Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка хроматографического метода получения концентрата фактора IX из плазмы донорской крови

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Дереза, Татьяна Леонидовна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы. «Место хроматографии в технологиях получения лекарственных средств».

1.1. История хроматографии как способа разделения смесей.

1.2. Технологии, используемые при фракционировании плазмы донорской крови.

1.3. Технологические и экономические аспекты внедрения хроматогра-фических процессов фракционирования донорской плазмы.

1.4. Особенности применения хроматографических технологий для выделения минорных компонентов плазмы.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Сырье и материалы.

2.2. Методики измерения.

Глава 3. Обсуждение результатов.

3.1. Разработка хроматографического процесса выделения фактора IX из плазмы донорской крови.

3.1.1. Изучение факторов, влияющих на хроматографический процесс выделения фактора IX как минорного компонента плазмы донорской крови.

3.1.2. Сравнительный анализ спсобов осуществления хроматографического процесса получения фактора IX и его оптимизация.

3.2. Масштабирование хроматографических процессов выделения минорных компонентов донорской плазмы.

3.2.1. Изучение факторов, определяющих масштабирование процесса хроматографического выделения фактора IX как минорного-компонента плазмы.

3.2.2. Масштабирование процесса выделения концентрата фактора IX на пилотной установке.

Список сокращений.

СЗП - свежезаморженная плазма донорской крови

КСН - криосупернатант плзмы донорской крови

КП - криопреципитат плазмы донорской крови

FIX - фактор IX системы свертывания крови

FVIII - фактор VIII системы свертывания крови

FVII - фактор VII системы свертывания крови

FX - фактор X системы свертывания крови

FII - фактор II системы свертывания крови

VWF - фактор Виллебранда системы свертывания крови

ME - международная единица активности

DEAE - группа - диэтиламиноэтильная группа

Na3Cit - трехзамещенный цитрат натрия

Gly -глицин

EtOH - этиловый спирт

ПЭГ - полиэтиленгликоль

А - активность

Ауд. удельная активность

НЕТР - height equivalent of a theoretical plate, высота, эквивалентная теоретической тарелке

As - asymmetry factor, фактор асимметрии

Т i/2 - период полувыведения или период полужизни

IVR -in vivo recovery, восстановление активности фактора

Ig - иммуноглобулин

PPSB - протромбиновый комплекс

N - нагрузка на сорбент, МЕ/ мл геля

ВЭЖХ - ысокоэффективная жидкостная хроматография

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка хроматографического метода получения концентрата фактора IX из плазмы донорской крови"

Актуальность работы.

Плазма донорской крови представляет собой уникальную систему, состоящую из нескольких сотен различных белков, многие из которых могут быть использованы для терапевтических целей.

В настоящее время в России в качестве лечебных препаратов из плазмы донорской крови выделяют, главным образом, альбумин и иммуноглобулин.

В то же время известен целый ряд белков, так называемых минорных компонентов плазмы, обладающих лечебной эффективностью. Это, в первую очередь, факторы свертывания крови VIII и IX антигемофильного действия.

В России до настоящего времени отсутствуют собственные технологии получения препаратов на основе минорных компонентов плазмы донорской крови. В связи с этим терапия больных гемофилией в отсутствие необходимых антигемофильных препаратов осуществляется криофракциями плазмы: криоп-реципитатом и концентратом нативной плазмы, использование которых является малоэффективным из-за недостаточно высокого содержания в них активного компонента (факторов VIII и IX) и наличия большого количества балластных белков. Кроме того, клиническое применение этих компонентов плазмы донорской крови несет опасность передачи вирусных инфекций, главным образом, гепатита и ВИЧ-инфекции. Обеспечить больным гемофилией эффективную терапевтическую помощь, безопасную в отношении вирусных инфекций, возможно только созданием собственных технологий получения препаратов из плазмы донорской крови.

Целью настоящей работы является изучение факторов, влияющих на процесс хроматографического выделения фактора IX как минорного компонента плазмы донорской крови и разработка на их основе одностадийного метода получения антигемофильного лекарственного препарата концентрата фактора IX.

Задачи исследования:

1. Установление факторов, определяющих оптимальность осуществления хроматографического процесса выделения фактора IX как минорного компонента плазмы.

2. Разработка одностадийного метода метода выделения концентрата фактора IX на основе изученных факторов.

3. Выявление определяющих критериев масштабирования процесса хроматографического выделения концентрата фактора IX.

4. Масштабирование процесса получения концентрата фактора IX в условиях пилотного производства.

5. Изучение состава препарата концентрата фактора IX «Агемфил В» и оценка клинической эффективности его применения при терапии гемофилии В.

Научная новизна исследования.

1. В результате проведенных исследований впервые выявлен характер влияния на процесс хроматографического выделения минорных компонентов плазмы следующих факторов: специфической активности целевого компонента в исходном сырье; нагрузки на сорбент по специфической активности целевого компонента; значений рН и ионной силы исходного сырья и буферных растворов; типа иона, используемого в буферных растворах; концентрации стабилизаторов в буферных растворах, что позволило найти оптимальные условия проведения процесса.

2. Установлен характер влияния при масштабировании хроматографического процесса выделения концентрата фактора IX характеристик хроматографической колонны, а именно, высоты, эквивалентной теоретичекой тарелке и фактора асимметрии, а также параметра линейной скорости элюции, что позволило определить оптимальные условия работы пилотной установки.

3. Изучением состава получаемого препарата концентрата фактора IX с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии, коагулологических и иммунофоретических методов подтверждено его соответствие требованиям, предъявляемым к препаратам данного типа.

Практическая значимость.

1. На основе изучения факторов, определяющих оптимальность процессов хроматографического выделения минорных компонентов плазмы, разработан одностадийный метод выделения концентрата фактора IX системы свертывания из плазмы донорской крови. Новизна полученных результатов подтверждена патентом РФ № 2163140 «Концентрат фактора IX системы свертывания крови и способ его получения» от 20.01.2001 г.

2. Осуществлено масштабирование лабораторного метода хроматографического выделения концентрата фактора IX в условиях пилотного производства, что позволило увеличить производительность процесса до объемов, достаточных для серийных наработок лекарственного препарата «Агемфил В» концентрата фактора IX.

3. По результатам исследований разработан опытно-промышленный регламент на производство препарата «Агемфил В», утвержденный 14.06.2001 г.

4. Полученные результаты легли в основу технологической схемы процесса получения препарата концентрата фактора IX с интеграцией в условия действующих производств препаратов плазмы.

Апробация работы. О результатах исследования доложено на международной конференции «2-d Plasma Products Biotechnology Meeting» (11-14 мая 2001 г., Мальта).

Внедрение в практику. Результаты исследования внедрены в практическую работу экспериментального производства препаратов плазмы ГНЦ РАМН.

Публикации: по материалам дисертации опубликовано 11 работ.

Объем и структура диссертации: диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы (103 наименования). Работа иллюстрирована 16 таблицами и 14 рисунками. Материалы изложены на 105 страницах машинописного текста.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Дереза, Татьяна Леонидовна

Выводы.

1. Сравнительный анализ сорбционных свойств по отношению к фактору IX плазмы донорской крови двух промышленных слабоосновных анионио-обменников показал, что одностадийный хроматографический процесс получения концентрата фактора IX может быть реализован с использованием в качестве сорбента ионообменника DEAE-Toyopearl.

2. Установлен характер влияния на процесс выделения фактора IX как минорного компонента плазмы донорской крови условий его проведения, в том числе: нагрузки на сорбент по специфической активности фактора IX, рН и ионной силы сырья и буферных растворов, природы иона, используемого в буферных растворах, природы и концентрации стабилизаторов в буферных растворах, что позволило выявить оптимальные условия хроматографии.

3. Выявлены определяющие критерии масштабирования хроматографического процесса выделения концентрата фактора IX, а именно: характеристики хроматографической колонны, в том числе высота, эквивалентная теоретической тарелке (НЕТР) и фактор асимметрии (As) и линейная скорость элюции, что позволило осуществить масштабирование процесса в условиях пилотного производства с использованием промышленной системы «BioProcess» при объемах переработки СЗП от 25 до 100 л за серию.

4. Показано, что концентрат фактора IX, получаемый по разработанному методу со средним выходом, по по данным 33 серий, 76 %, по своим характеристикам соответствует требованиям Фармстатьи на препарат «Агемфил В», а именно: специфическая активность не менее 12 МЕ/мл; концентрация ионов Na + не более 260 ммоль/л; концентрация общего белка не более 0.45% и удельная специфическая активность, в среднем, 4.8 МЕ/мг белка.

5. На основании изучения фармакокинетических особенностей и оценки риска тромбогенности концентрата фактора IX даны рекомендации для его широкого использования в лечебных целях с целью оптимизации гемоста-тической терапии у больных гемофилией В.

93

6. Разработана технологическая схема процесса получения первого отечественного антигемофильного препарата «Агемфил В» с ее интеграцией в действующую схему фракционирования плазмы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Дереза, Татьяна Леонидовна, Москва

1. Фрайфелдер Д. Физическая биохимия. М.: Мир, 1980. - 585 с.

2. Остерман Л. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот,- М.: Мир, 1985.-360 с.

3. Protein Purification. 2-d edition. J.-С. Janson, L. Ryden (Eds.). New York: Wiley -Liss, 1997. - 696 p.

4. Березин И.В. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии. М.: Мир, 1988. - 687 с.

5. Separation of Plasma Proteins. J. M. Curling (Ed.). New York: Acad. Press, 1982. - 228 p.

6. Methods of plasma protein fractionation. J.M. Curling (Ed.). New York: Acad. Press, 1980 - 326 p.

7. Sofer G. K., Nystrom L.E. Process Chromatography. A Practical Guide (2-d Edition).- New York: Acad. Press, 1994. 100 p.

8. Sofer G.K., Nystrom L.-E. Process Chromatography. A Guide to Validation. (2-d Edition). New York: Acad. Press, 1994 - 79 p.

9. Burnouf T. Chromatography in plasma fractionation: benefits and future trends // J. Chrom. B. 1995,- № 664, pp. 3-15.

10. Goss N. H. New plasma products opportunities and challenges // Abstr. «1st Plasma Products biotechnology meeting».- Queensland, Australia.-2001, pp. 6-8.

11. Cohn E.J., Strong L.E., Huges W.L. et al. Preparation and properties of serum and plasma proteins. IV. A system for the separation into fractions of the protein and fluids // J. Am. Chem. Soc. 1946,- № 68. - pp. 459-475.

12. Blood Cells and Plasma Proteins: Their State in Nature. J.L. Tullis (Ed.).- New York: Acad. Press.- 1953, pp. 1-58.

13. Newman J., Johnson A.J., Karpatkin M.H., and Pusskin S. Methods for the production of clinically effective intermediate and high-purity factor-VIII concentrates // Br. J. Haematol. 1971,- № 21, pp. 1-20.

14. Poison A. A theory for the displacement of proteins and viruses with polyethylene glycol // Prep. Biochem.- 1977.- №7,- pp. 129-154.

15. Burnouf T. Integration of chromatography with traditional plasma protein fractionation methods // Bioseparation I.-1991.- p. 383-396.

16. Kasper C.K., Lusher J.M. Recent evolution of clotting factor concentrates for hemophilia A and В // Transfusion.- 1993,- Vol. 33,- № 5:- pp. 422-434.

17. Анастасиев В.В. Иммуноглобулины для внутривенного введения. Нижний Новгород: Изд-во НГМА,- 2000,- С. 42-50.

18. The Plasma Proteins. F.W. Putham (ed.), New York: Acad. Press.-1975,- Vol. 1,2.

19. Foster P.A., Zimmerman T.S. Factor VHI structure and function // Blood reviews. 1988,- № 1. - p. 1-12.

20. Burnouf-Radosevich M. and Burnouf Т. Chromatographic preparation of a therapeutic highly purified von Willebrand factor concentrate from human cryoprecipitate // Vox Sang. 1992. - № 62. -. - pp. 1-11.

21. Tech L.-C., Froger M. Direct capture of plasma factor VIII:с by ion-exchange chromatography // Vox sang.- 1994. № 67. - pp. 8-13.

22. Josic D., Stadler M., Gruber G. et al. Process development of a highly purified, native Factor VIII / von Willebrand Factor concentrate // DownStream. -2001. Special issue. - pp. 18-20.

23. Michalski C., Bal F., Burnouf T. and Goudemand M. Production and properties of a solvent-detergent-treated factor IX concentrate // Vox Sang.- 1988. -№55.-pp. 202-210.

24. Chandra S. Evolution of coagulation factor concentrates: biotech-nological breakthrough of immunoaffinity chromatography using monoclonal antibodies // Abstr. «1st Plasma Products biotechnology meeting».- Queensland, Australia, 1999. pp. 12-14.

25. Kim H.C., McMillan C.W., White G.C., et al. Purified factor IX using monoclonal immunoaffinity technique: clinical trials in hemophilia В and comparison to prothrombin complex concentrates // Blood.- 1992. № 19- pp. 568-575.

26. Liu S., Addiego J., Gomperts E. et al:. A plasma factor VIILc concentrate purified by immunoaffinity. In: Biotechnology of plasma proteins. Stoltz J.F. and Rivat C. (Eds). 1989. - № 175,- pp. 263-270.

27. Brettler D.B., Forserberg A.D., Levine P.H. et al. Factor VIIIx — concentrate purified from plasma using monoclonal antobodies: human stidies // Blood. 1989. - № 73. - pp. 1859-1863.

28. Zimmerman T.S. Purification of factor VIII by monoclonal antibody affinity chromatography // Semin. Hematol.- 1988. № 25. -pp. 25-26.

29. Morfini M., Rafanelli D., Filimberti E. et. al. Protein content and factor Vin complex in untreated and monoclonal factor УШ concentrates // Thromb. Res. 1989. - № 56. - pp. 169-178.

30. Weinstein R.E. Immunoaffinity purification of factor VIII // Ann. Clin. Lab. ScL 1989,- № 19. pp. 84-91.

31. Prince A.M., Horowitz В., Horowitz M.S., Zang E. The development of virus-free labile blood derivatives a review // Eur. J.Epidemiol.- 1987. - № 2. -pp. 103-118.

32. Suomela H. Multiple forms of human factor IX in chromatography and isoelectric focusung // Thromb. Res 1975. - № 7. - pp. 101-112.

33. Suomela H. Purification of human factor IX by chromatography of a coagulation factor concentrates // Thromb. Haemost.- 1976. № 35. - pp. 211221.

34. Osterud В. Purification and some characteristics of human factor IX. In: Proceedings of the fourth international congress on thrombosis and haemosta-sis, Vienna, Austria. 1973. - p. 141.

35. Clark D.B., Menache D , Gee D.M., Mekka S.I., and Drohan W. Coagulation factor IX for replacement therapy in hemophilia В patients. In: Proceeding of the Biotechnology of plasma Proteins, Colloque INSERM. 1989. - № 175. -pp. 315-324.

36. Andersson L.-O., Borg H., Miller-Andersson M. Purification and characterization of human factor IX // Thromb. Res.- 1975. №7. -pp. 451-459.

37. Pepper D.S., and Prowse C. Chromatography of human prothrombin complex on dextran sulphate agarose // Throm. Res. 1977. - № 11. - pp. 687692.

38. Sewerin K. Human coagulation factor УШ. Purification, characterization and biological interactions // Comprehensive Summaries of Uppsala Dissertations from the Faculty of Pharmacy. University of Uppsala. -1987.

39. Ganz P. R., Tackaberry E.S., Palmer D.S. and Rock G. Human factor УШ from heparinized plasma. Purification and characterization of a single-chain form // Eur. J.Biochem. 1988. - № 170. - pp. 521-528.

40. Van Creveld S., Veder H.A., Pascha C.N. et al. The separation of AHF from fibrinogen // Thromb. Diath. Haemorrh.- 1960. № 4. - pp. 211-217.

41. Austen D.E.G. The chromatographic separation of factor VHI on ami-nohexyl-sepharose // Br. J. Haematol.- 1979. № 43. - pp. 669-74.

42. Foster P.R., Dikson I.H., McQuillan T.A. et al. Studies on the stability of FVIII: с during the manufacture of a factor VHI concentrate for clinical use // Vox Sang. 1988. - № 55. - pp. 81-89.

43. Thorrell L. and Blomback В. Purification of the factor VIII complex // Thromb. Res. 1984. - № 35. - pp. 431-450.

44. Ingerslev J. Assessment of murine immunoglobulins in monoclonal antibody purified factor VIII concentrates. In: Replacement Therapy in Haemophilia. Problems and Solutions. Mannucci P.M. (Ed).- University of Milan.- 1989. -pp. 131-133.

45. Burnouf Т., Constans J., Clerc A. et al. Biochemical and biological properties of an alpha-1-antitrypsin concentrate // Vox Sang. 1987. - № 52. -pp. 291-297.

46. Menache D., Grossman B.J., and Jackson C.M. Antithrombin Ш: physiology, deficiency, and replacement therapy // Transfusion. 1992. - Vol. 32. - №6.-pp. 580-588.

47. Vinazzer H. Clinical Use of Antithrombin III Concentrates // Vox Sang. 1987. -№ 53. - pp. 193-198.

48. Winkelman L., Smith J.K. Pilot production of AT-III concentrate for clinical use in England (Abstract) // Nouv. Revue Fr. Hemat. 1983. - № 25. - pp. 279.

49. Abildgaard U., Lie M., 0degard O.R. Antithrombin (heparin cofactor) assay with 'new' chromogenic substrates (S-2238 and Chromozym TH) // Thromb. Res.- 1977. -№ 11.-pp. 549-553.

50. Feldman P. and Winkelman L. In Blood separations and Plasma Fractionation. J.R. Harris (Ed.). New York. - Wiley-Liss. - 1991. - pp. 341-383.

51. Thaler E., Sschmer G. A simple two-step isolation procedure for human and bovine antithrombin II/III (heparin cofactor): a comparison of two methods // Br.J.Haematol. 1975. - № 31. -pp. 233-243.

52. Bolton-Maggs P.H.B. et al. Production and therapeutic use of factor XI concentrate from plasma // Thromb. Haemost. 1992. - № 67. - Suppl. 3. - pp. 314-319.

53. Briggs N. et al. A decade of experience with a factor ХШ concntrate // Thromb. Haemost. 1997. - Suppl. June. - pp. 35-36.

54. Унифицированная методика определения FVHI (по результатам исследования рабочей группы союзной проблемной комиссии «Патология гемостаза») // Гематология и трансфузиология. 1991. - № 11. - С. 31-33.

55. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991. - 466 с.

56. Фетисова JI.B., Вязова Е.П., Хаметова Р.Н. с соавт. Выделение концентрата фактора IX из криосупернатанта донорской плазмы // Гематология и трансфузиология. 1991.- № 6,- С. 34-36.

57. А.Е. Платонов. Статистический анализ в медицине и биологии.-М.: Изд-во РАМН, 2000. 51 С.

58. Ажигирова М.А., Фетисова Л.В., Дереза Т.Л. с соавт. Процесс получения препарата фактора IX: постадийное изучение фракционного состава // Проблемы гематологии 1997.- № 4, С. 20-24.

59. Дереза Т.Л., Фетисова Л.В., Адрианова В.А. Усовершенствование способа выделения концентрата фактора IX из плазмы донорской крови // Новое в трансфузиологии,- 1998,- Вып. 22,- С. 31-35.

60. Дереза Т.Л., Фетисова Л.В., Вязова Е.П. с соавт. Концентрат фактора IX системы свертывания крови и способ его получения // Патент РФ № 2163140 от 20 февраля, 2001 г.103

61. Dereza Т., Berkovski A., Ajiguirova M. The first in Russia experience of the use of large-scale chromatography in production of plasma protein preparations // DownStream.- 2001,- Special issue. p. 49-51.

62. Опытно-промышленный регламент на получение препарата «Агемфил В», утвержденный 14.06.2001 г.

63. Дереза Т.Л., Фетисова JI.B., Плющ О.П., Штильман М.И., Ажигирова М.А. Хроматографический способ получения препарата «Агемфил В» и оценка его клинической эффективности // Новое в трансфузиологии. -2002.-Вып. 29.-С.51-53.