Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

РАСПРОСТРАНЕНИЕ ТЕРМОФИЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ РОДОВ BACILLUS И THERMUS В ГОРЯЧИХ ВОДНЫХ ИСТОЧНИКАХ АЗЕРБАЙДЖАНСКОЙ ССР

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "РАСПРОСТРАНЕНИЕ ТЕРМОФИЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ РОДОВ BACILLUS И THERMUS В ГОРЯЧИХ ВОДНЫХ ИСТОЧНИКАХ АЗЕРБАЙДЖАНСКОЙ ССР"



МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи АХМЕДОВА Фараят Рамазан Кызы

РАСПРОСТРАНЕНИЕ ТЕРМОФИЛЬНЫХ БАКТЕРИЕЙ РОДОВ BACILLUS И THERMUS В ГОРЯЧИХ ВОДНЫХ ИСТОЧНИКАХ АЗЕРБАЙДЖАНСКОЙ ССР

Специальность 03.00.07 — микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1991

Работа выполнена на кафедре микробиологии Бакинского ордена Трудового Красного Знамени государственного университета им. М. А. Расулзаде.

Научный руководитель — заслуженный деятель науки, доктор биологических наук, профессор Г. С. Касимова.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук, профессор С. В. Летунова; кандидат биологических наук, старший научный сотрудник И. Н. Скворцова.

Ведущее предприятие — Университет дружбы народов им. П. Лумумбы.

Защита диссертации состоится «' » ¿ъ^Сл/Ц^.....

ми

1991 года в «7 7» часов на заседание г ециализированного совета К 120 35 06 в Московской сельср- озяйственной академии им К. А Тимиряч--»

Адрес 127550, Л» Тчь тя ул , 49, сек-

.ХА . . . 1991 г.

Мосина

тор защиты диссер-С диссертацие!

Авторефера -*

Ученый! специализирон кандидат биол

." ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблема. Характеристика микробиоты термальных источников дает информационную базу для возможного контроля >эа их естественным состоянием, не нарушенным антропотехногендам воздействием; Горячие водше источники Азербайджана в этом от-Йошении предоставляют исключительно благоприятные объекты, как »кологически чистые модели природной среда, где присущее им своеобразие экосистемы, ненарушенность биологических циклов,' отсутствие вагрязненияза счет различных абиогенных и биогенных факторов пока, как бы находятся на уровне естественного мониторинга. В связи с вт»4 знание качественного состава микрОбоиеноза• горячих источников Азербайджана представляется чрезвычайно важным для оценкии эффективного контроля за их состоянием, исследование же биологических особенностей основных представителей микроорганизмов способствует познанию группы термофилов. • Цель исследования. . Изучить видовой состав микробоценозов термальных водных источниковкшюго склона Большого Кавказа -(Ханш, Халтан, Джими-1, Джими-2, Гкэбулаг, Огланбулаг) и Малого Кавказа (НижнийИстасу, Верхний Истису, Багырсаг, Дарыдаг) на территории Азербайджана. Для достижения цели ставились следующие задачи: . ■ . . У

- выделить и идентифицировать термофила „ епорообразующие и неспорообразугоцие бактерии из 10 горячих вод т 'источников Азербайджана; -4'> изучить морфолого-культуральдае особенности и ультратонкое строение.выделенных термофильных культур;

- определить физиологические особенности (потребность в

- I

ЦЕНТРАЛЬНАЯ НЛУЧМ/.П .'ОТЕКА

к I. К. /« Ти^ирклеза Инз. КзДл

источниках С и ь ферментативную активность - протеолитичес-кую) и динамику роста при периодическом и непрерывном культивировании. Изучение.сосредоточить на наиболее специфических термофильных формах бактерий.

Научная новизна. Впервые выделены и изучены термофильные бактерии 10 горячих водных источников АзероаЦджана (Хаши, Хал-тан, Дкими-I, Джими-2, Огланбулаг, Гызбулаг, Верхний Истису, Нижний Истису, Багырсаг, Дарыдаг), имеющих нейтральную или слабощелочную реакцию среды. Показано, что наряду со спорообразую-ЩИМИ бактериями (Bac.stearotheiirophilus, Вас.с^гси1апа,В&с.те-gatenum, Bao.zaesentericUb,Sac.sabtlliB,Bao.ce.reUE^)a3BHBanTCH и неспорообразувщие, относящиеся к экстремально-термофильным бактериям тьегаив flavue и умеренно термофильным бактериям mermus ruber (бактерии рода Theimufc были ввделены только из источников Верхний Истису, Багырсаг). Все бактерии ввделены в чистую культуру.

Показано, что в условиях непрерывного культивирования скорость развития и накопления биомассы iiercus ruber, штамм Ко, значительно выше, чем при перлодическоы культивировании. Данные представляют интерес для практики.

Сведения о качественном и количественном распространении спорообразующих бактерий рода Ba^xiiua и не образующих спор бактерий рода ihereua дают информационную баау о благополучном состоянии источника а могут слуга?ь методом контроля эффектов, возк«1ь.авю1Х в природной среде в результате непреднамеренного воздействия на нее человека, а также при разработке целенаправленного преобразования природных условий.

Практическая ивнность. Создана коллекция термофильных спорообразующих бактерий - cei-.btebxjcbarfflppi.ilua, Еис.с^гсЛ.апы,

Bac.megaterium, Bac.meeentericUB, Bac.sxibtilis, Bac.cereus а,также неспорообразутаих экстремально-термофильных T.fiavus и умеренно-термофильных it,ruber. Бактерии могут быть использованы в научно-исследовательской работе, в том числе со студентами- на кафедре микробиологии Бакинского Государственного Университета им.М.А.Расулэаде. Особый интерес к выделенным культурам определяется их способностью продуцировать физиологически активные ведаства, в частности ферменты, а также способностью т.ruber вырабатывать литические вещества.

Выявленный факт литического воздействия бактерий '¿.ruber в отношении живых и мертвых клеток кишечной палочки позволяет сделать заключение о существовании у них активного литического комплекса ферментов, обеспечивающих им экологиадекие преимущества в условиях среды обитания. ,

Апробашя у. публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ. Результаты диссертации представлялись на IX республиканской научной конференции аспирантов вузов Азербайджана (1987); школе-семинаре молодых ученых к специалистов, посвященном 70-летмз образования Азербайджанского Государственного Университета (1989); и П Всесоюзном семинаре АН Каз.ССР (Алма-Ата, 1989). '

: Об^ем и структура. Диссертапия изложена на 96 страницах мгшшнописного текста и состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка литературы« содержащего 121 наименований работ, в том числе 64 зарубежных авторов. В работу включены 4 таблицы и 32 рисунка.

■ Автор выражает искреннюю благодарность профессору Г.С. Кастовой за повседневное руководство диссертационной работой; профессору Л.Г.Логиновой за оказание консультации при выполне-

юга работы; руководителю группы по культивировании микроорганизмов Института микробиологии АН СССР М.П.Ховрвчеву и кандидату биологических наук В.Т.Тередачу за руководство работой по непрерывному культивированию бактерий rubers младшему научному сотруднику Института микробиологии Г.И.Храпцовой аа консультации при определении систематического положения термо-■¿ильных бактерий; зав.лабораторией сектора Микробиологии АН &зерб.ССР Х.Г.Ганбарову .за помощь при проведении работы по определению ДДК бактерий.

ОВЬЕПЫ И МЕТОДЕ! ИССЛЕДОВАНИЯ

Термофильные бактерии выделили из 10 горячих источникдв юашого склона Большого Кавказа и Малого Кавказа (территория Азербайджана). Источники отличаются температурой, рН среда, солевым составом.

Для выделения термофильных спорообразувшнх бактерий из источников брали пробы по 2 л воды, фильтровали через ыеибран-ныа фильтры № 2, затем фильтры переносили в пробирки с 10 ыл стерильной водопроводной воды. После перемешивания I ил водлой суспензии вносили в 20Й-кый картофельно-пептонный отвар с 0,01;$ дрожжевого экстракта. Для выращивания бактерий на качалке (230 об/мин, температура 55°С) использовали колбы Зрленмейэра емкостью 100 ыл. После двух посевов из накопительной односуточной культуры делали посев на картофедьно-пептснн/о а иясо-пептон-нуи агаризованные средн. Чашки Петря помещали во атажнув камеру и Еьщеряивали в терыистато при 50, 60 и 70°С а течение 2-х суток.

Для выделения hp ооразумих споры термофильны* бактерий

из источников брали по 3 л воды, фильтровали через мембранные фильтры № 2, затем фильтры переносили в пробирки с 10 мл стерильной водопроводной воды. Из последнего разведения делали посев в количестве 10 мл на среду Виноградского для 1-й фазы нитрификации с целью обнаружения умеренно-термофильных бактерий ihermus ruber, с внесением в нее 0,01% дрожжевого экстракта, и на мясо-пептонный бульон, разбавленный в 5 раз (Логинова с соавт., 1977), а с целью обнаружения экстремально-термофильных бактерий т.xiavus , в среду вносили 0,2/6 дрожжевого экстракта.

Рост культур проводили в колбах Эрленмейера■емкостью 250 мл в стационарных условиях, при температуре 50, 60 и 70°С в течение 2-х суток для экстремально-термофильных бактерий, и

суток в случае умеренно-термофильныхi

Идентификация вццелешаос бактерий проводили по определителю Берги {9-е изд., 1980) и монографиям Л.Г.Логиновой с соавт. (1966,1977). Дня определения систематического положения спектрофотометрически определен нуклеотиддай состав ДНК по методу Волшна и Партье. Для этого использованы 0,5 н раствор КСН, б я 67%-ная хлопая кислоте, спектрофотометр СФ-4.

Для получения гигантских колоний производили посев точеч-нш уколом в картофельно-пептонный агар в чашках Петри. Куль-туральные признаки гигантских колоний описывали после 2...3 дней юисубации при оптимальной температуре роста умеренно-термофильных (55..,60°С) и экстремально-термофильных (70..,75°С) бактерий; Форму, размер и подвижность*клеток определяли в одно-суточных культурах на картофельно-пёптонном агаре и б...8-часовых культурах. - в жидкой картофельной среде. Для окраски жгутиков использовали метод Леффлера в модификации Пешкова. Споры

окрашивали по методу Дорнера (Касимова, Бабаева, 1975).

Для установления оптимальной температуры роста посев делали точечным методом, выращивали при температурах от 40 до 75° с интервалом в б°С на картофельной агаризованной среде. По величине колоний судили о благоприятной для роста культуры температуре.

Для выяснения влияния рН среды на рост бактерий использовали МПВ, разбавленный в 5 раз и картофельно-пептонный бульон с добавлением агар-агара. Выращивали при 55°С в течение 3-х суток. По величине колоний судили о благоприятных для роста, значениях рН среды. ' ' ' ,

Для выяснения отношения бактерий к источникам углерода и; азота их выращивали на дидкой минеральной среде Смита (табл.1), обогащенной 0,1% пептона. В качестве источника углерода исполь-, зовали глюкозу, сахарозу, лактозу, глицерин, маннит, сорбит.

Из солей органических кислот - уксусную, пировиноградную, яб-. * . . . ' лочную, янтарную, щавелевую, лимонную кислоты. Источники углерода использовали; в количестве 0,5/Î. Из источников азота использовали пептон, триптои, мочевину, кко^, ('hh4)2so4' в количестве 0,5^, а таюке аминокислоты мётионин, треонин, лейп?ш, валин, глутамин, аспарагин в-¿соличеотве 0,1?. О развитии бактерий судили по оптической плотности на 5ЭК-Б6 при длине волны Б40 НМ. . ■ . ' " . • .'.'•• ' , .',

. Кинетика роста s.rubérг изучена в условиях периодического и непрерывного культнвкровгишя.. Использовали среды 5 и 6 (табл. '

. 2). • . yvv./;V v!^.

s Для роста культуры в непрерывных условиях использована среда № б. Опыты проводили в ферментерах ."Eiotoo" (Шзеция). • емкостью 4 л, которые были снабжены автоматическим регулирова-

Таблица I

Состав сред для культивировагая бактерий штамм КБ

Среда Смита (г/л) Среда № 5 (г/л) Среда № б (г/л)

(HH^JgHPo^ МПБ- 100 мл : МПБ - 200 мл .

КС1 - 0,2

Mgso4 Глицерин - 5 Глицерин - 5

Дрожжевой экстракт Дрожжевой экстракт (кн^)2нро^

Вода дистиллирован- Вода водопровода. -аспарагин - I нал - I л -1л

рН 7,6 900 мл Kgso^ - 0,2

рН 7,6 Дрожжевой экстракт -

Вода водопровода. -900 мл

рН 7,8

нием рН и аэрацией. Объем среды - 2 л. Пробы отбирали каодые 3 ч. Об интенсивности роста культуры судили по увеличению оптической плотности, которую измеряли на ФЭК-56 и по сухой биомассе.: "

Время генерации у неспорообразушдах термофильных бактерий определяли по формуле:

(ц - t ) е - ................—•

1о£Яц - logm^

где . (tyt¿) отрезок времени; пц-т0 - биомасса эа это же время. .

. Для выявления способности гидролизовать крахмал, разжижать желатину,, пептонизировать или свертывать молоко использовали общепринятые методы (Большой практикум по микробиологии,

под ред.Селибера, 1962; Логинова с соавг., 1956,1977).

Для определения активности литических ферментов использовали турбодешетрический метод. По снижении оптической плотности суспензии клеток, инкубируемых с фильтратом культураль-ной жидкости в оптимальных условиях для действия литических ферментов, судили'об их активности. Инкубации проводили в пробирках при 70°С от II) мин до 1-го ч. В качестве контроля использовали суспензия живых и мертвых ¡Снеток о добавкой буфера вместо ферментного раствора. Измерения проводили в кюветах толщиной I см при длина волны 540.нм.

Фиксацию бактериальных клеток проводили по методу Ритер с соавт. (Hyter et ai., 1958). УльтратонЕИв срезы получали на ультрамикротоме фирмы ькв . 8800, затем, контрастировали их 25&-ным уранилацетатом и докрашивали 1%-ным нитратом свинца. Просматривали препараты на электронном ыикроскойе JEM-I00 в фирмы JÏUL при ускоряющем напряжении 80 кв.

Количественный и качественный состав термофильных -•'... бактерий в термальных источниках Малого и Большого Кавказа Азербайджана '

Численность термофильных бактерий в разных источниках • колебалась в пределах 20,..30/тыс.клеток в I мл. Доля каждого из ввделенных представителей термофилов' в различных источниках была разной5(рис. 1.2).:Примерно Ю.,.20& от принятых условно,-' 100£ всех микроорганизмов.;'в воде 'источника бшщ нз цдеитафщи-ров&пные преимущественно спорообразующиэ бактерии. Всего нами . была выделена 161 культура' (из Bcei; 10 источников) из них IIQ были спорообразующдми: (род Еас111иа)^' .. 43отнэсены к роду Sbexcue (2о - ï.ruber, 17 — X.fiavue).V ':.' :.'•;•''-v "•К'':.': Следует отметить, что спорообразующиэ бактерии дсминиро-• - 8 .;.■ "

Верхний Нотису

Нижний Исжу

багыгсаг

I бас. эШМЬеш^йиз

Дарыдаг

Васпш-Ьшп

\/!Ш\

Ш5ЕШЗ Бас

Ш2Ш (кссмЫв

: , Распределение, {$) термофильных бактерий в источниках

.. Малого Кавказа Азербайджана (исходя из 10056 - без • учета доли неидентифицированных бактерий, составляю: - •, вих, в: среднем, 10...20^ всего количества бактерий).

V' -- 9 -

1 crrrzn Вас suWiks Г^ГГЗ бас Ci«us bat тгйаЧтлг

Рво.2. Распределение? (%) термофильных бактерий а источниках Болыаого Кавказа Азербайджана (исходя из iQOi - без учета доли неидентифицизованньос бактерия, сссгавдяо-тас, в средней, общего 4>!сла бегга

-10 -

вали практически во всех источниках, кроме 2 источников Малого Кавказа, где распространены бактерии рода Thermus. Из остальных термальных источников эти бактерии не были виделены. Вероятно, это связано с более низкой температурой, а также наличием в некоторых из них повышенного количества таких микроэлементов, как сера и мышьяк, тормозящих развитие данных бактерий.

Разные источники Малого и Большого Кавказа существенно различаются по видовому составу бактерий и специфичности рас-» пределения виной (рис.1,2).

Спорообразующие бактерии найдены во всех источниках, имеющих разный химический состав Стабл.1). Следует отметить, что ' в источниках с более высокой температурой от 52 до 72°, как правило, всегда присутствовал вид Bac.etearothermophilue, имеющий оптимальную температуру роста Бб-бО^С.

В источниках с более низкой температурой от 35,5-48° наиболее распространенными видами являлись Bac.mesentericus и Bac.subtilis.

Неспорообразующие формы, относящиеся к роду Thermus были обнаружены тольхо 8 двух источниках Малого Кавказа - Верхнем Исгасу о температурой 72° и рН 9,0 и Вагырсаге с температурой 64°врН7,0. • V

Характеристика внделенгак тврмофильных бактерий

В диссертации приведено описание типовых культур выделенных бактерий: Bao.eteerotheiBophilus" (яТЖММ 16); Bec.circulane (втамм 21);, Bfce.megateriuai (штамм 49)';Eac.m«eonterieue («яамм 7); Bac,Eubtiiis (niTaMM 54); Bac.cereua (штамм 28); ,'■ Ibermue ruber (штамм Кб); l.ilavus (штамм Eg). Подробно изучены их;культуральные и морфологические особенности при росте

на разных питательны?" средах. Представлены фотографу« гигантских колоний, клеток под световым микроскопом и зчектронномик-роскспические фотографии. Отмечены те особенности культур, которые отличают термофилов от мезофилов или не совпадают с известными в литературе данными. Так, у спор juc.^ttorot. eico-philus обнаружен необычно толстый внешний электрошюплотный слой и четко выраженная слоистость лекаж го под ним слоя.

Приведено описание, такке физиологических осооенностей изученных культур (отношение к источникам угчерода, азота, температуре, рН и т.д.).

Наиболее детально и всесторонне изучен нами Г.ruber, несколько менее - sr.xia.vus. Всего было выделена 1'? -птаммоа вкстремально-гермофильных бактерий i.riuvu., и ¿6 ууаренно-термофидьных - Т.ruber.

Колонии 1.ruber круглой формы, <5лестнвшв, компактные, гладкие со слегка неровными краями, очрашвнк в ярко-красный цвет.

Морфология клеток - палочки с округлыми концами, размерами 4,7 мкм х 0,6...О,8 мкм. В определенные стадии развития, а именно а активной фазе роста бактерии приобретают вид нитей. Бактерии i.x-аЪвг представляют собой грамотрицателыше палочки, неподвижные, не образующие спор. Клетки способны образовывать капсулы на среде с картофельным отааром с добавлением 0,65« глицерина. Состав ДНК: 63,5 мол, %.

Электрснномикроекопическле исследования тонких срезов Т. ruoer подтвердили, что клеточная стенка у бактзрий этого род», как было показано ранее (track, Ld-лвгйз, 1970), состоит из "складчатой" наружной ыембрлны, подстдлавдегс ее фибриллярного материала и тонкого гигидного слоя. Все это ьыгдяд.!? так. Клат

- 12 -

Рио.З, Схема строения клеточной стенки т.ruber. Вверху -внешний jид клетки (очертания клетки даны штрихом), клеточная стенка которой вследствие инвагинаций имеет вид как бы состоящей из отдельных "шиноподобных" отсеков. Стрелкой показан возможный срез через клетку (видно, что срез слева проходит не через клетку, а через клеточнуо стенку; справа то же на конце срез идет через отсеки клеточной стенкл (это и определяет появление на рисунках 19-22 необычной, состоящей как бы из банэновидных структур клеточной стенки, а также расположенных в линейной последовательности как бы "пустых" клеток в "хвостовидной" части клеток. Особенно что хорошо еидно на рисунке вверху).

ка, как бы окружена клеточной стенкой, разделенной на шинопо-добные отсеки, причем "шины"-отсеки разной толщины (рис.3). Последние возникают вследствие того, что клеточная стенка (ее поверхностный слой) инвагинирует "кольцами" к внутреннему ригидному слою, примыкающему к цитоплазматической мембране. Здесь возникают своеобразные зоны адгезии, ранее известные^ только у грамположительных бактерий* Наличие таких зон облегчает транспорт веществ через клеточную стенку (Логинова с со-авт., 1973). Мы полагаем также, что это увеличивает поверхность соприкосновения клетки е окружающей средой* - •

X.ruber хорошо развивается на различных сахарах. Лучшими источниками углерода являются лактоза и глицерин, хуке усваи- < ваются глюкоза, маннит и сорбит. Из солей органических кислот лучи» усваиваются соли щавелевой и пировиноградной кислот.

Из источников азота лучншми являются сернокислый аммоний

и пептоя. Из аминокислот" наиболее благоприятны для г.ruber

глутамин, валин и аспарагин. Изучена скорость роста бактерии

I.ruber. Показано, что наибольшая удельная скорость роста

(м ) - 0,25 г.. Время генерации у бактерий т.ruber - 58 мин у пах

При изучении динамики роста культур т.ruber показано, что максимальная биомасса образуется к 12 и роста (составляет 1,8 г/л).

Кинетика роста i.rube* в условиях периодического и непрерывного культивирования

В условиях периодического культивирования использовали две различные до составу среды (табл.I). Ори росте бактерий на »той среде длительность лагфазы составляет б ч. В дальнейшем (до 9 ч) резко повышается скорость роста с Д равным 0,20. Пос

ле 9 ч скорость роста ааыодляется до Ь = 0,06 и культура продолжает расти с :рлГле низкк: значением и- до 21 ч. После 21 ч происхо^/.т лизис '-легс:'. Данный позволяют сделать вывод, что ограничение ^ оста, ьоа"С-"ЛО, происходит велздстзие не оптимальных условий культ.'Егровашя. 3 далыейаем, прл исследовании кинетики роста была использована среда о, более обогаяенная пита-тельнщгл веществами. Данные прздставлены на рисунке 4, Показано, что лаг-^аза длится 3 ч, от 3 до 6 ч фаза ускорения роста, экспоненциальная фаза от 6 до 15 ч сравным 0,25 В далывйшьм рост тормозится и после 21 ч происходит лизис клеток.

В таблице 2 приведена оптическая плотность культуры и ее биомасса. Показано, что чачсимальнал биомасса культуры наблюдается к 21 ч - 2,5 г/л. Однако следует отметить, что уже к 12 ч балтерля проявляла наибольшую активность (биомасса равна 1,6 г/л), в дальнейшем ее увеличение происходило медленнее.

Таким образом, мотшо сделать вывод, что среда б более благоприятна для роста культуры. На этой среде проведены опыты в услош"х хемостата (табл.3). После выращивания культуры в периодических условиях с течвние 12 ч, т.е. до логарифмической фазы, включали подачу плтатальной среды и устанавливали проток со скоростью разбаалешш Х> »0,25 Посла установления стационарной фазы О ) при каждом режима отбирали на менее трех проб и проводи»' соответствующие измерения.

Важный фактор, хиглиздий на рост термофильных бактерий -содержание растворенного кислорода в среде, особенно при повышении температуры, Билл испытаны 3 режима аэрации пр.: ^-члич-.кых оборота*. ъ-чи и соотношения подачи воздуха нз рабочий объем фермантзра: 500 об/мин и подача воздуха 2:1; 300 об/мин

Рис.4. Кинетика роста ihermue ruber, игам* Кб, при Периодическом культивировании иа среде » 6. I- оптическая плотность {(XI); 2 - lg СП; 3 - удельная скорость

-■:•:-<. рОСТа ( íf *, ). •■"•..■

.С/.

Таблица 2

Днчашша рал вития х.гиь-х, аггамм Кб при периодическом ,:удьт.1Е:грога!г.:и на сре ,з б

Часы роста рг! Оптическая плотность Сухая биомасса, г/л

3 8,1 0,02 0,6

б 7.0 0,04 0,9

9 7,4 0,07 1,3

12 7,45 0,13 1,8

15 7,25 0,22 1.9

18 7,25 0,43 2,4

21 7,2Ь 0,50 2,5

24 7,25 0,46 2,3

Таблица 3

Влияние аэрации и скорости протока на рост Т.гиЪег, штамм Кб в условиях непрерывного культивирования (температура опыта 55 °С, рН среды 7,8)

Вариант а, час"1 Аэрация, об/мин, воздух (общий объем среды) Оптическая плотность (вд.показа телей ¿ЭК)

Ч 0,15 500; 2:1 0,57

о *« 0,15 300; 1:1 0,45-0,39

3 0,15 700; 2:1 0,60

4 0.1& (-г0,5£ глзцер-ша) 700; 2:1 0,60-0,90

5 0,25 700; 2:1 0,57

и 1:1; 700 об/мин и 2:1. Снижение аэрации с 500 об/мин при . подаче воздуха 2:1 до 300 об/мин и 1:1 вызывало падение оптической плотности от 0,57 до 0,45-0,39, что свидетельствует о лимитировании роста культуры кислородом. При усилении аэрации (до 700 об/мин) и подаче воздуха (2:1) оптическая плотность повышалась до 0,60, то есть аэрация свыше 500 об/мин фактически не влияла на рост культуры и в этих условиях недостатка кислорода но было.

С целью определения лямитируювего фактора к культуре, растущей в стационарном режиме при з = 15 было внесено 0,Ь% глицерина. Уже через 2 ч после импульсной добавки дополнительного источника углерода оптическая плотность достигала 0,80, а через 4ч- 0,90. После исчерпания глицерина плотность, снижалась до исходного уровня (до внесения глицерина). Следовательно, лимитирующим фактором при культивировании в хемоста-те а.гиЪег - источник углерода.

Поскольку при периодическом культивировании ^ Шех не превышало 0,25 ч"1, были проведены опыты по уточнению максимальной скорости роста. Оказалось, что при повышении £ до 0,25 не наблюдалось вымывания культуры и содержание биомассы было как и при в, равном 0,16"^. Снижение режима аэрации до 500 об/мин при й - ч-1, таете не уменьшало количество биомассы, что подтверждает ранее установленный факт отсутствия лимитирования кислородом» Отсутствие снижения количества биомассы при к « 25 ч-1 показало, что максимальная удельная скорость роста культуры вше значений, наблюдаемых при культивировании в периодических условиях. Вероятно, низкие значения >

в периодических условиях объясняются неоптимальным составом среды и накоплением продуктов метаболизма, отрицательно влияю-

оши на скорость госта бактерий уже в ранних стадиях развития. При проточном ультиви^овагош вследствие вымывания метчоолитов их отрицательное деРстш<о на с сор~сть роста менее выражено, поэтому культкз! рованле можно вести при Э, больаих, чем максима-:^ iua скорости роста для периодических культур.

И.ак, для гетерономного рс^та культуры трзбуется интенсивная иэрация. В условиях прогоччсго культивирования культура достигает больней удельной скорости роста, чем при периодичес-ко I.

Для качуче(ля сольлей скорости роста и биомассы культуры Необходимо »..uter культивировать в непрерывных условиях. Из-CdOTHO БСЗГО .гве рабоы (aoometb, 19Ь2; borr.leiter et ul., 1964), проведенные С ;.a4uaticua в условиях непрерывного куль-тивлрованля.

Яитическиэ свойства 2.ruber

По..иано, что i.rate-, хтамм Кб, активно лизируют киеыз и мертвые кльткл гриме«дательных бактерий L.coli. О литичес-кой активности ¡^тьтуры судили по изменению оптической плотности суспензии клехо.. ja отрезки времени от 10 до ЬО мин. Лизис осуществляли ф.1льтраг.ыл культуральной жидкости бактерий Т.ruber.

К/дьт/ра *.rubel спосоона за 50 мин лизировать живые клетки L.coli на а мертвые - на 41,2% (табл.4). При

более длительном времени (60 м*ш) процент разрушенных гшвых и мертвых клеточ незначительно увеличивается. Данные согласуются с литературным.'. (..г.г; иоиа с соавт., 1975), в частности, с тем фактом, '.тс мертвые клетки лизируатсч активнее живых. Очевидно, яитичеегч). ь/тл^юсть бактерий рода ihercua дает им зкологи-

Таблица 4

Лизис клеток Escherichia coli фильтратами культуральной жидкости I.ruber, штамм Кб

Лизис живых клеток, % (Лизис мертвых клеток, %

В] ремя, мин

10 j 20 i 30 40 | 60 60 10 20 j30 140 150 60

5,5 9,2 17,1 26 35,2 36,4 7,8 12,5 21,2 28,5 41,2 43,7

ческие преимущества перед другими формами, этой способностью , не обладающими, и является одной из причин, обусловливающих их способность развиваться в источнике с низким содержанием органических веществ, поскольку они сами могут обеспечивать себя питанием за счет лизиса сосуществующих в источнике бактериальных форм. '

- \ • , ' ВЫВОДЫ . 1 ■

1. Впервые дана качественная и количественная оценка состава термофильных микроорганизмов 10-ти экологически чистых термальных водных источников Азербайджана (Хаши, Халтан, Джими-I, Джими-2, Огланбулаг, Гызбулаг, Верхний Истису, Нижний Иста- ; су, Багырсаг^ Дарьщаг), как информационная основа для контроля возможных антропотехногенных воздействий при целенаправленном преобразовании природных условий в республике.

2. Впервые из исследованных горячихводных источников Азербайджана выделены спорообразукдае бактерии Bacillus etearo-thermophilUB, Bac.mesentericus, Bac.subtilis, Bac.circulans,■

'Вас.megaterium, Bac.cereus jj неспорообразующие экстремально-терыофильные бактерии The mm □ flavus и умеренно-термофильные Г.ruber, (последние развиваются только в источниках Верхний Истису и Вагырсаг, характеризующихся малой степенью минерали-

: ; . 7 - 20 - 7 ;; 7'

зацин, температурой от 64 до 72°С и нейтральными или щелочными значениями pH).

3. С помошьо светового и электронного микроскопа изучена морфология и ультрагонкое строение спорообразующих бактерий (представителей всех идентифицированных видов) и Thurr.ua ruber Показано, что ультраструктура клеток термофильных бацилл содой на ультраструктуре соответствующих мэзофильных форм.

Обнаружено многослойное строение внутреннего слоя споровой оболочки у Bac.etearothermopbilus, аггамы 16 и Вьс.сегеиа штамм 28. Подтвержден полиморфизм у бактерий т.ruber, штамм Кб у клеток данного штамма выявлены инвагинации наружной мембраны клеточной стенки в ригидный внутренний слой, в результате чего клеточная стенка как бы состоит из отдельных линейно располо-ленных блоков, каждый из которых кольцом охватывает клетку. Подобное отроение клеточной стенки, характерное для грамотри-цдтадьных бактерий рода тьегшиа, обеспечивает им большую поверхность соприкосновения со внешней средой и тем самым лучший обмен веществ в экстремальных условиях,

4. Установлена высокая литическая активность бактерий Т. ruber, штамм Кб, в отношении живых (35/5 лизированных клеток за 50 мин), особенно мертвых (41%) клеток Escherichia coli.

По потребностям в источниках углерода и азота, временя генерации (опыты в условиях непрерывного я периодического культивирования) выделенные штаммы r.rubar несколько отличаются от описанных ранее в литературе.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

I. Ахмедова 8. Р. Термофильные бактерии в условиях Алшеро-на // Материала УП съезда ШО, Алма-Ата, Каз.ССР, 1985.-С. 15.

Z. Ахмедова Ф.Р. 0 распространении термофильных микроорганизмов в некоторых источниках Азербайджана /У Материалы IX республ.научн.конф.аспирантов вузов Азербайджана. - Баку,1987. - С.32-34.

.3. Ахмедова Ф.Р. Микробиологическая характеристика термальных источников Большого и Малого Кавказа в пределах Аз.ССР // Тезисы докл.Х республ.юбилейной научн.конф.аспирантов вузов Азербайджана.- Баку, 1987. ~ С.253«

4. Ахмедова Ф.Р. Об ли гатно-тврыофильные бактерии т.гиЪедг в гидротермах Кельбаджарского района Аз.ССР // Тематич.сборн.

. научн.трудов. Изучение ресурсов макро- и микрофлоры различных растений Больного Кавказа. - Баку« 1988. - С.41-42.

5. Ахмедова Ф.Р. . Терешина В.М., Логинова Я.Г., Ховрычев.. М.П. Особенности физиология Theraus ruber // Микробиология. -1909. - Т.58, вып.2. - 0.262-264.

6. Ахмедова Ф.Р. Некоторые фиэиолого-биохимнческие особен ности т.ruber, вггамм Кб, ввделекной из вод термальных источников Кельбаджарского района // Тез .республ.науч.конфервга^к молодых ученых. - Биология клетки, 1989. - С.10.

7. Ахмедова Ф.Р., Касимова P.C. • О распространении термофильных бактерий в горячих источниках Азербайджана и их иденти фикации // Тематич.сборн.науч.трудов. Микроорганизмы почв и растения северо-восточн.части Аэ.ССР. - Баку,1989. - 0.18-27.

8. Абушев P.A., Ахмедова Ф.Р. Антагонистические свойства т.ruber, шташ Кб, вцделеншх од горячих источников Кельбад- „ жарсяого района // й Всесоюэн. семдаара. Актуальные направления поиска антибиотиков. - Алма-Ата, Каз.ССР. - 1989.

Объем 1 г/г п л

Заказ 1024

Тир 100

Типография Московской с х академии им К А Тимирязева 127550, Москва И-550, Тимирязевская у л 1 44