Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка мембранно-хроматографических технологий очистки и концентрирования вирусов для получения вакцинных и диагностических препаратов

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка мембранно-хроматографических технологий очистки и концентрирования вирусов для получения вакцинных и диагностических препаратов"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК : НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ „ч : - им. Д. И. ИВАНОВСКОГО

|СГ.- --77Г2

С г/-л

¿¿г .'-'.ЦИв ,,

На правах рукописи

УДК 615.371:578.

КЛЮШНИК СЕРГЕЙ ЮРЬЕВИЧ

РАЗРАБОТКА МЕМБРАННО-ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ ОЧИСТКИ И КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ ВИРУСОВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИННЫХ И ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

(03.00.06. — вирусология)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук в форме научного доклада

Москва — 1993 г.

абота выполнена в НИИ вирусологии им. Д И. Ивановского Оссийской академии медицинских наук

аучные руководители:

.октор биологических наук, профессор В. М. Зайдес

фициальные оппоненты:

октор медицинских наук, профессор X Г. Карпович октор медицинских наук, профессор Л Л Фадеева

едущее учреждение:

осковский научно-исследовательский институт вирусных репаратов РАМН.

ащита состоится "/.г." ^у'^'Т.^ 1993 г. в /. / часов а заседании специализированного совета Д 001. 20. 02 ри НИИ вирусологии им. Д, И. Ивановского РАМН 123098, Москва, ул. Гамалеи, 16).

диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ ирусологии им. Л И- Ивановского РАМН

,октор химических наук

Б. Е Мчедлишвили

ченый секретарь специализированного совета

андидат медицинских наук А. М. Жуковский

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

1.1. Актуальность проблемы.

современный этап развития вирусологии отличается ужесточением требований к вирусным препаратам. Непрерывно увеличивается список вирусов, становящихся объектами теоретических исследований и практических разработок. Растет число потребителей вирусных препаратов за счет представителей смежных специальностей - биохимиков, иммунологов, специалистов в области генной инженерии. Ситуация такова, что этапы получения очищенных вирусов во многих случаях становятся определяющими по трудовым и финансовым затратам как в производстве медицинских препаратов, так и в научных вирусологических исследованиях. Соответственно, возникает проблема разработки простых и дешевых технологий очистки и концентрирования вирусных суспензий (ВС).

Как известно, в подавляющей большинстве случаев для очистки и концентрирования вирусов животных применяют методы, основанные на ультрацентрифугировании. основанием для такого подхода являются физические характеристики вириоиов, отличающие их от свободных макромолекул биологических жидкостей с одной стороны, и от клеток, их обломков и органелл - с другой. Этими характеристиками являются суммарная молеку-' лярная масса, которая для различных вирусов животных колеблется от 10^ до 10^ дальтон, и плотность в полных растворах, равная 1,15 - 1,30 г/мл. Ультрацентрифугирование бесспорно сыграло значительную роль в вирусологии, поскольку этот подход впервые дал возможность получить препараты вирусов в химически чистом виде, и до сих пор ультрацентря-фугирование является наиболее популярным методом среди вирусологов.

Между тем, далеко ие во всех случаях ультрамеитрмфупцхюеяне сева оправдывает из-за некоторых принципиальных недостатков. Во-первых, это высокая и постоянно увеличивающаяся стоимость иемтрнфужмЬго оборудования и часто его лалая доступность, во-вторых, что (кмее мим», значительная трудоемкость доботы при необходимости обработки больших объемов исходной вируссодержацей жидкости, например - десятки литров. В-третьих - слабое обеспечение режимных требовании специфической безопасности. Все это обуславливает необходимость создания альтернативной технологии очистки и концентрирования вирусов, удовлетворяющей следующим требованиям: быть универсальной, т.е. применимой для любого или, по крайней мере, широкого круга вирусов без каких-либо кардинальных доработок; быть недорогой и практически доступной для любой заинтересованной лаборатории или предприятия; быть менее трудо- и энергоемкой

По сравнению с ультрацентрифугированнем1 удовлетворять в максимально степени современный требованиям специфической безопасности при работ с инфекционными агентами; исключать попадание в конечный продукт ве ществ, которые могли бы ограничить дальнейвее применение получаемы препаратов; обеспечивать работу всей системы в стерильных условиях

Указанным требованиям отвечают, разрабатыйаемые для отдельных ви рус.ов, как у нас в стране, так и за рубежом, Методы микрофильтрации препаративной колоночной эксклюзионной хроматографии (гель-хроматогра фии). Использование в этих методах, разработанных й Нашей стране, де шевых и эффективных материалов, таких как трековые мембраны (известны также под названием 'ядерные фильтры') н макропористых кремнеземов позволяет создать уникальную по своей универсальности технологию удовлетворяющую разнообразный Требованиям вирусологическом науки практики. Это особенно актуально ввиду выявления новых опасных вирус ных заболеваний, в частности СПИД, Н отсутствия в напей стране доступ ных технологии получения чистых вирусных препаратов для изготовленн эффективных вакцин иднагностнкумов.

1.2. Цель и задачи исследования.

Несмотря на то, что в научной литературе были описаны весьма раз нообразные решения проблемы получения очищенных й концентрированны препаратов вирусов, в том числе испольэувйИе Методы ь'нкрофнльтрацни хроматографии, они не выходили за рамкн репения конкретных задач дл отдельных вирусов и не могли претендовать на универсальное нспользова ние для достаточно вирокого круга объектов. А как нэвесТно, объектам микробиологической промыилеННОсти являются многие груйпы вирусов и дл всех них высокое качество очищенных концентратов необходимо для повы пенной чувствительности изготовленных на их основе диагностически препаратов (для распозноваННя сывороток с Ннэкнй содержанием специфн ческих антител, обусловленный ранней серокоНверси£й ИЛИ нМйунНой не достаточностью) и для высокой антигенной чистоты вакцин (ЧТО должн исключать возможность побочных действий). Поэтому основной Целью нас тоящего исследования явилась разработка й Изучение различных варианте) универсальной технологии получения высокоочииенных вирусных концентра тов из ВС с различающимися фиэнко-химНЧескиии характеристиками и не пользование получаемых препаратов для изготовления вакцин и серодиаг ностическнх тест-систем. В основе навей разработки лежали известны методы эксклюзно«шой дрокатографНМ к! кикро$Нльт|дгцйп, йспользуювн отечественные иатвряалй И Оборудование.

- з -

Суиественное разнообразие физико-химических свойств используемы* з настоящее время в микробиологической промышленности вируссодерхашнх <атериалов, как то аллантоисные и культуральные жидкости с различной вязкостью и различным белковым составом, к тому хе содержащие различав ощиеся по многим параметрам вирусные частицы, потребовало для достиже-шя поставленной цели решить следующие задачи. Прежде всего необходимо зыло адаптировать выбранные методы эксклюзионноц хроматографическок )чистки и микрофильтрационного концентрирования для широкого круга ви-зусов, в том числе для таких, для которых эти методы не применялись. 1ля унифицирования подходов к получению очишенных концентратов мы при-(еняли различные комбинации этих методов к их модификаций, в частности киафнльтрацию.

Полученные результаты позволили предложить универсальный набор 1икрофильтрацнонно-хроматографических методик для очистки и концентри-ювания практически любых вирусов, а также приготовить высокоочищенные шрусные концентраты, которые были в дальнейшем использованы при изго-опленни вакцинных н диагностических препаратов, получения монокло-Ольных антител и для научных исследований.

I. *. Научная новизна.

1. Предложена универсальная технология очистки н концентрирования ирусов, применимая для иирокого их круга и различных типов ВС без до-олнительных доработок. Технология апробирована на представителях 8 емейств вирусов (парамиксовирусы, ортомиксовирусы, тогавирусы, рабдо-ирусы, гераесвярусы, ретровнрусы, аденовирусы, пикорнавирусы). во рех случаях Были получены положительные результаты.

2. Разработаны подходы к созданию субьелнничной герпетической акцннн из очинённого вирусного концентрата, полученного по предлож'е*-ой технологии, где действующим началом являются антигены поверхностях гликопротеидов вирусов простого герпеса 1 н 2 типов, стимулирующие неточные механизму противовирусной зашиты организма человека.

3. Получены и охарактеризованы очищенные концентраты вакцинных /льтуральных штаммов вируса бешенства. На основании этого изучения 1зработань| требования К производственным штаммам вируса бешенства.

4. С помовью полученных очишенных концентратов вируса бешенства мучены моноклончльнне антитела к гликопротеидному и нуклеопротеидно-! белкам.

- 4 !-

1.4. Практическая значимость.

Исследования, выполненные в рамках предлагаемой работы, легли в основу следующих практических разработок:

1. "Очистка н концентрирование вирусных суспензий истодами »накостной хроматографии и микрофильтрации• - методические рекомендации, утвержденные Ученым советом НИИ вирусологии 24.6.85 г., протокол N 8. Методические рекомендации были внедрены в несколько лабораторий института, в частности для работы с вирусами ВЭЛ и лейкоза коров.

2. Авторское свидетельство H 1631072 'Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus L., используемый для получения моноклинальных антител к гликопротеидному структурному белку вируса бешенства", зарегистрированное 1.11.90.

3. Авторское свидетельство N 1631073 "штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus L., используемых для получения ио-ноклональных антител к нуклеопротеидному структурному белку вируса бешенства", зарегистрированное 1.11.90.

4. "Вакцина герпетическая глйкопротеидиая" - Инструкция по изготовлению и контролю, утверждена Одесским предприятием по производству бакпрепаратов ю.07.89.

5. Авторское свидетельство N 1580618 'Способ получения гликопрб-теидной герпетической вакцины', зарегистрированное 22.03.90

6. 'Требования к отечественным нтаммам фиксированного вируса бешенства для производства культуральных антнрабическнх вакцин' - методические указания, рд 42-28-2-91, утвержденные M3 СССР 24.01.91.

1.5. Основные положения, выносимые назащиту.

1. Предложены единые подходы к созданию технологических схем иембранно-хроматографической очистки н концентрирования широкого круга вирусов из внруссодержацих жидкостей с различными фнзико-химическими характеристиками.

2. Для вирусных суспензий с различными физико-химическими характеристиками предложены конкретные варианты технологических схем иембранно-хроматографической очистки и концентрирования, для аллантоисных ВС: префильтрация - эксклвзионная хроматография - микрофильтрация; для культуральных ЕС с содержаниеи белка более 5 ur/мл: префильтрация -диафильтрация: для культуральных ВС с содержанием белка менее 5 мг/нл: префильтрация - ыикрофяльтрация - эассхлюэиониая хроматография, а также префнльтраш» - дкизодьтраияя.

S. оtfptAgASW' датиаал№м юлвчаюы гор отечественных трековых

мембран для работы с различными типами вирусов при различных технологических режимах препаративной очистки и концентрирования (режим пре-фильтрации, режим концентрирования, режим диафильтрацин).

4. Предложены оптимальные условия препаративной зксклюзнонной хроматографии различных типов вирусов по таким существенным технологическим параметрам, как размеры колонок, объем наносимой на колонку пробы, величина пор носителя.

5. Предложены подходы к созданию вакцинных и диагностических препаратов на основе очищенных концентратов вирусов, таких как субъединичная герпетической вакцины, диагностических тест-систем к вирусу бешенства.

1.6. Апробация работы.

Материалы диссертационной работы были доложены на XIX Всесоюзной конференции Института полиомиелита и вирусных энцефалитов "Вирусы и вирусные инфекции человека' (Москва 1981 г.); на 3 Всесоюзном симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии (Рига 1984 г.); на 17 Республиканской научной конференции молодых медиков Грузин (Тбилиси 1986 г.); на 5 Всесоюзном симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии (Рига 1990 г.); на Всесоюзной конференции "Мембранные методы разделения смесей" (Владимир 1991 г.); на Конференции "Аналитическая химия объектов окружающей среды* (С-Петербург - Сочи 1991 г.); на Международной конференции 'СПИД, рак и ретровнрусы человека* (С.-Петербург 1992 г.). Содержание работы и отдельных ее этапов докладывались на семинарах НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Вирусы.

В настоящей работе исследования проводились на представителях 8 семейств вирусов - парамнксовирусы (вирус парагриппа, тип 3; Сендай, шт. 960), ортомиксовнрусы (грипп А/Ленннград/1Ш2,385/80 и В/Ленинг-рад/489/80),тогавирусы (вирус венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ), шт. 230 и вирус восточного энцефаломиелита лошадей, шт. 689), рабдовнрусы (вирус бешенства, штаммы "Внуково-32", "МНИНВП-74", "РН1тап тоог" и вирус везикулярного стоматита, нтамм Индиана), гер-песвнрусы (вирус простого герпеса 1 типа, шт.УС н 2 типа, шт.бН), ретровнрусы (вирус иммунодефицита человека' (ВИЧ), штаммы НТА-4.1 и НТА-4.2 и вирус лейкоза коров), пикорнавнрусы (вирус полиомиелита, шт. ияс-гаЬ), аденовирусы (аденовирус человека, тип 5).

- 6 -

2.2. Методы исследования.

В работе были использованы следующие методы. Вирусологические и иммунологические - культивирование монослойных первичных и перевиваемых клеток, а также культивирование суспензионных неопластическнх клеточных линий; размножение вирусов в хуриных эмбрионах, в культурах первичных и пернвиваемых клеток и в неопластическнх суспензионных клетках; определение вирусной активности проводили методами титрования на животных, реакции нейтрализации, геммаглютинации, связывания комплемента, иммукоферментным анализом. Иммунохимические методы - иммунный блотннг. Молекулярно-бяологические - ультрацентрифужное фракционирование- вирусных частиц, и субвирусных структур; фракционирование белков В полиакриламиднон геле с помошью электрофореза. Указанные методы применялись как общепринятые. Математическую обработку данных для оценки существующих различий титров биологической активности вирусов Проводили, используя 1-статистику. Основными методами, с помошью которых получали очниенные концентраты вирусов, являлись микрофильтрация И экс-клюзионная хроматография.

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Отработка техники микрофильтрации.

для концентрирования вирусных суспензий изначально применили разработанный Б.В.Мчедлишпили с соавт. метод микрофильтрации, основанный на использовании трековых мембран (ТМ). ТМ, разработанные Г.Н.Флеровым с соавт. представляют собой полупроницаемые полиэтилентерефталатные пленки толщиной 5 - 12 мкм, пористая структура которых получается в результате облучения их ускоренными на циклотроне многозарядными тяже-' лыми ионами с последующим травлением образовавшихся треков щелочью до появления сквозных пор требуемого диаметра. В отличие от мембран других типов, в том числе - сетчатых ацетатцеллюлозных фильтров Типа МННроге, ТМ обладают следующими достоинствами: большой механической прочнотью; отсутствием выщелачиваемых компонентов в структуре мембраны; отсутствием проникновения концентрируемых частиц в глубину пор (это, в сочетани с гладкой поверхностью ТМ, позволяет быстро восстанавливать нх пропускную способность тангенциальным или обратным пульсирующим потоком жидкости практически до исходных параметров), основным достоинством ТМ является исключительно малая величина разброса диаметра пор: отклонение от величины среднего диаметра не превышает 2 -5% (Мчедлишвили, 1977)., Именно в силу строгой калиброванности пор разделение вирусных суспензий на ТМ идет, практически, по принципу 'все

или ничего", что хорошо иллюстрирует зависимость, показанная на рис. 1 (Мчедлиовилн, 1978). Здесь характеризует задерживающую способность ТМ ( ^ » 1 - Сф/Со, где Со и Сф - содержание частиц в исходной ВС и фильтрате соответственно), а Л является отношением диаметров частиц и пор ТМ. Эта зависимость была получена при фильтрации латексиих частиц И некоторых вирусов И определяет три возможные режима фильтрации:

1. X $ 0,2 - режим свободного прохождения члетии через ТМ (\> = 0), этот режим используется для задерживания и, тем самым, удаления из ВС примесей, превышающих по своим размерам вирусные частицы;

2. X ? °>5 - режим полной задержки частиц трековыми мембранами ( >» 100%), этот режим используется для'концентрирования гирусов.

3. 0,5 > Д/ >0,2- узкий переходный режим, в котором принципиально возможно разделение близких по размеру частиц (на практике используется крайне редко).

Полученные нами экспериментальные данные по мембранной фильтрации различных вирусов полностью подтвердили универсальный характер указанной зависимости. Для всех исследованных вирусов били получены экспериментальные значения по результатам микрофильтрацпн, которые пол-костью совпали с рассматриваемой кривой (см. рис. 1). Нспольпуя полученные данные, нам удалось рассчитать оптимальные размеры пор тм как для режима свободного прохождения вирусных частиц (режим префнльтрации - см. ниже), так и для режима полной задержки вирусных частиц (режим концентрирования), При этом результаты по микрофпльтраиип вирусов различных' размеров (от сферических полновирусов, имеющих 26 нм в диаметре, до вируса простого герпеса неправильной формы, имеющего размер около 190 нм) в режиме концентрирования показали полное отсутствие вн-русспецнфической активности в фильтратах, т.е. доказали способность используемых мембран полностью задерживать вирусный материал , а следовательно - возможность получать концентрат исследуемого вируса.

По сравнению с широко используемыми анетатцеллюлозными мембранами ТМ обладают также низкой адсорбционной способностью, что связано с их малой удельной поверхностью - 0,5 - 1,0 м^/г (что в ю - 30 раз меньше, чем у сетчатых мембран типа мНИроге) (Апель, 19К6). тм выдерживают все общепринятые методы химической стерилизации, а также автокла-вированне без изменения первоначальных свойств. Эти мембраны были разрешены мз России для применения в медицинской практике. В настоящей работе использовали ТМ с диаметром пор 0,5 — 1,8 мкм для префильтрации и мембраны с диаметром пор 0,03 - 0,09 мкм для концентрирования ВС.

34 0,8

о,1» о.г

Í41

•ijp---Ч^и" лф*"

1 ло

l/f

A-i 0-2 е-з

0-4

И-5 D-S • -7

о,г о,ц 0,6 0,8 я

Рис.1. Зависимость задерживающей способности ТМ (^р) от соотношения размеров вирусных частиц и пор тм (%) ■

1 - полиовирус (26 нм), 2 - вирус вэл (70 нм), 3 - аденовирус (80 им), 4 - ВИЧ (loo им), 5 - вирус бешенства (85 х 190 им), 6 - вирус гриппа (120 им), 7 - вирус простого герпеса (190 HMj.f* « 1,0 - полная задержка вирусов, ■ о - полное пропускание вирусов. Пунктирная линия - данные литературы, точки - собственные экспериментальные данные.

в качестве фнльтродержателя для ты использовали плоскокамерные аппараты с площадью фильтрации от 0,1 до 1,2 м^ . Все использованные фильтродержатели состояли из набора дренажных пластин и прокладок, между которыми укладывались мембраны. Собранная установка для микрофильтрации представлена на рис. 2. Исходный внруссодержаянй материал с помощью.перистальтического насоса поступал в фильтрующий аппарат под давлением, которое контролировалось манометром и не превышало 0,4 атм в случае префильтрации и 1,0 атм в случае концентрирования. Аппарат имел два шланга на выходе: по одному из системы удалялся материал, прошедший через поры TH (фильтрат или пермеат), а по другому непро-фильтровавшийся материал (концентрат) возвращался в исходную емкость для дальнейшего концентрирования. В случае префильтрации очищенный ви-руссодержащий материал собирался из шланга фильтрата, в случае концентрирования вирусный материал оставался в емкости для исходного материла. описанная снотема для концентрирования .являлась полностью замкнутой, что исключало как контакт оператора с инфекционным материа-

vom, так и попадание в вирусных материал нежелательных агентов в том теле бактериальных. Стерилизация системы проводилась заполнением ее

раствором формальдегида ;терильной дистиллированной грующей поверхности.

на Ю-15 часов с последующей отмывкой водой из расчета 10 - 15 л на 1 м*^ филь-

Рнс.2. Схема установки для мнкрофнльтрацин

1 - фильтрующий аппарат, 2 - перистальтический насос, 3 - манометр, 4 - зажим, уменьшающий просвет аланга (используется для увеличения скорости фильтрации через ТМ), 5 - емкость с концентрируемым или префильтрируемым материалом, 6 - емкость для приема материала, прошедшего через мембраны.

3.2. Отработка техники зкеклюзионной хроматографии.

Эксклюзиошгая хроматография для очистки ВС применялась нами в модификации, предложенной Б.в.Мчедлишвнли с соавт. для вируса бешенства, ~де в качестве носителя использовались макропористые кремнеземы (МПК), I частности - макропористые стекла (Жданов С.П., 1952). МПК выгодно сличаются от распространенных полимерных носителей малым разбросом киаметра пор: 5 - 15% от средней величины, Так как МПК обладают силь-юй адсорбцией вирусных частиц, для эксклюзионной хроматографии примелют химически модифицированные МПК, т.е. кремнеземы, обработанные по-.имерамн, которые закрывают активные центры МПК.

На основании изучения процесса диффузии жестких коллоидных частиц I поры носителя предыдущими авторами (Мчедлпшвили, 1980) была получена 1аинснмость величины козфнциеита распределения жестких коллоидных час-нц (Кс1), который характеризует вероятность захождения этих частиц в

поры носителя, от отношения размеров частиц и пор носителя (Д,). Из этой зависимости (см. рис. 3) следует, что свободная диффузия частиц в поры носителя (при этом К(1 = 1) идет лишь тогда, когда средний диаметр пор превышает средний диаметр частиц в ю и более раз, т.е. при 0,1. Проникновение же частиц в поры носителя начинается когда Х>= <Яо 0,5 и увеличивается по мере уменьшения этой величины. Используя носители с различным диаметром пор, по результатам хроматографии исследуемых вирусов, нами были рассчитаны экспериментальные точки, которые полностью совпали с рассматриваемой кривой. Из этого было сделано заключение об универсальности указанной зависимости н правомерности выводов, делаемых на ее основе, для вирусных частиц.

Ка

С,8-■0.6-

оя

\ т \

д-1 а-а

0-3 О-А 0-5

0.2.

0.1

0^6 1 0,8 1

Рис.3. Зависимость коэфициента распределения вирусных частиц (Кс1> от соотношения их размера, и величины пор Носителя (Д,). 1 - вирус бешенства, 2 - вирус Сендай, 3; - ВИЧ, 4 - вирус простого герпеса, 5 - вирус ВЭЛ. Пунктирная линия - данные литературы для жестких колоидных частиц, точки - собственные экспериментальные данные.

-ч

Анализ указанной зависимости позволил заключить, что процесс •очистки ЬС, т.е. удаление мелких, в основном белковых, примесей будет эффективным, если поры носителя еще не доступны для проникновения в них вирусных частиц, но максимально доступны для диффузии примесных макромолекул. Таким образом, оптимальная величина диаметра пор носителя (Оо) для эксклюзионной хроматографии вирусов со средним размером частиц (1 определяется из соотношения СЮ » <1/Л<о и для исследуемых

вирусов находится в интервале 0,1 - 0,4 мкм. Нами было проведено сравнительное изучение эксклюзионно-хроматографнческого разделения ВС на носителях с различным диаметром пор (0,1, 0,2 и 0,4 мкм). Эти данные, на примере вируса везикулярного стоматита, показаны на рис. 4. видно, что по мере увеличения диаметра пор хроматографического носителя увеличивается второй пик хроматограммы (пик белковых примесей), уменьшается и обособляется первый, внруссодержащий пик (см. ниже). Это происходит за счет того, что в поры с большим диаметром заходит большее количество примесных белков, в силу этого время их прохождения через колонку будет увеличиваться по сравнению с вирусными частицами, не диффундирующими в поры носителя, а следовательно примесный материал будет элюироваться из колонки вторым инком. Вирусный материал первого пика при этом становится более чистым, что было подтверждено исследованиями материалов пиков с помощью электрофореза (см. ниже). Таким образом нами было выявлено, что для вирусов с размерами О,<17 мкм и более оптимальный диаметр пор гранул носителя составил 0,2 - 0,4 мкм.

Т,/о 20-

60-

3 б 9 12 V, мл

Рис.4. Хроматография вируса везикулярного стоматита на носителях с различным диаметром пор.

I - диаметр пор носителя 100 нм, 2 - 200 нм, 3 - 400 им.

В соответствии С выше изложенными предпосылками н исследованиями для эксклюзионной хроматографии нами был выбран носитель С'МП-1М-2000 производства ПРЕД (г.Москва), который представляет собой макропористое стекло, химически модифицированное сополимером ы-винилпирролидона и диметакрилатон. Диаметр нор данного носителя составляет 0,19 - 0,21

ыкм, удельный объемом пор - 2,3 см^/г. Указанный носитель имел следующие преимущества перед полимерными хроматографическими носителями: большая механическая прочность; термическая устойчивость; устойчивость к бактериальному воздействию; большая скорость пропускания элюента; стойкость к различным химическим реагентам, структура данного носителя не изменяется с изменением рН и ионной силы элюентов.

Важным моментом отработки технологии хроматографической очистки явился выбор длины используемой колонки. На примере вируса венесуэль-

ГА

ВД

т

320-

¿0 80

80 20

I2L 2к 36 48 V

Рис.5. Очистка вируса ВЭЛ на колонках различной длины, а - на колонке 0,6 х 20 см., б

- на колонке 1 х 50 си., в -на колонке 1 х юо см. 1 -распределение ГА-актиыюсти в хроматографических фракциях (ед. ГА), 2 - поглощение УФ-лучей материалом хроматографических фракций при X = 25 4 ни (T, %). По осям абсцисс,

- объем элюента (V, мл).

ского энцефаломиелита лошадей было показано, что удовлетворительные результаты разделения зон вирусных частиц и загрязняющих примесей происходит на колонках более 50 см (см. рис. 5 и табл. 1). Только в этом случае вируссодержащий материал элюировался из колонки первым пиком, а основное количество ннзкомолекулярных загрязняющих примесей элюирова-лось вторым пнком.

ТАБЛИЦА 1.

Распределение биологического материала по пикам хроматограммы в зависимости от длины колонки (хроматография вируса ВЭЛ).

Материал

-Колонка_0,б_х_20_см_

Нанесено на _колонку-

-Белок(%)_ГА-актнв.(%)-

100 100

Всего собрано

_с_колонки-

Собрано в 1 пике хро-

_матограммы-

Собрано во 2 пике хро--матограммы-

83

3,9

79

87

50

37

_Колонка_1,0_Х—50—см_

_Белок(%)_ГА-актив.(%)-

100 100

90

2.4

88

7 8

75

3,4

Материал _Колонка-1,о_х_100_см_

-Белок(%)-ГА-актив.(%)_

Нанесено на юо 100

—колонку—!_

Всего собрано 95 83

_с—колонки_

Собрано в 1

пике хро- 1,7 81

-матограммы_,_

Собрано во 2

пике хро- 93 1,9 -матограммы_

Учитывая вышесказанное, в дальнейшем для хроматографии использовали два типа колонок': аналитические с диаметром 1 см и длинной 50 и 100 см и препаративные" с размерами 5 х 100 см. Колонки, заполненные носи-

телем, уравновешивали 0,05 М фосфатный буфером, содержащим 0,15 М Nací, рН 7,5. Для каждой колонки определяли оптимальный объем пробы ВС, наносимой на нее для одного цикла очистки. Для этого на колонку наносили различные объемы ВС, лежащие в пределах 1/10 - 1/5 от полного объема колонки (Vt) и сравнивали полученные хроматограммы (см. рис. 6), расчитывая степень разделения (Kg) по следующей формуле (Ю.Я.Лебедев, Б.В.Мчедлишвили.):

Ve i - Vea MAVÍ+AVÜ)

объем пробы ВС, соответствующий минимальной величине Kg, при условии,. что объемы дVI и не перекрываются, являлся оптимальным для колонки с данными параметрами, выбранной скорости элюцин и, что особенно важно, для данного типа ВС.

т,%

1 ду, ■ ■ м

Рис.6. Хроматограммы ВС для определения оптимального объема наносимой пробы (на примере концентрата вируса гриппа). 1 - нанесено 4 мл концентрата, 2 - 8 мл, (оптимальный объем - 4 мл); Уе1 - объем выхода вирусного пИка (равен Уо - свободному объему колонки, т.е. объему элюента между гранул носителя), Уей -объем выхода загрязняющих примесей (равен сумме объемов - Уо и VI, где VI - общий объем пор гранул носителя в колонке).

Собранная установка для эксклюзионной хроматографии показана на рис. 7. ВС, предназначенную для очистки, наносили на. колонку с помощью перистальтического насоса, объем наносимого материала для аналитичес-

ких колонок составлял 4-ю мл, а для препаративной - 200 - 400 мл. Скорость подачи элюента на аналитических колонках составляла 2-3 см/мин, на препаративной - 5 - 6 см/мин. Элюируемый материал контролировали проточным спектрофотометром и связанным с ним самописцем. Когда самописец регистрировал пик вирусного материала (см. ниже), элюат собирали в отдельную емкость. Загрязняющие примеси, элюирующиеся в другом пике, отбрасывали.

Хроматограммы всех исследованных ВС имели два выраженных пика. Первый пик всегда соответствовал свободному объему колонки (Vo), который составлял 16,9 и 33,7 мл для аналитических колонок длиной 50 и icio см соответственно и 800 мл для препаративной. В этом объеме выходили частицы и макромолекулы с большой молекулярной массой, которые не могли войти в поры гранул носителя. Второй пик определялся объемом элюа-та, соответствующего сумме объемов Vo и общего объема пор носителя в колонке (Vi), равного 35,8, 71,7 и 17CÍ0 мл для аналитических и препаративной колонок соответственно. В этом пике выходили низкомолекулярные вещества, молекулы которых свободно проникали в поры МПК.

Рис.7. Схема установки для эксклюзионной хроматографии. 1 - колонка с МПК, 2 - перистальтический насос, 3 - проточный спектрофотометр, 4 - самописец, 5 - емкость с исходной ВС, 6 -емкость с элюентом (буферным раствором), 7 - емкость для сбора очищенного вируса, 8 - емкость для сбора загрязнявших материалов. 9 - зажимы, 10 - емкость для улавливания воздушных пузырей.

3.3 Очистка и концентрирование вирусов из аллантоисных жидкостей.

Метод очистки ВС с помощью колоночной,эк^клюзионной хроматографии и микрофильтрационное концентрирование первоначально были нами применены для вируссодержаиих аллантоисных жидкостей (ВАЖ). Схема последовательности указанных процессов была выбрана следущая: фильтрация ВАЖ через крупнопористые мембраны (префильтрация) - эксклюэионно-хроматог-рафичсская очистка ВАЖ - микрофильтрационное концентрирование очищенного вирусного материала. Префильтрация была необходима для удаления из ВАЖ таких компонентов, как обрывки тканей куриных эмбрионов, клеток и их обломков, крупных белковых агрегатов. Префильтрация по достигаемому эффекту соответствовала осветлению на центрифуге, однако имела преимущество перед низкоскоростным центрифугированием в большей простоте операций и в более высокой производительности, которая составляла около 50 л/час для установки с эффективной цлоиадью фильтрации 1 м Хотя после префильтрацин ВАЖ, в основном, и освобождалась от примесей, превышающих по своим размерам вирусные частицы (в соответствии с диаметром пор используемых мембран), но оставалась достаточно вязкой жидкостью в силу высокой концентрации полисахаридов. Это не позволяло проводить ее концентрирование из-за быстрого забивания пор мембран, поэтому на втором этапе была применена зксклюзионно-хроматографическая очистка ВАЖ, которая освобождала вирусный материал от примесей (полисахариды, белки, аминокислоты и пр.). Производительность на данном этапе составляла около 500 мл/час для колонки 5 х 100 см: Очищенный вирусный материал на следующем этапе легко подвергался микрофильтрационному концентрированию, степень концентрирования в наших опытах достигала 80 - юо кратной величины, производительность концентрирования била более 5 литров в час.

Для отработки указанной технологии нами (чми выбраны два вакцинных штамма ортомиксовнрусов - А/Ленинград/388/80 (H3N2) и В/ленинг-рад/489/80, а также парамиксовирус Сендай - штамм 960 Такой выбор позволил изучить процессы очистки и концентрирования аллантоисных вирусных суспензий, содержащих вирусы различной величины (от 100 до 150, us:) и различающихся по количественному содержанию вирусов (по величине инфекционного титра содержание вирусов Сендая, гриппа А и гриппа В в ВАЖ соотносилось как 100 : 10 : 1).

На каждом этапе обработки ВАЖ отбирали пробы промежуточных продуктов, которые исследовали вирусологическими и биохимическими методами лналнз полученных -результатов позволил судить о динамике проходя-füix процессов.

Рис. 8. эксклюзнонно-хроматографнческая очистка миксовнрусов. а - вирус гриппа А, б - вирус Сендан, 1 - гемагглютнннрующая активность (обратные единицы титра), 2 - распределение белка на вы-, ходе из колонки (С^мкг/мл). 3 - хроматографнческое распределение материала, поглощающего УФ-лучи при Л »'254 ни (Т, %), по осям абсцисс - объем элюента (V, мл).

Рассмотрим результаты по очистке и концентрированию аллантоисиых вирусов, представленные на рис. 8 а,б и в таблице 2. 11а этапе префнль-трзции потери вирусного материала были минимальные. Получаемая на втором этапе очистки хроматограмма характеризовалась двумя пиками (использовалась колонка 5 х 100 см). В материале первого пика, оптическая плотность которого была обусловлена скорее не поглощением УФ-света, а светорассенваннем из-за выраженной мутности, определялось основное количество ГА-актнвностн н не более 4% нанесенного на колонку общего белка, наоборот, фракции второго пика содержали основное количество нанесенного на колонку белка и лишь следовые количества ГА-актнвности исходного материала.

Указанное распределение хорошо согласовалось с ожидаемым распределением материала исходном ВАХ на вирусные частицы (первый пик) и растворимые примеси (второй пик). Действительно, если'рассматривать ВАЖ, как суспензию различных коллоидных частиц, то самыми крупными из них (после этапа префильтрацин) окажутся рирусные частицы. Последние, проходя через колонку не будут заходить в поры носителя и элюируются

ТАБЛИЦА 2.

Очистка и концентрирование вирусов из аллаитоисных жидкостей.

I-

-Вирус_грнппа_А-

Материал I Объем I—Гемаг.-активность_X_Белок-

I (мл) I Титр ед. ГА/ % 1мкг/ мг/

-I-

-Обьем.

-I_мл—объем-

Исходная I 14500 I 1:2560 37,1X10 1001 1120 16240 100 -ВАЖ-1-

Сиыв с I _префильтров_1

1 пик хро- I —матограммы_I.

2 пик хро- I -матограммы_I,

Концентрат I -1

Смыв с кон- I -центрнр._ТМ_1

Фильтрат I -i

14000 I 1:1280 i 17,9X10® 481 т 950 13300 82

50 I 1:160 т 5 0,06Х10Э 0,021 х 130 6,5 0,04

15000 I 1:640 т 9,6х106 261 х 20 300 1,8

45000 I <1:10 т <0,7х10б <21 т 226 10170 63

300 11:40960 т 12,3x106 331 т 500 150 0,9

300 11:20480 т e.ixio6 161 т 220 66 0.4

14700 I <1: 10 т <0,3x10® <0,11 т 5 74 0,4

-Внрус_гриппа_В_

Материал . I объем 1_Гемаг.-активность_1__Белок-

I (мл) X Титр ед. ГА/ % I мг/ МГ/ %

-1_I_объем_—I_мл_объем_

5

Исходная I 4500 I 1:160 7,2X10 1001 2700 12150 100

-ВАЖ-1-1-_1_

„5

Префильтрат I 4000 I 1:160 6,4X10 891 2550 10200 84

-I-1-

„5

1 ПИК хро- I 5000 I 1:80 4,0x10 561 30 150 1,2 -матограммы_I_I_I_

2 ПИК хро- I 12000 X <1:2 <0,2X10® <2,71 736 8833 73 -матограммы—I_I_I_

Концентрат I 150 I 1:1280 1,9X10** 261 373 56 0,5

.1-1-:-1_

„5

Смыв С кон- I 25С X 1:640 1,6X10 221 128 32 0,3

_центрир._ТМ_1—I-1_I_

Фильтрат I 4850 I <1:2 <0,1X10® <1,31 5 24 0,2

-í-1_I_

ТАБЛИЦА 2 (продолжение).

_Вирус_сендан_

Материал

Исходная —ВЛХ-

Префильтрат

1 пик хро--матограммы—

2 пик хро--матограимы—

Концентрат

Смыв с кон--цецтрир.-ТМ-фильтрат

объем I—гемаг.-активность-1-Белок-

(«л> I Титр ед. ГА/ % I иг/ мг/

-объем-

-I_мл_объем-

3000 I 1:5120 15,3X10 1001 1661 4984 100 -1-1--1-

2750 I 1:5120 14,1X10 911 1576 4334 87 -1-1-

4500 I 1:1280 5,8x10 381 42 193 3,8 -1-1_

19250 I <1:10 <0,2X10 <1,31 175 3380 68 -1-1_

200 11:20480 4.1X10 -1-

271 310 _I_

62 1,2

250 11:10240 2,5x10 161 _ -1-,---1-

4300 I <1:2 <0,1X10 <0,11. _ --1-1-

%

из колонки первым пиком с объемом выхода равным, свободному объему колонки (Уо). Все более мелкие примеси, диффундируя в поры носителя, окажутся на выходе из колонки во втором пике и объем их выхода будет равен сумме свободного объема и объема пор носителя колонки (Уо + VI).

Идентификация материала хроматографических фракций была проведена с помощью электрофореза в 12% ПААГ по леммли. для этого аликвоты фракций центрифугировали в течение часа при l00000g (25000 об/мин, ротор 5И-28, Вескпап). На рис. 9а показан электрофорез материалов осадков хроматографических фракций вируса Сендай. Видно, что фракции 7 - 13 содержат структурные вирусные белки. На рис. 9б показан электрофорез материалов неосажденных фракций, где такжр в соответствующих фракциях выявляются исключительно вирусные белки. Анализ результатов обоих электрофорезов говорит о полном отсутствии загрязняющих белковых примесей в собираемом вирусном материале, и, следовательно, о его высокой чистоте после эксклюэнонной хроматографии. Электрофоретический анализ осажденных материалов из фракций второго пика показал практическое отсутствие в нем вирусспецнфических белков, это говорит о том, что при эксклюзионной хроматографии потерь вирусного материала за счет его вы-

3 А 5 6 7 8 9 Ю II 12 13 14 ^<рр.

-ИМ -ИР

-М

3^ 5 6 7 & 9 Ю И 12 |3 14 <рр

Рис.9. Электрофорез в полиакриламиднон геле белков хроматографи-ческих фракций вируса сендай.

а - электрофорез ультрацентрифужных осадков, б - электрофорез на-тивного материала фракций. Внизу указаны номера .фракций, справа обозначена структурные белки вируса.

хода во втором пике не происходит. Аналогичные результаты были получены нами и для других исследованных аллантоисных вирусов. То, Что мы получали после очистки исключительно виру специфический материал показывает также сравнение хроматограим исходной ВАХ и конечного препарата вируса (см. рис. 10). видно, что хроматограмма очищенного концентрированного вируса лишена второго пика, а следовательно в нем нет загрязняющих белковых примесей.

Рис.10. Эксклюзионная хроматография вируса гриппа. А. 1 - исходная ВАХ, 2 - концентрированный очищенный Енрус.

& о 1600 ¿¡,00 5200 \/,мл

Полученный после хроматографии материал, хотя и был хорошо очинён от балластных загрязнителей, но имел низкую концентрацию вируса в результате характерного для зксклюзионной хроматографии разбавления элю-ируемым раствором (объем исходной ВС после хроматографии мог увеличиваться в 1,5 - 2 раза). Поскольку такое разведение затрудняло дальней-.шее использование материала, на следующем технологическом этапе этот материал концентрировали на ТМ методом микрофильтрации.

Микрофильтрация позволяла получать препарат любой степени концентрации. в общем объеме конечного продукта мы получали 30 и более процентов исходной внрусспецифической активности, определяемой в РГА, при этом величины конечных титров исходных ВАХ возрастали на один -два и более порядка. Так титры исходной ВАХ и очищенного концентрированного вируса в случае гриппа А составляли 1:2560 и 1:40960, в случае вируса Сендай 1:5120 и 1:20480 соответственно. Однако, исходя из того, что в фильтрате ГА-активность практически не определялась и вирусные белки электрофоретически также не выявлялись, можно утверждать, что в концентрате мы собирали весь вирусспецифический материал, взятый изна-

чально. Меньшую хе величину суммарной ГЛ-актнвности концентрата по сравнению с исходной суспензией можно отнести за счет некоторой инактивации этой активности во-время процесса микрофильтрации. Некоторые потерн вирусного материала могут быть также связанны и с образованием на поверхности ТМ так называемого гель-слоя (см. ниже).

Отдельно остановимся на проблеме адсорбции вирусных частиц на ТМ. После микрофильтрации и удаления из аппарата концентрированного материала, мы проводили следующую операцию: аппарат заполнялся чистым буферным раствором, который циркулировал в нем некоторое время при минимальном давлении, а следовательно и с минимальной фильтрацией через мембраны. "После этого смыв удалялся из аппарата и анализировался (см. табл. 2). Анализ показал, что на мембранах после префильтрацнн адсорбции вирусов практически не было, а после концентрирующей микрофильтра-цин в смывах выявлялось в среднем до 22% вирусспецнфнческого материала, определяемого по ГЛ-активности. Адсорбированный материал легко смывался с гладкой поверхности ТМ при однократном их промывании. И В повторных смывах вирусспецнфнческая активность определялась только в следовых количествах. Материал смыва по определяемым характеристикам (в том числе по электрофоретической чистоте) практически не отличался от концентрата и мог быть объединен с последним. Эффект адсорбции объясняется образованием на мембранах во-время микрофильтрацин вирусных частиц (за счет ван-дер-ваальсовых, электростатических и других сил), так называемого, гель-слоя, состоящего из фильтруемых частиц (Черкасов А.Н., 1986).

В результате проведенных экспериментов мы пришли к выводу, что очистка и концентрирование по схеме: префильтрацня - эксклюзионная хроматография - концентрирующая мнкрофильтрация, с использованием химически модифицированных МПК в качестве носителя для очистки и ТМ для концентрирования, полностью применима для различных вирусов, культивируемых в фпбробластах куриных эмбрионов. Так, мы получали препараты различных мнксовирусоа, в которых очистка по белку доходила до 300 и более кратной величины при сохранении до 50% (с учетом смыва) исходной вирусспецифнческой активности, определенной в РГА и значительном возрастании титров конечных материалов. Степень концентрирования материала данная технология позволяла доводить практически до любых требуемых величин и ограничивалась лишь величиной внутреннего объема концентрирующего аппарата.

- 23 -

3.4. Очистка и концентрирование культуральных вирусов.

В отличие от ВАЖ, культуральные вируссодержащие жидкости (КВХ) менее вязкие, но различаются по содержанию сыворотки крови животных (в исследуемых квж концентрация сыворотки доходила до 20%). выяснилось, что при высоком содержании сыворотки в КВХ (при концентрации общего белка более 5 мг/мл) сывороточные белки были склонны к агрегации. Такие КВХ фильтровались плохо, быстро забивая поры ТМ. Наоборот, КВХ с низким содержанием сывороточных белков (при концентрации общего белка менее 5 мг/мл) свободно фильтровались через концентрирующие ТМ и основная масса примесных белков уходила в фильтрат. Эти наблюдения повлияли на выбор последовательности технологических процессов при проведении очистки и концентрирования КВХ. Дело в том, что технология, используемая нами для работы с ВАЖ, требовала значительных временных затрат (хотя и меньших, чем при ультрацентрифужной обработке аналогичного количества материала). Сократить время обработки материала можно, если на первое место в технологической цепочке поставить микрофильтрационное концентрирование до малых объемов. При этом очистка сведется лишь к одному циклу хроматографии (напомним, что за один цикл хроматографии на используемых нами препаративных колонках можно было обработать 100 - 200 мл внруссодержащей жидкости, а затрачиваемое на это время составляло не более 1 часа). Таким образом для КВХ с содержанием общего белка менее 5 мг/мл мы применили следующую последовательность технологических процессов: префильтрация - микрофильтрационное концентрирование - эксклюэионно-хроматографическая очистка. Использование же концентрированного материала для хроматографнческой очистки также было выгодно еще и потому, что из-за значительно меньшей, чем в ВАЖ, концентрации вирусных частиц в КВХ хроматограммы неконцентрированного материала не давали выраженного пика в области свободного объема колонки, что значительно затрудняло идентификацию области выхода из колонки вирусного материала. Этой проблемы не возникало при очистке вирусных концентратов. Указанная технология была применена к следующим культуральным вирусам: вирус бешенства (3 производственных штамма), вирус везикулярного стоматита, вирус герпеса (2 производственных штамма), вирус вэл, вирус восточного энцефаломиелита лошадей, вирус лейкоза коров.

Этап префильтрации проводили также, как и в случае ВАЖ, при этом КВХ освобождалась от крупных примесей клеточного происхождения. Потерь вирусспецнфического материала после этого этапа, как правило, не наблюдалось (см. таблицу 3).

ТАБЛИЦА 3.

Очистка и концентрирование культуральных вирусов.

_Вирус_ВЭЛ-

Материал ' I объем I_Гемаг__активность-1-Белок.

I (мл) I Титр ед. ГА/ % I мкг/ мг/ %

_I_I_объем_!_I—мл-объем-

5

исходная I 10500 I 1:256 26,9X10 100 I 164 1722 100

_КБЖ_I_I___1-

„5

Префильтрат I 10250 I 1:256 26,2X10 97 I 140 1435 83

.1-1-15

Концентрат I 250 I 1:8192 20,5X10 76 I 788 197 11,5 -1-1-

5

СМЫВ С ТМ I 200 I 1:4096 8,2x10 30 I 310 62 3,6

-I-1.5

Фильтрат I 10000 I <1:2 <0,2x10 <0,7 I 76 760 44

.1-1-1.

„5

1 пик Хро- I 500 I 1:4096 20,5x10 76 I 6 3,3 0,2 -матограммы—I-1-1--

2 пик хро- I 1700 I 1:16 0,3X10^ 1,1 I 108 185 И -матограммы_I_I_I-

I_Вирус-простого-герпеса.

Материал I Объем I-Инфек.-активность-1-Белок-

I (мл) I ТЦД50/ ТЦД50/ * I мкг/ мг/ % .1_I_мл_-объем_I—мл-объем-

Исходная I 11820 I 1.0Х105 1.2Х109 100 I 2170 25655 100

Префильтрат! 11600 I — I 1930 22388 87

т г г

Концентрат I 280 I », 6 ,0X10 9 0,3X10 25 I 4703 1317 5

т X X

Смыв с ТМ I 260 I 0, ,4X10® 0.1Х109 8,3 I 2950 767 3

т X т

Фильтрат I 11320 1<0, ,2X10* <0,2X10® <0,021 1830, 20716 81

-I- л .1.

1 пик хро- I 560 X 0,4X10® 0,2X10* 17 I 7 4 0,04 -матограммы-1_I_I_

2 пик хро- I 4100 I 0.9Х103 0,4х107 0,3 I 317 1300 5 -матограммы-1_I_I_

ТАБЛИЦА 3 (продолжение)

-Вирус-бешенства-

Материал Юбъем I-Инфек__активность_I_Белок_

I (мл) Г ЛД50/ ЛД50/ % I мкг/ мг/ % -1_I-мл_объем_I_мл_объем_

5 а

Исходная I 7500 I 1,0x10 7,5x10 100 I 2310 17327 100 -КВЖ-1-_I_

Префильтрат!,7400I _ _ _ I 1950 14430 83

-I,-1-1.6 . . .8

Концентрат I 165 I 4,0x10 6,6X10 88 119600 3234 18,7

б 8

Смыв С ТМ I 200 I 0,5X10 1,0X10 13 I 4200 840 4,8

Фильтрат I 7235 1<0,1x10^ <0,1Х107 <0,1 I 1549 11214 65

-I-1-1.

,5

1 пик хро- I 550 I 5,0x10 2,7X10 36 I 41 23 0,1 _матограммы_1_I_I_

2 пик хро- I 4730 I 4,0х10Э 0,2x10® 2,7 I 675 3197 18 _матограммы_1_I_I_

х

I

Материал

Исходная --КВЖ-

Концентрат

Смыв с ТМ

Фильтрат

1 пик хро--матограммы—

2 пик хро-

-матограммы—

-Вирус-везикулярного-стоматита_

Объем I-Инфек__активность-1_Белок-

(мл)1 БОЕ/ БОЕ/ % I мкг/ мг/ %

.1-мл-

-объем-

-I_мл_объем.

2200 I 3,5X10® 7,7X10^ 100 I 746 1641 100

7 9

100 I 3,5X10 3,5X10 45 I 1310 131

б 9

100 I 2,0X10 0,2X10 2,6 I 840 84

-X.

2100 I -1-

-I.

_ I 740 1556 95 -1-

150 I -1-

_ I 13 -1-

550 I -1-

_ I 130 _I-

72

0.13

8

5

4

ТАБЛИЦА 3 (продолжение).

I_Внрус-восточного—энцеф.-лошаден-

Материал I объем I_Актнвность_в_РСК-1-Белок.

1 (мл)Г Титр ед. титра % 1 мкг/ мг/ % _I_I-/объем:-1—мл-объем-

L

Исходная 15600 I 1:20 11,2X10 100 I 1358 7610 100

_КВЖ_I-1-1---

Префильтрат!5 5 00 I 1:20 . 10,0x10^ 98 I 1160 63S0 84

Концентрат I 150 I 1:320 | 1 4,8X10^*. 43 I 1 3580 537 7

Фильтрат 15350 I <1:2 <! .ОХЮ^ <9 I 1330 7116 93

I 1 I.

1 ПИК хро- I 180 I 1:160 2,9x1 О^1 26 I 7 1,3 0,02 _маторгаммы_1-1-1-

1---Вирус—лейкоза-корон..

Материал 1 Объем!—_Актишюеть_в_РСК-1-Белок-

I (мл)1 Тигр ед. титра % I мг/ мг/ %

_1_I_/объем_I_мл_объем_

U

Исходная 19700 I 1:4 3,88X10 100 I 4,9 47530 100

СВХ-1-1--1.

Л

Префильтрат19600 I 1:4 3,84X10 99 I 4,7 45105 -95

-1-1Л

Концентрат I 201) I 1:128 2,60х 10 67 I 72 ,6 14520 31

Смыв с ТМ I 150 I 1:16 о.зоно'* 7 1 20,7 4005 8,4

I | (

Фильтрат 19400 I <1:2 <0,9х10/* <24 1 1,9 18486 39

I , . -Т.- . . .1.

1 ПИК Хро- 12000 I 1:8 1,60X10^ 4! 1 0,1 217 0,5 -матограммы-1_1_

2 ПИК хро- 15000 I <1:2 <1,0X11)'* <25 1 1,2 6080 29 _матограммы_ I-1__l_

На этапе микрофильтрационного концентрирования, как видно из таблицы 3, достигалось эффективное концентрирование культуральных вирусов. Так при уменьшении по объему в 20 - 50 раз, концентрация вирусного материала, определяемая по биологической активности, увеличивалась до 30 - 40 раз (вирусы ьэл, бешенства). При этом менее эффективное концентрирование некоторых других вирусов, по-видимому, можно рассматривать как кажущийся феномен, связанный с использованием для оценки выхода вирусного материала такого лабильного маркера как инфекцион-ность. В пользу такой точки зрения говорит и отсутствие заметных количеств инфекционного вируса в фильтрате.

Процесс мнкрофильтрационного концентрирования позволял также не только получать концентрированный вирусный материал, не и проводить дополнительную очистку, это было возможно в связи с тем, что используемый нами процесс микрофильтрации основан на избирательном удалении из суспензий низкомолекулярных соединений (воды, солен, пептидов и пр.) во-время тангенциального потока жидкости над мембранами в плоскокамер-нои фильтрующем аппарате. Об этом говорят низкие цифры содержания общего белка з концентратах вирусов. Тем не менее эти препараты были еще далеки от того, чтобы их можно было считать удовлетворительными. Применение же на третьем этапе эксклюзионной хроматографии полностью ре-иало поставленную задачу по очистке вирусной суспензии.

Для тонкой очистки сконцентрированных КВЖ использовалась препаративная колонка с указанным выше носителем; условия проведения эксклюзионной хроматографии были аналогичными. Характер хроматограмм для всех использованных концентратов культуральных вирусов был сходен с хроматограммами ВАЖ, т.е. все хроматограммы содержали два выраженных пика, один из которых находился в области свободного объема колонки, а второй определялся суммой объемов Уо и VI (см. выше). Как видно на рисунках 5в (стр. 12) и 11а,б,в,г и следует из таблицы 3, почти вся ви-русспецифическая активность и небольшая часть общего белка выявлялись в первом пике хроматограммы. Наоборот, во втором пике выявлялось основное количество белка, а вирусспецифнческая активность в этих пиках практически отсутствовала. Все это говорило о том, что в первом пике мы собирали очищенный вирусный материал, тогда как загрязняющие примеси элюировались из колонки во втором пике. Эти результаты хорошо согласуются с данными электрофореза хроматографических фракций. На рис. 12 (стр. 29), на примере вируса вэл, видно, что во фракциях первого пика (2 - 6) выявляются хорошо известные структурные белки вируса -наружные гликопротеиды £р 50 и яр 56 и, нуклеокапсидный белок С. Во

фракциях второго пика хроматограммы (7 - 11) электрофорез показывает большое количество загрязняющих белков. Результаты подобного электро-

Рнс. и. Эксклюзионно-хроматографическая очистки культуральных вирусов.

а - вирус бешенства, б - вирус восточного энцефаломиелита лошадей, в - вирус простого герпеса, г - ВИЧ; 1 - внрусспецнфнческая активность, 2 - распределение выхода из колонки белка (С}мкг/мл), 3 - хроматографическое распределение материала, поглощающего УФ-лучн при 254 нм (Т, %), по осям абсцисс - объем алюента

(V, мл).

форетического анализа позволили показать очень высокую степень очистки вируса вэл (аналогичные результаты мы получили и для всех остальных исследованных вирусов).

В заключении этого раздела необходимо отметить, что в отличие от аллантоисных вирусов, содержание культуральных вирусов в конечных препаратах сравнительно мало - оно достигает всего липь нескольких десятков микрограммов на миллилитр суспензии. Это определяется низким содержанием внрионов в исходной КВХ по сравненню с исходной ВАЖ. Между тем, в некоторых случаях требуются препараты с гораздо более высокими концентрациями, для достижения этого мы использовали ультрацентрифужное осаждение вирусных частиц из препаратов, предварительно сконцентрированных мнкрофильтрацией. Маломасштабное ультрацентрифугирование вирусных концентратов ни в коей мере не усложняло технологии получения требуемых препаратов. Интересно отметить, что при ультрацентрифугнро-вании осаждалось более 90% общего белка очищенных концентратов, что говорит о том, что этот белок входит в состав осаждаемых вирусных частиц и, следовавтельно, - о высокой степени очистки препаратов после микрофильтрации н эксклюзионной хроматографии.

--

I

ор56_ „

Зр50 —:

С-

' — ■] !

I I

12. 3 Л 5 6/ 7 8 9 10 II 1г ^

Рис. 12. Электрофорез в полиакриламидном геле белков хроматогра-фических фракций вируса ВЭЛ (внизу указаны номера фракций, слева обозначены структурные белки вируса).

3.б. Очистка и концентрирование вирусов с помощью диафильтроции

В начале предыдущего раздела мы указали, что при использование описанной технологии очистки и концентрирования возникали определенные трудности с КВЖ, содержащими более 5 мг/мл общего белка. Хотя нам и удалось применить микрофильтрационно-хроматографическую технологию для вирусов лейкоза коров н иммунодефицита человека, КВЖ которых содержали около 20% сыворотки крови (см. рис. 11г и рис. 13), концентрирование этих КВЖ протекало медленно, с быстрым забиванием пор мембран, а хро-матографическая очистка - с засорением носителя в верхней части колонки. Как видно на рис. 13, хроматография исходной КВЖ вируса лейкоза коров уже изначально выявляет материал элюируемьш из колонки первым пиком. Этот материал не может являться вирусными частицами из-за смещенности объема его выхода относительно \го. Ио эта зона перекрывается с зоной выхода вирусснсцнфического материала, а следовательно загрязняет его. Таким образом, материал первого пика хроматораммы исходной КВЖ, судя но его положению, содержит, по-видимому, агрегаты сывороточных белков, которые по своим размерам сравнимы с размерами вирусных частиц. Разделить такие компоненты с помощью эксклюзионной хроматографии представляется достаточно сложно. В случае ВИЧ нам вообще не удалось провести микрофнлырацпю исходной КВЖ с достаточной степенью концентрирования и пришлось использовать технологию, применяемую для ВАЖ. Однако, препарат Ш1Ч, полученный по технологии, применяемой к ВАЖ, был недостаточно антигенно активен и специфичен и не мог использоваться для получения диагностических тест-систем. Все ото потребовало разработки альтернативного способа очистки и концентрирования.

Аля технологической реализации этого подхода был выбран метод ди-афильтрационного концентрирования. Этот метод предусматривает постоянное или ступенчатое разбавление ВС в процессе концентрирования. Процесс диафильтрации был выбран прежде всего потому, что он удачно сочетает как очистку, так и концентрирование вирусных частиц. При этом хорошо сохраняется даже такая лабильная для Некоторых вирусов характеристика, как инфекционносТЬ. Постоянное разбавление концентрируемого материала буферным раствором препятствует образованию трудно диссоциируемых комплексов как вирусной, так И не вирусной природы при возрастании в ходе диафильтрации концентрации белков; способствует эффективному вымыванию примесей; предохраняет поры мембран от забивания. Кроме того, выбранная методика значительно проще и экономичнее по трудо- и энергозатратам н По аппаратурному исполнению ( по сравнению с методиками, использующими эксклюзионную хроматографию и ультрацентрифугиро-ванне). применяя метод диафильтрационного концентрирования, мы получили хорошие результаты как для КВХ с содержанием белка более 5 мг/мл, так и для ВС, содержащих меньшее количество общего белка.

Первым этапом обработки rio новой технологии, как и прежде, была префильтрацня. На следующем этапе (в процессе диафильтрационного концентрирования) материал подвергался ступенчатому разбавлению буферным раствором. Суммарная краткость разбавления исходной КВХ была 50 - юо кратной.

После получения диафильтрационного концентрата проводили его изучение. На рис. 14, на примере вируса бешенства, показаны хроматограммы ййрусйых концентратов, полученных с помощью микрофильтрации без диа-фАлЬТрацйй и диафильтрационным способом. Видно, что при сходном содержании вирусного материала (по величине первых пиков кривых 1 и 2) диа-фильтрацнонйо очищенный концентрат содержит принципиально меньшее количество низкомолекулярных примесей, чем микрофильтрационный, полученный без отмывания буферным раствором. Хроматограмма вирусного концентрата, прошедшего хроматографическую очистку (кривая 3) имеет сходный вид с кривой 2, но с менее выраженным вторым пиком. Таким образом видно, что применяя только днафильтрацию мы получаем вирусный концентрат не многим более загрязненный, чем при двухступенчатой обработки с помощью микрофильтрации и хроматографии.

Данные, представленные в таблице 4 показывают, что очистка по белку днафильтрационных концентратов уступает микрофильтрационно-хро-матографическим, но при этом значительно лучше (до 80 и более процентов) сохраняется вирусспецифическая активность, а следовательно - це-

Рис. 14. Эксклюзионная хроматография вируса бешенства. 1 - микрофнльтрационный концентрат, 2 - диафильтрационно очищенный концентрат, 3 - концентрированный вирусный материал, прошедший хроматографи-ческую очистку.

ценность для медицинских

31. ¿Ь 30 128 V, Мл

лостность вирусных частиц и их антигенная препаратов.

Результаты сравнительного исследования с помощью электрофореза, представленные на рис. 15 (на примере вируса бешенства), показали, что исходная КВЖ (дорожка 3) и нативные материалы концентратов, полученные по разным технологиям (дорожки 1 и 4 соответственно), отличаются только по содержанию загрязняющих белков (в случае, представленном на ри-

&-N

N5-

м -

1 г 3 А 5 б ? м

Рис. 15. Электрофореграммы препара-1 тов вируса бешенства.

1 - мнкрофильтрационно-хроматогра-фический концентрат, 2 - белки осадка микрофнльтрацнонно-хроматог-рафического концентрата, 3 - Мсход-~ ^ пая КВЖ, 4 - диафильтрационный кон-^•_ ^р центрат, 5 - белки осалка днафиль-трацнонного концентрата, ь - белки ультрацентрнфужного осадка исходной м КВЖ, 7 - препарат вируса бешенства,

полученный после ультрацентрнфуги-ропания в градиенте плотности сахарозы, М - белки-маркеры. Справа обозначены молекулярные носа белков-маркеров, слева - структурных белков вируса бешенства.

-30

ТАБЛИЦА 4.

Сравнение мнкрофильтрационно-хроматографического и диафильтра-ционного методов очистки культуральных вируссодержащих жидкостей.

I-вирус-иммукодефицита-человека_

Материал Юбъем I-Актив__в_ИФЛ-1_Белок-

I (мл) I Титр ед.титра/ % X мг/ гр/

_I_I_объем_X._мл_объем-

Л

Исходная КВЖ I 3000 I 1:40 12,3X10 100 I 5,1 15,30 100 -1-1-1-

микрофильтрационно-1 I I

хроматографический I 100 I 1:512 5,1X10^ 42 I 0,09 0.009 0,06

-концентрат-1-1-1--

диафильтрационный I 100 I 1:1024 Ю.гхЮ^ 83 I 1,2 0,119 0,8 -концентрат-1--—I-:-1_

-Вирус-бешенства-

Материал Юбъем I—Инфек.-активность-1-Белок-

I (мл) I ЛД50/ ЛЛ50/ % I мг/ мг/ %

_Г_X_мл_объем__I_мл_объем_

5 8

Исходная КВЖ 110000 I 1,3x10 13,0хю 100 X 3,1 31500 100 _I-1-1---

Микрофильтрационно-1 I ^ I

хроматографический I 200 I 1,охю 2,0x10 15 I о,2 40 0,1

-концентрат-1-1-:-1-

диафильтрационный I 200 I 3,2X10® 6,4x10й 49 I 1,7 340 1,0 -концентрат-1-1-■-1-

-Вирус-простого-герпеса-

Материал Юбъем I-Инфек__активность-Г-Белок_

I (мл) I ТЦД50/ ТЦД50/ % I мг/ гр/ %

_I_I_ил объем_I_мл_объем_

Исходная КВЖ 120000 I 3,1x10® 6,3х1010 100 I 2,1 42 100 _I-1-1-

Микрофильтрационно-1 I I

хроматографический I 300 I З.ОХЮ'* 0.9хю'° 14 I 0,1 0,04 0,09

-концентрат-1-1---1-

в к>

Диафильтрационныи I 250 I 1,0X10 2,5X10 40 I 1,3 0,34 0,8 -концентрат-1-1-1-

сунке - сывороточного альбумина в положении маркера 67 кд). Вирусспе-цифические белки в этих дорожках не выявляются в силу их низкой концентрации. Напротив, спектр белков осадков обоих концентратов практически идентичен и близок к спектру эталонного препарата вируса (дорожка 8). Интересно отметить, что после ультрацентрифугировання осадок исходной КВЖ намного сильнее загрязнен баластными белками, чем осадки концентратов. Этот факт может говорить о том, что при ультрацентрнфу-гнровании происходила агрегация низкомолекулярных белков и нх соосаж-дение с вирусными частицами. Таким образом с помощью только ультра-нентрнфугирования не всегда можно добиться удовлетворительной очистки получаемого материала.

Однако, в некоторых случаях определяющим фактором является не только чистота вирусного материала по белку, но и антигенная активность. Так нами были получены 500 кратные концентраты ВИЧ по центрифужной, микрофильтрацнонно-хроматографической и диафильтрационной технологиям, обратные величины титров в ELISA которых составляли соответственно 20480, 5120, 10240. Отсюда следует, что для целей приготовления антигенных днигностикумов диафильтрационный препарат превосходил •мнкрофильтрационно-хроматографнческий и по этому качеству приближался к центрифужному.

В заключении следует отметить, что препараты, полученные по разным технологическим схемам, различаясь по своим качествам, определяют тем самым свое применение. Так хроматографический препарат, проигрывая в антигенной активности, имеет лучшие показатели очистки по белку, диафильтрационный - обладает большей антигенной активностью и специфичностью. Центрифужный препарат имеет, как правило, преимущества и по очистке и по антигенным свойствам, но технология его производства более трудоемкая из-за использования сложного и дорогостоящего оборудования. Таким образом, для приготовления вакцин и диагностических систем наилучшим препаратом является центрифужный. Хроматографический препарат может применятся в биохимических исследованиях, диафильтрационный - в иммунологических, а также при дополнительной обработке для производства вакцин и диагностических систем, что может значительно упростить и удешевить центрифужную технологию производства.

3.6. Использование вирусных концентратов для приготовления медицинских иммунобиологических препаратов.

В целях создания нового поколения противогерпетических вакцин были приготовлены концентраты вируса герпеса. При этом использовались две технологии: микрофильтрационно-хроматографическая и днафнльтрацн-онная. Первым этапом работы было изготовление очищенной концентрированной цельновирионной вакцины, а в дальнейшем, уже на ее основе, приготавливалась гликопротеидная герпетическая вакцина. Полученые из ннактнвнрованного исходного материала вирусные концентраты проверялись на иммуногенные свойства, для этого активность сывороток животных, иммунизированных концентратами вирусов, приготовленными по различным технологиям, определялась по индексу нейтрализации. Выяснилось, что иммунногенность диафнльтрационного препарата была достоверно выше аналогичного показателя для Препарата, приготовленного микрофильтрацион-но-хроматографическим способом (логарифмы индекса нейтрализации были равны 4,75 и 3,25 соответственно), и значительно превышала иммуноген-ность коммерческой неконцентрированной герпетической вакцины (логарифм индекса нейтрализации - 2,3). Следует также отметить, что очищенная концентрированная герпетическая вакцина, полученная из днафильтрацион-ного концентрата, была безвредна, не токсична, имела большую иммуно-генность по сравнению с коМерческими препаратами. Кроме этого, она содержала значительно меньшее количество обоего белка, что позволяло стандартизовать ее по этому параметру. Применение диафильтрацин в технологии приготовления герпетической вакцины позволяло также перерабатывать Материал, который подлежал выбраковке по активности при изготовлении неконцентрированных вакцин. Немаловажным преимуществом диа-фильТрацИонной технологии при производстве указанного препарата было и то, что его себестоимость была в два раза ниже по сравнению с концентрированной вакциной, получаемой иикрофильтрационно-хроматографическим способом и в 3 - 4 раза меньше по сравнению с ультрацентрифужной технологией. В результате проведенной работы совместно с Одесским предприятием по производству бакпрепаратов была составлена и утверждена •Инструкция по изготовлению и контролю гликопротеидной герпетической вакцины".

Разработанные технологии удалось успешно использовать и для приготовления очищенных концентратов культуральных производственных штаммов фиксированного вируса бешенства с целью получения характеристик их белкового строения и стандартизации по. этому признаку. Вирусные концентраты из больших объемов получали по одной из описанной выше техно-

логий, после чего требовалось однократное ультраценрифужное осаждение полученных материалов. Вируссодержащие осадки анализировались с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, выяснилось, что используемые в 'производстве антирабических вакцин штаммы отличаются Друг от друга по изучаемому признаку. Так, в частности, электрофоретическая подвижность белка N8 производственного штамма "Внуково-32" была выше, а следовательно его молекулярная масса меньше, чем у штамма "МНИИВП 74". На основе проведенной работы были составлены "Методические требования к отечественным штаммам фиксированного вируса бешенства для производства культуральных антирабических вакцин". Другим направлением использования очищенных концентратов вируса бешенства явилось получение с их помощью моноклональных антител к гликопротеидному н нуклеоп-ротеидному белкам вируса и использование их для приготовления диагностических тест-систем к вирусу бешенства.

4. ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ.

1. Разработаны единые подходы к созданию технологических схем основанных на мембранно-хроматографнческой очистке и концентрировании широкого круга вирусов из вируссодержащих жидкостей с различными физико-химическими характеристиками.

2. На примере большого количества нозологических групп вирусов подтверждена универсальность для них физико-химических диффузионных зависимостей, описывающих процессы проникновения жестких коллоидных частиц в пористые среды (зависимость задерживающей способности ТМ (*р) от соотношения размеров вирусных частиц и пор ТМ (%) и зависимость коэфициента распределения жестких коллоидных частиц (К(1) от соотношения их размера и величины пор хроматографнческнх носителей (Л,)-

3. Оптимизированы условия препаративной зкеклюзионной хроматографии различных типов вирусов по ряду существенных параметров (высота колонок не менее 50 см., величина наносимой пробы - 1/10 - 1/5 от полного объема колонки, диаметр пор носителя 200 - 400 ни для изученных групп вирусов).

4. Разработаны и изучены режимы препаративной очистки и концентрирования на отечественных ТМ с калиброванной пористостью; (режим пре-фильтрации, режим концентрирования ВС с содержанием общего белка менее 5 мг/мл, режим диафильтрации любых ВС); определены оптимальные величины пор для работы с различными типами вирусов при различных режимах фильтрования (70 - 90 нм для концентрирования, 500 - 1000 нм для пре-фнльтрации).

5. для вирусных суспензий с различными фиэико-хикическиии характеристиками предложены конкретные вариант технологических схем иемб-ранно-хроматографической очистки и концентрирования: для аллантоисшх вс - префильтрация - эксклюзионная хроматография - микрофнльтрация; для культуральиых ВС с содержанием белка более 5 мг/мл - префильтрация -диафильтрация; для культуральиых ВС с содержанием белка менее 5 мг/мл -префильтрация - микрофильтрация - эксклюзионная хроматография, а такяе префильтрация - диафильтрация.

6. в результате применения предлозенной технологии для вируса простого герпеса разработаны подходы к созданию субъединичной герпетической ваккцнны; утверждена документация для ее производства.

7. Высокое качество очищенных концентратов отечественных вакцинных культуральиых штампов вируса бешенства, позволило охарактеризовать их для производственных целей, а такае получить с их помощью монокло-нальные антитела к гликопротеидному н нуклеопротеидиому белкам вируса.

5. СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ.

1. клюшнпк С.П., Романова Л.Н., Полюшкина Г.С., Чигиринский A.B., Григорьева A.B. Изучение производственных штаммов фиксированного вируса бешенства, используемых для производсва культуральиых вакцин. - Тезисы докладов XIX Всесоюзной конференции Института полиомиелита и вирусных энцефалитов» "Вирусы и вирусные инфекции человека". Москва, 1981, стр.. 156—157

2. Клодиик С.И., Мчедлишвнли Б.В., Зайдес В.М., Борисова В.Н. Выбор оптимального размера пор носителей типа "Вирохром" для ситовой хроматографии суспензий вируса гриппа. - Тезисы докладов 3-го всесоюзного симпозиума по молекулярной жидкостной хроматографии. Рига, 198«, стр. 165-166.

3. Жданов В.М., Мчедлишвнли Б.В., зайдес B.M., Клюпшик С.П., Бе-резин В.Э., Селимова A.M., Бреслер С.Е., Коликов В.М., Флеров Г.Н., Кузнецов В.И. Получение очищенных концентратов миксовирусов. - Молекулярная генетика микробиология и вирусология, 1984, Н Ю, стр 37-43.

4. Березин В.Э., Зайдес В.М., Мчедлишвнли Б.В., селимова A.M., Клюшник C.D., Артамонов А.Ф., Исаева B.C., Коликов В.М., Жданов В.М. сепаративное получение гликопротеидов миксовирусов и изучение их . ин-йуиогенных свойств. - Молекулярная генетика никрЬбиология и вирусология, 1985, И 7, стр 36-43.

5. Клюшник C.D., ИчедлишвиАи В.В., Березин В.З., селимова A.M., Зайдес В.М., Гайдаиович с.Я., Жданов В.М. применение миерофильтрашюн-

ной и гель-фильтрационной техники для очистки п концентрирования вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей. - вопросы вирусологии,

1985, N 5, стр. 561-567.

6. Клюшник с.ю., Береэин В.Э. Использование очищенного антигена вируса иммунодефицита человека для приготовления диагностических тест-систем и обследование на инфнцнрованность различных контингентов людей. - тезисы докладов 17-й Республиканской научной конференции молодых медиков Грузин. Тбилиси, 1986, стр. 33-34.

7. зайдес в.м., Березки р.Э., Клюшник С.Ю., Строков A.A., Марен-ннкова с.е., Мацевич Г.Р., Букркнсквя А.Г., Жданов В.М. Экспертная диагностика инфицированностк вирусом СПИД с помощью иммунного блотннга: разработка системы и оценка ее прр&хстрор. - Вопросы вирусологии,

1986, N 6, СТр. 701-706.

8. Романова Л.Н., Полшкина Г-С., Клюднцк С.Ю. Сравнительное изучение биологических свойств производственных штаммов вируса бешенства, депонирование в ВИНИТИ от 4.9.86 N 6473-В. ^ "депонированные рукописи"

1987, N 1, б/О 593.

9. Зайдес В.М., клюшник с.ю., Мчедлинвилн р.В., крзеильников ИЗ-Жданов в.м. Очистка и концентрирование вирусных суспензий методами жидкостной хроматографии и микрофильтрации. - в кн. "Методы исследования в молекулярной, общей и медицинской вирусологии". Москва, 1987, стр. 52-61.

10. Пушкарская H.A., Береэин В.Э., Клюаник С.ю., зайдес В.М., Ба-ринский и.Ф. Предварительные результаты изучения нммуногенностн субъединичной герпетической вакцины. - Вопросы вирусологии, 1987, N 2, стр. 235-237.

П. Клюаник С.Ю., Береэин В.Э., Новицкий В.А., Пушкарская H.A., Зайдес В.М., Артамонов л.*., Исаева Е.С., Баринскнй И.Ф. Препаративное получение очищенных антигенов вируса простого герпеса типа 1 и изучение их иммуногенных свойств. - Вопросы вирусологии, |988, N 1. стр. 48-51.

. 12. Селимова A.M., Береэин В.Э., Клюаник С.Ю., Шаламберидэе Т.Л., Воробьева М.С., Маренннкова С.С., зайдес В.м. Приготовление и оценка качества производственных серий подтверждающей тест-системы на ан-ти-вич (иммуноблот). - В кн. 'Фундаментальные и прикладные вопросы проблемы СПИД". Москва, 1988, стр. 162-165.

13. Трушинская Г.Н., Березин В.Э., Клюшник С.Ю., Маренннкова с.е., зайдес в.м. Маскирование антигена вируса иммунодефицита человека специфическими антителами в модельном эксперименте. - Вопросы вирусо-

- 39 -

ЛОГИН, 1989, H 6, СТр. 679-684.

14. Клюшник c.D., Зайлес В.M., Ычйдлйнвили Б.В. Гель-хроиатогра-фическая очистка вируса иммунодефицита человека. - Тезисы докладов 5-го Всесоюзного симпозиума по молекулярной жидкостной хроматографии. Тезисы докладов. Рига, 1990, стр. 184.

15. Клюшник С. 13., Мчедлнввнли Б.В., Гребенча C.B., Романова А.Н. , Баринский И.Ф. Очистка и концентрирование вируса бешенства методом ди-афилЬтрационНого концентрирования. - Вопросы вирусологии, 1991, N 5, стр. 394 - 399.

10. клюшник c.D., Мчедлиивиди В. Й. Хроматография и микрофильтрация в микроанализе вирусов. - Тезисы докладов конференции "Аналитическая химия объектов окружающей среды". СгПетербург - Сочи, 1991, стр 205.

17. Клюшник С.Й.; ИчедливнИЛй Б.В. Очистка и концентрирование вируса спид мембранными методам«. - тезисы докладов Всесоюзной конференции 'Мембранные методы разделений снесен*. Владимир, 1991, стр 91.

18. Klyushnik S.tu., Mchedlishvili в.v. Technologies of manufacturing HIV preparations. - international conference on AIDS, cancer and human retroviruses, st.-Petersburg 1992, s. 66.

6. АВТОРСКИЕ СВИДЕТЕЛЬСТВА, ИНСТРУКЦИИ, МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

t. зандес В.H., клюиник С. В., мчедлишвили Б.В., Красильннков И.В., Березин В.Э., Селнйова A.M., Хданов В.И. Очистка и концентрирование вирусных суспензий методами жидкостной хроматографии и микро-фИАьТрацнн. - МйтодИЧСские рекомендации, утверждены Учен. Сов. НИИ вирусологии АМН CCCÎ> 24.06.85, прот. H 8.

2. Новицкий O.A., Клюшник С.10., Львов H.A., Баринский И.Ф1, Зай-Аес В.М., Артамонов А.Ф., Березин В.Э., Бикбулатов P.M. способ получения! f-ликопротеидной герпетической вакцины. - Авторское свидетельство N lSÄöeiS, зарегистрировано 22.03.90.

3.. Грибенча C.B., Фуралев В.А., Клюшник С.Ю., Свешников П.Г., Баринский И.Ф., Северин Е.С. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. Musculus L., используемый для получения моноклональных антител к гликопротеидному белку вируса бешенства. - Авторское свидетельство N 1631072, зарегистрировано 01.11.90. Бюлл. N 8 от 28.02.91.

4. Грибенча C.B., Василенко О.В., Клюшник C.B., Свешников П.Г., Баринский И.»., Северин Е.С. штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus L., используемый для получения моноклональных антител к нуклеопротеидному структурному белку вируса бешенства. - Ав-

торское свидетельство N 1631073, зарегистрировано 01.11.90. Бюлл. N 8 ОТ 28.02.91.

5.Романова л.н. Григорьева A.B. Чигиринский А.Е. храпова и.с. Мо-рогова в.П. Крутилнна д.в. ишкильдин И.В. зайдес s.u. клюшник с.ю. Требования к атеотации штаммов фиксированного вируса бешенства для производства антирабнческих вакцин. - Методические указания, РД 42-28-2-91, утверждены Главным управлением мз СССР 24.01.91.

6. Новицкий S.A., Клюшник С.Ю., Львов Н.Д., Баринскнй 11.Ф., зайдес В.М. Вакцина герпетическая гликопротеидная. - Инструкция по изготовлению и контролю, утверждена Одесский предприятием бакпрепаратов Минмедбиопрома СССР Ю.07.89.