Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка метода получения полиненасыщенных жирных кислот

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка метода получения полиненасыщенных жирных кислот"

На правах рукописи

003053220

Рахматуллина Юлия Рашитовна

РАЗРАБОТКА МЕТОДА ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИНЕНАСЫЩЕНШ»1Х ЖИРНЫХ КИСЛОТ

Специальность 03.00.23 - «Биотехнология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Казань - 2007

003053220

Работа выполнена на кафедре биохимии и технологии микробиологических производств Уфимского государственного нефтяного технического университета.

Научный руководитель

Официальные оппоненты:

Ведущая организация

доктор химических наук, профессор Зорин Владимир Викторович.

доктор технических наук, профессор Решетник Ольга Алексеевна; кандидат биологических наук, доцент Рахимова Гузель Маратовна.

Институт биологии Уфимского научного центра Российской Академии наук.

Защита состоится «28» февраля 2007 года в 14-00 на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.080.02 при Казанском государственном технологическом университете по адресу: 420015, Республика Татарстан, г. Казань, ул. К. Маркса, 68.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Казанского государственного технологического университета.

Автореферат разослан «28» января 2007 года.

Ученый секретарь совета

Поникаров С.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) играют важную роль в биологических системах. ПНЖК подвергаются биотрансформации липоксигеназами или циклооксигеназами, что приводит к образованию многочисленных низкомолекулярных регуляторов процессов, протекающих в клетках, тканях и организме в целом. Одной из важнейших ПНЖК является арахидоновая кислота (АК), являющаяся предшественником простагландинов, лейкотриенов и тромбоксанов. Основными областями применения АК являются: фармакология, косметическая промышленность, пищевая промышленность, сельское хозяйство и др. В настоящее время основным источником получения АК являются липидные экстракты из печени свиньи и других органов животных, что делает их крупномасштабное производство неэффективным (содержание АК оставляет не более 0,2% в пересчете на сухую массу - АСВ). В течение последних двадцати лет значительные успехи были достигнуты в области биотехнологического получения АК с помощью низших грибов и морских водорослей, которые в ряде случаев позволили осуществить ее промышленное производство. Однако существующие на сегодняшний день биотехнологии получения АК далеки от совершенства, поскольку ее выход в лабораторных условиях в лучших случаях составляет 13 г/л (Япония), а в среднем у различных исследователей около 6-10 г/л (Россия, США, Польша и др.). В связи с этим создание эффективных отечественных биотехнологий получения АК и других ПНЖК является актуальной задачей.

Цель работы. Разработка эффективного метода получения ПНЖК на основе гриба Mortierella alpina (18-1) и исследование направлений их практического использования.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

поиск и подбор компонентов питательной среды для эффективного культивирования гриба;

исследование динамики накопления биомассы, АК и других ПНЖК на подобранной среде;

поиск экспресс-метода контроля за биосинтезом АК in vivo; поиск условий биосинтеза других ценных ПНЖК; обоснование принципиальной технологической схемы получения ПНЖК в оптимальных условиях;

исследование рострегулиругощей активности ПНЖК.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с Федеральной целевой программой «Государственная поддержка интеграции высшего образования и фундаментальной науки в 2002-2006 гг.» (2004-2006 гг., госкотракт № 02.438.11.7003), с региональной программой РФФИ "Агидель" (2005г.), планами научно-исследовательских работ Уфимского государственного нефтяного технического университета (2003-2006 гг.), ведомственной научной программой "Развитие научного потенциала высшей школы" (проект «Научно-образовательная деятельность музея, созданного на базе кафедры биохимии и технологии микробиологических производств Уфимского государственного нефтяного технического университета», 2005-2006 гг.).

Научная новизна. Разработан метод экспресс-анализа содержания арахидоновой кислоты в мицелии гриба Mortierella alpina (18-1) в процессе культивирования на плотной овсяной среде. Найдены условия, позволяющие эффективно осуществлять биосинтез ПНЖК. В этих условиях исследована динамика

состава ПНЖК в процессе культивирования. Научно обоснована принципиальная технологическая схема производства ПНЖК с помощью гриба М. alpina (18-1) на плотной овсяной среде. Показана принципиальная возможность получения практически ценной эйкозапентаеновой кислоты на основе изученного штамма М. alpina.

Практическая значимость. Разработан метод получения ПНЖК с помощью гриба М. alpina на твердой овсяной среде с выходом АК 15,3 г/кг среды. Результаты научных исследований легли в основу создания новых лабораторных работ и используются в учебном процессе при подготовке инженеров по специальности 240901 «Биотехнология» в УГНТУ.

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на 55, 56, 57-й научно-технических конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых УГНТУ (2004-2006), V Всероссийском научном семинаре и Молодежной научной школе «Химия и медицина» (Уфа, 2005), III Всероссийской научной INTERNET-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и механики многофазных систем» (Уфа, 15-31 декабря 2005), IV, V Всероссийских научных INTERNET-конференциях «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и биотехнологии» (Уфа, 20052006).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 2 статьи и материалы докладов 7 конференций.

Структура и объем работы: Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов, материалов и методов исследования (глава 2), обсуждения результатов (глава 3), выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Работа изложена на 161 страницах машинописного текста, содержит 61 рисунок и 12 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1 Исследование влияния состава среды на рост и липидообразование гриба при поверхностном культивировании

Ранее сотрудниками кафедры биохимии и технологии микробиологических производств УГНТУ была показана возможность получения АК с использованием штамма М. alpina (18-1) с выходом 10,4 г/кг среды при поверхностном культивировании на картофельно-глюкозной пасте.

С целью повышения выхода АК был осуществлен поиск эффективных сред, обеспечивающих более активный рост гриба, синтез липидов и АК. В результате исследования роста биомассы штамма М. alpina на плотных питательных средах на основе риса, а также традиционных для России сельскохозяйственных культур -пшеницы, ржи, ячменя, овса, гречихи и картофеля - было установлено, что наиболее активно гриб растет на овсяной среде (ОС). Однако исследование содержания липидов в клетках гриба М. alpina показывает, что даже в течение 23 суток культивирования оно не превышает 20% (от АСВ). Так как эффективный синтез триацилглицеридов может осуществляться при высоких концентрациях источника углерода, то для интенсификации биосинтеза ПНЖК целесообразно использовать дополнительные источники углерода - глюкозу, растительные масла, жирные кислоты (ЖК) или глицерин.

При исследовании роста исследуемого гриба М. alpina на ОС в присутствии оливкового, подсолнечного, льняного масла или олеата натрия (в концентрации 1%)

во всех случаях было обнаружено увеличение выхода биомассы по сравнению с контролем (рисуГгок 1). Наилучшие результаты были получены на среде с добавкой олнвковот масла, обеспечивающего увеличение выхода сырой биомассы в 1,7 раза.

Недавно было показано, что степень окрашивания мицелия, инкубированною с 2,3,5 -три ф еши гтегразоли см хлоридом (ТТХ), восстанавливающимся дегидрогеназами живых организмов в 2,3,5-трифенилформазан красного цвета, коррелирует (степень корреляции 0,982) с содержанием АК и грибах Mortierella alpina М-2 7.

W

/-N-CA I ---Í-^ ГйНч—с

»-Sí-ад WN-qh,

а

на

В то же время показано, что ТТХ-редуктазпая активность не обнаруживается у других олеогенных фибов, не способных синтезировать ЛК. Это указывает на участие специфических для синтеза АК фермеров в восстановлении ТТХ. В отличие от длительных и трудоемких методов, основанных на выделении липидов и анализе их состава, этот метод мог оказаться весьма удобным для экспресс-контроля процесса синтеза АК in vivo.

) 1ри использовании в качестве дополнительного ростовою субстрата растительных масел или олеата натрия при культивировании исследуемого гриба M.alpina были выявлены различия и в динамике 'ГГХ-редуктазной активности грибного мицелия (рисунок 2).

Ш подсолнечное масло -1%

■ олеат натрия - 1%

□ Ota доЛавок (кои г роль)

■ оливковое масло - 1 % В лыгяиое масло -1 %

Рисунок 1 - Выход биомассы гриба Mortierella alpina при росте гриба на овсяной среде с растительными маслами и олеатом натрия

5 10 [3 14 1S 16 17 19 30 21 22 Время, сутки - — подсолнечное масло -1% —•—оливковое масло - 1%

олеат натрия - 1% —•—льняное масло - l'A

Условия реакции: ТТХ - 0,8 %; биомасса -100 мг/мл; 0,2 M боратный буфер (рН 8,0); температура -25°С; время -1 ч

Рисунок 2 - Динамика изменения ТТХ-редукташой активности мицелия гриба M.alpina (в ед. оптической плотности, /,"485 нм) при росте на овсяной среде с добавками растительных масел и олеата натрия

Наиболее высокую активность проявляют выращенные в присутствие 1% оливкового масла.

17 - 20-суточные мицелии,

Установлено, что у 22-суточного мицелия гриба, выращенного на этой среде, наблюдается и более высокий уровень ТТХ-редукгазной активности мицелия по сравнению с мицелием гриба, выращенным на овсяной среде без добавок.

При исследовании влияния других источников углерода (глюкозы и глицерина) на рост гриба было установлено, что при концентрации 1% эти соединения увеличивают выход биомассы на 18 и 22,6%, соответственно. Более высокие концентрации этих соединений подавляют рост гриба (рисунок 3).

о 5 ю

Концентрация субстрата, %

—•— глицерин —О— глюкоза

Рисунок 3 - Рост гриба на ОС и добавкой различных концентраций глюкозы и глицерина

11 12 13 14 15 16 18 Время, сутки

Условия реакции: ТТХ - 0,8 %; биомасса -100 мг/мл; 0,2 М боратный буфер (рН 8,0); температура - 25°С; время -1ч

Рисунок 4 - Динамика изменения ТТХ-редуктазной активности мицелия гриба М. alpina при росте на овсяной среде с глицерином и глюкозой

В то же время липидообразование наиболее активно протекает именно при повышенной концентрации глицерина и глюкозы (рисунок 3). На среде с глицерином наблюдается более высокая ТТХ-редуктазная активность мицелия по сравнению со средой, содержащей оливковое масло (в 1,24 раза). Это свидетельствует об увеличении активности или количества ферментов, участвующих в синтезе АК.

С целью увеличения выхода липидов при росте на ОС с глицерином и глюкозой была предпринята попытка стимулировать липидообразование путем введения в среду биосинтетического предшественника ЖК - цитрата натрия (ЦН) или ионов цинка и магния, которые являются кофакторами ацетил-СоА-карбоксилазы.

В результате исследования роста гриба на овсяной среде с глюкозой, содержащей различные концентрации ЦН, было обнаружено, что это соединение полностью подавляет рост гриба уже в концентрации 5 г/л (рисунок 5).

В то же время при росте на среде с глицерином при концентрации ЦН 5 г/л, напротив, наблюдается увеличение выхода биомассы через 20 суток (в 1,8 раз). Ингибирующий эффект ЦН в этом случае проявлялся только в области концентраций 10-20 г/л.

Анализ динамики ТТХ-редуктазной активности мицелия гриба М alpina при его росте на средах, содержащих 1% глицерина и 0,5% ЦН, показывает (рисунок 6), что в случае добавки глицерина эта зависимость имеет экстремальный характер с максимумом на 15 сутки, а в случае совместного присутствия глицерина и ЦН монотонно возрастает в изученном интервале.

При внесении в ОС с глицерином ионов цинка и магния ТТХ-редуктазная

активность достигала такого же уровня, что и на среде только с глицерином, а в случае сульфата цинка даже превышала его (рисунок 7).

200£ 160'

I g 120' а в

I 1 80*

ti—t

1ИШИ

1! Л-HaJ

I г 4<Ч

° о!

О г/л 5 г/л 10 г/л 20 г/л

Концентрация цитрата натрия

О овсяная среда с добавкой 1% глицерина Р овсяная среда с добавкой 1% глюкозы

8 9 11 12 13 14 15 16 18 Время, сутки

- ОС с глицерином

- ОС с глицерином и цитратом натрия

Рисунок 5 - Влияние ЦН на выход Условия реакции: ТТХ - 0,8 %; биомасса -биомассы гриба 100 мг/мл; 0,2 М боратный буфер (рН 8,0);

температура - 25°С; время -1ч

Рисунок 6 - Динамика изменения ТТХ-редуктазной активности мицелия гриба М. alpina при росте на овсяной среде с глицерином и цитратом натрия

При этом выход биомассы не уступал среде с глицерином и цитратом натрия (таблица 1).

Таблица 1 - Влияние добавок сульфатов цинка, магния на выход биомассы и липидов

Среда Выход биомассы, г/кг среды Выход липидов, % от АСВ

ОС с 1% глицерина и 0,5% ЦН 44,3 29

ОС с 1% глицерина и 0,01% сульфата цинка 45,0 67

ОС с 1% глицерина и 0,01% сульфата магния 39,2 62

В то же время содержание липидов в биомассе существенно превышало их уровень, полученный на среде с глицерином и цитратом натрия, и составило 62 -67%.

Таким образом, учитывая высокий выход липидов и биомассы, а также и наибольшую ТТХ-редуктазную активность, наиболее приемлемой средой может явиться овсяная среда с глицерином и сульфатом цинка, при условии подтверждения максимального выхода арахидоновой кислоты.

2 Корреляция ТТХ-редуктазной активности мицелия с содержанием

арахидоновой кислоты в липидах при росте гриба на овсяной среде с глицерином и сульфатом цинка

Анализ зависимости ТТХ-редуктазной активности препаратов грибного мицелия, полученных в течение различного времени (5, 8, 10, 14, 18 и 23 суток) при культивировании их на овсяной среде с глицерином и сульфатом цинка, от

содержания АК в составе липидов показывает, что она не является линейной (рисунок 8).

10 12 14 Время, сут

-с глицерином и сульфатам цинка -с глицерином и сульфатом магния

Арахидонован кислота, % (от суммы кислот)

Условия реакции: ТТХ - 0,8 %; биомасса -100 мг/мл; 0,2 М боратный буфер (рН 8,0); температура - 25°С; время -1ч

Рисунок 7 - Динамика изменения ТТХ-редуктазной активности мицелия гриба М. alpina при росте на овсяной среде с глицерином и сульфатами магния и цинка

Рисунок 8 - Зависимость ТТХ-редуктазной активности мицелия М.а1рта различного возраста, выращенного на овсяной среде с глицерином и сульфатом цинка от содержания арахидоновой кислоты в липидах

Вместе с тем можно выделить два участка, которые могут описываться прямыми линиями. Первый участок охватывает период роста культуры в течение 5 -15-ти суток, а второй от 15 до 18-ти суток. Полученные результаты позволяют предположить, что за восстановление ТТХ отвечает не один, а несколько ферментов, активность или содержание которых меняются в клетках в процессе роста.

2.1 Влияние условий на восстановление ТТХ 7- и 18-суточными мицелиями гриба

Исследование температурной зависимости ТТХ-редуктазной активности исследуемых мицелиев показало, что она имеет экстремальный характер с максимумом при 25°С независимо от возраста гриба (рисунок 9а).

При изучении влияния рН установлено, что в молодом мицелии наибольшая ТТХ-редуктазная активность проявлялась при рН 7,5 - 8,0, тогда как в более позднем мицелии - при рН 8,5 (рисунок 96).

Изучение иншбирующего действия метилэтилкетона (МЭК, конкурентный окислитель восстановленной формы Д5-десатуразы) на восстановление ТТХ позволило выявить более высокую чувствительность 7-суточного гриба к этому соединению по сравнению с 18-суточным мицелием (рисунок 9в).

Ингибирующее действие МЭК на ТТХ-редукгазную активность 18-суточной биомассы гриба также начинает проявляться в области низких концентраций, но

менее выражение, чем в более молодом мицелии.

Полученные зависимости ТТХ-редукгазной активности от концентрации МЭК могут быть связаны с участием в восстановлении ТТХ двух ферментов, различающихся опгимумами рН и чувствительностью к МЭК, либо низким содержанием фермента у молодого мицелия М. alpina.

10 20 30 Температура, град. Ц

Условия реакции- ТТХ - 0,8 %; биомасса -100 мг/мл; 0,2 М боратный буфер (рН 8,0);

время -1ч

- 7-суточный мицелий ■

- 18-сугочный мицелий

Условия реакции: ТТХ - 0,8%; биомасса - 100 мг, фосфатный или боратный 0,2 М буфер - 1 мл, температура - 25°С, врем« -1ч

0 12 3 4

содержание метклэтилкетона, %

Условия реакции: ТТХ - 0,8 %; биомасса -100 мг/мл; 0,2 М боратный буфер (рН 8,0); температура -25°С; время - 1 ч

Рисунок 9 - Зависимость ТТХ-редуктазной

активности грибного мицелия от а - температуры; б - от кислотности среды; в - от концентрации метилэтилкетона

Следует заметить, что в период достижения наиболее высокого содержания АК в липидах гриба (18 - 20 суток) наблюдается высокая активность фермента с оптимумом рН 8,5.

2.2 Корреляция ТТХ-редуктазной активности и содержания арахидоновой кислоты в липидах 18 - 23-ти суточных мицелиев, полученных на овсяных средах с различными добавками

При исследовании состава липидных фракций было обнаружено, что наибольший уровень АК наблюдается в препаратах, полученных из мицелия с более высокой ТТХ-редуктазной активностью (таблица 2). Выявлена линейная

положительная корреляционная зависимость этих параметров с высоким значением коэффициента корреляции (г2 = 0,97) (рисунок 10).

Таблица 2 - ТТХ-редуктазная активность гриба М alpina и содержание арахидоновой кислоты в липидах при росте на различных средах

Среда Возраст биомассы, сут ОП 485 АК, % (от суммы кислот)

ОС с оливковым маслом (1 %) 18 2,513 56,6

ОС с оливковым маслом (1 %) и сульфатом цинка (0,01%) 18 2,815 45,3*

ОС (без добавок) 18 1,411 35,7

ОС с глицерином (1 %) 19 1,840 35,8

ОС с ЦН (0,5%) 18 1,691 55,0

ОС с глицерином (1 %) и ЦН (0,5%) 18 2,380 51,6

ОС с глицерином (1 %) и сульфатом цинка (0,01 %) 19 2,877 63,7

ОС с глицерином (1 %) и сульфатом магния (0,01 %) 19 3,108 68,7

Примечание - Условия реакции: ТТХ - 0,8 %; 18-19-суточная биомасса - 100 мг/мл; 0,2 М боратный буфер (рН 8,5); температура - 25°С; время -1ч.

Полученные результаты показывают принципиальную возможность использования данной зависимости для экспресс-анализа in vivo содержания арахидоновой кислоты в липидах исследуемого гриба М. alpina (по крайней мере, при культивировании на рассмотренных средах) по степени окрашивания 18-20-суточных мицелиев, инкубированных с ТТХ.

3 Исследование динамики роста биомассы Mortierella alpina и состава липидов

на перспективной среде

Исследование роста гриба на овсяной среде с добавками глицерина (1%) и сульфата цинка (0,01%) показало, что биомасса увеличивается в течете всего периода культивирования - 23-х суток (рисунок 11). В то же время выход, рассчитанный на обезжиренную биомассу, полученную после экстракции липидов гексаном, активно увеличивается только в течение 8-ми суток. Это показывает, что рост гриба, в ходе которого должны синтезироваться белки, нуклеиновые кислоты и другие вещества, необходимые для построения клеток, происходит в этот период, после чего наступает стационарная фаза.

При исследовании динамики накопления липидов в грибном мицелии, было обнаружено, что к началу стационарной фазы роста (через 8 суток) выход липидов в расчете на один килограмм среды составляет около 20 % от максимального уровня (рисунок 11). Основной синтез липидов происходит во время стационарной фазы.

В период 8-18 суток содержание липидов в мицелии гриба возрастает с 36 до 67% и продолжает медленно увеличиваться до конца культивирования.

В липидных фракциях биомассы гриба были выявлены следующие жирные кислоты: миристиновая (14:0), пальмитиновая (16:0), стеариновая (18:0), олеиновая

(18:ln9), линолевая (18:2пб), у-линоленовая кислота (18:3п6), дигомо-у-линоленовая (20:3п6) и АК (20:4п6). В следовых количествах обнаружены эйкозановая (20:0) и эйкозаеновая (20:1) кислоты.

О 10 20 30 40 50 60 70 80

Арахидоповая кислота, % (от суммы кислот)

5 10 15 Время, сут

»- необезжиреяная биомасса обезжиренная биомасса липиды

Условия реакции: ТТХ - 0,8 %; биомасса -100 мг/мл; 0,2 М боратный буфер (рН 8,0); температура - 25°С; время - 1 ч

Рисунок 10- Зависимость ТТХ-редуктазной активности мицелия М. alpina от содержания арахидоновой кислоты в липидах

Рисунок 11 - Динамика роста гриба М. alpina при культивировании на овсяной среде с глицерином и сульфатом цинка

На основании полученных результатов и литературных данных по биосинтезу ПНЖК в грибах Mortierella alpina образование АК из миристиновой кислоты с участием специфических ферментов, осуществляющих элогацию (EL) и десатурацию (D) кислот, можно представить следующей гипотетической схемой:

tEL |ю

|вб

Исследование динамики содержания фракций С20 и С14-С18 ЖК в липидах гриба М. alpina показало, что в стационарной фазе роста значительно увеличивается суммарный уровень С20 ЖК (рисунок 12). В то же время содержание С14 - С18 ЖК напротив уменьшается. Это указывает на то, что специфические стадии синтеза С20

кислот наиболее активно протекают в период 8-18-ти суток.

Возрас] мицелии, сут

IC20 »C14-CI8

Рисунок 12 — Динамика содержания фракций С20 ¡i С14-С18 жирных кислот в лилидах гриба Mortierella alpina

Рисунок 13 - Жирнокислотный профиль 8-суточного мицелия гриба Mortierella alpina

Обнаружено, что липидная фракция 8-суточного мицелия почти на 55 % обогащена насыщенными кислотами, а также содержит более 35 % С18 ненасыщенных жирных кислот (рисунок 13). Напротив, уровень практически важных кислот, таких как дигомо-у-линоленовая (20:3пб) и АК (20:4пб), в этот период составляет около 5 %, хотя непосредственные полиненасыщенные предшественники этих кислот (18:2пб и 18:3пб) присутствуют в значительных количествах 10 - 17 %. Ото указывает на то, что в 8-суточном мицелии гриба может быть лимитирована стадия элонгации 18:3пб в 20:3п6.

В пользу такого предположения свидетельствуют также данные но изменению содержания лннолеиой и у-линоле новой кислоты (18:2п6 и 18:3п6), уровень которых начинает' быстро снижаться в период интенсивного синтеза С20 жирных кислот (рисунок 14).

Обращает на себя внимание и тот факт, что содержание пальмитиновой кислоты (рисунок 15) в лшидах гриба М. alpina значительно превышает уровень стеариновой кислоты (рисунок 16), которая, как известно, образуется у аналогичных штаммов путем элонгации первого соединения. Это указывает на возможность лимитирования не только элошазы, отвечающей за синтез дигомо-у-линоленовой кислоты, но и других элонгаз в 8-суточном мицелии.

Активацией стадии, удлиняющей скелет пальмитиновой кислоты, можно объяснить и временное возрастание содержания стеариновой и олеиновой кислот в липидной фракции 10-еуточного мицелия на фоне резкого падения уровня С16 кислоты (рисунок 15) и интенсивного синтеза С20 кислот (рисунок 17). Дальнейшее снижение стеариновой и олеиновой кислот, вероятно, обусловлено их быстрой трансформацией в С20 кислоты.

-18:2 -18:3

5 10 15 20 25 Время, сут

Рисунок 14 - Динамика содержания линолевой и у-линоленовой кислот в липидах гриба M.alpina

-18:0 -18:1

10 15 20 Время, сут

-14:00 -16:00

10 15 20 Время, сут

Рисунок 15 - Изменение уровня миристиновой и пальмитиновой кислот в липидах гриба М alpina

-20:3 -20:4 -20:0

10 15 20 25 Время, сут

Рисунок 16 - Изменение уровня стеариновой и олеиновой кислот в липидах М. alpina

Рисунок 17 - Динамика синтеза С20 -жирных кислот М. alpina

Анализ динамики накопления дигомо-у-линоленовой кислоты исследуемым исходным штаммом М alpina показал, что при твердофазном культивировании на овсяной среде при температуре 20 - 25°С синтезируются липиды с низким содержанием (около 6 %) этого практически важного продукта (рисунок 17). Лимитирование стадии элонгации является только одной из причин низкого выхода дигомо-у-линоленовой кислоты. Более важной причиной является быстрая конверсия этого соединения в АК, которая, как известно, осуществляется Д5-десатуразой грибов.

Следует отметить, что содержание АК в липидах к 23-м суткам несколько снижается по сравнению с максимальным значением, так как на фоне монотонного роста выхода липидов (см. рисунок И) выход АК остается на прежнем максимальном уровне (рисунок 18).

Это позволяет предположить, что в этот период липидная фракция обогащается за счет продолжающегося синтеза других кислот. В пользу такого предположения свидетельствует значительное увеличение в конце культивирования содержания линолевой и у-линоленовой кислот в липидах гриба М alpina, вероятно, из-за снижения активности элонгазы (см. рисунок 14).

Таким образом, полученные данные показывают, что на подобранной среде

наибольший выход АК (15,3 г/кг) достигается уже на 18-е сутки культивирования гриба.

4 Поиск условий синтеза эйкозапентаеновой кислоты грибом Moríierella alpina

Эйкозапентаеновая кислота (ЭПК) используется при лечении сердечнососудистых заболеваний и болезней, связанных с агрегацией тромбоцитов, кровяным давлением, и ее получение с помощью грибов М. alpina может представлять практический интерес.

4.1 Двухстадийный синтез при разных температурах

Известно, что грибы М. alpina при культивировании на средах с глюкозой способны синтезировать ЭПК при низкой температуре (ниже 10°С), что связано с активацией в этих условиях ю3-десатуразы, дегидрирующей АК. Исследуемый гриб в этих условиях также синтезировал ЭПК, но рос очень медленно.

В связи с этим был исследован синтез ПНЖК при двухстадийном культивировании гриба при разных температурах. Для обеспечения активного роста грибы сначала в течение 8-ми суток выращивали при температуре 25"С, обеспечивающей высокую скорость накопления биомассы, после чего температу ру снижали до 10°С и инкубировали в течение еще 15-ти суток для обеспечения условий биосинтеза ЭПК.

Уровень ТТХ-редуктазной активности мицелия (рисунок 19) в ходе эксперимента указывает на снижение активности Д5-десатуразы, отвечающей за синтез АК.

10 20 Время, сут

Рисунок 18 - Динамика накопления АК грибом М. alpina

9 11 12 13 14 15 16 18 19 :!0 Время, сутки

—•— 25 град Цельсия А 10 град Цельсия

Условия реакции: ТТХ - 0,8 %; биомасса -100 мг/мл, 0,2 М боратный буфер (рН 8,0); температура - 25°С; время -1ч

Рисунок 19 - Динамика ТТХ-редуктазной активности мицелия гриба, выращенного! на овсяной среде при различных температурах

В результате исследования состава липидов 20-суточного мицелия было установлено, что действительно уровень АК был пониженным (не превышал 30 %). Однако ЭПК не обнаруживалась.

4.2 Синтез в условиях повышенной солености

Одним из подходов к интенсификации синтеза ПНЖК может служить культивирование продуцента при повышенной солености среды. Однако было обнаружено, что хлорид натрия уже в концентрации 1 % подавляет рост гриба на 15 %, а при 3 % почти ингибирует развитие грибного мицелия. В связи с этим был осуществлен поиск способов повышения устойчивости гриба к высоким концентрациям хлорида натрия. В результате облучения суспензии спор гриба была получена галорезистентная культура, способная расти на ОС с глицерином (1%) и хлоридом натрия (5 %). При этом было обнаружено, что галорезистентный гриб характеризуются пониженной ТТХ-редуктазной активностью (рисунок 20) по сравнению с исходным штаммом при росте на ОС с различными добавками.

Анализ состава липидов 23-суточного мицелия гриба ХН-1 показал, что в них преобладают ненасыщенные жирные кислоты, среди которых присутствуют в значительных количествах АК и ЭПК (рисунок 21). Выход ЭПК в данных условиях составил 0,95 г/кг среды.

10 11 12 13 14 16 17 18 19 20 22 23 время, сутки

Условия реакции: ТТХ - 0,8 %; биомасса -100 мг/мл; 0,2 М боратный буфер (рН 8,0); температура -25°С; время -1ч

Рисунок 20 - ТТХ-редуктазная активность мицелия мутанта гриба М. alpina (ХН1)

Рисунок 21 - Жирнокислотный состав 23-суточного мицелия гриба М. alpina (ХН1)

Таким образом, показана принципиальная возможность биосинтеза ЭПК с помощью полученного галорезистентного гриба М. alpina (ХН1) на овсяной среде в присутствии глицерина и хлористого натрия.

4.3 Трансформация льняного масла в эйкозапентаеновую кислоту

Альтернативным подходом к получению ЭПК с помощью грибов М. alpina может служить биотрансформация а-линоленовой кислоты (18:ЗпЗ) - струюурного предшественника целевого продукта, под действием ферментов, участвующих в синтезе АК.

В настоящем исследовании проведена трансформация льняного масла, содержащего в своем составе а-линоленовую кислоту, с помощью изучаемого гриба М. alpina. Льняное масло вносили в ростовую среду (овсяная среда с 1% глицерина) на 10-ые сутки культивирования, когда наиболее активно осуществлялся синтез АК. Трансформацию заканчивали на 23-и сутки и выделяли липиды из мицелия после предварительной промывки его от остатков не поглощенного льняного масла.

В результате исследования жирно-кислотного состава полученных липидов было установлено, что в них превалируют С20 полиненасыщенные жирные кислоты (эйкозатриеновая, АК и ЭПК) (рисунок 22).

Í 1

i & n w

a

к ^

s

60 50 40

зон 20 10 0

5IL21

o,:_0,31'191,6.70,072¿6''¿|9

<s n ^r

I

Рисунок 22 - Жирнокислотный профиль 23-х суточного мицелия гриба Mortierella alpina при трансформации льняного масла

Выход ЭПК в данных условиях составил 1,48 г/кг среды.

Таким образом, показана альтернативная возможность получения ЭПК с помощью исследуемого гриба М. alpina путем трансформации льняного масла.

5 Принципиальная схема получения ПНЖК

С целью разработки принципиальной схемы получения ПНЖК были проведены эксперимешы, ставящие своей целью повысить эффективность выделения липидов из биомассы 1риба М. alpina.

5.1 Различные способы выделения целевого продукта

На первом этапе была произведена сравнительная оценка полноты извлечения липидов из обработанной различными методами биомассы. Лучшие результаты по выходу липидов получены при их экстракции из биомассы после ее замораживания и высушивания. Далее исследовали выход липидов при использовании для экстракции разных растворителей. Наиболее эффективное извлечение липидов (до 63% от АСВ) достигалось при применении гексана. При использовании в качестве экстрагентов этанола и бинарной смеси этанола с гексаном (3:2), а также смесей хлороформ-этанол (1:2), хлороформ-метанол (1:2) выход липидов колебался от 59 до 62%. При использовании системы гексан-изопропанол (3:2) выход липидов составлял 50%.

Таким образом, наиболее эффективно липиды извлекаются при экстракции замороженной, а затем высушенной биомассы гексаном.

5.2 Принципиальная технологическая схема получения арахидоновой кислоты

культивированием гриба Mortierella alpina на плотной овсяной среде

Предложена принципиальная технологическая схема получения /УС твердофазным культивированием гриба М. alpina на овсяной среде (рисунок 23). Синтез ПНЖК осуществляется в процессе культивирования продуцента Mortierella alpina на овсяной среде с глицерином и сульфатом цинка в течение 18-та суток в стерильных условиях (1). Экстракция ЖК проводится путем прямого омыления влажной биомассы КОН в этаноле (2).

Далее осуществляется фильтрация смеси для отделения остатков биомассы с целью предотвращения образования эмульсии (3). Перед экстракцией неомыляемого остатка гексаном (5), для смещения равновесия в сторону гексана, в смесь добавляется вода (4). Гексан регенерируется и многократно используется в процессе. Этанольный раствор мыл подкисляется НС1, и ЖК в свободном состоянии экстрагируются гексаном (6). Этанол регенерируется и многократно используется. Раствор ЖК в гексане концентрируется путем испарения гексана под вакуумом (7). ЖК добавляются к горячему насыщенному раствору мочевины в метаноле (ЖК:мочевина 1:4) (9), после чего происходит кристаллизация мочевины (10). Кристаллы отделяются на фильтре (11), а метанольный раствор ПНЖК упаривается под вакуумом (12). ПНЖК экстрагируются гексаном (13), а метанол регенерируется и многократно используется в процессе (14).

Смесь ПНЖК разделяется методом ВЭЖХ (элюэнт - подкисленный уксусной кислотой (1%) метанол: вода-80:20-\улу) (15). Фракции, содержащие АК (17) и остальные ПНЖК (16), упариваются под вакуумом. АК подвергается очистке от остатков элюэнта путем экстракции гексаном (18) Готовый продукт хранится в виде ампулированного гексанового раствора (19).

1 - ферментер поверхностного культивирования; 2 - аппарат для омыления биомассы; 3,11 - фильтр-пресс; 4, 6,13,18-экстрактор; 5,7, 8,12,14,16,17 - вакуумный дисстилятор; 10 - кристаллизатор; 15 - колонка ВЭЖХ; 19 - упаковочный аппарат

Рисунок 23 - Принципиальная схема получения АК с помощью М alpina

6 Исследование биологической активности препаратов ПНЖК

В настоящей работе исследовали влияние метиловых эфиров ПНЖК, полученных на основе липидов, выделенных из мицелия гриба М alpina на проращивание семян сельскохозяйственных культур. В эксперименте использовали препараты в концентрации 1*10'6-1*10"3 г/л.

В случае семян редиса обработка любым из препаратов в концентрации от 10'6 до 10"3 г/л увеличивала процент проросших семян (энергия прорастания) с 82% в контроле до 90-92%. Наибольший прирост массы семян редиса в первые 3 дня проращивания обеспечивают препараты концентрации Ю'МО"4 г/л. Масса семян в этих случаях увеличивается на 57-72% по сравнению с контролем.

В случае семян пшеницы обработка препаратами АК в концентрации от 10"6 -10'3 г/л также увеличивала процент проросших семян с 60% в контроле до 80-82%.

Наибольший прирост массы семян пшеницы в первые 6 дней проращивания обеспечивают препараты концентрации 10"3-10"" г/л. Масса семян в этих случаях увеличивается на 15-20% по сравнению с контролем. В опыте с семенами пшеницы было отмечено также отсутствие развития посторонней микрофлоры на обработанных семенах.

При обработке семян гороха количество проросших семян увеличивается с 60% в контроле до 81-84% . Наибольший прирост средней массы семян в первые три дня проращивания обеспечивают препараты в концентрациях Ю'МО"5 г/л. Масса семян увеличивается на 15-27% по сравнению с контролем.

При обработке семян фасоли также наблюдается увеличение энергии проращивания и средней массы семян. Наибольшая эффективность воздействия отмечена при концентрации 10'4 и 10"' г/л липидов.

Обработка семян свеклы препаратами липидов в концентрации от 10"6 до 10"3 г/л увеличивала процент проросших семян с 40% в контроле до 53-59%. Наибольший прирост массы семян свеклы в первые 3 дня проращивания обеспечивают препараты при концентрации 10"4-10'3 г/л. Масса семян в этих случаях увеличивается на 22-24% по сравнению с контролем.

Обработка семян моркови препаратами липидов в концентрации от 10"6 до 10"3 г/л также увеличивала энергию прорастания на 20-23% и среднюю массу семян.

В случае семян капусты обработка препаратами при концентрации от 10'6 до 10"4 г/л увеличивала процент проросших семян с 82% в контроле до 90-92%. Наибольший прирост массы семян капусты в первые 3 дня проращивания обеспечивают препараты при концентрации 10"4-10"5 г/л. Масса семян в этих случаях увеличивается на 57-72% по сравнению с контролем.

При исследовании действия препарата на проращивание семян огурцов было установлено, что прирост массы семян в первые 3 дня проращивания увеличивается незначительно по сравнению с контролем, но процент проросших семян увеличился с 60% в контроле до 71-80%.

Таким образом, препараты, содержащие низкие концентрации липидов (10'6-10'3 г/л) могут быть использованы для ускорения проращивания семян различных сельскохозяйственных культур.

Выводы

1 Подобрана питательная среда (овсяная среда с 1% глицерина и 0,01% сульфата цинка), обеспечивающая при культивировании гриба М. alpina (18-1) в течение 18-ти суток выход арахидоновой кислоты 15,3 г/кг среды.

2 Исследована динамика накопления арахидоновой кислоты в процессе роста Mortierella alpina (18-1) на подобранной среде, идентифицированы промежуточные метаболиты (пальмитиновая, стеариновая, олеиновая, линолевая, у-линоленовая и дигомо-у-линоленовая кислоты) на пути превращения миристиновой кислоты в арахидоновую.

3 Выявлена положительная линейная корреляция зависимости ТТХ-редуктазой активности мицелия гриба Mortierella alpina (18-1) от содержания арахидоновой кислоты в липидах при выращивании его на овсяных средах с различными добавками. Предложен метод экспресс-контроля синтеза арахидоновой кислоты исследуемым грибом in vivo

4 Установлены зависимости ТТХ-редуктазной активности мицелия гриба от рН, температуры и возраста мицелия гриба.

5 Показана принципиальная возможность получения эйкозапентаеновой кислоты с помощью галорезистентного гриба М alpina (ХН1) с выходом 0,95 г/кг среды при выращивании на овсяной среде с глицерином (1%) и хлоридом натрия (5%).

6 Показана принципиальная возможность получения эйкозапентаеновой кислоты с выходом 1,48 г/кг среды при трансформации льняного масла мицелием гриба М. alpina (18-1).

7 На основе проведенных исследований предложена принципиальная технологическая схема производства арахидоновой кислоты с использованием штамма М. alpina (18-1) культивированием на плотной овсяной среде.

8 Установлено ростстимулирующие воздействие растворов метиловых эфиров полиненасыщенных жирных кислот (10"6-10'5 г/л) на проращивание семян различных сельскохозяйственных культур (редис, морковь, пшеница, горох, свекла, капуста, огурец, фасоль).

Содержание работы опубликовано в 9 научных трудах, из которых №1-2 включены в перечень ведущих рецензируемых научных журналов н изданий, выпускаемых в Российской Федерации в соответствии с требованиями ВАК Минобразования и науки РФ

1 Рахматуллина Ю.Р., Петухова Н.И., Зорин В.В. Влияние цитрата натрия и глицерина на рост гриба Mortierella alpina 18-1 - продуцента арахидоновой кислоты при твердофазном культивировании на растительных субстратах // Башкирский химический журнал.-2005.-Т.12, №1.-С.49-52.

2 Петухова Н. И., Рахматуллина Ю. Р., Яхутова Я. Р. и др. Исследование корреляции ТТХ-редуктазной активности с содержанием арахидоновой кислоты в липидах гриба Mortierella alpina 18-1/ Н. И. Петухова, Ю. Р. Рахматуллина, Я. Р.

Яхутова, B.B. Зорин // Башкирский химический журнал. - 2006. - Т. 13, № 1. - С. 9597.

3 Казанцева A.B., Рахматуллина Ю.Р., Петухова Н.И. и др. Исследование росга гриба Mortierella alpina 18-1 на различных твердых питательных средах/А.В. Казанцева, Ю.Р. Рахматуллина, Н.И.Петухова, В.В. Зорин // Материалы 55-й научно-технической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых. - Уфа, 2004. -С.396.

4 Авдеева Е.В., Рахматуллина Ю.Р., Петухова Н.И. и др. Влияние растительных масел и олеиновой кислоты на рост гриба Mortierella alpina 18-1- продуцент арахидоновой кислоты /Е.В. Авдеева, Ю.Р. Рахматуллина, Н.ИЛетухова, В.В. Зорин // Материалы 56-й научно-технической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых. - Уфа, 2005. -С. 175.

5 Рахматуллина Ю.Р., Авдеева Е.Г., Петухова Н.И. и др. Исследование влияния концентрации цитрата натрия на рост и активность гриба Mortierella alpina 18-1/ Ю.Р. Рахматуллина, Е.Г. Авдеева, Н.И. Петухова, В.В. Зорин // Химия и медицина: материалы II Всерос. науч. конф.- Уфа, 2005.- С.129-131.

6 Рахматуллина Ю.Р., Петухова Н.И., Зорин В.В. Исследование влияния низких концентраций арахидоновой кислоты на всхожесть семян // Интеграция высшей науки в области био- и органической химии и механики многофазных систем: материалы III Всероссийской научной INTERNET-конференции 15-31 декабря 200:5.-Уфа: Реактив, 2005. - С.ЗЗ.

7 Рахматуллина Ю. Р., Яхутова Я.Р., Петухова Н.И. и др. Исследование влияния добавок растительных масел и олеата натрия на рост и ТТХ-редуктазную активность гриба Mortierella alpina 18-1 / Ю. Р. Рахматуллина, Я.Р. Яхутова, Н.И. Петухова, В.В. Зорин // Успехи интеграции академической и вузовской науки по химическим специальностям: Материалы республ. науч.-пракг. конф., 18-19 февр. 2006 г. - Уфа, 2006. - С.153-158.

8 Рахматуллина Ю.Р., Яхутова Я.Р., Петухова Н.И. и др. Исследование роста гриба Mortierella alpina 18-1 на овсяной среде в присутствии углеводородов / Ю.Р. Рахматуллина, Я.Р. Яхутова, Н.И. Петухова, В.В. Зорин // Интеграция высшей науки в области био- и органической химии и механики многофазных систем: материалы IV Всероссийской научной INTERNET-конференции, 15-25 декабря 2005.- Уфа: Реактив, 2006. - С.103-104.

9 Пантелеева С.Н., Рахматуллина Ю.Р., Петухова Н.И. и др. Исследование влияния способа обработки биомассы и систем растворителей на выход липидов из мицелия гриба Mortierella alpina 18-1/ С.Н. Пантелеева, Ю.Р. Рахматуллина, Н.И. Петухова, В.В. Зорин // Материалы 57 научно-технической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых УГНТУ. - Уфа: УГНТУ, 2005. - С. 18.

Подписано в печать 22.0-1.0? . Бумага офсетная. Формат 60x84 1/16. Гарнитура «Тайме». Печать трафаретная. Усл. печ. л. 1. Тираж 90. Заказ 27.

Типография Уфимского государственного нефтяного технического университета

Адрес типографии. 450062, Республика Башкортостан, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1.

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Рахматуллина, Юлия Рашитовна

ВВЕДЕНИЕ.

1 Литературный обзор.

1.1 Строение, номенклатура и распространение полиненасыщенных жирных кислот.

1.2 Биологические функции и области применения арахидоновой кислоты.

1.3 Источники получения арахидоновой кислоты.

1.3.1 Альтернативные источники получения арахидоновой кислоты

1.3.2 Скрининг продуцентов арахидоновой кислоты.

1.3.3 Биосинтез полиненасыщенных жирных кислот и основы его регуляции у микроорганизмов.

1.3.4 Промышленное производство арахидоновой кислоты.

1.4 Производство арахидоновой кислоты с помощью Mortierella alpina

1.4.1 Глубинное культивирование.

1.4.2 Поверхностное культивирование.

1.5 Генетическая модификация продуцентов ПНЖК и их использование для получения ценных продуктов путем трансформации экзогенных липидов.

1.6 Выделение и очистка.

1.6.1 Методы разделения полиненасыщенных жирных кислот.

1.6.2 Экстракция липидов и/или жирных кислот.

1.6.3 Концентрирование полиненасыщенных жирных кислот и их разделение.

1.6.4 Другие потенциально полезные методы концентрирования и очистки полиненасыщенных жирных кислот.5S

2. Объекты, материалы и методы исследования.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Материалы исследования.

2.3. Методы исследования.

2.3.1 Хранение микроорганизма.

2.3.2 Изучение влияний условий культивирования на биосинтез арахидоновой кислоты у выбранного штамма.

2.3.3 Определение ТТХ-редуктазной активности.

2.3.3.1 Определение ТТХ-редуктазной активности в стандартных условиях.

2.3.3.2 Исследование ТТХ-редуктазной активности.

2.3.3.2.1 Исследование зависимости ТТХ-редуктазной активности от времени.

2.3.3.2.2 Исследование зависимости ТТХ-редуктазной активности от температуры.

2.3.3.2.3 Исследование зависимости ТТХ-редуктазной активности от рН

2.3.3.2.4 Исследование зависимости ТТХ-редуктазной активности от концентрации ингибитора.

2.3.4. Выделение продуктов биосинтеза.

2.3.5. Идентификация продуктов биосинтеза и трансформации.

2.3.5.1 Тонкослойная хроматография.

2.3.5.2 Хроматомасс-спектрометрия.

2.3.6 Исследование влияния низких концентраций метиловых эфиров ПНЖК на всхожесть семян.

2.3.7 Математическая обработка результатов опытов.

3 Результаты и обсуждение.

3.1 Исследование влияние состава среды на рост и липидообразование гриба при поверхностном культивировании.

3.1.1 Поиск основного твердого субстрата.

3.1.2. Поиск добавок к овсяной среде.

3.1.2.1 Влияние углеводородов.

3.1.2.2 Влияние растительных масел и олеата натрия.

3.1.2.3 Влияние глюкозы и глицерина.

3.1.2.4 Влияние цитрата натрия.

2+ 2+

3.1.2.5 Влияние ионов Zn и Mg'T.

3.2 Корреляция ТТХ-редуктазной активности мицелия с содержанием арахидоновой кислоты в липидах при росте гриба на овсяной среде с глицерином и сульфатом цинка.

3.2.1 Влияние условий на восстановление ТТХ 7- и 18-суточными мицелиями гриба.

3.2.2 Корреляция ТТХ-редуктазной активности и содержания арахидоновой кислоты в липидах 18 - 23-ти суточных мицелиев, полученных на овсяных средах с различными добавками.

3.3 Исследование динамики роста и состава липидов на перспективной среде.

3.4 Исследование синтеза эйкозапентаеновой кислоты грибом Mortierella alpina.

3.4.1 Двухстадийный синтез при разных температурах.

3. 4.2 Синтез в условиях повышенной солености.

3.4.3 Трансформация льняного масла в эйкозапентаеновую кислоту

3.5 Принципиальная схема получения ПНЖК.

3.5.1 Различные способы выделения целевого продукта.

3.5.2 Принципиальная технологическая схема получения арахидоновой кислоты культивированием гриба Mortierella alpina на плотной овсяной среде.

3.6 Исследование биологической активности препаратов ПНЖК.

3.6.1 Проращивание семян редиса.

3.6.2 Проращивание семян пшеницы.

3.6.3 Проращивание семян гороха.

3.6.4 Проращивание семян фасоли.

3.6.5 Проращивание семян свеклы.

3.6.6 Проращивание семян моркови.

3.6.7 Проращивание семян капусты.

3.6.8 Проращивание семян огурцов.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка метода получения полиненасыщенных жирных кислот"

Актуальность работы. Полиненасыщенные жирные кислоты представляют собой уникальный класс органических веществ, играющих важную роль в биологических системах. Исследования последних четырех десятилетий вскрыли широкий спектр их функций в живых организмах. ПНЖК подвергаются биотрансформации липоксигеназами или циклооксигеназами, что приводит к образованию многочисленных низкомолекулярных регуляторов процессов, протекающих в клетках, тканях и организме в целом. Одной из самых важных ПНЖК является АК, которая выступает в роли непосредственного предшественника серии простагландинов, лейкотриенов и тромбоксанов. Основными областями применения АК являются: фармакология (предшественник различных лекарственных и профилактических препаратов применяемых при заболеваниях сердечно-сосудистой системы, печени и др.); косметическая промышленность (средства по уходу за кожей); пищевая промышленность (обогащение различных продуктов питания, в том числе искусственных детских молочных смесей и др.); сельское хозяйство (высокоэффективный стимулятор роста и защитных реакций растений) и др. В настоящее время основным источником получения АК являются липидные экстракты из печени свиньи и других органов животных, что делает их крупномасштабное производство неэффективным (содержание АК оставляет не более 0,2% в пересчете на сухую массу). В течение последних двадцати лет значительные успехи были достигнуты в области биотехнологического получения АК с помощью низших грибов и морских водорослей, которые в ряде случаев позволили осуществить ее промышленное производство. Однако существующие на сегодняшний день биотехнологии получения АК далеки от совершенства, поскольку ее выход в лабораторных условиях в лучших случаях составляет 13 г/л (Япония), а в среднем у различных исследователей около 6-10 г/л (Россия, США, Польша и др.). В связи с этим создание эффективных отечественных биотехнологий получения АК и других ПНЖК является актуальной задачей.

Цель работы. Разработка эффективного метода получения ПНЖК на основе гриба Mortierella alpina (18-1) и исследование направлений их практического использования.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: поиск и подбор компонентов питательной среды для эффективного культивирования гриба; исследование динамики накопления биомассы, АК и других ПНЖК на подобранной среде; поиск экспресс-метода контроля за биосинтезом АК in vivo; поиск условий биосинтеза других ценных ПНЖК; обоснование принципиальной технологической схемы получения ПНЖК в оптимальных условиях; исследование рострегулирующей активности ПНЖК.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с Федеральной целевой программой «Государственная поддержка интеграции высшего образования и фундаментальной науки в 2002-2006 гг.» (2004-2006 гг., госконтракт № 02.438.11.7003), с региональной программой РФФИ "Агидель" (2005г.), планами научно-исследовательских работ Уфимского государственного нефтяного технического университета (2003-2006 гг.), ведомственной научной программой "Развитие научного потенциала высшей школы" (проект «Научно-образовательная деятельность музея, созданного на базе кафедры биохимии и технологии микробиологических производств Уфимского государственного нефтяного технического университета», 2005-2006 гг.).

Научная новизна. Разработан метод экспресс-анализа содержания арахидоновой кислоты в мицелии гриба Mortierella alpina (18-1) в процессе культивирования на плотной овсяной среде. Найдены условия, позволяющие эффективно осуществлять биосинтез ПНЖК. В этих условиях исследована динамика состава ПНЖК в процессе культивирования. Научно обоснована принципиальная технологическая схема производства ПНЖК с помощью гриба М. alpina (18-1) на плотной овсяной среде. Показана принципиальная возможность получения практически ценной эйкозапентаеновой кислоты на основе изученного штамма М. alpina.

Практическая значимость. Разработан метод получения ПНЖК с помощью гриба М. alpina на твердой овсяной среде с выходом АК 15,3 г/кг среды. Результаты научных исследований легли в основу создания новых лабораторных работ и используются в учебном процессе при подготовке инженеров по специальности 240901 «Биотехнология» в УГНТУ.

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на 55, 56, 57-й научно-технических конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых УГНТУ (2004-2006), V

Всероссийском научном семинаре и Молодежной научной школе «Химия и медицина» (Уфа, 2005), III Всероссийской научной INTERNET-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и механики многофазных систем» (Уфа, 15-31 декабря 2005), IV, V Всероссийских научных INTERNET-конференциях «Интеграция науки и высшего образования в области био-и органической химии и биотехнологии» (Уфа, 2005- 2006).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 2 статьи и материалы докладов 7 конференций.

Структура и объем работы: Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов, материалов и методов исследования (глава 2), обсуждения результатов (глава 3), выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Работа изложена на 161 страницах машинописного текста, содержит 61 рисунок и 12 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Рахматуллина, Юлия Рашитовна

Заключение

Увеличение спроса на АК а также другие ПНЖК привело к разрыву между современным уровнем их производства из традиционных источников (растения, рыбы, млекопитающие) и потребностью в них рынка. Подобная ситуация стимулировала поиск альтернативных источников их получения, таких как водоросли, грибы и бактерии.

Наиболее перспективным источником АК в настоящее время являются грибы рода Mortierella. Однако, несмотря на значительные успехи в области получения АК с помощью различных штаммов Mortierella alpina приведшие в ряде случаев к промышленному их использованию, ненасыщенность рынка этим продуктом обусловлена его стоимостью. Поэтому весьма актуальным является поиск способов понижения стоимости липидов содержащих АК получаемых биотехнологическими путем и популяризация продуктов обогащенных ею. Основными направлениями в этой области являются: поиск новых штаммов продуцентов и создание мутантов на основе уже имеющихся синтетиков АК, поиск дешевых субстратов и оптимизация условий культивирования найденных продуцентов, поиск активаторов и ингибиторов десатураз, сокращение этапов и совершенствование методов выделения и концентрирования микробных липидов, содержащих АК.

Настоящая работа была направлена на поиск условий эффективного культивирования низшего фикомицета Mortierella alpina (18-1) на плотной питательной среде с целью повышения выхода арахидоновой кислоты. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: поиск и подбор компонентов питательной среды для эффективного культивирования гриба; исследование динамики накопления биомассы, АК и других ПНЖК на подобранной среде; поиск экспресс-метода контроля за биосинтезом АК in vivo; поиск условий биосинтеза других ценных ПНЖК; обоснование принципиальной технологической схемы получения ПНЖК в оптимальных условиях; исследование рострегулирующей активности ПНЖК.

2. Объекты, материалы и методы исследования

В данном разделе рассмотрены основные объекты, материалы и методы, а также физико-химические и спектральные характеристики (масс спектры) соединений используемых или полученных в ходе выполнения экспериментальных исследований. Приведены результаты математической оценки качества проведенных экспериментов.

2.1. Объекты исследования

Объектом исследования служил гриб Mortierella alpina (18-1) из коллекции микроорганизмов кафедры биохимии и технологии микробиологических производств УГНТУ.

Основные признаки данного штамма представлены в таблице 2.1.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Рахматуллина, Юлия Рашитовна, Уфа

1. Бартон Д.Н. Общая органическая химия Т.П. М.: Химия. 1986.- 736 с.

2. Ratledge С. Single cell oils—have they a biotechnological future? // Trends Biotechnol. 1993. - Vol. 11. - P. 278-284

3. Shimizu S., Shinmen Y., Kawashima H. Production of C-20 polyunsaturated fatty acids by fungi// Proceeding of World Conference on Biotechnology for the Fats and Oils Industry. 1987. - AOCS, Champaign, IL. -P. 1000-1006

4. Gunstone F. D., Harwood J. L., Padley F. B. Occurrence and characteristics of oils and fats// The Lipid Handbook (Editors, F D Gunstone, J L Harwood and F В Padley), Chapman and Hall, London. 1994. - P. 47-223

5. Westhuizen J.P.J., Kock J.L.F., Botha A. The distribution of the w3 and w6 series of cellular long - chain fatty acids in fungi// Systematic and Appl. Microbiol. - 1994. - Vol. 17. - P. 327-345

6. Ahlgren G., Gustafsson I. В., Boberg M. Fatty acid content and chemical composition of freshwater microalgae// J. Phycol. 1992. - Vol. 28.- P.37-50

7. Dunstan G. A., Volkman J. K., Jeffrey S. W. Biochemical composition of microalgae from the green algal classes Chlorophyceae and Prasinophyceae. 2. Lipid classes and fatty acids// J. Exp. Marine Biol. Ecol. -1992.-Vol. 161.-P.115- 134

8. Blomquist G. J., Borgeson С. E., Vundla M. Polyunsaturated fatty acids and eicosanoids in insects// Insect Biochem. 1991. - Vol. 21. - P.99 - 106

9. Allman M. A. Plant sources of n-З fatty acids// J. Food. 1995. -Aust., Vol. 47. -P.14-I7.

10. Yongmanitchai W., Ward 0. P. Omega-3 fatty acids: Alternative sources of production// Proc. Biochem. 1989. - Vol. 9. - P. 117 — 125

11. Ratledge C. Technological Advances in Improved and Alternative Sources of Lipids (Kamel B. S. and Kakuda Y. eds) // Blackie Acad. 1994. - P. 235-291

12. Botha A., Paul I., Roux С. e t.s. An isolation procedure for arachidonic acid producing Mortierella species // Kluwer Acad. Publ. 1999. -Antonie van Leeuwenhoek. - Vol. 75. - P. 253-256

13. Панькина И. О., Конова И. В. Жирные кислоты фитофторовых грибов при их росте на различных средах// Микробиол. 1996. - Т.65, №2. -С.177-181

14. Zittelli С. G., Lavista F., Bastianini A., Rodolfi L Production of eicosapentaenoic acid by Nannochloropsis sp. Cultures on outdoor tubular photobioreactors // J. Biotechnol. 1999. -Vol. 70. - P. 299-312

15. German J.B., Dillard C.J., Whelan J. Symposium: Biological Effects of Dietary Arachidonic Acid—Introduction//). Nutr. 1996. - Vol. 126. - P. 1076-1080

16. Варфоломеев, С. Д. Простагландины- молекулярные биорегуляторы / С. Д. Варфоломеев, А. Т. Мевх; ред. И. В. Березин. М.: Изд-во МГУ. - 1985. - 307 с.

17. Гуннько В., Андреева С. Биологически активные вещества в косметических средствах по уходу за кожей лица // Провизор. 2002. - №12. - С.65-72

18. Кульнев А.И., Соколова Е. А. Многоцелевые стимуляторы защитных реакций, роста и развития растений. Пущино // ОНТИ ПНЦ РАН.- 1997.- 100 с.

19. Eroshin V. К., Dedyukhina E. G. Effect of lipids from Mortierella hygrophila on plant resistance to phytopathogens // World J. of Microbiol. & Biotechnol. 2002. - Vol. 18. - P. 165-167

20. Devane W. A., Hanus L. A., Breuer R. G. Isolation and structure of a brain constituent that binds to the cannabinoid receptor // Science. 1992. -№258.-P. 1946-1949

21. Stella N., Schweitzer P., D. Piomelli. A second endogenous cannabinoid that modulates long-term potential // Nature. 1997. - № 388. - P. 773-778

22. Carlson S. E., Werkman S. H., Peeples J. M. Arachidonic acid status correlates with first year growth in preterm infants // Proc. Natl. Acad. Sci. 1993. -№90.-P. 1073-1077

23. O'Conner D. L., Hall R., Adamkin D. Growth and development in preterm infants fed long-chain polyunsaturated fatty acids: A prospective, randomized controlled trial // Pediatrics. 2001. - № 108. - P. 359-371

24. Birch E. E., Garfield S., Hoffman D. R. A randomized controlled trial of early dietary supply for long-chain polyunsaturated fatty acids and mental development in term infants // Develop. Med. Child Neurol. 2000. - № 42. - P. 174-181

25. Smith W. L., Borgeat P. Biochemistry of Lipids and Membranes147

26. Vance D. E and Vance J. E. // Benjamin Cummings, Redwood City, CA, USA. -1985.-P. 325-360

27. Grammatikos S.I, Subbaiah P.V., Victor T.A. e t.s. Diverse effects of essential (n-6 and n-3) fatty acids on cultured cells // Cytotechnology. 1994. -Vol. 15.-P. 31-50

28. Chow C.K. Fatty acids in meats and meat products. Fatty acids in foods and their health implications // New York: Marcel Dekker, Inc. 1992. - P. 65-93

29. Панькина О.И., Конова И.В. Рост зигомицетов и образование жирных кислот при культивировании на углеводородных субстратах // Микробиология. 1998. - Т.67. - № 6. - С.748-753

30. Владимиров В. А. Свободные радикалы и антиоксиданты // Вестник Рос. Академии мед. Наук. 1998 . - №7. - С. 43-51

31. Ерошин К., Дедюхина Э.Г., Чистякова Т.Н. и др. Исследование синтеза арахидоновой кислоты грибами рода Mortierella: микробиологический метод селекции продуцентов арахидоновой кислоты// Микробиол. 1996. - Т. 65, Вып. 1. - С. 31-36

32. Igbal G., Valivety R. Polyunsaturated fatty acids, part 1: Occurrence, biological activities and applications// Tibtech October. 1997. - Vol. 15. - P. 401-409

33. Bajpai P., Bajpai P.K., Arachidonic acid production by microorganisms // Biotechnol. Appl. Biochem. 1992. - Vol. 15. - P. 1-10

34. Shinmen Y., Shimizu S., Akimoto D. Production of arachidonic acid by Mortierella fungi. Selection of a potent producer and optimization of culture conditions for large-scale production // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1989. -Vol.31.-P. 11-16

35. Certik M., Sakuradani E., Shimizu S. Desaturase-defective fungalmutants: useful tools for the regulation and overproduction of polyunsaturated fatty acids // Tibtech December. 1998. - Vol. 16. - P.500-505

36. Eroshin V. K., Satroutdinov A. D., Dedyukhina E. G. e t.s. Arachidonic acid production by Mortierella alpina with grown-coupled lipid synthesis// Proc. Biochem. 2000. - Vol. 35. - P. 1171-1175

37. Streekstra H. On the safety of Mortierella alpina for the production of food ingredients, such as arachidonic acid// J. Biotechnology. 1997. - Vol. 56. -P. 153-165

38. Singh A., Ward O. P. Production of high yields of arachidonic in a fed-batch system by Mortierella alpina ATCC 32222 // Appl. Vicrob. Biotechnol. -1997.-Vol. 48.-P. 1-5

39. Jang H.-D., Lin Y.-Y., Yang S.-S. Polyunsaturated fatty acid production with Mortierella alpina by solid substrate fermentation // Bot. Bull. Acad. Sin. 2000. - №41. - P.41-48

40. Желифонова В. П., Зинченко Г. А., Белов А. П. и др. Исследование состава липидов Mortierella hygrophila продуцента арахидоновой кислоты // Прикл. биохим. и микробиол. - 1994. - Т. 30. -Вып. 4-5.-С. 610-616

41. Kamisaka Y.; Noda N., Sakai Т. e t.s. Lipid bodies and lipid body formation in an oleaginous fungus, Mortierella ramanniana var. angulisporal/ Biochim. Et. Biophys. Acta. 1998. - Vol. 1438. - P. 185-198

42. Eroshin V.K., Dedyukhina E.G., Chistyakova T.I., e t.s. Arachidonic-acid production by species of Mortierella II World J. Microbiol. Biotechnol. -1996.-Vol. 12.-P. 91-96

43. Totani N., Watanabe A., Oba K. An improved method of arachidonic acid production by Mortierella alpinall J. Jpn. Oil Chem. Soc. 1987. - Vol. 36. -328-331

44. Ward 0. Microbial production of long-chain PUFAs// INFORM. -Vol. 6.- 1995.-P. 683-688

45. Tadao Y., ed. Advances in Polyunsaturated Fatty// Acids Reserch. -1993. Vol. 1025. - International Congress Series, Excerpta Medica, Tokyo

46. Ohlrogge J. B. Design of new plant products: engineering of fatty acid metabolism // J. Plant Physiol. 1994. - Vol. 104. - P.821-826

47. Reddy A. S., Thomas T. L. Expression of a cyanobacterial delta6-desaturase gene results in gamma-linolenic acid production in transgenic plants// J. Nat. Biotechnol. 1996. - Vol. 14. - P. 639-642

48. Ratledge C. Biotechnology of oils and fats in industrial Applications of Single Cell Oils (Kyle D.J. and Ratledge C., eds) // American Oil Chemists Society, Champaign, IL, USA. 1992. - P. 1 - 15

49. Folch J., Lees M. and Stanley G. M. A simple method for the isolation and purifications of total lipids from animal tissues// J. Biol. Chem. 1957. - Vol. 226.-P. 497-509

50. Medina R. A., Gimenez G. A., Camacho G. F. Concentration and purification of stearidonic, eicosapentaenoic, and docosahexaenoic acids from cod liver oil and the marine microalga Jsochrysis galbana II J. Am. Oil Chem. Soc. -1995.-Vol. 72.-P. 575-583

51. Галанина JI. А., Соловьева H. JI., Конова И. В. Образование эйкозаполиеновых кислот Pythium debarianum при культивировании на различных средах// Микробиол. 1999. - Т. 68, №4. - С. 473^179

52. Napier J.A. Transgenic plants for the production of pharmaceutical fatty acids// Bundesgesundheitsbl Gesundheitsforsch - Gesundheitsschutz. -2000.-Vol. 43.-P. 99-103

53. Budziszewski G. J., Croft К. P. C., Hildebrand D. F. Uses of biotechnology in modifying plant lipids// J. Am. Oil Chem. Soc. 1996. - Vol.15031.-P. 557-569

54. Панькина И. О., Конова И. В. Липидные характеристики Phytophthora cryptogea I/ Микробиол. 1996. - Т.65, №2. - С.182-188

55. Gertik М., Berhan S., Sajbidor J. Lipid production and fatty acid composition of select strain belonging to Mucoralesll Acta Biotechnol. 1993. -Vol. 13.-P.193-196

56. Cohen Z., Didi S., Heimer Y. M. Overproduction of y-linolenic and eicosapentaenoic acids by algae// J. Plant Physiol. 1992. - Vol. 98. - P. 569-572

57. Kyle D., Behrens P., Bingham S. Biotechnology for the Fats and Oils Industry// American Oil Chemists' Society, Champaign, IL, USA. (Applewhite T. H., ed.).- 1988.-P. 117-121

58. Kyle D. J., Sicotte V. J. and Reeb S. E. Industrial Applications of Single Cell Oils// American Oil Chemists' Society, Champaign, IL, USA (Kyle D. J. and Ratledge C., eds). -1992. P. 287-300

59. Yazawa K., Watanabe K., Ishikawa C., Kondo K. and Kimura S. Industrial Applications of Single Cell Oils// American Oil Chemists' Society, Champaign, IL, USA (Kyle D. J. and Ratledge C., eds).- 1992. P. 29-51

60. Ratledge C. Biotechnology of oils and fats in Microbial Lipids// Academic Press (Ratledge C. and Wilkinson S. G., eds). 1992. - Vol. 2. - P. 567 -668

61. Certik M. and Shimizu S. Recent Research Developments in Oil Chemistry // Transworld Research Network, Trivandrum, India. (Pandalai, S. G., ed.)- 1998.-Vol. 2.-P. 89-103

62. Zhu M., Yu L.J., Liu Z., Xu H.B. // Letters in Applied Microbiology. -2004. V.39. - P.332-335

63. Shimizu S. and Jareonkitmongkol S. Biotechnology in Agriculture and Forestry // Springer-Verlag. 1995. - Vol. 33. - P. 308-325151

64. Napier J. A., Hey S. J., Lacey D. J. and Shewry P. R. Identification of a Caenorhabditis elegans D6 fatty acid desaturase by heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae II J. Biochem. 1998. - Vol. 330. - P. 611-614

65. Shimizu S., Akimoto K., Sugano M. and Yamada H. Essential Fatty Acids and Eicosanoids // AOCS Press, Champaign, USA (Sinclair, A. and Gibson, R.,eds).-1993.-P. 31-41

66. Botha A., Paul I., Roux С., Kock J. L. F., Coetzee D. J., Strauss T. and Maree C. An isolation procedure for arachidonic acid producing Mortierella species II Kluwer Acad. Publ. 1999. - Antonie van Leeuwenhoek. - Vol. 75. -P. 253-256

67. Hempenius R. A., Van-Delft J. M., Prinsen M., Lina B. A. Preliminary safety assessment of an arachidonic acid-enriched oil derived from Mortierella alpina: summary of toxicological data //Food Chem. Toxicol.-1997.-№ 35.-P. 573-581

68. Koskelo E. K., Boswell K., Carl L., Lanoue S., Kelly C., Kyle D. High levels of dietary arachidonic acid triglyceride exhibit no subchronic toxicity in rats // Lipids. -1997. № 32. - P.397-405

69. Streekstra H. On the safety of Mortierella alpina for the production of food ingredients, such as arachidonic acid // J. Biotechnol. 1997. - № 56. - P. 153-165

70. Burns R. A., Wibert G. J,. Diersen-Schade D. A, Kelly С. M. Evaluation of single-cell sources of docosahexaenoic acid and arachidonic acid: 3-month rat oral safety study with an in utero phase // Food Chem. Toxicol. 1999. -№37.-P. 23-36

71. Whitaker A., Long P. A. Fungal pelleting // Process Biochem. 1973. - № 8. - P. 27-31

72. Vardar F. Problems of mass transfer and momentum transfer in large152fermenters // Process Biochem. 1983. - № 18. - P. 21-23

73. Clark D. S. Submerged citric acid fermentation of ferrocyanide treated beet molasses: morphology of pellets of Aspergillus niger // J. Microbiol. -1962.-№8.-P. 133-136

74. Metz В., Kossen N. W. F., Van Suizdum J. C. The rheology of mold suspensions // Biochem. Eng. 1979. - № 11. - P. 103

75. Hosobuchi M., Fukui F., Matsukawa H., Suzuki Т., Yoshikawa H. Morphology control of preculture during production of ML-236B, a precursor of pravastatin sodium, by Penicillium citrinum // J. Ferment. Bioeng. 1993. - № 76. -P. 476-481

76. Smith J. J., Lilly M. D., Fox R. I. The effect of agitation on the morphology and penicillin production of Penicillium chrysogenum // Biotechnol. Bioeng. 1990. -№35. -P. 1011-1023

77. Byrne G. S., Ward 0. P. Effect of nutrition on pellet formation by Rhizopus arrhizus //Biotechnol. Bioeng.-1989.-№ 33.-P. 912-914

78. Lindberg, A. M., Molin G. Effect of temperature and glucose supply on the production of polyunsaturated fatty acids by fungus Mortierella alpina CBS343.66 in fermentor cultures // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993. - № 39. -P. 450-455.

79. Higashiyama K., Yaguchi Т., Akimoto K., Fujikawa S., Shimizu S. Enhancement of arachidonic acid production by Mortierella alpina 1S-4 // J. Am. Oil Chem. Soc. 1998. - № 75. - P. 1501-1505

80. Park E. Y., Koike Y., Higashiyama K., Fujikawa S., Okabe M. Effectof nitrogen source on mycelial morphology and arachidonic acid production in cultures of Mortierella alpine // J. Biosci. Bioeng. 1999. - № 88. - P. 61-67

81. Totani N., Hyodo K., Ueda T. A study on new nitrogen source for cultivation of genus Mortierella // J. Jpn. Oil Chem. Soc. 2000. - № 49. - P. 479485

82. Totani N., Hyodo K., Ueda T. Minerals essential for growth of the filamentous fungus, Mortierella alpine // J. Jpn. Oil Chem. Soc. 2000. - № 49. -P. 487-493

83. Kyle D. J. Arachidonic acid and methods for the production and use thereof. PCT Patent W096/21037. 1996

84. Higashiyama K., Yaguchi Т., Akimoto K., Fujikawa S., Shimizu S. Effects of mineral addition on the growth morphology of and arachidonic acid production by Mortierella alpina 1S-4 // J. Am. Oil Chem. Soc. 1998. - № 75. -P. 1815-1819

85. Wynn J.P., Hamid A.A., Midgley M., Ratledge C. // Wold J. Microbiol. Biotechnol. 1998. - V. 14. - P. 145

86. Krishnaiah M.M. Scale-up strategies for solid state fermentation systems. // Process Biochemistry. 1992. - № 27. - P. 259-273

87. Mitchell D.A., Grenfield P.F. & Doelle H.W. A model substrate for solid state fermentation. Biotechnology Letters. 1986. - V.6. - P. 827-832

88. Bajpai P.K., Bajpai P. & Ward, O.P. Production of arachidonic acid by Mortierellu a@na ATCC 32222. // Jownal of Indtrstriul Microbiology. 1991. -V.8.-P. 179-186

89. Давлетбаев И.М., Петухова Н.И., Зорин B.B. Скрининг низших грибов потенциальных продуцентов незаменимых полиненасыщенных жирных кислот// Баш. Хим. Ж.- 2003.- Т. 10.- С. 50

90. Totani N., Watanabe A., Oba К. An improved method of arachidonic154acid production by Mortierella alpina // J. Jpn. Oil Chem. Soc. 1987. - Vol. 36. -328-331

91. Melnik B. and Plewing G. Octob. Baby food containing -y-linolenic acid, dihomo-y-linolenic acid, or PGE, for atopy prophyxis. European patent EP 391,218.- 1990

92. Ratledge C., Rangasamy D. Compartmentation of ATP:Citrate Lyase in Plants and Plant Physiology, April 2000, Vol. 122, pp. 1225-1230

93. Теоретические основы биотехнологии. Биохимические основы синтеза биологически активных веществ. /Бутова С.Н., Типисева И.А., Эль-Регистран Г.И. Под общ.ред. Грачевой И.М. // М.: Элевар. - 2003. - 554 с.

94. Jareonkitmongkol S., Sakuradani Е., Shimizu S. A Novel А5-Desaturase-Defective Mutant of Mortierella alpina 1S-4 and Its Dihomo-y-Linolenic Acid Productivity // Vol. 59, No. 12 Applied and Environmental Microbiology, 1993, p. 4300-4304

95. Shimizu S, Shinmen Y, Kawashima H, Akimoto K, Yamada H (1988a) Fungal mycelia as a novel source of eicosapentaenoic acid: activation of enzyme(s) involved in eicosapentaenoic acid production at low temperature. Biochem Biophys Res Commun 150:335-341

96. Shimizu, S., H. Kawashima, Y. Shinmen, K. Akimoto, and H. Yamada. 1988. Production of eicosapentaenoic acid by Mortierella fungi. J. Am. Oil Chem. Soc. 65:1455-1459.

97. Wynn J. P., Hamid A. A., Li Y. and Ratledge C. Biochemical events leading to the diversion of carbon into storage lipids in the oleaginous fungi155

98. Mucor circinelloides and Mortierella alpina // Microbiology (2001), 147, 28572864

99. Wynn J. P., Aidil bin Abdul Hamida and Ratledge C. The role of malic enzyme in the regulation of lipid accumulation in filamentous fungi // Microbiology {1999), 145,1911-1917

100. Wynn J.P. and Ratledge C. Evidence that the rate-limiting step for the biosynthesis of arachidonic acid in Mortierella alpina is at the level of the 18: 3 to 20: 3 elongase II Microbiology (2000), 146,2325-2331

101. Parker-Barnes J. M., Das Т., Bobik E., Leonard A. E., Thurmond J. M. Identification and characterization of an enzyme involved in the elongation of n-6 and n-3 polyunsaturated fatty acids // PNAS, 2000, vol. 97, 158284-8289

102. Zebrafish cDNA Encoding Multifunctional Fatty Acid Elongase Involved in Production of Eicosapentaenoic (20:5n-3) and Docosahexaenoic (22:6n-3) Acids //Mar. Biotechnol. 6, 251-261,2004

103. Jareonkitmongkol S, Kawashima H, Shirasaka N, Shimizu S, Yamada H (1992a) Production of dihomo-7-linolenic acid by a A5-desaturase-defective mutant of Mortierella alpina 1S-4. // Appl Environ Microbiol 58:2196 2200

104. Jareonkitmongkol S, Shimizu S, Yamada H (1992b) Fatty acid desaturation-defective mutant of an arachidonic acid-producing fungus, Mortierella alpina 1S-4. // J Gen Microbiol 138:997 1002

105. Jareonkitmongkol S, Shimizu S, Yamada H (1993) Occurrence of two nonmethylene-interrupted A5-polyunsaturated fatty acids in a A6-desaturase-defective mutant of the fungus Mortierella alpina 1S-4. // Biochim Biophys Acta1561167:137 141

106. Автореферат диссертации кандидата технических наук Давлетбаева И.М. Биосинтез полиненасыщенных жирных кислот и их производных Уфа, 2002 - 24с.

107. Нага A. and Radin N.S. Lipid extraction of tissues with a low-toxicity solvent // Anal. Biochem. 1978. - Vol. 90. -P. 420^26.

108. Ahlgren G. and Merino L. Lipid analysis of freshwater microalgae: A method study// Arch. Hydrobwi. 1991. - Vol. 121. -P. 295-306.

109. Nagle N. and Lemke, P., (1990) Appl. Biochem. Bioiechnol. 24/25, 355-361 Production of methyl ester fuel from microalgae.

110. Schlenk H. Urea inclusion compounds of fatty acids// Progress in the Fats and other Lipids. -1954. Vol. 2. - P. 243-267.

111. Swern, D, Fatty Acids. Their Chemistry, Properties, Production, and Uses, Markley, К S (ed.). New York: Interscience Publishers Techniques of separation. Urea complexes. -1964. Part 3. - 2nd edition. - P. 2309-2358.

112. Smith A.E. The crystal structure of the urea-hydrocarbon complexes// Acta Cry si. -1952. Vol. 5. P. 224-235.

113. Abu-Nasr A.M. and Holman R.T., J. Highly unsaturated fatty acids. II Fractionation by urea inclusion compounds// Am. Oil Chem. .Sue. 1954. Vol. 31. P. 16-31.

114. Ratnayake W.M.N., Olsson В., Matthews D. and Ackman R.G., Preparation of omega-3 PUFA concentrates from fish oils via urea complexation// Fat Sci. Technol. 1988. - Vol. 10. P. 381-386.

115. Gruger E.H. Jr., Methods of separation of fatty acids from fish oils with emphasis on industrial applications// 11th Annual Conference of Pacific Fisheries Technologists, Gerhart, OR, March. 1960. - Vol. 27-28. - P. 31^10.

116. Robles Medina A., Gimenez Gimenez A., Molina Grima E. and157

117. Garcia Sanchez, J.L., Obtencion de concentrados de acidos grasos poliinsaturados por el metodo de los compuestos de inclusion de urea// Grasas у Aceiles- 1995. Vol. 42. P. 174-182.

118. Iverson J.L., Weik R-W., Correlation of fatty acid structure with preferential order of urea complex formation// J. Am. Oil Chem. Soc. 1967. Vol. 50. P. 1111-1118.

119. Haagsma N., Van Gent C.M., Luten J.B., De Jong R.W. and van Doom E. Preparation of an to-3 fatty acid concentrate from cod liver oil// J. Am. Oil Chem. Soc.- 1988.-Vol. 59. P. 117-118.

120. Traitler H., Wille H.J. and Studer A. Fractionation of blackcurrant seed oil// J. Am. Oil Chem. Soc.- 1988/- Vol. 65.- P. 755-760.

121. Wille H.J., Traitler H. and Kelly M. Production of polyenoic fish oil fatty acids by combined urea fractionation and industrial scale preparative HPLC// Revue Francaise des corps gran. 1987. - Vol. 34. - P. 69-73.

122. Domart C., Miyauchi D.T. and Sumerwell W.N. The fractionation of marine-oil fatty acids with urea// J. Am. Oil Chem. Soc. 1955. - Vol. 32. - P. 481-483.

123. Amitabha Ghosh, Anita Ghosh, Mominal Hoque, Jyotirmoy Dutta. Fatty acids of boal fish oil by urea fractionation and gas-liquid chromatography // Journal of the Science of Food and Agriculture. Volume 27, Issue 2 , Pages 159 -164

124. Shukla V. Recent advances in the high performance liquid chromatography of lipids// Prog. Lipid Res. 1988. - Vol. 27. - P. 5-38.

125. Scholfield C.R. Silver nitrate-high performance liquid chromatography of fatty methyl esters// J. Am. Oil Chem. Soc. 1979. - April. -P. 510-511.

126. Hartley F.R Thermodynamic data for olefin and acetylene complexes oftransition metals// Chem. Rev. 1973. - Vol. 73. - P. 163-190.

127. Aveldano M.I., van Roollins M. and Horrocks L.A. Separation and quantitation of free fatly acids and fatty acid methyl esters by reverse phase high pressure liquid chromatography // J. Lipid Res. 1983. - Vol. 24. - P. 83-93.

128. Henke H. and Schubert J. HPLC of fatty acid esters of mono- and polyhydric alcohols, part 1: Analytical separation// .J. High Resol. Chromat. & Chromat. Comm. 1980. - Vol. 3. - P. 69-78.

129. Privett O.S. Preparation of polyunsaturated fatty acids from natural sources // Progress in the Chemistry of bats and Other Lipids. Holmnan R.T. (ed.). - 1968. - Vol. 9, Chapter 11, part 3, Pergamon Press. - P. 409-452.

130. Schlenk H. Crystallization of fatty acids// J. Am. Oil Chem. Soc. -1961.-Vol. 38.-P. 728-736.

131. Shinowara G.Y. and Brown J.B. Studies on the chemistry of the fatty acids. VI The application of crystallization methods to the isolation of arachidonic acid, with a comparison of the properties// J. Biol. Chem. 1940. -Vol. 134. - P. 331-340.

132. Markley K.S. Interscience Publishers Technique of separation A Distillation, salt solubility, low-temperature crystallization // Fatty Acids, Their Chemistry, Properties, Production, and Uses, Markley, KS (ed.), 2nd edition. Part 3,1964.-P. 1983-2123.

133. Teramoto M., Matsuyama H., Ohnishi N., Uwagawa S. and Nakai K. Extraction of ethyl and methyl esters of polyunsaturated fatty acids with aqueous silver nitrate solutions.// Ind. Eng. Chem. Res. 1994. -Vol. 33. -P. 341-345.159

134. Shantha N.C and Ackman R.G. Silica gel thin-layer chromatographic method for concentration of longer-chain polyunsaturated fatty acids from food and marine lipids// Can. Inst. Sci. Technol. J. 1991. - Vol. 24. - P. 156-160.

135. Hardy R. and Keay J.N. The isolation of the polyunsaturated acids of the fish oils as their methyl esters by preparative scale gas chromatography// J. Chormatog. 1967. - Vol. 27. -P. 474-479.

136. Wrigth S.W., Kuo E.Y., Corey E.J. An effective process for the isolation of docosahexaenoic acid in quantity from cod liver oil// J. Org. Chem. -1987. Vol. 52. - P. 4399-4401.

137. Corey EJ. and Wright S.W. Convenient method for the recovery of eicosapentaenoic acid from cod liver oil// J. Org. Chem. 1988. - Vol. 53. - P. 5980-5981.

138. Gaiday N.V., Imbs A.B., Kuklev D.V. and Latyshev N.A. Separation of natural polyunsaturated fatty acids be means of iodolactonization.// J. Am. Oil. Chem. Soc. 1991.-Vol. 68. P. 230-233.

139. Hayastii K., and Kishimura H. Separation of eicosapenlaenoic acid-enriched triglycerides by column chromatography on silicic acid// Bull. Fac. Fish. Hokkaido Umv. 1993. - Vol. 44. - P. 24-31.

140. Moffat C.F., McGill A.S., Hardy Ft. and Anderson I. The production offish oils enriched in polyunsaturated fatty acid-containing triglycerides// J. Am. Oil Chem. Soc. 1993. - Vol. 70. - P. 133-138.

141. MRS Lipid Analysis Unit Электронный ресурс.: Режим доступа: www.lipid.co.uk, свободный. Загл. с экрана. Яз. англ.

142. Lipid bank Электронный ресурс.: Copyright1999-2002 International Medical Center of Japan / Japan Science and Technology Corporation all rights reserved. Режим доступа: http://lipid.bio.m.u-tokvo.ac.ip, свободный. Загл. с экрана. Яз. англ.

143. Дудка И. А., Вассер С. П. и др. Методы экспериментальной микологии. Киев: Наукова думка. - 1982. - С. 432—438.

144. Халабуда Т. В. Грибы рода Mortierella Coemans. М.: Наука, 1973.-С. 9-96.

145. А.С. 968072. СССР, МКИ С 12 Q 1/100. / Султанович Ю. А., Нечаев А. П., Барсукова И. А. Способ количественного определения жирно-кислотного состава липидов микроорганизмов. //Б.И. - 1982. - №39. С. 223.

146. Досон Р., Элиот Д., Элиот У., Джонс К. Справочник биохимика// М.:Мир. 1991. - С.543.

147. Практикум по физиологии растений: учеб. пособие для педвузов /Под ред. В.Б. Иванова. 2-е изд., испр. - Академия : : 2004 144 с (Высшее образование)

148. Гмурман В. Е. Теория вероятностей и математическая статистика// М.: ВШ. 1998. -479 С.

149. Shimizu S, Shinmen Y, Kawashima H, Akimoto К, Yamada H Fungal mycelia as a novel source of eicosapentaenoic acid: activation of enzyme(s) involved in eicosapentaenoic acid production at low temperature. Biochem Biophys Res Commun 150:335 341

150. Shimizu Sakayu Conversion of linseed oil to an eicosapentaenoic acid-containing oil by Mortierella alpina 1S-4 at low temperature // Appl Microbiol Biotechnol (1989) 32:1-4

151. Dosanjhi BS, Higgs DA, Plotnikoff MD, Markert JR, Buckley JT (1988) Preliminary evaluation of canola oil, pork lard and marine lipid singly and in combination as supplemetal dietary lipid source for juvenile fall chinook salmon. Aquaculture 68:325-343