Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка системы доставки генетического материала с использованием микросфер
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология
Автореферат диссертации по теме "Разработка системы доставки генетического материала с использованием микросфер"
На правах рукописи
Белов Сергей Юрьевич
Разработка системы доставки генетического материала с использованием микросфер
03.02.02 Вирусология 03.01.06 Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Покров-2011 г.
1 6 ИЮН 2011
4850471
Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВВиМ Рос-сельхозакадемии).
Научный руководитель:
доктор биологических наук, старший научный сотрудник
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук (ФГУ «ВНИИЗЖ»)
доктор биологических наук (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии)
Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский и
технологический институт биологической промышленности (ГНУ ВНИТИБП, г. Щелково)
Защита диссертации состоится «16» «июня» 2011 г. в «Ю00» часов на заседании диссертационного совета Д 006.003.01 при ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии по адресу: 601120, Владимирская область, г. Покров, ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. Тел./факс: (09243) 6 21 25.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.
Автореферат разослан «12» мая 2011г. и размещен на официальном сайте ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии www.vniiwim.ru
Вера Ивановна Балышева
Ольга Владиславовна Прунтова
Борис Валентинович Новиков
Ученый секретарь диссертационного совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, Е.А. Балашова
кандидат биологических наук
1. Общая характеристика работы 1.1. Актуальность работы
Перспективным направлением, которое основывается на современных успехах в молекулярной биотехнологии, является разработка вакцин с использованием методов генной инженерии. Возможности дальнейшего совершенствования традиционных вакцин, если не исчерпаны, то весьма ограничены. С начала 90-х гг. научные лаборатории начали все активнее разрабатывать ДНК-вакцины против многих инфекционных (ВИЧ, бешенство, ЛДР, малярия и др.) и онкологических болезней (C.N. Baxevanis, 2010; N.G. Commander, 2010). Поскольку ДНК-вакцины обеспечивают синтез иммунногенных белков клетками самого организма, они способствуют формированию как гуморального, так и клеточного иммунитета (G. Lorenzo, 2010). Усиленно развивается и генная терапия.
Как при создании ДНК-вакцин, так и для целей генной терапии требуется разработка стратегии и тактики введения ДНК в клетки. Плазмидная ДНК поглощается клетками животных в небольшом количестве (0,1-0,2%), а большая ее часть быстро разрушается (Ю.З. Гендон, 1975; Б.Г. Орлянкин, 1998; В.Д. Солодовник, 1980), т.к. в условиях in vivo чужеродная ДНК нестабильна из-за быстрой деградации нуклеаза-ми (D.D. Dunlap, 1997) - ферментами, расщепляющими нуклеиновые кислоты. Поэтому многочисленные научные исследования в этой области посвящены разработке систем доставки ДНК в клетку. По своей природе они делятся на микробиологические (аденоассоциированные, ретровирусные, вирус осповакцины, бактериальные) и искусственные системы переноса генетического материала (физические и химические).
Наиболее безопасным и перспективным подходом для повышения эффективности доставки генов к разнообразным клеткам-мишеням является конструирование химическими методами искусственных комплексов ДНК с какими-либо носителями. Появление новых полимеров открыло широкие возможности конструирования синтетических систем переноса генов с заданными характеристиками (H.L. Davis, 1993; A. Lanzavecchia, 1993).
В последнее десятилетие интенсивно изучается возможность и перспективы применения биодеградируемых биосовместимых микросфер как эффективной сис-
темы доставки вакцин (М.С. De Oliveira, 2001; Н. Bäumler, 2005; D.W. Pack, 2005; Emir Baki, Denkbas, 2006; C.J. Park, 2009).
Таким образом, значительное появление в последние годы работ в области вакцинологии и многочисленные исследования, направленные на разработку методов микрокапсулирования, свидетельствуют об актуальности и перспективности данного направления.
1.2. Степень разработанности проблемы
Разработке методов микрокапсулирования белков посвящены работы Г.Б. Су-хору кова (1998 г., 2005 г.), Д.В. Володькина (2004 г.), Т.Н. Бородиной (2008 г.). Авторами предложен метод послойной адсорбции полиэлектролитов для формирования мембраны микрокапсул. В работе Т.Н. Бородиной (2008 г.) показана принципиальная возможность иммобилизации ДНК в полиэлектролитные микрокапсулы. Однако, не изучены вопросы эффективности сорбции карбонатно-кальциевыми частицами геномной и плазмидной ДНК при формировании микрокапсул, деградации микрокапсул in vivo, кинетики синтеза антител при введении инкапсулированной плазмидной ДНК, зависимости иммунного ответа от способа введения и полиэлектролитного состава микросфер.
1.3. Цель и задачи исследований
Целью данной работы является разработка системы доставки генетического материала в виде полиэлектролитных биодеградируемых микросфер (микрокапсул) в клетки макроорганизма, оценка биологических свойств микрокапсулированной ДНК и возможности применения этого метода в ветеринарии.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- определить эффективность сорбции ДНК различного молекулярного веса и структуры на микрочастицах карбоната кальция;
- подобрать биосовместимые и биодеградируемые полиэлектролиты, позволяющие получать мембрану микрокапсул на поверхности сферических микрочастиц карбоната кальция методом послойной адсорбции (Layer-by-Layer).
- разработать высокоэффективный способ получения микрокапсулированной ДНК на основе микрочастиц карбоната кальция методом послойной адсорбции полиэлек-
тролитов;
- изучить эффективность доставки в клетки микрокапсулированной геномной ДНК вируса болезни Ауески в условиях in vitro и in vivo;
- исследовать кинетику синтеза вирус-специфических антител на введение микро-капсулированных плазмид;
- оценить влияние микрокапсулированных препаратов на содержание иммунорегу-ляторных лимфоцитов СД4+ и СД8+ в селезенке цыплят;
- изучить влияние различного композиционного состава микросфер на иммунный ответ;
- изучить биодеструкцию микрокапсул in vivo.
1.4. Научная новизна результатов исследований
Разработан способ доставки ДНК в макроорганизм путем введения иммобилизованной ДНК в биодеградируемые и биосовместимые микросферы, мембрана которых состоит из природных модифицированных полисахаридов. Впервые в России гистологическими методами установлено, что микрокапсулы состава (ДЕАЕ-dextran/Car)3 сохраняются в организме до 23 суток (срок наблюдения). Показано, что микрокапсулы, содержащие плазмиды, кодирующие гены NP и НА вируса гриппа А, при введении в организм являются иммунологически безвредными, поскольку не вызывают патологических изменений в структуре популяции регуляторных (СД4+ и СД8+) лимфоцитов. Впервые в России установлено, что полиэлектролитный состав микрокапсул влияет не только на уровень синтеза, но и на кинетику синтеза специфических антител. Новизна исследований подтверждена патентом на изобретение № 2409384.
1.5. Практическая значимость работы
Разработаны «Методические рекомендации по иммобилизации плазмидной ДНК в полиэлектролитные микрокапсулы», которые рассмотрены, одобрены на секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН и утверждены секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии A.M. Смирновым 24.10. 2009 г.
1.6. Апробация работы
Результаты исследований, выполненных по теме диссертационной работы
представлены, заслушаны и обсуждены на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИВ-ВиМ Россельхозакадемии (Покров 2006-2009гг.), Международном конгрессе биоорганической химии (Москва, 2008г.), Международных научно-практических конференциях ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (Покров, 2008г.), ФГУ ВНИИЗЖ (Владимир, 2008г.), УГСХА (Ульяновск, 2008-2009гг.), а также представлены на XY International Workshop on Bioencapsulation, 2007,Vienna, Austria и The XVI International Conference on Bioencapsulation (Dublin, Ireland 2008). 1.7. Соответствие содержания диссертации паспорту специальности, по которой она рекомендуется к защите
В соответствии с формулой специальности 03.02.02 Вирусология, занимающейся проблемами противовирусного иммунитета, инфекционности вирусов, разработкой мер и средств предупреждения вызываемых вирусами заболеваний, включающей область исследований: стратегию вирусного генома; разработку мер предупреждения, терапии и иммунопрофилактики вирусных инфекций, в диссертационной работе проведены исследования инфекционной активности вируса болезни Ауе-ски, вирусологическими методами подтверждено специфическое развитие инфекционного процесса при инокуляции микрокапсулированной ДНК в опытах in vivo и in vitro, серологическими методами выявлены вирус-специфические антитела в сыворотках крови животных, инокулированных препаратами плазмидной ДНК. Используя стратегию вирусного генома возбудителя болезни Ауески, была разработана лабораторная модель для оценки эффективности переноса ДНК вируса болезни Ауески в эукариотические клетки.
В соответствии с формулой специальности 03.01.06 Биотехнология (в том числе бионанотехнологии), охватывающей область науки об использовании живых организмов и биологических процессов в производстве с целью получения полезных продуктов в ветеринарии, включающей область исследований: сгущение биомассы, выделения, очистки, контроля и хранения конечных продуктов; иммунологические исследования в прикладной вирусологии и цитологии; иммунную биотехнологию; биотехнологию препаратов для животноводства, в диссертационной работе проведено накопление, выделение и очистка плазмидной и геномной ДНК, разработаны методы иммобилизации генно-инженерных конструкций (плазмидных ДНК) в макропористые микрочастицы СаС03 и доставки их в клетки макроорганизма с сохра-
6
нением их биологических свойств, исследован иммунный ответ на введение натив-ных и микрокапсулированных ДНК, изучены процессы биодеструкции микрокапсул in vivo и in vitro.
Полученные соискателем научные результаты соответствуют пунктам 3, 7, 10 паспорта специальности 03.02.02 Вирусология и пунктам 1, 4, 7, 9, 11 паспорта специальности 03.01.06 Биотехнология (в том числе бионанотехнологии).
1.8. Публикации
По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ, получен 1 патент.
1.9. Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 139 страницах, иллюстрирована 15 таблицами и 28 рисунками. Список литературы включает 314 источников, из которых 259 иностранные.
1.10. Основные положения диссертации, выносимые на защиту
Способ получения микрокапсул для доставки ДНК в клетки макроорганизма. ДНК, иммобилизованная в полиэлектролитные биодеградируемые микрокапсулы защищена от нуклеаз и сохраняет свои биологические свойства. Биодеградируемые и биосовместимые микрокапсулы обеспечивают пролонгированное высвобождение ДНК в зависимости от их композиционного состава.
1.11. Личный вклад автора в выполнение работы
Основной объем исследований проведен автором самостоятельно. Отдельные этапы исследований выполнены при консультативной и методической помощи сотрудников лабораторий «Биофизика», «Биохимия», «Иммунология» ГНУ ВНИИВ-ВиМ Россельхозакадемии; лаборатории «Полимеров для биологии» Института биоорганический химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; лаборатории «Диагностики вирусных болезней птиц» ФГУ ВНИИЗЖ; кафедры нормальной, патологической анатомии и ВСЭ Ивановской ГСХА. 2.Собственные исследования 2.1. Материалы и методы 2.1.1. Материалы
2.1.1.1. Вирусы: вирус болезни Ауески (ВБА) штамм «МК-25» с инфекционной ак-
тивностью 7,0-7,3 lg ТЦД50/СМ3; эталонные вирусы гриппа птиц А (ВГП) штаммы: А/цыпл/Росток/29 (H7N7), А/Крачка/Ю.Африка/59 (H5N3) и Новосибирск/56/05 (H5N1); рекомбинантный вирус осповакцины (Рек-КЧС), экспрессирующий полипептиды вируса классической чумы свиней (КЧС); липосомы (Liposome Kit, L4395), Sigma.
2.1.1.2. Плазмидные ДНК: двухцепочечные кольцевые плазмидные ДНК: pTKShi, содержит встройку генов gp 33, gp 44, gp 55 белков вируса КЧС, размер 8,130 т.п.о.; plnfNP, содержит встройку гена негликозилированного структурного белка нуклео-протеина вируса гриппа А размер 5,185 т.п.о.; plnfHA, содержит встройку конфор-мационного эпитопа гена гемагглютинина вируса гриппа А, размер 3,141 т.п.о. любезно предоставлены д.б.н. Н.Н. Власовой (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии).
2.1.1.3. Перевиваемые культуры клеток: почек сибирского горного козерога (ПСГК-60) и почек зелёной мартышки (CV-1).
2.1.1.4. Питательные среды, растворы и сыворотки: Игла - MEM (Sigma, США), сыворотка крови крупного рогатого скота (Биолот, Россия), референс-сыворотка к вирусу КЧС, референс-сыворотка к ВГП Н5.
2.1.1.5. Животные: мыши белые, инбредные, кролики породы «Шиншилла» 3-4 месячного возраста, цыплята СПФ 5 - суточного возраста, подсвинки крупной белой породы 4 мес. возраста.
2.1.2. Методы
2.1.2.1. Культивирование перевиваемых линий клеток и вирусов проводили согласно общепринятым методам (Сергеев, 2003). Титр вируса подсчитывали по методу Рида и Менча в модификации Ашмарина и выражали в lg ТЦД50/см3.
2.1.2.2. Реакцию нейтрализации ставили по общепринятой методике (Сергеев, 2003) с постоянной дозой вируса ВБА или ВГП (100 ТЦД50) и разными разведениями сывороток (от 1:2 до 1:64) в культуре клеток ПСГК-60.
2.1.2.3. Выделение геномной ДНК ВБА и плазмидной ДНК проводили фенольно-детергентным способом. Эффективность включения ДНК ВБА и плазмидной ДНК в СаСОз микрочастицы определяли спектрофотометрически при 1=260 нм, как разницу между оптическими плотностями водного раствора плазмидной ДНК до сорбции и супернатанта после осаждения микрочастиц с иммобилизованной в них ДНК.
2.1.2.4. Электрофорез продуктов амплификации проводили в лунках агарозного геля в смеси с stop-буфером при напряжении 15 В/см длины геля в течение 20 минут. Результаты электрофореза учитывали на трансиллюминаторе в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм.
2.1.2.5. С целью выявления антител, специфичных к антигенам вируса КЧС и ВГП в сыворотках крови использовали непрямой метод твердофазного иммунофермент-ного анализа.
2.1.2.6. Электронную микроскопию микрокапсул, микрочастиц и ВБА проводили с использованием электронного микроскопа «Jem 100 S». Препараты суспензии микрочастиц и микрокапсул готовили методом негативного контрастирования 3-4% фосфорно-вольфрамовой кислотой (Brenner, 1981; Hörne, 1961).
2.1.2.7. Получение Т-лимфоцнтов из селезенки цыплят, иммунизированных мик-рокапсулированной плазмидной ДНК, проводили на 8 и 14 сутки. Асептически отбирали селезенку в стерильную посуду и гомогенизировали в забуференном физиологическом растворе (ЗФР) при щадящем режиме для клеточного пула. Суспензию спленоцитов выделяли согласно методике градиентного центрифугирования на растворе Ficoll-Paque (Ekejindu, 1985; Kol, 1983; Nohara, 1992). Исследуемые образцы смешивали с мышиными антиптичьими антителами в соотношении 50; 1 и выдерживали при 4 °С 40 мин, затем лейкоциты осаждали при 1000 об/мин в течение 5 мин. затем ресуспендировали в 1 см3 ЗФР и исследовали с помощью проточного цитоф-луориметра.
2.1.2.8. Статистическую обработку данных проводили общепринятыми методами (Лакин, 1990).
3. Результаты собственных исследований
3.1. Изучение возможности применения метода послойной адсорбции полиэлектролитов на поверхности частиц карбоната кальция для микрокапсулирования ДНК
Дня оценки эффективности переноса ДНК в эукариотические клетки была выбрана ДНК вируса болезни Ауески (ВБА), т.к. ее введение в чувствительную систему приводит к продуктивной вирусной инфекции, которую можно наблюдать как in
vivo, так и in vitro. Работу проводили в двух направлениях: на животных и в культуре клеток.
Полиэлектролитные микрокапсулы получали путем последовательной адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов поли-Ь-лизин и альгинат (PLL/Alg)n на поверхности частиц карбоната кальция (СаС03) для формирования многослойной мембраны. Процесс получения микрокапсул, содержащих иммобилизованную в них ДНК, включал 4 основных этапа, которые представлены на рисунке 1:
1) синтез макропористых микрочастиц СаСОз;
2) сорбция ДНК пористыми микрочастицами СаСОз при 4 °С 20-24 часа;
3) нанесение полимерных слоев Alg- PLL-Alg- PLL-Alg- PLL,..;
4) растворение внутреннего ядра СаСОз и отмывка микрокапсул с заключенной в них ДНК.
Cjt'O) umpoMtamiJ.
Рис. 1. Схематическое изображение формирования многослойной мембраны путем последовательной адсорбции ПЭ
Частицы карбоната кальция получали по методу Д. В. Володькина (Володькин 2004). 3.2. Выделение ДНК вируса болезни Ауески
ВБА культивировали в перевиваемой линии клеток ПСГК-60. Инфекционная активность полученного вируссодержащего материала составляла 8,23 - 8,50 lg ТЦД50/СМ3. Выделение и очистку ДНК осуществляли фенольно-детергентным методом. Для выделения ДНК ВБА вирус концентрировали ПЭГ-6000 в 100 раз. Определение молекулярных масс фрагментов после проведенного рестрикционного анализа ДНК подтвердило принадлежность выделенной ДНК к ДНК ВБА.
Следующим этапом являлось изучение сорбции ДНК ВБА микрочастицами CaCOj. Процесс инкубации микрочастиц с ДНК проводили в течение 1,5 ч при t° 1820 °С и перемешивании (500 об/мин). Затем сорбцию продолжали при 4 °С в течение 12 ч. Микрочастицы с сорбированной ДНК осаждали центрифугированием (5 мин, 1500 об/мин) и определяли зависимость сорбции ДНК при ее постоянной концентрации 25 мкг/см3 от концентрации микрочастиц СаСОз в растворе. Определено, что при концен-
трации микрочастиц от 25 до 50 мг/см сорбция ДНК ВБА частицами составляла 80,0 % (рис. 2).
При постоянном количестве микрочастиц СаСОз - 50 мкг/см3 и изменении концентрации ДНК от 25 до 100 мкг/см3 максимальное включение ДНК в микрочастицы наблюдали при концентрации ДНК, равной 50 мкг/см3. Таким образом, 50 мг частиц СаСОз включают максимальное количество ДНК, равное 50 мкг, т.е. должно соблюдаться соотношение СаСОз : ДНК как 1:1 мг/мкг.
сороции г0
днк 60 50 40 30 20 10 0
% сорбции ДНК
_
г
75 100 125 150
игс'СаССП
Рис. 2,
а) зависимость сорбции ДНК ВБА от концентрации микрочастиц СаСОз;
б) зависимость сорбции ДНК ВБА микрочастицами от концентрации ДНК в растворе
30 40 50 60 70 80 90 концентрация ДНК {мкг^мз)
3.3. Иммобилизация ДНК ВБА в полиэлектролитные микрокапсулы
20 - 50 мкг ДНК ВБА инкубировали 22 ч с пористыми микрочастицами СаС03 при 4 °С. После инкубации концентрация ДНК в микрочастицах составляла 80 -84,5% от исходной. После адсорбции ДНК микрочастицы дважды отмывали дистиллированной водой и формировали на их поверхности методом послойного нанесения полиэлектролитов мембрану. Затем СаС03 растворяли 0,1М ЭДТА и оценивали относительную механическую прочность микрокапсул центрифугированием (10000 об/мин, 5 мин). Было определено, что для получения микрокапсул необходимо нанесение на частицы СаСОз не менее 6 полимерных слоев.
Изучение элюции ДНК из микрокапсул в процессе хранения в 0,9% ЫаС1 показало, что через 2 недели хранения 3,054 мкг/ см3 ДНК в микрокапсулах в растворе после их осаждения было 0,263мкг/см3 ДНК, т.е. 8,6±1,2%. Элюция ДНК из микрокапсул в водном или спиртовом растворе не превышала 1% в первые сутки и в дальнейшем выход ДНК из микрокапсул прекращался (срок наблюдения 14 дней).
Электронно-микроскопические исследования микрокапсул с заключенной в них ДНК показали, что размер микрокапсул составляет 1-2 мкм, а толщина оболочки 200 нм (рис. 3).
Рис. 3. Фотографии СаС03 микрочастиц и микрокапсул: 1- микрочастицы СаС03;
2 - ПЭ микрокапсула с иммобилизованной ДНК; электронная микроскопия, увеличение бОООх
3 - микрочастицы СаСОз под световым микроскопом;
4 - микрокапсулы, в состав мембраны которых включен РЬЬ - Р1ТС (люминесцентная микроскопия), увеличение 400х
3.4. Изучение возможности доставки ДНК микрокапсулами в клетку
Четырем кроликам вводили инкапсулированную ДНК ВБА в дозе 6,0 - 6,1 мкг, двум - в дозе 0,6 мкг (таблица 1).
Таблица 1
Эффект введения микрокапсулированной ДНК ВБА кроликам
Вид животного Кол -во Способ введения Количество введенной ДНК, мкг Проявление заболевания ПЦР/анализиру емые пробы Наличие ЦПД
Кролики 1 в/б 6,1 Гибель на 4-е сут + / печень, мозг +
1 в/м 6,1 Гибель на 5-е сут. + /печень, мозг, селезенка +
2 в/м 6,0 Вялотекущая респираторная форма, гибель на 21-е сут + /печень, мозг, селезенка +
2 в/м 0,6 Не выражено - -
Кролики, контроль 2 в/б 6,0 неинкапсу-лированная Не выражено
в/м
Примечание: «+» - наличие реакции; «-» - отсутствие реакции.
Контрольным животным инокулировали нативную ДНК в водном растворе. Два кролика, которым вводили ДНК в микрокапсулах в количестве 6 мкг, пали на 4 и 5 сутки, а у других двух на 6-7 сутки развилась легочная форма болезни, проявившаяся в кашле, чихании и слизистых выделениях из носа.
Животные, которым вводили 0,6 мкг ДНК и контрольные животные оставались клинически здоровыми. Приготовленную 10% суспензию органов павших (печень, селезенка, легкие, мозг, кровь) и убитых животных исследовали методом ПЦР со специфическими праймерами к gp 50 ВБА и в культуре клеток ПСГК-60. На 4-5 сутки наблюдали цитопатический эффект только во флаконах, которые были иноку-лированы материалом, взятым от животных, которым вводили микрокапсулирован-ную ДНК. Методом ПЦР ДНК вируса болезни Ауески была выявлена в печени и мозге, а также в культуральном материале, инфицированном суспензией печени и мозга животных, которым вводили ДНК в микрокапсулах (рис. 4). В контрольной группе ДНК ВБА в суспензии органов и культуральном материале не выявляли.
Рис. 4. Результаты ПЦР-анализа для выявления ДНК ВБА
Треки: 1—маркер 100 п.о.; 2— проба 10%-й суспензии мозга (кролик 2), 3—проба 10%-й суспензии мозга (кролик 1), 4— проба 10%-й суспензии печени (кролик 2), 5—ДНК ВБА (штамм МК-25); 6—проба 10%-й суспензии печени(кролик 1)
При постановке реакции нейтрализации с культуральным материалом, взятым после проявления 90% ЦПД и специфической сывороткой индекс нейтрализации составил 5,0.
Это свидетельствовало о том, что ДНК в микрокапсулах была защищена от нуклеаз, достигла чувствительных клеток и вызвала инфекционный процесс у кроликов в отличие от некапсулированной ДНК.
Для определения возможности осуществления трансфекции эукариотических клеток методом микрокапсулирования ДНК на монослой клеток ПСГК-60 вносили 5-10 мкг ДНК ВБА: 1) с добавлением 100 мкг ДЕАЕ-декстрана; 2) с использованием
1 2 3 4 5 6
липосом; 3) ДНК в микрокапсулах и инкубировали при ю 37 С в течение 4 - 5 су-
н..^. ' ... - -
' . - ^
........ . г .■
"3
. ....... ШИЯЯ
:
L 2
Рис. 5. Развитие ЦПД после трансфекции клеток микрока-сулами с ДНК
Стрелками указаны: 1 - микрокапсулы, лежащие на поверхности монослоя клеток ПСГК-60; 2 - монослой клеток ПСГК-60, начало ЦПД, 72 часа культивирования; 3 - монослой клеток ПСГК-60, 120 часов культивирования. Неокрашенный препарат, увеличение 400х
Во флаконах с культурой клеток, в которых осуществляли трансфекцию с помощью микрокапсул, развитие ЦПД обнаруживали на 2-е сутки (рис. 5), на 4-е сутки ЦПД было обнаружено в культуре клеток, трансфекцию в которых осуществляли с использованием липосом (рис. 6). Все культуры клеток были заморожены при минус 40 °С и после оттаивания пробы титровали в культуре клеток ПСГК-60 Наивысший титр вируса наблюдали при инфицировании культуры клеток ДНК ВБА, заключенной в микрокапсулы - 5,5 1§ТЦД50/см3. Полученный цитопатический эффект был обусловлен вирусом болезни Ауески, что подтверждено в реакции нейтрализации, а также выявлен геном методом ПЦР (рис. 7).
Таким образом, в результате проведенных экспериментов был разработан метод иммобилизации ДНК в биодеградируемые микрокапсулы, обеспечивающий высокую эффективность микрокапсулирования ДНК (до 80-90%) и сохранность ее биологических свойств.
пир вирус ,i l<J ТЦДи'Сн3 6
□ сДЕАЕжеютршюн ■ с лиюсэнзин
□ с имкрокат-улэмм
сутки
Рис. 6. Трансфекция клеток ПСГК-60 различными способами
| 1 2 3 4 5 --- 492 п о.
-Jn*« ■ ; Ч 5'. • <■ ÍS /• •, .>. , s ."S- жШШИШ Шт аВ^кк / ^ /
Рис. 7. Результаты ГЩР-анализа для выявления ДНК ВБА
Треки: I-культура клеток, трансфециро-ванная ДНК ВБА с использованием липо-сом; 2- интактная культура клеток; 3-культура клеток, инфицированная ВБА; 4-культура клеток, трансфецированная ДНК ВБА с использованием микрокапсул состава ПЛЛ/Алг; 5-культура клеток, трансфецированная ДЕАЕ-декстрановым методом - результат отрицательный
3.5. Исследование доставки плазмидных ДНК, включённых в микрокапсулы различного полимерного состава в клетки макроорганизма
В настоящее время при создании ДНК-вакцин используют плазмидные ДНК. Поэтому следующим этапом работы было включение в микрокапсулы плазмидной ДНК для проведения экспериментов in vivo.
В работе использовали плазмиды: pTKShi (81.30 т, п.о,), имеющую в своем составе участок генома, кодирующий полипептид Е2 вируса классической чумы свиней (КЧС); plnfNP (5185 п.о.), содержащую ген нуклеопротеина; плазмиду plnf НА (3,141 т.п.о.), содержащую участок гена, кодирующий конформационный эпитоп ге-магглютинина ВГП.
3.6. Изучение сорбции плазмидной ДНК pTKShi микрочастицами СаСОз
Учитывая, что ДНК ВБА является линейной молекулой и имеет большую молекулярную массу по сравнению с плазмидной ДНК, изучали сорбцию ДНК pTKShi
15
частицами СаСОз. При постоянной концентрации плазмиды 50 мкг/см3 с увеличением концентрации микрочастиц СаС03 до 50 мг/см3 количество сорбировавшейся плазмидной ДНК значительно увеличивалось с 79,76% до 91,00 %, последующее увеличение массы микрочастиц СаС03 до 150 мг приводило к не столь значительному увеличению сорбции ДНК и составляло 91,65- 93,02% (таблица 2).
Таблица 2
Зависимость сорбции плазмиды рТК8Ы от концентрации микрочастиц СаС03
______ (п=3)
Кол-во СаСОз Кол-во плазмиды Кол-во сорбиран-ной ДНК Кол-во плазмиды в суперна-танте Кол-во сорбированной ДНК
мг мкг/см3 мкг мкг/см3 %
25 50 19,94±0,56 5,06±0,56 79,76
50 45,56±0,45 4,44±0,45 91,00
75 68,26±0,45 6,74±0,45 91,65
100 91,81±0,39 8,19±0,39 91,81
125 116,09±0,52 8,91±0,52 92,8
150 139,53±0,45 10,47±0,45 93,02
При изменении концентрации плазмиды в растворе от 20 до 150 мкг/см3 (таблица 3) наибольшую сорбцию ДНК плазмиды наблюдали при соотношении 50 мг СаСОз и 150 мкг ДНК плазмиды, т.е. при соотношении 1:3 мг/мкг.
Таблица 3
Зависимость сорбции плазмиды pTKShi микрочастицами СаСОз от ее концентрации в растворе (п=3)
Кол-во Количество Количество сор- Количество плазми- Количество сорби-
СаСОз плазмиды биранной ДНК ды в супернатанте рованной ДНК
мг. мкг/см3 мкг. мкг/см3 %
50 20 17,38±0,25 2,62±0,25 86,9
40 35,24±0,23 4,76±0,23 88,1
60 53,45±0,21 6,55±0,21 89,08
80 67,16±0,32 12,84±0,32 83,95
100 88,08±0,27 11,92±0,27 88,08
150 92,32±0,25 7,68±0,25 92,32
200 90,76±0,47 9,24±0,47 90,76
Эффективность сорбции плазмидной ДНК (92,3%) была значительно выше,
чем при сорбции ДНК ВБА (до 84,5%, п. 3.2.2.4), что, вероятно, связано с ее меньшим молекулярным весом.
3.7. Усовершенствование метода иммобилизации плазмидной ДНК
Учитывая, что Д.В. Володькин и др. (2004 г.) для включения белков в СаСОз микрочастицы использовали метод совместного осаждения, заключающийся в одновременном синтезе частиц и иммобилизации в них белка, было проведено усовершенствование этого метода для иммобилизации ДНК в микрочастицы СаСОз. С этой целью смешивали 615 мкл одномолярного раствора бикарбоната натрия и 615 мкл одномолярного раствора хлористого кальция в присутствии 1 мл водного раствора плазмиды рТКБЫ в течение 30 секунд. Смесь оставляли на 2 минуты для завершения процесса кристаллизации макропористых СаСОз микрочастиц. Полученные микрогранулы с ДНК использовали для дальнейшего нанесения полиэлектролитных слоев РЬЬ-А^. Данный подход позволил сократить время иммобилизации ДНК в микрочастицы, снизить количество операций и повысить количество сорбированной ДНК (таблица 4).
Таблица 4
Сравнительная характеристика методов микрокапсулирования
Этапы работы Усовершенствованный метод Исходный метод
Синтез и высушивание частиц СаСОз - 24 часа
Сорбция ДНК Соосаждение, 2-5 мин 2 ч при 1° 20-22 "С, перемешивание, 18 часов при 10 + 4 °С
Нанесение полиэлектролитных слоев + +
% сорбции 98,56±0,41% 92,32±0,25%
3.8. Определение оптимальной дозы и способа введения плазмид
Для определения оптимального количества плазмиды, необходимого для индукции синтеза специфических антител у мышей, животным вводили инкапсулированные и нативные плазмиды в дозе 5-40 мкг однократно внутримышечно в область внутренней поверхности бедра. Через 28 дней у мышей отбирали пробы крови для определения титра специфических антител в сыворотках в непрямом варианте метода твердофазного иммуноферментного анализа. Как видно из представленных в таблице 5 результатов, при увеличении дозы вводимой ДНК рТКБЫ до 20 мкг на
мышь наблюдали повышение титра антител в исследуемых сыворотках крови. Даль-
17
нейшее увеличение количества вводимой плазмиды как нативной, так и в микрокапсулах, не влияло на индукцию антител. При этом существенных различий в титрах антител при иммунизации нативной плазмидой и микрокапсулированной не установлено.
Таблица 5
Титр антител в сыворотках крови мышей, иммунизированных микрокапсулами, в зависимости от количества вводимой плазмиды рТК8Ы (п=3)
Кол-во плазмиды, мкг Титр антител у мышей, иммунизированных
нативной плазмидой инкапсулированной плазмидой
Х±т Х±т
5,0 6,66-8,66 7,41 ±0,47 7,66-9,65 8,40±0,47
10 9,66-10,65 10,15±0,28 11,65-12,65 10,65±0,28
20 11,65-12,65 12,15±0,29 11,65-12,65 11,90*0,25
30 11,65-12,65 12,40±0,25 11,65-12,65 12,15±0,29
40 11,65-12,65 11,90±0,47 11,65-12,65 12,40±0,25
При введении мышам плазмид р1пЮТ и р1пША вируса гриппа птиц установлена аналогичная зависимость между дозой введения и титром антител, образующихся у животных в ответ на их инокуляцию (таблица 6).
Таблица 6
Зависимость титра антител в сыворотках крови мышей, иммунизированных
(п=3)
Доза плазмид-ной ДНК (мкг/мышь) Титр антител при введении плазмид
р!п№ р!пША
5 1:400-1:1600 9,32±0,43 1:100-1:400 7,33±0,66
10 1:1600-1:3200 10,31±0,31 1:400-1:400 8,66±0,00
20 1:1600-1:3200 11,32±0,43 1:1600-1:3200 10,98±0,44
30 1:1600-1:3200 11,32±0,43 1:1600-1:3200 11,32±0,43
40 1:3200-1:3200 11,65±0,00 1:3200-1:1600 10,98±0,44
Примечание: Титр антител в нормальной сыворотке белой мыши (0) - 1:50
Таким образом в результате проведенных исследований установлено, что при
увеличении дозы вводимой плазмиды более 20 мкг, существенного увеличения титра ВН- антител не наблюдали, поэтому в дальнейших исследованиях доза вводимых плазмид была не менее 20 мкг на мышь.
На следующем этапе исследований сравнивали образование специфических антител в зависимости от способа введения плазмидной ДНК в организм животного. Плазмиду вводили внутримышечно, интраназально, внутрибрюшинно и внутрикож-но. Как видно из представленных в таблице 7 результатов, значительных различий в титрах антител, полученных в ответ на введение плазмиды разными способами, не выявлено.
Таблица 7
Титр антител в сыворотках крови мышей при разных способах введения плазмиды рТКБЫ (п=3)
Способ введения Титр специфических антител (Ео§2)
21 сут 35 сут
Нативная Капсулированная Нативная Капсулированная
Интраназально 11,32±0,43 9,99±0,33 10,31±0,31 9,99±0,33
В/брюшинно 11,32±0,43 9,99±0,33 10,31±0,31 10,31±0,31
В/кожно 11,98±0,44 10,31±0,31 11,32±0,43 11,32±0,43
В/мышечно 11,98±0,44 10,31±0,31 11,32±0,43 11,32±0,43
3.9. Изучение зависимости иммунного ответа при введении плазмид, иммобилизованных в микрокапсулы композиций (СН-2(то(1)/Саг)3 и (ДЕАЕ-<1ех1гап/Саг)з
Учитывая, что при введении мышам нативной плазмиды или включенной в микрокапсулы состава (РЬЬ-А1§)з существенных различий в титрах антител не наблюдали (таблица 7), провели исследования по определению зависимости титра вирус-специфических антител в сыворотках крови животных от композиционного состава мембран микрокапсул при инокуляции инкапсулированных плазмид. Совместно с сотрудниками ИБХ РАН из 7 пар полиэлектролитов были отобраны для дальнейших исследований 2 пары: ДЕАЕ- декстран, Мм 500000 / к-каррагинан, выделен из ЕисЬеита сойопн, Мм 15000-30000 (ДЕАЕ-(кх1гап/Саг)3 и сульфат хитозан СХК-2, Мм 74000 / к-каррагинан, выделен из ЕисЬеита сойопп, Мм 15000-30000 (СН-2(тос1)/Саг)з, образующие достаточно прочную мембрану микроскапсул.
Плазмиды р1пЙЯР и р1пША были иммобилизованы в микрокапсулы состава (РЬЬ-А^)з, (СН-2(шо(1)/Саг)з и (ДЕАЕ-скхй-ап/СаОз, которые вводили мышам внутримышечно в дозе 25 мкг. На 14-е и 21 сутки после инокуляции плазмид у животных
отбирали пробы крови для определения в их сыворотках антител. Наиболее высокий титр антител на 14-е сутки наблюдали в сыворотках крови мышей, инокулирован-ных микрокапсулами состава (СН-2(тос1)/Саг)з с плазмидой р1пМР, которые составляли 1:625-1: 3125. На 21-е сутки титры антител у мышей, инокулированных микрокапсулами (ДЕАЕ-с1ех1гап/Саг)з и (СН-2(тос1)/Саг)з с плазмидами р1пШР и р1пША сравнялись и были выше, чем при введении нативной плазмиды или иммобилизованной в микрокапсулы состава (Р1Х/А1£)з (таблица 8).
Таблица 8
Титр антител при иммунизации мышей микрокапсулами разной композиции полимеров, содержащими плазмиду рМНА и р1пШР (п=3)
Взятие Титр антител
крови, plnfHA plnfNP
сутки в микрокапсулах состава
(PLL/Alg)3 (СН-2(mod)/Car)3 (ДЕАЕ-dextran/Car)3 (PLL/Alg)3 (CH-2(mod)/Car)3 (ДЕАЕ-dextran/Car)3
14 1:125 1:125 1:125 1:125 1:625-1: 3125 1:625
21 1:125 1:625 1:625 1:125 1:3125 1:3125
Примечание: титр вирусспецифических антител у мышей, инокулированных нативными
плазмидами plnfflA ир InfNP, составлял < 1:125
Таким образом, при введении одинакового количества микрокапсулированных плазмид plnfHA и plnfNP индукция вирус-специфических антител у мышей зависела от композиционного состава микрокапсул.
Сыворотки крови от привитых мышей исследовали на наличие ВН-антител против вируса гриппа H5N3. Введение мышам инкапсулированной плазмиды plnfflA индуцировало у них образование вируснейтрализующих антител на 21 сутки в титрах 1:4-1:16, в то время как при введении нативной плазмиды титр ВН-антител составлял 1:4 (таблица 11).
Для оценки возможности защиты мышей от заболевания при контрольном заражения вирусом гриппа, животным вводили в дозе 40 мкг на мышь двукратно с интервалом 14 суток капсулированные и нативные плазмиды plnfNP и plnfHA. Контрольное заражение (КЗ) иммунизированных мышей проводили через 21 сутки после второй иммунизации штаммами соответствующих сероподтипов вируса гриппа в дозе 100 ЭЛД50/мл.
Таблица 9
Результаты контрольного заражения мышей, инокулированных препаратами плазмид
Штамм вируса, используемый при КЗ Результаты контрольного заражения
р1пШР и р!пША В капсулах (СН-2(шоё)/Саг)3 Кошроль (пал/ выжил)
р1пШР и р1пМА
Н5 (А/Новосибирск/02/05) 7/13 8/12 20/0
Н7 (А/Росгок/29) 8/12 9/11 20/0
Примечание: числитель - количество павших животных;
знаменатель - количество выживших животных
Как видно из результатов, приведенных в таблице 9, иммунизированные ре-комбинантными плазмидами мыши имели частичную устойчивость (55-60%) к контрольному заражению вирулентными штаммами вируса гриппа Н5 и Н7.
Была изучена кинетика образования вирус-специфических антител на примере плазмиды рТК8Ы, заключенной в микрокапсулы состава (ДЕАЕ-ёех1гап/Саг)3. Мышам вводили внутримышечно плазмиду рТК8Ы в дозе 25 мкг на мышь. На 14-42 сутки после инокуляции плазмиды у животных отбирали пробы крови для определения в их сыворотках антител.
Титр вируса
19, .
Рис. 8, Кинетика образования специфических антител в сыворотках белых мышей, иммунизированных плазмидой рТКБй)
сутки
Как видно из представленных результатов (рис. 8), введение микрокапсулиро-ванной плазмидной ДНК рТК8Ы в организм белых мышей вызывало более пролонгированное действие препарата по сравнению с нативной ДНК. Так, титры специфических антител в сыворотках крови мышей, инокулированных инкапсулированной плазмидной ДНК, на 28 сутки превышали титры антител у мышей, инокулирован-
ных нативной ДНК на 2,5 Такая разница в титрах антител у двух групп мышей сохранялась до 42 суток (срок наблюдения).
3.10. Оценка популяции лимфоцитов СД4+ и СД8+ при применении микрокап-сулированных препаратов
Представляло интерес оценить количественные изменения субпопуляции лимфоцитов СБ4+ и СО8" при введении микрокапсулированных плазмид в организм. С этой целью 14-суточным цыплятам вводили внутримышечно в дозе 50 мкг плазмиды с XI'- или НА-вставкой с целью определения относительного количества субпопуляций лимфоцитов С041 и С08. На 7 и 14 сутки осуществляли убой цыплят и отбор селезенок у 3-х цыплят из каждой группы. Определение относительного количества субпопуляций лимфоцитов СГ)4 и С1)8' проводили, используя метод им-мунотипирования при проточной цитофлуорометрии с использованием антивидовых типоспецифических антител, меченых ИТС. Инокуляция цыплятам капсулирован-ной плазмиды вызывала на 14 сутки увеличение процента СГМ - и С О 8 лимфоцитов в селезенке опытной птицы, по сравнению с введением нативной плазмиды (таблица 10).
Таблица 10
Иммунотипирование субпопуляций лимфоцитов СЭ4+ и СО8' методом проточной цитофлуорометрии (п=3)
сутки 1пАЧР 1пША
(ДЕАЕ-с1ех1:гап/Саг)з нативная (ДЕАЕ-ёех1гап/Саг)з нативная
С04+ С08+ СБ4+ СБ8+ СБ4+ С08+ С04+ С08+
8 12,73±1,07 29,52±1,34 - - 20,95±1,33 35,17±1,47] - -
14 12,04±0,87 34,86±1,22 25,70±1,6б 28,34±0,68 22,91±0,89 34,38±1,13 14,54±1,72 29,82±0,66
Примечание: «-» - не исследовали
Из результатов, представленных в таблице видно, что процент цитотоксиче-ских лимфоцитов, при иммунизации капсулированной плазмидой, несущей ген нук-леопротеина незначительно отличается от таковой с гемагглютинином. Несмотря на увеличение содержания СБ4+ и СБ8+ лимфоцитов соотношение последних сохраняется. То есть не происходит существенных изменений в структуре популяции регу-ляторных лимфоцитов, что свидетельствует об иммунологической безвредности иммобилизованных плазмид.
3.11. Изучение деградации микрокапсул в мышечной ткани
С целью выяснения скорости распада микрокапсул in vivo, был проведен гистологический анализ срезов образцов мышечной ткани, взятых в очаге введения микрокапсул состава (ДЕАЕ-ёех1гап/Саг)з.
Взрослым мышам вводили микрокапсулы (flEAE-dextran/Carb в физиологическом растворе внутримышечно в область бедра по 40 мкл каждой. Мышей подвергали эвтаназии и отбирали образцы мышечной ткани в месте введения микрокапсул для гистологического исследования. На рис. 9 видно, что через 1 час после внутримышечного введения микрокапсул вокруг очага введения наблюдается инфильтрация клеток микро- и макрофагов.
Рис. 9. Динамика морфологических изменений в мышечной ткани у мышей (п=6). Окраска гематоксилином и эозином, увеличение 400х
По окрашиванию мышечных волокон в красный цвет (цвет окрашивания микрокапсул) можно сделать предположение, о начинающейся по периферии деградации микрокапсул. В течение 3-х суток инфильтрация очага введения микрокапсул лейкоцитами нейтрофильного ряда продолжает усиливаться и сохраняется в этой степени выраженности до 10 суток.
К этому времени значительно уменьшилось общее количество микрокапсул, в связи с чем можно сказать, что деградация их быстрее происходит по периферии, в то время, как в центре видны неразрушенные микросферы. Лимфоциты нейтро-фильного ряда проникают вглубь очага введения микрокапсул, чем объясняется ба-зофильная окраска очага не только по периферии, но и постепенное смещение ее к центру. Увеличивается и количество мышечных волокон, окрашенных в красный цвет, что свидетельствует о продолжающемся распаде капсул. Через 14 дней после инокуляции микрокапсул отмечается уменьшение их количества, что свидетельствует об их активной деградации. Процессы медленного уменьшения количества капсул и клеточной инфильтрации продолжаются до 23 суток (срок наблюдения) и к концу периода наблюдения часть микрокапсул в месте введения еще сохраняется, что свидетельствует о постепенном высвобождении иммуногена из микрокапсул. 3.12. Изучение зависимости иммунного ответа при введении инкапсулированных плазмид на кроликах и подсвинках
Учитывая, что микрокапсулы образованы из биосовместимых и биодегради-руемых полисахаридов, которые в организме подвергаются деструкции, а также, что скорость метаболизма у мышей гораздо выше, чем у более крупных животных, были проведены исследования динамики накопления специфических антител на кроликах и подсвинках. Было сформировано 4 группы животных по 3 кролика в каждой группе. Каждому кролику вводили внутримышечно по 100 мкг иммобилизованной в микрокапсулы или нативной плазмиды 1пЙЧР. У животных отбирали пробы крови для проведения исследований на 7, 14, 21 и 28 сутки. У кроликов, инокулированных плазмидой в микрокапсулах (СН-2(тос1)/Саг)?, титр антител был наиболее высокий по сравнению с другими образцами препаратов и составлял 10,15±0,31 1о§2 (рис. 10).
Рис. 10. Кинетика
вируса "
!», образования вирус-
специфических антител у кроликов, привитых препаратами плазмиды ШМР
При постановке реакции нейтрализации с этими сыворотками крови, было установлено, что введение кроликам инкапсулированной плазмиды р1пМА индуцирует у животных в крови синтез ВН-антител в титрах 1:4 - 1:8 (таблица 11).
Таблица 11
Гитр ВН - антител в сыворотках животных, иммунизированных инкапсулированной плазмидой р!г^ НА
животные Титр ВН-антител через 21 сутки после инокуляции
(РША1ё)3 (СН- 2(тос1)/Саг)з (ДЕАЕ-с!ех1гап/Саг)з некапсулированая
мыши 1:8 1:16-1:8 1:4-1:16 1:4
кролики 1:2 1:4 1:8 1:2-1:4
Подсвинкам вводили внутримышечно в область 1/3 шеи препараты плазмиды рТКвЫ в дозе 500 мкг с интервалом 14 суток. Одному подсвинку вводили нативную плазмиду, другому - заключенную в микрокапсулы состава (Р1Х/А^)3. У животных каждые 2 недели отбирали пробы крови для определения титра вирус-специфических антител. Проведенные исследования показали, что кинетика синтеза вирус-специфических антител при инокуляции нативной плазмиды существенно отличается от таковой при инокуляции капсулированной плазмиды (рис, 11).
1000 800 600 400 200
7
Рис. !!, Кинетика синтеза вирус-специфических антител при инокуляции подсвинкам плазмиды рТКБЫ
14 28 Ж .<РША1д|, # -нативная
сутки
Максимальный титр антител при инокуляции нативной плазмидой отмечали на 28-е сутки (1:800), который постепенно снижался и на 70-77 сутки составлял 1:400 - 1:200, в то время, как титр антител при инокуляции инкапсулированной плазмидой достигал к этому времени максимального уровня. Вероятно, процесс биодеградации микрокапсул у подсвинков протекает более медленно (по сравнению с белыми мышами и кроликами) и высвобождение ДНК происходит значительно позже срока введения, что связано, по-видимому, с различной скоростью катаболизма в их тканях полисахаридов, составляющих мембрану микрокапсул.
25
4. Выводы
1. Разработан эффективный способ доставки генетического материала в клетки макроорганизма, заключающийся в иммобилизации как геномной, так и плазмидной ДНК в биодеградируемые и биосовместимые микросферы, защищающие ее от действия нуклеаз с сохранением биологических свойств.
2. Введение иммобилизованной в микрокапсулы состава (РЬЬ/А1§)3 ДНК вируса болезни Ауески в чувствительную систему (культура клеток ПСГК-60 или кролики) приводит к продуктивной вирусной инфекции.
3. Эффективность сорбирования геномной и плазмидной ДНК сорбционным методом в течение 24 часов карбонатно-кальциевыми микрочастицами составляет 84,51±0,12%, и 92,32±0,25% соответственно, а включение плазмидных ДНК р1п!ЫР и рЫНА в полиэлектролитные микрокапсулы методом соосаждения сокращает время иммобилизации до 2 минут и повышает эффективность сорбции до 98,56±0,41%.
4. Двукратное введение инкапсулированных плазмид р1пШР и р1пМА взрослым мышам индуцирует у них синтез ВН-антител, титр которых на 21 сутки составляет 1:8 - 1:16 и защищает 55-60% особей от заболевания при контрольном заражении вирулентным вирусом гриппа птиц.
5. Титр вирус-специфических антител и кинетика их накопления зависят от композиционного состава микросфер. При инокуляции мышам плазмид р1пШР и р!пГ-НА, иммобилизованных в микрокапсулы состава (СН-2(тоё)/Саг)3 и (ДЕАЕ-с!ех1гап/Саг)з, титры антител на 21 сутки составляли 1:625 - 1:3125 соответственно, в то время, как в микрокапсулах (РЬЬ/А^з — 1:125.
6. Микрокапсулы, содержащие плазмиды р1пГЫР и р1пША при введении в организм являются иммунологически безвредными, поскольку не вызывают патологических изменений в структуре популяции регуляторных (СД4+ и СД8+) лимфоцитов.
7. Однократное введение микрокапсулированной плазмиды рТК8Ы мышам индуцирует у них синтез вирус-специфических антител с достижением титра на 21 сутки 1:3200 - 1:6400 (ТФ ИФА).
8. Кинетика синтеза антител в ответ на инокуляцию микрокапсулированной плазмидамы рТКБЫ зависит от вида животного, что связано с различной скоростью катаболизма в их тканях полисахаридов, составляющих мембрану микрокапсул.
9. Микрокапсулы состава ^EAE-dextran/Car)3 при внутримышечном введении подвергаются постепенной деградации, обеспечивая пролонгированное поступление заключенной в них ДНК в антиген-презентирующие клетки в течение 23 дней (срок наблюдения), что может быть использовано при разработке ДНК-вакцин для ветеринарии.
Автор выражает благодарность за оказание консультативной и методической помощи сотрудникам лабораторий «Биофизика», «Биохимия», «Иммунология» ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии; лаборатории «Полимеров для биологии» Института биоорганический химии им. Академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; лаборатории «Диагностики вирусных болезней птиц» ФГУ ВНИИЗЖ; кафедры нормальной, патологической анатомии и ВСЭ Ивановской ГСХА.
5. Практические предложения
Способ получения микрокапсул с иммобилизованной геномной и плазмидной ДНК предложен для применения при конструировании микрокапсулированных вакцин в биотехнологии. Разработанные «Методические рекомендации по иммобилизации плазмидной ДНК в полиэлектролитные микрокапсулы» используются в ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии в научно-исследовательских работах при создании биодеградируемых микрокапсул и разработке вакцин нового поколения.
6. Список использованной литературы
1. Бородина, Т.Н. Получение и исследование биодеградируемых полиэлектролитных микрокапсул с контролируемым выходом белков, ДНК и других биоактивных соединений: автореф. дис. ... канд. хим. наук / ИБХ РАН; Бородина Татьяна Николаевна. - М., 2008. - 26 с.
2. Биодеградируемые микрокапсулы с включенной в них ДНК для создания новых ДНК-вакцин / О.Е. Селина, С.Ю. Белов, Н.Н. Власова, В.И. Балышева, А.И. Чу-рин, А. Бартковиак, Г.Б. Сухоруков, Е.А. Марквичева // Биоорганическая химия. -2009.-Т. 35,№ 1.-С.113-121.
3. Nanoengineered polymer capsules: tools for detection, controlled delivery, and site-specific manipulation / G.B. Sukhorukov, A.L. Rogach, B. Zebli, T. Liedl, A.G. Skir-
tach,A.A. Antipov, N. Gaponik, A.S. Susha, M. Winterhalter, W.J. Parak // J. Phys. Chem. - 2005. - Vol. l.-P. 194-200.
4. Stepwise polyalectrolyte assembly on particles surface: a novel approach to colloid design / G.B. Sukhorukov, E. Donath, S. Davis, H. Lichtenfeld, F. Caruso, V.I. Popov, H. Mohwald // Polymers for Advanced Technologies. - 1998. - Vol.9. - P.759-767.
5. Matrix Polyelectrolyte Microcapsules: New System for Macromolecule Encapsulation / D.V. Volodkin, A.I. Petrov, M. Prevot, G.B. Sukhorukov // Langmuir. - 2004. - Vol.20. -P.3398-3406.
6. Volodkin, D.V. Protein Encapsulation via Porous СаСОЗ Microparticles Templating / D.V. Volodkin, N.I. Larionova, G.B. Sukhorukov //Biomacromolecules. - 2004. -Vol.5.-P.1962-1972.
7. Список научных работ, опубликованных по теме диссертации
1. Микрокапсулирование ДНК как способ доставки ДНК-вакцин / В.И. Балышева, Н.Н. Власова, О.Е. Селина, С.Ю. Белов, Е.А. Марквичева, Г.Б. Сухоруков // Российский ветеринарный журнал. - 2007. -№1. - С. 25-26.
2. Microencapsulated DNA as a DNA-vaccine delivery system / V.I. Balysheva, N.N.VIasova, E.A.Markvicheva, S.Yu. Belov, O.Ye. Selina and G.B. Sukhorukov // XY International Workshop on bioencappsulation, Vienna, Austia, 6-8 September, 2007. -P2-10. - Vienna, Austia, 2007. - P 1-4.
3. Технология микрокапсулирования ДНК и перспективы ее использования в вирусологии / С.Ю. Белов, О.Е. Селина, А.С. Каталымов, О.В. Зиновьева // Ветеринарная патология. - 2007. - №4. - С. 81-84.
4. Балышева, В.И. Влияние композиционного состава микрокапсул на индукцию специфических антител / В.И. Балышева, С.Ю. Белов, О.В. Капустина // Актуальные вопросы аграрной науки и образования: материалы Междунар. науч,-практ. конф. - Ульяновск, 2008. - С. 18-21.
5. Использование микрокапсулирования для иммунного ответа при ДНК-вакцинации / С.Ю. Белов, О.Е.Селина, В.И. Балышева, Н.Н. Власова и др. // Материалы III Международной конференции по коллоидной химии и физико-химическим механизмам, Москва, 2008. - М., 2008.
6. Effect of microcapsule composition upon specific antibody induction / V.l. Balysheva, N.N.Vlasova, E.A.Markvicheva, S.Yu. Belov [et al.] // XY International Workshop on bioencappsulation, Dublin, Ireland, 4-6 September, 2008, P45. - Dublin, Ireland, 2008. -P. 1-4.
7. Иммунный ответ на введение рекомбинантных плазмид, содержащих гены вируса гриппа птиц Н5, Np и Nsl / H.H. Власова, В.И. Балышева, С.Ю. Белов, О.В. Капустина, Д.Б. Андрейчук, A.C. Каталымов // Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных: труды Международной науч.-практ. конф. - Покров. - 2008. - Т.1. - С. 101-105.
8. Иммобилизация плазмид в полиэлектролитные многослойные микрокапсулы /
B.И. Балышева, H.H. Власова, С.Ю. Белов, Е.А. Марквичева, O.E. Селина и др. // Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных: труды Международной науч.-практ. конф. - Покров, 2008. - Т.2. - С. 117-120.
9. Биодеградируемые микрокапсулы с включенными в них антигенами для создания новых ДНК вакцин / O.E. Селина, С.Ю. Белов, H.H. Власова, В.И. Балышева и др. //Биоорганическая химия. - 2009. - Т.35, № 1. - С. 113-121.
10. Белов, С.Ю. Иммунно-биологическая активность микрокапсулированной ДНК /
C.Ю. Белов // Аграрная наука и образование на современном этапе развития: Международная науч.-практ. конф. - Ульяновск, 2009. - С. 17-21.
11. Патент RU 2336090 С2, № 2409384. Способ получения микрокапсул для доставки ДНК в макроорганизм / В.И. Балышева, Е.А. Марквичева, H.H. Власова, С.Ю. Белов, О.В. Капустина, O.E. Селина.
Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, г. Покров Владимирской области Тираж 80 экз.
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Белов, Сергей Юрьевич
1 Общая характеристика работы
1.1 Актуальность работы
1.2 Степень разработанности проблемы
1.3 Цель и задачи исследований
1.4 Научная новизна результатов исследований
1.5 Практическая значимость работы
1.6 Апробация работы
1.7 Соответствие содержания диссертации паспорту специальности, по которой она рекомендуется к защите
1.8 Публикации
1.9 Структура и объем диссертации
1.10 Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту
1.11 Личный вклад автора в выполнение работы
2 Обзор литературы
2.1 Вакцинопрофилактика. Традиционные вакцины и вакцины нового поколения
2.1.1 Живые вакцины
2.1.2 Инактивированные вакцины
2.1.3 Биосинтетические вакцины (молекулярные, химические) вакцины
2.1.4 ДНК-вакцины
2.2 Способы доставки ДНК в клетку для разработки ДНК-вакцин
2.2.1 Введение нативной ДНК с помощью прямых инъекций
2.2.2 Трансфекция
2.2.3 Электропорация
2.2.4 Введение ДНК с помощью микроинъекции
2.2.5 Метод баллистической трансфекции
2.2.6 Введение нативной ДНК с помощью ионофореза
2.2.7 Введение нативной ДНК с помощью ультразвукового (УЗ) излучения
2.2.8 Введение ДНК с помощью транспортных систем
2.2.8.1 Вирусные векторы
2.2.8.2 Белковые и пептидные векторы
2.2.8.3 Введение ДНК с использованием липосом
2.2.8.4 Введение ДНК, включенной в полимерные микрочастицы и микрокапсулы
2.3 Микроапсулирование
2.3.1 Полимерные носители
2.3.2 Взаимодействие микросфер и плазмидной ДНК с иммунной системой
2.3.3 Применение микрокапсулирования в вакцинологии
Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Белов, Сергей Юрьевич
6 Выводы
1. Разработан эффективный способ доставки генетического материала в клетки макроорганизма, заключающийся в иммобилизации как геномной, так и плазмидной ДНК в биодеградируемые и биосовместимые микросферы, защищающие ее от действия нуклеаз с сохранением биологических свойств.
2. Введение иммобилизованной в микрокапсулы состава (PLL/Alg)3 ДНК вируса болезни Ауески в чувствительную систему (культура клеток ПСГК-60 или кролики) приводит к продуктивной вирусной инфекции.
3. Эффективность сорбирования геномной и плазмидной ДНК сорбцион-ным методом в течение 24 часов карбонатно-кальциевыми микрочастицами составляет 84,51±0,12%, и 92,32±0,25% соответственно, а включение плаз-мидных ДНК plnfNP и plnfHA в полиэлектролитные микрокапсулы методом соосаждения сокращает время* иммобилизации до 2 минут и повышает эффективность сорбции до 98,56±0,41%.
4. Двукратное введение инкапсулированных плазмид plnfNP и plnfHA взрослым мышам индуцирует у них синтез ВН-антител, титр которых на 21 сутки составляет 1:8 — 1:16 и защищает 55-60% особей от заболевания при контрольном заражении вирулентным вирусом гриппа птиц.
5. Титр вирус-специфических антител и кинетика их накопления зависят от композиционного состава микросфер. При инокуляции мышам плазмид plnfNP и plnfHA, иммобилизованных в микрокапсулы состава (СН-2(mod)/Car)3 и (ДЕАЕ-с1ех1:гап/Саг)3, титры антител на 21 сутки составляли 1:625 - 1:3125 соответственно, в то время, как в микрокапсулах (PLL/Alg)3 — 1:125.
6. Микрокапсулы, содержащие плазмиды plnfNP и plnfHA при введении в организм являются иммунологически безвредными, поскольку не вызывают патологических изменений в структуре популяции регуляторных (СД4+ и СД8+) лимфоцитов.
7. Однократное введение микрокапсулированной плазмиды рТКБЫ мышам индуцирует у них синтез вирус-специфических антител с достижением титра на 21 сутки 1:3200 - 1:6400 (ТФ ИФА).
8. Кинетика синтеза антител в ответ на инокуляцию микрокапсулированной плазмидамы рТКБЫ зависит от вида животного, что связано с различной скоростью катаболизма в их тканях полисахаридов, составляющих мембрану микрокапсул.
9. Микрокапсулы состава (ДЕАЕ-ёехй-ап/Саг)3 при внутримышечном введении подвергаются постепенной деградации, обеспечивая пролонгированное поступление заключенной в них ДНК в антиген-презентирующие клетки в течение 23 дней (срок наблюдения), что может быть использовано при разработке ДНК-вакцин для ветеринарии.
7 Благодарности
Автор выражает благодарность д.х.н. Е.А. Марквичевой (лаборатория Полимеры для биологии, ИБХ им. акдемиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, г. Москва) за предоставленную, возможность выполнения части экспериментальной работы в ее лаборатории, м.н.с. O.E. Селиной (ИБХ им. акдемиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН) за помощь в освоении метода иммобилизации ДНК, H.H. Власовой (ГНУ ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии, г. Покров) за плодотворное сотрудничество и постоянную помощь в обсуждении результатов работы, О.В. Капустной и А.И. Чурину (ГНУ ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии, г. Покров) за помощь в проведении иммунологических исследований, д.б.н. Н.С. Мудрак (лаборатория Диагностики вирусных болезней птиц ФГУ ВНИИЗЖ) за предоставленную возможность выполнения части экспериментальной работы в ее лаборатории, к.б.н. Д.Б. Андрейчуку (лаборатория Диагностики вирусных болезней птиц ФГУ ВНИИЗЖ) за помощь в проведении исследования популяций лимфоцитов CD4+ и CD8+ методом проточной ци-тофлуорометрии, д.б.н., профессору В.В. Пронину (кафедра нормальной, патологической анатомии и ВСЭ Ивановской ГСХА) за плодотворное сотрудничество и помощь в обсуждении результатов гистологического исследования. Особую благодарность автор выражает руководителю диссертационной работы д.б.н. В.И. Балышевой за постоянную поддержку и помощь.
8 Практические предложения
Способ получения микрокапсул с иммобилизованной геномной и плаз-мидной ДНК предложен для применения при конструировании микрокапсу-лированных вакцин в биотехнологии. Разработанные «Методические рекомендации по иммобилизации плазмидной ДНК в полиэлектролитные микрокапсулы» используются в ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии в научно-исследовательских работах при создании биодеградируемых микрокапсул и разработке вакцин нового поколения.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Белов, Сергей Юрьевич, Покров
1. Аллисон, А. Липосомы в медицине / А. Аллисон, Г. Григориадис // Вестн.акад. мед. наук 1990. -Вып.6. - С.32-36.
2. Аптека. Генные вакцины Электронный ресурс. — Режим доступа URL:http://www.apteka.ua. Заглавие с экрана.
3. Ардашева, H.A. Эвтаназия как метод искусственного прерывания жизни:правовые условия / H.A. Ардашева // Рос. юрид. журнал. 1996. - Вып.1. - С.71-80.
4. Афанасьев, А.Г. Микрокапсулирование и некоторые области его применения / А.Г.Афанасьев. М.: Знание, 1982. - 64 с.
5. Барсуков, Л.И. Липосомы / Л.И. Барсуков // Соросовский образовательныйжурнал. 1998. - №10. - С.2-9.
6. Биотехнология. Методы Биотехнологии Электронный ресурс. Режимдоступа URL: http://www.biotechnolog.ru/. Заглавие с экрана.
7. Бородина, Т.Н. Получение и исследование биодеградируемых полиэлектролитных микрокапсул с контролируемым выходом белков, ДНК и других биоактивных соединений: автореф. дис.канд. хим. наук / Бородина Татьяна Николаевна. М.:ИБХ РАН, 2008. 26 с.
8. Бургасов, П.Н. Практическая иммунология / под ред. П.Н. Бургасова и И.С. Безденежных. М., 1969. - 468 с.
9. Вакцины будущего Электронный ресурс. Режим доступа URL: http://www.privivki.ru/immunitet/future.htm. — Заглавие с экрана.
10. Ветеринарная вирусология / В.А. Сергеев, Б.Г. Орлянкин, A.A. Гусев, О.И. Сухарев. М.: Мир, 2003. - 216 с.
11. Вудворд, Дж. Иммобилизованные клетки и ферменты / под ред. Дж. Вудворда. Методы. - М.: Мир, 1988. - 346 с.
12. Галактионов, В. Г. Иммунология / В.Г. Галактионов. — 3-е изд. — М.: Академия, 2004. 523 с.
13. Гендон, Ю.З. Молекулярная генетика вирусов человека и животных / Ю.З. Гендон. М.: Наука, 1975. - 303 с.
14. Гредунова, Г.П. Микрокапсулирование фармацевтических препаратов / Г.П. Гредунова, В.Я. Лебеденко / под ред. А.И. Тенцовой. М.: 1-й Мед. институт, 1976. — 57 с.
15. Григориадис, Г. Липосомы в биологических системах / под ред. Г. Григориадиса, А. Аллисона. -М.: Медицина, 1983. — С.69-115.
16. Дебабов, В.Г. ДНК-вакцинация и генотерапия / В.Г. Дебабов // Молекулярная биология. 1997. — №31. - С.2.
17. Дебабов, В. Г. ДНК-вакцинация и генотерапия на основе транзиентной экспрессии нуклеиновых кислот в соматических клетках человеку и животных / В.Г. Дебабов // Молекулярная биология. —1997. -Т.31, №2. -С. 187-192.
18. Егоров, А.М.Теория и практика иммуноферментного анализа / А.М. Егоров, А.П. Осипов, Б.Б. Дзантиев, Е.М. Гаврилова. — М.: Выс. шк, 1991. -288с.
19. Блинов, Н. П. Основы биотехнологии / Н. П. Елинов. СПб.: Наука, 1995. - 599 с.
20. Жданов, В.М. Вирусология / В.М. Жданов, С .Я. Гайдамович. М.: Медицина, 1966. - 480 с.
21. Зеленин, А. В. Генная терапия медицина будущего / А. В. Зеленин // Труды ВИНИТИ РАН-ППФНТП. - М., 2000. - С.32
22. Зеленин, A.B. Генная терапия на границе третьего тысячелетия / A.B. Зеленин // Вестник Российской академии наук. — 2001. — Том 71, №5. -С.387-395.
23. Использование новой сублинии перевиваемых клеток тестикул поросенка ПТП ТК в качестве селективной системы для получения рекомбинантных вирусов / Е.В. Ставничий, H.H. Власова, С.Ж. Цыбанов, С.Г. Юрков // Ветеринария. 2003. - №2. - С.43-45.
24. Кнорре, Д. Г. Исследование фармакокинетики и стабильности в крови in vivo фосфодиэфирных и модифицированных производных олигонуклеотидов / Д.Г.Кнорре, В.В. Власов // Биоорганическая химия. — 1992. -Вып.18 — С.1330-1340.
25. Лабораторная диагностика вирусных болезней животных / В.Н. Сюрин, Г.А. Иванова, Е.А. Краснобаев, Ю.В. Фомин. М.: Колос, 1972. - 416 с.
26. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. М.: Высшая школа, 1990. - 352 с.
27. Левина, E.H. Иммунолюминесценция в медицине / под ред. E.H. Левиной. -М., 1977.-315 с.
28. Ленхофф, Г. Иммуноферментный анализ: пер. с англ. / под ред. Г. Ленхоффа. — М., 1988. С.145-183.
29. Липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ / А.П. Каплун, Шон Ле Банг, Ю.М. Краснопольский, В.И. Швец // Вопросы медицинской химии. 1999. - Вып.1. - С.74-79.
30. Медуницын, Н.В. Основы иммунопрофилактики и иммунотерапии инфекционных болезней / Н.В. Медуницын, В.И. Покровский. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2005. - 512 с.
31. Медуницын, Н.В. Вакцинология. М.: Триада-Х, 2004. - 439 с.
32. Медуницын, Н.В. Побочное действие вакцин / Н.В. Медуницын // Иммунология. 1995. - №2. - С.6-8.
33. Микрокапсулирование ДНК как способ доставки ДНК-вакцин / В.И. Балышева, H.H. Власова, O.E. Селина, С.Ю. Белов, Е.А. Марквичева, Г.Б. Сухоруков // Российский ветеринарный журнал. — 2007. №1. — С.25-26.
34. Митрофанов, Е.Э. Первичная структура и организация генома / Е.Э. Митрофанов // Молекулярная биология. — 1997. —№31. — С.9.
35. Овчинников, Ю.А. Биоорганическая химия / Ю.А. Овчинников. М.: Просвещение, 1987. - С.513-636.
36. Орлянкин, Б. Г. Противовирусные вакцины третьего поколения / Б.Г. Орлянкин // Вестник РАСХН. 1998. - Вып.5. - С. 74-76.
37. Перадзе, Т.В. Иммунологическая диагностика вирусных инфекций / под ред. Т.В. Перадзе и-П. Халонена. М., 1985. - 584 с.
38. Позмогова, Г.Е. Адресованные белок-нуклеиновые комплексы для генотерапии / Г.Е.Позмогова, А.Н. Чувилин // Новые направления биотехнологии: Материалы VIII конф. М., 1998. - С.64.
39. Позмогова, Г.Е. Белковые и пептидные конструкции для доставки в клетку олигонуклеотидов и ДНК Электронный ресурс. — Режим доступа URL http://medi.ru/pbmc/8890602.htm. — Заглавие с экрана.
40. Полиэлектролитные комплексы в, растворе и в конденсированной фазе / Е.Е. Биченков, В.Г.Будкер, В.Ф. Зарытова, Е.М. Иванова, С.Г. Лохов, Е.В. Савченко, Н.М. Теплова // Биол. мембраны. -1988. №5. - С.735-741.
41. Ридли, М: Геном пер. с англ. и ред. к. б. н. О. Н. Ревы / М. Ридли. М.: Эксмо, 2008.-432 с.
42. Розенкрантц, A.A. Молекулярно-генетические аспекты в создании и использовании трансгенных сельскохозяйственных животных / A.A. Розенкрантц, C.B. Ячменев, A.C. Соболев // Доклады АН'СССР. 1990Т. 312, № 2. - С.493-494.
43. Розенкранц, A.A. Генно-инженерные сельскохозяйственные животные / A.A. Розенкранц, O.A. Смирнова, A.C. Соболев // Материалы Междунар. конф., посвященной памяти акад. A.A. Баева. — М., 1996. — С. 59.
44. Ройт, А. Иммунология / А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл. М.: Мир, 2000.-529 с.
45. Сидорович, И.Г. Иммунология / И.Г. Сидорович. — М.: Медицина, 2000. — 432 с.
46. Солодовник, В.Д. Микрокапсулирование / В.Д. Солодовник. М.: Химия, 1980.-215с.
47. Супотницкий, М.В. ДНК-иммунизация в профилактике инфекционных болезней сельскохозяйственных животных / М.В. Супотницкий // Ветеринария. 1998. - № 5. - С. 18-24.
48. Сюрин, В.Н. Практическая вирусология / под ред. В.Н. Сюрина, З.Ф. Богаутдинова и Я.С. Ландсберга. М.: Колос, 1970. — 352 с.
49. Таточенко, В.К. Вакцинопрофилактика. Справочник для врачей / под ред. В.К. Таточенко, Н.А. Озерецковского. -М.: Арико, 1994. — 184 с.
50. Таточенко В. К. Иммунопрофилактика / под ред. В.К. Таточенко и Н.А. Озерецковского. М., 2000. - 174 с.
51. Таточенко, В.К. Вакцинопрофилактика / В.К. Таточенко, Н.А.Озерецковский. М., 1994. - 264 с.
52. Трансформация клеток Электронный ресурс. — Режим доступа URL: http://www.transgene.ru/ru/transformation.html. Заглавие с экрана.
53. Шиц, JI. A. Encyclopedia of polymer science and technology пер с англ. JI. А. Шиц.-N. Y., 1968.-Vol. 8. -Р.719.
54. Abe, A. Enhanced gene transfer with fusogenic liposomes containing vesicular stomatitis virus G glycoprotein / A. Abe // J. Virol. 1998. - Vol.72. - P.l 1591663.
55. Adenovirus enhancement of transferrin-polylysine-mediated gene delivery / D.T. Curiel, S. Agarwal; E. Wagner, M. Cotten // Proc. Natl. Acad. Sci. -1991. Vol.88. - P.8850-88541
56. Alving, C.R. Liposomes as adjuvants for vaccines / C.R. Alving // J. Lipos. — 1997. -P.207-213. Hhb. № CH 8813 h/c-24434.
57. An immunocompetent mouse model for the tolerance of human chronic hepatitis B virus infection / L.-R. Huang, H.-L. Wu, P.-J. Chen, and D.-S. Chen // PNAS J. -2006. -Vol.103. -P.17862-17867.
58. Antisense Nucleic Acid Drug Delivery / C. Pichon, I. Freulon, P. Midoux, R. Mayer, M. Monsigny, A.C. Roche // J. Cancer. 1997. - Vol.7. - P.335-343.
59. Assembly of Multicomponent Protein Films by Means of Electrostatic Layer-by-Layer Adsorption / Yuri Lvov, Ariga Katsuhiko, Izumi Ichinose, Kunitake Toyoki // J. Am. Chem. Soc. 1995. - Vol.117. - P.6117-6123.
60. Austyn, J.M. Antigen uptake and presentation by dendritic leukocytes / J.M. Austyn // Semin. Immunol. 1992. - Vol.4. - P.227-236.
61. Bagley, K.C. Genetic adjuvant therapy for pancreatic cancer and other solid tumours / Bagley K.C. // Gut. J. 2008. - Vol.57. - P.289-291.
62. Biological significance of amino acid substitutions in hepatitis B surface antigen (HBsAg) for glycosylation, secretion, antigenicity and immunogenicity of HBsAg and hepatitis B virus replication / C. Wu, X. Zhang, Y. Tian, J.
63. Song, D. Yang, M. Roggendorf, M. Lu and X. Chen // J. Gen. Virol. 2010. -Vol.91.-P.483-492.
64. B-lymphocytes in bone marrow or lymph nodes can take up plasmid DNA after intramuscular delivery / A.A. Coelho-Castelo, R.R. Santos Junior, V.L. Bonato, M.C. Jamur, C. Oliver, C.L. Silva // Hum Gene Ther. 2003. -Vol.14.-P.1279-1285.
65. Boehm, G. On technological and immunological benefits of multivalent single injection microsphere vaccines / G. Boehm, M. Peyre, D. Sesardic // Pharmaceutical Res. 2002. - Vol.19. -P.1330-1336.
66. Bouillot P. Protein encapsulation in biodegradable amphiphilic microspheres. Polymer synthesis and characterization and microsphere elaboration / P. Bouillot, I. Petit, E. Dellacherie // Journal of applied polymer science. 1998. -Vol.68.-P.1695-1702.
67. Brand, R.M. Effects of size and sequence on the ionophoretic delivery of oligonucleotides / R.M. Brand, A. Wahl, P.L. Iversen // J. Pharm Sci. 1998. -Vol.87.-P.49-52.
68. Brenner, S.A preliminary report on the fine structure of a bacteriophage of Arthrobacter polychromogenes schippers-lammertse, muysers et klatser-oedekerk / S. Brenner, R.W.Horne // Biochim. Biophys. Acta. — 1953. -Vol.34.-P.103.
69. Budker, V.G. Cell Membranes as Barriers for Antisense Constructions / V.G. Budker, D.G. Knorre, V.V. Vlassov // Antisense Res. Devel. 1992. - Vol.2. -P. 177-184.
70. Bungenberg de Jong, H.G. Crystallisation-coacervation—flocculation, Colloid Science, (Ed. Kruyt H.R.). J. of Colloid and Interface Scence. - 1978. -Vol.66.-P.l 10-117.
71. Bungenberg de Jong, H.G. Microencapsulation by a complex coacervation process using acid-preciraor grlatin. — J. Biochemisry and Biotechnology. -1998.-Vol.10.-P.251-254.
72. Burrell, A.K. Polymer assisted deposition / Anthony K. Burrell, T. Mark McCleskey and Q. X. Jia// Chem. Commun. -2008. Vol.17. -P.1271-1276.
73. Cappecchi, M.R. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells / M.R. Cappecchi // J. Virol. 1980. -Vol.22. - P.479.
74. Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication / A.A. Antipov, D. Shchukin, Y. Fedutik, A.I. Petrov, G.B. Sukhorukov, H. Mohwald // Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 2003. - Vol.224.-P.175-184.
75. Chang, T.M. Enzymes immobilized by microencapsulation: preparation and biomedical applications: Insolubilized Enzymes / M. Salmona, C. Saronio, S. Garattini. New York: Raven Press, 1974. - P. 15-27.
76. Chen, J. Galactosylated histone-mediated gene transfer and expression / J. Chen, R.J. Stickles, K.A. Daichendt // Hum. Gene Ther. 1994. - Vol.5. -P.429-435.
77. Cheng, P.-W. Receptor Ligand-Facilitated Gene Transfer: Enhancement of Liposome-Mediated Gene Transfer and Expression by Transferrin / P.-W. Cheng, W. Yin // Biochim. Biophys. Res. Commun. 1994. - Vol.205. -P.826-833.
78. Cho, M.J. Macromolecular versus smallmolecule therapeutics: drug discovery, development and clinical considerations / M.J.Cho, R. Juliano // Tibtech. -1996. -Vol.14.-P.153-158.
79. Cohen, P. On the role of aging incarcinogenesis / P. Cohen // New Sci. 2000. -Vol.19.-P.148.
80. Combination of Viral Oncolysis and Tumor-Specific Immunity to Control Established Tumors / C.-M. Chuang, A. Monie, A. Wu, S.I. Pai and C.-F. Hung // Clin. Cancer Res. 2009. - Vol.15. - P.4581-4588.
81. Combined Administration with DNA Encoding Vesicular Stomatitis Virus G Protein Enhances DNA Vaccine Potency / C.-P. Mao, C.-F. Hung, T.H. Kang, L. He, Y.-C. Tsai, C.-Y. Wu and T.-C. Wu // J. Virol. 2010. - Vol.84. -P.2331-2339.
82. Controlled Release of DNA from Self-Degrading Microcapsules / T. Borodina, E. Marcvicheva, S. Kunizhev, H. Mohwald, G. Sukhorukov, O. Kreft // Macromolecular Rapid Communications. 2007. - Vol.28. - P.1894-1899.
83. Cox, G.J. Bovine herpesvirus 1: immune responses in mice and cattle injected with plasmid DNA / G.J. Cox, T.J. Zamb, L.A. Babiuk // J. Virol. 1993. -Vol.67.-P.5664-5667.
84. Crooks, R.M. Dendrimer-encapsulated metals and semiconductors: Synthesis, characterization, and applications / R.M. Crooks // Topics Curr. Chem. — 2001. -Vol.212.-P.81.
85. Cytotoxicity of solid lipid'nanoparticles as a function of the lipid matrix and the surfactant / R.H. Muller, D. Ruhl, S. Runge, K. Schulze-Foster, W. Mehnert // Pharm. Res. -1997. Vol.14. - P.458-462.
86. Davis, H.L. DNA-based immunization induces continuous secretion ofhepatitis B surface antigen and high levels of circulating antibody / H.L. Davis,114
87. M.L. Michel, R.G. Whalen // Hum. Mol. Genet. 1993. - Vol.2. - P. 18471851.
88. De Kruif C.G. Complex coacervation of proteins and anionic polysaccharides / C.G. De Kruif, F. Weinbreck, R. de Vries // Current Opinion-in Colloid & Interface Science. 2004: - Vol.9. - P.340-349.
89. De Oliveira, M.C. pH-sensitive liposomes as a carrier for oligonucleotides / M.C. De Oliveira, C. Dubemet, Mi Paternostre // STP Pharma Sci. 2001. -Vol.11.-P.103-107.
90. Design and development of polymeric for gene delivery / D.W. Pack, A.S. Hoffman, S. Pun, P.S. Stayton // Nature Rev., Drug Descovery. 2005. -Vol.4.-P.481.
91. Design and targeted reactions of oligonucleotide derivatives / L.A. Yakubov, E.A. Deeva, V.F. Zarytova, E.M. Ivanova, A.S. Ryte, L.V. Yurchenko, V.V. Vlassov // Proc.Natl.AcadiSci.USA. 1989. -Vol.86. - P.6454-6458.
92. Dhiman, N. Poly (DL-lactide-co-glycolide) based delivery systems for vaccines and drugs / N. Dhiman, M. Dutt, G.K. Khuller // Indian J. Exp. Biol. -2000.-Vol.38 P.746-752.
93. Direct gene transfer in skeletal muscle: plasmid DNA-based immunization against the hepatitis B virus surface antigen / H.L. Davis, M.L. Michel, M. Mancini, M. Schleef, R.G. Whalen // Vaccine. 1994. - Vol.16. - P.1503-1509.
94. DNA-based immunization for exploring the enlargement of immunological cross-reactivity against the lyssaviruses / Chokri Bahloul, Yves Jacob, Noel Tordo and Pierre Perrin // Vaccine. 1998. - Vol.16. - P.417-425.
95. DNA inoculation induces neutralizing immune responses against humanimmunodeficiency virus type 1 in mice and nonhuman primates / B. Wang, J.115
96. Boyer, V. Srikantan, L. Coney, R. Carrano, G. Phan // DNA CellBiol. 1993.-V0I.I2.-P.799-8O5.
97. DOTAP as a vehicle for efficient gene delivery in vitro and in vivo / G. McLachan, H. Davidson, P. Davidson, J. Dorin, D. Porteous //Biochimica. -1994.- Vol. 11. -P.19-21.
98. Drake; D.M. Biochemical investigation of active intracellular transport of polymeric gene-delivery vectors/ D:M. Drake and D.W. Pack // J. Pharm. Sci. 2008. - Vol.97. - P. 1399-1413.
99. Emir Baki, Denkbas. Perspectives on Chitosan Drug Delivery Systems Based on their Geometries / Denkbas Emir Baki, Raphael M. Ottenbrite // Journal of Bioactive and Compatible Polymers. 2006. - Vol.21. -P.351-368.
100. Encapsulated protein and DNA delivery system for the development of vaccines against intracellular pathogens / E. Markvicheva, E. Svirshchevskaya, D. Volodkin, O. Selina, M. Gerstenberger, A. Bartkowiak, G. Sukhorukov //
101. Proceedings of The XII International Workshop on Bioencapsulation. -Vitoria, Spain, Sept 24-26, 2004. P. 89-92.
102. Enhancement of Antibody Responses to Bacillus anthracis Protective Antigen Domain IV by Use of Calreticulin as a Chimeric Molecular Adjuvant Infect / Y.S. Park, J.H. Lee, C'.-F. Hung, T.-C. Wu and T.W: Kim It Immun: -2008. -Vol.76.-P.1952-1959.
103. Erbacher, P. Chitosan-based vector/DNA complexes for gene delivery: biophysical characteristics and transfection ability / P. Erbacher, S. Zou, T. Bettinger // Pharm Res. 1998. - Vol.15 - P.1332-1339.
104. Evaluation of the protective efficacy of a rabies DNA vaccine in mice using an intracerebral challenge model / S. Biswas, M. Ashok, G. Reddy, V. Srinivasan, P. Rangarajan // Curr Sci. 1999. - Vol.76. - P.1012-1016.
105. Excretion of hepatitis B surface antigen particles from mouse cells transformed with cloned viral DNA / M.F. Dubois, C. Pourcel, S. Rousset, C. Chany, P. Tiollais // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1980. Vol.77. - P.4549-4553.
106. Feigner, J.H. Phosphonolipids as non-viral vectors for gene therapy / J.H. Feigner, R. Kumar, C.N. Sridhar // J. Biol. Chem. 1994. - Vol.269. - P.2550-2561.
107. Fendler, J.H. Nanoparticles and Nanostructured Films: Preparation, Characterization and Applications / J.H. Fendler //Wiley-VCH: New-York, 1998. -P.13-142.
108. Ferkol, T. Gene transfer into the airway epithelium of animals by targeting the polymeric immunoglobulin receptor / T. Ferkol, C.S. Kaetzel, P.B. Davis // J. Clin. Invest. 1993. Vol. 92. - P.2394-2400.
109. Findeis, M.A. Methods Enzymol / M.A. Findeis, G.Y. Wu, C.H. Wu // J. Biotechnol. 1994. - Vol.247. -P.341-351.
110. Fisher, K.J. Biochemical and functional analysis of an adenovirus-based ligand' complex for gene transfer / K. J. Fisher, J. M. Wilson // Biochem J. -1994. Vol.299. - P.49-58.
111. Fisher, K.J. The transmembrane domain of diphtheria* toxin improves molecular conjugate gene transfer / K. J. Fisher, J. M. Wilson // J. Biochem. — 1997.-Vol.321.-P.49-58.
112. Fominaya, J. Target cell-specific DNA transfer mediated by a chimeric multidomain protein. Novel non-viral gene delivery system / Fominaya, J, Wels W. // J Biol Chem. 1996. - Vol.271. - P. 1056-1064.
113. Formation of Luminescent Spherical Core-Shell Particles by the Consecutive Adsorption of Polyelectrolyte and CdTe(S) Nanocrystals on Latex Colloids /
114. G.B. Sukhorukov, A.L. Rogach, F. Caruso, A.L. Rogach, A. Komowski, H. Mohwald, M. Giersig, A. Eychmiller, H. Weller // Colloids Surf. 2000. -Vol. 163. -P.39-44.
115. Formation of Ultrathin Multilayer and Hydrated Gel from Montmorillonite and Linear Polycations / Y. Lvov, K. Ariga, I. Ichinose, T.J. Kunitake // Am. Chem. Soc.- 1995.-Vol.17.-P.6117.
116. Forssen, E.A. Development of a new methodology to follow physicochemical changes along with pH of loaded liposomes / E.A. Forssen, M.E. Ross // J. Lipisomes Res. 2006. - Vol.4. - P.481-512.
117. Foster, M.M. Bluetongue and epizootic hemorrhagic disease virus isolations from vertebrate and invertebrate hostat a common geographie / M.M. Foster,
118. H.E. Metcalf, T.L. Barber // J. Amer. Vet. Assoc. 1980. - Vol. 176.- P.126-129.
119. Fotino, M. Micromethod for rapid separation of lymphocytes from the peripheral blood / M. Fotino, E.J. Merson, F.H. Allen // Ann. Clin. Lab. Sd. -1971.-Vol.1.-P.131 -133.
120. Free-standing ultrathin films with universal thickness from nanometer to micrometer by polymer nanosheet assembly / Hiroshi Endo, Masaya Mitsuishi, Tokuji Miyashita, J. Mater // Chem. 2008. - Vol.18. - P.1302-3211.
121. Functional Coatings by Polymer Microencapsulation / Edited by Ghosh S.K.- Weinheim: WILEY-VCH Verlag GmbH & Co, 2006. 357 p.
122. Fynan, E.F. Use of DNA encoding influenza hemagglutinin as an avian influenza vaccine / E.F. Fynan, H.L. Robinson, R.G. Webster // DNA Cell Biol. 1993. - Vol.12. -P.785-789.
123. Gabizon, A. Stealth Liposomes and Cancer Targeting: A Realistic Compromise in Drug Delivery / A. Gabizon, R. Catane, B. Uziely // Cancer Res. 1994. - Vol.54. - P.987-992.
124. Ganem, D. The molecular biology of the hepatitis B viruses / D. Ganem, H.E. Varmus //Annu. Rev. Biochem. 1987. - Vol.56 -P.651-693.
125. Gao, X. A novel« cationic liposome reagent for efficient transfection of mammalian cells / X. Gao, and L. Huang // Biochim. Biophys. Res. Commun.- 1991. Vol. 179. - P.280-285.
126. Gill, P.S. Optimizing Liposomes for Delivery of Chemotherapeutic Agents to Solid Tumors / P.S. Gill, B.M. Espina, F. Muggia // J. Clin. Oncol. 1995. -Vol.13.-P.996-1003.
127. Glorioso, J. C. Annu. Rev. / J.C. Glorioso, N.A. DeLuca, D.J. Fink // Microbiol. 1995. - Vol.49. -P.673-710.
128. Gordon, J.W. Gene Transfer in Mouse Eggs: Microinjection and Organelle Transplantation Techniques / J.W. Gordon // Academic Press Inc. London, 1986. -P.351-370.
129. Gordon, J.W. Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei / J.W. Gordon, F.H. Ruddle // Science. 1981. -Vol.214.-P.1244-1246.
130. Gregoriadis, G. Progress in Drug Delivery Systems / G. Gregoriadis // J. TIBECH. 1995. - Vol.13. -P.527-537.
131. Grunlan, J.C. Layer-by-Layer Assembly of Multifunctional Thin Films — Overview / J.C. Grunlan // Nanotech Conference, Houston, CD. May 3-7,2009.
132. Guo, X. Chemical approaches to triggerable lipid vesicles for. drug and gene delivery/X. Guo, F.C. Szoka//Acc. Chem. Res.-2003.-Vol.36.-P.335-341.
133. Gutcho, M. Capsule Technology and Microencapsulation / M. Gutcho // Noyes Data. Park, Ridge, 1972. - 370 p.
134. Gutcho M. Промышленная Биотехнология: Методы иммобилизации ферментов Электронный ресурс. Режим доступа URL: http://www.biotechnolog.ru/prombt/prombtl ll.htm. - Заглавие с экрана.
135. Guyomard, A. Buildup of Multilayers Based on Amphiphilic Polyelectrolytes / A. Guyomard, G. Muller, K. Glinel // Macromolecules. 2005. - Vol.38. -P.5737-5742.
136. Hassett, D.E. DNA immunization / D.E. Hassett, J.L. Whitton // Trends Microbiol. 1996. - Vol.4 - P.307-312.
137. Hassett, D.E. Neonatal DNA immunization with a plasmid encoding an internal viral protein is effective in the presence of maternal antibodies and protects against subsequent viral challenge / D.E. Hassett // J. Virol. — 1997. -Vol.71. -P.7881-7888.
138. Hechard, C. Molecular cloning of the Chlamydophila abortus groEL gene andevaluation of its protective efficacy in a murine model by genetic vaccination /121
139. С. Hechard, О. Grepinet and A. Rodolakis // J. Med. Microbiol.-2004. -Vol.53.-P.861-868.
140. HER-2 neu as a target for cancer vaccines / C.N. Baxevanis, I.F. Voutsas, A.D. Gritzapis, P.L. Feigner // Immunotherapy. 2010. - Vol.2. - P.213-226.
141. Hohlfeld, R. The immunobiology of muscle / R. Hohlfeld, A.G. Engel // Immunol. Today. 1994. - Vol.15. -P.269-274.
142. Home, R.W. In Techniqes for Electron Microscopy / R.W. Home, D. Kay // Thomas, Springfield, Illinois, 1961. — P.154.
143. Hosseinkhani, H. Ultrasound enhances the transfection of plasmid DNA by non-viral vectors / H. Hosseinkhani, T. Aoyama, O. Ogawa // Curr. Pharmaceutic. Biotechnol. 2003. - Vol.4. - P. 109-122.
144. Htc. Микрокапсулирование лекарственных и витаминных препаратов электронный ресурс. Режим доступа URL: http://htc.mpei.ru. - Заглавие с экрана.
145. Huckett, В. Pharmaceutical Gene Delivery System / В. Huckett, M. Ariatti, A.O. Hawtrey // Biochem. Pharmacol. 1990. - Vol.40. - P.253-263.
146. Humoral and cellular immunogenecity of DNA vaccine / J. Donnelly, J. Ulmer, J. Shiver, M. Liu // Annu Rev Immunol. 1997. - Vol. 15. - P.617-648.
147. Iiier, R.J. Layer by layer deposition of hydroxyapatite onto the collagen matrix/R.J. Iller// Colloid Interf. Sei. 1966. - Vol.21. -P.569.
148. In. Stealth Liposomes / D.W. Northfelt, L. Kaplan, J. Russell, D.D. Lasic, F.J. Martin // CRC Press. 1995. - Vol.10. - P.257-266.
149. Induction of anti-hepatitis B surface antigen (HBsAg) antibodies in HBsAg producing transgenic mice: a possible way of circumventing "nonresponse" to HBsAg / M. Mancini, M. Hadchouel, P. Tiollais, C. Pourcel, M.L. Michel // J.
150. Med. Virol. 1993. - Vol.39. -P.67-74.123
151. Inovio. Technology Platform: Electroporation Электронный ресурс. -Режим доступа URL http://www.inovio.com/technology electroporation.shtml. Заглавие с экрана.
152. Intradermal gene immunization: the possible role of DNA uptake in the induction of-cellular immunity to viruses / E. Raz, D.A. Carson, S.E. Parker, T.B. Parr, A.M. Abai, G. Aichinger // Proc. Natl. Acad. Sei: USA. 1994. -Vol.91.-P.9519-9523.
153. Jaenisch, R. Simian virus 40 DNA sequences in DNA of healthy adult mice derived from preimplantation blastocysts injected with viral DNA / R. Jaenisch, B. Mintz // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1974. - Vol.71. - P. 1250-1254.
154. Janoff, A.S. Liposome-associated retinoids: production, characterization and antiproliferative activity on neoplastic cells / A.S. Janoff // Lab. Invest. 1992. - Vol.66.-P.655-658.
155. Jessica Gorman. Delivering the Goods Gene Therapy without the Virus Электронный ресурс. — Режим доступа URL http://ecmd.nju.edu.en/UploadFile/23/l 1091/g. — Заглавие с экрана.
156. Kaneda, Y. Synthesis of Antisense Oligonucleotide-Peptide Conjugate Targeting to GLUT-1 in HepG-2 and MCF-7 Cells / Y. Kaneda, R. Morishita, V.J. Dzau // Ann N.-Y. Acad. Sei. 1997. - Vol.811. - P.299-308.
157. Kim, J.S. A new non-viral DNA delivery vectors: the terplex system / J.S. Kim, B.I. Kim, A. Maruyama et al. // J. Control. Real. 1998. - Vol.53. -P.175-182.
158. Kneuer, C. Silica nanoparticles modified with aminosilanes as carriers for Plasmid DNA / С. Kneuer, M. Sameti, E.G. Haltner // Int. J. Pharm. 2000. -Vol.196.-P.257-261.
159. Kodihalli, S. Strategies for, inducing protection against avian influenza A virus subtypes with DNA vaccines / S. Kodihalli, D.L. Kobasa, R.G. Webster // Vaccine. 2000. - Vol. 18. - P.2592-2599.
160. Kolasi, E. Characteristics, of polyelectrolyte multilayers: effect of PEI anchoring layer and1 posttreatment, after deposition / E. Kolasi, R. Krastev, E. Warszy // J. Colloid Interface Sci. 2007. - Vol. 1. - P.46-56.
161. Konishi, E. A DNA vaccine expressing dengue type 2 virus premembrane and envelope genes induces neutralizing antibody and memory B cells in mice / E. Konishi, M. Yamaoka, I. Kurane // Vaccine. 2000. - Vol.18. - P. 1133-1139.
162. Kotov, N. Thin Solid Films / N. Kotov, I. Dekany, J.J. Fendler // Phys. Chem. 1995.-Vol. 99. -P.13065.
163. Kremer, E.J. Perricaudet M.B. Adenovirus and adeno-associated virus mediated gene transfer / E.J. Kremer, M.B. Perricaudet // Medical Bull. 1995. -Vol.51 -P.31-44.
164. Labeling of biocompatible polymer microcapsules with near-infraredemitting nanocrystals / N. Gaponik, I.L Radtchenko, M.R. Gerstenberger, Y.A. Fedutik, G.B. Sukhorukov, A.L. Rogach //Nano Letters. 2003. - Vol.3. - P.369-372.
165. Lanzavecchia, A. Identifying strategies for immune intervention / A. Lanzavecchia // Science. 1993. - Vol.14. - P.937-944.
166. Larsen, D.L. Coadministration of DNA encoding interleukin-6 and hemagglutinin confer protection from influenza virus challenge in mice / D.L. Larsen, N. Dybdahl-Sissoko, M.W. McGregor // J. Virology. 1998. - Vol.72. -P.1704-1708.
167. Lasik, D.D. Liposomes: From Physics to Applications / D.D. Lasik. — Amsterdam: Elsevier, 1993. Vol.14. - P. 1202-1210.
168. Lavigne, C. Application for ribozymes that target human t-cell leukemia virus type I tax/rex mRNA / C. Lavigne, A.R. Thierry // Biophys. Res. Commun. -1997.-Vol.237.-P.566-71.
169. Layer-by-Layer Assembly of Poly(vinyl alcohol) and Hydrophobic Polymers Based on Their Physical Adsorption on Surfaces / T. Serizava, S. Kamimura, N. Kawanishi, M. Akashi //Langmuir. -2002. Vol.18. -P.8381-8385.
170. Layer-by-layer assembly of single-charged ions with a rigid polyampholyte / Guang Chen, Guojun Wu, Liming Wang, Suobo Zhang and Zhaohui Su //Chem. Commun.-2008.-Vol. 19.-P.1741-1748.
171. Lee, A.H. DNA inoculation with HIV-1 recombinant genomes that express cytokine genus enhance HIV-1 specific immune responses / A.H. Lee, Y.S Suh, Y.C. Sung // Vaccine. 1999. - Vol.17. - P.473-479.
172. Lee, H. Self-assembly of thin film superstructures based on alternating metal-bisphosphonate and cobalt-diisocyanide layers / H. Lee, L.J. Kepley // J. Phys. Chem. 1988. - N 92. - P.2597.
173. Lehmann K. Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy / K. Lehmann, M. Donbrow // Boca Raton. 1992. - CRC Press. - P.73-97.
174. Liposomes / J.R. Bogner, F-D. Goebl, D.D. Lasic, F. J. Martin // CRC Press. -1995. Vol. 10. - P.267-278.
175. Lodmell, D. Gene gun particle-mediated vaccination with plasmid DNA confers protective immunity against rabies vims infection / D. Lodmell, N. Ray, L. Ewalt//Vaccine. 1998. - Vol.16. -P.l 15-118.
176. Loirat, D. Muscle-specific expression hepatitis B surface antigen: no effect on DNA raised immune responses / D. Loirat, M. Mancini // Virology. — 1999. -Vol.200.-P.74-83.
177. Long-term anti-nucleoprotein cellular and humoral immunity is induced by intramuscular injection of plasmid DNA containing NP gene / M.A.
178. Yankauckas, J.E. Morrow, S.E. Parker, A. Abai, G.H. Rhodes, V.J. Dwarki, S.H. Gromkowski // DNA Cell Biol. 1993. - Vol.12. - P.771-776.
179. Loper-Macias, C. Studies of the coagulation kinetics of mixed suspensions / C. Loper-Macias //DNA vaccines. -N. Y., 1995. P. 1-6.
180. Lvov, Y. Assembly, structural characterization, and thermal behavior of layer-by-layer deposited ultrathin films of poly(vinyl sulfate) and poly(allylamine) / Yuri Lvov, Gero Decher, Helmuth Moehwald // Langmuir. 1993. - Vol.9. -P.481-486.
181. Lvov, Y. Layer-by-layer self-assembly: The contribution of hydrophobic interactions / Y. Lvov, K. Ariga and T. Kunitake // Colloids Surf. 1999. -Vol.17. -P.146-337.
182. Ma, D.D. Enhanced delivery of synthetic oligonucleotides to human leukaemic cells by liposomes and immunoliposomes / D.D. Ma, A.Q. Wei // Leuk Res. 1996. - Vol.20. - P.925-930.
183. Maa, Y.-F. Spray-drying of air-liquid interface sensitive recombinant human growth hormone / Y.-F. Maa, P.-A.T. Nguyen, S.W. Hsu // Journal of Pharmaceutical Sciences. 1998. - Vol.87. - P. 152-159.
184. Mahato, R.I. Cell Targeting in Anit-Cancer Gene Therapy / R.I. Mahato, Y. Takakura, M.J. Hashida // Drug Targeting. 1997. -. Vol.4. - P.337-357.
185. Mahato, R.I. Drug Targeting / R.I. Mahato, Y. Takakura, M. Hashida / J. Biol. Chem. 1997. - Vol.6. - P.642-649.
186. Mandell, G. Principles and Practice of Infectious Diseases // G. Mandell, R.C. Douglas, J.E. Bennett. New York: Churchill-Livingston, 1990. - 542 p.
187. Manickan, E. DNA vaccines a modem gimmick or a boon to vaccinology? / E. Manickan, K.L. Karem and B.T. Rouse // Crit. Rev. Immunol. - 1997. -Vol.17.-P.139-154.
188. Markvicheva, E. Bioincapsulation in polymer micro- and nanocarriers and applications in biomedical fields / E.Markvicheva // Finely dispersed particles: micro- and nano-and atto- engineering Spasic A, Hsu J-P (Eds). Marcel
189. Dekker Ink, New-York, 2005. P.853-868.127
190. Martin, C.N. Evolutios / Martin C.N. // J. Clin. Invest. 1997. - Vol.2. - P.l-8.
191. Martin, T. Plasmid DNA malaria vaccine: the potential for genome integration after intramuscular injection / T. Martin, S.E. Parker, R. Hedstrom //Hum. Gene Ther. 1999. - Vol.10. -P.759-768.
192. Maruyama, A. Nanoparticle DNA carrier with poly(L-lysine) graft polysaccharide copolymer and poly(D,L-lactic acid) / A. Maruyama // Bioconjug. Chem. 1997. - Vol.8. -P.735-742.
193. Matrix Polyelectrolyte Microcapsules: New System for Macromolecule Encapsulation / D.V. Volodkin, A.I. Petrov, M. Prevot, G.B. Sukhorukov // Langmuir. 2004. - Vol.20. - P.3398-3406.
194. Method for encapsulating active substances by coacervation of polymers in non-chlorinated organic solvent / J.-P, Benoit, J. Richard, E. Fournier, S. Liu // PCT Internatinal Application. 2001. - Vol. 115. - P.799.
195. Micelle delivery of doxorubicin increases cytotoxicity to prostate carcinoma cells / T.L. McNealy, L. Trojan, T. Knoll, P. Aiken, M.S. Michel // Urological. Res. 2004. - Vol.32. - P.255-260.
196. Miller, E.M. Escherichia coli Electrotransformation / E.M. Miller and J.A. Nickoloff // Electroporation Protocols for Microorganisms. New Jersey: Humana Press, 1995.-P.105-114.
197. Milman, G. Efficient DNA transfection and rapid assay for thymidine kinase activity and viral antigenic determinants / G. Milman, M. Herzberg // Somatic Cell Genet. 1981. - Vol.7. -P.161-170.
198. Mir, L.M. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses / L.M. Mir, M.F. Bureau, G. Gehl // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol.96. - P.4262-4267.
199. Monodisperse particle production: a method to prevent dropcoalescence using electrostatic forces / H. Brandenberger, D. Nussli, V. Piech, F. Widmer // Journal of Electrostatics. 1999. - Vol.45. -P.227-238.
200. Moore, A.C. Effects of antigen and genetic adjuvants on immune responses to human immunodeficiency virus DNA vaccines in mice / A.C Moore, W.P. Kong // J. Virology. 2002. - Vol.76. - P.243-250.
201. Morales, M.P. Contrast agents for MRI based on iron oxide nanoparticles prepared by laser pyrolysis / M.P. Morales // J. Magn. Magn. Mater. 2003. -Vol.266. — P. 102.
202. Morris, M.C. A new peptide vector for efficient delivery of oligonucleotides into mammalian cells / M.C. Morris, P. Vidal, L. Chaloin, F. Heitz, G. Divita //Nucl. Acids Res. 1997. - Vol. 25. - P 2730-2736.
203. Nanomedicine. High-efficiency DNA injection into a single human mesenchymal stem cell using a nanoneedle and atomic force microscopy Электронный ресурс. — Режим доступа URL:http://dx.doi.org/10.1016/j:nano.2008.03.005 и
204. URL: http://portalnano.ru/read/prop/pro/part6/med/nanoigla. — Заглавие с экрана.
205. Nanoscopic structure of DNA condensed for gene delivery / D.D.* Dunlap, A. Maggi, M.R. Soria, L. Monaco // Nucl. Acid. Res. 1997. - Vol.25. - P.3095-3101.
206. Next generation DNA vaccines for HIV-l / J.D. Bayer, M. Chattergood, K. Muthumani, H.L. Davis // J. Liposome Res. 2002. - Vol.12. - P. 137-142.
207. Novel Disialoganglioside in Rat Spleen Lymphocytes /Keiko Nohara S., Minoru Suzuki, Fuyuhiko Inagaki, Tomoharu Sano and Kunimitsu Kaya// J. of Biol. Chem. 1992. - Vol. 267. - P. 14982-14986.
208. Optimal induction of HPV DNA vaccine-induced CD8+ T cell responses and therapeutic antitumor effect by antigen engineering and electroporation / S.H. Seo, H.T. Jin, S.H. Park, J.I. Youn, Y.C. Sung // Vaccine 2009. Vol.27. -P.5906-5912.
209. Ostrander, J.W. Two modes of linear layer-by-layer growth of nanoparticle-polylectrolyte multilayers and different interactions in the layer-by-layer deposition/ J.W. Ostrander, A.A. Mamedov, N.A. Kotov // J. Am. Chem Soc. -2001.-Vol.14.-P.1101-1110.
210. Park, T.G. Current status of polymeric gene delivery systems /T.G. Park, J.H. Jeong, S.W. Kim // Adv. Drug Deliv. Rev. 2006. - Vol.58. - P.467-586.
211. Perrio, Y. Liposome-entrapped plasmid DNA / Y. Perrio, G. Gregoriadis // Biochim. Biophys. Acta. -2000. Vol.1475. -P.125-132.
212. Pokoma, D: DNA-vaccination via tattooing induces stronger humoral and cellular immune responses than intramuscular delivery supported by molecular adjuvants / D. Pokorna, I. Rubio, M. Miiller // Gen. Vaccines Ther. 2008. -VoL6.-P.l-8.
213. Possible regulatory role for conserved promoter motifs in an adult-specific muscle myosin gene from mouse / S. Takeda, D.L. North, M.M. Lakich, S.D. Russell, R.G. Whalen // J. Biol. Chem. 1992. - Vol.267.-P.16957-16967.
214. Potential of Transfected Muscle Cells to Contribute to DNA Vaccine Immunogenicity / H. Shirota, L. Petrenko, C. Hong and D.M. Klinman // J. Immunol. 2007. - Vol.179. - P.329-336.
215. Preclinical efficacy of a prototype DNA vaccine: enhanced protection against antigenic drift in influenza virus / J.J. Donnelly, A. Friedman, D. Martinez, D.L. Montgomery, J.W. Shiver, S.L. Motzel // Nature Medicine. 1995-Vol.l. -P.583-587.
216. Preparation and characterization of nanoparticles containing trypsin based on hydrophobically modified chitosan / C.-G. Liu, H. Desai, X.-G. Chen, H.-J. Park // J. Agric. Food Chem. 2005.- Vol.53. - P. 1728-1733.
217. Preparation and stability of lipid-coated nanocapsules of cisplatin: anionic phospholipid specificity / M.J. Velinova, W.J. Mulder, A.S. Dries, B.A. Jansen,
218. B. de Kruijff // Biochem. Biophys. Biomemb. 2004. - Vol.1663. - P.135-142.
219. Proliferation assays with human, rabbit, rat, and mouse lymphocytes / Forrest
220. C. Liu, David B. Hoyt, Raul Coimbra and Wolfgang G. Junger // In Vitro Cellular & Developmental Biology. 1996. Vol.32. - P. 520-523.
221. Protection against lethal Rift Valley fever virus (RVFV) infection in transgenic IFNAR mice induced by different DNA vaccination regimens / G. Lorenzo, R. Martin-Folgar, E. Hevia, H. Boshra, A. Brun //Vaccine. 2010. -Vol.9. - P. 2937-2944.
222. Protection against malaria by immunization with plasmid DNA encoding circumsporozoite protein / M. Sedegah, R. Hedstrom, P. Hobart, S.L. Hoffman // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1994. Vol.91. -P.9866-9870.
223. Purves, W.K. Life: The Science of Biology / W. K. Purves // 6th ed. Sinauer Associates. -2001.- P.316-317.
224. Radiation-guided drug delivery to tumor blood vessels results in improved tumor growth / L. Geng, K. Osusky, S. Konjeti, A. Fu, D. Hallahan // J. Control. Rel. -2004. Vol.99. - P.369-381.
225. Raviprakash, К. Dengue vims type 2 DNA vaccine induces in protective immune responses in rhesus macaques / K. Raviprakash, K.R. Porter, TJ. Kochel // J. Gen. Virol. 2000. - Vol.81. - P. 1659-1667.
226. Release mechanisms for poly electrolyte capsules / B.G. De Geest, N.N. Sanders, G.B. Sukhorukov, J. Demeester, S.C. De Smedt // Chem Soc Rev. — 2007.-Vol.36.-P. 636-49.
227. Robinson, H.L. DNA vaccines for viral infections: basic studies and applications / H.L. Robinson, Т. M. Pertmer // Advances In Virus Research — 2000.- Vol.55. -P.l-74.
228. Robinson, H.L. Protection against a lethal influenza virus challenge by immunization with a haemagglutinin-expressing plasmid DNA / H.L. Robinson, L.A. Hunt, R.G. Webster // Vaccine. 1993. - Vol.11. - P.957-960.
229. Rose, J.K. A new cationic liposome reagent mediating nearly quantitative transfection of animal cells / J.K. Rose, L. Buonocore, M.A. Whitt // Biotechniques. 1991. - Vol.10. -P.520-525.
230. Rose, N.R. Manual of Clinical Laboratory Immunology / N.R. Rose. -Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1992. 1350 p.
231. Saito, Tetsuichiro. In Vivo Electroporation Электронный ресурс. Режим доступа URL: http://www.frontier.kyoto-u.ac.jp/rc01/invivoelectroporation.html. - Заглавие с экрана.
232. Salmon, J.H. DNA vaccines- designer vaccines for the 21st century / J.H. Salmon // West. J. Med. 1994. - Vol.160. - P.l.
233. Schmid, G.P. Clusters and Colloids: From Theory to Applications / G.P. Schmid // Vet. Clin. Weinheim, Germany. - 1994. - Vol.7. - P.555.
234. Schoen, P. Gene transfer mediated by fusion protein hemagglutinin reconstituted in cationic lipid vesicles / P: Schoen, A. Chonn, P.R. Cullis // Gene Ther. 1999. - Vol.6. - P.823-832.
235. Schoenly, K.A. Human Immunodeficiency Virus Type- 1 Vaccine Development: Recent Advances in- the Cytotoxic T-Lymphocyte Platform-"Spotty Business" / K.A.„ Schoenly and D.B. Weiner // J. Virol". 2008. -Vol.82.-P.3166-3180.
236. Separation of human lymphocytes on Ficoll-Paque gradients: stimulation of cells and depletion of a concanavalin-A responsive radioresistant subpopulation / R. Kol, M. Friedlander, E. Riklis, D. Raveh // Radiat Res. -1983.- Vol.95. -P.108-15.
237. Sharma, S. Alginate-based oral drug delivery system for tuberculosis: pharmacokinetics and therapeutic effects / S. Sharma, G.K. Khuller, S.K. Garg // Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2003. - Vol.51. - P.931-938.
238. Slutter, B. Dual role of CpG as immune modulator and physical crosslinker in ovalbumin loaded-trimethyl chitosan (TMC) nanoparticles for nasal vaccination/ B. Slutter, W. Jiskoot // J. Control Realease. 2010. - Vol.1. -P.26-29.
239. Somatic expression of herpes thymidine kinase in mice following injection of a fusion gene into eggs / R.L. Brinster, H.Y. Trumbauer, M. Chen, A.W. Senear, R. Warren, R.D. Palmiter // Cell. 1981. - Vol.27. - P:223-231.
240. Steele, K.E. Cutaneous DNAvaccination against Ebola virus by particle bombardment: histopathology and alteration CD3-positive dendritic epidermal cells / K.E. Steele, K. Stablor, L. Vander Zaden // Vet. Pathol. 2001'. -Vol.38.-P.203-215.
241. Stepwise polyalectrolyte assembly on particles surface: a novel approach to colloid design / G.B. Sukhorukov, E. Donath, S. Davis, H. Lichtenfeld, F. Caruso, V.I. Popov, H. Mohwald // Polymers for Advanced Technologies. — 1998.-Vol.9.-P:759-767.
242. Study on the preparation'and1 anti-tumor efficacy of bovine serum albumin nanospheres containing* 5-fluorouracil / K. Santhi, S.A. Dhanaraj, V. Joseph, S. Ponnusankar, B. Suresh // Drug. Develop. Industrial. Pharm. — 2002. — Vol.28. -P. 1171-1179.
243. Synthesis of Novel Chitosan Derivatives for Micellar Solubilization of Cyclosporine / Xiaolei Chen, Song Ding, Guowei Qu and Can Zhang // A Journal of Bioactive and Compatible Polymers. 2008. - Vol.23. - P.563-578.
244. Systemic gene expression after intravenous DNA delivery into adult mice // N. Zhu, D. Liggitt, Y. Liu, and R. Debs // Science. 1993. - Vol.261. - P.209-211.
245. Tal, J. Adeno-associated virus-based vectors in gene therapy / J. Tal // J. Biol. Sci. 2000. - Vol 7. - P.279-291.
246. Tangi D. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response / D: Tang, M. Devit, S. A. Johnston // Nature. 1992. - Vol,356. -P.152-154.
247. Targeted transgenic: insertion into human chromosomes, by adeno-associated virus vectors / R. Hirata, J. Chanberlain, R. Dong, D.W. Russell // Nature Biotechnol: 2002. - Vol; 20. - P.735-738.
248. The effect of chitosan on the migration of neutrophil-like HL60 cells,mediated by IL-8 / C.J. Park, N.P. Gabrielson, D;W. Pack, R.D. Jamison and
249. A.J.W. Johnson // Biomaterials. 2009. - Vol. 30 - P.436-444.135
250. The HSUS Statement on Euthanasia Methods for Animals in Shelters Электронный ресурс. Режим доступа URL: http://www.The HSUS Statement on Euthanasia Methods for Animals in Shelters.html. - Заглавие с экрана.
251. The surface fine structure of vaccinia virus / R.W. Home, S. Brenner, A.P.' Waterson, P. Wildy // J. Mol. Biol. 1959. - Yol.l. - P.84.
252. Tiollais, P. The hepatitis В virus / P. Tiollais, C. Pourcel, A. Dejean // Nature. -Vol.317. -P.489-495.
253. Torchilin, V.P. Solid lipid nanoparticles (SLN) for controlled drug delivery / V.P. Torchilin // J. Microencapsul. 1998. - Vol.15. - P. 1-19.
254. Two types of hydrophobic aggregates in aqueous solutions of chitosan and its hydrophobic derivative / O.E. Philippova, E.V. Volkov, N.L. Sitnikova, A.R. Khokhlov // Biomacromolecules. 2001. - Vol.2. - P.483-490.
255. Ulmer, J.B. DNA vaccines / J. B. Ulmer, J.C. Sadoff, M.A. Liu // Curr. Opin. Immunol. 1996. - Vol.8. - P. 531-536.
256. Ulmer, J.B. Influenza DNA vaccines / Jeffrey B. Ulmer // Vaccine. 2002. -P.74-76.
257. Ulmer, J.B. Protective CD4+ and CD8+ T cells against influenza virus induced by vaccination with nucleoprotein DNA / J.B. Ulmer, T.M. Fu, R.R. Deck//J. Virol. 1998.-Vol.72. -P.5648-5653.
258. Ulmer, J.B. Vaccine manufacturing: challenges and solutions / J: B. Ulmer, U. Valley, R. Rappuoli // Nature Biotechnology. 2006. - Vol.24. - P. 1377-1383.
259. US Patent 4/675,140. Method for coating particles or liquid droplets / R.E. Sparks, M. Norbert 1987.
260. US Patent 60/216.604. Microshperes and adjuvants for DNA vaccine delivery136
261. M.E. Johnson, S. Mossman, T.C. Bellevue, L.E. Seattle. 2002.
262. Vaccination with a plasmid vector carrying the rabies virus glycoprotein gene induces protective immunity against rabies virus / Z.Q. Xiang, S. Spitalnik, M. Tran, W.H. Wunner, J. Gheng, H.C. Ertl // Virology. 1994. - Vol.199. -P.132-140.
263. Vaheri, A. Infectious poliovirus RNA: A sensitive method of assay / A. Vaheri and J.S. Pagano // Virology. 1965. - Vol.27. - P.434.
264. Vile, R. G. Nucleic acid vaccines: an overview / R. G. Vile, S. J. Russel // Annu. Rev. Br. Medical Bull. -1995. Vol.51. - P.12-30.
265. Volodkin, D.V. Protein Encapsulation via Porous CaC03 Microparticles Templating / D.V. Volodkin, N.I. Larionova, G.B. Sukhorukov // Biomacromolecules. -2004. Vol.5. - P. 1962-1972.
266. Vu, H.N. Engineering of a stable retroviral gene delivery vector by directed evolution / H.N. Vu, J.D. Ramsey and D.W. Pack // Molecular Therapy: J. the Am. Soc. Gene Therapy. 2008. - Vol.16. - P.308-314.
267. Wagner, E. Proc. Natl. Acad. Sci. / E. Wagner, M. Zenke, M. Cotten // Ann N.-Y. Acad. Sci. 1990. - Vol. 87. -P.3410-3414.
268. Whalen, R.G. DNA-mediated immunization and the energetic immuneresponse to hepatitis B surface antigen / R.G. Whalen, H.L. Davis // Clin1.munol. Immunopathol. — 1995. — Vol.75. — P. 1-12.137
269. Whalen, R.G. DNA'.Vaccines for Emerging Infectious Diseases: What If? / R.G. Whalen // Emerging Infectious Diseases. 1996. - Vol.2. — P3;
270. Yang, Z. Overcoming immunity to a viral vaccine by DNA priming before vector boosting / Z. Yang, L.S. Wyatt, W. Kong / J. Virol. 2003. - Vol.77. -P.799-803.
271. Yeh, P. Advances in adenoviral vectors: from genetic engineering to their biology / P. Yeh, M. Perricaudet // FASEB J. 1997. - Vol.11. - P.615-623.
272. Yoo, H.S. Hyaluronic acid modified biodegradable scaffolds for cartilage tissue engineering / H.S. Yoo and T.G. Park // Biomaterials. — 2005. — Vol.26 — P.1925-1933.
273. Yoon, J.J. Heparin immobilized biodegradable porous scaffolds for sustained release of angiogenic growth factors / J.J. Yoon and T.G. Park // Biomaterials. 2006. - Vol.79 - P.934-942.
274. Yuan, F. Transvascular drug delivery in solid tumors / F. Yuan //Semin. Radiat. Oncol. 1998. - Vol.8. -P.164-175.
275. Zaman, M. Synthetic polyacrylate polymers as particulate intranasal vaccine delivery systems for the induction of mucosal immune response / M. Zaman, P. Simerska, I. Toth // Curr Drug Deliv. 2010. - Vol.7. - P. 118-124.
276. Zhang, X. Layer-by-layer assembly: from conventional to unconventional methods / Xi Zhang, Huan Chen and Hongyu Zhang // Chem. Commun. -2007.-Vol.15. 1395-1402.
277. Zhang, Y. Surface modification of superparamagnetic magnetite nanoparticles and their intracellular uptake / Y. Zhang // Biomaterials. 2002. - Vol.23. -P. 1553.
-
Белов, Сергей Юрьевич
-
кандидата биологических наук
-
Покров, 2011
-
ВАК 03.02.02
- Исследование невирусных способов доставки генных конструкций для генотерапии миодистрофии Дюшенна
- Разработка облегченных и сверхлегких тампонажных материалов с полыми стеклянными микросферами для цементирования нефтяных и газовых скважин
- Изучение некоторых особенностей эксперсии гена CFTR и разработка экспериментальных подходов к генотерапии муковисцидоза
- Научные основы формирования технико-эксплуатационных параметров сверхлегкого и трещиностойкого тампонажного камня
- Распределение в организме и воздействие на опухоль лабораторных животных иттрия-90Y и ультрадисперсного железа
