Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка технологии получения иммобилизованного ферментного препарата и оценка эффективности его использования

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии получения иммобилизованного ферментного препарата и оценка эффективности его использования"

Солдатова Любовь Сергеевна

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА И ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

Специальность 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Улан-Удэ-2011

005009192

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» (КемТИПП)

Научный руководитель:

доктор технических наук, профессор Просеков Александр Юрьевич

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор Жамсаранова Сэсэгма Дашиевна

доктор химических наук, профессор Ананьев Владимир Алексеевич

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет инженерных технологий»

Защита диссертации состоится «23» декабря 2011 г. в 14:00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.039.02 при Восточно-Сибирском государственном университете технологий и управления по адресу: 670013, Республика Бурятия, г. Улан-Удэ, ул. Ключевская, 40-в, ауд. 251 (Зал заседаний ученого совета).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Восточно-Сибирского государственного университета технологий и управления.

Объявление о защите и автореферат размещены 22 ноября 2011 г. на официальном сайте ВАК Министерства образования и науки РФ: http://vak.ed.gov.ru/ и на официальном сайте Восточно-Сибирского государственного университета технологий и управления: http://www.esstu.ru/.

Автореферат разослан «22» ноября 2011 г.

Ученый секретарь у,

диссертационного совета Н.И. Хамнаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Ферменты широко используются в различных видах деятельности: медицине, сельском хозяйстве, химическом синтезе, пищевой промышленности. Промышленные процессы с применением ферментов внедрены, прежде всего, в фармацевтическую и пищевую промышленность. Повсеместное использование ферментов до последнего времени сдерживалось вследствие ряда причин, таких как снижение каталитической активности в процессе реакции, трудоемкость отделения ферментов от исходных реагентов и продуктов реакции, нестабильность ферментов при хранении и при действии различных факторов, высокая стоимость чистых ферментных препаратов.

Для их преодоления целесообразно использовать иммобилизованные формы ферментов, которые имеют ряд очевидных преимуществ перед растворимыми катализаторами.

В настоящее время достигнуты значительные успехи в технологии получения иммобилизованных ферментных препаратов для использования в различных областях деятельности. Для их широкого использования необходимо преодолеть ряд трудностей, в первую очередь связанных с использованием дорогостоящих реагентов и использованием многостадийных процессов, требующих значительных временных затрат и соответствующего оборудования.

В качестве носителей для иммобилизации ферментов в последнее время интерес представляют нанообъекты. Повышенное внимание к наноматериалам обусловлено тем, что при переходе в наноразмерное состояние происходит изменение ряда важных свойств вещества. Одним из главных факторов, определяющих физические характеристики наноразмерных объектов, выступает развитая поверхность, что способствует преобладанию поверхностных явлений. Благодаря своим размерам, сопоставимым с размерами клеток, вирусов, белков, ДНК, наночастицы могут приближаться к биообъекту, взаимодействовать и связываться с ним. Все вышеизложенное указывает на актуальность настоящего исследования.

Представленные результаты были получены в ходе исследований, проводившихся в 2009-2011 гг. в рамках следующих научных программ и проектов, участником и руководителем которых была соискатель: программа «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» («УМНИК»), государственный контракт №7221р/10112 «Разработка технологии получения циклических аминокислот из молочной сыворотки»; ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013, государственный контракт №П2064 «Разработка технологии получения органических наноком-позиционных носителей для выделения и иммобилизации биологических веществ»; ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013, государственный контракт №14.740.11.0475 «Разработка специфичных ферментных биосенсоров на основе нанообъектов для контроля качества пищевой продукции».

Цель и задачи исследований. Целью работы является разработка технологии получения иммобилизованного ферментного препарата химотрипсина и

оценка эффективности его использования.

Для достижения поставленной цели сформулированы основные задачи исследований:

- изучить физические характеристики и химический состав частиц РезС>4, используемых в качестве носителей для иммобилизации химотрипсина;

- оптимизировать параметры иммобилизации химотрипсина на немодифи-цированные частицы БезС^ и частицы РезС>4, модифицированные амино-и карбоксильными группами;

- охарактеризовать физико-химические свойства иммобилизованного ферментного препарата;

- разработать технологию получения иммобилизованной формы ферментного препарата;

- оценить эффективность применения иммобилизованного ферментного препарата химотрипсина при ферментативном гидролизе вторичного ке-ратинсодержащего сырья.

Научная новизна работы. Показано, что реакция гидролиза смеси хлоридов железа (II) и (III) в щелочной среде приводит к получению агломератов диаметром от 0,2 до 80,0 мкм, состоящих из частиц диаметром от 10 до 100 нм.

Установлен химический состав наночастиц, соответствующий формуле РезС>4. Показано, что обработка наночастиц РезС>4 аминопропилтриэтоксисила-ном приводит к модификации поверхности частиц реакционноспособными аминогруппами, а обработка полиакриловой кислотой - к модификации реакционноспособными карбоксильными группами.

Практическая значимость работы заключается в разработке методики, позволяющей упростить модификацию поверхности наночастиц РезС>4 реакционноспособными функциональными группами: карбоксильными в случае кар-бодиимидной иммобилизации и аминогруппами - в случае глутаральдегидной иммобилизации. Разработанная методика позволяет удешевить технологию получения иммобилизованного препарата и продуктов, полученных с его использованием.

Разработана технологическая схема получения кормовой добавки на основе химотрипсинового гидролизата кератина.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Физические свойства и химический состав частиц РезС>4, используемых в качестве носителей для иммобилизации химотрипсина.

2. Оптимальные параметры иммобилизации химотрипсина на немодифи-цированные наночастицы Ре304 и модифицированные аминогруппами и карбоксильными группами.

3. Физико-химические свойства иммобилизованного ферментного препарата.

4. Технология получения иммобилизованной формы ферментного препарата химотрипсина.

5. Оптимальные параметры гидролиза кератина иммобилизованным хи-мотрипсином.

6. Технологическая схема получения кормовой добавки на основе химот-рипсинового гидролизата кератина.

Апробация работы. Материалы по разработке технологии получения иммобилизованного ферментного препарата представлены на II Всероссийской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Пищевые продукты и здоровье человека» (г. Кемерово, 2009); на II Международном форуме по нано-технологиям Низпап^есИ (г. Москва, 2009); на Всероссийской конференции «Инструментальные методы для исследования живых систем в пищевых производствах» (г. Кемерово, 2009); на XXV Всероссийском открытом конкурсе научно-исследовательских, изобретательских и творческих работ «Национальное Достояние России» (г. Москва, 2010); на III Всероссийской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Пищевые продукты и здоровье человека» (г. Кемерово).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ, в том числе в отраслевых журналах, рекомендованных ВАК: «Фундаментальные исследования», «Достижения науки и техники АПК».

Получен патент на изобретение №2425879 «Способ получения поверхностно-модифицированных наночастиц для иммобилизации биологических веществ», подана заявка на получение патента №2009138371/10 «Способ иммобилизации протеолитических ферментов на наночастицах РезО,»» (приоритет от 16.10.2009).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из следующих основных разделов: введение, аналитический обзор, организация, объекты и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение, практическая реализация результатов исследований, выводы, библиографический список и приложения. Основное содержание работы изложено на 128 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы и 42 рисунка. Список литературы включает 172 наименования.

МЕТОДИКА ВЫПОЛНЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

Теоретические и экспериментальные исследования выполнены в соответствии с поставленными задачами в Научно-образовательном центре и на кафедре «Бионанотехнология» Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности». Общая схема исследований представлена на рис. 1.

Весь цикл исследований состоял из нескольких взаимосвязанных этапов. На первом этапе проводили анализ отечественных и зарубежных литературных данных по теме исследования, формулировали цель и задачи собственных исследований.

На втором этапе изучали физические характеристики и химический состав частиц РезО<(, являющихся объектом исследований. Анализу подвергали немодифицированные наночастицы Ре304 и наночастицы Рез04, поверхность которых предварительно модифицирована амино- и карбоксильными группами.

Изучали такие свойства носителя, как относительное распределение по размеру, удельная площадь поверхности, морфология поверхности, элементный состав поверхности.

Рис. 1. Общая схема проведения исследований

Следующий этап исследований посвящен выбору оптимальных параметров иммобилизации химотрипсина на модифицированные и немодифицирован-ные наночастицы БезО,).

Оптимизировали такие параметры процесса, как концентрация глутарово-го альдегида при иммобилизации химотрипсина на аминомодифицированных частицах БезОд, концентрация карбодиимида при иммобилизации химотрипсина на частицах Ре304, модифицированных карбоксильными группами, и концентрация химотрипсина. Кроме того, изучали влияние иммобилизации химотрипсина на оптимальные условия действия фермента: рН-оптимум, температурный оптимум.

Следующий этап исследований связан с характеристикой физико-химических свойств иммобилизованного ферментного препарата, таких как удельная активность, операционная стабильность, стабильность при хранении, константа Михаэлиса-Ментен К1П, максимальная скорость Ут, изменение энтальпии ДН, изменение энтропии ДБ, изменение свободной энергии Гиббса ДО.

На основании проведенных исследований разрабатывали технологию получения иммобилизованного ферментного препарата для использования в различных областях биотехнологии, а также технологическую схему получения кормовой добавки на основе химотрипсинового гидролизата кератина.

При выполнении исследований использовали стандартные и общепринятые методы исследований: просвечивающая электронная микроскопия, лазерная дифракция, определение белка по Дюма, спектрофотометрия, метод Бру-науэра-Эммета-Теллера, энергодисперсионный элементный анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Из известных в настоящее время магнитных носителей наиболее хорошо изученным является магнетит (РезОд). К наночастицам Рез04 проявляется широкий интерес вследствие ценных физико-химических и биологических свойств: сильные ферромагнитные свойства, высокая устойчивость к окислению, относительно невысокая токсичность по сравнению с другими наномате-риалами, легкость получения, химическая стабильность, отсутствие канцерогенных свойств, биодеградируемость. В связи с этим частицы Рез04 являлись объектом настоящих исследований.

На первом этапе исследовали физические параметры и химический состав необработанных частиц Ре304, полученных методом Массарта, и частиц РезО.1, обработанных полиакриловой кислотой и аминопропилтриэтоксисиланом. В ходе исследования установлено, что полученный порошок представляет собой жесткие агломераты размером от 0,2 мкм до 80,0 мкм, состоящие из наночастиц размером от 10 нм до 100 им (рис. 2).

Рис. 2. Микрофотография наночастиц Ре3С>4: а - увеличение х2 ООО, б - увеличение х20 ООО

Анализ удельной поверхности порошка Ре304 методом БЭТ позволил получить среднюю величину полной удельной поверхности порошка, равную 3,142 ± 0,103 м2/г. Результаты энергодисперсионного элементного анализа порошка Ре304 свидетельствуют о том, что химический состав полученного порошка действительно соответствует формуле Бе304.

Установлено, что обработка частиц Ре304 аминопропилтриэтоксисиланом приводит к модификации их поверхности реакционноспособными аминогруппами, в то время как обработка полиакриловой кислотой - к модификации карбоксильными группами. Модифицированные частицы Ре304 в последующем могут быть использованы для ковалентной иммобилизации ферментов.

В настоящей работе в качестве иммобилизуемого фермента использовался протеолитический фермент химотрипсин, широко применяемый в биотехнологической промышленности. Исследовали три способа его иммобилизации на поверхности частиц Ре304: глутаральдегидный, карбодиимидньш и адсорбционный.

\

\

V

ч

ч

\

V

ч.

а & * !1

\

\

\

ч

\

N

\

ч

\

Массовая доля глутарового альдегида, <

0.5 1,0 1,5 2, Массовая доля карбодиимида, %

Рис. 3. Зависимость массовой доли Рис. 4. Зависимость массовой доли

белка в контактном растворе от массо- белка в контактном растворе от мас-

вой доли конденсирующего агента - совой доли конденсирующего агента -

глутарового альдегида карбодиимида

Глутаровый альдегид - это наиболее широко распространенный конденсирующий агент, применяемый для активации поверхностей с аминогруппами. Для выбора оптимальной концентрации глутарового альдегида, используемого при иммобилизации химотрипсина на аминомодифицированной кремнийсо-держащей поверхности частиц РезСХ), проведена серия экспериментов, результаты которой представлены на рис. 3. Из рис. 3 следует, что оптимальная концентрация глутарового альдегида для иммобилизации химотрипсина на частицы Рез04 составляет 10%.

В качестве конденсирующих бифункциональных агентов при иммобилизации биомолекул широкое распространение получили карбодиимиды (соединения с общей формулой 1Ш=С=КК'). Результаты оптимизации концентрации Ы-циклогексил-Ы'-(п-диметиламиноциклогексил) карбодиимида при иммобилизации химотрипсина на частицах Рез04, модифицированных карбоксильными группами, представлены на рис. 4.

На основании результатов, представленных на рис. 4, для дальнейших исследований была выбрана концентрация Ы-циклогексил-М'-(п-диметиламиноциклогексил) карбодиимида, равная 1,0%, поскольку последующее увеличение концентрации конденсирующего агента приводит к насыщению системы.

Дальнейшие исследования направлены на определение оптимальной концентрации раствора химотрипсина, используемого для иммобилизации глута-ральдегидным, карбодиимидным и адсорбционным способами. Установлено, что оптимум активности иммобилизованного препарата во всех исследуемых случаях достигается при концентрации фермента 25%, выше которой не наблюдается значительных изменений в величинах активности препарата.

я £ £ & К

/ к

Л4

Л

г

11н Температурите

Рис. 5. Зависимость удельной активности нативного и иммобилизованного химотрипсина от величины рН (а) и температуры (б) реакции: 1 - нативный фермент; 2 -фермент, иммобилизованный на частицы РезС>4, модифицированные глутаровым альдегидом; 3 - фермент, иммобилизованный на частицы Рез04, модифицированные карбодиимидом; 4 - фермент, иммобилизованный на немодифицированные частицы РезС>4

Варьирование активной кислотности реакционной среды оказывает существенное влияние на активность фермента. В результате исследования рН-зависимости нативного и иммобилизованного химотрипсина показано, что ге-

терогенный катализатор проявляет максимальную каталитическую активность при рН 8,0 в случае всех рассмотренных методов иммобилизации (рис. 5-а), однако диапазон оптимальных значений рН при использовании глутаральдегид-ного и карбодиимидного методов иммобилизации значительно шире (6,3-9,2 для глутаральдегидного способа и 7,0-9,1 для карбодиимидного), чем для на-тивного химотрипсина (наблюдается существенное снижение ферментативной активности при рН ниже 8,0 и выше 9,0).

Оптимальная температура действия нативного и иммобилизованного химотрипсина различна. Оптимум температуры смещен на 3°С в случае иммобилизации на немодифицированные частицы и на 5°С для фермента, иммобилизованного на частицы Ре304, модифицированные карбодиимидом или глутаровым альдегидом по сравнению с нативным химотрипсином (рис. 5-6). Кроме того, установлено, что для фермента, иммобилизованного на частицы Кез04, модифицированные глутаровым альдегидом, при температуре выше 60°С сохраняется 49% каталитической активности, в то время как нативный химотрипсин практически полностью инактивируется. Стабилизирующее действие наноча-стиц Без04 на химотрипсин, вероятно, обусловлено стабилизацией конформаци-онной структуры молекулы белка в результате его взаимодействия с нанообъектами.

Следующий этап исследований посвящен анализу таких физико-химических показателей иммобилизованного ферментного препарата, как удельная активность, операционная стабильность, стабильность при хранении, гранулометрический состав биокатализатора. Сравнительная характеристика химотрипсина, иммобилизованного на наночастицах Ре304 различными способами при ранее выбранных параметрах, представлена на рис. 6. В случае использования всех рассматриваемых вариантов иммобилизации (адсорбционного, глутаральдегидного и карбодиимидного) установлено, что инкубация фермента с наночастицами Рез04, модифицированными глутаровым альдегидом, в течение 6 ч приводит к переходу 78% изучаемого фермента в твердую фазу, в случае карбодиимидного метода этот показатель составляет 67%, а для адсорбционного способа - 33%.

к а

ц

о Ы о »

й Ё

2 2

V

V 1

ч

с>2

» ю 1? го з Продолжительность ннкубащгп, ч

Рис. 6. Зависимость массовой доли белка в контактном растворе от продолжительности иммобилизации химотрипсина: 1 - адсорбционный способ; 2 - кар-бодиимидный способ; 3 - глутаральдегидный способ

и

Сопряжение ферментных препаратов с наночастицами открывает новые возможности их отделения от реакционной среды и многократного использования с целью оптимизации технологических процессов. В этой связи было установлено, что исследуемый иммобилизованный фермент после 5-кратного использования в качестве катализатора сохраняет 79%, 63% и 23% протеолитиче-ской активности, соответственно, в глутаральдегидном, карбодиимидном и адсорбционном методах иммобилизации, что является дополнительным свидетельством эффективности ковалентного взаимодействия химотрипсина с нано-материалом.

На основании данных, полученных при исследовании стабильности ферментных препаратов при хранении в сухом, защищенном от света месте при температуре (4±2)°С (рис. 7), можно сделать вывод о снижении каталитической активности для всех исследуемых систем в процессе хранения. Полная инактивация отмечена для нативного фермента и химотрипсина, адсорбированного на наночастицах Ре304, по истечении 20 суток хранения. Таким образом, химическая иммобилизация химотрипсина на наночастицах Ре3С>4 приводит к стабилизации фермента, поскольку предотвращает саморазложение и лизис фермента.

Для иммобилизованного ферментного препарата значительный интерес представляют кинетико-термодинамические показатели, определяющие возможность протекания процесса в заданном направлении, поэтому на следующем этапе исследований изучали кинетические характеристики процесса, катализируемого иммобилизованным ферментом.

V

\

к 'п

X

б 0 5 10 15 20 25 30

Продолжительность хранения, сутки

Рис. 7. Зависимость каталитической активности химотрипсина от продолжительности хранения: 1 - фермент, иммобилизованный на частицы РезС>4, модифицированные глу-таровым альдегидом; 2 - фермент, иммобилизованный на частицы РезС>4, модифицированные карбо-диимидом; 3 - фермент, иммобилизованный на немодифицированные частицы РезС>4; 4 - нативный фермент

Рис. 8. График Лайнуивера-Бэрка для реакции гидролиза под действием нативного и иммобилизованного химотрипсина: 1 - нативный фермент; 2 - фермент, иммобилизованный на немодифицированные частицы Ре304; 3 - фермент, иммобилизованный на частицы РезО), модифицированные карбодиимидом; 4 - фермент, иммобилизованный на частицы Ре304, модифицированные глутаровым альдегидом

Результаты определения кинетических параметров действия иммобилизованного химотрипсина (Кш, Ут), рассчитанных на основании графика в двойных обратных координатах (графика Лайнуивера-Бэрка), представленные на рис. 8 и в табл. 1, свидетельствуют о том, что величина максимальной скорости для иммобилизованного фермента выше, чем для нативного химотрипсина.

При этом максимальная величина Ут была получена для фермента, иммобилизованного на частицы Ре304, модифицированные глутаровым альдегидом. Таким образом, в ряду нативный химотрипсин; химотрипсин, иммобилизованный на немодифицированные частицы Ре304; химотрипсин, иммобилизованный на частицы Ре304, модифицированные карбодиимидом; химотрипсин, иммобилизованный на частицы Ре304, модифицированные глутаровым альдегидом, отмечено увеличение эффективности иммобилизации и, соответственно, увеличение константы Ут (уменьшение Кт).

В то же время параметры Кт и Ут имеют эффективное значение и не позволяют однозначно оценить сродство фермента и субстрата. В исследуемом случае высокое сродство фермента и субстрата при глутаральдегидном способе иммобилизации, возможно, связано с информационными изменениями в молекуле фермента при иммобилизации, в результате которых создаются благоприятные условия для активного центра энзима.

Таблица 1

Кинетические параметры нативного и иммобилизованного химотрипсина, рассчитанные на основании графика Лайнуивера-Бэрка

Способ иммобилизации фермента Ут, мМ/(минмл) Кш, мМ

Нативный химотрипсин 1,406 0,946

Немодифицированные частицы Бе304 1,689 0,718

Частицы Ре304, модифицированные глутаровым альдегидом 2,506 0,694

Частицы Ре304, модифицированные карбодиимидом 1,942 0,765

Для иммобилизованного ферментного препарата исследовали термодинамические характеристики: величина сорбции, константа сорбции, изменения энтальпии (ДН) и изобарно-изотермического потенциала (ДО). По результатам исследований уровень взаимодействия химотрипсина с поверхностью носителя возрастает в ряду: немодифицированные наночастицы Ре304 - наночастицы Ре304, модифицированные карбодиимидом - наночастицы Ре304, модифицированные глутаровым альдегидом, а термодинамические характеристики свидетельствуют о том, что в случае ^модифицированных наночастиц фермент взаимодействует с поверхностью носителя за счет ван-дер-ваальсовых сил, а в случае модифицированных носителей - за счет химических взаимодействий.

Полученные экспериментальные данные позволили разработать технологическую схему получения иммобилизованного препарата ферментного химот-рипсина для использования в различных биотехнологических процессах.

ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕАЛИЗАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

В процессе получения основной товарной продукции на кожевенных, меховых, шерстеперерабатывающих предприятиях на отдельных этапах производства образуется большое количество побочных продуктов в виде скотоволо-са, щетины, очеса шерстяных волокон. Преобладающим структурным и химическим компонентом перечисленных выше побочных продуктов является фибриллярный белок - кератин. Наибольшая ценность данного сырья связана с высоким содержанием сырого протеина (85% в пересчете на сухое вещество) и наличием в нем серосодержащих аминокислот цистина и метионина.

Несмотря на имеющийся опыт сбора кератинового сырья, в настоящее время оно используется не полностью. Это обусловлено несовершенством методов его переработки.

В настоящей работе исследована возможность проведения ферментативного гидролиза кератинсодержащего сырья нативным и иммобилизованным химотрипсином в связи с последующим получением кормовых добавок с высокой биологической ценностью.

В ходе исследования изучали физико-химические параметры гидролиза кератина нативным и иммобилизованным химотрипсином, молекулярно-массовое распределение пептидов в гидролизатах кератина, динамику накопления свободных аминокислот в процессе ферментативного гидролиза кератина, аминокислотные последовательности в высвобождаемых фрагментах при рациональных параметрах гидролиза кератина иммобилизованным химотрипсином.

а Продо.гмлтега.ностъ лиршпюа. ч

о Продолжительность гидролиза. 'I

Рис. 9. Зависимость степени гидролиза кератина нативным (а) и иммобилизованным (б) химотрипсином от продолжительности гидролиза при фермент-субстратном соотношении: 1 - 1:25, 2 - 1:50, 3 - 1:100

Установлено, что наиболее оптимальными параметрами гидролиза кератина иммобилизованным химотрипсином являются следующие: фермент-субстратное соотношение 1:50 и продолжительность гидролиза от 12,00±0,05

до 24,00±0,05, поскольку степень гидролиза в этом случае составляет 35,17 -40,44%. Повышение соотношения фермент-субстрат нецелесообразно, поскольку приводит к незначительному повышению степени гидролиза при большем расходе дорогостоящего фермента (рис. 9).

М 1:25 1:5» 1:10« М 1:25 1:50 1:100

Рис. 10. Молекулярно-массовое распределение пептидов при ферментативном гидролизе кератина нативным (а) и иммобилизованным (б) химотрипсином при фермент-субстратных соотношениях 1:25, 1:50 и 1:100, продолжительности гидролиза 12,00±0,05 и 24,00±0,05 ч, температуре 40°С и рН 8,0

Изучение молекулярно-массового распределения пептидов в гидролиза-тах казеина, полученных под действием нативного химотрипсина, показало, что при всех рассмотренных фермент-субстратных соотношениях в процессе гидролиза кератина происходит перераспределение пептидных фракций. С увеличением продолжительности процесса ферментации количество пептидных фракций с молекулярной массой 55,0 кДа уменьшается, что сопровождается увеличением количества низкомолекулярных пептидов (рис. 10-а).

Что касается иммобилизованного химотрипсина, накопление низкомолекулярных пептидных фракций в этом случае происходит интенсивнее, чем при использовании нативного химотрипсина (рис. 10-6).

Изучение динамики накопления свободных аминокислот в процессе гидролиза кератина нативным и иммобилизованным химотрипсином свидетельствует о том, что в обоих случаях наблюдается накопление свободных аминокислот в процессе гидролиза. Однако процесс гидролиза кератина иммобилизованным химотрипсином приводит к еще более интенсивному накоплению аминокислот, чем в случае нативного фермента. Так, при фермент-субстратном соотношении 1:25 и продолжительности гидролиза 24,00±0,05 ч общее содержание свободных аминокислот в первом варианте эксперимента (нативный фермент) составляет 69,72 г/100 г белка, а во втором варианте (иммобилизованный фермент) это значение равно 89,22 г/100 г белка.

Таблица 2

Внешний вид, органолептические и физико-химические показатели иммобилизованного химотрипсина

Наименование показателя Значение показателя

Теоретическая формула носителя Ре304

Внешний вид Черный порошок

Запах Специфический, свойственный животным протеазам, без посторонних запахов

Гранулометрические размеры частиц, нм 10-100

Химический состав, %: Железо, не менее Кислород Различные примеси Белок, мкг/мг частиц 45,0 20,0 0,01-0,05 55,0

Протеолитическая активность, ед/мг 47,0

Массовая доля влаги, %, не более 2,0

рН-оптимум 8,0

Температурный оптимум, °С 40,0

В результате изучения аминокислотных последовательностей пептидов, образующихся при гидролизе кератина иммобилизованным химотрипсином, идентифицирован фосфопептид с последовательностью аминокислот Arg-Glu-

Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-VaI-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-Ser(P)-Leu-Ser(P)Ser(P)-

Ser(P)-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg, который обладает функцией усвоения и стимулирования минеральных веществ в организме человека. Обнаружение в составе гидролизата кератина биологически активных пептидов открывает перспективы использования вторичного кератинсодержащего сырья при создании биологически активных добавок.

Таким образом, на основании анализа отечественной и зарубежной информации, а также собственных исследований, теоретически обоснована и экспериментально доказана целесообразность создания технологии кормовых добавок на основе гидролизатов кератина, полученных с использованием иммобилизованного химотрипсина. Полученный иммобилизованный химотрипсин по внешнему виду, органолептическим и физико-химическим показателям соответствует значениям, представленным в табл. 2.

ВЫВОДЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Установлено, что реакция гидролиза смеси хлоридов железа (II) и (III) в щелочной среде приводит к получению жестких агломератов состава Fe304 размером от 0,2 мкм до 80,0 мкм, состоящих из наночастиц диамет-

ром от 10 нм до 100 нм. Получена средняя величина полной удельной поверхности порошка Fe304, равная 3,142 ± 0,103 м2/г.

2. Оптимальные параметры иммобилизации химотрипсина на модифицированные и немодифицированные наночастицы Fe304: концентрация глута-рового альдегида - 10%, концентрация карбодиимида - 1%; концентрация химотрипсина - 25%. Установлено влияние иммобилизации химотрипсина на оптимальные условия действия фермента: pH и температуру.

3. Удельная активность химотрипсина, иммобилизованного адсорбционным способом, составляет 27,0 ед/мг, глутаральдегидным способом - 47,0 ед/мг, карбодиимидным способом - 45,0 ед/мг. Кинетические параметры иммобилизованного химотрипсина: Vm = 2,506 мМ/(минмл); Km = 0,694 мМ.

4. Оптимальные параметры гидролиза кератина иммобилизованным химот-рипсином: температура 35°С, pH 8,0, фермент-субстратное соотношение 1:50, продолжительность процесса от 12,ООН),05 до 24,00±0,05 ч.

5. Разработана технологическая схема получения кормовой добавки на основе химотрипсинового гидролизата кератина.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы: Статьи в журналах, рекомендованных ВАК:

1. Козлова, О.В. Изучение основных параметров гидролиза лактозы ферментными препаратами / О.В. Козлова, A.B. Крупин, JLC. Солдатова // Достижения науки и техники АПК.- 2009.- №5,- С. 68-69.

2. Сухих, С.А. Технология выделения и очистки L-фенилаланин-аммоний-лиазы / С.А. Сухих, О.О. Бабич, Л.С. Солдатова // Достижения науки и техники АПК,- 2010,- №9,- С. 78-80.

3. Солдатова, Л.С. Сравнительная оценка адсорбционного и глутаральде-гидного методов иммобилизации L-фенилаланин-аммоний лиазы на частицах Fe304 / Л.С. Солдатова, О.О. Бабич, А.Ю. Просеков // Фундаментальные исследования,- 2011,- №8,- С. 672-677.

Сборники научных трудов вузов, материалы конференций:

1. Солдатова, Л.С. Повышение каталитической активности и стабильности химотрипсина за счет ковалентной иммобилизации на магнитных наноча-стицах Fe304 / Л.С. Солдатова, О.О. Бабич // Техника и технология пищевых производств,- 2010,- №1,- С. 69-72.

2. Солдатова, Л.С. Особенности получения нанокомпозитных материалов для иммобилизации и фракционирования биологических веществ в молекулярной биологии, генной инженерии и пищевой промышленности / Л.С. Солдатова, О.О. Бабич, А.Ю. Просеков // Роснанотех-2009: сб. науч. работ,- М., 2009,- С. 810-811.

3. Солдатова, Л.С. Способ модификации наночастиц Fe304 для выделения биологических веществ // Проведение научных исследований в области индустрии наносистем и материалов: сб. науч. работ.- Белгород, 2009,- С. 73-76.

4. Бабич, 0.0. Разработка технологии иммобилизации 1,-фенилаланин-аммоний-лиазы на ферромагнитные наночастицы / О.О. Бабич, Л.С. Сол-датова, А.Ю. Просеков // Проведение научных исследований в области индустрии наносистем и материалов: сб. науч. работ.- Белгород, 2009.- С. 7.

5. Солдатова, Л.С. Применение поверхностно-модифицированных наноча-стиц Бе304 для иммобилизации биомолекул / Л.С. Солдатова, О.В. Муд-рикова, О.О. Бабич, Н.С. Величкович // Актуальные проблемы современной неорганической химии и материаловедения: нанохимия, наномате-риалы и нанотехнологии: сб. науч. работ.- Звенигород, 2009,- С. 50.

6. Солдатова, Л.С. Инновационная технология модификации наночастиц для выделения биообъектов // Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы: сб. науч. работ.- Белгород, 2009.- С. 61-64.

7. Солдатова, Л.С. Нанокомпозитный материал для иммобилизации и фракционирования ферментов в биотехнологии / Л.С. Солдатова, О.О. Бабич, А.Ю. Просеков // Наукоемкие технические технологии-2009: сб. науч. работ,- М„ 2009,- С. 84.

8. Солдатова, Л.С. Модификация карбодиимидного способа иммобилизации для повышения эффективности выделения ДНК на наночастицах Ре304 / Л.С. Солдатова, О.О. Бабнч // Эврика-2009: сб. науч. работ,- Новочеркасск, 2010.-С. 174-176.

9. Солдатова, Л.С. Ферментный биосенсор на основе наночастиц Ре304 для экспресс-анализа глюкозы при контроле качества пищевых продуктов / Л.С. Солдатова, О.О. Бабич // Национальное достояние России: сб. науч. работ,- М„ 2010,- С. 891-892.

10. Солдатова, Л.С. Нанокомпозитный материал для иммобилизации ферментов в молочной промышленности / Л.С. Солдатова, О.О. Бабич, А.Ю. Просеков // Переработка молока.- 2010,- №10.- С. 56-58.

11. Солдатова, Л.С. Безреагентный нанобиосенсор для количественного определения глюкозы на основе частиц Ре304 и глюкозооксидазы / Л.С, Солдатова, А.Ю. Просеков // Биотехнология: состояние и перспективы развития: сб. науч. работ,- М., 2011, С. 219-220.

Патенты

1. Патент №2425879 Российская Федерация, С12И 11/14. Способ получения поверхностно-модифицированных наночастиц для иммобилизации биологических веществ.- А.Ю. Просеков, Л.С. Солдатова, О.О. Бабич,-№2010105590/10; заявл. 16.02.2010; опубл. 10.08.2011.-Бюл. №22.

Подписано в печать 15.11.2011. Формат 60x86/16. Тираж 80 экз. Объем 1,1 п.л. Заказ №154.

Кемеровский технологический институт пищевой промышленности.

650056, г. Кемерово, б-р Строителей, 47.

Отпечатано в лаборатории множительной техники КемтТИППа.

650010. г. Кемерово, ул. Красноармейская, 52

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Солдатова, Любовь Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР.

1.1. Химотрипсин: структура молекулы и механизм катализа.

1.2. Классификация носителей для иммобилизации ферментов.

1.3. Классификация методов иммобилизации ферментов.

1.4. Особенности комплексной биотехнологической переработки керагинсодержащего сырья.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Организация выполнения работы.

2.2. Используемые материалы.

2.3. Используемое оборудование.

2.4. Методы исследований.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Изучение физических характеристик и химического состава частиц Ге304, используемых в качестве носителей для иммобилизации 52 химотрипсина.

3.2. Оптимизация параметров иммобилизации химотрипсина на немодифицированные частицы Ре304 и частицы Ре304, 63 модифицированные аминогруппами и карбоксильными группами.

3.3. Характеристика физико-химических свойств иммобилизованного ферментного препарата.

ГЛАВА 4. ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕАЛИЗАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

ИССЛЕДОВАНИЙ.

4.1. Изучение физико-химических параметров гидролиза кератина пера нативным и иммобилизованным химотрипсином.

4.2. Изучение молекулярно-массового распределения пептидов в гидролизатах кератина, полученных с использованием нативного и 87 иммобилизованного химотрипсина.

4.3. Изучение динамики накопления свободных аминокислот в процессе ферментативного гидролиза кератина нативным и иммобилизованным 92 химотрипсином.

4.4. Изучение аминокислотных последовательностей в высвобождаемых фрагментах при рациональных параметрах гидролиза кератина 101 иммобилизованным химотрипсином.

4.5. Использование полученных закономерностей при разработке кормовых добавок на основе ферментативных гидролизатов кератина.

4.6. Расчет экономической эффективности выработки кормовой добавки па основе кератинового гидролизата.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка технологии получения иммобилизованного ферментного препарата и оценка эффективности его использования"

Ферменты широко используются в различных областях деятельности: медицине, сельском хозяйстве, химическом синтезе, пищевой промышленности. Промышленные процессы с применением ферментов внедрены, прежде всего, в фармацевтическую и пищевую промышленность. В пищевой отрасли с участием ферментов идут процессы получения глюкозо-фруктозных сиропов, яблочной и аспарагиновой кислот, оптически активных Ь-аминокислот, безлактозного молока, Сахаров из молочной сыворотки и т.д. Однако повсеместное использование ферментов до последнего времени сдерживалось из-за таких факторов, как снижение каталитической активности в процессе реакции, трудоемкость отделения ферментов от исходных реагентов и продуктов реакции, нестабильность ферментов при хранении и под воздействием различных факторов, высокая стоимость чистых фсрмёйтааетшретщррядвпроблем, связанных с использованием ферментов, характерен для молочной промышленности. Важным сегментом молочной индустрии является сыродельная отрасль. Так, за 2009 год продажи сыра в России составили около 634 тыс. т. Основополагающей операцией в производстве сычужных сыров является ферментативное свертывание молока, в результате которого образуется сгусток, содержащий концентрат казеина и жира молока. Традиционно для этой цели используют молокосвертывающие ферментные препараты. На стадии образования молочного сгустка (свертывания молока) закладывается основа качества сыра и творога. Возможность лишь однократного использования ферментных препаратов и трудность их отделения от продуктов реакции представляют собой серьезный недостаток, который выражается, прежде всего, в значительных за тратах на приобретение протеолитических ферментов.

Одним из наиболее хорошо изученных протеолитических ферментов является химотрипсин - фермент, секретируемый из поджелудочной железы в тонкий кишечник в виде неактивного предшественника, или зимогепа, называемого химотрипсиногеном. Химотрипеиноген образован одной по-липепшдной цепыо, состоящей из 245 аминокислотных остатков. Цепь связана пячыо дисульфидиыми мостиками. Химотрипеиноген практически полное 1ью лишен ферментативной активности. Однако оп превращается в активный фермент, когда под действием трипсина расщепляется пептидная связь между аргинином-15 и изолейцином-16. Образующийся активный фермеш. называемый я-химотрипсином, действует затем на другие молекулы 71-химо I рипсина. В результате удаления еще двух пептидов образуется С1абильная форма фермента - а-химотрипсии. Особенность /денного процесса состоит в том, что расщепление лишь одной специфической пептидной связи превращает белок из каталитически неактивной формы в полностью активную.

Химо трипсин способен гидролизовать с высокой скоростью далеко не всякую пептидную связь. Он действует избирательно на пептидные связи, образованные карбоксильными группами аминокислот с ароматическими боковыми цепями — тирозина, триптофана и фенилаланина, а также аминокислот с гидрофобными остатками большого рашер}{щ(шир0оди1т1)шя описанных трудностей, связанных с применением-ферментных препаратов, целесообразно использование иммобилизованных ферментов. Начало этому методу было положено в 1916 году, когда Дж. Нельсон и Е. Гриффин адсорбировали на угле иивертазу и показали, что она сохраняс! в таком виде каталитическую активность. Сам термин «иммобилизованные ферменты» узаконен в 1971 году и означает любое ограничение свободы передвижения белковых молекул в пространстве.

Иммобилизованные ферменты имеют ряд очевидных преимуществ перед растворимыми катализаторами; это возможность отделения биокатализатора от реакционной среды, непрерывность проведения технологического процесса с направленным регулированием скорости и выхода реакции, целенаправленное изменение свойств фермента, высокая стабильность по о тношению к денатурирующим факторам окружающей среды.

В настоящее время достигнуты значительные успехи в разработке технологий иммобилизованных ферментных препаратов для использования в различных областях деятельности. По данным многочисленных исследований существует большое разнообразие органических и неорганических носителей и способов иммобилизации биомолекул на инертной матрице. Однако следует отметить не всегда эффективным использование дорогостоящих реагентов и многостадийных процессов, требующих значительных временных затрат и вьюокЗшаш1ШШ5БИШйогшп€рр§?дввж[шястве носителей для иммобилизации ферментов представляют нанообъекты. Повышенное внимание к папоматериалам обусловлено тем, что при переходе в наноразмерное состояние происходит изменение ряда важных свойств вещества. Одним из главных факторов, определяющих физические характеристики наноразмерпых объектов, выступает развитая поверхность, что способствует преобладанию поверхностных явлений. Благодаря своим размерам, сопоставимым с размерами клеток, вирусов, белков, ДНК, паночастицы могут приближаться к биообъекту, взаимодействовать и свя-зыват(Циж 1Йгоотехнологического применения наночастиц необходимо выполнить ряд требований, главным из которых является образование устойчивой коллоидной системы в водных растворах и других биосовместимых растворителях. Однако ввиду высокой реакционной активности для наночастиц практически не существует инертной среды. Одной из особенностей поведения наночастиц в растворе является их склонность к агрегации, поэтому практическое использование растворов наночастиц сопряжено с их стабилизацией (нанесение покрытия на поверхность магнитного «ядра», добавление стабилизаторов, подбор растворителей).

Помимо защиты от агрегации, окисления, кислотной и щелочной коррозии, покрытие может играть роль спейсера для присоединения биомолекул к носителю. Можно модифицировать поверхность наночастиц различными функциональными группами: азидо-, амино-, карбоксильными, сульфгидрильиыми, гидроксильными, имидными и другими, что позволяет ковалентно связывать наночастицы с биологическими веществами.

Важно отметить, что иммобилизация на поверхности наночастицы приводит к стабилизации биомолекул и служит защитой от деградации под воздействием различных факторов. Показано, что ДНК, иммобилизованная на поверхности наночастицы, сохраняет свою стереометрию и устойчива к действию нуклеаз. При иммобилизации белков и ферментов на паночастицах их стабилизация достигается, главным образом, за счет стабилизации конформационной структуры и предотвращения ферментативной деградации. Благодаря малым размерам соединение с наночастицей не приводит к денатурации белковых молекул.

Магнитные свойства наночастиц лежат в основе создания методов выделения и очистки нуклеиновых кислот и белков. На основе магнитных наночастиц разработаны методы пробоподготовки биообъектов для дальнейших исследований.

Цель и задачи исследований. Целыо работы является разработка технологии получения иммобилизованного ферментного препарата химотрипсина и оценка эффективности его использования.

Для достижения поставленной цели сформулированы основные задачи исследований:

- изучить физические характеристики и химический состав частиц 17е30,|, используемых в качестве носителей для иммобилизации химотрипсина;

- оптимизировать параметры иммобилизации химотрипсина на немодифицированиые частицы Ре30,| и частицы Ре30,|, модифицированные амино- и карбоксильными группами;

- охарактеризовать физико-химические свойства иммобилизованного ферментного препарата;

- разработать технологию получения иммобилизованной формы ф е р м е і гш о г о и р е 11 ар а га; оценить эффективность применения иммобилизованного ферментного препарата химотрипсина при ферментативном гидролизе вторичного кератинсодержащего сырья.

Научная новизна работы. Показано, что реакция гидролиза смеси хлоридов железа (II) и (III) в щелочной среде приводит к получению агломератов диаметром от 0,2 до 80,0 мкм, состоящих из частиц диаметром от 10 до 100 нм.

Установлен химический состав наночастиц, соответствующий формуле Ре30,|. Показано, что обработка наночастиц Ре30,і аминопропилтриэтоксисиланом приводит к модификации поверхности частиц реакционноспособными аминогруппами, а обработка полиакриловой кислотой - к модификации реакционноспособными карбойряюгншскр^ипамаиимость работы заключается в разработке методики, позволяющей упростить модификацию поверхности наночастиц Ре30,| реакционноспособными функциональными группами: карбоксильными в случае карбодиимидной иммобилизации и аминогруппами - в случае глутаральдегидной иммобилизации. Разработанная методика позволяет удешевить технологию получения иммобилизованного препарата и продуктов, полученных с его исполь-зовашйшработана технологическая схема получения кормовой добавки на основе химотрипсинового гидролизата кератина.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Физические свойства и химический состав частиц Ре30,ь используемых в качестве носителей для иммобилизации химотрипсина.

2. Оптимальные параметры иммобилизации химотрипсина на немодифицированные наночастицы Ре304 и модифицированные аминогруппами и карбоксильными группами.

3. Физико-химические свойства иммобилизованного ферментного препарата.

4. Технология получения иммобилизованной формы ферментного препарата химотрипсина.

5. Оптимальные параметры гидролиза кератина иммобилизованным химотрипсином.

6. Технологическая схема получения кормовой добавки на основе химотрипсинового гидролизата кератина.

Апробация работы. Материалы по разработке технологии получения иммобилизованного ферментного препарата представлены на II Всероссийской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Пищевые продукты и здоровье человека» (г. Кемерово, 2009); на II Международном форуме по нанотехнологиям ЯизпапоІесЬ (г. Москва, 2009); на Всероссийской конференции «Инструментальные методы для исследования живых систем в пищевых производствах» (г. Кемерово, 2009); на XXV Всероссийском открытом конкурсе научно-исследовательских, изобретательских и творческих работ «Национальное Достояние России» (г. Москва, 2010); на III Всероссийской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Пищевые продукты и здоровье человека» (г. Кемерово).

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Солдатова, Любовь Сергеевна

выводы

1. Установлено, что реакция гидролиза смеси хлоридов железа (II) и (III) в щелочной среде приводит к получению жестких агломератов состава Ре304 размером от 0,2 мкм до 80,0 мкм, состоящих из наночастиц диаметром от 10 нм до 100 нм. Получена средняя величина полной удельной поверхности порошка Ре304, равная 3,142 ±0,103 м2/г.

2. Оптимальные параметры иммобилизации химотрипсина на модифицированные и немодифицированные наночастицы Ре304: концентрация глутарового альдегида - 10%, концентрация карбодиимида - 1%; концентрация химотрипсина - 25%>. Установлено влияние иммобилизации химотрипсина на оптимальные условия действия фермента: рН и температуру.

3. Удельная активность химотрипсина, иммобилизованного адсорбционным способом, составляет 27,0 ед/мг, глутаральдегидным способом - 47,0 ед/мг, карбодиимидным способом - 45,0 ед/мг. Кинетические параметры иммобилизованного химотрипсина: Ут = 2,506 мМ/(мин-мл); Кт = 0,694 мМ.

4. Оптимальные параметры гидролиза кератина иммобилизованным химотрипсином: температура 35°С, рН 8,0, фермент-субстратное соотношение 1:50, продолжительность процесса от 12,00±0,05 до 24,00±0,05 ч.

5. Разработана технологическая схема получения кормовой добавки на основе химотрипсинового гидролизата кератина.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Солдатова, Любовь Сергеевна, Кемерово

1. Адсорбционная иммобилизация глюкоамилазы на амфотерных полиэлектролитах / И.В. Шкутина, О.Ф. Стоянова, В.Ф. Селеменев и др. //

2. Журнал физической химии.- 2001.- Т.75.- №11.- С. 2080-2010.

3. Андреева, И.Н. Иммобилизация ферментов и других биологически активных веществ: учебное пособие / И.Н. Андреева, A.B. Пантю-хин, Б.Б. Сысуев.- Пятигорск: Пятигорская государственная фармацевтическая академия, 2001.- 340 с.

4. Антипова, JI.B. Применение ферментов в переработке вторичного молочного сырья / Л.В. Антипова,- М: АгроНИИТЭИММП, 1992,- 234 с.

5. Антипова, Л.В. Использование вторичного коллагенсодержащего сырья мясной промышленности / Л.В. Антипова, И.А. Глотова.-Санкт-Петербург: Гиорд, 2006.- 382 с.

6. Антипова, Л.В. Биохимические характеристики ферментативного гидролиза кератинсодержащего сырья птицеперерабатывающей промышленности / Л.В. Антипова, Ч.Ю. Шамханов, О.С. Осминин // Известия Вузов. Пищевая технология.- 2003.- №5.- С.59-64.

7. Антипова, Л.В. Совершенствование технологии производства керопеп-тида из перо-пухового сырья / Л.В. Антипова, Ч.Ю. Шамханов, О.С. Осминин // Мясная индустрия.- 2004.- №3.- С. 44-47.

8. Артемьев, Ю.М. Введение в гетерогенный фотокатализ / Ю.М. Артемьев, В.К. Рябчук.- СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 1999.- 304 с.

9. Ю.Березин, И.В. Биотехнология: учебное пособие для вузов. Кн.7. Иммобилизованные ферменты / И.В. Березин.- M.: Высшая школа, 1987.- 159 с.

10. Березин, И.В. Введение в прикладную энзимологию / И.В. Березин.-M.: Изд-во МГУ, 1982.- 384 с.

11. Березин, И.В. Иммобилизованные ферменты. Современное состояние и перспективы. Т. 1 / под. ред. И.В. Березина, В.К. Антонова и К. Мартинека.- М.: Изд-во МГУ, 1976.- 296 с.

12. Березин, И.В. Инженерная энзимология / И.В. Березин, A.A. Клесов, В.К. Швядос.- М, 1987.- 187 с.

13. Березин, И.В. Исследования в области ферментативного анализа и инженерной энзимологии / И.В. Березин.- M.: Наука, 1990.- 234 с.

14. Березин, И.В. Основы физической химии ферментативного катализа / И.В. Березин, К. Мартинек М.: Высшая школа, 1977.- 280 с.

15. П.Большаков, О.В. Реализация концепции государственной политики в области здорового питания / О.В. Большаков // Холодильная техника.- 2000.-№1.- С. 10-12.

16. Варфоломеев, С.Д. Кинетические методы в биохимических исследованиях / С.Д. Варфоломеев, C.B. Зайцев.- М.: Изд-во МГУ, 1982.- 343 с.

17. Влияние режимов предварительной обработки на ферментативный гидролиз пера / В.Г. Волик, Н.М. Ильина, В.В. Алексенко и др. // Научные разработки в птицеперерабатывающей и клеежелатиновой промышленности: сб. науч. трудов.- М, 1985.- С. 70-73.

18. Волова, Т.Г. Биотехнология / Т.Г. Волова.- Новосибирск: Изд-во СО РАН, 1999,- 252 с.

19. Вудворд, Дж. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы / Дж. Вудворд.- М.: Мир, 1988.- 215 с.

20. Гершкович, A.A. Синтез пептидов. Реагенты и методы / A.A. Гер-шкович, В.К. Кибирев.- Киев: Наукова думка, 1987.- 264 с.

21. ГОСТ 20264.2-88. Препараты ферментные. Методы определения протеолитической активности.- Введ. 01.01.1989.- М.: Изд-во стандартов, 1988.- 15 с.

22. Грачева, И.М. Технология ферментных препаратов / И.М. Грачева.-М.: Агропромиздат, 1985.- 502 с.

23. Донченко, JI.B. Безопасность пищевого сырья и продуктов питания / J1.B. Донченко, В.Д. Надыкта.- М.: Пищевая промышленность, 1999.- 352 с.

24. Магнитные наночастицы: методы получения, строение и свойства / С.П. Губин, Ю.А. Кокшаров, Г.Б Хомутов и др. // Успехи Химии.-2005.- Т. 6.- С. 539-574.

25. Диксон, М. Ферменты / М. Диксон, Э. Уэбб.- М.: Мир, 1982.- 345 с.

26. Иванова, H.A. Развитие инновационных процессов в производстве и переработке молока: (на материалах Ульяновской области): монография / H.A. Иванова, В.Климова.- Ульяновск: ГСХА, 2007.- С. 47-65.

27. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы / С.П. Бодей, П. Броделиус, И.М.А. Кабрал и др.- М.: Мир, 1988.- 215 с.

28. Иммобилизованные клетки микроорганизмов / А.П.Синицын, Е.И Райнина, В.И. Лозинский и др.- М.: Изд-во МГУ, 1994,- 288 с.

29. Инихов, Г.С. Методы анализа молока и молочных продуктов / Г.С. Инихов, Н.П. Врио.- М.: Пищевая промышленность, 1971.- 424 с.

30. Карпов, О.В. Наночастицы в атмосферном воздухе. Методы измерения / О.В. Карпов, Д.М. Балаханов, Е.В. Лесников // Измерительная техника.- 2011.- №3.- С. 31-34.

31. Деградация 2,4-динитрофенола свободными и иммобилизованными клетками Rhodococcus erythropolis HL РМ-1 // А.Е. Китова, Т.Н. Ку-вичкина, А.Ю. Аринбасарова и др. // Прикладная биохимия и микробиология.- 2004.- Т. 40.- №3.- С. 307-311.

32. Зависимость термостабильности свободной и иммобилизованной глюкоамилазы от концентрации ионов водорода / И.В. Шкутина, О.Ф. Стоянова, В.Ф. Селеменев и др. // Журнал физической химии.-2001.- Т. 75.- №12.- С. 2292-2293.

33. Зб.Золотов, Ю.А. Основы аналитической химии. Книга 1. Общие вопросы. Методы разделения / Ю.А. Золотов, E.H. Дорохова, В.И. Фадеева.- М.: Высшая школа, 2002.- 351 с.

34. Кобаяси, Н. Введение в нанотехнологию / Н. Кобаяси М.: Бином. Лаборатория знаний, 2007.- 134с.

35. Ковалева, Т.А. Физико-химические и кинетико-термодинамичесикие аспекты свободной и иммобилизованной амилаз / Т.А. Ковалева.-Воронеж: ВГУ, 1998.- 421 с.

36. Коваленко, Г.А. Иммобилизация ферментов на углеродминеральных носителях. Некоторые закономерности адсорбционной иммобилизации ферментов / Г.А. Коваленко, М.П. Ванина // Биотехно л огия.-1997.- №4.- С. 3-24.

37. Коваленко, Л.В. Биологически активные нанопорошки железа / Л.В. Коваленко, Г.Э. Фолманис.- М.: Наука, 2006.- 124 с.

38. Кулис, Ю.Ю. Аналитические системы на основе иммобилизованных ферментов / Ю.Ю. Кулис.- Вильнюс: Моклас, 1981.- С. 110-123.

39. Ленинджер, А. Основы биохимии. Т. 1 / А. Ленинджер.- М.: Мир, 1985.-367 с.

40. Можаев, В.В. Иммобилизация ферментов как новый подход к решению фундаментальных проблем энзимологии /В.В. Можаев // Успехи биологической химии.- 1983.- Т. 24.- С. 99-134.

41. Москвичев, Б.В. Проблемы и перспективы применения иммобилизованных ферментов и других биологически активных веществ в медицине / Б.В. Москвичев, С.А. Шуколюков, A.A. Шучихина.- М.: Центральное бюро научно-технической информации, 1983.- 187 с.

42. Патент №3301992 Российская Федерация, МПК7, C12N11/16. Иммобилизованная каталаза / Благородов, С.Г.- №4953337/13, заявл. 03.06.1991, опубл. 30.07.1994, Бюл. №21.

43. Патент №2181770 Российская Федерация, МПК7, C12N11/08, 9/34. Способ получения иммобилизованной глюкоамилазы / заявитель и патентообладатель Воронежский госуниверситет.- №2000116346/13, заявл. 20.06.2000, опубл. 27.04.2002, Бюл. №12.- 6 с.

44. Патент №1572418 Российская Федерация, МПК7, C12N11/08. Способ получения иммобилизованных ферментов / Горленко, Л.Е.-№93008907/13; заявл. 16.02.1993; опубл. 20.02.1996, Бюл. №12.

45. Патент №1280834 Российская Федерация, МПК5, С07К17/00. Активированная матрица для иммобилизации белков / Зенюк A.A.; заявитель и патентообладатель Институт биоорганической химии АН БССР.- №3031253/14; заявл. 02.11.1981; опубл. 30.01.1994.

46. Патент №1314672 Российская Федерация, МПК6, С12Ш/56, С12Ш1/14, А2313/00. Способ получения белковых гидролизатов / Коваленко Г.А.- №3776134/13; заявл. 02.08.1984; опубл. 27.09.1999.

47. Патент №2026685 Российская Федерация, МПК6, А61К38/43. Способ получения высокопористой пенополиуретановой композиции с иммобилизованным трипсином / Кирпиченок Л.Н.- №5064945/14; за-явл. 13.10.1992; опубл. 20.01.1995.

48. Патент №2054481 Российская Федерация, МПК6, C12N11/08. Способ получения иммобилизованных ферментов / Горленко Л.Е.-№93008907/13; заявл. 16.02.1993; опубл. 20.02.1996.

49. Першина, А.Г. Использование магнитных наночастиц в биомедицине / А.Г. Першина, А.Э. Сазонов, И.В. Мильто // Бюллетень сибирской медицины.- 2008,- №2,- С. 70-78.

50. Повышение эффективности производства комбикормов / A.A. Шевцов, А.Н. Остриков, Л.И. Лыткина и др.- М.: ДеЛи Принт, 2005.

51. Полторак, О.М. Физико-химические основы ферментативного катализа / О.М. Полторак, Е.С. Чухрай.- М.: Высшая школа, 1971.- 311с.

52. Пушкарь, В.Г. Приготовление и применение магнитных сорбентов для изучения антигенов микроорганизмов / В.Г. Пушкарь, И.М. Климова, В.И. Ефременко: мет. рек.- Волгоград, 1984.- 15 с.

53. Сапожникова, А.И. Оптимизация получения кератинсодержащего препарата из овечьей шерсти / А.И. Сапожникова, О.В. Баранцева // Ветеринарная медицина 2009 - № 1-2 - С. 16 - 17.

54. Термоинактивация глюкоамилазы, иммобилизованной на амфотер-ных ионообменниках АНКБ-2 и АНКБ-35 / И.В. Шкутина, О.Ф. Стоянова, В.Ф. Селеменев и др. // Журнал физической химии.- 2001.1. Т. 75.-№12.-С. 2290-2291.

55. Тиховская, Н.В. Некоторые проблемы физики наночастиц / Н.В. Ти-ховекая, К.Н. Югай // Вестник Омского университета.- 2009.- №2.- С. 100-106.

56. Устинова, А.В. Мясные продукты для детского питания / А.В. Устинова, Н.В. Тимошенко М.: ВНИИ мясной промышленности, 1997 - 252 с.

57. Фершт, Э. Структура и механизм действия ферментов / Э. Фершт.-М.: Мир, 1980.-432 с.

58. Халгаш, Я. Биокатализаторы в органическом синтезе / Я. Халгаш.-М.: Мир, 1991.-204 с.

59. Хиггинс, И. Биотехнология / под ред. И. Хиггинса, Д. Беста, Дж. Джонса.- М.: Мир, 1988.- 479 с.

60. Черкасов, А.Н. Мембраны и сорбенты в биотехнологии / А.Н. Черкасов, В.А. Пасечник.- JL: Химия, 1991.- 239 с.

61. Шпигун, О.А. Новые высокоэффективные сорбенты для одновременного ионохроматографического определения разнозарядных ионов / О.А. Шпигун, О.В. Крохин, П.Н. Нестеренко // Информационный бюллетень РФФИ.- 1995.- Т. 3,- №3.- С. 337.

62. Activity of Candida rugosa lipase immobilized on gamma-Fe203 magnetic nanoparticles / A. Dyal, K. Loos, M. Noto, et al. // J. Am. Chem. Soc.-2003.- 125.-P. 1684-1685.

63. Acute toxicity and irritation of water-based dextran coated magnetic fluid injected in mice / Y. Zhai, X. Wang, X. Wang, et al. // J. Biomed. Mater. Res. A.- 2008,- 85.- P. 582-587.

64. A new method for the synthesis of magnetoliposomes / C. Sangregorio, J.K. Wiemann, C.J. O'Connor, et al. // J. Appl. Phys.- 1999.- 85.- P. 5699-701.

65. A new precursor for the immobilization of enzymes inside sol-gel-derived hybrid silica nanocomposites containing polysaccharides / Yu.A. Shchipunov, T.Yu. Karpenko, I.Yu. Bakunina, et al. // J. Biochem.

66. Biophys. Meth.- 2004.- №58.- P. 25-39.

67. Aniline dimer-COOH assisted preparation of well-dispersed polyaniline-Fe304 nanoparticles / X. Lu, Y. Yu, L. Chen, et al. // Nanotechnology. -2005.- 16.- P. 1660-1665. ,

68. Application of citrate-stabilized gold-coated ferric oxide composite nanoparticles for biological separations / P. Hien, T. Thao, C. Cao, et al. // J. Magn. Magn. Mater.- 2008.- 320.- P. 2049-2055.

69. Berry, C. Functionalisation of magnetic nanoparticles for applications in biomedicine / C. Berry, A. Curtis // J. Phys. D. Appl. Phys.- 2003.- V. 3.- P. 36.

70. Bioconjugation of papain on superparamagnetic nanoparticles decorated with carboxymethylated chitosan / Y.Y. Liang, L.M. Zhang, Y.Y. Liang, et al. // Biomacromolecules.- 2007.- 8.- P. 1480-1486.

71. Biofimctionalized magnetic nanoparticles for in vitro labeling and in vivo locating specific biomolecules / C.C. Wu, L.Y. Lin, L.C Lin / Appl. Phys. Lett.- 2008.- 92.- P. 142504-142504.

72. Bionanotechnology based on silica nanoparticles / W. Tan, K. Wang, X. He, et al. // Medicinal Research Reviews.- 2004.- V. 24.- №5.- P. 621-638.

73. Blood-specific whole-body electromagnetic hyperthermia / M. Babincova, P. Sourivong, D. Leszczynska, et al. // Med. Hypotheses.- 2000.- 55.- P. 459-460.

74. Bruce, I.J. Surface modification of magnetic nanoparticles with alkoxysilanes and their application in magnetic bioseparations / I.J. Bruce, T. Sen // Langmuir.- 2005,- V. 21.- P. 7029-7035.

75. Cao, X. Spindly cobalt ferrite nanocrystals: preparation, characterization and magnetic properties / X. Cao., L. Gu // Nanotechnology.- 2005.-№16.-P. 180-185.

76. Characterization, electrical and magnetic properties of polyaniline / maghemite nanocomposites / P. Dallas, N. Moutis, E. Devlin, et al. / Nanotechnology.- 2006.- 17.- P. 5019-5026.

77. Chaubey, G.S. Synthesis and stabilization of FeCo nanoparticles / G.S.

78. Chaubey, C. Barcena, N. Poudyal // J. Am. Chem. Soc.- 2007.- №129.- P. 7214-7215.

79. Chemical modification of alkalize precursors / C. Sanchez, J. Livage, M. Henry, et al. // Journal of Non-Crystalline Solids.- 1988.- 100,- P. 65-76.

80. Chen, S. Temperature-responsive agnetite PEO-PPO-PEO block copolymer nanoparticles for controlled drug targeting delivery / S. Chen, Y. Li, C. Guo // Langmuir.- 2007.- №23.- P. 12669-12676.

81. Cheng, J. Formulation of functionalized PLGA-PEG nanoparticles for in vivo targeted drug delivery / J. Cheng, B.A. Teply, I. Sherifi // Elsevier. -2008.- 28.-P. 869-876.

82. Chiang, C.L. Application of superparamagnetic nanoparticles in purification of plasmid DNA from bacterial cells / C.L. Chiang, C.S. Sung, T.F. Wu // J. of Chromatography B.- 2005,- V. 822.- P. 54-60.

83. Collection of trace amounts of DNA/mRNA molecules using genomagnetic nanocapturers / X.X. Zhao, R. Tapec-Dytioco, K. Wang, et al. // Anal. Chem.- 2003.- V. 75 (14).- P. 3476-3483.

84. Composition dependent magnetic properties of iron oxide-polyaniline nanoclusters / R. Sharma, S. Lamba, S. Annapoorni, et al. // J. Appl. Phys.-2005.- 97.-P. 014311-014311.

85. Connolly, J. Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine / J. Connolly, S.K. Jones, J.J. Dobson // Phys. D: Appl. Phys.- 2003.- 36.- P. R167-R181.

86. Dramatic increase in stability and longevity of enzymes attached to monodispersive iron nanoparticles / A. Sharma, Y. Qiang, J. Antony, et al. / IEEE Trans. Magn.- 2007.- 43.- P. 2418-2420.

87. Effect of growth temperature on the shape and crystallinity of chemically produced Fe-Pt nanoparticles / T. Hachisu, T. Yotsumoto, A. Sugiyama, et al. // Chem. Lett.- 2008.- 37.- P. 840-841.

88. Electrocatalysis of horseradish peroxidase immobilized on cobalt nanoparticles modified ITO electrode // C. Wei, M. Yang, J. Hu, et al. // Anal. Lett.- 2007.- 40.- P. 182-3194.

89. Examination of cholesterol oxidase attachment to magnetic nanoparticles / Kouassil G. K. et al. // Journal of Nanobiotechnology.-2005.- Vol. 3.- P. 354-356.

90. FTIR study of surfactant bonding to FePt nanoparticles / N. Shukla, C. Liu, P.M. Jones, et al. // JMMM.- 2003.- №266.- P. 178-184.

91. Fuentes, M. Detecting minimal traces of DNA using DNA covalently attached to superparamagnetic nanoparticles and direct PCR-ELISA / M. Fuentes, C. Mateo, A. Rodriguez // Biosensors and Bioelectronics.- 2006.- V. 21,- P. 1574-1580.

92. Functionalized magnetic micro- and nanoparticles: optimization and application to chip tryptic digestion / Z. Bilkova, M. Slovakova, N. Mine, et al. // Electrophoresis.- 2006,- 21.- P. 1811-1824.

93. Georgelin, T. Functionalization of Fe2Ü3 nanoparticles through the grafting of an organophosphorous ligand / T. Georgelin, B. Moreau, N. Bar // Sens. Actuat. B.- 2008.- 134.- P. 451-454.

94. Glaser, A.N. The chemical modification of proteins by groupspecific and site-specific reagents / A.N. Glaser // The Protein.-1976,-Vol. 2,-P. 1-103.

95. Gorin, D.A. Magnetic/gold nanoparticle functionalized biocompatible microcapsules with sensitivity to laser irradiation / D.A. Gorin, S.A. Portnov, O.A. Inozemtseva // Phys. Chem. Chem. Phys.-2008,- 10.-P. 6899-6905.

96. Gu, H. Biofunctional magnetic nanoparticles for protein separation and pathogen detection / H. Gu, K. Xu, C. Xu // J. of the American Chemical Society Chem. Commune.- 2006.- P. 941-949.

97. Gupta, A.K. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications / A.K. Gupta, M. Gupta // Biomaterials.- 2005,- 26.- P. 3995-4021.

98. He, X.X. Bioconjugated nanoparticles for DNA protection from cleavage / X.X. He, K. Wang, W. Tan // J. Am. Chem. Soc.- 2003.- V. 125,- P. 7168-1769.

99. Huang, S.H. Direct binding and characterization of lipase onto magnetic nanoparticles / S.H. Huang // Biotechnol. Prog.- 2003.- Vol. 19.- P. 1095-1100.

100. Hudson, B.J.F. Immobilized enzymes / B.J.F. Hudson // Chem. Ind.- 1975,- №2.- P. 1059-1060.

101. Immobilization of proteins and enzymes to fine magnetic particles / M. Koneracka, P. Kopcansky, M. Antalik, et al. // J. Magn. Magn. Mater. -1999,- V. 201,- P. 427.i

102. Immobilisation of synthetically useful enzymes by condensation polymerization / A. Pollak, R.L. Baughn, O. Adalsteinsson, et al. // J. Amer. Chem. Soc.- 1978.- №7.- P. 302-304.

103. Iron/iron oxide core-shell nanoclusters for biomedical applications / Y. Qiang, J. Antony, À. Sharma, et al. // Journal of Nanoparticle Research.- 2006.- №8.- P. 489-496.

104. Iron oxide nanoparticles-chitosan composite based glucose biosensor / A. Kaushik, R. Khan, P.R. Solanki, et al. // Biosens. Bioelectron.- 2008.- 24.- P. 676-683.

105. Ito, A. Medical application of functionalized magnetic nanoparticles / A. Ito, M. Shincai, H. Honda // J. of bioscience and bioengineering.- 2005.- V. 100.- P. 1-11.

106. Katz, E. Nanobiotechnology: integrated nanoparticle-biomolecule hybrid systems: synthesis, properties, and applications / E. Katz, I. Willne // Angew. Chem. Int. Ed.- 2004.- 43.- P. 6042-6108.

107. Kim, M.J. Functionalization of magnetite nanoparticles for protein immobilization / M.J. Kim, G.H. An, Y.H. Choa // Diffus. Defect Data, Pt. B.- 2007.- P. 895-898.

108. Kim, D.K. Protective coating of superparamagnetic iron oxide nonoparticles / D.K. Kim, M. Mikhaylova, Y. Zhang // Chem. Mater.- 2003.-V. 15,-P. 1617-1627.

109. Jeng, J. Using high-concentration trypsin-immobilized magnetic nanoparticles for rapid in situ protein digestion at elevated temperature / J. Jeng, M.F. Lin, F.Y. Cheng // Rapid Commun. Mass Spectrom.- 2007.- V. 21.-P. 3060-3068.

110. Liao, M.H. Immobilization of yeast alcohol dehydrogenase on magnetic nanoparticles for improving its stability / M.H. Liao, D.H. Chen // Biotechnology Letters.- 2001.- V. 23.- P. 1723-1727.

111. Li, Y. The synthesis of amine-capped magnetic (Fe, Mn, Co, Ni) oxide nanocrystals and their surface modification for aqueous dispersibility / Y. Li, M/ Afzaal, P. O'Brian // J. Mater. Chem.- 2006.-№16.-P. 2175-2180.

112. Lin, X.M. Synthesis, assembly and physical properties of magnetic nanoparticles /X.M. Lin, A.C.S. Samia // JMMM.- 2006.- №305.- P. 100-109.

113. Massart, R. Preparation of aqueous magnetic liquids in alkaline and acidic media // IEEE Trans. Magn.- 1981.- Mag-17, 2.- P. 1247-1248.

114. Majewski, P. Superparamagnetic magnetite (Fe3C>4) nanoparticles for bioapplications // P. Majewski, B. Thierry // Recent Pat. Mater. Sci.-2008,- l.-P. 116-127.

115. Martina, M.S. Generation of superparamagnetic liposomes revealed as highly efficient MRI contrast agents for in vivo imaging / M.S.

116. Martina, J.P. Fortin, C. Mefnager // J. Am. Chem. Soc.- 2005.- V. 127,- P. 10676-10685.

117. Molday, R.S. Immunospecifc ferromagnetic iron-dextran reagents for the labeling and magnetic separation of cells / R.S. Molday, D. MacKenzie // J.Immunol. Methods.- 1982.- V. 52.- P. 353-367.

118. Mornet, S. Magnetic nanoparticle design for medical applications / S. Mornet, S. Vasseur, F. Grasset // Prog. Solid State Chem.- 2006,- 34.-P. 237-247.

119. Mosbach, K. Enzymes bound to artifical matrixes / K. Mosbach // Sci. Am.- 1971.- №4.- P. 26-33.

120. Neiderberger, M. Organic reaction pathways in the nonaqueous synhesis of metal oxide nanoparticles / M. Neiderberger, G. Garnweitner // Chem. Eur. J.- 2006,- №12,- P. 7282-7302.

121. Niemeyer, C.M. Nanoparticles, proteins, and nucleic acids: biotechnology meets materials science / C.M. Niemeyer // Angew. Chem. Int. Ed.- 2001.- 40.- P. 4128-4158.

122. Niemeyer, C.M. Functional hybrid devices of proteins and inorganic nanoparticles / C.M. Niemeyer // Angew. Chem. Int. Ed.-2003.- 42,- P. 5796-5800.

123. Nicolais, L. Metal-polymer nanocomposites / L. Nicolais, G. Carotenuto // New York, Wiley Interscience.- 2005.- №43.- P. 300.

124. Novel method for immobilization of enzymes to magnetic nanoparticles / A. Johnson, A. Zawadzka, L. Deobald, et al. // Journal of Nanoparticle Research.- 2008.- №10.- P. 1009-1025.

125. Pankhurst, Q.A. Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine / Q.A. Pankhurst, J. Connoly, S.K. Jones // J. Phys. D.-2003.-№36,-P. 167-181.

126. Park, H.Y. Fabrication of magnetic core-shell Fe oxide-Au nanoparticles for interfacial bioactivity and bio-separation / H.Y. Park, M.J. Schadt, L. Wang // Langmuir.- 2007.- 23.- P. 9050-9056.

127. Peng, S. Synthesis and stabilization of monodisperse Fe nanoparticles / S. Peng, C. Wang, S. Sun // J.Am. Chem. Soc.- 2006.-№128.-P. 10676-1067.

128. Peng, Z.G. Selective and sequential adsorption of bovine serum albumin and lysozyme from a binary mixture on nanosized magnetic particles / Z.G. Peng, K. Hidajat, M.S. Uddin // J. Colloid Interface Sci.-2005.- 281.- P. 11-17.

129. Perez, J.M. Magnetic relaxation switches capable of sensing molecular interactions / J.M. Perez, L. Josephson, T. O'Loughlin // Nat. Biotechnol. 2002.- V. 20.- P. 816-820.

130. Polyaniline-coated Fe304 nanoparticle-carbon-nanotube composite and its application in electrochemical biosensing / Z. Liu, J. Wang, D. Xie et al // Small.- 2008.- 4.- P. 462-466.

131. Preparation and characterization of hydrophobic superparamagnetic magnetite gel / X. Liu, M.D. Kaminski, Y. Guan, et al. // JMMM.- 2006,-№306,- P. 248-253.

132. Preparation and application of polymergrafted magnetic nanoparticles for lipase immobilization / Y. Yong, Y. Bai, Y. Li, et al. // J. Magn. Magn. Mater.- 2008,- 320.- P. 350-2355.

133. Qiu, J. Ferrocene modified Fe304-Si02 magnetic nanoparticles as building blocks for construction of reagentless enzyme-based biosensors / J. Qiu, H. Peng, R. Liang // Electrochem. Comm.- 2007.- 9.- P. 2734-2738.

134. Rosevear, A. Immobilized biocatalysts a critical review / A. Rosevear//J. Chem. Technol. Biotechnol.- 1984.- 34 B.- P. 127-150.

135. Sergeev, G.B. Encapsulation of small metal particles in solid organic matrices / G.B. Sergeev, M.A. Petrukhina // Prog. Solid. St. Chem.- 1996.-№24.-P. 183-211.

136. Shchipunov, Yu.A. Hybrid polysaccharide-silica nanocomposites prepared by the sol-gel technique / Yu.A. Shchipunov, T.Yu. Karpenko // Langmuir.- 2004.- №20.- P. 3882-388.

137. Shukoor, M.I. Fabrication of a silicacoating on magnetic-Fe203 nanoparticles by an immobilized enzyme / M.I. Shukoor, F. Natalio, H.A. Therese / Chem. Mater.- 2008.- 20.- P. 3567-3573.

138. Silica- and alokoxysilane-coated ultrasmall superparamagnetic iron oxide particles: a promising tool to label cells for magnetic resonance imaging / C. Zhang, B. Wangler, B. Morgenstern, et al. // Langmuir.-2007.-№23.-P. 1427-1434.

139. Simple synthesis of functionalized superparamagnetic magnetite/silica core/shell nanoparticles and their application as magnetically separable high-performance biocatalysts / J. Lee, Y. Lee, J.K. Youn, et al. // Small.- 2008.- 4.- P. 143-152.

140. Size-controlled preparation of magnetite nanoparticles in the presence of graft copolymers / S. Wan, J. Huang, H. Yan, et al. // J. Mater. Chem.- 2006.- №16.- P. 298-303.

141. Skimer, K.J. Enzymes technology / K.J. Skimer // Chem. Eng. News.- 1975.-№5.-P. 23-42.

142. Stabilization of chymotrypsin by covalent immobilization on amine-functionalized superparamagnetic nanogel / J. Hong, P. Gong, D. Xu, et al. // J. of Biotechnology.- 2007.- V. 128.- P. 597-605.

143. Structural and magnetic properties of nanoscale iron oxide particles synthesized in the presence of dextran or polyvinyl alcohol / H. Pardoe, W. Chua-Anusorn, T. G. St. Pierre, et al. // J. Magn. Magn. Mater.- V. 225.- P. 41-46.

144. Sucking, C.J. Immobilized enzymes / C.J. Sucking // Chem. Soc. Rev.- 1976.- №6,- P. 215-233.

145. Surface modulation of magnetic nanocrystals in the development of highly efficient magnetic resonance probes for intracellular labeling / H.T. Song, J.S. Choi, Y.M. Huh, et al. // J. Am. Chem. Soc.- 2005.- 127.- P. 9992-9993.

146. Synthesis of magnetite (Fe304) nanoparticles without surfactants atroom temperature /1. Martinez-Mera, M.E. Espinoza-Pesqueira, R. Perez-Hernandez, et al. // Materials Letters.- 2007.- №56.- P.- 4447-4451.

147. Synthesis of highly stable folic acid conjugated magnetite nanoparticles for targeting cancer cells / S. Mohapatra, S.K. Mallick, T.K. Maiti, et al. // Nanotechnology.- 2007.- №18.- P. 385102-385111.

148. Taylor, J.I. Application of magnetite and silica-magnetite composites to the isolation of genomic DNA / J.I. Taylor, C.D. Hurst, M.J. Davies // J. of Chromatography A.- 2000.- V. 890,- P. 159-166.

149. The preparation of magnetic nanoparticles for applications in biomedicine / P. Tartaj, M.P. Morales, S. Veintemillas-Verdaguer, et al. // J. Phys. D.- 2003.- №36.- P. 182-R197.

150. Thermosensitive polymer coated nanomagnetic particles for separation of bio-molecules / N. Shamim, L. Hong, K. Hidajat, et al. // Sep. Purif. Technol.- 2007.- 53.- P. 164-170.

151. Thompkinson, D.K. Immobilisation of (3-galactosidase on macroporous anion exchange resin / D.K. Thompkinson // Bulletin of the IDF.- 1993.- №289.- P. 23-26.

152. Topoglidis, E. Factors that affect protein adsorbtion on nanostructured titania films. A novel spectroelectrochemical application to sensing / E. Topoglidis, C.J. Campbell, J.R. Durrant // Langmuir.-2001.-V. 17.-P. 7899-7906.

153. Wang, T.H. Immobilization of proteins on magnetic nanoparticles / T.H. Wang, W.C. Lee // Biotechnol. Bioprocess Eng.- 2003.- 8.- P. 263-267.

154. Using high-concentration trypsin-immobilized magneticnanoparticles for rapid in situ protein digestion at elevated temperature / J. Jeng, M.F. Lin, F.Y. Cheng, et al. // Rapid Commun. Mass Spectrom.-2007.-V. 21.-P. 3060-3068.

155. Xu, C. Dopamine as A robust anchor to immobilizefunctional molecules on the iron oxide shell of magnetic nanoparticles / C. Xu, K. Xu, H. Gu // J. Am. Chem. Soc.- 2004.- V. 126 (32).- P. 9938-9939.

156. Патент США №US006001587A, Int.Cl. C12P 1/00. Chemically specific patterning on solid surface immobilized enzymes / David C. Turner, Bruce P. Gaber.- №6,001,587; filed Apr. 8, 1997; Date of Patent Dec. 14, 1999.

157. Патент США №US20080293592A1, Int.Cl.C40B 40/04. Methods of covalently immobilising biomolecules on organic surface / Jürgen Ruhe, Holder Klapproth №US 2008/0293592 AI; filed Mar. 1, 2005; Pub. Date Nov. 27, 2008.