Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка и обоснование способа определениябиологической активности фитоадаптогенов намодели одноклеточных эукариот

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка и обоснование способа определениябиологической активности фитоадаптогенов намодели одноклеточных эукариот"

рГ6 од

- э ЧЮ/1 В97

На правах рукописи

СЕРЕБРЯКОВА РЕГИНА ВАСИЛЬЕВНА

Разработка и обоснование способа определения биологическом активности фнтоадаптогенов на модели одноклеточных эукарнот

03.00.23. — Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени •кандидата биологических наук

Москва 1997 г.

Работа выполнена в Онкологическом Научном Центре им. H.H. Блохина Российской Академии Медицинских Наук

Научные руководителя: доктор биологических наук Ольга Алексеевна Бочарова

(ОНЦ им. H.H. Блохина РАМН) кандидат биологических наук Ольга Николаевна Куренная. (Институт биологии гена РАН)

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Нина Борисовна Градова (РХТУ им. Д.И. Менделеева) доктор медицинских наук, профессор Владимир Михайлович Зоисков (ГНЦ - Институт иммунологии U3 РФ)

Ведущее учреждение - Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова (кафедра медицинской биотехнологии)

Защита состоится «/7^« 1997 г. в SJL часов

на заседании диссертационного совета Д 053.34.13. по защите диссертаций в Российском химико-технологическом университете им. Д.И. Менделеева (125047, Москва, Миусская пл., 9)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского химико-технологического университета им. Д.И. Менделеева

Автореферат разослан * 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биол. наук

/Ii

/ Гусева И.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Благодаря широкому спектру эффектов, направленных на нормализацию гомеостаза, фитоадаптогены (женьшень, элеутерококк, ро-диола розовая и др.) находят все большее применение как средства профилактики и терапии при многих заболеваниях [Дардымов И.В., 1967; Яременко К.В., 1990; Klm S.H et al., 1993].

Очевидно, что использование растительных адаптогенов в медицине, например в качестве иммуномодуляторов, требует стандартизации, поскольку дозы препарата могут варьировать в зависимости от активности последнего.

Известен ряд методов определения биологической активности Яитоадаптогенов In vivo [Брехман И.И., 1957; Гриневич М.А., 1964; Брехман И.И. и др.. 1966; 1968; Добряков Ю.И., 1978]. Однако подобные исследования трудоемки и экономически нецелесообразны из-за необходимости применения животных. Поэтому проблема биологического контроля данных препаратов остается весьма актуальное.

Исходя из неспецифического характера действия фитоадаптогенов, предпринимаются попытки разработать более доступные способы их биологического контроля на моделях In vitro. С этой целью использовали мембраностабилизируший эффект растительных адаптогенов, проявляющийся в снижении гемолиза эритроцитов в присутствии окисленной олеиновой кислоты (Дардымов И.В., 1976; Крендаль Ф.П. и др., 1988].

Другим объектом для выявления биологической активности фито-адаптогенов явились простейшие эукариоты - дрожжи. Ранее проведенные исследования влияния препаратов женьшеня на ростовые характеристики дрожжей S. cerevlslae показали перспективность использования данной модели для биологического контроля растительных адаптогенов (Гаврилов К.И., 1963; Юртаева Н.М. и др., 1988].

Нами было предложено градуировать активность фитоадаптогенов по уровню пролиферации медленно растущих клеток S. cerevlslae. Замедление роста возможно, в частности, при замене источника углерода, обеспечивающего наибольшие скорости роста (глюкоза), на менее предпочтительный источник - этанол. Можно было ожидать, что добавление адаптогенов в среду с этанолом приведет к ускорению прироста клеток, и при подтверждении выдвинутого тезиса - рассматривать этот фактор как характеристику биологической активности фитоадаптогенов.

Цель исследования: изучить возможность использования дрожжей S. cerevlslae в качестве тест-объекта для определения биологической активности препаратов женьшеня и родиолы розовой и разработать количественный способ биологического контроля фитоадаптоге-нов.

Задачи исследования:

1. Исследовать динамику роста клеток дрожжей S. cerevlslae в полной и минимальной питательных средах в присутствии биопрепаратов женьшеня.

2. Изучить влияние биопрепаратов женьшеня и родиолы розовой на рост культуры дрожжей S. cerevlaiae при сниженной пролифера-тивной активности последней.

3. Оценить возможность определения содержания суммарной гла-козидной фракции (СГФ) в биопрепаратах женьшеня и фенольных соединений (ФС) в биопрепаратах родиолы розовой на модели дрожжей и сравнить с результатами химического контроля.

4. Сравнить закономерности влияния препаратов из природного сырья и биомассы, полученной In vitro, на рост клеток дрожжей S. cerevlaiae.

6. Разработать количественный способ определения биологической активности изучаемых препаратов (по показателе относительной адаптогенной активности, Aadapt) на дрожжах S. cerevlslae.

6. Изучить корреляцию между относительной адаптогенной активностью и иммуномодулирувдим действием препаратов женьшаня в родиолы розовой.

Научная новизна

В результате изучения закономерностей влияния препаратов женьшеня и родиолы розовой на рост культуры клеток дрожжей S. cerevlslae при сниженной пролиферативной активности последней разработан количественный способ 'определения биологической активности фитоадептогенов In vitro на модели одноклеточных аукариот.

Показана возможность и проведено определение содержания биологически активных веществ в биопрепаратах женьоеня и родиолы розовой по изменению индекса пролиферации культуры дрожжей S. cerevlslae.

Выявленная положительная корреляция показателя относительной адаптогенной активности изучаемых препаратов с содержанием БАВ, определенным химическим и биологическим методами, а также показателем их иммунсмодулируодей активности In vivo подтверждает правомочность использования разработанного способа для количествен-

- б -

ного биологического контроля фитоадаптогенов.

Научно-практическая значимость работы

Разработанный способ позволит с учетом индивидуальной чувствительности к какому-либо фитоадаптогену объективно устанавливать курсовые дозы при использовании таких препаратов в клинической практике, в частности в онкологии. Применение его возможно при производстве данных препаратов для их биологического контроля и стандартизации. Вместе с тем предложенный способ имеет большое значение для поиска и скрининга новых Фитоадаптогенов, для которых еще не разработаны метода химического контроля биологически активных веществ, а такжэ сложных фитокомплексов.

Апробация диссертации проведена на меклабораторной научной конференции в ОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН 20 июня 1996 г.

Материалы диссертации доложены:

- на б-м Национальном конгрессе по раку (5-th National Cancer Congress), София, Болгария, 1993;

- 8-м Международном фармацевтичёском технологическом симпозиуме (8th International Pharmaceutical Technology Symposium), Анкара, Турция, 1996 г.';

7-м Международном конгрессе антираковой терапии (7-th International Congress, on Anti-Cancer Treatment), Париж, Франция, 1997;

- IV-м Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство", Москва, Россия, 1997 г.

По материалам диссертации получен патент РФ N 20Ô2300. Опубликовано 9 печатных работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методического раздела, шести глав, включающих результаты собственных исследований и их обсуадение, заключения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 118 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц, 12 рисунков. Библиография включает 197 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Культура дрожжей S. cerevlalae. В работе использовали выбранный в результате предварительного скрининга штамм дрожжей S. cerevlslae/концентрация клеток которого при культивировании на полной.среде с этанолом удваивается за время, не превышающее 5 часов.

Препараты Дитоадаптогенов. В работе использовали препараты женьшеня и родиолы розовой из природного сырья, а также из биомассы культуры тканей этих растений.

Таблица I. Сравнительная характеристика препаратов женьшеня

№ пп Сырье Конц-ия этанола <*) СГФ <*> Общее содержание Сахаров в пересчете на глюкозу (иг/ил)

I. биомасса куль-

туры тканей 20,0 ' 0,12 2,03

2. 20,0 0,3 2,14

3. 40,0 0,2 1,95

4. 40,0 0,23 1.8

Б. корень 70,0 0,07 Т |»г 1, «о

Таблица 2. Сравнительная характеристика препаратов

родиолы розовой

NN ПП Сырье Конц-ия этанола (*> ФС (*> Общее содержание Сахаров в пересчете на глюкозу (мг/мд)

I. биомасса куль-

туры тканей 20,0 0,21 2,24

2. 40,0 0,17 2,0

3. 40,0 0,2 1.9

4. корень 40,0 0,07 1,97

6. * _н_ 40,0 0,46 2,3

В работе использованы химические методы количественного определения суммарной гликозидной фракции (СГФ) - в препаратах женьшеня (ВФС, 1389} и фенольных соединений («С) в пересчете на салидрозид - в препаратах родиолы розовой 1ТУ-64-13-06-871.

Количественное определение Сахаров в растительных препаратах проводили методом газо-жидкостцой хроматографии (Нопопеп I.* 1981).

йдазотные: В работе использовали мышей-самцов литот СВА (питомник "Столбовая") массой 20-22 г.

Условия экспериментов на культуре клеток дрожжей Я. сегеу1а1ае.

Культуру клеток выращивали в течение 24 ч при 30°С на агари-зованной среде, содержащей Свктопептон, дрожжевой экстракт, глюкозу. Затем ее переносили в жидкую среду (бактопептон - 1», дрожжевой экстракт - 0,5%) до концентрации, соответствующей значению оптической плотности суспензии (Е) « 0,1 при X = 620 нм. В качестве источника углерода в инкубационные среда вносили: глюкозу (0.4%) - полная среда с глюкозой (ПСГ), положительный контроль;

этанол (2 об.*) - полная среда с этанолом (ПСЭ), отрицательный контроль; а таксе этанол с различными концентрациями ад&птогена. культивирование проводили при 30°С на качалке со скоростью 260 об/мин. Для оценки влияния на рост клеток Б. сегет1в1ае отдельных ингредиентов среды в сравнении с адаптогенами использовали минимальную среду (ЫС), содержащую (Ш4)2304: Ы^С^.Т^О; КН2Р04. Индекс пролиферации клеток дрожжей (1р) выражали как отношение конечной концентрации к посевной.

Получение ¿т^РЛ^Н* клеток. Суспензию клеток получали путем' дезинтеграции ткани селезенки с помощью гомогенизатора Поттера. Выделение из нее лимфоцитов проводили методом градиентного центрифугирования (¿даме Р., 1983].

Реакция блаеггранейошапии лимЬоиитов (РБТЛ). Суспензию лимфоцитов в концентрации 2 х 10 кл/мл культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах в течение 72 ч при 37°С в атмосфере б* С02 без митогена и с добавлением КонА (1мкг/мл). Результаты выражали величиной индекса стимуляции (18) по формуле:

1 з * бластных форм в пробе с Кон А 8 % бластных форм в пробе без Кон А

Оценка влияния изучаемых препаратов на функциональную активность Т-лимВошггов селезенки мышей при ишунодэпрэссии.

Эксперименты проводили на 3-х группах животных для каждого препарата. Мытам 1-й группы ежедневно в течение 7 дней вводили внутрибрпшнно физ. раствор (25 мкл/г веса). Животным'2-й группы в том та режиме вводили иммунодепрессант - дексаметазон в дозе I мкг/г веса (ДМ-контроль). Животным 3-й группы на фоне аналогичного введения дексаметазона в питьевую воду добавляли 2 об.Ж изучаемого препарата. Функциональную активность Т-лимфоцитов селезенки определяли в РБТЛ по их пролиферативной активности в ответ на стимуляцию политональным митогеном конканавалином А (КонА).

Для оценки влияния препаратов на функциональную активность Т-лтфзцитов на фоне иммунодепрессии вычисляли изменение индекса стимуляции для конкретного препарата относительно соответствующего ЛМ-контроля (условно Т-иммуногенная активность - Ар^):

13 препарата

^^ 1а ДМ-контроля

Статистическая обработка данных. Для расчета ошибки показателя средней, достоверности разницы между значениями использовали

статистические пакет БТАТСЛАР. Корреляционный анализ проводили по методу Бравэ-Пирсона.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИКИ РОСТА КЛЕТОК ДРСШЖЕП В ПОЛНОЙ И МИНИМАЛЬНОЙ СРЕДАХ В ПРИСУТСТВИИ БИОПРЕПАРАТОВ ЖЕНЬШЕНЯ

4 5 6 7 Время (часы)

Рис. I. Влияние на рост культуры дрожжей Б. сегетШае различных доз биоженьшеня в полной среда с этанолом при эквивалентном содержании СГФ, мкг/мл: 1 - 8; 2 - 20; 3 - 40; 4 - 80. -К - полная среда с этанолом; +К - полная среда с глюкозой

Из рис. I видно, что наиболее активный рост клеток дрожжей наблюдался в полной среде с глюкозой (ПСГ; кривая +К)> Замена глюкозы на этанол приводила к снижению роста культур:- (ПСЭ; кривая -К), что выражалось в уменьшении скорости роста от 0,4 до 0,2 ч-1. В то же время введенный в ПСЭ биоженьшень дозо-зависимо ускорял рост дрожжей. При этом наблюдалось резкое сокращение длительности лаг-фазы, даже по сравнению с положительным контролем, что, очевидно, связано с более ранним вступлением клеток в процесс деления.

Галеновые препараты фитоадаптогенов - это сложный комплекс, включающий кроме биологически активных веществ (БАВ), в данном

случае СТО, другие соединения - углевода, витамины, аминокислот ■ др.. В связи с этим необходимо было оценить, в какой степени повышение индекса пролиферации (!_) клеток дрожжей при введении адаптогена в среду с этанолом отражает влияние именно ВАВ данных препаратов.

Учитывая, что интенсивность роста дрожжей в полной среде прежде всего зависит от содержания глккозы как "фаворитного" источника углерода (Lagunas R., 1976; Fraenkel D.G., 1982], представлялось целесообразным исследовать влияние на 1р клеток дрож-' жей возрастающих концентраций глюкозы, внесенной в ПСЭ.

Таблица 3. Зависимость индекса пролиферации клеток дрожжей S. cerevlslae от концентрация глюкозы в полной среде с этанолом после 4-х часов крльтитрования <О0; п = 5)

Кон-ция f 0 глюкоза 8(конт-в среда {роль; (мг/мл) 1|-К) 0.05 0,15 0,30 0,40 0,80 1,20

Индекс 1 пролифа-3 1,56* рации,1р| 0,03 1,Бб± 0,03 1,57± 0,04 2,12* 0,03 2,26t 0,04 2,40± 0,04 2,47± 0,05

Показано (таОл. 3), что глюкоза в низких концентрациях (0,05-0,пэ изменяет 1р клэток дрозакей по сравнению с отрицательным контролем. Погашение 1р наблюдалось, начиная р 0,3

Следует отметить, что в препаратах кеньшеня и родиолы розовой содержание сахароз не превышало 2,3 от/мл. Концентрация последних в среде при внесении даже максимальных доз адаптогена (1-2 ш/50 мп среды) составляла 0,05-0,09 мг/мл. При этом (табл. 3) 1р культура не отличался от такового в среде только с этанолом. Это шкет свидетельствовать о том, что сахара, входящие в состав изучаемых препаратов, не оказывают влияния на рост дрожжей в ПСЭ.

Качественную оценку влияния препарата адаптогена на рост клеток дрожжей в сравнении или па фоне отдельных компонентов среда проводили, культивируя клетки в минимальной среде (МС) с этанолом, к которой добавляли питательные ингредиенты (дрожжевой экстракт (ДЭ), витамины, глюкозу), препарат адаптогена, а также Их сочетания. Отрицательным контролем слукила среда МС, содерка-щая этанол, положительным - среда МС, содержащая глюкозу и витамины. Результаты гфедставлены нз примере биопрепарата женьшеня, СГФ = 0,2Ж (рис. 2).

4 5 6 Время (часы)

Рас. 2. Влияние на рост культуры Б. сеге?1в1ае отдельных ингредиентов среды в сравнении с биоженыпенем: I - КС . + глпсоза (0,4%) + витамины (0,1%); 2-110-1- этанол; 3 - ЫС + этанол + витамины (О,IX); 4 - МС + этанол + биоженьшень; 5 - ЫС ♦ . этанол биоженьшень + витамины (0,1«); б - ЫС + этанол ♦ ДЭ (0,61); 7 -МС + этанол + ДЭ (0,5%) ч- биоженьшень.

Опыты показали, что максимальная скорость роста культуры дрожжей наблюдалась на среде с глюкозой (кривая I), минимальная - на среде с этанолом (кривая 2). Введение в ЫС витаминов практически не сказывалось на интенсивности роста дрожкэй (кривая 3). Рост клеток при добавлении бцоженьшеня (кривая 4) был значительно выше, чем на среде, содержащей витамины, во отставал от такового в положительном контроле (кривая I) шш на среда о ДЭ (кривая 6). Отсутствие эффекта при введении витаминов в среду о адаптогеном (кривая 5), очевидно, свидетельствует о той, что сем препарат содержит спектр последних, достаточных для роста дрожжевых клеток. Статистически достоверные различия (р < 0,05) значений 1р в случае одновременного введения в среду ДЭ и биоженьшеня (кривая 7) по сравнению с добавлением только ДЭ ¿южно отнести за счет действия специфических БАВ адаптогена. Влияние других составляющих препарата, в том числе аминокислот, витаминов, нивелируется из-за присутствия в среде такого богатого источника пита-

тельных веществ, как ДЭ. Учитывая это, для дальнейших экспериментов была выбрана полная питательная среда, содержащая ДЭ.

Оптимальные значения длительности культивирования клеток дрожжей были определены на основании анализа зависимости коэффициента вариации 1р клеток от времени культивирования. Было показано, что после 3-го часа разброс значений 1р начинает возрастать. Однако, поскольку в течение первых З^х часов различия в величине 1р при разных дозах адаптогена были незначительны (см. рис. I), для проведения экспериментов выбран 4-й час культивирования, соответствующий экспоненциальной фазе роста.

2. ИЗУЧЕНИЕ ПРОЛИФЕРАТИВНОП АКТИВНОСТИ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СОДЕРЖАНИЯ В СРЕДЕ СУММАРНОЙ ГЛИК03ИДН0П ФРАКЦИИ (ДЛЯ БИОПРЕПАРАТОВ ЖЕНЬШЕНЯ)

Рис. 3. функциональная зависимость индекса пролиферации клеток дрожжей 3. сегетШае от содержания СГФ в среде ра 4-й час культивирования (биоженьшень, СГФ = 0,2%)

При изучении характера влияния биопрепаратов женьшеня на рост клеток дрожжей выявлено, что зависимость 1р клеток от содержания СГФ в ПСЭ на 4-й час культивирования в интервале исследованных доз адаптогена представляет собой обратную параболу (рис. 3), списываемую уравнением:

у = а +Ь.*5 (I),

где г - значение 1р клеток в пробе о биокеньаенам: ж - абсолютов содержание СГФ в объема биоженьвевя, введенного в среду культивирования (Ар), мг; в « 1,86 - значение в отрицательном контроле (-К), где активность настойки равна нулю; Ь - неизвестный параметр, подлежащий определению по данным эксперимента. Следовательно, уравнение (I) имеет вид:

1р- 1,86 + Ъ.*ЯГ (2)

На основании этого уравнения и данных более 100 экспериментов с различными препаратамиь по которым построен грефос на рас, 3, методом нелинейной регрессии получили значение Ь * 0,672 * 0,08. Таким образом, уравнение (2) приобретает шц:

1р» 1,86 + 0,672.У2р (3)

Поскольку экспериментальному определению подлежит 1р, а ио-комую величину представляет Ар, т.е. в данном случае содержание СГФ, то, сделав соответствующе преобразования, получаем: (VI.se)2

<У1»

0,327.

ТЩ5) И).

где 7 (мл) - объем внесенного препарата адаптогена, ыд; Ар - выражается в мг/ил 2

ш* (1р-1.Вв) хоо> ■

0,327 .У(МКЛ)

где У(мкл) - объем внесенного препарата адаптогена, ши; А_ - выражается в % на единицу объема.

В связи с вариабельностью биологического состояния клеточной культуры, а, следовательно, а значений 1р в положительном и отрицательном контроля* (без адаптогенов) от опыта к опыту, в полученную формулу (5) был введен коэффициент качества культурь (К^), который вычисляли следующим образом:

(1р(+К)"

—££— 16)\

где 1р(+ю» Ар(-К) " КН^0КС пролиферации на 4-й час культивировании в положительном и отрицательном контроля! конкретного эксперимента, соответственно; 5,86 - значение выражения ' 1р(_К)0рг)2 в оптимальном случае, установленное на основании экспериментов со всеми изучаемыми препаратами.

Таким образом, окончательная формула для определения содержания СТО в биопрепаратах женьшеня биологическим путем имеет вид;

- 1,86) V 0,327-Ккк-7(МКЛ) '

100»

(7)

Дм доказательства спещфтчности разрабатываемого способа изучено влияние возрастают! концентраций глпсозы, внесенной в ОСЭ, ю рост клеток дрожжей после 4-х часов культивирования (рис. 4).

Из рве. 4 следует, что графах, описывающий зависимость 1р= КС), где 0 - концентрация глшозы в среде, имеет вид кривой насыщения, определяемой формулой:

V Kg1*0*? * гда К| » 2.62S Kg » 0,Сб (8)

Очевидно, что кривая насыщения отличима от обратной парабола. полученной при внесении в ТЮЗ возрастающих доз биоженыаеня.

3,0

2,5

2,0

1.0

г Т-1 П Ü

кт J

[

«

01234 567 8 Концентрация глюкозы в среде, мг/мл

Рйс. 4. Зависимость индекса пролиферацот S. ceravlslae от uut цантрации глюкозы в полной среде с этанолом на 4~Э час культмьн-рования

Следует отметить, что в основе предлагаемого спосоОа определения содержания БАВ в изучаемых препаратах хеш"/, вероятно, ait тавация адаптогеном роста дроааей в процессе глужокеигвнэг.а, ко г да источником углерода в среде является этанол. В слу^ео содержания в среде культивирования других источников углерода, в част-

ности глюкозы, происходит смена метаболического пути их усвоения на гликолиз и, следовательно, формула (7) становится недействительной.

3. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ РОДИОЛЫ РОЗОВОЙ

НА РОСТ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ Б. сегвт1в1ае Установлено, что зависимость 1р клеток дрожжей от содержания фенольных соединений (ФС) биопрепаратов родиолы розовой в ПСЭ на 4-й час культивирования подобна зависимости, полученной 'для био-«еньшеня (формула I) с той разницей, что коэффициент Ь при радикале в данном случае имеет значение 0,486 * 0,06 (рис. 6).

Рве. 5. Функциональная зависимость индекса пролиферации клеток дрожжей Б. сегеу1з!ае от содержания ФС в среде на 4-й час культивирования (биородиола, ФС=0,2Ж)

Таким образом, уравнение, описыващее ату зависимость, имееЧ-вид: 1р= 1,86 + 0,486>У£Г . (9), .

где 1р - значение 1р клеток дрожжяй в пробе с биородиолой; Аг абсолютное содержание ФС в объеме бжякныа?Ея, введенного в среду культивирования, мг; 1,86 - значение 1р в отрицательном кантреле (- К), где активность настойки равна нулю;

Результатом преобразований (как описано для биоженьшеня) явилась следующая формула для определения содержания БАВ в биопрепаратах родиолы розовой:

- 1В -

(1р-1,86)*

100* (Ю)

* 0,24<Кзд-7(ккл) Такт образом, используя результаты прироста клеток дрожжэ! на 4-й час культивирования и формулу (10), с удовлетворительной степенью достоверности можно определить содержание ВДВ в данных препаратах.

4. СРАВНЕНИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ ВЛИЯНИЯ ПРЕПАРАТОВ ИЗ ПРИРОДНОГО СЫРЬЯ И БИОМАССЫ, ПОЛУЧЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИМ ПУТЕМ

2,8

!2,б

2,4

2,2

ё

I 2,0

1,8

О 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 Содержание БАВ в среде, мг/50мл

Рас. б. Функциональные зависимости индекса пролиферации клэток дфогвей от содержания соответствующих БАВ препаратов из природного сырья в ПСЭ на 4-3 час культивирования: I - СГФ (препарат яаныюня): 2 <ВС (препарат родаолы розовой)

• 0 целью оценки корректности применения разработанного способа для анализа активности препаратов из природного сырья были проведены эксперименты по определению зависимостей 1р клеток дрожжей от содержания соответствующих БАВ препаратов натурального явнызеня (СГФ=0.07*) и натуральной родаолы розовой (ФС=0.07*) в ПСЭ на 4-й час культивирования (рис 6).

Оказалось, что искомые зависимости имеют вид обратных парабол, которые описываются следующими уравнениями: 1р- 1,86 ♦ 0,570.УХрапл1аг - для натурального

женьшеня

ip- 1,86 + О.ЛЭО.УХу^ ^ - для натуральной

родаолы розовой Следовательно, выражения для определения БАВ препаратах будут иметь вид: .

(V1 .в6)2 ___

1 nAt ---Е--.100%

T»n-nat 0#32 . у(мкл)

(L-1.86)2 -rnoa.nai 0>24 t v(MWI)

Сравнив данные выражения с формулами (7) и (10), можно сделать вывод об их практической идентичности, т.о. полученные коэф-фидаенты в формулах для гомблогичных адаптогенов (из природного сырья и биомассы) совпадают.

Таким образом, приведенные результаты показывают, что вышеописанным способом можно количественно определять активность конкретных адаптогенов в пересчете на специфические вещества.

6. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ШТОАДШГОГИЮЗ НА КУЛЬТУРЕ ДРОЖЖЕЙ s. cererlsiao Представленные результаты позволили прэдяоЕЕТЬ критерий сравнения биологической активности различных фатаздаптогонов.

Таблица 4. Сравнение активностей биопрепаратов хшьшэня & родиолы розовой, определенных различными методами

(И) (12)

в данных.

(13),

(14)

Активность препарата Вид препарата

биояеньшень бдородиола

Химический контроль % активного вещества 0,12 СГФ •0,23 СГФ 0,21 ФС 0,17 ФС

Биологический контроль 0,11± 0,04 СГФ •н мое ООО 0,20* 0,03 ФО 0,16* 0,05 ФС

Aadapt {%) 24,3t0,2 35,6*0,3 33,2*0,2 28,2*0,5

Принимая за максимум в выбранных условиях культивирования рост дрожжей на среде с глюкозой, за минимум - рост на среде с этанолом, относительную адаптогенную активность (адаптогенность) препарата (А а(1арг) определяем как меру повышения адаптогеноы 1р _ -ган0л0М> выраженную в процентах: ^р(ехр) ~ *р(-К

клеток в среде с этанолом, ^dapr

1р(+К)

-Ж

ХР(-К)

100%

(15),

гд6 ^(ехр)' *р(+К)' ^(-К) ~ значения 1р клеток дрожжей в инкубационной среде с оцениваемой дозой препарата, а также в положительном и отрицательном контроля!, соответственно.

Поскольку в данном случае 1р вычисляется для одной дозы препарата в нескольких повторностях, необходимым условием является контроль содержания Сахаров.

Разницу между 1р клеток дрожжей при максимальном (+К) и минимальном (-К) росте привяли за 100» или за одну условную единицу адэптогеняости (УЕА). Следовательно, А£ц1ар4 допустимо выражать в % или в долях УЕА.

С целью оценки корректности использования показателя А^р^ для биологического контроля фитоадаптогенов некоторые биопрепараты женьшеня и родиолы розовой были охарактеризованы по содержанию БАВ с помощью химического и биологического анализов, а также по величине Аайарг с учетом формулы 15 (табл. 4).

Из табл. 4, следует, что между перечисленными параметрами существует положительная удовлетворительная корреляция (г - + 0,68 * 0,12).

Таким образом, используя предлагаемый способ, можно определять биологическую активность различных фитопрепаратов в единых величинах. Последнее позволит сравнивать препарата из разных растений, а также сложные фитокомплексы.

6. ИЗУЧЕНИЕ КОРРЕЛЯЦИИ ИЕВДУ ОТНОСИТЕЛЬНОЙ АДАПГОГЕННОИ

АКТИВНОСТЬ!) И ИММУНОЫОДУЛИРУВДЕВ АКТИВНОСТЬ!) ПРЕПАРАТОВ ЖЕНЬШЕНЯ И РОДИОЛЫ РОЗОВОЙ

Таблица 5. Влияние препаратов женьшеня и родиолы розовой на функциональную активность Т-лимфоцитов на фоне иммунодепрессии (11*0)

Препарат Индекс стимуляции (18)

Контроль ДМ-контроль ДМ * препарат

Женьшень нат. (СГФ=0.07*) 4,8 * 0,2 2,6 1 0,3 5,3 ± 0,5

Биожанывень (СГФ=0.23*) 7,9 * 0,8

Родиола нат. (ФС=0,46) 4,7 » 0,1 1,9 » 0,4 7,1 1 0,7

Виородиола (ФС=0,17Ж) 4,8 * 0,2

Исследование функции Т-лимфоцитов селезенки мышей на фоне

иммунодепрессии показало (табл. 5), что введение ДМ приводит к резкому снижению (по сравнению с контрольной группой) npcxrajepa-тивной активности лимфоцитов. Применение фитоадаптогенов на фоне ДМ в той или иной степени восстанавливало данный показатель (р < 0,01 для всех препаратов).

Из рис. 7, на котором представлены изученные параметры для каждого из препаратов, видно, что самые высокие показатели биологической активности (Aadapt) 1л vitro и иммувомодулирулцей активности (A/jjjj,) In vi yo характерны для родиолы натуральной (50,4*0,4 и 3,7 соответственно), саше низкие - для женьшеня натурального (20,5i0,2 и 2,0 соответственно). Препараты биоженыпень и биоро-днола шеш промежуточное положение по этим показателям.

Рис. 7 Сравнение препаратов женьшеня и родиолы розовой по адаптогенной - Аааар1. (а) и иммуномодулирупцей - А^ (б) активностям: I - женьшень натуральный; 2 - биоженьшень; 3 - родиола натуральная; 4 - биородаола.

В результата корреляционного анализа оказалось, что между Аас1ар1; и Аг1гп существует вполне..достоверная;, и довольно сильная положительная корреляция.(Г - +0,72 * 0,114 р<0,05). „

Тэкад. образом, с фдной стороны,' :адаптрЬййая.'активность ^асйарг* стит.ельщйс■. препаратов коррелирует с содержанием .БАВ,

определенным химическим в биологическим способами. С другой - с показателем их ишуномодулирувдей активности. Следовательно, разработанный способ определения относительной адаптогенной активности правомочен для количественного биологического контроля фи-тоадаптогенов.

ВЫВОДЫ

1. Скорость роста культуры дрожжей S. cerevielae повышается пропорционально концентрации препарата адаптогена в среде на фоне сниженной пролиферативной активности клеток.

2. функциональная зависимость индекса пролиферации клеток дрожжей S. cerevlalae от содержания БАВ препарата фиоадаптогена в полной среде с этанолом на 4-й. час культивирования является индивидуальной характеристикой растительного адаптогена независимо от источника сырья (природного или "культурального"). ■

2.1. функциональная зависимость индекса пролиферации клеток дрожжей от содержания СГФ (для биопрепаратов женьшеня) в среде о этанолом на 4-й час культивирования является обратной параболой о определенным коэффициентом при радикале (Ь-0,572).

2.2. Для биопрепаратов родиолы розовой выявлена аналогичная зависимость, но с другим коэффициентом при радикале (Ь=0,490).

2.3. Функциональные зависимости индекса пролиферации клеток дрожжей от содержания БАВ в среде культивирования для препаратов из природного сырья и биомассы, полученной In vitro, совпадают.

3. Разработан способ количественного определения содержания специфических веществ в препаратах женьшеня и родиолы розовой биологическим путем.

4. Разработан количественный способ определения биологической активности фитоадаптогенов (по показателю относительной адаптогенной активности Aadapt), заключающийся в оценке ускорения роста клеток дрожжей на энергетически бедной тюде в присутствии адаптогена и позволяющий сравнивать различные фитопрепараты.

б. Содержание биологически активных веществ препаратов женьшеня п родиолы розовой, определенное химическим и биологическим методами, коррелирует с относительной адаптогенной ахтивностью.

6. Относительная адаптогенная активность препаратов женьшеня и родиолы розовой коррелирует с показателем их ишуномодулирувдей активности In vivo (восстановление функциональной активности Т-лимфоцитов селезенки мышей на фоне иммунодепрессии, вызванной введением дексаметазона).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Серебрякова Р.В., Александрова И.В. Культура ткани родио-лы розовой - продуцент биологически активных веществ. // Материалы конф. "Современные направления развития биотехнологии". -Москва. - 1991. - с. 35.

2. Бочарова О.А., Куренная О.Н., Серебрякова Р.В., Бодрова Н.Б. Новый способ биологического-тестирования препаратов адапто-генов. // Биотехнология. - 1993. - H 8. - с. 28-34.

3. Bocharova 0., Serebrlakova R. Expérimental prophilaxie of herelitory tumoura In mice by Rhodlola roaea administration. // Abstracts of 5-th National Cancer Congress, Sofia, Bulgarla. -1993. - p. 105,

4. Бочарова O.A., Серебрякова P.B. Испытание препаратов растительного происхождения для профилактики и нетоксической терапии онкологических заболеваний на экспериментальных моделях. // Вестник РАМН. - 1994. - N 2, о. 62-55.

5. Bocharova 0., Kurennaya 0., Serebrlakova R.t Phlllppova T. Blological Control for Adaptogene Actlvlty of Plant Préparation. // Abstracta of 8-th International Pharnaceutlcal Technology Symposium, Ankara, Turkey. - 1996. - p. 153-154.

6. Бочарова O.A., Куренная О.Н., Косиков К.В., Серебрякова Р.В., Бодрова Н.Б., Зацепина Г.Н. Способ биологического контроля адаптогенов. // Патент РФ N 2062300. - 1996. - 10 с.

7. Бочарова О.А., Серебрякова Р.В., Филиппова Т.Г., Фигурин К.М., Матвеев Б.П. Перспективы использования фитоадаптогенов для профилактики рака мочевого пузыря. // Материалы IV-го Российского национального конгресса "Человек и лекарство", Москва, Россия. -1997, с. 248.

8. Бочарова О.А., Фигурин К.М., Серебрякова Р.В., Филиппова Т.Г., Барышников A.D; Коррекция препаратом Rhodlolae rosea адгезии клеток уротелия и иммунного статуса у больных поверхностным раком мочевого пузыря. Индология. - 1997. - Н 1. - с. 51-55. •

9. Bocharova 0,, Figurin К., Serebrlakova R., Phlllppova T. Rhodlola rosea lnnunotherapy of superficiel bladder cahcer. // Abatracts of 7-th. International Congress on Anti-Cancer Treatment, Paris, France. - 1997* - p. -183.