизации энергии в 5С2, но решен с желаемой однозначностью. Приходится говорить о нескольких возможных причинах усиления дезактивации, к числу которых следует отнести и процесс выделения кислорода из каталитического центра связывания воды. Б настоящее время данные о кинетике этого процесса находятся на стадии активного пересмотра средствами целого ряда методов. Оставляя открытой для критики количественны сторону измерений кинетики выделения кислорода после вспышки при низкой поляризации электрода, следует обрытить внимание на обнаруженные качественные различия кинетики этого процесса у хлоропласгов и клеток хлореллы. Эти различия позволяют объяснить меньший уровень дезактивации энергии при избытке световой энергии в СС2 хлореллы, а также особенности быстрой фазы индукции 35 у двух названных объектов.

Среди рассмотрен/нос-параметров индукции 3$ особый интерес представляет относительная величина потребления мембранного потенциала тилакоидов, измеряемая как нормированная амплитуда медленного индукционного спада свечения (фазы PS) или, более строго, как параметр ^ (стр. 21). Сравнение потерь энергии по измеряемым уровнял 35 дает информацию об эффективности энергетического сопряжения световых и темновых ферментативных реакций хлоропласта. АнзлиЗ данного показателя в связи с видовой спецификой фотосинтетического аппарата позволил наметить новый подход для определения фото-, синтетической продуктивности растений, основанный на оценке эффективности, а не интенсивности фотосинтеза. В целом результаты исследований показывают, что корректное определение параметров индукции : подразумевает необходимость предварительной трмнопой пп

дготовки объекта к регистрации. Ь то же время, процесс измерения показателя эффективности энергетического сопряжения может бить значительно облегчен и ускорен. Для этого можно исиольэо-ьать то обстоятельство, что основным определяющим его величину фактором является различие уровней стационарной энергизованности мембраны в зависимости от облученности. Рассчет можно производить на основе только одной максимальной интенсивности ЗФ после периода освещения светом полунасыщающей интенсивности, который явится "выравниванцим" состояние объектов фактором вместо темновой адаптации.

Следует заключить, что метод измерения индукции ЗФ не является оптимальным в качестве основы автоматизированных систем контроля за состоянием растений. Более перспективным в этом плане представляется подход, основанный на регистрации стационарных характеристик ЗФ (кинетики затухания и интегрального сигнала). В данном случае необходимо пожертвовать информативными возможностями ЗФ ради оперативности измерений и технологичности системы автоматизированного контроля за состоянием растения. Хорошей технической базой для реализации такого методического подхода является использование светодиодов с электронной системой модуляции циклов возбуждения и регистрации свечения. Высокая частота модуляции светодиодов позволяет существенно сократить задержку перед регистрацией свечения и тем самым увеличить уровень измеряемого сигнала на несколько порядков. Возбуждение светом невысокой интенсивности, не вызывающим существенных индукционных изменений фотосинтеза, позволяет измерять затухание в режиме накапливания и усреднения кривых и.свести к минимуму шумы регистрации. Устройства, работающие в таком режиме, дадут возможность оценивать скорость транспорта электронов и концентрацию активных реакционных центров ФС2{ они могут быть легко сопряжены с существующими системами регистрации переменной флуоресценции.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОдЫ

I. Затухание замедленной флуоресценции хлорофилла в миллисе-к;_,щном временном интервале определяется двумя кинетическими компонентами, отражающими потери энергии в процессе нормального функционирования ФС2. Потери энергии связаны с наиболее медленными этапами ее стабилизации на донорной стороне ФС2: заключится! ной

стадией окисления водоразлагающего комплекса и выделением молекулы кислорода. Ыиллисекундная люминесценция возникает в случае, когда скорость поступления квантов света в реакционный центр превышает скорость протекания этих реакций.

2. ЮС-200-микросекундный компонент затухания замедленной флуоресценции отражает кинетику безизлучательной рекомбинации в паре Р^, квантовый выход которой на порядок больше, чем излучатель-ной. Ниллисекундный компонент при отсутствии лимитирования оттока электронов от СС2 отражает протекание прямой реакции окисления Цд, а после восстановления пула пластохинона и замедления оттока электронов,- протекание обратной реакции между первичным и вторичным донорами электронов.

3. Быстрая фаза светоиндуцированных изменений замедленной флуоресценции связана с изменением квантовых выходов 100-200-микро-секундного и 1-миллисекундного компонентов при отсутствии лимитирования оттока электронов. В основе этого лежит изменение вероятности состояния 4С2 с водоразлагаицим комплексом в высшем стабильном окисленном состоянии (Мд). Данное состояние возникает в процессе ступенчатой стабилизации энергии в первом 5-цикле, а также во втором, если появляется быстрее, чем происходит выделение молекулы кислорода. Снижение вероятности состояния Мд связано с восстановлением пластохинона и замедлением оттока электронов

от 5С2.

4. Медленная фаза индукции замедленной флуоресценции связана с изменением квантового-выхода миллисекундного компонента, отражающего обратную реакцию на донорной стороне 4С2. Кинетика этой фазы определяется кинетикой внутримембранной разности электрических потенциалов тилакоида. Кинетика увеличения мембранного потенциала в фазу ИР определяется лимитирующей транспорт электронов реакцией окисления пластохинона в ходе транспорта электронов на кислород, а скорость возрастания отражает установление разности электрических потенциалов на мембране при заполнении буферной емкости тилакоида и увеличении электрического пртенциала обменных катионов во внутренней фазе.

и. Индукционный спад РЗ определяется снижением мембранного потенциала и ускорением транспорта электронов при включении цикла фиксации СОг,. Кинетика фазы РЗ отражает снижение мембранного потенциала, вызванное осмосом противоионов и синтепон АТФ, цпти'"

- Зо -

.ик-1/(;11 ь темповых реакциях. Амплитуда фазы Р5 определяется потреблением мембранного потенциала, наибольшая величина которого наб-лшднетен при иолунасыщающей фотосинтез облученности. При более вы-етаи облучешшстях происходит увеличение стационарной величины мембранного потенциала, связанное с перераспределением световой энергии в пользу &С1.

6. Следствием приспособления растений к росту при пониженной освещенности является увеличение потребления мембранного потенциала в темновых реакциях, увеличение удельной энергиэованности мембран и ускорение кинетики медленной фазы индукции. В основе указанных изменений индукции аамедленной флуоресценции лежит перераспределение световой энергии в пользу ФС2 за счет увеличения све-тосбора.

7. Межвидовые и межсортовые различия индукционных кривых замедленной флуоресценции наиболее значимы для величины показателя (Р8Б^»Дакс» отРажавЧего потребление мембранного потенциала при полунасыщающей фотосинтез облученности. Высокопродуктивные сорта пшеницы характеризуются параметрами индукции замедленной флуоресценции, сходными с таковыми у растений, произрастающих в условиях недостатка света.

8. Увеличение водного дефицита листа после начальной сти)^уля-ции приводит к замедлению транспорта электронов в ФС1, не связанно^ с закрыванием устьиц. Вследствие этого при высоких об^гченно-стях усиливается фотоингибирование ФС2. Фактором, вызывающим эти явления, является снижение рН в строме хлоропласта.

9. Водный стресс, минеральный голод и уменьшение количества листьев на растеши вызывает увеличение потребления мембранного потенциала в темновых реакциях фотосинтеза. Такое увеличение под действием водного стресса более выражено у засухоустойчивых сортов пшеницы, которые в норме характеризуются меньшей величиной потребления мембранного потенциала по сравнению с высокопродуктивными и неустойчивыми сортами.

Основные материалы диссертации опубликованы в работах:

Григорьев 1).С., Стельмах Е.Е., Моргун В.Н. Зависимость индукционных переходов миллисекундного послесвечения растений от условий регистрации// Тезисы докладов 6 Всесоюзной конференции по фотоэнергетике растений. Львов, 19о0, с. 29.

2. Григорьев Li.С., Моргун В.Н., Гладышева Е.Е. Природа связи индукционных переходов послесвечения с фотосинтезом у растений// Тезисы докладов I Всесоюзного биофизического съезда. Москва, 19о2, с. 314.

3. Григорьев U.C., Моргун В.Н., Гольд В.Ы., ГаевскиЯ H.A. Исследование светоиндуцированных изменений миллисенундного послесвечения хлоропластов гороха// Биофизика, I9ö2, т.27, в.6, с.973-976.

4. Григорьев U.C., Г'ладышева U.E., Моргун В.П., Гольд D.U. Световая зависимость индукционных переходов замедленной флуоресценции хлорофилла нативных систем// Физиология-растений, 1903, т.30, в. 2, с. 20I-26Ü.

э. Григорьев U.C., Знак H.ii., Моргун В.Н., Гольд В.М. Исследование связи кислородвыделяющей фун!сции растений с замедленной флуоресценцией хлорофилла// Тезисы докладов всесоюзной конференции "фотосинтетическое выделение кислорода". Пущино, I9U3, с. 18.

6. ¡яоргун В.П., Григорьев b.c., ГаевскиЯ H.A., Гольд В.М. Индукция послесвечения деконизированных хлоропластов гороха// Биофизика, 19оЗ, т. Zö, в. Li, с. 779-7Ö3.

7. Григорьев U.C., Моргун В.П., Знак H.L., Гладулева Е.К., Гехман A.B., Гольд В.14. Послесвечение как метод диагкостикик термоустойчивости растений// Тезисы всесоюзной конференции "Устойчивость к неблагоприятным факторам среда и продуктивность растений". Иркутск, 19о4, с. 129.

Ь. Моргун В.Н., Григорьев L.C., Знак H.D., Гладыаева Е.Ь. Замедленная флуоресценция-как показатель фотосинтетической активности растений// Труды li> конференции молодых ученых биол. фак. ИГУ. Иосква: ¡¿ГУ, I9u4, ч. I, с. 246-249-

5. Гольд В.М., Григорьев Ю.С., Гаевский H.A., Гладышева Е.Е., Белоног Н.П., Алешко Ü.H., Моргун В.Н. >1юминесцентнкй анализ конкурентных взаимоотношений основных терминальных акцепторов электронов при фотосинтезе// Тезисы докладов всесоюзного симпозиума "Связь метаболизма углерода и азота при фотосинтезе". Пущино, 19ЬЬ, с. oü.

10. Григорьев U.C., Ыоргун В.Н., Гехман A.B., Гольд В.М. Температурная зависимость транспорта ионов в фотосинтетических мембранах// Там же, е.. 96-97.

11. Знак Н.Ь., Гладашева ь.Е., Mopi-ун В.Н., Гольд В.М. Участии- зтурного и светового факторов в регуляции выхода зпмед-

,î.i •-•спеьцгя (астений// Труды 10 конференции молоди yw-

- -

ныл. биол. фак. (¿ГУ. М: МГУ, I9U6, ч. I, с. I50-Iü4.

12. Моргун В.Н., Григорьев iL.С., Гехман A.B., Гаевский H.A., Гольд Ь.Ы. Роль светособираюцего хлорофилл а/б-белкового комплекса в регуляции выхода замедленной флуоресценции// Биологические мембраны, I9U6, т. 3, ь. 2, с. Iüb-IbO.

. 13. Моргун Ö.H., Григорьев О природе катион-индуцирован-

ных изменений выхода замедленной флуоресценции хлорофилла: роль поверхностного потенциала// Труды 17 конференции мол. учен. биол. фак. МГУ. М: МГУ, ч. 3, с. lb-20. Аеп. в ВИНИТИ 15.0У.Ь6 )Йоь2-Ь.

14. Гладышева К.К., Знак H.ii., Моргун В.Н., Григорьев 'и.С.

О роли терминальных акцепторов электронов в регуляции выхода замедленной флуоресценции// Тезисы 2 всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки. Москва, 1986, с. 76.

15. Григорьев B.C., Моргун В.Н., Гехман A.B., Гольд В.М. Связь миллисекундной замедленной флуоресценции с первичными процессами фотосинтеза: влияние температуры// Физиология растений, 1986,

т. 33, в. I, с. Ib-22.

16. Гладаиева К.В., Гехман A.B., Моргун В.Н., Знак Н.Ю., Григорьев Ю.С. Изучение связи светоиндуцированных изменений замедленной фдуоресценции с фотосинтетической активностью растений// Труды 17 научной конф. мол. учен. биол. фак. МГУ. М: МГУ, ч. 3,

с. 11-15. Дел. в ВИНИТИ 15.09.86 К6662-В.

17. Моргун В.Н., Гехман .A.B., Григорьев Ю.С. Температурная зависимость люминесценции хлорофилла и первичных процессов фотосинтеза// Труды 5 всесоюзной конференции "Биология клетки". Тбилиси, из-юо ТГУ, 1987, ч. 1, с. 230-237.

18. Григорьев D.C., Знак H.L1,, Гладышева К.Е., Моргун В.Н., Гехман A.B. Об информационных возможностях замедленной флуоресценции растений// Тезисы докладов конференции "Изучение, охрана и рациональное использование природных ресурсов". Уфа, 19ü7, с. IIb.

19. Гехман A.B., Моргун В.Н., Знак Н.Ю., Григорьев Ь.С. Температурная зависимость микро- и миллисекундной замедленной флуоресценции хлоропластов и листьев гороха// Труды lö конференции мол. учен. биол. фак. МГУ "Проблемы современной биологии". М: МГУ, 1№7, ч.j2, с. 21-25.

20. Моргун В.Н.. Григорьев L.C. Замедленная флуоресценция как индикатор поверхностного потенциала и структурнга изменений свето-собирапдего хлорофилл-белкового комплекса// Тезисы 25 Юбилейного совещания и симпозиума "Исследование биогенеза, структуры и функ-

ции фотосинтетического аппарата в связи с преобразованием солнечной энергии". Толбухин - Болгария, 1968, с. ЬЗ.

21. Моргун В.Н., Григорьев Ь.С. Замедленная флуоресценция как индикатор поверхностного потенциала и структурных изменений светосо-биракхцего хлорофилл-белкового комплекса// Тезисы докладов всесоюзной конференции "Структурная динамика биологических мембран и ее роль в регуляции фотобиологических и рецепторных процессов". Минск, Институт фотобиологии АН БССР, i960, с. 94.

22. Моргун В.Н., Григорьев'Ю.С. Изучение электрических свойств тилакоидной мембраны с помощью замедленной флуоресценции хлорофилла// Физиология растений, 1988, т. 35, в. 5, с. 95Ь-961.

23. ¿олжиков C.B., Моргун В.Н. Влияние содержания воды в листе на первтные процессы фотосинтеза и лшинесценцют хлорофилла// Труду научн. конф. мол. учен. биол. фак. МГУ. М: ЫГУ, 1988, ч. 2,

с. 161-164.

24. Моргун В.Н., Гехман A.B., Знак Н.Ю. О природе мидро- и миллисекундной замедленной флуоресценции растений// Биофизика, 1990, т. ЗЬ, в. 2, с. 326-330.

2Ь. Моргун В.Н., Гехман Л.В., Григорьев U.C. Механизм светоин-дуцированных изменений миллисекундной замедленной флуоресценции хлорофилла// Материалы û научн. конф. мол. учен. Казанского ин-та биологии. Казань, Институт биологии казанского филиала /Л СССР, 1990, с. 149-1Ы.

26. Долздков C.B., Знак Н.Ю., Моргун В.Н. О возможности использования замедленной'флуоресценции хлорофилла как показателя энергетической эффективности фотосинтеза// Труда 20 научн. конф. мол. учен. биол. фак. МГУ. М: ИГУ, 1990, ч. I, с. 37-41.

27. Знак Н.Ю., Моргун В.Н., Гехман A.B. Методы и аппаратура фотолжинусцентной диагностика! фотосинтеза растений// Методические указания Всесоюзной пколы-семинара "Биотермохемилюминесценцня".

M, 1990, с. 91.

2Ь. Моргун В.Н., Дол-киков C.D. 0 природе световой зависимости милли со кун,оной замедленной флуоресценции растений// Физиология растений, 1990, т. 37, в. 6, с. 1072-1079.

29. Моргун В.Н., Доляиков С.В.Влияние быстрого обезвоживания листа на фотсс/.птетический транспорт электронов и мембранный потен-г. к а л тилакоидоп// физиология растений, 1991, т. 38, в. 4, с. 641-

M;. I n-M-wi' !;.<>., Моргун D.H., Пронина H.D. Стргтч-ич н(1ч-п"

« иОлышл фотосинтетического аппарата растений к различным услови-И1Л освещенности// Тезисы докладов и сообщений международной кон-^иренции "Фотосинтез и/фотобиотехнслогия". Лущино, 1991, с. 9.

31. Гаевскш": Н.А., Моргун Ь.Н. Использование переменной и замедленной флуоресценции хлорофилла для изучения фотосинтеза растений. Обзор// ймзиология растений, 1992, т. 39, в. 4.

32. liopiyn В.Н., .Долашков С.В., Знак Н.С. Использование замедленной флуоресценции хлорофилла для оценки фотосинтетической продуктивности v. устойчивости растений// Тезисы докладов 2 съезда Всесоюзного общества физиологов растений. Ы, 1992, ч. 2

33. Morgun V.ll., Gekhuan A.V. Soma aBpecta of the relation between membrane potential and chlorophyll delayed fluorescence// Electromagnetic fields and bionembranefl, Il-d Int. School. Abstracts. Pleven, 1909» p. 74

34. Morgun V., Znak II. Relation of delayed fluorescence of chlorophyll of plant with photosynthesis: light dependence// Phy-siologla plontaruai, 1989, v. 76, N3/2, p. 172

35. Horgun V.H., Doldshikov S.V. Hlgh-or.ergy otete of chloro-plaate naasured no function of light Induced changes of delayed fluorescence and energetic etteciivity of photosynthesis of pea leaves// Photosynthotlco, 1990, 24, H p. 556-562

36. Morgun V., Znak П., Doldjlkov 3. The relation of chlorophyll delayed fluorescence of plant with photosynthesis: light dependence// Current research in photosynthesis (ed. H. Baltechef-feky), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1990, p. 732-737

37. Morgun V., Leeuen P.J. ven, Hemelrijk P.I?., Gorkca H.J. тал. SI on release of photosynthetlc oxygen and klnetlcB of the oxygen gush// The Bolecular and structural basis of regulation In photosynthesis. 37-th Harden Conference of Biomedical Society, Abstracts. London, 1991. p. 48

30. Uorgun Y.N., Crlgor'er Y.S., Gekhman A.V. The relation of light Induced changes of chlorophyll delayed fluorescence and C02 fixation of plant// Fhotoeynthetica, 1991. v. 25, Я 6

39. Znak B.Y., Morgun V.H. Changes of photosynthetlc membrane po'_/?ntlal expenses in microalgae induced by chromatic and light adaptation// Photoaynthetica, 1992, v. 26, Я 6