Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка методов определения дезоксирибонуклеазной и гепариназной активности микроорганизмов, выделенных из различных источников

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка методов определения дезоксирибонуклеазной и гепариназной активности микроорганизмов, выделенных из различных источников"

МИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

УДК 576.855:612.115.35

РГ5 ОД

; ; ... <• Генералова Анжелика Геннадьевна

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕАЗНОЙ И ГЕПАРИНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЬЩЕЛЕННЫХ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ИСТОЧНИКОВ

03.00.07. Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель: профессор, доктор медицинских наук Д. К. НОВИКОВ. Научный консультант: профессор, доктор медицинских наук А. Н. КОСИНЕЦ.

Минск, 1995 г.

Работа выполнена в Витебском медицинском институте

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Д.К.Новиков Научный консультант:

доктор медицинских наук А.Н.Косинец

, Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук А. П. Красильников кандидат медицинских наук А. А. Кукулянский

Оппонирующая организация - Гомельский государственный

медицинский институт

Защита диссертации состоится на заседании совета по защите диссертаций Д 03.18..05 в Минском государственном медицинском институте

19 декабря 1995 г. в 15 часов (г. Минск, пр.Дзержинского, 83).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Минского государственного медицинского института (г. Минск, пр. Дзержинского, 83)..

Автореферат разослан "18"_ноября_ 1995 г.

Ученый секретарь совета, кандидат медицинских наук, доцент

И. А.КРЫЛОВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы диссертации

В настоящее время широкое распространение получили внутрибольничные инфекции, вызываемые различными видами патогенной и условно-патогенной микрофлоры. Чаще всего они вызываются золотистым стафилококком, синегнойной палочкой, кишечной палочкой, стрептококками групп А, Д, К, бактероидами (Акатов А.К. с соавт.,1980; Колесов А.П.с соавт., 1989; Ха-теневер M.JI. с соавт., 1975; Finegold S.М., 1982). Известно, что эти возбудители обладают широким спектром ферментов инвазии и агрессии. Ими выделяются гиалуронидаза, лецитиназа, плазмокоагулаза, бега-лактамазы. протеиназы,. каталаза, гепа-риназа, ДНК-аза и т.д. Данные энзимы значительно ухудшают течение патологического процесса, ускоряют микробное распространение, инактивируют вводимые антибиотики и дезинтокси-кационные средства. С другой стороны, эти ферменты являются маркерами данных штаммов возбудителей (Безбородов A.M. с соавт. ,1984; Воропаева С.Д.. 1980; Генералов И.И. с соавт. ,1992; ДарбееваО.С. с соавт.,1988).

До настоящего времени для микробиологического исследования ДНК-азной и гепариназной активности применялись лишь качественные и полуколичественные методы. Необходимо отметить, что способы, используемые с этой целью, сложились еще в 50-60-х годах и в настоящее время недостаточно удовлетворяют поставленным задачам из-за их невысокой чувствительности, а, следовательно - большой продолжительности выполнения.

Многочисленные данные (Колуканов И. Е.,1992; Кочеровец В. И., с соавт. ,1986; Joubert J.J.,1985; Sotophernandez J.L., et al.,1988; Waller J.R.,et al.,1985) свидетельствуют о необходимости продолжения разработки простых и высокочувствительных количественных способов определения ДНК-азы и гепариназы. В свою очередь, количественный характер методов дает возможность дифференцировать объекты по ДНК-азопродуцирующей и гепа-риназопродуцирующей способности (например - микроорганизмы). Стафилококк представляется здесь наиболее значимым возбудителем, т.к., во-первых, он является частым этиологическим фактором внутрибольничных инфекций (Акатов А.К., с соавт.,1980), а

во-вторых - обладает выраженной ДНК-азной активностью (Коче-ровскийЮ.Э., с соавт.,1986; Петровский С., 1987; ЬапйШэ В.Е.. е1 а1., 1989).

Поскольку ДНК-аза и гепариназа представляют собой деполи-меразы, то акт их каталитического действия на молекулу полимера приводит к скачкообразному изменению состояния субстрата, поскольку средняя молекулярная масса его при этом снижается вдвое. Этот переход можно обнаружить, присоединив к субстрату легко детектируемую метку (колориметрическую или флюоресцентную) с последующим отделением распавшихся молекул от непрореа-гировавших. Если использовать это свойство, то можно резко повысить чувствительность способов с одновременным приданием им количественного характера. Кроме того, используемая метка должна быть дешевой, безопасной и легко доступной.

Этим условиям соответствует выбранный нами флюорохром риванол (2-этокси-б, 9-диаминоакридина лактат), вызывающий сгуст-кообразование с субстратом (ДНК) обратно ее деполимеризации соответствующим ферментом.

В свою очередь, для исследования гепариназной активности существует возможность удаления нераспавшегося гепарина бис-четвертичным аммониевым соединением этонием (1,2-эти-лен-бис-(И-диметил-карбдецилоксиметил-) аммония дихлоридом) с последующим определением уроновых кислот в надосадочной жидкости карбазоловым методом.

Все это создает необходимые предпосылки для разработки простых чувствительных количественных методов определения как ДНК-азной, так и гепариназной активности бактерий. Создание таких методов позволило бы точно оценить продукцию данных ферментов агрессии, изучить их использование в качестве диагностических критериев, исследовать их вклад в патогенез соответствующих инфекций, а также разработать мероприятия по коррекции таких инфекционных процессов при помощи антиферментной терапии.

Связь работы с научными программами и темами

Работа является частью научных исследований по теме социального заказа здравоохранения Республики Беларусь "Комп-

лексное изучение течения и распространения госпитальных инфекций в лечебных учреждениях Республики Беларусь".

Цель и задачи исследования

Целью исследования явилась разработка новых методов определения ДНК-азы и гепариназы для оценки продукции этих ферментов патогенности микроорганизмами-возбудителями гнойно-воспалительных заболеваний.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие

задачи:

1) разработать количественный способ определения ДНК-азной активности биологических объектов;

2) при помощи данного способа изучить термостабильную и термолабильную эндонуклеазную активность стафилококков, выделенных от различных контингентов обследуемых;

3) разработать способ определения гепариназной активности микроорганизмов;

4) проанализировать взаимоотношения между продукцией этих ферментов и другими энзимами, выделяемыми возбудителями гнойно-воспалительных заболеваний и их осложнений.

Научная новизна полученных результатов

Впервые разработан высокочувствительный способ определения ДНК-азы, основанный на сгусткообразовании риванолом дезоксирибонуклеиновой кислоты обратно" пропорционально ее деполимеризации, позволяющий зафиксировать до 2 нг энзима в пробе, коэффициент вариации метода до 9%.

Впервые разработан метод определения гепариназной активности микроорганизмов, основанный на удалении нераспавше-гося гепарина бис-четвертичным аммониевым соединением этони-ем с последующим определением уроновых кислот в супернатанте карбазоловым методом.

Предлагаемые диагностические критерии (продукция термостабильной эндонуклеазы, плазмокоагулазы и лецитиназы) позволяют с вероятностью до 99, 8% дифференцировать золотистый и эпидермальный стафилококки.

Практическая значимость полученных результатов

Результаты исследования внедрены в бактериологической лаборатории Витебской областной клинической больницы, эпидемиологическом отделе Витебского областного центра гигиенн и эпидемиологии, а такие используются в учебном процессе на кафедре микробиологии с иммунологией и вирусологией Витебского медицинского института.

Разработаны и издаются методические рекомендации МЗ Республики Беларусь по определению ферментов агрессии и инвазии микроорганизмов.

Оформлено 2 заявки на изобретения "Способ определения ДНК-азной активности" и "Способ определения гепариназной активности бактерий". По первому изобретению получено положительное решение патентного ведомства Республики Беларусь от 16.08.1994г. По второму получена приоритетная справка от 13.10.92 г. N 5064948 патентного ведомства Российской Федерации.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Определение ДНК-азной (ТНК-азной) активности, основанное на образовании сгустка дезоксирибонуклеиновой кислоты риванолом обратно пропорционально ее деполимеризации, делает возможным быстро количественно оценить продукцию этого фермента бактериями.

2. Определение гепариназной активности бактерий, основанное' на удалении нераспавшегося гепарина бис-четвертичньм аммониевым соединением с последующим определением уроновых

кислот в супернатанте карбазоловым методом, позволяет выявлять гепариназопродуцирующих представителей аэробной и анаэробной микрофлоры среди возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний.

Личный вклад соискателя

Все исследования, проведенные в рамках диссертационной темы, выполнены самостоятельно.

Апробация результатов диссертации

Результаты исследований и основные положения диссертации доложены и обсуждены: на ежегодных научных конференциях Витебского мединститута, а также представлены на 1 Пленуме общества иммунологов Республики Беларусь (Могилев, 1993 г.); на 20 Пленуме правления общества хирургов Республики Беларусь (Новополоцк,1994); и на 2 Европейском съезде химиотерапевтов "Химиотерапия в инфекционных болезнях" в г. Коимбра, 1994г., Португалия.

Опубликованность результатов

По результатам исследования опубликовано 8 научных работ. Оформлено 2 заявки на изобретения. Разработаны и издаются методические рекомендации МЗ Республики Беларусь по определению ферментов агрессии и инвазии микроорганизмов. Получено 2 удостоверения на рационализаторские предложения.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 97 страницах машинописи, иллюстрирована 18 таблицами и 14 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, двух глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы, включающего 86 отечественных и 104 иностранных источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Всего нами было изучено 298 штаммов микрооганизмов, среди них S.aureus, S.epiderraidis, Proteus sp., Ps. aeruginosae, Citrobacter, sp, Klebsiella sp., Candida sp., Bacteroides fragi-lis, Peptostreptococcus sp., Peptococcus sp.

Штаммы были получены из городского центра гигиены, эпидемиологии и санитарии, а также выделены от оперированных больных с гнойными осложнениями из хирургического отделения N1 в бактериологической лаборатории Витебской областной клинической больницы. Идентификация вида стафилококков проводилась согласно методическим рекомендациям А. П. Красильникова и соавт., 1980 и 1986 г., Акатова А.К., с соавт., 1983 г. Выделение и идентификация анаэробов осуществлялись по методу В.И.Кочеровца и соавт.(1986,1990).

Каталазную, бета-лактамазную, протеолитическую и липоли-тическую активность микроорганизмов определяли по методам изложенным в руководстве Никитина В. М., 1986 г., с нашими модификациями.

Для сравнения с разработанным нами способом выявления ДНК-азной активности микроорганизмов использовали следующие количественные методы ее оценки: вискозиметрический метод ускоренного определения ДНК-азной активности (Никитин В.М., 1986 г.); метод определения ДНК-азной активности по спиртовому сгусткообразованию (Никитин В.М., 1986 г.).

Для определения гепариназной активности концентрацию гепарина оценивали по методу Bitter Т., 1962 г., с карбазоловым реактивом по глюкуроновой кислоте (Melet J., 1980 г.). Гидролиз гепарина осуществляли с помощью 1н р-ра соляной кислоты при нагревании на водяной бане. Уроновые кислоты определяли карбазоловым методом.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕАЗНОЙ АКТИВНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ ПО МЕТОДУ РИВАНОЛОВОГО СГУСТКА.

Мы усовершенствовали широко используемый метод экспресс -определения ДНК-азной активности по образованию сгустка ДНК спиртом обратно пропорционально ее деполимеризации (Никитин В.М., 1986 г.) В качестве нового сгусткообразователя применили хромоген риванол.

Было изучено взаимодействие различных катионных красителей с ДНК. Из всех исследованных хромогенов (метиленовый синий, акридин оранжевый, 2-этокси-6,9-диаминоакридина лактат (риванол) только последний образовывал сгусток с ДНК обратно пропорционально ее деполимеризации.

Нами был осуществлен -подбор оптимальных параметров сгуст-кообразования и условий инкубации фермента с ДНК.

Было выявлено, что при фиксированной концентрации риванола образование сгустка начиналось при содержании ДНК 25 мкг/мл, линейная зависимость сохранялась с увеличением концентрации ДНК до 200 мкг/мл. В дальнейшем увеличения оптической плотности сгустка не происходило.

При постановке эксперимента" с постоянной концентрацией ДНК (150 мкг/мл) оптическая плотность нарастала с увеличением количества хромогена до 0,08-0,10 мг в пробе.

В процессе работы необходимо было выяснить, существует ли зависимость сгусткообразования от ионной силы раствора. Были приготовлены растворы NaCl на Трис-HCl буфере, молярность которых увеличивалась от О, 01М до 2М. До концентрации 0,5М NaCL оптическая плотность оставалась неизменной, при дальнейшем нарастании ионной силы раствора она несколько увеличивалась.

Далее мы определяли зависимость сгусткообразования от рН среды. Использовали следующие буферные растворы с различным рН: глицин-HCl 0,1М рН 2,0; 2,6; 3,35; ацетатный 0,1М рН 3,6; 4,2; 5,3; натрий-фосфатный 0,1М рН 7,2; 8,2; трис-HCl О,02М рН 7,5. Оказалось, что сгусток не образуется в глицин-HCl буфере. При остальных же значениях рН сгусток образовывался.

Также было выявлено, что нет необходимости проводить специальную инкубацию смеси с риванолом, поскольку оптическая плотность сгустков была одинаковой в начале и конце 5-минутной инкубации.

При изучении стабильности окрашивания проб во времени мы определяли оптическую плотность сразу после добавления хромогена, через 30 мин, через 1ч, 3 ч, 6 ч, 18 ч, 24 ч. Выявилось, что за 3 ч она снижается в среднем на 0,03 ОД, оставаясь далее постоянной в течение суток.

Так как ДНКаза является металлозависимым ферментом, то мы провели подбор оптимальной концентрации ионов магния. Готовили растворы, содержащие хлорид магния в следующих концентрациях: 0,2М; 0,02М; О, 002М; О, 0002М; О, 00002М. При визуальном учете было отмечено, что сгусток увеличивается при высоких концентрациях Mg в смеси. В дальнейшем мы в своих исследованиях пользовались 0,02М трис-HCl буфером, содержащим О, Q02M MgCl¿. Данная концентрация является общепринятой при определении ДНКазы.

Итак, схема постановки основного опыта заключалась в следующем:

- готовили 5-кратные разведения ДНКазы производства Олайнского завода химреактивов в диапазоне от 100 нг/мл до 0,8 нг/мл на О,02М трис-HCl буфере, содержащем 0,002 М раствор хлорида магния;

- к 0,2 мл фермента добавляли 0,2 мл раствора ДНК (300 мкг/мл) и инкубировали в термостате при 37° в течение 30 мин;

- на поверхность проб наслаивали 20 мкл 0,5% раствора хромофора и встряхивали для получения сгустка.

Сгусток однократно отмывали дистиллированной водой, добавляли 0,5 мл 1 н раствора HCl, образец помещали в кипящую водяную баню на 5 минут для растворения сгустка, после чего смесь доводили до 2,5 мл дистиллированной водой.

Спектрофотометрировали при длине волны 410 нм.

Мы оценили воспроизводимость предлагаемого метода (как опытных, так и контрольных проб).

Коэффициент вариации контролей составил 2, 93%.

Коэффициент вариации ДНКазной активности внутри одного определения оказался равным 7,08% (содержание энзима - 10 нг в пробе, 9 определений).

Для определения коэффициента вариации ДНКазной активности между анализами использовали фермент дезоксирибонукле-азу в концентрации также 10 нг в пробе. Проводили 8 независимых дублированных определений (партии реагентов идентичные) с одним контролем. Время инкубации - 30 мин. Коэффициент вариации опыта был равен 8,86%, коэффициент вариации

контроля равен 3,46%.

Полученные результаты свидетельствуют о высокой воспроизводимости метода.

Мы проверили чувствительность предлагаемого способа при 30 и 60 мин инкубации. Оказалось, что за 30 мин достоверно открывается до 10 нг энзима. За 1 час - до 0,8 нг. Когда же инкубация была увеличена до суток, то мы не выявили порога чувствительности способа (он был менее 32 пг фермента в пробе), хотя контроля при такой инкубации также частично гидроли-зовались.

Было проведено сравнение чувствительности нашего способа и метода определения ДНКазной активности по спиртовому сгуст-кообразованию. При визуальном учете было отмечено, что ДНКаз-ная активность, определяемая спиртовым сгусткообразованием, появляется в пробах, содержащих не менее 100 нг фермента. Причем при более низкой концентрации субстрата контрольный спиртовой сгусток был нитевидным и не подлежал учету. Отсюда наш способ превышал сравниваемый по чувствительности не менее, чем в 10 раз, причем нам удалось снизить расход субстрата более чем втрое. В свою очередь, спектрофотометрическая детекция позволила придать нашему способу количественный характер и объективность.

В качестве метода сравнения мы использовали также вискозиметрию. При инкубации в течение часа с ее помощью достоверно открывалось только 100 нг зндонуклеазы. Отсюда предлагаемый нами способ был в 10-100 раз более чувствительным.

Способ был модифицирован для определения ДНКазы микроорганизмов. В этом случае для приготовления суспензии микробов брали две-три петли выделенной чистой культуры золотистого стафилококка или несколько его колоний и суспендировали в дистиллированной воде. Измеряли оптическую плотность взвеси на спектрофотометре при длине волны 600 нм и приводили ее к значению 1,0 дистиллированной водой. Для изучения термостабильной ДНК-азы взвесь кипятили на водяной бане в течение 30-ти минут.

К 0,2 мл приготовленной взвеси микроорганизмов добавляли 0,1 мл раствора ДНК (600 мкг/мл) и 0,1 мл 0.02М трис-HCl буфера, содержащего О,002М раствор хлорида магния. Смесь инкубировали в термостате при 37° в течение 4 часов. Затем на поверх-

ность проб наслаивали 20 мкл (1/20 от полученного общего объема) 0,5% раствора риванола (100 мкг в пробе) и встряхивали для получения сгустка. Контролем служила проба, содержащая вместо суспензии микробов 0,2 мл дистиллированной воды.

При визуальном учете полученные результаты оценивали в баллах: 0 - отсутствие активности - крупный, компактный сгусток; 1 - слабая активность - мелкий, рыхлый сгусток; 2 - высокая активность - хлопья, нити; 3 - очень высокая активность -полный распад сгустка с образованием гомогенной взвеси.

В части экспериментов учет проводили не только полуколичественным, но и количественным способом. Для этого сгусток двукратно отмывали дистиллированной водой, добавляли 0,5 мл 1 н раствора HCl, и образец помещали в кипящую водяную баню на 5 минут для растворения сгустка, после чего смесь доводили до 2 мл дистиллированной водой и детектировали. Определение проводили с помощью спектрофотометрии (длина волны - 410 нм, толщина слоя - 1 см). Измерения проводили против дистиллированной воды.

РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ СПОСОБА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕПАРИНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИЙ

Нам удалось разработать и апробировать в условиях бактериологической лаборатории новый метод определения гепариназной активности микроорганизмов.

Сущность способа заключается в том, что после инкубации бактерий с субстратом (гепарином), нераспавшийся гепарин удаляется бис-четвертичным аммониевым соединением (1,2-эти-лен-бис-Ш-диметил-карбдецшюксиметил-) аммония дихлоридом (этонием), а продукт распада гепарина (глюкуроновая кислота), образовавшаяся под действием гепариназы бактерий, определяется карбазоловым методом.

Способ осуществляли следующим образом: готовили взвесь суточной культуры бактерий (1 петля в 1 мл физиологического раствора). К 0,2 мл культуры добавляли 0.4 мл 1% раствора гепарина. Смесь инкубировали в течение 24 часов при температуре

- и -

37°С. После инкубации взвесь центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 минут. К 0,5 мл супернатанта добавляли 0,5 мл 1% раствора этония и инкубировали в термостате в течение 10 мин при температуре 37°С, затем к пробе добавляли 0,1 мл 1н НС1 и перемешивали.

Смесь центрифугировали в центрифуге с бакетным ротором в стеклянных центрифужных пробирках при 1500 об/мин в течение 10 минут. После этого надосадочную жидкость центрифугировали повторно в центрифуге с угловым ротором при 8000 об/мин в течение 20 минут.

К 0,5 мл надосадочной жидкости добавляли 3 мл боратного реактива. Для приготовления последнего 0, 955 г тетрабората Na растворяли в 100 мл концентрированной серной кислоты (плотность - 1,84 г/см). Полученные образцы тщательно перемешивали и кипятили на водяной бане при Ю0°С в течение 10 мин. Пробы охлаждали на водяной бане при 4°С в течение 5 мин, после чего добавляли 0,1 мл 0,125% спиртового раствора карбазола и кипятили на водяной бане при 100ВС в течение 15 мин. Пробы повторно охлаждали на водяной бане при 4°С в течение 5 мин.

Результат считали положительным, а микроорганизм - гепа-риназопродуцирующим, если в опытных пробах происходило изменение цвета до малинового окрашивания. В случае количественного учета реакции образцы спектрофотометрировали против дистиллированной воды при длине волны 530 нм, толщина рабочего слоя кюветы 1 см. В этом случае за положительную принимали пробу с оптической плотностью выше среднего значения контролей на 50% и более.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕАЗНОЙ И ГЕПАРИНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ИСТОЧНИКОВ

Разработанные нами методы определения ДНК-азной и гепари-назной активности были использованы для изучения вклада данных энзимов в патогенез гнойно-воспалительных заболеваний и осложнений, а также в оценке возможности использования этих ферментов для микробиологической диагностики.

При изучении штаммов, выделенных от больных гнойными хирургическими заболеваниями и осложнениями, оказалось, что они характеризуются наличием широкого спектра ферментов инвазии и агрессии, причем наиболее часто встречающимся энзимом была ДНК-аза (до 93 - 97%) в зависимости от изучаемых штаммов. Ка-талаза присутствовала у 67,4% штаммов, бета-лактамаза - у 62,6%,.. гиалуронидаза - у 40%, протеаза - у 36,78%, гепариназа - у 17,7%. Совместная продукция ДНК-азы и гепариназы обнаружена у 10 из 12 (83, 3%) видов-возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний. В целом микроорганизмы одновременно продуцировали от 2-х до 7 ферментов агрессии. Принимая во внимание одномоментный синтез большого количества энзимов деполимеризующего действия, представляется существенной их комплексная роль в патогенезе гнойно-воспалительных осложнений в хирургии (в частности - при перитоните). Соответственно, это требует осуществления специфического антиферментного воздействия при таких состояниях. Последнее положение подтверждается и успешными клиническими примерами такой терапии.

Учитывая положительные результаты применения наших методов определения ферментов агрессии (в частности ДНК-азы) в клинических условиях, мы попытались также оценить возможность использования критерия ДНК-азной активности для установления вида микроорганизма, а именно - S.aureus. Известно, что патогенные, высоко токсигенные, типируемые фагами штаммы стафилококков в подавляющем большинстве случаев обладают резко выраженной ДНК-азной активностью. Тем не менее, простое наличие у коагулазоотрицательных стафилококков ДНК-азной активности еще не является критерием, по которому их абсолютно следует относить к S. aureus. Коагулазонегативные стафилококки также продуцируют ДНК-азу (0-47,3%), хотя они проявляют ее в меньшей степени, приблизительно в 10 раз слабее, чем S. aureus (Акатов А.К. с соавт., 1983).

Используя разработанный нами способ, мы оценили ДНК-азную и термонуклеазную активность S.aureus и S.epldermldls, выделенных от различных контингентов обследуемых, и сравнили ее с другими факторами, применяющимися в качестве диагностических критериев.

Оказалось, что в предлагаемых условиях инкубации ДНК-азу

удалось обнаружить у 73 штаммов S.aureus из 83, что составило 88%. ТНК-аза открывалась у 82 штаммов из 83, что составило 98,8%. У эпидермального стафилококка ДНК-аза присутствовала у 14 штаммов из 85, что составило 16,5%. ТНК-аза присутствовала у 4 штаммов из 85, что составило 4, 7%.

Очевидно, что ни ДНК-аза, ни ТНК-аза, ни любой другой фактор не могут быть использованы в качестве единственного критерия дифференциации данных видов, что полностью совпадает и с литературными данными (Акатов А.К. с соавт., 1983 г.). Для близкой к полной дифференциации предлагались следующие сочетания факторов: лецитиназа и плазмокоагулаза, ДНК-аза и лецити-наза, плазмокоагулаза и протеин А, плазмокоагулаза и разложение маннита и т.д. Эти комбинации обладают приблизительно равными диагностическими возможностями, не достигая, однако, 100%. По данным многофакторного дисперсионного анализа нами было установлено, что сочетание положительной ТНК-азы, плазмо-коагулазы и лецитиназы позволяет установить вид S.aureus с вероятностью 0.998 при дифференциации его со S.epidermidis. Использование этих критериев является удобным для обычной лабораторной практики, поскольку лецитиназная активность определяется в ходе посева материала на ЖСА по Чистовичу, а ТНК-азная и плазмокоагулазная активность определяются в течение следующего рабочего дня.

Результаты проведенного кластерного анализа по .одной из групп обследуемых полностью совпали с установленной видовой принадлежностью стафилококков. Все это подтверждает полученные нами данные. Удалось получить также уравнение множественной регрессии для определения вида стафилококка.

Таким образом, разработанные нами методы определения ферментов агрессии микроорганизмов (ДНК-азы и гепариназы) позволили нам повысить чувствительность и ускорить определение этих энзимов. Использование их в клинической практике дало возможность корригировать назначаемую терапию при хирургических гнойно-воспалительных заболеваниях и осложнениях. Кроме того, их использование оказалось возможным при дифференциации различных видов стафилококков.

- 1 н -

выводы

1) Разработан .метод определения ДНК-азной активности по предупреждению образования сгустка ДНК риванолом, позволяющий открывать данный фермент в различных биологических жидкостях с чувствительностью до 2 нг энзима в пробах (с коэффициентом вариации 8-9%), а также проводить идентификацию ДНК-азопроду-цирующих штаммов микробов.

2) Разработан метод определения гепариназной активности бактерий, основанный на удалении нераспавшегося гепарина бис-четвертичным аммониевым соединением этонием с последующим определением уроновых кислот в надосадочной жидкости карбазо-ловым методом.

3) По наличию термонуклеазной активности штаммы стафилококков обнаруживают значительные различия: у золотистого стафилококка ТНК-аза присутствовала у 82 штаммов из 83 (98,8%), у эпидермального - у 4-х из 85 (4,1%).

4) Наиболее значимыми ферментами при дифференциации между золотистым и эпидермальным стафилококком являются ТНК-аза, плазмокоагулаза и лецитиназа (коэффициент корреляции между видом стафилококка и наличием данных энзимов равен 95,3%, 93,9%, 80,0%,' соответственно, при р<0,001). При наличии всех трех положительных тестов вероятность соответствия стафилококка виду S.aureus превышает 99,8%.

5) По наличию ферментов инвазии и агрессии штаммы микроорганизмов, выделенные от больных с гнойно-воспалительными заболеваниями и их осложнениями, распределились следующим образом: ДНК-азной активностью обладало 90,9% от общего числа изученных штаммов, каталаза присутствовала в 67,4%, бета-лактама-за - 62,6%, гиалуронидаза - 40%, протеаза - 36,78%, гепариназа - 17,7%.

6) Совместная продукция ДНК-азы и гепариназы обнаружена у 10 из 12 (83,3%) видов-возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. К.С. Азаренок, И.И.Генералов, А.Г.Голубева, Н.В.Железняк, И.И.Шур, М.Р.Конорев. определение дезоксирибонуклеазы стафилококков/ Витебский медицинский институт Минздрава Республики Беларусь,- Витебск, 1992.- 4_ е.- Библиогр. 3

назв.__- Рус,- (Рукопись деп. в ВИНИТИ 14.07.92., N 2292 -

В92.

2. К.С.Азаренок, И.И.Генералов, А.Г.Голубева, Н.В.Железняк, И.И.Шур, М.Р.Конорев. Усовершенствование способа определения активности ДНК-азы / Витебский медицинский институт Минздрава Республики Беларусь,- Витебск, 1992,- 4_ е.- Библиогр. 3 назв.Рус,- (Рукопись деп. в ВИНИТИ 14.07.92., И 2291 - В92.

3. И.И.Генералов, И.И.Шур, Н.В.Железняк, М. Р.Конорев, А.Г.Голубева. ДНК-азная активность иммуноглобулинов /Витебский медицинский институт Минздрава Республики Беларусь.- Витебск, 1992,- 5_ е.- Библиогр. 3 назв._.- Рус,- (Рукопись деп. в ВИНИТИ 14.07.92., N 2290 - В92.

4. К.С.Азаренок, И.И.Генералов, А.Г.Голубева, Н.В.Железняк, И.И.Шур, М.Р.Конорев. К вопросу об определении эндонукле-азной активности. //Сб. "Роль наследственных факторов в патогенезе заболеваний человека." - Витебск, 1992. - С.99'- 104.

5. Генералов И.И., Голубева А. Г., Железняк Н.В., Беренш-тейн Т. Ф., Адамович Л. И. Определение эндонуклеазной активности для дифференциальной диагностики стафилококков.//Сб. "Вопросы патогенеза и терапии инфекционных и паразитарных заболеваний." - Витебск, 1993. - С. 53 - 55.

6. Голубева А. Г.. Генералов И.И., Косинец А.Н. Изучение ферментов агрессии бактерий как определяющих патогенетических факторов при микробной инфекции. // Сб. "Механизмы регуляции гомеостаза организма." - Витебск, 1994. - С.121 -123.

7. Генералова А.Г., Сидорская Е.В. Определение ТНК-азной активности стафилококков. // Сб. "Актуальные вопросы медицины. " - Витебск, 1994. - С. 8-9.

8. Косинец А.Н., Генералова А.Г., Железняк Н.В., Карлович Г. А., Беренштейн Т. Ф. Микробиологическая диагностика гнойно-воспалительных процессов в хирургии по ферментам агрессии возбудителей. //Сб. "Актуальные проблемы современной медицины. " - Витебск, 1994. - Т. 2. - С. 73 - 74.

Генералова Анжелика Геннадьевна

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕЗОКСЙРИБОНУКЛЕАЗНОЙ И ГЕПАРИНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ИСТОЧНИКОВ

Ключевые слова: ДНК-азная активность, гепариназная активность, методы определения, аэробные и анаэробные, микроорганизмы, стафилококки,

В работе осуществлена разработка новых методов оценки ДНК-азной и гепариназной активности бактерий. Определение ДНК-азной активности по предупреждению образования сгустка ДНК риванолом позволяет открывать данный фермент в любых биологических жидкостях до 2 нг в пробах (с коэффициентом вариации 8-9%), а также проводить идентификацию ДНК-азопро-дуцирующих штаммов микробов. Гепариназопродуциругащие возбудители гнойно-воспалительных заболеваний выявляются методом определения гепариназной активности, основанном на удалении нераспавшегося гепарина этонием с последующим определением уроновых кислот в надосадочной жидкости карбазоловым методом. Разработанные способы позволяют проводить диагностику высоковирулентных штаммов бактерий среди представителей аэробно-анаэробной микрофлоры. Кроме того, их использование оказалось возможным при дифференциации различных видов стафилококков.

РЭЗЮМЕ

Генералава Анжалхка Генадзьеуна

РАСПРАЦОУКА МЕТАДАУ ВЫЗНАЧЭННЯ ДЭЗАКСIРЫБАНУКЛЕАЗНАЙ И ГЕПАРЫНАЗНАЙ АКТЫУНАСЦ1 У М1КРААРГАН13МАУ РОЗНАГА ПАХОДЖАННЯ

Ключавыя словы: ДНК-азная актыунасць, гепарыназная актыу-насць, метады вызначэння, аэробныя 1 анаэробныя м!краарган1з-мы, стаф!лакок1.

У даследавашп ажыццеулена распрацоука новых метадау ацэнк1 ДНК-азнай 1 гепарыназнай актыунасц! м1краарган!змау. 1Вызначэнне ДНК-азнай актыунасц! шляхам папярэджання сгусткаут-варэння ДНК рыванолам дае магчымасць знаходзгць гэты фермент ва усяляк1х б!ялаг1чных вадкасцях да 2 нг энз1ма у пробах (с каэфЩентам варыяцН 8-9%), а таксама праводзЩь !дэнтыф1ка-цыю ДНК-азапрадуцыруючых штамау м1кробау. Гепарыназапрадуцыру-ючыя штамы узбуджальн1кау гнойна-запаленчых захворванняу адк-рываюцца з дапамогай вызначэння гепарыназнай актыунасц! па вы-даленню неразбуранага гепарына этон!ям з наступнай ацэнкай колькасц! уронавых к!слот у надасадкавай вадкасц! карбазолавым метадам. Распрацаваныя спосабы ствараюць магчымасць да дыяг-носц1к! высокав1рулентных штамау м1кробау сярод прадстаун!коу аэробна-анаэробнай мшрафлоры. Апрач таго, !х выкарыстанне апынулася мэтазгодным для дыферэнщфоук1 розных в!дау стаф1ла-кокау.

SUMMARY

Generalova Anjelika Gennad'evna

CREATION OF DNASE AND HEPARINASE ACTIVITY DETECTION METHODS OF MICROORGANISMS DERIVED FROM DIFFERENT SOURCES

Key words: DNAse activity, heparinase activity, methods of their determination, aerobic and anaerobic microorganisms, staphylococci.

The new methods of microbial DNAse and heparinase activity determination were developed. The method of DNAse activity detection using rivanol-DNA clot formation prevention makes possible the DNAse determination at different biological fluids and sources (including microorganisms) with maximal sensitivity 2 ng/ml and variation coefficient equal 8-9%. The heparinase-producing strains are determined with the method of the heparinase activity detection, based on complexing of non-degraded heparin with the cation detergent aethonium followed by uronic acid determination In the supernatant with the carbasol reaction. The methods having been worked out may be used for the high-virulence representatives typing among the aerobic-anaerobic strains. The DNAse activity detection may be used also for staphylococci species determination.