Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ УМЕРЕННЫХ ПОВТОРОВ И САЙТОВ РАДИАЦИОННО-ИНДУЦИРОВАННОГО ХРОМОСОМНОГО МУТАГЕНЕЗА В ГЕНОМЕ DROSOPHILA.MELANOGASTER

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "РАСПРЕДЕЛЕНИЕ УМЕРЕННЫХ ПОВТОРОВ И САЙТОВ РАДИАЦИОННО-ИНДУЦИРОВАННОГО ХРОМОСОМНОГО МУТАГЕНЕЗА В ГЕНОМЕ DROSOPHILA.MELANOGASTER"

'9 3 57 7

'Л.

госкомиссия

ПО ПРОДОВОЛЬСТВИЮ И ЗАКУПКАМ ПРИ СОВЕТЕ МИНИСТРОВ СССР

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ РАДИОЛОГИИ

На правах рукописи

АЛЕКСАНДРОВА Маргарита Васильевна

УДК 577.391:595.773.4

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ УМЕРЕННЫХ ПОВТОРОВ И САЙТОВ РАДИАЦИОННО-ИНДУЦИРОВАННОГО

ХРОМОСОМНОГО МУТАГЕНЕЗА В ГЕНОМЕ 011050РН11,А МЕЬАМОСА5ТЕК

03.00.01 — радиобиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Обнинск — 1990

Работа выполнена » Научно-исследовательском института медицинской радиологии АМН СССР

Научный руководитель —

доктор биологических наук, профессор А. В. СЕВАНЬКАЕВ

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В. А. Тарасов

Институт общей генетики АН СССР

кандидат биологических наук А. А. Жлоба

Научно-исследовательский институт медицинской радиологии АМН СССР

Ведущая организация — Институт генетики и цитологии АН БССР (г. Минск).

< Защита состоится « _1990 года

в Л . . часов на заседании Специализированного совета Д 120.81.01. при Всесоюзном научно-исследовательском институте сельскохозяйственной радиологии при Госкомиссии по продовольствию и закупкам при Совете Министров СССР по адресу: г, Москва, пер. Волкова, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного научно-исследовательского института сельскохозяйственной радиологии.

Отзывы просьба направлять по адресу: 249020, г. Обнинск Калужской обл., ВНИИСХР, Специализированный совет Д 120.81.01.

Автореферат разослан « ^ » 199 О года.

. 1 секретарь Специализированного совета, к -------чческих наук Н. И. САНЖАРОВА

ОБЩАЯ ХАРШЕШЛИКА РАБОШ

Актуальность rem, ^унпаментальнье s радиобиологии принципы (попадания, мишени, рекомбинации) Силе сформулированы еще в ранний, классический, период ее развития. Однако, наполнение юс коыкрегныи молекулярным содержанием, в частности, решение вопроса о там, какова природа "мишеней" и рекомбинацвэнных механизмов, ведущих к перестройкам генома облученных клеток высших организмов, только начинается. Открытке рекомбинации do нуклеотвпньм повторам ЛИК в качестве молекулярной ссновн спонтанны! изменений структуры ген она клеток про- и зу-кнриот стимулировало появление аналогичных представлений о природе механизмов образования рациацяонн о-вн цуцврованннх аберраций хромосом у высших. Центральная роль в них отводится процессам гомологичной рекомбинации по умеренным (среднечастотным) повторам оснований ДНК (СоЙ$ер, Акифьев, 1976; Cb*d*i£k, Lecnhouts, 1976).

Известная высокая радиочувствительность придавгромервого и ив-теркалярного гетерохроматана, насыщенного средне- и высокочастотными повторами, как-б.упго поптаержнает эти представления. Однако, их справедливость для эухроматина, структурные изменения которого вне или в прямой связи с мутаниями уникальных генов вносят наиболее весомый вклад в наследственную изменчивость потомков облученных клеток и организмов, пока не показана. Более того, прямая экспериментальная проверке этих представлений путем сопоставительного анализа ра соре деления аберрационных разрывов и умеренных повторов по длине отдельных хромосом из одного я того же генотипа вообще по сих пор не проведена. Неизвестно также, первичные повреждения любых умеренных повторов или только определенных их семейств способны инициировать ввутрн- и меж-хроыосомные обмены и хакова при этом роль первичных повреждений, природа которых определяется качеством излучения.

Ицеята^акаоия в геноме Droeophii* meianog&eter умеренно повторя-яшхсн последовательностей разных семейств, пояучиамх название "мобильные элементы" (МЭ) в связи с «х способностью к перемещениям, ■ их клонирование открывают в настоящее время мрогае возможности для экспериментального анализе пере численных вше вопросов.

Дель и задача исследования» Цель- настоящей работы - экспериментальное изучение вопроса о том, являются ли МЭ сайтами - "мишенями" рекомбинации для регулярно вовникапцех наследуемых перестроек хромосом, регистрируемых как мутации отдельных уникальных генов, при действии редко- и плогноиояимрупцего излучений. Для этого необходимо

центральная

" t*г\t»,;

им. К, А. Ти:.«.рй=ова Инв №.............

йнлз решить еде пущее основные зааачя:

- Изучить спектр наследуемых хромосомных изменений аре мутациях ивпивинуальнше аутосомных генов, вызываемых гамка-излучением и нейтронами , в закономерности ре соре не летя по плена аугооом резрнвов;

_ Изучить распре ведение яо длине аутосом того же генотипа № разных семейств;

_ Сопоставить закономерности распределения МЭ в вв так гном геноме и сайтов "раэрнв-соединеане" у мутантов;

- Изучи» характер изменений » распределении МЭ в области аберрационных разрывов-соединений у хромосомных мутантов;

• Определять точную локализацию аберрационных разрывов-соединений на гене гите ской карп относительно генов-паркеров;

- Сопоставить результата цитологического, генетического и молежу-лярво-цитогеветического анализа по локализации МЭ и сайтов "разрнв-соецвиение" аа хромосомном и генетическом уровнях.

Научная новизна и практическое значенке работы. В работе впервые экспериментально установлено, что опектр хромосомных изменений, регистрируемых как нутации отдельных уяиаальнщ генов и в большинстве своем недоступных для традиционного метафазного анализа (наследуемые нуль шло кусиве делении, пара- и трвцен триче окяе инверсен, симметричные траведокатиж, транспозиция), качественно сходен для разных генов и излучений, хотя соотношение в вам делений ш обменов зависит oí природы хромосомного локуса, содержащего ген, я излучения.

Впервие также показано, что положение аберрационных разрывов-соединений ("горячие" точки структурного мутагенеза) на хромосомной и генегичесяой картах изученных районов генома для редко- и шютноио-яизнрдоего излучений совпадает, что свидетельствует с реализации качественно разных первичных повреждений в регистрируемые аберрации лишь в определенных, отличающихся, по-видимому, специфичностью структуры и топологии, участках еух роме тина этих районов геноме.

Впервые охарактеризован геном линии Dweophil» a»lv>og««ter подмосковного проиохожщшия (Д-32) в отноаении числа и распределения по главным аутосомам Ю одиннадцати разных семейств, что с учетом данных по точкам структурного мутагенеза в этих аугесомах также впервые позволило для одного и toro же геномоа покааа» ва хромосомном у роже наличие оопряжевяоетя в'локализации опредвленвнх МЭ и сайтов раврнвоа.

Новыми являю гея молекулярно-пигогенегические данные о том, что ИЭ ведут себя оря $ортрохавик перестроек как обычные генетические маркеры.Регулярная потере U3 ж уникальных генов, бланкирутшх границы щ-

версий, позволяет предполагать важную роль незаконно! ремтбшацш я образовании внутрихромосомвых обменов, ен душ реванша радиацией.

Новыми я принцвгаально важными является пашне о резво* мвотопо-ложеяив на хромосоме 1£Э м разрввов-соединеавй отвосимльво друг круга в □ тесной сопряженности на генетической карп спияочвнх и "горячих" точек хромосомного мутагенеза с разными уняквльаьмя генамв, позволяющие высказать гипотезу о тон, что сайтам« - "миюняи" рекомбияациов-яой реализация редиациоаио-иидуцировааинх первичных поврешдений хромосом являвгея не столько умеревнив (среднечастотане), сколько висо-кокооийные короткие (типа ооля- СА/йТ ) повторы, фланкирующие гены (я их эазонн) эукаряот я служащие, согласно паннам литератур«, структурными детерминантами регулярных генетвческях проаесоов ■ топологии хромосом в лоре.

Сказанное определяет фундаментальность I научную значимость работы, расширяющей к конкретизирующей нами представления о струкгуряой детерминации рекоибиваояонных механизмов радиационного хромосомного мутагенезе. Одновременно новые данные о спектре я частоте гамма- и нейгран-ивдуш«ревевпых наследуемых изменений хромовом, аосоциирован-ных с мутациями о г цельны* уникальных генов, можно рассматривать как заклагшваютв методологию зкепе р*ме н та льно г о изучения генетических механизмов радиационного канцерогеяеаа и в этой связи она могут быть иопользовааы сля сове роев ствования оценок генетического риска излучение о разной ЛПЭ и их гигиевического нормирования.

Структура н объем работы. Диссертация включает следующие раздели'. введение, обзор литературы, материалы к методы, результаты н обсуждение , заключение я выводы. Работа содержит 124 страницы машинописного текста, П рисунков (из них 3 с 13 жкрефотографвями) к 17 таблиц. Список литературы включает 161 наименование, из них 51 на русском языке.

Апробация, Материалы диссертации докладывались на научных семинарах я итоговых конференциях НИИМР АМН СССР (1988, 1969); 1У, У в Л Всесоюзных совещаниях по проблемам биологии и генетика дрозофилы (Нинок, 1985; Львов, 1967; Одесса, 1989); IX Всесоюзной конференции "Восстановительные и компенсаторные процессы при лучевых поражениях*1 (Ленинград, 1986); Международном симпозиуме "Репарация ДНК, аберра-цив хромосом и структура хроматина при загрязнениях окружавшей среды" (Москва, 1988); Международной совещании по генетическому действие корпускулярных излучений (Дубна, 1988); I Всесоюзном радиобиологическом съезце (Москва, 1989).

На аашягу выносят cm: _ результат онтогенетического анализа наследуемых абаррещгй хромосом, индуцжрованных качественно разными веками излучения ( -квавтъ, нейтроны) 9 геноме вваренной явкой лен«« Д-32 дрозофилы н регвсгрв-руемых как мутации отдельных, локализованных в аутосомвх, структур-нвх генов, овицегельсгвутове о:1) качественно сходном спектре эти аберрец«* шш изученных генов в излучений, но разном в специфичном идя них соотношении отдельных таоов перестроек в «том спектре; 2) идентичном для редко- я пло гаои ояв эаруицего излучений положения на интерфазных хромосомах "горячих" точек хромосомного мутагенеза в 3) едином тая разных районов иягерфввной хромосома "хромоиерно-огупеячатом" принципа, которому подчиняется наблюдаемые изменения в величине и положении мулмилокусных делений относительно друг друга;

- результат сопоставительного анализа полученных гевегических и мо-лекулярно-цигогенетнчаскях ценных, свиявтельствуппиб о;1) разном местоположении относительно яруг друга оаХтов "реэрив-соалвнение" и 11Э на генетическом уровне в 2) о том, что МЭ ведут себя ори формировании аберраций как обычные генетические маркере;

- гипотеза, согласно которой сайгами-пмишенями* для радиашшнно-наду-пяроваяного хромосомного мутагенеза у аукариот являются во умеренные повторы, а внсокововторягаиеся короткие пола-CA/Gï-тракты, являющиеся, до литературным данным, структурами ютермивантама пространственного положения генома в ядре и регулярных генетических процессов (репликация, репарация, рекомбяаацвя).

МА1ЕШЛЫ И ЫЕТОДН

Для онтогенетической характеристики спектра наследуемых хромо сомиых аберраций, регулярно возникавших при действии редко- и плотно-нонизяруицюс излучений на зародышевые щетки самцов дрозофилы к регв-* сгрируемых как мутация индивидуальных генов, была взята случайная выборка хромосомных мутантов но генам blaoic (£) , elna»b«r (on) и ув-tigi»! (зд) с локализацией в районах 34D, 432 и 49D, соответственно, поли генной аутосомн 2 (lindelèy, Grell, 1968). Хромосомные мутанты названных генов получены в одних и тех же сериях радиацноано-гевеси-ческих експеряиентов, выполненных в 19?0-Г960-е годы ( AI»laadrov,19841 AleiaDdrov, Alemtidrove, 1586, 1987; Александрове, Александров, 1958). Во воет случаях облучению -квантами №Со (дозы 5-60 Гр) жля быотры-.> ми нейтронами деления (Е=0.85 МзВ; дозы 2.5-20 Гр) подвергались 3-4-х суточные виргиннве самцы Droeophil* melanogaeter ва нябредно! дикой линии подмосковного Происхождения Домодецово-32 (Д-32). Облученные

самим су w скрещивались с самками тестер-линии геиагкпа 1пе<1) so31Lec®R+dl-49, у sc3Ieo4a, ь cu vg. осе появляющиеся среди регулярного потомства от гаки* скрещиваний мутант ъ, сь 0 подвергались гибридологическому и генетическому анализу, на основания результатов которого проводилась их классификация на точксвые и хромосомные (Alexaridrov, I9B4)• Последние, ставшие предметом дальнейшего анализа, из-за их рецессивной легальности или стерильности попно^ жввались в гетерсзягстах о хрокоссмами-балансерами СуО, S13, Cía.

Для точной локализации аберрационных разрывов у хромосомных мутантов ь на генетической карте с помощью кэмолеменгацисиного анализа их окре шивали с мутантами do генам-маркерам этогс района с винимым (b, ¿i rk, £и ) или реиессивно-летальным действием (33 деталей группы Ъг лрбезас аре доставленные доктором Ы.Эшйюрнером, Кэмарииж, Англия), Наличие комплемеягации (появление гетерозигст по изучаемой мутации Ь и мутации гена-маркера) свидетельствует о локализации радиационного повреждения вне этого гена-маркера я, наоборот, ее отсутствие - о вовлечении этого гева в перестройку.

Дня анализа автогенетических изменений у мутантов, гетерозиготных ас аортальной хромосоме, использовали методику выделения и фикса пая слюнных желез личинок Ш возраста по Калину (к&ПесЬ, HSgele, 1981). Локализацию меченых тритием в интактном геноме и у хромосомных мутантов проводила с помощью стандартной методики гибридизации in

eltu (Pardue et al.,. 1970). Местоположение сайтов "разрыв-соединение" и ТЛЗ определяли с помошыо фазово-коитраотной и световой микроскопии в соответствии со стандартной (Lindsiey,Cr«ll, 1968) а электронно-микроскопической (Ананьев, Барскай, 1985) картами политенных хромосом с точностьп до индивидуальных в данной подсекции дисков. 3 качестве проб при проведении гибридизация ln alta использовали меченую тритием (Зн) с помотью метода ник-трасляции ДНК плазмяд, несущих копии следующих II МЭ: ВДЧ, ЫДГ2, №3, МГ4, Р, I-элемент, BI04, copia, Кю2Э7. Jockey и YIW2.

Для оценки характера наблюдаемого распределения сайтов локализации разрывов-соединений и МЭ по районам политенних хромосом его сравнивали в обоих случаях со случайным {цуассововскин) распределением, тогда как неслучайность совпадения локализации МЭ и точек рекомбинации при хромосомном мутагенезе оценивали для аутосоиы 2 по величине коэффициента сопряженяоогя, а для генома в целом - с оомопью «-критерия, используя V -преобразование Р.Фишере (Урбвх, 1964).

РЕШЬТАШ И ОБСУЖДЕНИЕ

Ни гогене гяка гамма- я дей гроа^ийдуляроааниых хромосомных мугангов трех уникальных гевов аутосоиы 1 Патогенетический анализ 24 хромосомных мугангов ь, 42 мугангов №я ?3 мутантов vg (139 мутантов в цело«) показал, что вызываемые явумя изученными видами радиация хромосомные нзмененвя для трех генов опкзгяпны, аре оставляя coJfli культилокусяне цв лепив, пара- и перицев-трячесние инверсии, сншетрячные тренслокацяв в редко гранопвзищи (табл. I).

Таблица I. Хромосомные изменения у мутантов b.cn я индуцированные

irt

гамма-излучением Со я быстрыми нейтронами юления в зрелых спермнях санюов E.n»l*iioeaeter авбрепной линии Д-32

Тип j аберраций 11 7 г а ц и и * 0 К У 0 0 в ! Все

Ь ! СП ! t в це-

-индус.к- -инлуц.! - инауц.ю- -инпуп.! - -янцуи.п- -иняуп. t лом

Деления 4 10 18 II Z4 7 64

Vbверсии 7 2 5(4)* 5(1) 23 15 57

Транслокации / I 2(1) 9 3 15

Транспозиции I 2 3

Всего II 13 25(5) 17(1) 48 25 139

*- В той числе независимые аберрации, сопутствуйте муташк локуса.

Однако, соотношение разных категорий аберраций идя грех генов специфично, особенно если сопоставить относительную частоту возникновения мультилокусных цалвций и обменов (инверсии, транслскацияЫЗри этом видно, что среди хромосомных мутаций гена уц преобладают (2/3) изменения обманного тина, тогда как орехи мутаций оп - мульталокусные целении, Ген ь в этом отношении занимает промежуточное положение. Нейтроны целения сменяют спектр хромосомных мутаций гена о» в стороау обменных аберраций, а мутапайЬ - в сторону нелеций; опекгр хромосомных перестроек, вовлекатевх ген »¿при в том меняется шло,

Анализ 64 ранжированных по величине и положении на хромосоме мужь-гялокуоймх делений, затрегиваших сены ь, ов и (рис.! а,б,в), позволяет опием» следупмв главные и обшив лля редко- и плотвоиони-зи рунце г о излучений закономерности, которым поцчиняегся, их фсрмярова-ние в ли!ом из грех изученных районов генома: I) сайты "реэрыв-совдв-вение" делений локализуются, главный образом, в мехдисковых районах; 2) существуют нежински, где раарывы-соедоення реализуются чеце, фор-

Рже Л. Пятологическве размеры ранжированных не величине и положению

гамма- (гонкие линии) и нейтрса-индуцированных (тоястае линии) Пвлецвй, за траги ватам гены ь (a)t en (<5J « ¡t (в). Цифры около далв-щй - их условннй кок (см. раздел 4.1). Оекцаи в подсекции поли генных-хромосом соответствуют с тан пв р гной карте Брвцкеса. BI04, copia в т.я. - МЭ;* - нестабильные МЭ.

мвруа "горячие" точки пелационного мутагенеза; 3} размеры делений и их положенве относи re лье о круг друга изменяются краше 1,2,3 и г.д. авскам-хроыомерам ("хроиомерео-сгувенчагыЯ" принта); 4) цедеция имеют ввредевный перекрывающийся характер; 5) размер делений варьирует or одного цитологически видимого диска (1.0-1.5x10* п.н,) ю 40-50 дясков-хромомер (потеря по I.5iI06 о.».), если исходить вэ литературных оценок, что крупней диск в среднем содержит I.5-2.QxI05 п.н.

Пи то генетический анализ 75 хромосомных мутантов ь, сп и содержащих ВО обменных перестроек (инверсии, травслокацвн), показал,что у 66 из 80 аберраций один сайг "разрыв-соединение" локализован в районе изучаемого гена, тогда как второй сайг - в ином районе той хе (в случае инверсий и транспозиций) или третьей (ори траяслокациях) хромо-, сомы. Остальные 14 аберраций является рашшпяонно-индуцврсвааными событиями о независимыми от мутапвй изучаемого гена сайгами "разрые-со-емнениел. С учетом двойных хромосомных мутантов ¡¡я ï£ суммарное число идентифицированиях точек разрывов-соединений для всех обменных перестроек составило 117. Разрывы, как и в случае лелециВ, локализованы в

ые*исках я неслучайным обрезом распределены среде подсекций ауто-comb 2 (инверсии, транспозиции) и случайным - с ре пи 13 районов аутосо-Nu 3 (трааслокации). Анализ распре целевая 102 независимых событий •рвврив-соецинение" лдя внутрихромосомаых обменов (инверсии, транспозиции) среди 57 районов аутосомы 2, гяе они локализовалась, показал, что 42 es них являются одиночкиод сочками хромосомного мутагенеза, тогда как в остальных ре Я она* нутационные события наблюдаются два* три и более рее ("горячие" точки внутрахромосошкг обменов) (рис.2).

Рис.2. Локализация сайтов "разрыв-соединение" (х) для радяащюнно-вн-дуцированных внутрихромосомных обменов, ассоциированных с мутациям генов ь, св и v£, и сопряженных с ними МЭ sa пол и генной хромосоме 2LR . Цифрами обозначены секции хромосомы во цитологической карте Бридкеса, каждая яэ которых включает 6 подсекций (a,b,c,d,e,ï). МЭ:» - copiai о - BI04; » * йп297,' ! - МДП; I - НДГ2;*- НДГЗ;

Jockey;у - i- элемент.

В целом наблюдаемое распределение высоко достоверно отличается от теоретически ожидаемого случайного (пуассоновского) ( 2 » 16.81; Р 0.001). Каков хе нуклеотядныВ состав (на уровне КЗ) районов с одиночными и "горячими" точками хромосомного мутагенеза? Нуклеогидный. состав (на уровне ИЗ) вухромагияовых районов. содержащих сайги - "мишени" хромосомного мутагенеза

Для определения МЭ в районах разрывов-соединений до облучения и после него изучено распределение 1С И-ти разных семейств по аутосэ-мам в интактноы геноме £-52, а затем - в области резрнвов-соешшений делеционных л инверсионных мугенгов.

Согласно данным гябридвэационного анализа, три ЧЭ (Р, КДГ4 и П«2) из II изученных представлены в геноме Д-Э2 одиночными копиями

в эухрсматкне (Р - е I7C; .vulTi - в 96F + хромэценгр) или только в хponí оцеп тре (Хйа12 ), 4 из 8 укеренис представленных UiüTI, №3, J, Т-элеменг} кэсгенны по своему местоположению у есех изученных (2-4) особей, тогда как МЭ ЗДГ2, Dm297, tl04 и особенно сор1апсликорфнв зо сайтам локализации. Следовательно, на примере линии Д-32 наблюдается ситуация, когда а одном и тем же геаоме вьсекая изогенность па месгс- ■ положению одних ÍÍS сопряжена с вь-раженним полиморфизмом по сайгам локализации других. Стабильные ¿«ДГ1, МДГЗ, Jockey и I-элеменг представлены ео вгзрой и третьей хромосомах 25, 21, 17 и II копиями, ссот-ветсгвенно, тогда как полиморфные copla, Em297 и 2104 - 34, 38 и 41 стабильными и 120, 15 и 60 вариабельными сайгами, соответственно (их распределение по попсешиям политенных хрсмсейм см.табл.S, гл4). Распределение MS по длине аутосом (в частности, вутосомы 2) далеко не случайно СГ^-сЭ.66; P<O.COI), достоверно отличаясь от гуассоновского-Транспозиция нестабильных "3, как показывает анализ, в 1.5 раза чаше происходи: в районы, уже содержащие Ш, чем в "пустое".

Сопоставление данных по локализации сайтов "разрыв-соединение" и МЭ (рис.1 для челепий и рис.2 для инверсий) позволяет отметить, что, во-первых, гены ь и »g, регулярно вовлекаемые в Обмены, находятся рядом с хромомерами, содержащими Ю, и ре комбинируют в большинстве слу^ чаев (36 из 40) с районами, также содержащими МЭ (с учетом нестабильных сайтов локализации МЭ, поскольку выборка облученных самцов была тоже случайной), причем 21 из 36 районов имеют МЗ, гомологичные сопряженным с генами ь и тд; во-вторых, район локализации гена сп, редко вступающего в обмены, свободен от изученных МЭ в ре комбинирующие с ним районы (7 обменов) содержат (4IAB, 49С, 5éd,98A) либо не содержат (Z4C 60ав) МЭ: в-третьих, феноменологическая связь между сайгами локализации МЗ и пелеаионных разрывов заметно слабее, чем при обменах. Неслучайность топологической сопряженности МЭ и разрывов для последних подтверждают и результаты статистического анализа данных по инверсиям (коэффипиенг сопряженности К=О.ЕО, достоверно отличаясь от 0#?«2.I6) и всем обменам в целом (коэффициент у =2.69; Р< 0.01). Существенно гак же, что многие установленные "горячие" и одиночные точки хромосом ого мутагенеза находятся в районах интеркалярного гетерохроштина, содержащих в геноме Д-32 сор!«-подобные МЭ.

Таким образом, полученное нами данные подтверждают сделанный ранее Ли (Lee, IS75) для х-хромосомн вывод о том, что районы с "горячими" точками рацяационно-индуцированных аберрационных разрывов-соединений на цитологическом уровне совпадают с районами локализации умеренных повторов, а тем самым как-буцто бы и современные представления о

непосредственном участия умеренна* повторов в процессах образования радиационных перестроек генома зукариот, Возможны ива альтернативных механизма участия МЭ в индуцированном структурном мутагенезе. Согласно одному из них МЭ являются непосредственной мишенью для первичных повреждений и последующей рекомбинации, по-видимому, ао длинным концевым повторам МЭ, которые могут располагаться в междисковых районах. В результате будут возникать цитологические структуры (см,рис.6,Г в разп.4,2,2), отличавшиеся от генерируемых рекомбинацией по участкам вне МЭ (рис.б.Б.В.Л.Е). На основе этого механизма следует также ожидать появление разных продуктов рекомбинации, ведушей к мультилокус-ным делениям, в зависимости от того, где (по МЭ или вне их) проходят разрывы-соединения (гая. рис. 7, разд.4.2,2). Согласно алые раа гаев оку механизму МЭ, осуществляя своп структурную функцию (см."Обзор литературы"), пространственно сближают районы одной и той же или разных хромосом, формируя топологические узлн, где возможен контакт потенциальных сайтов-"мишеней" структурного мутагенеза, игезтифипируемнх на ослитенных хромосомах как междисковые районы (линкврная ДНК).

Проверке основанных на первом механизме моделей (рио.6,7;рази. 4,7.2) была проведена посредством гибридизационного анализа положения у мутантов в районах всех разрывов-соединений тех МЭ, которые находились в в тс районах в интактном геноме. Была изучена случайная выборка из € разных пелеционных к двух инверсионных мутантов ь и 5 мутантов тд с пара- или пернцентрнческнми инверсиями. Согласно результатам гибридизации (табл. 14,15; фото на рио.6-10. pasn.4.2.3), МЭ со стабильной локализацией на границах перестроек либо теряются (некоторые инверсии), либо ведут себя как обычные генетические маркеры (рис.3), что указывает аа механизм образования изученных перестроек, основанный на обменах по участкам вне МЭ, по крайней мере, его центральной час re.

Поскольку 9тв данные окончательно не отвергали возможность рекомбинация по ЛКП 1С, находящимся, как предполагалось, у основания хромомер в междисковых районах, были локализованы одиночные и "горячие" точки аберрационных разрывов-соединений на генетической карте о!-" ного из изученных районов (ген Ь) среди генов-маркеров, местоположение которых относительно хромомер, сопержащих изученные нами МЭ, известно. Результаты ВИДОЛНвНйОГО С ЦвЛЬЮ КОШТЛбМввТАЦЯОВЯОГО ШДОЛВЭ6 НЗЛ8—

гаются ниже*

т Л «с *

• >< ' К*.

___ ___' 1----■ --

Ч .

* *■/ V35*' * ^ы'1 —«р

' ЛАЙ^ ТЛ * 'Ф

Рис.з. Гибридизация 1в НЭ £»297 с инмктяой (а) I анввртаровм-вов (б) у мутанте ъв1гз полягенной хромосомой гъ (се «ми 3435); то же для ИЭ ВЮ4 к инверсионной гетерозвгога »ве2оИ/»«еП1а: в - раврвв-соедавея» «ги,г|эьо (у мутант» ▼«аане) ■ 49М.г|эбк (у мутант *гб2е14); г - реарыв-ссв мнение 36Б1,2|49Е (мутаят »«8X118). Стрелка»« указана сайты гибридизации.

Генетическое доложен»« сайтов хромосомного мутагенеза относительно генов-паркеров и содержащих их и ИЭ дискор Комплеменгадиснннй анализ 14 мультилокусвых делений и .7 инверсий Ь с 42 генами-марке рами, в процессе которого было выполнено 360 скрещиваний и проанализировано около 50 тыс.особей, показал, чгс единая на хромосомном уровне дан шлепай и инверсий "горячая" точка разрывов-соединений проксимальное дисха 3421,2 (рас.П, на генетическом уровне представлена резными для т перестроек "горячима" сайтами (рас.4). Иэ рисунка видно» что "горячая" точка для инверсионных обменов находится в районе между геками-маркерами Ьт-го и Ът£, так что между ней а хромомером 341)1,2, содержащем МЭ оср!а располагаются, по меньшей мере, три разных структурных гена (Ьгго, Ьгэг, ьгзв ). Две яз нях (ьгзе и ) предшествуют я "горячей" точке делеционного мутагенеза, локализованной между генами Ьгзг к Ьг20.

Тахям образом, "горячие" точка хромосомного мутагенеза «того района аугосода 2 не совпадают с местоположением бляжайвего к ним ИЗ в диске Э4Ш.2 и, следовательно, не данный КЗ (равно как к не другие ИЭ, возможно находящиеся а егсм хромомере), а какие-то аные повторящиесв

,i.f 7[т.» < « »f.д ) ггг»tr.î iiu n [T,i irervi [ т ITT»

ar?

Hflll

ШГТ1

, Mlllim<W/UUI..................

1 «JÎ! iï»:t»ï;i*»Hï»» Л » лЯЩхтяэьхялмтгя!) ■

161-

Pic.4. Раэмерн. локалвзацвя и структуре рашшионно-иапуцврованных делений (I-I4 - условный код, ом.рвзд.4Л) я инверсий (15-21) ь относительно хромосомной (А) в генетической (Б) карг секций 34-35 по-литенной хромосомы гь. Цифрами на генетической карте обозначены летали группа Ьг Ы.Эшбгрнера, а буквами - видимые мутации.* - волнистый отрезок не л в пии >14 (сг(гь) ьввЫ5) - фрагмент, транслоцировавный на ï-хромосому. Толстыми линиями у инверсий выделены инактввированнне (или потерянные) отельные гены или их кластеры.

последовательности являются непосредственной "мишенью" для первичных повреждений и ре комбинационной реализации раднащгонно-ивдупяроваввнх делений и обменов.

Результаты комплементационного анализа (рис.4) позволяют отметить еще ряд новых и интересных закономерностей, которым на генетическом уровне подчиняются процессы радиапионно-индуцированвого делецяонного в (шверсиовясго мутагенеза: во-первых, увеличение генетического размера делений (или изменение их положения относительно друг друга) носвт выраженный ступенчатый характер, подчиняясь тому же "хромомеряо-ступев-чагому" прввсиду, который был ранее сформулирован при анализе деледий на хромосомном уровне, что вполне объяснимо в рамках гипотезы "один диск - один ген"; йо -вгорълг» слзкякй (ешашлоксянй} характер кого повреждения у многих, регулярно вознякаоцвх и цитологически кажущихся простыми, делений (особенно крупных) и янверсвй, представляют« собой либо аластер делений разной величины (делецвв ПО и 12,рис.4),

либо обмени с сопутствующими точковыми мутациями и/или тгелециями отдельных индивидуальных генов (инверсия #15,16,18,21, рис.4); в третьих, процессы инверсионных раз рввов-сое мнений сопрово*яаются инакти-вааивй (очввяаао. потерей) одновременно двух смежных генов на одной (Р1?-13,?1,Р1!С.4) или обеих (*20) границах инверсий, показывавшей, что ралиационно-инкупированные обмени, по крайней мере, пара- в перикенг-рическяа инверсии, формируются на основе более сложного (или принципиально иного) механизма обмена, чем гомологичная рекомбинация, поскольку он должен включать процессы, вецушие к обмену н делении, альтернативные для опного и того же поврежденного радиацией участка нук-леомпной последовательности; в-четвертых, "горячие* в одиночные точки хромосомного мутагенеза дисперсно распределены пс всему охваченному комгслементацяоннвм анализом цитогенетическому району Э4С1-35ЕЭ, фланкируя многие, если яе все, структурные гены (или их экзоны) вне связи с 1С?. Способность последовательностей, образуйте эти "точки", к взаимному контакту и рекомбинации является, по-видимому, проявлением определенной их гомологии. Какова возможная природа этих последовательностей, почему некоторые из них являются "горячими", а другие аналогичные - одиночными точками хромосомного мутагенеза, взаимодействие каких после по вате л то с гей (ИЗ или лежащих в основе сайтов хромосомного мутагенеза) обусловливает топологическую связь между разными районами хромосом, с о ге ржа щи ми одновременно КЭ и зги сайты - вот те номе интригутие вопросы, которые ставят наюн исследования и которые поэтому заслуживают своего специального рассмотрения в заключение работ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

О топологической_связ и_Ш из разных районов генома, оодержащих сайт« .хромосома о ро _щтаге не за

На существование этой связи указывают три установленных нами факта: I) в индуцированные обменные перестройки регулярно вовлекаются оба сопряженных с МЭ структурных гена (ь и тд) в отличие от гена оп, не ассоциированного с № (по-крайней мере пз изученных) и исключительно редко вступающего в обмены; 2) подавляющее большинство (90$) поврежденных и рекомбинирующих о генами Ь » уц районов 2 я 3 хромосомы также содержат МЭ; 3) почти 6Сй нз 8тих ЭД6 содержат те же МЭ, которые сопряжены с уникальными генами Ьи !£. Эти данные дополняют имеющиеся немногочисленные в литературе наблюдения о топологической связи на хромосомном уровне между умеренными повторами н сайгами обменных перестроек, с одной стороны, л между самими повторами, с другой, делая эту связь теперь более очевидной. Для ее объяснения можно выдвинуть две

альтернативные гипотезы.

Первую из них о МЭ как не оос ре дс гвеяных"мишенях" индуцяровавяого хромосомного мутагенеза ее подтверждают результат проведенного янмя сспссгавительногс анализа цитологических, генетических и молекуляряо-цат о генетических шшых по локализации МЭ и разрывов - соединений относительно друг друга (раздел 4.4).

В рамках «торой гипотезы, учигнветеей сущесгвутовае в литературе представления о структурной $ункпия КЗ (Маяуэлилис, 1996; Бвритейн, 1987), везущую роль в обеспечения обсуждаемой топологической связи должны играть сами МЭ» взаимодействие которых друг с другом должно, ао-вигамому, создавать необходимые предпосылки кия контакта и смежных с няни после дова гельа о с тей - потенциальных "мишеней" мутагенеза.

Сказанное как-будтс подтверждают нави данные о неслучайной квду-цироваивой рекомбинации районов аутосом, еогер*а»шт нэ ояного я того ке семейства. 0*накс. как нами показано, ре комбинировать могут я районы, содержание МЭ размыт семейств, что в райках втой гипотезы требует призвания, с одной стороны, наличия у гетерологичвнх МЭ специфически* участков связывания яте ран* белков и, в "ругой, гомологии ятях участков. Указания на то, что »то так, в поелейнее время пайсгвя те льна появились в литературе. Однако, во всех гаки* случаях пока установлена и описаны участки связывания белков ве со структурной, а регуля-юраой, ьлияшей на вкспрессию самих 10. акцией. Повтому аредстав-ленве о вахней структурной роли МЭ осгаегея интересной я привлекательной для дальнейших исследований гипотезой, в рамках которой можно интерпретировать и часть полученных ваш данных.

Отличавшиеся от нумеотидвые повторы как возможные сайт -"ииврцд" радиационного хромосомного мутагенеза

Исходя ве полученных в работе данных, следует, очевидно, призвать, что среднечастотные или умеренные повтори (а их изучение у дрозофилы, если иеекмысо перефразировать Ю.Н.Ильина (1982), сводится, в конечном стоге, к исследованию МЭ>не являю тоя ее по средстве иной молекулярной "мязюяью" для радяацяонве-няауцвровамаых обменных аберраций, хотя была изучена наиболее представительная часть таких НЭ.

Остановленная намя множественность "горячих" я одиночных точек хромосомного мутагенеза и кг геоная связь на генеической карте с равными структурными генами показывают, что нуыеоиляая основа зтвх точек должна быть представлена последовательностями о такими свойствами, как ваздесуанооть а наличие повторов с прямой и/или обратной ориентайней > гомологией, до с га точной для законной и незаконной рекомбинации.

Среди повторяющихся последовательностей, широко диспергированных в геноме эукариот, перечисленными свойствами обладает, согласно последним данным литературы, относительно простые, яепротяженные (до 30 п.в.) и обогащенные А-Т-парамн тракты, располагающиеся изолированно или кластерами (последовательности поли- СА/ат).С!утвесгввйяо, что в .геноме дрозофилы они локализуются в междисковых районах полвтенных хромосом, а у позвоночных могут фланкировать экэоны. Все это с учетом данных литературы о полифункциональностя таких повторов (как "горячие" точки равного и неравного кроссивговера, сайты автономной репликации, места прикрепления ДНК к ядерному матрикоу и/или внутренней плаотине ядерной мембравы) позволяет высказать гипотезу о важной роля (как "мишеней") обсуждаемых повторов в радяапиовно-вадуцировавных реорганизациях генома высших вукариот. В ее рамцах оказывается возможным непротиворечиво объяснить всю описанную нами и имеющуюся в литературе феноменологию структурного мутагенеза на молекулярио-си тогеае гаче ском уровне, шишчвя наличие "горячих" и одиночных точек разрывов.

В самом деле, согласно гипотезе, "горячие" точки должны, очевидно, представлять собой поли -ci/ст - трактв со статичным положением в геноме (а их совокупность - статичную компоненту в семействе этих повторов) я в силу етого служить местами прикрепления хроматиновых петель к ядерному матриксу ила мембране и, вероятно, сайтами репликации и рекомбинационной ошибочной репарации. Постулируемой их функциональное триединство предполагает инвариантность положения таких "горячих" точек в геноме разных клеток (что наблюдается) и для равных генотипов в пределах вида (что проверяемо, если расширить круг изученных в втом отношения линий дрозофилы). Тогда одиночные точки хромосомного мутагенеза должны, по-видимому, представлять собой те же последовательности, но строго не фиксированные на ядерном матриксе (динамичная компонента в семействе этих повторов), что обусловливает индивидуальный пля отдельных клеток и генотипов рисунок других петель хроматина и их относительную подвижность. Если эти петли содержат ИЗ, гомологичные находящимся рядом с "горячими" точками, становится вполне вероятным их просграяотвеявое сближение с формированием топологичеоких узлов, обеспечивающих контакт в рекомбинацию поврежденных радиацией поли-са/ст-повтаров.

ВЫВОДЫ

I. Онтогенетический анализ (на пслнтенннх хромосомах) 139 4енотипических мутантов ъ, on и v£ с хромосомными изменениями, индуцированными в зрелых спермяях самцов инбредноП линии Л-32 Droeophila meU-

oogaeter f -излучением и быстрыми в в И тронам* деления, показал, что при качественно сходном спектре аберрнций для изученных генов я излучений соотношение в вей мулыплокусннх делений и обменных перестроек Свара- и перицентрнческне инверсии, транслокации, транспозиции) для каждого гене и излучения специфично.

2. Суммарно для 64 мультилокусных аелецнй и 80 обменных перестроек определено местоположение на волитенньгх хромосомах 290 точек разрыв-соединение, локализованных в 155 разных и преимущественно межднс-ковых районах аугосом, совпадавших для излучений разного качества. Идентифицированы районы с одиночными и "горячими" тачками хромосомного мутагенеза и установлен "хромоиеряо-ступвнчагый" принцип, в соответствии с которым изменяются размер« и положение делений относительно друг друга.

5. Молекулярно-цитогеяетический анализ распределения мобильных зле ментов (МЭ) И-тя разных семейств на поли генных аутосомах ив генома этой же линии Д-32 показал, что I) высокой изогевности в локализации одних МЭ (МДГ1, ЦВГЭ, I, Jockey) сопутствует определенный полиморфизм других (ВДГ2, 1Ю2Э7, БЮ4), особенно ярко выраженный для copia 2) умеренно о высококопийнне МЭ, находяоь в дисках, распределены по клине аугосом не случайно, формируя "горячие" участки локализации МЭ и 3) транспозиция нестабильных Ю идет ореимущесгвеняо в диски, уже содержащие МЭ.

4. Анализ нуклеотидвого состава (на урсвве МЭ) воех 155 районов интаятного генома, содержащих у мутантов одиночные и "горячие" точки хромосомного мутагенеза, показал, что последние достоверно чаще, чем ожидалось, сопряжены с дисками, соавриацимп U9, в случае обменных аберраций, но не мультилокусных иелеовй.

5. С помощью двух независимых подкопов - анализ распределения МЭ в области сайтов "разрыв-соединение" у хромосомных мутантов и компле-мвнтациовннй анализ локализация этих сайтов на генетической карте относительно генов-маркеров, смежных МЭ, - установлено, что "горячие" и одиночные точки аберраций находятся вне К&, последние ведут себя яра формировании перестроек как обычные генетические маркеры я, таким образом, не являются сайтами - "мишенями" хромосом«ого мутагенеза. Регулярно наблюдаемая на концах инверсий потеря фланговых маркеров - ЫЭ или уникальных генов - дает основание предполагать важную роль незаконной рекомбинации в образовании, по крайней мере, внутрнхромосом-ных обменов.

6. Препложена гипотеза, согласно которой сайтами - "мишенями" рекомбинация при рецяацнонна-ннкупированном хромосомном мутагенезе

эу кари от служа! не умеренные повторы, в $ланкирущае уиакальнне гвнн короткие поли- СА/СТ- тракты, являшиеся, по литературным данным, структурными детерминантами пространствеиаого полевения генома в ядре я регулярных генетических процессов (ревЬикадия, репарация, рекомбинация). В рамках ятой гипотезы "горячие" точки хромосомного мутагенеза представляют собой тракты с инвариантным положением в геноме для развит клеток и генотипов (статичная компонента в семействе таких повторов), тогда как одиночные точки - тракты, строго на фиксированные на ядерном мамиков (динамичная компонента таких повторов).

Работы, опубликованные по теме диссертации

1, Александрова M.S. Спектр структурных мутаций, вызываемыхjr-квантами и нейтронами, в полноценном я дефектном по рекомбинации геномах // Тезисы докл. 9 Всесоюзной яовференцик "Восстановительные а компенсаторные процессы при лучевых поражениях", Ленинград,1986,С,4-5.

2. Alex&ndrova M.Y. Genetic and cytogenetic mapping of the chromoeon« rearrangement breakpoint« induced by high- and lo«-I.£T radiations around the black locue of ErosopMle melaJiogaeter // Drceophila Inform et Ion Eeryice. 1986, V.63, 21-22.

J. Alaxaadrov I.D,, Alexauirova M.V. Genetioe and cytogenetic« of the black mutations induced by f -r«ys,2^SCf and fleeioa neutron // Drosophila Info met ion Service. 19 S6. V.63. P.I59-I6I. 4* Alexandre? I .Г., Alexortdrova H.V. Genetics and oytogenetioe of the vestigial imitations Induced by gamma-raye, 252Of and fleeion neutron« // Droeophila Informetion Servie». 19B7. Y,66. Р.185-187.

5. Александров И.Д,, Адекоандрова М.В, Генетическая дифференциация по мобильным элементам « радяомутабнльнооть сопряженных с ними структурных генов у b.melanogaeter /} Тезисы доклада У Съезда ВОГиС им. H,И,Вавилова, M.: 1987. Т.У1. С.75.

6. Alex and г ova M.V., Sevank&ev A. V., Alexandra? I.D, The moderate repeat DMA (mobile elenente) and hot spote for chromosome nuttgeceele in Droeophila euohromatin // In "DMA-repair,Chromo«orne Alteration« and Chromatin Structure under Environmental Pollutions; X.I986.F.47.

7. Длекоаядрова «.В., Александров И.Д. Единый для генома принцип ступенчатого 3 армирования мультялокусных делений у Droeophil» mela-noga«ter //Тез.цокл. Л Всесоюзного совещания до генетике и биологии дрозофилы. Одесса. 1989. С. 4-5.

8. Александрова М.А.. Александров И.Д. Радиационный локус-специфиче-екий мутагенез животных: генетические и радиобиологические аспекты //Тр.рабочего совей, до генетическому действию корпускулярных

излучен**. Дубна. 1989. С. 259-290. 9. Александрове К.В., Севанькаев A.B., Александров И.Д. Умеренные повтори ДНК (мобильные элементы) я "горячие" точка хромосомного мутагенеза у Broeophila melanogMter If Там же. С. 290-299.

ш

tu mm r nimm ч ■ шущшш п им г im» i»i Хщт ta о гит» m » ■ ■