Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка методов приготовления контрольно-калибровочных сывороток крови человека с заданным содержанием общего холестерина, холестерина липопротеидов высокой плотности и триглицеридов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Разработка методов приготовления контрольно-калибровочных сывороток крови человека с заданным содержанием общего холестерина, холестерина липопротеидов высокой плотности и триглицеридов"



и

З^РАВСОХ^АЙЕгШЙ 7Ф Т<ГсУДл?С7Птага,Ь!Ц- НАУЧКЛ-ИССЛЕДОВЛТЕЛКйагй _ЦЕШ г ПК'ФШШС'М><ЖСК0Й медицины

Нг.^ко-н.-лявяо'зауеяьской йнсячгуг ■профмл»»'«**и неитЬекционных

заболеваний

На правах рукописи УДК б 16.153.92?.

Хайдукова Ирина Львовна

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ПРИГОТОВЛЕНИЯ КОНТРОЛЬНО-КАЛИБРОВОЧНЫХ СЫВОРОТОК КРОВИ ЧЕЛОВЕКА С ЗАДАННЫМ СОДЕРЖАНИЕМ ОБЩЕГО ХОЛЕСТЕРИНА, ХОЛЕСТЕРИНА ЛИПОПРОТЕИДОВ ВЫСОКОЙ ПЛОТНОСТИ И ТРИГЛИЦЕРИДОВ

03.00.04 Биологическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-1993

Работа выполнена в ШЩ профилактической медицину ?.'3 РФ.

Научный руководитель:

Доктор биологических наук В.Н.Малахов

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,.

профессор 4 В.В.Меньшиков

доктор медицинских наук,

профессор Р. Л .'Гигранян,

Ведущая организация: НИК биомедицинской химии РАМН

Завита состоится'" " ¿¿/^¿¿Л-

в час на заседании специализированного совета Д 074.61.01 по защите диссертаций на' соискание ученой степени доктора наук пр) Всероссийском научном центре молекулярной диагностики и лечения- М РФ по адресу:'113 149, Москва, Симферопольский бульвар, д. 8.,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийское научного центра молекулярной диагностики и лечения МЗ РФ

Автореферат разослан "_"__

Учуний секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук- {7)СГУ В.Б.Отрадаов!

Актуальность проблемы. Одним из важнейших аспектов в обэспе-нш надежности результатов, получаемых в клинико-^биохимических и пуляционных исследованиях, является регулярный контроль качества полнявмых анализов;Такой контроль подразумевает исследоваше в ждой аналитической серии наряду с анализируемыми пробами конт-льных материалов, которые должны максимально воспроизводить сос-в и свойства анализируемых проб, в том числе разные концентрации али^ируемых компонентов (в пределах нормального физиологического овня, ниже или выше этих пределов). Для большинства компонентов воротки крови, анализируемых в диагностических целях (вналитов) иготовление контрольных материалов о заданной концентрацией ана-та не вызывает проблем, однако такие проблемы возникают при -~>и-товлении сывороток с повышенным содержанием липидов - общего хо-стерина (ОХС), холестерина липопротеидов высокой плотности (ХС-П) и триглицеридов (ТГ) - ввиду их водонерастворимости и нахож-ния в сыворотке в составе белково-липи"чых комплексов - лп.лопро-вдов (ЛП). В связи с отмеченными особенностями основной подход к вышению содержания ХС и ТГ состоит в добавлении к яативной сыво-гке фракций сыворотки крови человека, содержащих ЛП соответству-нх классов.

В настоящее время описан ряд методов получетая фракций снво-гки крови, предназначенных для приготовления нонтрольно-калиб-вочных сывороток с повышенным содержанием липидов. Основной не-зтаток этих методов состоит в невозможности получения фракций, держащих порознь ХС и ТГ, что не позволяет избирательно повышать щентрацию одного из липидов и воспроизводить вариации состава ализируемых-проб. В связи с вышеизложенным актуально дальнейшее вершенствование этих методов и разработка таких, ¿«вторые позво-пи бы достаточно, избирательно менять концентрации 0X0, ТГ и ХС-I в контрольной сыворотке, сохраняя нативный матрикс сыворотки эви человека.

Цель исследования. Целью настоящей работы являлась разработка зых способов приготовления контрольных и калибровочных сывороток эви человека, позволяющих получать таковые с заданным содержани-ОХС, ХС-ТВП и ТГ в "нормальном" и "патологическом" диапазоне с хранением натианого сывороточного матрикса.

Проведенные исследования были направлены на ра^аботку и со~ эшенствование способов разделения сыворотки крови человека на акции, содержащие преимущественно тот или иной класс ЛП. Предва-

рктельнай анализ .читературы показал: что наиболее пврсшктдвнь способом выделения ЛП, позволяющим обрабатывать большие объемы ei воротки, явлис ^ся дифференцированное осаждение ЛП, достигаемое £ счет избирательного взаимодействия ЛП разных классов с сульфзтирс . а иными полианиочами, тагами как сульфат декстрана (СД) и гепарщ с образованием нерастворимых комплексов, или за счет высаливания сульфатом аммония (СА) в результате нарушения еольватнзй оболочга я агрегащти ЛИ.

Задачи исследования:

1. Разработать методы фракционирования ЛП сывс^ ¿тки крови челове ка с использованием: СД, гепарина, СА;

2. Провести сравнивальшй анализ разработанных и существующих ьк тодов приготовления сывороток крови, используемых в качеств© кона рольно-калибровочных материалов, для чего:

2.1. Приготовить на основе разработанных, методов опытные сер* сняороток кровк с избирательно повышенной концентрацией ОХС п/ш ТГ, а также ХС-ЛВП;

2.2. Исследовать опытные серии сывороток на возможность испол; зования в качестве стандартных. Сравнить поведение пркготовлент сывороток с поведением нативной пулированаой сыворопси кроен чс ловека в различных аналитических процедурах;

3. Разработать практические рекомендации по выбору метода .пригс товлп^яа г.тяитт ртутных гш?ороток с повышенным содержанием ХС-ЛВ1 ОХС и/или ТГ.

Научная новизна исследования состоит в том, что впервые

1) разработаны условия последовательного выделения фракции тре основных классов ЛП сыворотки крови человека, в том числе лкпопрс теидов очень низкой (ЛОНП) и низкой плотности (ЛНП) с помощью ге парина и СД, полученного из декстрана с мол. весом 500 кДа;

2) для приготовления сывороток с повышенны:.! содержанием ОХС, TF ХС-ЛВП использовано фракционирование сыворотки крови человека СА;

3) впервые дня контроля качества стадии определения ОХС в вадосг до'шой лэдкости (НЖ) при определении ХС-ЛБ11 предложена сывороткс обедненная ЛОНП и ЛНП.

Практичеекая значимость. Применение разработанных способс приготовления контрольно-калибровочных материалов позволит: I) избирательно менять в приготовляемой сыворотки концентрации oi дельных ЛП. в ток числе ЛВП, и варьировать- их соотношение в преде лэх. необходимых для проведения контроля качества выполняешх she

isüb в кчтшко-Лгохимичосттх исследованиях:

} ):с1Ч»лъ00оа*ь дол^гещфовьнкул и. чйс?ичр.> ¡о свь,>-

яяу ь качэсаве_ р^аоатаполн здь ь кбюст&э _

йьмкпм союрэзннэм ОХС дт,я контроля качеств'; внодезд ,'íO J!?l'í: ; дать мгадег.оскке рохоиондэцч::; для nnc№4ivffi¡.)¡ .-• прсь&_.»встГ"Л гснд'Р'пшх сивсрстот; кров." с рппщт!!" ур;./,т:ом лкпндоз.

Апробации работа: Результат исследования оыш прод«:тоъ*<эш1 г.а -ой международной конференции молодых уче" их по органической и ю.иоп:-ческой химии (Варна.. Болгария, 1990).

Дпробацип даосортвща сэстоялас'. на ^сжлоОоритораои кау-тш мшжвиуме Всероссийского научного центра молекулярной диагноста-

¿ v.- АиЛЛЛ ii.O la.'.

Публикации: по материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Объем и структура работа. Диссертация изложена на 142 строш-IX, состоят из введения, 3 глав (обзор литературы, материалы и ¡тода, результаты и их обсуждение), заключения, выводов и г^ило-)няя, содержит 25 рисунка и 17 таблиц. Описок литература включает 38 публикаций отечественных и зарубежных авторов.

Материалы и методы

Б работе использовали сыворотку крови доноров, хранившуюся при '0°С но более 6 месяцев, а также слитые остатки проб сывороток, вступающих на анализ в лаборатории НИИ профилактики нешьЗ»кцион-и. заболеваний ВНШЩМ МЗ РФ при обследовании популяции г. Москвы, шио сыворотки хранились при 4°С не более 4-ех суток.

Концентрацию ОХС определяли химическим экстракциошшм методом 5еля-Кендала в модификации CDC с калибровкой по стандартным раст->ршл ОХС в абсолютном этаноле, прямым ручным методом йлка с ка-1бровкой по сывороткам с.известным содержанием ОХС, на автоанали-!торе "Техникон AA-II" с экстракцией изопропанолом, ферментным ¡тодом на автоанализаторе "Centriíichem" с использованием набор tono test Gholesterin" (Boehringer, ФРГ). Концентрацию ТГ определи химическим методом Готтфрида с рассчетом весового содержания ) молекулярной массе триолеина, а также ферментным методом на ав-шализаторе "Centrtfichem" с использованием набора "Trlglyceri-;s GPO-PAP" (Boehringer, ФРГ). Осаждение ЛП очень низкой (ЛОШ) и шкой плотности (ЛИП) в методах анализа ХС-ЛВП проводили гепа-ш-марганцевым и магний-фосфовольфрамовым методаш -Концентрацию ¡сфолипидов определяли колориметрически с- использованием набора »активов "Test Combination Phosphorus" (Boehringer, ФРГ), концен-

трацию билирубина определяли методом Fog J. с калибровкой по сыво ротке SHA Referens Serum (Техникон, США). Содержание белка опреде ляли модифицированным методом Лоури с калибровкой по раствору аль бумина человека. Содержание аполипопротеидов A-I и В определял ■•"•тодом ракетного иммуноэлектрофореза и иммунотурбидиметрии Электрофоретический анализ проводили в геле агарозы и в полиакрил-емидном геле со ступенчатым градиентом концентрации в неденатури-руюодах условиях с окраской судановым черным Б.

Фракционирование сыворотки сульфатом аммония (СА) проводил] при комнатной температуре путем дробных добпок сухого СА да требуемой степени насыщения. Фракционирование сыворотки крови этанолом проводили согласно методам, описанным Kuchmak с соавторам! (1981, 1984). Одноэтапное фракционирование сыворотки проводили npi концентрации этанола 15% и 2Ь%. Для изучении липопротвидного состава осадок растворяли в 5% растворе NaCl и диализовали.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Фракционирование сыворотки крови сульфатом дэкстрана

В процессе разработки и поиска эффективного способа фракционирования ЛП сыворотки крови человека в качестве осаждающего агента был использован СД, полученный из декстрана с молекулярным весом 500 кДа. Было изучено поведение ЛП при разных концентрация: добавленного к сыворотке СД как в отсутсвии экзогенно вводам: ионов Kg24' и Мпг+, так и в присутствии таковых и подобраны условш выделения ЛП разных классов в отдельных фракциях. Согласно разработанной схеме фракционирования (рис. I) добавление к сыворотке раствора СД до концентрации 0,1% приводит к осаждению максимального количества ХС за счет формирования нерастворимого комплекса СД с ЛОШ и ЛНП, который отделяется центрифугированием. После растворения комплекса в 5% растворе NaCl ЛОНП и ЛНП могут быть выделеш в виде суммарной фракции или разделяются добавлением хлорида Mg д< концентрации 0,15 моль/л. При этом ЛНП остаются в растворе, а ЛОНЗ формируют шлвдислерсныв частицы, которые флотируют на поверхносп раствора.. Для обеспечения оптимального соотношения концентраций С) и ЛП и успешного отделения ЛОНП от ЛНП на этой стадии важно, чтоб! ос,ьем раствора. ЛП в Ъ% растворе NaCl составлял 1/8 объема исходно! порции сыворотки крови. К НЕ, оставшейся после отделения vpvn.nQwn< ОД о ЯОНП и ЛНП, добавлч-j'ipaoioop шпС12 до лонцьшрации О,] моль/л и дополнительное количество СД до концентрации 0,2%, чтс приводит к практичнски полному удалению ОХС из раствора, то есть

j сиеоротка"|

сульфат декс грана 500 кДа, II,! г/дл

Рис.1. Схема фракционирования сыворотки 1срови человека СД в сочетании с ионами Mg и Мп.

эсажденшо остававшихся в растворе ЛВП. Из НЖ,' полученной на этапе эсавдения ЛВП, удпляли ионы Мл и СД и получал.! долипидированную эипоротку.

Метод позволяет получать'фракцию "ЛОНП+ЛНП" (рис. 2 Б) с высоким содержанием ОХС, ТГ, фосфолипидов и ano В (табл. I), фракцию "ЛВП" (рис. 2 Д) с высоким содержанием ХС-ЛВП и ano А, а такие Обогащенную ТГ фракцию ЛОНП, содержащую преимущественно ЛОНП с триыесыо ЛНП (рис.. 2 В), и фракцию "ЛНП", содержащую только ЛШ (рис. 2 Г) и обогащенную ОХС, фосфолипидами и ano В (табл. I), о„-мко эффективность этой стадии зависит от состава фракционируемой звворотки. В таблице I указаны пределы колебания концентраций измеренных параметров, полученные в ряде экспериментов, что вызвано эааличиями в составе фракционируемых сывороток. Соотношение пара-летроб при этом остается довольно постоянным и характерным для сласса ЛП, преобладающего во фракции. Метод позволяет также полу-»ать делипидированную сыворотку, которая может бъгго использована <ак разбавитель для понижения концентрации ЛП и их компонентов в юходной сыворотке с сохранением концентрации ее остальных кото-

лнп

3% 3% • 5% 10% концентрация

—1------—«. геля

направление электрофореза

Рис.2. Денситогрзммы гелей после' электрофореза в ПААГе фракций выделенных из сыворотоки крови человека с помощью СД А - исходная сыворотка, Б - суммарная фракция "ЛОНП+ЛНГ В - фракция "ЛОНП , Г - фракция "ЛИГ, Д - фракция "ЛЕ

нентов.

2. Фракционирование сыворотки крови человека с помощью гепари и сульфата декстрана В целях разработки надежного, не зависящего от свойств фрак онируемой сыворотки, метода выделения ЛОНП и ЛНП в отдельных фр циях было проведено фракционирование сыворотки гепарином в соче нии с ионами Мя2+ и Мпг+.

В результате проведенных исследований были разработаны уело поэтапного выделения ЛП разных классов (рис. 2). Добавление к с воротке раствора гепарина 5000 Ед/мл в соотношении 0,05 мл/1 г.; сыворотки и хлорида М^ до концентрации 0,1 тль/л приводит к ф

Состав фракций, лолученьих ярл фрагацюнкро&зпии сыворотнк крови человека CI БООкДа в сочетаний о ионам« Kg и Нп

Фракция" эхе WHOÍli/ll ТГ HMOflb/Л схс/тг нг/мг Обции овяок Г/дл í>oosor<n- педы ы/ди •3RO А' лгУдд t Р иг; дл Д~ПЯ ^Г.O'.ÍCJ: " j «сз Ц) от

ЛОНП 7,80- 5,SO 6,83 i 5,15 а.^в- 0,С5 •Л А 0.60* 0,30 2/5.0-A8.I) У? л 2,300,75 163,5* 80,i 23,'!

ЛНП 18,50* I.SO 2,22- 3i5li-0,25 2,902,11 s4< 59М" 181,5 8,601,00 1)91,0-55,2 « 17.3

яонп+лнп 29,70* 6,60 fí.371 З.^О 1,580,31 1),70-0,96 823,0301 28,004,50 л 582,3175,5 А 15',-

ЛВП »5,90- 2,110,65 з.оз1 0,81) 1,76 723.0Í 296,0 52*) ,00-<<9,50 * 72, 5* 70,1 13,6

депипи-дироаан-ная сыворотка 0,230,09 0,11-0,0<f - 6,3^ 0,28 .. зо.э1 9,6 - - -

Примечание: п=8, р=0,95; * - п=6; ** - п=4

дированию комплекса гепарина с ЛОШ, который флотирует при центрифугировании на поверхности раствора в виде кремовидного слоя, содержащего около 20% ОХС и 70% ТГ сыворотки. К отделенной от этого злоя так называемой НЖ добавляется раствор MnCl2 I моль/л до кон-;ентрации 0,06 моль/л, что приводит к формированию комплекса гепарина с ЛНП, который отделяется центрифугированием. Для осаждения ГОП, оставшихся в-НЖ, добавляется СД до концентрации 0,4 г/дл. Тосле растворения комплексов ЛП с полианионами в растворе NaCl, удаления полианионов в виде солей Ва и диализа получаются отдвль-ше фракщм "ЛОНГГ о примесью ЛП других классов (рис. 4) и высоким зодержанием ТГ (талб. 2), фракция "ЛИГ, содержащая примесь ЛОШ t обогащенная ОХС, фосфолипидами и ano В, франция "ЛВП", содержа- • цая ЛВП с "римесью ЛНП с высоким содержанием ОХС, фосфолипидами í ano А, а.также долипидированная сыворотка. Величина концентрации )ХС, ТГ, фосфолипядов и апо-белнов во фракциях колеблется в зави-зтготи от состава ЛП в каждой фракционируемой сыворотке, однако зоотнощешю ОХС/ТГ во фракциях остается довольно постоянным и ха-

СЫВОРОТКА

РАСТВОР ГЕмАРИНА

}НАДОСАДСК|

MnCl.

КОМПЛЕКС ЛНП-ГЕПАРИН

¡НЛДОСАДОК]

СУЛЬФАТ ДЕКСТРАНА

КОМПЛЕКС ФРАКЦИЯ

ЛВП-СД 'лвгг

ДЕЛИПИДИРОВАННАЯ СЫВОРОТКА

Рис. 3. Схема фракционирования сыворотки крови человека гепарине в сочетании с СД

рактерным для одноименных с названием фракции классов ЛП. Фракщ содержат примесь Селков сыворотки крови, ко доля апобэлков cocTi ляет до 12% Солка фракции в отличие от сыворотки, где она равна 1-2%.

4. Фракционирование сыворотки крови человека сульфатом аммония в сочетании с сульфатом декстрана Методом титрования сыворотки СА с интервалом 5% насыщения в диапазоне концентраций СА 25-70% насыщения были определены конце трпцш СА, которые позволяли выделить обогащенные липидами фракции.' Однако но результатам электрофоретического анализа фракцис чое оснащение ЛП с помощью СА не позволяет проводить достаточно избирательное выделение ЛП отдельных классов. Эффективное pasioj нио ЛП достигалось при использовании СА б сочетании с СЛ. РазраС тенная нами схема фракционирования (рис. 51 включает выделе! спеси ЛОШ+ЛШ из сыворотки крови с помощью СЯ с посла душим вил

- а -

Состав фракций, полученных при фракционировании сыворотки крови человека гепарином в сочетании с Щ, Мп и СД

фракция охс шюль/л тг ммоль/л охс/тг мг/мг фосфо-липиды мг/дл Общий беле г/дл апо А1 мг/дл апо В мг/дл Доля апобел-ка % от общ, белка фракции

ЛОНП 13^60-5,55 10, Ю4 2,69 0,570,05 ¡Й1.0 3.2 22,0 83.0 3.3

ЛИП 30.50^ 4, б* 1»,6°4 0,80 2,800,61 600,0 м 31.0 **55,0 11,8

ЛВП 17. «Ю4 2.38 2,380,53 з.ю± 0,21) 6«)6,0 5,1 530,0 1(0,0 11,8

липиди- взнная воротка 0,25- о.оэ о.ю4 0,01. - 31.0 6,3 - - -

наир ав л е ш I е ач о к тр о Л) ор е з а

Рис.4. Денситограмма гелей после электрофореза в ПААГе фракций,

выделенных гепарином в сочетании, с СД. А - фракция "лош", Б - фракция "ЛШГ, Р - фракция "ЛИГ.

СЫВОРОТКА

СУЛЬФАТ «ЕКСТРАНА 0,1 г/дл

Рис. Б. Схема фракционирования сыворотки крови человека СД в сочетании с СА

лением ЛОНП и ЛНП в отдельных фракциях с помощь» СА. По резул! там электрофоретического анализа (рис. 6) и данным белково-лш ного состава (табл. 3) фракция Ф0_50 содержит ЛОНП и примесь ЛЬ обогащена ТГ при относительно низком содержании 0X0. ©рак ф50-бв С0'г,.еРжит Л® и представляет собой ОХС-богатую фрак снримесью белков сыворотки. Выделение ЛВП может быть провэ; двумя способами. Первый состоит в высаливании СА в интервале 70% насыщения. Соосэг?дение белков сыворотки, несмотря на предвЕ тельное их отделение при 60Ж насыщения, не позволяет ско'ндентрк вать выделяемую фракцию для получения в ней высокой концентра ХС. Такую фракцию целесообразно использовать для повышения кони трации ХС-.ЛВП не 10-20%. Для получения более концентрирован фракция выделение проводят по второму способу осавденкеы ЛБП с мощыз СД в сочетании о ионом Нп2+ и последующим переосавдением (рис.5). Это.позве нит получить фракцию Ф£0_70 высоким содс-рж

лип

лонп

3% 3%

5%

10% концентрация -- геля

направление электрофореза

ис. 6. Денситограммы гелей после электрофореза в ПААГе фракций, выделенных с помощью СД в сочетании с СА. А - фракция, выделенная добавлением ч сыворотку СД, Б - фракция Ф 0-50, В - фракция Ф 50-68, Г - фракция Ф 60-70.

ем ХС-ЛВП и йпо А-1 при небольшом содержании общего белка (табл. . В этом случае одним из продуктов метода является также делипи-рованная сыворотка.

Наиболее существенные показатели описанных методов фракциони-вания приведены в таблице 4..Разрабо ¡иные нами методы (I, 2 и близки по своим характеристикам и позволяют получать фракции, еиод^вртвенно обогащенные одним классом ЛП и содержащие незначи-лыше правей белков сыворотки крови. При этом фракции, выделяе-е методом I, содержат около 90% ОХС и ТГ исходной норции сыво-тки, методом 2 - до 80% ОХС и 76% ТГ, методом 3 - до 85% ОХС и %Для Сравнения в таблице приведении аналогичные показатели

- 1г -

Состав фракций, выделенных при фракционировании сыворотки 1срош человека СД сочетают с СА

1 •>ракц'.1л ОХС ммоль/л ТГ ммоль/л 0ХС/ТГ мг/нг Фосфо- липиды мг/дл Общий белок г/ЦП ало А1 мг/дл апо В мг/дл Доля апобел-ка 5 от об белка Орзкци

0-50 6,11(1 2,17 ,; о* 1,99 0,760,24 159,0^ 748 0,7 й 5,0 229,0 18,0

50-68 21,40* 3,61 3,90* 1,97 2,60* 0,72 348,1* li.it, 1 2,5* 0,7 л 5.0 465,0 19.2

60-70 (ЛВП 1) 1,500,36 0,21* 0,09 3,11* 0,61» 106,5* 123,7 7,7* 1.8 я 92,0 4,0 М

20-70 (ЛВП 2) 11,002,09 ял 2,40* 0,97 2,00* 0,11 359,0124,0 *« 4,1* 0,98 400,0 30,0 13,0

Примечание:п=8,р=0,95;*-п=6;**-п=4

для метода фракционирования сыворотки етанолом (КисЬшак, 1931 1984). По нашим данным, фракционирование в один отап при конце ил рации этанола 15% позволяет выделить липидбогатув фракции, соде]: жащую до 40" 0X0 и 60% ТГ исходной порции сыворотки и представлю ющую собой по данным электрофореза смесь ЛП разных классов. Прове дение фракционирования при концентрации этанола 26% позволяет вы лить до 80% ОХС и 90% ТГ, но сопровождается такке увеличением дс ли соосавдающегося белка. Фракционирование в два этапа позволяв получить фракцию, содержащую'ЛОНП и ЛНП, и фракцию "ЛИГ, содержЕ щую незначительное количество липидов при высоком содержании бел ка. Во фракциях, выделенных осаждением этанолом, доля апобелков с общего белка фракции сохраняется такой не, как в исходной сыворот ке из-за высокого содержания соосаждающегося белка.

5. Приготовление сывороток с повышенным содержанием липидов. .

Фракции, выделенные разработанными методами, использовали в качестве добавок к сыворотке крови человека для избирательного повышения содержания ОХС, ХС ЛВП и ТГ (табл. 5). Добавление фрак-ц.тй ЛП, выделенных разработанными методами, приводит к изменению лиотдоого состава сывороток и связанному с ним изменению'содержания ано-белков с сохранением уровня концентрации общего белка и билирубина в пределах нормы для нативной сыворотки.

Добавление лшшдоь к сыворотке в составе нудных рвечворов Л

- Х -

Сравнительная характеристика методов "раюшотфования

Метод фракционировв- фракции Количественный выход X от количества вещества в-исход--ной порции сыворотки Доля апо-(5елков от ебцего белуа Фр-зкции

ОХС ТГ Белок об«. эпо Л! апо 0

1 2. Сульфат \ декстрина ■ 1 -.е-ч, „V« :ьГ ЛОНП ЛНП ЛОНП+ЛНП Я ЬП Дс/«;п«ди-роаанная сыворотка 15 C6,8«t> <¡1 (5.12) S3 tt,38) 35 02,53) 5 (2.02) И (7,93) 21 14,17) 64 (5,38) 15 <4.63) 9 ft,33) 1 (0,61)> 4 (0,70) 6 (0,32) 5 (0.69) 73 (5,76) 0,1. о,з 6,0 12,0 28,0 17,0 12.1) 1 ,6

1 - 1+ Нд - Ип сульфат декстранз (п з; ЛОНП ЛНП • ЛЗП Делмпиди-ровамная сыворотка (5.73) (5,15) 20 (4,42) £ (1,00) 42 (17 .«tl 32 (5,52) 15 0,010 1) (3,75.) 2 (0,96) 3 «0,5D 3 (0,23) 77 (MM 0,7 0,8 11,0 2,5 11 ,0 0,8

11, Сульфат декстрана -сульфат аммония •п - 4 > ЛОНП ЛНП ЛОНП+ЛНП ЛВЛ J ЛВП 2 13 (3,95) 42 (10,86) 63 f.,3® 20 (4,38) 12 35 (6,17) 35 (13,5( 64 (5,38) J5 (5,38) 5 2 (0,06) 2 (0,67) 6 (0,32) 3 (0,2*1) о.ь 0,2 6,0 1,2 17,0 17,0 19,0 12,1. о,' 1

*. Спиртооое оспадение о,дноотг~ное: д) этанол б) 2$% этанол смесь /II! гмгеь ЛЛ (7,81) BO (6,lt3J 57 01,80) 9003,83; 13 C6,6o) 45 <6.81) J ,5 0,5 1,5 0,4

1 . 2 ,Спиргооог осгу-д^низ /¡сухэтапное I ЛОНП+ЛНП ЛВП 64 (9,81) 17. Ct ,6?) 68 (4,16) 15. (5,06) 26 (4,78) 27 05,60) ' 0,2 1,8 2,0 0,1

Примечание: процентное содержание апобелков во фракциях, а также состав фракции ЦЛВП 2я определены однократно.

соответствующих к пассов, содержащих известную долю липидов Фракционируемой сыворотки, позволяет проводить предварительные рассюты затрат сыворотки на получение фракций и последующее смешивание с ниш при приготовлении сывороток с повышенным содержанием липидов. • Подробное описание рассчетов приведено в тексте диссертации.

Оценка пригодности ггриготовлешмх пулов к использование^ качестве контрольных материалов В соответствии с требованиями, предъявляемыми к контрольным приготовленные сшюротнз анализировали наиболее часто

Состав сывороток крови, обогащенных добавлением к наганной сыворотке фракций ЛП, выделенных разработанными методами

СЫВОРОТКА (добавленная фракция, метод выделения) Общий хс ммоль/л ХС-ЛВП ммоль/л ТГ ммоль/л Общий белок г/дл Зилирубин м.чоль/л апо А1 мг/дл апо Б мг/дл

натиеная 5,0 1.3 1.1 7.3 0,61 1А6.0 106,0

1 ( ЛОШНЛНП, Ш 6,7 - 6.6 а,<.9 152,0 136,0.

2(концентрат ЛП, 151 этанол3 6,5 - 7.7 0,61 .156,0 11)6,0

3(концентрат ЛП, 25% этанол) 8,3 - 1.7 8.5 0,60 178,0 178,0

А (ЛНП, сдУ 7,1 - 1.2 6,6 0,48 115.0 100,0

5 (ЛНП, гепарин) 8,1. - 1.» 6.8 0,1.7 158,0 192.0

6 (ЛНП, СД+СА) 7,9 - 1.6 6.6 0,51 152,0. 180,0

7 (ЛОНП, СД) 5,7 - 1.6 6.5 0.28 123.0 115.0

8 'ПОМП, гепарин) 6.0 - 1.6 6.5 0,51 "9.0 121,0

9 (ЛОНП, СД+СА.) 5.* - 1.2 6,6. 0,53 118,0 123,6

10 (ЛВП, СД) 2,3 1.2 8,5 0,37 221,0 95,0

И (ЛВП, гепарин+СД) 6,6 2,5 1.2 83 0,36 222,0 99,0

12 (ЛВП, СА) 5,2 1.5 1.1 8.6 0,61 153.0 • 90,0

используемыми в клинической практике методами ■ определения ОХС, ХС-ЛВП и ТГ. Для' определения влияния способа получения фракций на аналитические свойства приготовленные сывороток сыворотки Т 3, б, 6, 9 и 13 анализировали методами определения ОХС и ТГ, а сыворотки 10-13 методами определения ХС-ЛВП. В каждой серии измерений наряду с иоходной и приготовленными сыворотка анализировали нативные сыворотки, не подвергавшиеся замораживанию. Такие сыворотки представляли собой слитые остатки проб сывороток, поступавших не анализ в лаборатории НИИ профилактической медицины и имели, таким образом, усредненный состав.

Оценку аналитических св< "ств приготовленных сывороток проводили методом регрессионного анализа, используя графическое представление результатов измерения концентраций определяемых пара-

метров так что координата "х" соответствовала концентрации, определенной методом «равнения, "у" - другим чз использованных методов. По результатам определения концентраций исследуемых компонентов -в нативнах пулированннх-сыворотках - строгопг лилии регрессии и оценивали отклонение от этой линии точек, соответствующих приготовленный сывороткам. Пржоднши в качестве контрольных считали сыворотки, для которых отклонение не превышало ЗБ этой линии.

Расположение точек на грантах, представляющих'результаты определения ОХС и ТГ (рис.7), указывает па совпадение свойств приготовленных сывороток со свойствами натиьяых. Аналогичные графики были получены для результатов определения ОХС в гепарин-марганцевом (рис 8) и фосфоволт^ремпт-магниевом надооадквх в методах анализа ХО-ЛВП.

Наряда' с методом регрессионного анализа оценку аналитических свойств приготовленных сывороток проводили методом сопоставления смещений. Поскольку приготовленные сыворотки должны иметь те же параметры случайных и систематических ошибок, что и нативные, мы проводили сопоставление смещений результатов, опрвдел ля ОХС, ХС- ■ ЛВП и ТГ в приготовлениях и нативных сыворотках разными методами относительно результатов метода сравнения. Для проведенных 5-ти серсй гсзгжрений ОХС не было обнаружено достоверных отличий между смещениями на нативной и приготовленных сыворотках (таол. 6). При определении ТГ достоверное отличие между величиной смещения на нативной и приготовленной сыворотках имело место для сыворотки 9, содераащей фракцию ЛСШ, выделенную с помощью СА. По нашему мнению, поведение этой сыворотки может быть рассмотрено как врте-ф?кт, не отражезсщй? общую закономерность, поскольку измерение ТГ ферментных методом в сыворотке б, содержащей фракцию ЛНП, выделенную такке СА, не .выявило отличий в поведении такой сыворотки от нативной.

Сопоставление смещений результатов определения ХО-ЛВП в приготовленных и натияных снвороткях ?чк1;<я р° янявило достоверннх <.<г личий.(тэбл. 7).

Оценку аналитических свойств сывороток, обогащенных по ЛВП, проводили еще одни.) способом, используя "намеренно искаженные" методы разделения ЛП. результаты кглорих кчиболе» сильно отличатся от результатов мотоде •-.•рарнечия. Б них <ж>дв-лировака ситуация, наиболее чувоч;р!лтелкч^я к .-■.ортчру матрико». 55чло проведано опр^пел^ -••«г.. ого г. "•упг,рп":т:'>1 т:оа?> с^р-'-З-я'чи ^аы ¡ротон голарва-мергепцо••

- 1С -

мг/дп

Рис. 7 Регрессия результатов определения ОХС (А,Б,В) методом Абе-ля-Ке^ала и ТГ (Г) методом Готтфрида (по оси X) и другим из использованных методов (по оси У). По оси У на рис. А -результаты определения ОХС прямым методом, Б - на автоанализаторе "Техникон", В - ферментным методом, Г - результаты определения ТГ ферментным методом. • - нативные сыворотки, * - пиготовленные сыворог'и

вой смесью при уменьшенной вдвое концентрации Мп и фосфовольфра-мат-магниевой смесью при уменьшенной вдвое концентрации фосфоволь-фрамовой кислоты. Вместе с обогащенными по ЛВП сыворотками анализировали исходную сыворотку, а также 3 нативные пулированные сыворотки, хранившиеся не более 4 дней при 4°С (табл. 8). Изменение концентраций осаждающих агентов приводило к высокой величине положительного смещения в нативных сыворотках, которая составляла'от 46 до 602%. Такое же значительное. смещение было получено на сыворотке 12. Сыр тотки 10 и II, содержащие фракции ЛВП, выделенные полианионами, вел*" себя аналогично нативной при обработке гепарин-

Рис, 8 Регрессия результатов определения ОХС в гепарин-марганцевом суиернатанге методом Абеля-Кендала (по оси X) и пряммм методом (А), на автоанализаторе "Техников" (Б), ферментным методом (В) (по оси У), е - нетканые сыворотки, * - приготовленные сязороткя

гепарин-марганцевой смесью, а в случае фосфовольфрамат-мягшевой смеси смещение было очень незначительным, сравнимым с ошибкой метода. Мы объясняем это присутствием остаточных количеств полиани- • оков, которые компенсировали отсутствие фосфоаолъфрямовой кислоты ■три избытке иона чеуэлла в мо.щфщироватом методе. Как видно на примере сыворотки 14, этот эф]зект отсутствует при обогащении сыворотки фракцией двп, которая выделяется СД с последующим переосая-' дохшем СА, Випвленные отлегая подтверждают необходимость проверки ссотвотстшя I .го8"с 1й гчач уляьдого материале V йнаддакруск;то образца, оео<;етз/о д-и контре лы'сго кат^рчалп на ХС -ТОП.

Наряду с обогащенными по ЛП онпороткям мч чооле>.я.ов«ли ™?о#стп» оыюротки. не содержащей -ЮПИ и ЛНП 'снв. 13), -оторэя уртстш&йя-

Смещение результатов определения ОХС разными мьтодами по отношению к результатом метода Абаля-Кендала и ТГ по отношению к результатом метода Готтфрида

СЫВОРОТКА СМЕЩЕНИЕ ПО ОХС, 1 смещение по ТГ, 2 ферментный метод

прямой метод автоанализатор "Техникой" ферментный метод

нативнан 5,7 • 3.9 М 43

исходная 6,г - 47 0,3 11,9

п РИГ0Т0ВЛЕННЫЕ СЫВОРОТКИ

1 7,0 - 1Л 3,7 7,3

2 5,9 - 3,1 2,0 7.2

3 46 - 2.8 2,1 9.1

5 7,3 о,а ■ 49 ■5Л

6,5 - 0.6 5.9 2.0

6 8.2 - 1,2 4 5 5.8

9 9.9 1.2 49 -

Примечание: представлены средние величины смещений, полученные в 5 сериях.

Таблица 7

Смещение результатов определения ХС-ЛВП разными методами относительно результатов метода Абеля-Кендала в гепарин-марганцевом 'супернатанте

Сыворотка гепарин-марганцевый метод осаждения фог -ювольфрамат-магниевый мет"д осаждения

прямой метод атоанализа-тор "Техникон" ферментный метод Абель-Кендал прямой метод автоанализатор "Техникон" ферментный ие^од

нативная 11.7 - 6,3 - 3,5 - 5.5 47 " 23,2 - 9,1

исходная 16,5 - 3,9 1,3 - 42 6,8 - 13,9 - 3,3

• • П Р ИГ0Т0ВЛЕННЫ Е СЫВОРОТКИ

10 12,1 - 5,1 - - 10,3 - 1.9 - 19.2 -'11Л

11 11,7 - 6,4 - 3.4 - 1.0 8.1 - 12,6 - 4* |

12 1Г ■ - 15,3 0,5 ; -.2,7 8.3 - 249" -3.8 ,

Смещения результатов определе^'я ХС-Л. Л в НЖ при обработке сыворотки крови человека модифицированными гепврш-мзрган-иевим и фосфовольфрамят-мчгкиевым методами--------- ~ --------------- "

сьыоротка величина ХС-ЛвП, определенная методом сравнения, мг/лл С И Е 1Д Е М 1 я Г*)

модифицированный гепарин-моргамцеони метод модифицированный фосфоеот-фрамат-магниевый метод

нзтиекая 1 51,70 46 174

К1ТКОМЙГ- ?. 46,70 9'. 202

нативная 3 <•3.60 386 502

исходная 50, 67 212

Г| Р И Г 0 7 0 8 Я Е н И НЕ С Ы В 0 Р О Т К И

10 86,91 60 9

1) 95,25 71 13

12 55.99 ¡25 213

11| 89.10 80 131

Примечание: сыворотка 14 была приготовлена смешиванием исходной сыворотки с фракцией "МП", полученной с использованием СЦ и СА (рис. 5, вариант 2}

от оооой надосадок поело осаздениэ названных ЛП с помощью СД. Сценка нативности этой Сыворотки методом регрессионного анализа (рис. 10) показала, что она обладает теми зге свойства:,га, что и гепарин-марганцовые и фосфовольфрамат-мэгниевые надосадки нативных сывороток. Аналогичные результаты были получены при оценке аналитических свойств этой сыворотки методом сопоставления смещений (твОл. 9). Представленные в таблице смещения достоверно не отличатся. Таким образом, анализ сыворотки, не содержащей ЛОНП и ЛНП показал, что она может быть использована для контроля качества оп-опроделения ХС в методах анализа ХС-ЛВП.

Оценка нативности сывороток с повышенным. содержанием ОХС и ТГ, содержащих фракций ЛП, выделенных разработанными методами, позво- . ляет сделать вывод, что они могут быть использованы в качестве контрольных при анализе ОХС и ТГ.

На осповвчпи результатов двух способов опенки вативносч-и приготовленных е.иъоротон с повааенхшм содержание 1ВГ1 сведет, что <) использованиз Фрвчши ЛЕЯ, ¿ыдалешюй СА, целвсооорншго для по-Еншения в сыворотке содержания ХС-ЛВП не 10-20». Таквя сыворотка

ГЕПАРИН-МАРГАНЦЕВЫЙ КАДОСАДОК

ФОСФОВОПЪФРАМАТ-МАГНИЕВЫЙ НАДОСАДОК

Рисунок 10. Регрессия результатов определения 0X0 в гепарин-марганцевом и фосфовольфрамат-магниевом надооад-ках

По оси "X" отложены результаты, полученные методом Абеля-Кендала, а по оси "У" - прямым методом (А), на автоанализаторе "Техникон" (Б), ферментным методам.

■ • - нативные сыворотки, в - сыворотка 13

Смещения результатов определения ОХС в гепарин-марганцевом и фосфовольфрвмат-матевом ь_.досадках

СЫВОРОТКА Метод сравнения Пряной метод Автоанализатор "Техникон" Ферментный метод

нативная сызоротка без ЛОНП и ЛИП Лбель-Кендал ГЕПАРИН-М 11 >7 20,1 АРГАНЦЕВЫЙ НАД0САД - 6,} - 3.3 ОК - 3,7 - 8.9

нэтманая сыеоротка без ЛОНП и ЛНП Абель-Кеипая Ф0М0В0ЛМРАН и,2 20,1 ЛТ-НАГНИЕВЫЙ НАДОС - 14,4 - 3,3 едок - з.б - 8.9

(снв. 12) обладает теш же аналитическими свойствами, что и натив-вая сыворотка крови человека и может быть использована в качестве контрольного материала; 2) сыворотки 10 и II могут быть использованы в качестве контрольных при определении ОХС я гепарин-марганцовом супернатанте лгЗнм из использованных методов; 3) для приготовления сыворотки со значительно повышенным содержанием ХС-ЛВП целесообразно использовать фракцию ЛВП, выделенную СД с последующем горэосаздэнием СА. Такая сыворотка (сыв. 14) совпадает по аналитическим свойствам с нативной сывороткой крови человека и монет быть использована в качестве контрольной.

ВЫВОДЫ

1. Изучено поведение липопротеидов сыворотки крови человека при их осаглониет сульфатом дакотрана, гепарином и сульфатом аммония в разных условиях. Найдено, что:

1.1. Добавление,к сыворотке крови сульфата декстрана, полученного из докстранв с молекулярной массой БОО кДа, до концентрации 0,1 г/дл приводит к .практически полному осаждению липопротеидов очень шзкой и низкой плотности даже в отсутствие ионов металлов, обычно используемых при разделении липопротеидов. Последующее добавление к растворенному осадку ионов Мвг+ до концентрации 0,15 моль/л позволяет избирательно осадить липопротеиды очень низкой плотности, птделяя их таким образом от .липопротеидов низкой плотности.

1.2. Различия в растворимости липопротеидов в присутствии суд«1та аммония ...огут быть использованы для избирательного выделения липопротеидов очень низкой, низкой и высокой плотности в отдельных фракциях после отделения липопротеидов очень низкой и низкой плотности от липопротеидов высокой плотности с помощь» сульфата декстрана.

1.3. Добавление к сыворотке крови гепарина и хлористого магния до концентрации 164 г/л и 0,1 моль/л соответственно приводит к осаждению липопротеидов очень низкой плотности. Последующее добавление к супернатанту хлорида марганца до концентрации 0,06 моль/л приводит к осаждению липогт] твидов нияк_Л плотности. Введение в оставшийся суиориатаит сульфата декстрана до концентрации 0,4 г/дд приводит к осаздению липопротеидов высокой плотности.

2. На основе результатов, полученных при исследовании возможностей разделения липопротеидов сыворотки крови человека методами фракционного осаждения сульфатом декстрана, гепарином и сульфатом аммония, предложены новые схемы препаративного фракционирования липопротеидов сыворотки крови человека на отдельные классы.

3. Добавление к нативной сыворотке крови липопротеид-содержащих секций, выделяемых разработанными методами, не изменяет существенно свойства матрикса, проявляемые матриксом нативной • сыворотки при анализе в ней общего холестерин, холестерина липопротеидов высокой плотности и триглицеридов. Это обстоятельство позволяет использовать получаемые таким образом сыворотки с избирательно повышенными уровнями липидов в качестве контрольно-калибровочных.

.4. Удаление из сыворотки крови человека липопротеидов очень низкой и низкой плотности в виде осадка, образующегося при добавлении дульфата декстрана (0,1 г/дл), позволяет получать сывороточную фракцию, пригодную для калибровки и контроля качества ощх еления холестерина пр' анализе холестерина липопротеидов . высокой плотности.

Б. В результате выполненных в работе исследований разработаны новые или усовершенствованы предложенные ранее методы приготовления контрольных и калибровочных сывороток с избирательно повышенными е заданное число раз уровнями общего холестерина, холестерина липопротеидов высокой-плотности и трлглицеридов, позволяющие, в отличие от существующих, получат; заданное содержание .саадого из липидов в отдельности с использованием натиьных компонентов сыворотки кроьи челоьока. „ . ■'' •

Список "вбот, опубликованных по теме диссертации:

•..Хийдукопч Й.Д., Теркин Б.И., Малахов В.Н. К вопросу о жжшишкостк результатов ощл-цвлбння эльфа-холестерина при

эаздедэтпе* "~л!топротоидбз~""плпгм7~-крст)и ""Гопорин-мэргяниэЕой — и----------

^'Г1в1еоо-!^оси,оволыурв:,:овок смесями, Лоб. цело, IS86, »1 К, 3.68'?'-689

2. К-м-Байдуков п, Ю.Д.Шахов, ,V;.K.Fperf9>'Ba, В.Н.Малахов, ¡¿реяционироеагшз енвороткя крови сульфатом аммония на фракции, ;олективно .тл/гащеннкв одним из классов липопсотзидов. Тепомфоваи:- д ВИНИТИ, Ч С931-Ю8, 1938.

3. И.Л.Хэйдукова» Э.А.Шзхов, Н.П.Чернызова.В.Я.Мэлахов. Полу-id-jzz фр^сцпЗ сизсроп" irponvi толо^гп, прчгодкчх .?.лч чэвирет» *»— ЮГО аС,ЛЭН6221Я ¿"РОЕЙЛ И £Ш0ЛП!0Цр070ТЩ071 прл приготовлении стандартных сывороток, Вопр.мед.химии, 1989, N 2, с. 134-139.

4. И.Л.Хайдукова, Ю.А.Шахов, М.Е.Еромеева, В.Н.Малахов. <1спользовзние сульфата аммония для приготовления контрольных вывороток 1срови с повышенным содержанием холестерина, григлицо ридов и холестерина липопротеидов. высокой плотности, Зопр. мед. химии,•IS39, II Б, с. 133-138.

5. Е.М.Потошшх, М.Л.Хэйдукова, В.А.Логинов. Влияние замораки-збя»я -оттаавтэя сшюр^пш кроен человекч па pesywaT« опрояолв-ж холестэрыш лшопротепдов высокой плотностя. Лай, дало. 1989,

'! 8, с, 39-31.

6. I.jj.Khaydukov«. fee o'l emucmluir, dulfate and dextran euliate for preparation of human blood aerum fractions, available for aelfctiva alteration 1» content of lipids in production of control зеге. Abstracts of 7-th International Conference of young gcieatlato on organic and biological chemistry, Varna, 1990, p. 30.