Разработка основ технологии комплексной переработки стевии

Цугкиева, Елена Борисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка основ технологии комплексной переработки стевии
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка основ технологии комплексной переработки стевии"

На правах рукописи

□03054450

Цугкиева Елена Борисовна

РАЗРАБОТКА ОСНОВ ТЕХНОЛОГИИ КОМПЛЕКСНОЙ ПЕРЕРАБОТКИ СТЕВИИ

Специальность: 03.00.23. — Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2007

003054450

Работа выполнена на кафедре биотехнологии инженерно-экологического факультета Российского химико-технологического университета им. Д.И. Менделеева

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Градова Нина Борисовна

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор

Борисенко Евгений Георгиевич

доктор биологических наук, профессор Складнев Дмитрий Анатольевич

Ведущая организация: ОАО Государственный научно-

исследовательский институт биосинтеза белковых веществ Федерального агентства по управлению Федеральным имуществом

ли ~ Ю

Защита состоится «Л 2007 г. в у Ц часов на заседании дис-

сертационного Совета ДМ212.3^4.13 в Российском химико-технологическом университете им. Д.И. Менделеева по адресу: 125047, г. Москва, Миусская пл., д.9, тел. (499) 978-74-66, факс (499) 978-74-92^^ ^.С )

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ им. Д.И. Менделеева

Автореферат разослан « 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета ^^^^^^ и.В. Шакир

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В соответствии с современными воззрениями рациональное использование целлюлозосодержащего сырья, применение замкнутых систем материального производства, ослабляя антропогенное воздействие на окружающую среду, повышая эффективность использования солнечной энергии, является одним из необходимых факторов устойчивого развития общества.

Важнейшей проблемой развития современного общества является обеспечение продовольственными белковыми ресурсами, а также необходимыми нутри-цевтиками для рационального питания человека (Тутельян, 2002).

Значительный опыт, накопленный в России, показывает эффективность применения методов микробиологического синтеза в решении этой проблемы при использовании целлюлозосодержащих отходов сельского хозяйства, лесной и пищевой промышленности (Эрнст, 1988).

К настоящему времени разработан ряд биотехнологических способов переработки целлюлозосодержащих отходов, основанных на предварительном их гидролизе с последующим глубинным, поверхностным, твердофазным или гетерофаз-ным культивированием микроорганизмов (Шарков и др., 1973; Быков, Прищепов, 1985; Борисенко и др., 2003; Панфилов, 2004).

Гетерофазное глубинное культивирование является одним из наиболее технологичных способов, так как позволяет исключить стадию отделения твердой фракции непрогидролизованного растительного сырья и получать продукт, который содержит не только дрожжевую биомассу, но и непрогидролизованные цел-люлозосодержащие продукты, которые при их содержании в кормах в определенной концентрации улучшают биологическую ценность кормов.

Известна способность дрожжей накапливать в биомассе высокие концентрации микронутриентов, что является основой их использования для получения лечебных и профилактических биологически активных добавок, обогащенных селеном, йодом и др. микроэлементами (Жильцова и др., 1998).

Одной из развивающихся отраслей фармацевтической промышленности является получение лечебно-профилактических препаратов из растительного сырья.

Большой интерес представляет растение стевия (Stevia геЬаисИапа Вег1от) -источник суммы дитерпеновых гликозидов (стевиозид), обладающих в 250-300

раз большей подслащивающей способностью, чем сахароза и применяющихся в диетическом питании в качестве заменителя сахара. Уровень накопления дитер-пеновых гликозидов зависит от почвенно-климатических условий произрастания стевии (Дзюба, 1998). В настоящее время культивирование стевии осваивается в ряде регионов России, в том числе и в республике Северная Осетия - Алания (РСО-А). В России и ряде зарубежных стран разработаны технологии выделения стевиозида, как для пищевой промышленности, так и для медицинских и фармацевтических целей, однако проблема утилизации отходов производства стевиозида остается нерешенной (Комисаренко, 1994, Федоров, 2004).

Целью настоящей работы явилась разработка основ технологии комплексной переработки стевии, культивируемой в республике Северная Осетия-Алания, с получением целевого продукта - стевиозида и белково-углеводной кормовой добавки, обогащенной йодом и селеном. В задачи исследований входило:

- Изучение стевии, культивируемой в предгорной зоне. Северного Кавказа, как сырья для получения дитерпеновых гликозидов.

- Разработка основ технологии получения белково-углеводного продукта на основе отходов производства стевиозида:

• исследование режимов предобработки целлюлозосодержащих отходов как субстрата для культивирования дрожжей;

• разработка режимов гетерофазного культивирования дрожжей на отходах производства стевиозида;

- Изучение закономерностей и разработка способов получения белково-углеводного продукта, обогащенного селеном и йодом;

- Первичная оценка биологической ценности обогащенного йодом и селеном белково-углеводного продукта.

парата Целловиридин Г20х, обеспечивающие 90% степень гидролиза. Впервые показана возможность получения белково-углеводного продукта, обогащенного органическими селеном и йодом, при гетерофазном культивировании дрожжей У. ИрсАуйса на гидролизатах целлюлозосодержащего сырья. На новом биологическом объекте - дрожжах 7. \ipolytica - подтверждены ранее выявленные закономерности обогащения дрожжей селеном. Впервые исследовано влияние селена и серы на общую дыхательную активность клеток дрожжей Г. \ipolytica и распределение потока электронов между двумя путями окисления - цитохромным (классическим) и альтернативным, цианидрезистентным. Показано, что при недостатке серы в среде селен замещает серу и способствует «нормализации» функционирования митохондрий. Впервые показана возможность обогащения йодом в органической форме в присутствии окислителя, как растительного компонента, так и обогащенных селеном дрожжей при гетерофазном культивировании У. Про1уНса на ферментативных гидролизатах целлюлозосодержащего сырья.

Практическая значимость. Впервые определен уровень содержания стевио-зида (11,7%) в листьях стевии, культивируемой в Предгорной зоне Северного Кавказа, что с учетом урожайности стевии определяет перспективу создания сырьевой базы в республике Северная Осетия - Алания для получения стевиозида. Разработаны основы технологии комплексной переработки стевии с получением препарата стевиозида и белково-углеводной добавки при использовании отходов производства стевиозида. Разработаны режимы гетерофазного глубинного культивирования дрожжей, обеспечивающие получение белково-углеводного продукта с содержанием «сырого» протеина 29%, селена 187 мг/кг и йода до'600 мг/кг. Показано, что обогащение селеном и йодом белково-углеводной добавки повышает биологическую ценность продукта, обеспечивая увеличение прироста живой массы кроликов на 15%.

Апробация работы. Основные1 положения диссертационной работы обсуждены на 2-м Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005); Московской международной конференции .«Биотехнология и медицина» (Москва, 2006); Международной научно-практической конференции «Рациональное использование биоресурсов в АПК»

(Владикавказ, 2006); Всероссийской научно-технической конференции «Наука -производство - технологии - экология» (Киров, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и трое тезисов. , ■

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на странице машинописного текста, содержит '/Утаблиц и /¿^"рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы и шести глав экспериментальных исследований. Список литературы включает 226 источников, из них 118 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

В работе использовано воздушно-сухое сырье (влажность < 8%) - лист сте-вии сорта «Рамонская сластена», культивируемой в республике Северная Осетия-Алания, а также отходы производства стевиозида, состоящие из шрота, остающегося после водно-спиртовой экстракции дитерпеновых гликозидов из листьев сте-вии, и стеблей растения. Принимая во внимание соотношение массы стеблей сте-вии и шрота, образующегося после выделения стевиозида, для исследований использовался смешанный субстрат в соотношении шрот: стебли -1:2.

В работе использовали дрожжи Candida maltosa Б-1, Candida tropicalis Б-2, Endomycopsis fibuligera C-2, из коллекции кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева, а также дрожжи Yarrowia lipolytica, любезно предоставленные Звя-гильской Р. А.

Определение стевиозида осуществляли совместно с ВИЛАР: - Качественное определение стевиозида - методом ТСХ на пластинах «Silufol UV 254» (Чехия) в системе хлороформ : этанол (2 : 1), проявитель - пары йода. Спектры 13С ЯМР образцов стевиозида были записаны в дейтерированном пиридине (C5D5N) с концентрацией раствора 0,1 г/мл на спектрометре «Gemini-200»

(Vanan, США). . ..........

Количественное определение стевиозида - методом ВЭЖХ на хроматографи-ческой системе Gilson (США). Хроматографические анализы проводили на колонке Luna 5ц С18 (4,6x250 мм, 10 мкм) (Phenomenex, США) с защитной колонкой

Security Guard Cartridge CI8 (4x3,0 мм) (Phenomenex, CIIIA). В качестве подвижной фазы использовали смесь: деионизированная вода (рН 5,5) - ацетонитрил 70 : 30. Объемная скорость 1 мл/мин. В качестве внешнего стандарта использовали сухой очищенный экстракт стевии, предоставленный ЗАО «НПКФ Аквилон».

Ферментативный гидролиз отходов производства стевиозида при использовании Целловиридина Г20х, предоставленного НТЦ «Лекарства и биотехнология», проводили в реакторе периодического действия при перемешивании 200 об/мин при: t - 50°С, рН среды - 5,5, при времени экспозиции - 2 часа.

Дрожжи культивировали в периодическом режиме в колбах Эрленмейера объемом 250 и 750 мл в 100 мл питательной среды, при температуре 28-30°С и перемешивании 120-150 об/мин и в лабораторном ферментере объемом 5 л, снабженном барботером (подача воздуха до 35 л/ч), при перемешивания - 500-800 об/мин.

При определении селенорезистентности дрожжей и исследовании влияния селена на дыхательную активность в качестве источника углерода использовали глюкозу в концентрации 1 %. Дыхательную активность дрожжей регистрировали с помощью прибора Oximetr Lab-Master pQ-8000, в ячейке Островского -Шольца с использованием компьютерной программы для обработки показаний прибора «sholtz2.exe» в институте биохимии им А.Н. Баха РАН. Различное содержание серы в среде культивирования достигали путем замены соответствующих солей серной кислоты на соли соляной кислоты. Для обогащения дрожжей селеном в среду культивирования вносили диоксид селена в различных концентрациях (3-30 мг SeOj/л).

Определение содержания селена в биомассе осуществляли микрофлуористи-ческим методом (Голубкина, 1995).

Биомассу дрожжей отделяли от жидкой фазы центрифугированием при 4500 об./мин. в течение 30 минут или методом декантации, далее подвергали термолизу (75°С, 30 мин) и отмывали пятикратно водопроводной водой от неорганического селена и йода при центрифугировании или седиментацией при тех же условиях. Продукт сушили при комнатной температуре до остаточной влажности 7-8 %.

Исследование внутриклеточного содержания йода осуществляли методом изотопного разбавления совместно с Институтом биоорганической химии им.

М.М. Шемякина и Ю .А.Овчинникова РАН. В качестве источника йода использовали раствор йодида калия в концентрации 1г/л.

Измерение активности образцов 1251 осуществляли на жидкостном сцинциля-ционном счетчике TRI-CARB 21000TR фирмы Packard (США).

Качественное определение продуктов йодирования определяли методом ТСХ на пластинках Fertigplatten Kieselgel 60 (Merck) в камере с системой растворителей 0,1 М раствор йодида калия - этанол (1 : 2). Хроматограммы анализировали на приборе Instant Imager фирмы Packard (США).

При изучении «включения» йода в продукты автолиза концентрацию белка определяли по методу Лоури.

Определение биологической ценности белково-углеводного продукта проводили на базе Горского ГАУ г. Владикавказа методом пар-аналогов на крольчатах калифорнийской породы в возрасте 60 дней. Продолжительность опыта составляла - 60 дней. Рационы балансировались согласно нормам кормления ВИЖ (Калашников и др., 1978).

Статическую обработку результатов проводили на ПК с помощью пакета статистических программ MS Excel 2000.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Характеристика стевии, культивируемой в республике Северная Осетия -Алания, как сырья для получения препарата стевиозида

В Северной Осетии - Алании разработана технология размножения стевии и ее возделывания по однолетнему циклу при густоте посадки до 60 тыс. экз. раст./ га. Урожайность стевии в этих условиях составляла 9,5 т/га сухого листа и 11 т/га сухих стеблей, что превышало урожайность по сухому листу, достигнутую в Воронежской области (0,8-1,4 т/га) (Удовидченко, Безлёр, 1995) и Краснодарском крае (2-3 т/га) (Горбатенко, Дзюба, 1996).

Методом ВЭЖХ определено содержание стевиозида в листьях стевии, культивируемой в республике СО-А на уровне 11,7% (рис.1), в то время, как, по литературным данным, в стевии, культивируемой в Краснодарском крае и Центральной части России, Крыму, Украине, Молдове, Грузии содержание стевиозида не превышало 5-7% (Горбатенко, Дзюба, 1996;. Лисицин, Воловик, 1999).

Рис. 1. Хроматограмма водного экстракта листьев стевии (по методу С.В. Федорова, 2004)

а - хроматограмма стандарта стевиозида .

б - хроматограмма водного экстракта листьев стевии, культивируемой в республике Северная Осетия-Алания

Совместно с институтом ВИЛАР в лабораторных условиях по методу, предложенному B.C. Федоровым (2004), из сухих листьев стевии был выделен препарат стевиозида, что было подтверждено методом ТСХ.

Подлинность стевиозида была доказана с помощью 13С ЯМР. Методом ВЭЖХ было установлено, что содержание стевиозида в выделенной сумме дитер-пеновых гликозидов составляло 84 %, и было выше рабочего стандарта, содержащего 75% стевиозида (Вьетнам).

Таким образом, полученные данные показывают, что стевия, культивируемая в республике Северная Осетия - Алания характеризуется высоким содержанием целевых веществ -11,7%, а получаемый из данного сырья стевиозид 84%-ной степенью чистоты, что обосновывает возможность ее использования в качестве сырья для получения веществ стевиозидного комплекса.

Характеристика целлюлозосодержащих отходов производства стевиозида как сырья для культивирования дрожжей

При изучении химического состава целлюлозосодержащих отходов производства стевиозида показано, что содержание «сырого» протеина и «сырой» клетчатки в шроте и стеблях существенно различается и составляет: «сырой» протеин - 19,7 и 8,2%, «сырая» клетчатка - 20,6 и 46,5 % соответственно. В смешанном

субстрате (шрот : стебли -1:2) определено содержание «сырой» клетчатки -37,8%, что обосновывает возможность использования данного сырья после его гидролиза для получения белково-углеводной кормовой добавки (табл.1).

Таблица 1

Химический состав отходов производства стевиозида (в воздушно-сухом состоянии)

Отходы производства стевиозида «сырой» протеин, % «сырой» жир, % «сырая» клетчатка, % «сырая» зола, % БЭВ, %

1. трот 19,7±0,29 1,9+0,13 20,6±0,22 7,9±0,19 49,9+0,45

2. стебли 8,2±0,15 1,2+0,10 46,5±0,21 5,2±0,07 35,4+0,06

3. шрот: стебли -1:2 12,0+0,10 1,5±0,11 37,8+0,09 6,1 ±0,05 40,2+0,08

Поскольку в шроте и стеблях растения содержатся остаточные дитерпеновые гликозиды (~ 1%) было исследовано влияние стевиозида на рост дрожжей К Иро1уНса. Исследования показали, что стевиозид в концентрациях 0,5% и 1% не оказывает угнетающего действия на рост дрожжей, что свидетельствует о возможности использования отходов переработки стевии для их культивирования.

Исследование способов предподготовки целлюлозосодержащих отходов производства стевиозида как сырья для культивирования дрожжей

Предподготовка растительного сырья включала стадии измельчения стеблей (0,5-1 мм), суспендирования шрота и измельченных стеблей, термореагентную и ферментативную обработку сырья!

При термореагеншой обработке отходов растительного сырья определяли влияние таких параметров, как температура, рН, давление и время воздействия на выход редуцирующих веществ. Результаты исследований показали, что при давлении 0,5 атм., £=110° наибольший выход РВ - 4,5 г/л достигался при кислотном термогидролизе при рН 3.

При исследовании влияния давления и времени экспозиции на выход РВ показано, Что при изменении давления в диапазоне от 0,5 до 1,5 атм. при рН=3 выход редуцирующих веществ практически не увеличивался и составлял 4,5-5 г/л, а при повышении давления до 2 атм. выход РВ увеличивался до 7,1 г/л (рис.2.).

При исследовании влияния времени экспозиции при разном давлении показано, что выдержка более 30 мин неэффективна, так как выход РВ при этом практически не повышался (рис. 2.).

Рис. 2. Накопление РВ в процессе термогидролиза отходов производства стевио-зида (рН 3, гидромодуль 10)

Таким образом, при химическом термогидролизе был достигнут уровень накопления РВ ~ 7,1 г/л. Так как данная концентрация РВ не может обеспечить высокий уровень обогащения белком продукта при культивировании дрожжей, исследовалась возможность ферментативного гидролиза суммарных отходов производства стевиозида

Ферментативный гидролиз отходов производства стевиозида

Так как эффективность ферментативного гидролиза целлюлозосодержащих материалов в значительной степени зависит от их реакционной способности, было исследовано влияние отношения концентрации субстрата и фермента Целловири-дина Г20х, а также условий предподготовки сырья на выход РВ (табл. 2.).

Полученные данные показывают (табл. 2), что наибольшая концентрация редуцирующих веществ в среде определялась при воздействии фермента на измельченное и термообработанное (автоклавирование 0,5 атм. 30 мин.) сырье. Глубина гидролиза изменялась от 88 до 92 % при 10 %-ной концентрации сырья при увеличении концентрации фермента от 0,1 до 1 %.

При увеличении концентрации субстрата в среде с 10% до 15% выход РВ повышался в среднем на 23%, однако показатель глубины гидролиза при этом не менялся.

Таблица 2

Эффективность ферментативного гидролиза целлюлозосодержащих отходов

производства стевиозида (время экспозиции - 2 часа)

Конце нтра- ция цел- лови- риди- на Г20х, % концентрация субстрата, %

10 | 15

способы предподготовки

измельчение измельчение и ав-токлавирование измельчение измельчение и ав-токлавирование

содержание РВ, г/л глубина гидролиза, % содержание РВ, г/л глубина гидролиза, % содержание РВ, г/л глубина гидролиза, % содержание РВ, г/л глубина гидролиза, %

0,1 7,2+0,21 79,2±0,44 13,4±0,23 88,8±0,33 9,7±0,26 76,3+0,45 15,3±0,31 86,3+0,20

0,2 9,8±0,33 84,7+0,20 15Д±0,19 90,0+0,54 12,3+0,15 81,3+0,20 17,5+0,33 88,0+0,38

0,3 10,4+0,27 85,6+0,24 15,5+0,27 90,3+0,43 12,6+0,23 81,7+0,27 18,6+0,16 88,7+0,30

0,5 12,3±0,30 87,8±0,30 16,1+0,20 90,6±0,63 15,1+0,15 84,8±0,27 18,7+0,16 88,8±0,40

1 12,8+0,34 88,3 ±0,27 18,3+0,29 91,8±0,28 17,20,15 87,8+0,26 21,8+0,16 90,0±0,25

Таким образом, на основании проведенных исследований разработаны режимы предподготовки и условия ферментативного гидролиза целлюлозосодержащих отходов производства стевиозида для использования их в качестве сырья для культивирования дрожжей.

Гетерофазное культивирование дрожжей на отходах производства стевиозида. Получение белково-углеводного продукта

Отбор продуцентов для гетерофазного глубинного культивирования проводили среди штаммов дрожжей Candida maltosa Б-1, Candida tropicalis Б-2, Yar-rowia lipolytica и Endomycopsis fibuligera C-2, практически применяемых при получении кормового белка на гидролизатах растительного сырья. Эксперименты показали, что все исследованные штаммы способны активно расти на средах, содержащих в качестве источника углерода ферментативные гидролизаты целлюлозосодержащих отходов производства стевиозида. Для исследований был отобран штамм Y. lipolytica, титр клеток которого в стационарной фазе в 2-3 раза превосходил титр клеток других штаммов.

Для глубинного гетерофазного культивирования дрожжей 7. lipolytica 10%-ную водную суспензию, содержащую смешанные шрот и измельченные стебли (0,5-1мм) - 1:2, автоклавировали при 0,5атм. 30 мин. Далее в суспензию вносили

фермент Целловиридин Г20х в концентрации 0,2-0,3%. Ферментативный гидролиз осуществляли в реакторе периодического действия при рН 5,5,1=50°С и перемешивании 200 об/мин. Время экспозиции составляло 2 часа. При таких условиях концентрация РВ составила 16 г/л. К полученному ферментативному гидро-лизату добавляли минеральные соли в концентрациях, соответствующих их содержанию в среде «П» и инокулят дрожжей У. \ipolytica в количестве N0=6,7-• 106кл/мл.

Дрожжи У \ipolytica культивировали в периодическом режиме в ферментере (У06щ=5 л.) при I = 28-30°С, рН=4,5-5, при перемешивании - 500-800 об/мин и аэрации. Выращивание дрожжей осуществлялось до начала стационарной фазы. Показатели гетерофазного глубинного культивирования представлены в таблицеЗ.

Таблица 3

Показатели процесса гетерофазного глубинного культивирования дрожжей Уаг-гом>1а Иро1уйса на ферментативных гидролизатах целлюлозосодержащих отходов

производства стевиозида

Концентрация РВ (нач/кон), г/л 16,0/1,5

Потребление РВ, % 91,0

Прирост дрожжевых клеток (N„,¡«-N0), кл/мл х 108 6,6

Удельная скорость роста, цтах, ч"1 0,26

Концентрация биомассы X (расчетно), г/л 21,8

Содержание в сухом продукте:

- «сырого» протеина, % 29,0

- «сырой» клетчатки, % 20,0

В процессе гетерофазного культивирования потребление дрожжами редуцирующих веществ составило 91%, прирост дрожжевых клеток - 6,6 кл/мл х 108. Содержание "сырого" протеина в белково-углеводном продукте увеличилось на 17% и составило 29%, а показатель "сырой" клетчатки снизился на 18 % и составил 20 %.

Таким образом, в результате проведенных исследований показана возможность получения белково-углеводного продукта при гетерофазном глубинном культивирования дрожжей на ферментативных гидролизатах отходов производства стевиозида.

Обогащение микроэлементами белково-углеводной добавки Изучение влияния селена на рост дрожжей К Иро1у1ка. Обогащение селеном белково-углеводной добавки

Для повышения биологической ценности полученного белково-углеводного продукта изучали возможность его обогащения селеном.

При культивировании К \ipolytica на средах, содержащих в качестве источника углерода глюкозу, показано, что низкие концентрации селена до 1 мг 8е02/л не оказывали влияния на рост дрожжей. Увеличение содержания в среде культивирования селена выше 4 мг 8е02/л приводило к резкому снижению активности роста дрожжей, а концентрации выше 10 мг/л 8с02 ингибировали их рост. Величина, приводящая к 50% снижению роста культуры, составила 8 мг 8е02/л (рис. 3), что позволяет отнести дрожжи У. Иро1у11са к группе нерезистентных к селену дрожжей, которые способны накапливать в биомассе более высокий уровень селена по сравнению с резистентными (Жильцова и др., 1998).

Концентрация Бе02, мг/л

Рис. 3. Влияние концентраций 8е02 на рост дрожжей, при культивировании на среде с глюкозой

Так как, в настоящее время имеется мало данных о механизме действия селена на клетки дрожжей, было исследовано влияние различных концентраций селена в средах культивирования на дыхательную активность селенонерезистентных дрожжей V. Иро1уНса. Изучение компонентов дыхательной цепи, участвующих в окисление того или иного субстрата, осуществлялось методом ингибиторного анализа (рис. 4).

Показано, что в норме, в отсутствии селена, при выращивании дрожжей на полноценной среде по сере, окисление осуществлялось в основном через цито-хромный путь. В среде, обедненной по сере, наряду с цитохромньш путем функционировал и альтернативный, цианидрезистентный путь. Добавление низких

концентраций селена, не влияющих на скорость роста дрожжевых клеток, приводило к более полному включению цитохромного пути. Более высокие концентрации селена в среде ингабировали скорость роста клеток и их дыхательную активность. При этом дыхательная активность дрожжей полностью ингибировалось при совместном добавлении КСИ и СГ, что свидетельствует о функционировании двух путей окисления - мигохондриальной цитохромной системы и альтернативного пути. Создается впечатление, что 8е замещает Б в клетках, способствуя «нормализации» функционирования митохондрий.

Клетки Клетки

Рис 4. Кривые поглощения кислорода клетками дрожжей У. Нро1уИса (а, б- клетки дрожжей, выращенные на полноценной по содержанию серы среде (контроль 1); в, г- клетки дрожжей, выращенные на среде, обедненной по сере (контроль 2); д, е - клетки дрожжей, выращенные на среде, обедненной по сере, при добавлении 3 мг/л 8е02; ж, з- клетки дрожжей, выращенные на среде, обедненной по сере, при добавлении 8 мг/л 8е02).

Поскольку ранее было показано, что селенорезистентность дрожжей и накопление селена в биомассе значительно возрастает при культивировании их в условиях, нелимитированных кислородом, а также на среде, обедненной по сере (Жильцова и др., 1996) для изучения накопления селена в биомассе дрожжи куль-

тивировали в периодическом режиме в ферментере в условиях интенсивной аэрации на среде, обедненной по сере, с глюкозой, при концентрации селена - 20 г/л БеОг, которая не оказывала влияния на продолжительность лаг-фазы и приводила к незначительному снижению активности роста дрожжей - в среднем на 10%. Содержание серы в среде было снижено с 835,2 мг/л до 6,8 мг/л. При культивировании в таких условиях в начале стационарной фазы роста в биомассе дрожжей накапливалось до 1280 мг/кг 8еОг при содержании «сырого» протеина - 49,8%.

При культивировании дрожжей в ферментере в периодическом режиме в условиях гетерофазного глубинного культивирования на подготовленных отходах производства стевиозида и после осуществления постферментационной обработки был получен белково-углеводный продукт, состоящий из дрожжевой биомассы и твердой неутилизируемой фракции растительных отходов, который содержал 29% «сырого» протеина, 20% «сырой» клетчатки и 187 мг/кг селена.

Исследование возможности йодирования белково-углеводпой кормовой добавки на основе целлюлозосодержащих отходов производства стевиозида

В основу разработки метода йодирования белково-углеЬодного продукта положена извёстная химическая реакция окисления йодида в присутствии сильного окислителя. Получающийся в результате реакции окисления молекулярный йод взаимодействует с органическими веществами клетки, предположительно, встраиваясь в тирозин, и образовывает прочные ковалентные соедДпяшйучения возможности введения йода в белково-углеводный продукт, обогащенный селеном, исследовалась возможность обогащения йодом, как растительной биомассы отходов производства стевиозида, так и дрожжей, на разных технологических стадиях получения белково-углеводного продукта.

В таблице 4 представлены данные, характеризующие влияние окислителя в реакционной смеси на процесс «включения» йода в растительную массу. Под понятием «включение» подразумевается количество йода, ковалентно связанного с органическими соединениями клетки, в том числе и с белками. Из данных таблицы 4 следует, что при увеличении концентрации Н202 с 2 до 6 мМ/л количество йода в растительной клетке соответственно увеличивается со 100 до 400 мкг /г.

Таблица 4

Влияние концентрации Н202 на «включение» йода в шрот листьев стевии

Концентрация Н202,мМ/л Активность образца, импульс/мин Содержание 12, мкг/г

2 55619 100

3 130660 290

4 141254 320

6 178019 400

При изучении «включения» йода в растительную массу шрота листьев стевии и стеблей, показано, что в шроте йода накапливалось на 57% больше, чем в натив-ных стеблях растения (при этом неспецифическая сорбция йодида составила 0,1%) (табл. 5), что связано в основном с более высоким содержанием белка, доступного для йодирования, в шроте по сравнению Со стеблями растения (табл. 5).

Таблица 5

«Включение» йода в биомассу целлюлозосодержащих отходов производства

стевиозида (шрот и стебли растения) (5 мМ/л Н202)

Отходы производства стевиозида Активность образца, импульс/мин Содержание 12, мкг/г

1. шрот 135063 300

2. стебли 69759 130

Так как белково-углеводный продукт помимо твердой неутилизируемой фракции содержит биомассу дрожжей, было исследовано «включение» йода в клетки дрожжей.

При исследовании «включения» йода в клетки дрожжей культивирование осуществляли на среде, содержащей в качестве источника углерода глюкозу. Показано, что в присутствии 9 мМ/л Н202 в биомассу дрожжей «включалось» 17 мг 12/г АСВ дрожжей. Степень утилизации йода при данных условиях составляла 3,4%.

Таким образом, в присутствии Н202 йод может «включаться» как в биомассу целлюлозосодержащих отходов производства стевиозида, так и в клетки дрожжей У Иро1уНса.

При йодировании дрожжей, обогащенных селеном, показано, что селен увеличивает степень утилизации йода, при этом при одинаковом внесении в среду радиоактивной метки в нативную биомассу включалось 0,31 мг/г органически свя-

занного йода, а в биомассу дрожжей, обогащенную селеном - 1,22 мг/г соответственно (табл. 6).

Таблица 6

Влияние селена на процесс йодирования биомассы дрожжей

Характеристика биомассы дрожжей Внутриклеточное содержание йода в дрож. биомассе, имп./мин Степень утилизации йода из среды, % Содержание йода в биомассе (на сухой вес дрожжей), мг/г

- нативная биомасса 228 0,9 0,31

- биомасса, обогащенная селеном 907 3,5 1,22

Методом ТСХ при исследовании йодированных отходов производства сте-виозвда и дрожжей У. Нро1уНса (рис. 5) показано, что содержащийся в йодированных отходах, подвергнутых ферментолизу, йод, находится в биополимерной, а также в водорастворимой фракции (рис. 5 б). Из рис. 5 в следует, что йод, содержащийся в йодированных дрожжах, культивированных на целлюлозосодержащих отходах, также находится в органически связанном виде.

1251 мече- 1251 меченый 1251 мече-

иодид

ныи иодид

1251 меч( раствор! а нические

I мечен лимерная

ные водо-мые орга- ч-соединения

ш биопо-фракция

I меченая д юж-

жевая культ

Фа

а- радиоактивный изотоп I; б-йодированные, подвергнутые ферментативному гидролизу отходы производства стевиозида; в- йодированные дрожжи У Иро1уИса, выращенные на отходах производства стевиозида

Рис 5. ТСХ продуктов йодирования

Таким образом, показано, что йодирование белково-углеводной добавки в присутствии Н202 возможно на разных стадиях технологического процесса, так как йод может «включаться» в массу, как целлюлозосодержащих отходов производства стевиозида, их гидролизатов, так и в клетки дрожжей У. Пропса. При

этом возможно получение белково-углеводной добавки, содержащей 29% «сырого» Протеина, 187 мг/кг селена и 300-600 мг/кг органически связанного йода.

Первичная биологическая оценка белково-углеводной кормовой добавки, обогащенной микроэлементами на оспове отходов производства стевиозида

На экспериментальной базе НИИ биотехнологии Горского государственного аграрного университета г. Владикавказа был проведен опыт по использованию при кормлении крольчат белково-углеводной добавки, обогащенной йодом и селеном, полученной на основе отходов производства стевиозида.

Условия содержания и кормления животных в контрольной и опытной группах были идентичными, разница состояла в том, что в рационе кормления кроликов опытной группы жмых подсолнечный заменяли на белково-углеводную кормовую добавку на основе отходов производства стевиозида (34 % общей питательности рациона в кормовых единицах - КЕ).

Из анализа данных таблицы 7 следует, что к концу опыта показатель Средней живой массы животных опытной группы, получавшей, белково-углеводный продукт, на 5,7% был выше по сравнению с контрольной 1руппой и составлял 147 г или. По показателям абсолютного и среднесуточного приростов живой массы превосходство крольчат опытной группы достигло 12,5 и 12,7% соответственно.

Таблица 7

Развитие кроликов при включении в рационы белково-углеводной кормовой добавки

Показатели Единица измерения Группы животных

Контрольная | Опытная

Возраст, дай

60 120 60 120

Живая масса г 1456+0,45 2580+0,78 1455+0,59 2727

Прирост живой массы Абсолютный г - 1130 ± 19,4 - 1271 ± 17,4

В % к контролю - - 112,5

Среднесуточный г - 18,8 ±0,35 - 21,2 ±0,28

В % к контролю - - 112,7

При исследовании биологической эффективности белково-углеводной кормовой добавки, обогащенной селеном и йодом, контрольная группа получала в составе рациона необогащенную микроэлементами белково-углеводную добавку.

Превосходство крольчат опытной группы через 60 дней опыта составило: по живой массе - 165 г (6,2%); по абсолютному приросту живой массы - 164 г (14,9%), а по среднесуточному приросту - 2,7 г (14,7%) (табл.8).

Таблица 8

Развитие кроликов при включении в рационы белково-углеводной добавки,

обогащенной селеном и йодом

Показатели Един ица измерения Группы животных

Контрольная | Опытная

Возраст, дни

.60 120 60 120

Живая масса г 1561±1,88 2663±4,08 1563±2,69 2828±6,44

В % к контролю 100,1 106,2

Прирост живой массы Абсолютный г - 1102±2,61 - 1266±6,96

В % к контролю 114,9

Среднесуточный г 18,4±0,23 - 21,1±0,12

В % к контролю 114,7

Таким образом, необогащенная микроэлементами белково-углеводная добавка повышала прирост живой массы кроликов в среднем на 13% по сравнению со жмыхом подсолнечным. При включении в рационы белково-углеводной добавки, обогащенной йодом и селеном, прирост живой массы увеличивался в среднем на 15% по сравнению необогащенной микроэлементами белково-углеводной добавкой.

Выводы

1. Определено количество стевиозида в листьях стевии, культивируемой в республике Северная Осетия - Алания на уровне11,7%, что с учетом урожайности определяет практическую возможность культивирования в республике Северная Осетия — Алания стевии для получения стевиозида.

2. Показано, что стевиозид в концентрациях до 1% не оказывает угнетающего влияния на рост дрожжей, что свидетельствует о возможности использования отходов производства стевиозида для получения обогащенных белком кормовых добавок на основе культивирования дрожжей.

3. На основании изучения режимов предобработки отходов производства сте-виозида (влияние температуры, давления) и воздействия фермента Целлови-ридина Г20х показана возможность достижения 90% степени гидролиза отходов при измельчении и термической обработке растительного сырья при 110°С в течение 30 минут и концентрации фермента 1,0%. При этом достигается выход РВ до 22 г/л.

4. При сравнительном исследовании роста дрожжей Candida maltosa Б-1, Candida tropicalis Б-2, Endomycöpsis fibuligera C-2, Yarrowia lipolytica на ферментативных гидролизатах отходов производства стевиозида отобран наиболее активный штамм дрожжей К lipolytica.

5. Разработаны режимы гетерофазного глубинного культивирования дрожжей Y.lipolytica, обеспечивающие получение продукта, содержащего 29% "сырого" протеина и 20% "сырой" клетчатки.

6. Изучено влияние концентраций ScOä от 1 до 30 мг/л на рост дрожжей Y.lipolytica, установлена их селенонерезистентность (величина Gso составляет 8 мг/л). Исследовано влияние селена и серы на общую дыхательную активность клеток дрожжей Y. lipolytica и распределение потока электронов между двумя путями окисления - цитохромным (классическим) и альтернативным. Показано, что при недостатке серы в среде селен замещает серу и способствует «нормализации» функционирования митохондрий.

7. Показана возможность культивирования дрожжей Y. lipolytica на среде, обедненной по сере, при концентрации Se02 - 20 мг/л в условиях интенсивной аэрации. Получена биомасса дрожжей Y. lipolytica, содержащая до 1289 мг/кг органического селена и «сырого» протеина 49,8%.

8. При исследовании иодирования дрожжей и целлюлозосодержащих отходов производства стевиозида показано, что: йод в присутствии окислителя (2-9 мМ/л Н2О2) включается, как в дрожжевые клетки, так и в растительную Массу.

9. "Установлена возможность йодирования белково-углеводного продукта, обогащенного селеном. При гетерофазном культивировании дрожжей получена белково-углеводная добавка с содержанием органического селена 187 мг/кг и йода до 600 мг/кг.

10. Показано, что полученная при гетерофазном культивировании дрожжей бел-ково-углеводная добавка повышает прирост живой массы кроликов в среднем на 13% по сравнению со жмыхом подсолнечным. При включении в рационы белково-углеводной добавки, обогащенной йодом и селеном, прирост живой массы кроликов увеличивается в среднем на 15% по сравнению с введением необогащенной микроэлементами белково-углеводной добавкой.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Цугкиева Е.Б., Павлова Н.М., Градова Н.Б., Цугкиев Б.Г. Получение белково-углеводной кормовой добавки на основе отходов производства стевиозида // Биотехнология. 2006. № 5. С. 45-51.

2. Цугкиева Е.Б. Оценка биологической ценности белково-углевой кормовой БАД на основе целлюлозосодержащих отходов производства стевиозида. // Материалы международной научно-практической конференции «Рациональное использование биоресурсов в АПК». — Владикавказ, 2006. — с.160-161.

3. Цугкиева Е.Б., Бурлакина Н.И., Градова Н.Б. Основы технологии получения селенообогащенных БАД на целлюлозосодержащих отходах производства стевиозида // Материалы Всероссийской научно-технической конференции «Наука — производство - технологии - экология». - Киров, 2006. -с.181-182.

4. Цугкиева Е.Б., Звонкова E.H., Цугкиев Б.Г., Градова Н.Б. Биотехнология комплексной технологии переработки сгевии // 3-й Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - Москва, 2005. - с. 325.

5. Цугкиева Е.Б. Отходы производства стевиозида как сырье для получения БАД // Материалы Московской международной конференции «Биотехнология и медицина». - Москва, 2006. - с.233.

6. Цугкиева Е.Б. Стевия - растение настоящего и будущего. // Материалы международной научно-практической конференции «Рациональное использование биоресурсов в АПК». - Владикавказ, 2006. - с.159.

Автор выражает искреннюю благодарность и признательность своему научному руководителю д.б.н., профессору Н.Б. Градовой, чей богатый опыт, внимание и поддержка помогли в создании данной работы, а также д.х.н., профессору E.H. Звонковой, д.б.н., профессору P.A. Звягальской, к.х.н., ст. науч. сотр. Ю.С. Скоблову, к.б.н., ст. науч. сотр. Н.М. Павловой за помощь в проведении экспериментальных исследований и обобщении результатов.

Формат 60x84 1/16, Усл. Печ. Лист 1,5 Подписано в печать 25.01.07 г. Тираж 100 экз. Заказ Ка 179 Отпечатано в типографии «АллА Принт» Тел. (495) 621-86-07, факс (495) 621-70-09 www.allaprint.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Цугкиева, Елена Борисовна

Введение.

Часть 1: Обзор литературы.

1.1. Стевия. Биологические особенности. Химический состав и методы выделения веществ стевиозидного комплекса.

1.2. Целлюлозосодержащие материалы как сырье для микробиологического синтеза белка.

1.3. Способы культивирования микроорганизмов на растительном сырье.

1.4. Использование дрожжей для получения БАД, обогащенных микроэлементами.

1.4.1. Получение селенообогащенной биомассы дрожжей.

1.4.2. Биологическая роль йода. «Включение» йода в дрожжевую и растительную биомассу.

Часть 2. Экспериментальная часть.

Глава 1: Объекты и методы исследований.

Глава 2: Характеристика стевии, культивируемой в республике Северная

Осетия - Алания, как сырья для получения препарата стевиозида.

Глава 3. Характеристика целлюлозосодержащих отходов производства стевиозида как сырья для культивирования дрожжей.

3.1. Исследование способов предподготовки целлюлозосодержащих отходов производства стевиозида для культивирования дрожжей.

3.2. Ферментативный гидролиз отходов производства стевиозида.

Глава 4. Гетерофазное культивирование дрожжей на отходах производства стевиозида. Получение белково-углеводного продукта.

Глава 5. Обогащение микроэлементами белково-углеводной добавки.

5.1. Изучение влияния селена на рост дрожжей Yarrowia lipolytica. Обогащение селеном белково-углеводной добавки.

5.2. Исследование возможности йодирования белково-углеводной кормовой добавки на основе целлюлозосодержащих отходов производства стевиозида

Глава 6: Биологическая оценка белково-углеводной кормовой добавки, обогащенной микроэлементами, на основе отходов производства стевиозида 97 Заключение.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка основ технологии комплексной переработки стевии"

В соответствии с современными воззрениями рациональное использование целлюлозосодержащего сырья, применение замкнутых систем материального производства, ослабляя антропогенное воздействие на окружающую среду, повышая эффективность использования солнечной энергии, является одним из необходимых факторов устойчивого развития общества.

Важнейшей проблемой развития современного общества является обеспечение продовольственными белковыми ресурсами, а также необходимыми нут-рицевтиками для рационального питания человека (В.А. Тутельян, 2002).

К настоящему времени разработан ряд биотехнологических способов переработки целлюлозосодержащих отходов, основанных на предварительном их гидролизе с последующим глубинным, поверхностным, твердофазным или ге-терофазным культивированием микроорганизмов (В.И. Шарков и др., 1973; В.А. Быков, Ф.А. Прищепов, 1985; Е.Г. Борисенко и др., 2003; В.И. Панфилов, 2004).

Гетерофазное глубинное культивирование является одним из наиболее технологичных способов, так как позволяет исключить стадию отделения твердой фракции непрогидролизованного растительного сырья и получать продукт, который содержит не только дрожжевую биомассу, но и непрогидролизован-ные целлюлозосодержащие продукты, которые при их содержании в кормах в определенной концентрации улучшают биологическую ценность кормов.

Большой интерес представляет растение стевия (Stevia rebaudiana Bertoni) -источник суммы дитерпеновых гликозидов (стевиозид), обладающих в 250-300 раз большей подслащивающей способностью, чем сахароза и применяющихся в диетическом питании в качестве заменителя сахара. Уровень накопления дитерпеновых гликозидов зависит от почвенно-климатических условий произрастания стевии (О.О. Дзюба, 1998). В настоящее время культивирование стевии осваивается в ряде регионов России, в том числе и в республике Северная Осетия - Алания (РСО-А). В России и ряде зарубежных стран разработаны технологии выделения стевиозида, как для пищевой промышленности, так и для медицинских и фармацевтических целей, однако проблема утилизации отходов производства стевиозида остается нерешенной (Н.Ф. Комисаренко, 1994, С.В. Федоров, 2004).

Научная новизна результатов исследований. Впервые изучено содержание дитерпеновых гликозидов в стевии, культивируемой в предгорной зоне Северного Кавказа, и показана возможность ее использования в качестве сырья для получения стевиозида пищевого и медицинского назначения со степенью чистоты целевого продукта 84%. Разработаны режимы предподготовки и ферментативного гидролиза отходов производства стевиозида при использовании ферментного препарата Целловиридин Г20х, обеспечивающие 90% степень гидролиза. Впервые показана возможность получения белково-углеводного продукта, обогащенного органическими селеном и йодом, при гетерофазном культивировании дрожжей Y. lipolytica на гидролизатах целлюлозосодержащего сырья. На новом биологическом объекте - дрожжах Y. lipolytica - подтверждены ранее выявленные закономерности обогащения дрожжей селеном. Впервые исследовано влияние селена и серы на общую дыхательную активность клеток дрожжей Y. lipolytica и распределение потока электронов между двумя путями окисления - цитохромным (классическим) и альтернативным, цианидрези-стентным. Показано, что при недостатке серы в среде селен замещает серу и способствует «нормализации» функционирования митохондрий. Впервые показана возможность обогащения йодом в органической форме в присутствии окислителя, как растительного компонента, так и обогащенных селеном дрожжей при гетерофазном культивировании Y. lipolytica на ферментативных гидро-лизатах целлюлозосодержащего сырья.

Практическая значимость. Впервые определен уровень содержания сте-виозида (11,7%) в листьях стевии, культивируемой в Предгорной зоне Северного Кавказа, что с учетом урожайности стевии определяет перспективу создания сырьевой базы в республике Северная Осетия - Алания для получения стевио-зида. Разработаны основы технологии комплексной переработки стевии с получением препарата стевиозида и белково-углеводной добавки при использовании отходов производства стевиозида. Разработаны режимы гетерофазного глубинного культивирования дрожжей, обеспечивающие получение белково-углеводного продукта с содержанием «сырого» протеина 29%, селена 187 мг/кг и йода до 600 мг/кг. Показано, что обогащение селеном и йодом белково-углеводной добавки повышает биологическую ценность продукта, обеспечивая увеличение прироста живой массы кроликов на 15%.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Цугкиева, Елена Борисовна

Заключение

В основе современных представлений о здоровом питании лежит концепция, предусматривающая необходимость и обязательность полного обеспечения потребностей организма не только в энергии, эссенциальных макро- и мик-ронутриентах, а также в целом ряде минорных компонентов пищи.

К нутриентам, являющимся важнейшими регуляторами биохимического и функционального статуса макроорганизма, относятся селен и йод. Именно этим объясняются широкие исследования, направленные на получение препаратов, БАД, обогащенных данными элементами. В настоящее время на рынок поступило большое число препаратов, содержащих селен и йод в основном в минеральной форме. Однако установленный факт наибольшей биологической ценности этих элементов при поступлении в макроорганизм в органической форме определил перспективность разработок биотехнологических процессов, основанных на микробиологическом синтезе. Физиологические и биохимические аспекты включения селена и йода в органические компоненты клетки требуют более глубокого изучения для разработки технологий получения продуктов, обогащенных этими микроэлементами.

Полученные в работе результаты при исследовании влияния разных концентраций селена на рост и активность дыхания дрожжей Y. lipolytica при их культивировании на среде, обедненной по сере, подтверждают ранее полученные данные (Т.С. Жильцова и др., 1998) о том, что оптимальной концентрацией для получения биомассы дрожжей, обогащенной селеном, включенным в органические компоненты клетки, является концентрация селена, снижающая активность роста на 50%. Результаты исследования дыхательной активности клеток дрожжей Y. lipolytica позволяют обосновать этот вывод тем, что включение селена вместо серы обеспечивает активное митохондриальное дыхание клетки, а, следовательно, и биосинтетические процессы и, в частности, синтез белка, что очень важно при получении продукта, обогащенного белком на основе культивирования дрожжей.

Большое значение для развития биотехнологии получения йодированных БАД, содержащих йод в органической форме имеют результаты исследований, показавшие «включение» йода в дрожжевой и целлюлозосодержащий компонент продукта при гетерофазном культивировании. Эти результаты дают основание для разработки технологий, предусматривающих возможность иодирования получаемого продукта на разных технологических стадиях при использовании целлюлозосодержащих субстратов.

Основным объектом данной работы явилось растение стевия, являющееся источником получения препарата стевиозида, родиной которого является плоскогорье Северо-Восточного Парагвая у границы с Бразилией (C.C.Shock, 1982; D.H. Gaenadi, 1987). В настоящее время культивирование стевии осваивается в ряде регионов России (Воронежской области, Краснодарской крае и др.), в том числе и в республике Северная Осетия - Алания (РСО-А). Сравнение урожай-ностей, достигаемых в разных регионах России, показало, что почвенно-климатические условия Предгорья Северного Кавказа являются более благоприятными для выращивания стевии по сравнению с другими регионами.

Так как показано, что стевия не обладает токсическим эффектом, и имеются данные о возможности включения ее в рационы кормления животных, целесообразной явилась разработка основ технологии комплексной технологии переработки стевии с получением целевого продукта - стевиозида и белково-углеводного продукта. В республике Северная Осетия-Алания планируется культивировать стевию на 5 га. Учитывая урожайность сухого листа стевии (9,5 т/га) и сухих стеблей (11 т/га), а также количество получаемого стевиозида, составляющее 80 г/кг сухого листа, выход препарата целевого продукта с 5 га посевных площадей составит около 3 т/год стевиозида. Так как выход белково-углеводного продукта составил ~ 60%, из отходов производства стевиозида возможно получение около 35 т/год белково-углеводного продукта.

Для получения полноценных кормов в 1 тонну комбикорма целесообразно добавлять 100 кг белково-углеводной добавки, следовательно, исходя из выхода белково-углеводной добавки в год, возможно получение 350 т комбикормов, обогащенных белково-углеводной добавкой, содержащей йод и селен в органической форме.

Полученные результаты исследований могут явиться основой для разработки исходных данных для проектирования установки по комплексной переработке стевии в РСО-А мощностью 3 т/год целевого продукта - стевиозида и 35 т/год белково-углеводной кормовой добавки.

1. Определено количество стевиозида в листьях стевии, культивируемой в республике Северная Осетия - Алания на уровне 11,7%, что с учетом урожайности определяет практическую возможность культивирования в республике Северная Осетия - Алания стевии для получения стевиозида.

3. На основании изучения режимов предобработки отходов производства стевиозида (влияние температуры, давления) и воздействия фермента Целловиридина Г20х показана возможность достижения 90% степени гидролиза отходов при измельчении и термической обработке растительного сырья при 110°С в течение 30 минут и концентрации фермента 1,0%. При этом достигается выход РВ до 22 г/л.

4. При сравнительном исследовании роста дрожжей Candida maltosa Б-1, Candida tropicalis Б-2, Endomycopsis Jibuligera C-2, Yarrowia lipolytica на ферментативных гидролизатах отходов производства стевиозида оюбран наиболее активный штамм дрожжей Y. lipolytica.

5. Разработаны режимы гетерофазного глубинного культивирования дрожжей Y.lipolytica, обеспечивающие получение продукта, содержащего 29%) "сырого" протеина и 20% "сырой" клетчатки.

6. Изучено влияние концентраций Se02 от 1 до 30 мг/л на рост дрожжей Y.lipolytica, установлена их селенонерезистентность (величина G5o составляет 8 мг/л). Исследовано влияние селена и серы на общую дыхательную активность клеток дрожжей Y. lipolytica и распределение потока электронов между двумя путями окисления - цитохромным (классическим) и альтернативным. Показано, что при недостатке серы в среде селен замещает серу и способствует «нормализации» функционирования митохондрий.

7. Показана возможность культивирования дрожжей У lipolytica на среде, обедненной по сере, при концентрации SeCb - 20 мг/л в условиях интенсивной аэрации. Получена биомасса дрожжей У. lipolytica, содержащая до 1289 мг/кг органического селена и «сырого» протеина 49,8%.

8. При исследовании иодирования дрожжей и целлюлозосодержащих отходов производства стевиозида показано, что йод в присутствии окислителя (2-9 мМ/л Н2Ог) включается, как в дрожжевые клетки, так и в растительную массу.

9. Установлена возможность йодирования белково-углеводного продукта, обогащенного селеном. При гетерофазном культивировании дрожжей получена белково-углеводная добавка с содержанием органического селена 187 мг/кг и йода до 600 мг/кг.

10. Показано, что полученная при гетерофазном культивировании дрожжей белково-углеводная добавка повышает прирост живой массы кроликов в среднем на 13% по сравнению со жмыхом подсолнечным. При включении в рационы белково-углеводной добавки, обогащенной йодом и селеном, прирост живой массы кроликов увеличивается в среднем на 15% по сравнению с введением необогащенной микроэлементами белково-углеводной добавкой.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Цугкиева, Елена Борисовна, Москва

1. Авцын А.П., Жаворонков А.А., Риш Ш.А., Строчкова JI.C. Микроэлемен-тозы человека. М.: Медицина. 1991.С. 196-231.

2. Апишин С. JI. Влияние площади питания стевии на урожай сухого листа в Западной лесостепи Украины // Введение в культуру стевии — источника низкокалорийного заменителя сахара. Киев, 1990. С. 63-66.

3. Артур JI. Реакции, инициированные излучением высокой энергии// Целлюлоза и ее производные / Ред. Н. Байклз, JI. Сегал. М., 1974. Т. 2. С. 356-291.

4. Арутюнянц С.И., Хамракулов Б. Влияние ферментированной пшеничной соломы на организм крупного рогатого скота. Тр. УЗНИВИ // Узб. научно-исслед. вет. инст-т. 1986. Т. 40. С. 69-74.

5. Африкян Э.К. Некоторые проблемы микробиологического получения пищевых и кормовых продуктов // Биологический журнал. 1984. Т.34. № 10. С.825-835.

6. Бакай С.М. Аспекты использования целлюлазы грибов Chaetomium cellulo-liticum в подготовке кормов//Ферменты в народном хозяйстве и медицине. Киев, 1974, № 6. С. 155.

7. Бекер М.Е. Трансформация продуктов фотосинтеза. Рига: Зинатне, 1984. С. 11-25, 83-131.

8. Билай В. И., Билай Т. И., Мусич Е. Г. Трансформация целлюлозы грибами. Киев, 1982. 295 с.

9. Богдан С.Д., Сивере B.C. Использование Geotrichum candidum для повышения кормовой ценности кукурузных стержней // Микробиологический журнал. 1979, Т.41. №2. С.135-140.

10. Бодруг М. В. Интродукция стевии (Stevia Rebaudiana (Bertoni)) в Молдове // Материалы науч. конф. «Биологическое разнообразие. Интродукция растений». СПб., 1995. С. 142—143.

11. Бутова С.Н. Биотехнологическая деградация отходов растительного сырья. -М., 2004. 86-93 с.

12. Варвикер Д.О. Набухание целлюлозы// Целлюлоза и ее производные / Ред. * Н.Байклз, Л.Сегал. М., 1974. Т.1. С. 235-278.

13. Васшьневш С. I., Хасянев1ч А. I., Адамчык Г. Г., Бярдз1чавец Л. Г. Ф1таб1ях1м1чныя даследаванш Stevia Rebaudiana (Bertoni) як натуральнага падслалоджвалышка // Весщ Акадэмп навук БССР. Сер. б1ял. навук. 1991. № 3. С. 114—117.

14. Гауровитц Ф. Химия и биология белка. М., 1953. 435с.

15. Гвасалия В. П., Коваленко Н. В., Гаргулия М. Ч. Изучение возможности возделывания двулистника садкого (медовая трава каа-хе) в условиях Абхазии // Субтроп, культуры. 1990. № 5. С. 149-156.

16. Гмошинский И.В., Мазо В.К., Тутельян В.А., Хотимченко С.А. Микроэлемент селен: роль в процессах жизнедеятельности. //Экология моря. 2000. -№54.-С. 5-19.

17. Голубев В.Н., Гедрих М.Г. и др. Ресурсосберегающая технология природного подсластителя пищевых продуктов стевиозида.// Пищевая промышленность. 1997. №5. С. 10-11.

18. Голубкина Н.А. Флуориметрический анализ определения селена // Журнал аналитической химии, 1995, № 5, с. 492-497

19. Горбатенко Л. Е, Дзюба О. О. Интродукция стевии на юге России // Тр. I Всерос. конф. по бот. ресурсоведению. СПб. 1996. С 133.

20. Грачева И.М., Гаврилова И.Н., Иванова JI.A. Технология микробных белковых препаратов, аминокислот и жиров. М.: Пищевая промышленность. 1980. С.198.

21. Дамберг Б.Э., Апсите М.Р. Получение селеносодержащих дрожжей Sac-charomyces cerevisiae и их биологическая ценность. // Сб.: «Микробиоло! ия и биотехнология производства кормов». Рига: Зинатне., 1990. С. 160.

22. Денисова Г. А. Распределение в растительном мире терпеносодержащих вместилищ//Бот. журн. 1976. Т. 61. №4. С 1489—1504.

23. Денисова Г. А. Терпеносодержащие структуры растений. Д., 1989.

24. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований). Учебник для студентов высших сельскохозяйственных учебных заведений по агрономическим специальностям М.: Агропромиздат. 1985. 126-134 с.

25. Дудкин М.С., Сайгадак Т.В., Щелкунов Л.Ф. Комплексы белков и пищевых волокон, обогащенных йодом.// Известия вузов. Пищевая технология. 2001. №2-3. С. 18-21.

26. Ермаков В. В., Ковальский В. В. Биологическое значение селена. М.: Наука. 1971.298 с.

27. Жильцова Т.С., Шолова М.Е., Голубкина Н.А. Исследование резистентности дрожжей p.Candida к соединениям селена // Прикладная биохимия и микробиология. 1996, т.32, №5, с. 567-570.

28. Жильцова Т.С., Белов А.П., Градова Н.Б. Накопление и распределение селена в клетках, обогащенных селеном дрожжей p. Candida // Прикладная биохимия и микробиология. 1998, т.34, №2, с. 86-88.

29. Жуковский П. М. Промышленность СССР и импортное растительное сырье // Соц. реконструкция и наука. 1935. Вып. 4. С. 115.

30. Закордонец Я.А., Билай Т.Н., Супрун С.М., Горбик JI.T. Образование биологически активных веществ мезо- и термофильными грибами при выращивании их на целлюлозо- и крахмалсодержащих субстратах // Микробиологический журнал. 1983. Т.45. № 5. С.55-60.

31. Зелтин Р.П. Влияние питательной среды на биосинтез целлюлолитических ферментов термотолерантного гриба //Микробиология. 1970. №39. С.574-582.

32. Зубенко В. Ф., Ковальчук М. И., Гресь Е. И. Выращивание рассады стевии // Сахар, свекла. 1992. № 6. С. 38—39.

33. Зубенко В. Ф., Чудновский Б. Д. Рождение новой отрасли // Сахар, свекла: производство и переработка. 1990. № 5. С. 49—50.

34. Кадималиев Д.А. Биотехнология нетоксичных композиционных материалов из отходов растительного сырья и микробиологической промышленности. Автореферат на соискание ученой степени доктора биологических наук. Москва. 2003. С. 30.

35. Калашников А.П. и др. Нормы и рационы кормления сельскохозяйственных животных. М.: Агропромиздат, 1985. 351 с.

36. Калунянц К.А., Шаненко Е.Ф., Зайцева JI.B. Современные способы ферментативного гидролиза целлюлозосодержащих материалов // Итоги науки и техники. Сер. хим. и технол. пищ. прод. М., 1988.Т.7. 187 с.

37. Квирикашвили Д. Использование в комбикормах муки из отходов герани, базилика и ботвы баклажанов при мясном откорме свиней // Корма и кормление. 1983, №1. С.101.

38. Кедик С.А., Федоров С.В. и др. Контроль содержания стевиозида в растительном сырье методами ВЭЖХ и ТСХ.// Химико-фармацевтический журнал. 2003. Т.37Ю № 10. С. 19-22.

39. Ким Ю. М. Интродукция новых нетрадиционных культур и перспективы их внедрения в с.-х. производство республики // Генофонд растительных ресурсов — основа для селекции. Ташкент, 1993. С. 49—50.

40. Кисничан JI. П. Мику В. Е. Размножение Stevia Rebaudiana (Bertoni) семенами. // Материалы III Междунар. конф. по селекции, технологии возделывания и переработке нетрадиционных растений. Алушта, 1994. С. 106.

41. Клесов А. А. Ферментативное превращение целлюлозы в глюкозу// Введение в химическую энзимологию. М., 1983. С. 189-249.

42. Клесов А. А. Ферментативное превращение целлюлозы// Итоги науки и техники. Сер. Биотехнол. М., 1983. Т. 1. С. 63-150.

43. Ковальский В.В., Ермаков В.В., Летунова С.В. Восстановление селенита штаммами Вас. megatenum, выделенными из почв с различным содержанием селена. //Журнал обшей биологии. 1967.Т.28.№6. С. 1175-1182.

44. Комиссаренко Н. Ф., Дергач А. И., Ковалев И. П., Бублик Н. П., Чермене-ва Г. А., Котов А. Г., Зинченко В. В. Дитерпеновые гликозиды и фенилпро-паноиды листьев Stevia Rebaudiana Bertoni (Asteraceae) // Раст. ресурсы. 1994. Т. 30. Вып. 1—2. С. 53-64.

45. Коробова М. М. Особенности развития черенков Stevia Rebaudiana в Санкт-Петербурге // Материалы конф. «Анализ и прогнозирование результатов интродукции декоративных и лекарственных растений мировой флоры в ботанические сады». СПб., 1996. С. 98—99.

46. Крутошникова А., Угер М. Подслащивающие вещества в пищевой промышленности. М., 1988.

47. Лавриченко М.И., Кайдун Л.Г., Красноков В.В. и др. Биоконверсия отходов хлопчатника с целью получения белковых кормовых продуктов // Биотрансформация вторичного растительного сырья в белковые кормовые продукты. Тез. докл. Тбилиси, 1987. С.45.

48. Летунова С.В., Ковальский В.В., Алтынбаев Р.В. //Сб.: "Биологическая роль микроэлементов и их применение в сельском хозяйстве и медицине". Л.: Наука. 1979. С.409.

49. Летунова С.В., Ковальский В.В. Геохимическая экология микроорганизмов. М.: Наука. 1978. 148 с.

50. Лисицин В.Н., Воловик Е.Л. Стевия подсластитель или лекарственное растение. // Пищевая промышленность. 1999. № 11. С. 40-41.

51. Лобанок А.Г., Бабицкая В.Г., Богдановская Ж.Н. Микробный синтез на основе целлюлозы. Минск: Наука и техника, 1988, 25-28 с.

52. Лобов С. В. Ензиматичне трансглшозилювання продуктт стевюзиду 13 Stevia Rebaudiana (Bertoni): Автореф. канд. дис. Киев, 1992.

53. Лобов С. В. Синтез и выделение продуктов трансгликозилирования стевиозида // Введение в культуру стевии — источника низкокалорийного заменителя сахара. Киев, 1990. С. 102—109.

54. Ляховкин А. Г., Чан Динь Лонг, Май Фыонг Ань, Солдатов В. Н., Титов Д. А. Медовая трава во Вьетнаме. Ханой, 1992.

55. Ляховкин А.Г., Николаев А.П. Мировое производство и использование стевии. // Пиво и напитки. 1999. №3. С.20-21.

56. Мамулаишвили И., Кобалия О. Стевия // Субтроп, культуры. 1990. № 3. С. 125.

57. Матасар И.Т., Салий Н.С., Ермолова Ю.В. Йодная недостаточность — причина многих заболеваний для настоящего и будущего поколений // Здоровье и питание. 1998. №3-4. С. 8-10.

58. Маюрникова. Л.А., Позняковский В.М. Новые технологические решения в создании продуктов специального назначения / Тез. докл. Междунар. на-уч.-техн. конф. "Науч.-техн. прогресс в пищевой пром-ти". Могилев, 22-24 нояб. 1995 г. Могилев. 1995. С. 39.

59. Мейсель М.Н., Мохнач В.О и др. О механизме антимикробного действия . биологически активных форм йода. // Изв. АН СССР, Сер. Биология. 1967 г. Выпуск 6. С. 819.

60. Мику В.Е., Кисничан Л.П. и др. Стевия перспективная культура для производства низкокалорийных и диабетических продуктов. // Пищевая промышленность. 1999. № 10. С. 32.о

61. Мохнач В.О. Иод и его связи с растениями и значение для медицины и сельского хозяйства. // Растительные ресурсы. 1967 г. Т. 3, С. 157.

62. Огарков В. И., Киселев О. И., Быков В. А. Биотехнологические направления использования растительного сырья// Биотехнология. 1985. № 3. С. 115.

63. Панфилов В.И. Биотехнологическая конверсия углеводсодержащего сырья для получения продуктов пищевого и кормового назначения. Автореферат на соискание ученой степени доктора технических наук. Москва. 2004. С. 19.

64. Патент РФ №2052953, МКИ А 23 L1 /0524,1996.

65. Патент РФ №2104302, С 12 N 1/18,1998.

66. Патент РФ №2119952, С 12 N 1/18,1998.

67. Патент РФ №2165975, С 12 N 1/18, 1998.

68. Патент РФ № 2173706, С 12 N 1/18,1998.

69. Патент РФ № 2173707, С 12 N 1/18,1998.

70. Патент РФ №2181145, С 12 N 1/18,1998.

71. Патент РФ № 2203941, С 12 N 1/18,1998.

72. Передерий В.Г., Соловьева А.А. Йодная недостаточность — проблема государственная // Проблемы питания и здоровье. 1996. № 3-4. С. 4-5.

73. Подпоринова Г.К. Разработка технологии получения концентрата сладких веществ стевии. Автореферат на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук. Рамонь. 1999. С. 7-13.

74. Правдин A.M. Сырьевые ресурсы для производства кормовых дрожжей в Карелии. // Гидролизная и лесохимическая промышленность. 1985.№2. С. 29-30.

75. Прищепов Ф.А. Интенсификация процесса получения биомассы на углеводах растительного происхождения. Автореферат на соискание ученой степени кандидата технических наук. Москва. 1987. С. 18.

76. Решетникова И.А. Накопление селена и фракционирование его изотопов микроорганизмами. Автореферат кандидатской диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. М.1974. 22 С.

77. Родионова Н. А. Ферментативное расщепление целлюлозы// Целлюлазы микроорганизмов/ Под ред. В. JI. Кретовича. М., 1981. С. 4-40.

78. Рудак В.Ф. Биологические основы получения биомассы микроводорослей и перспективы ее применения. Автореферат докторской диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук. М. 1986. 23 с.

79. Сарджвеладзе Г. П., Харебава J1. Г. Способ получения концентрата из растения Stevia Rebaudiana Bertoni: Пат. 1796128 // Изобретения. 1993. № 7. С. 9.

80. Сарджвеладзе Г. П., Цанава В. П., Джугели Р. Я., Харебава JI. Г. Способ приготовления низкокалорийного напитка: Пат. 1797816 // Изобретения. 19936. №8. С. 11.

81. Синицын А. П., Гусаков А. В., Черноглазов В. М. Биоконверсия лигноцел-люлозных материалов: Учеб. пособие. М.: Изд-во МГУ, 1995. 224 с.

82. Синицын А.П., Ковалев Г.В., Меса-Манреса С.Р. и др. Сравнительное изучение влияния различных видов предобработки на скорость ферментативного гидролиза природных целлюлозосодержащих материалов// Химия древесины. 1984. № 5. С. 60-71.

83. Синицын А.П., Леонова И.Л., Наджеми Б. И др. Сравнительный анализ реакционной способности целлюлозосодержащего сырья по отношению к ферментативному гидролизу//Прикл. Биохим. Микробиол. 1986. Т. 22, Вып. 4. С. 517-525.

84. Складнев А.А. Биотрансформация растительных субстратов // Жури. Все-союзн. хим. общ. им. Д.И. Менделеева. 1982. T.XXVI. №6. С.682-687.

85. Смоляр В.И. Рациональное питание. Киев: Наукова Думка, 1991. 368 с.

86. Солдатова С.Ю. Разработка технологии биологически активного полуфабриката пищи и корма на основе растительного сырья и дрожжей. Автореферат на соискание ученой степени кандидата технических наук. М. 2004. С. 13.

87. Соловарова В.П., Козлов Ю.П. Эколого-биотехнологические основы конверсии растительных субстратов. М.: Изд-во РУДН. 57-75с.

88. Стахеев И.В. Белковые кормовые добавки грибного происхождения из oi-ходов переработки растительного сырья. Шнек, 1984.

89. Тутельян В.А.,. Княжев В.А, Хотимченко С.А. и др. Селен в организме человека: метаболизм, антиоксидантные свойства. Роль в канцерогенезе. М.: Изд-во РАМН. 2002. С. 7-25.

90. Увилевич А.З., Ахмина Е.И., Раскин М.Н. Безотходное производство в гидролизной промышленности. М., 1982. С.4-40.

91. Удовидченко JI. П., Корниенко А. В., Куракон В. И. Отдельные элементы технологии возделывания стевии в ЦЧП // Материалы I Междунар. симпоз. «Новые и нетрадиционные растения перспективы их практического использования». Пущино, 1995. С. 582—583.

92. Федоров С.В. Сухой очищенный экстракт из листьев стевии (Stevia Rebaudiana Bertoni), получение и стандартизация. Автореферат на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук. Москва. 2004. С. 3-8.

93. Харитонов В.А. Парагвай. М., 1976. С. 5-7

94. Храмов В.А., Дмитриенко Н.В. Свободные аминокислоты в листьях и лио-филизированных экстрактах стевии. // Пищевая промышленность. 1998. № 6. С. 37.

95. ЮЗ.Цанава В. П., Сарджвеладзе Г. П., Харебава JI: Г. Влияние некоторых технологических приемов на состав летучего комплекса травы двулистника сладкого //Субтроп, культуры. 1991. № С. 64—70.

96. Чугунков Я. Технология приготовления и качество жидких кормовых дрожжей. // Молочное и мясное скотоводство. 1981. №11. С. 26-27.

97. Ю5.Шарков В.И., Сапотницкий С.А., Дмитриева О.А., Туманов И.Ф. Технология гидролизных производств.- М.: Лесная промышленность, 1973. С. 1220.

98. Юб.Шафферт Е. Э. Морфолого-анатомическое и цитоэмбриологическое исследование вегетативно-репродуктивной системы стевии Stevia Rebaudiana (Bertoni) Hemsl. в условиях интродукции на Южном берегу Крыма: Авто-реф. канд. дис. Ялта, 1992.

99. Ю7.Шестрем Э., Малинен Р., Наленнус И. и др. Химические процессы, про1. KJисходящие при варке целлюлозы// Химия древесины / Под ред. В. Иенсена. М., 1982. С. 221-252.

100. Эрнст J1. К., Науменко 3. М., Ладинская С. И. Кормовые продукты из отходов леса. М.: Лесн. пром-сть, 1982. С. 13-15.

101. Ajinomoto КК. Japanese Patent 56121454, 1981.

102. Andreae М.О., Barnard W.R., Ammous J.M. Biological production of dimethyl sulfide in the ocean and its role in the global atmospheric sulfur budget. //Ecology Bulletin. 1983. N. 33. P.187-177.

103. Arnow D., Olesson J.J. and Williams J.H. The effect arginine on the nutrition of Chlorella vulgaris. //American Journal of Botany. 1953. V. 407. P. 100-104.

104. Banshu, Cromityo. Japanese Patent 79040500, 1979.

105. Bergvist R., Yare N. // Moder. Kemi. 1969. V. 11. P. 44.

106. Bertoni M.S. Eupatorium Rebaudianum // Bol. de la Escuela de Agncultura del Paraguay. 1899. Vol. II. P. 35

107. Bertrame P. L., Carniti P., Focher B. et al. Cotton cellulose: enzyme adsorption and enzymatic hydrolysis// J. Appl. Polym. Sci. 1982.Vol. 27. P. 3493-3502.

108. Bondarev N., Reshetnyak O., Nosov A. Plant Science. 2001. Vol. 161. P. 155163.

109. Brandrick A.M., Newton J.M. An investigation into the interaction between iodine and bacteria. // J. App. Bact. 1977. Vol. 30. P.484.

110. Bridel M., Lavieille R. Le steviol de l'hydrolyse diastasique et 1'isosteviol de l'hydrolyse acide // Bull. Soc. Chim. Biol. 1931c. Vol. 13, N 7. P. 780—795.

111. Brown K.M., Arthur J.R. Selenium, selenoproteins and human health: a review. //Public. Health. Nutr. 2001. - № 4. - P. 593-599.

112. Bungay H.R. Energy: the biomass options. New York, 1981. 347 p.

113. Bungay H.R., Garcia M.A., Foody B.F. Treatment and characterization of exploded wood fraction // Biotecchnol. Bioeng. Symp. 1983. No. 13. P. 121-127.

114. Burk R. F. Biological activity of selenium.//Annual Review Nutration. 1983. V. 3. P. 33-70.

115. Chang C. Y., Chang W. H. A study of the conditions of extractions of ste-viosides from Stevia leaves // J. Chin. Agric. Chem. Soc. 1985. Vol. 23. P. 168—177.

116. Chang M., Chou Т., Tsao G. T. Structure, pretreatment and hydrolysis of cellulose// Bioenergy/ Ed. A. Fiechter/ Berlin, Heidelberg, New York.l981. P. 15-32.

117. Chau Y.K., Wong P.T.S., Silverberg B.A., Luxon P.L., Bergert G.A. Methyla-tion of selenium in the aquatic environment. //Science. 1976. V. 192. N. 4244. P. 1130-1131.

118. Combs G. F., Combs S.B. The role selenium in nutrition. Orlando. Academic Press INC. 1986. P. 156-172.

119. Crammer В., Ikan R. Sweet glycosides from the Stevia plant // Chem. Brit. 1986. Vol. 22, N 10. P. 915—916.

120. Czechowiak C., Dubois J., Vasseur J. Culture in vitro du Stevia rebaudiana Ber-toni // Comptes rendus de l'Academic des sciences. 1984. T. 298. N 6. P. 173— 175.

121. Dang Hong Thuy, Do Thu Huyen, Tu Minh Koong. Isolation and selection of Vietnamese yeasts for assimilating selenium. //Tap Chi Duoc Hoc. 1992. N. 4. P 9-12.

122. Datta R. Energy requirements for lignocellulose pretreatment processes // Process Biochem. 1981. June/July. P. 16-19.

123. Dekker R.E.H., Wallis A.F. Autohydrolysis-explosion as pretreatment for the enzymatic saccharification of sunflower seedhalls // Biotecchnol. Lett. 1983. Vol. 5. P. 311-316.

124. Dietench K. Uber die Bestandteile der Paraguay-Susstoffpflanze Eupatorium Rebaudianum Kaa-He-E und ihre pharmazeutische Verwertbarkeit // Chem. Zentral-Blatt. 1909. Т. 2.1. S. 459.

125. Dunapol. US Patent 4402990, 1983.

126. Eriksson К. E. Advances in enzymatic degradation of lignocellulosic materials// Proc. Int. Symp. on Ethanol, Canada. Oct. 1982. P. 345-370.

127. Espinar L. A., Cerana M. M. Contribucion al conocimiento de las especies de Stevia (Asteraceae) del centra de Argentina // Bol. de la Academia Nacional de cicn. 1986. Vol. 3-4. T. 57. P. 122.

128. Falcone G. and Nickerson W. J. Metabolism of selenite and mechanism of inhibitory action of selenite on yeasts. //Giorn. Microbiology. I960. V. 8. P. 129150.

129. Falcone G. and Nickerson W.J. Enzymatic reduction of selenite. //Bacteriology Prue. I960. P. 132.

130. Falcone G., Nickerson W. J. Identification of protein disulfide reductase as a cellular division enzyme in yeasts. //Science. 1956. V. 124. N. 3225. P. 722-723.

131. Farid M.A., Shaker M.H., El-Diwany A.I. Effect of peracetic acid sodium hydroxide and phosphoric acid on cellulosic materials as a pretreatment for enzymatic hydrolysis// Enzyme Microb. Technol. 1983. Vol. 5. P. 441-444.

132. Fels I.G. and Cheldelin V. H. Selenite inhibition studies. IV. Biochemical basis of selenate toxicity in yeast. //Journal of Biological Chemistry. 1950. V. 185. P. 803-811.

133. Fels I.G. and Cheldelin V. H. Methionine in selenium poisoning. //Journal of Biological Chemistry. 1948. V. 176. P. 819-828.

134. Frohne D., Jensen U. Systematik des Pflanzenreichs. Stuttgart, 1979.

135. Frohne D., Jensen U. Systematik des Pflanzenreichs. Stuttgart, 1992.

136. Fugi Food KK. Japanese Patent 57046998, 1982.

137. Fullas F., Kim J., Compadre С. M., Kinghorn A. D. Separation of natural product sweetening agents using overpressured layer chromatography // J. Chroma-togr. 1989. Vol. 464, N 1. P. 213—219.

138. Gaenadi D.H. Effect of slope position on the growth of Stevia in Indonesia // Commun. Soil and Plant Anal. 1987. Vol. 18. N. 11. P. 1317-1328.

139. Gennity J.M., Bottino N.R. at all. A selenite-induced decrease in the lipid content of a red alga.// Phytochemistry. 1985. V.24. N.12. P. 2823-2830.

140. Ghakpuray M.M., Lee Y.-H., Fan L.T. Structural modification of lignocellu-losics by pretreatments to enhance enzymatic hydrolysis// Biotechnol. Bioeng. 1983. Vol. 25. P. 157-172.

141. Gosling C. Caa-ehe or asuca-caa // Bui. of Miscellaneous Inform. 1901. N 175— 177. P. 173—174.

142. Gutmanis T. Selenium yeast production. Universal Food Corp. U.S. US 4.530. 846 [CL 426-62; A23L1/28J, 23 Jul. 1985, Appl. 466, 398. 15 Feb. 1983. 5 p.

143. Hedegaard J., Falcone G., Galabro S. Incorporation de selenium dans des analogues des acides amines soufres, dans Candida albicans. // C. R. Society in Biology. 1963. 157. N. 2. P.132-135.

144. Herzog T. Planzenwelt der bolivischen Anden. Leipzig, 1923

145. Hidiroglou M., Jenking K. J., Hoffman I. Teneurs en selenium dans les tissus des ruminants.// Annual Biology of Animals in Biochemistry and Biophysics. 1973. V.11.N.4. P. 695-704.

146. Hsieh H.S. and Ganther H.E. Acid-volatile selenium formation catalyzed by glu-tatione reductase.// Biochemistry. 1975. V. 14. N. 8. P. 1050-1054.

147. Hudman J.F. and Gienn A R. Selenit uptake and incorporation by Selenomonas ruminantium//Archives Microbiology. 1984. V.140. P.232-236.

148. Hugo W.B., Newton J.M. The adsorbtion of iodine from salutation by microorganisms and by serum. // J. Pharm. Pharmachol. 1964. Vol. 16. P.49.

149. Jenkins K.J., Hidiroglou M. A review of selenium/vitamin E responsive problems in livestock; a cose for selenium as a feed additive in Canada. //Canadian Journal Alimentary Science. 1972. V. 52. N. 4. P. 591-620.

150. Kamakura M., Kaetsu I. Radiation degradation and the subsequent enzymatic hydrolysis of waste papers// Biotechnol. Bioeng. 1982. Vol. 24. P. 991-997.

151. Kienle U. Stevia Susstoff von Europas Feldern? // Landtechnik. 1989. J.44. N. 5. S. 171-175

152. Kinghorn A.D., Soejarto D.D., Nanayakkara N.P.D., Compadre C.M., Maka-pugay H.C., Hovanek-Brown J.M., Medon P.J., Kamath S.K. J. Nat. Prods. -Lloydia. 1984. Vol. 47 (3). P. 439.

153. Klyosov A. A., Rabinowitch M. L. Conversion of cellulose to glucose: present state of the art and potential// Enzyme Engineering: Future Directions. N. Y., 1980. P. 83-166.

154. Knappert D., Grethlein H., Converse A. Partial acid hydrolysis of cellulose materials as a pretreatment for enzymatic hydrolysis// 4 Joint US/USSR Enzyme Engineering Conf. New Orleans, 1978. P. 403-419.

155. Knoch B. Klimakunde von Sudamerika. Berlin. 1930. T. 6. S. 206-212.

156. Kobayashi M., Horikawa S., Degrandi I. H., Ueno J., Mitsuhashi H. Dulcosides A and В new diterpene glycosides from Stevia rebaudiana // Phytochem. 1977. Vol. 6. P. 1405—1408.

157. Kohda H., Kasai P., Yamasaki K., Murakami К., Tanaka O. New sweet diterpene glycosides from Stevia rebaudiana // Phytochem. 1976. Vol. 15. P. 981— 983.

158. Konstantinova R., Kozuharova-Petrova N. Verwendung von abfall -malzkeimen zur futtermefeproduktion auf hydrolysat basis. Zbl. Mikrobiol. 1985. P. 141.

159. Kumar H.D. and Prakash G. Toxicity of selenium to the blue-green algae, Ana-cystis nidulans and Anabaena variablis. //Annual Botany. 1971. V.35. N.141. P. 697-705.

160. Lewis W. H. Early uses of Stevia rebaudiana (Asteraccae) leaves as a sweetener in Paraguay // Econ. Bot. 1992. Vol. 46. P. 336-337.

161. Liqi X., Zheng Q., Xiuzhen X. Assimilation of inorganic selenium by yeast. //Weishengwu Xuebao. 1990. V.30. N.l. P.30-33.

162. Lwoff A., Nittiand J., Trefonel J. Rechercher sur le sulfamide et les antisulf amides. III. Action du sulfamide sur le development d'Esherichia coli et de Proteus vulgaris XI9. //Aun. Inst. Pasteur. 1941. V.67. P. 173-185.

163. MacDonald D.G., Bakhshi N.N., Matheys J.F. at al. Alkali treatment of corn stover to improve sugar production in enzymatic hydrolysis // Biotechnol. Bio-eng. 1983.Vol. 25. P. 2067-2076.

164. Maiers D.T., Widiluez P.L., Thompson D.L. and Bruhn D.F. Selenate reduction by bacteria from a selenium-rich environment. //Applied and Environmental Microbiology. 1988. V.34. N. 10. P. 2591-2593.

165. Maruzen Kazel. Japanese Patent 56042560,1981.

166. Matuda E. El genero Stevia en el valle de Mexico у sus alrededores // Bol. dc la Soc. botanica de Mexico. 1958. N 23. P. 55—83.

167. Maunuing Z., Zheng-Ziang N. Effects of Se and S on organic Se assimilation by Se-containing yeasts. //Shipin Kexne Beijing. 1991. V.142. P. 546-549.

168. Mes-Hatreii M., Saddler J.N. The nature of inhibitory materials present in pre-treated lignocellulosic substrate which inhibit the enzymatic hydrolysis of cellulose//Biotechnol. Lett. 1983. Vol. 5. P. 531-536.

169. Mitsubishi Acetate. Japanese Patent 58028246, 1983.

170. Moloney A., Coughlan M.P. Sorption of Talaromyces emeraonii cellulase on cellulose substrates//Biotechnol. Bioeng. 1983. Vol. 25. P. 271-280.

171. Monteiro R. Biologia floral de Stevia rebaudiana // Tese de Mestrado. Univ. Est. Campinas (Brasil). 1980. 156—157.

172. Mosetting E., Berglinger U., Dolder F., Lichti H., Quitt P., Waters J. A. The absolute configuration of steviol and isosteviol // J. Amer. Chem. Soc. 1963. Vol. 85. P. 2305—2309.

173. Mosetting E., Ness W. R. Stevioside II. The structure of the aglicon // J. Org. Chem. 1955. N20. P. 884—899.

174. Munk V., Benes J., Horokova I. Bactchwise submerged microbial production of selenoamino acids. Czech. 141, 907CL С 97 С. C016., 15 Jul. 1971. Appl. 8215/68,02 Dec. 1968. 5p.

175. McGready R.G.L., Campbell J.N. and Payne J.I. Selenite reduction by Salmonella heidelberg. //Canadian Journal of Microbiology. 1966. V.12. P.703-714.

176. Newton J.M., Vickers J.A. Response of standardized suspensions of Escherichia coli to iodine. // J. Pharm. Pharmachol. 1964. Vol. 16. P.381.

177. Nickerson, Taber W.A., Falcone G. Physiological bases tellurite on cellular division of yeast like fungi. //Canadian Journal of Microbiology. 1956. V.2. N.4. P. 575-578.

178. Pengra R.M., Berry E.C. Growth of Saccharomyces cerevisiae in the presence of selenium arsenic and selenium-arsenic mixtures. //Proceeding Sauce Dakota Academician Science. 1953. V.32. N.l. P.120-123.

179. Phillips K.C. Developments in sweeteners. London: Elsevier appl. Science, 1987. P.6-15.

180. Podgorska E., Bujak S. Effect of selenium on the growth of the yeasts Saccharomyces cerevisiae and Candida tropicalis. //Acta Alimentary Polonica. 1985. V.57. N.3.P. 323-331.

181. Porter R.H. Econ. Botany. 1950. Vol. 4. P.37.

182. Puri V.P. Ozone pretreatment to increase digestibility of lignocellulose // Biotechnol. Lett. 1983. Vol. 5. P. 773-776.

183. Rasenack P. Uber die Susstoffe des Eupatorium Rebaudianum und des Sushol-zes // Chem. Zentral-Blatt. 1908. Т. 2.3. S. 78—79.

184. Richkov R.S., Skryabin G.K. Single cell proteins: investigation and realization in the USSR. Collog. int. protein, org. unicellulaires, Paris, 28-30 jan., 1981. P. 243-244.

185. Rolz С., Arriola J., Villadares J. et al. Effect of some physical and chemical pre-treatments on the composition, enzymatic hydrolysis and digestibility of ligno-cellulosic sugar cane residue// Process Biochem. 1987. Vol. 2. P. 17-23.

186. Sakaguchi M., Tatsuhiko K. As pesquisas japonesas com Stevia rebaudiana (Bertoni) о esteviosideo // Cienc. e Cult. 1982. Vol. 34, N 2. P. 235—248.

187. Sarwar G., Peace R.W., Botting H.G. Nutritional evaluation of inactive dried food yeast products. В кн.: Mikrobial biomass proteins.

188. Sasaki Т., Tanaka Т., Nanbu N. et al. Correlation between X-ray diffraction measurements of cellulose crystalline structure and the susceptibility to microbi-alcellulase // Biotechnol. Bioeng. 1979. Vol. 21. P. 1031-1042.

189. Sekisui Chemical Industry KK. Japanese Patent 58212759. 1983.

190. Selvam P.V.P., Ghose Т.К., Ghosh P. Catalytic solvent delignification of agricultural residues: inorganic catalysis//Process Biochem. 1983. May/June. P. 13-15.

191. Shewale J.G., Sadana J. Enzymatic hydrolysis of cellulosic materials by Scle-rotium rolfsii culture filtrate for sugar production// Can. J. Microbiol. 1979. Vol. 25. P. 773-783.

192. Shigekata Y. Studies on carbohydrate formation in Stevia rebaudiana // Jap. J. CropSci. 1986. Vol. 55, N2. P. 189—195.

193. Shock C.C. Rebaudi's Stevia: Natural noncalonc sweeteness // Calif. Agnc. 1982a. Vol.36. N. 9-10. P.4-5

194. Shrift A. Biochemical interrelation between selenium and sulfur in plant and microorganisms. //Federation proceedings. 1981. V.30. N. 1. P. 695-702.

195. Shrift A. Metabolism of selenium by plants and microorganisms. In D.L. Klayman and W.H.H. Gunther ed. Organic selenium compounds: their chemistry and biology. John Wiley. Sons. Inc. New-York. 1973. P. 760-814.

196. Shrift A. Sulfur-selenium antagonism. I. Antimetabolite action of selenate on the growth of Chlorella vulgaris.//American Journal Botany. 1954. V.41. P. 223-230.

197. Simuda T. Problems of stevia growing technology // Jap. Food Sci. 1978. Vol. 17, N8. P. 24—30.

198. Simuda Т. Studies on Stevia Rebaudiana Bertoni as a new possible crop for sweetening resource in Japan // J. Cent. Agric. Exp. Stn. 1980. Vol. 31. N. 1. P. 67-71.

199. Soejarto D.D., Compadro C.M., Medon P.J., Katath S.K., Kinghorn A.D. Potential sweetening agend of plant origin. II. Field search for sweet-tasting Stevia species. Econ. Bot. 1983. Vol 37. P. 71-79

200. Soejarto D.D., Kinghorn A.D., Farnsworth N.R. Potential sweetening agend of plant origin. III. Organoleptic evaluation of stevia leaf herbarium samples for sweetness. J. Nat. Prod. 1982. Vol. 45. P. 500-593

201. Springer S.E., Huber R.E. Sulfate and selenate uptake and transport in wild and two selentolerant strains of Escherichia coli K-2. //Archives Biochemistry and Biophysics. 1973. V. 156. N2. P. 128-133.

202. Sun Star. Japanese Patent 80046695, 1980.

203. Suzuki F.K. International Inc. US Patent 4361697, 1983.

204. Tama Seikagaku KK. Japanese Patent 57075952,1982.

205. Tanaka O. Chemistry of a Stevia rebaudiana Bertoni — new source of natural sweeteners//Recent Adv. Nat. Prod. Res. 1980. Vol. I. P. 111—119.

206. Tanaka O. Steviol-glycosid: new natural sweeteners // Trends in analytical chemistry. 1982. Vol. 1, N 11. P. 246—248.

207. Toyo Seito KK. Japanese Patent 83011986, 1982

208. Tuve T.W., Williams H.H. Metabolism of selenium by E. coli: biosynthesis of selenomethionine.//Journal Biological Chemistry. 1961. V. 236. N.2. P. 597-601.

209. Watanabe N., Uchida Т., Sassagewa Т., Sato N., Miura M. Feeding selenium-utilizing yeast to broiler and swine.//Chikusan no Kenkyu. 1993. V.47. N.8. P.890-896.

210. Weisman G.S., Trelease S.F. Influence of sulfur on the toxicity of selenium to Aspergillus.//American Journal Botany. 1955. V.43. N.6. P. 1046-1049.

211. Weiss K.F., Ayres J.G., Kraft A. A. Inhibitory action of selenite on Escherichia coli, Proteus vulgaris and Salmonella thompson. //Journal Bacteriology. 1963. V.90. N.4. P. 857-862.

212. Xiang-Xian H., Xin-Qiang W., Zhen-Houg L., Qin M. Deep layer cultivation of selenium enriched yeast. //Pharm. Ind.1988. V.19. N.8. P.337-340.

213. Yakasaki K., Kohda H., Kobayashi T. Tetrahedron Let. 1976. V.13. P. 10051008.

214. Yamada S. Japanese Patent 7969719, 1980.

215. Zaidan L. B. P., Dietrich S. M. C., Fellipe G. M. Effect of photopenod on flowering and stevioside content in plants of Stevia rebaudiana Bertoni // Jap. J. Crop Sci. 1980. Vol. 49. P. 569—574.

216. Zhang S.Q., Kumar A., Kutowy O. Membrane-based separation scheme for processing sweeteners from Stevia leaves.// Food Research Int. 2000. Vol. 33. P.617-620.

217. Zvyagilskaya R.A., Parkhomenko A.O., Gordeeva A.V. et al. Bioenergetics of Yarrowia lipolytica cells grown at alkaline conditions. Bioscience reports. 2004. Vol.24. No.2. P. 117-118.

Информация о работе

Цугкиева, Елена Борисовна
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка основ технологии комплексной переработки стевии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы