Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ранняя реакция организма млекопитающего на воздействие хлоридом кобальта

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Ранняя реакция организма млекопитающего на воздействие хлоридом кобальта"

На правах рукописи

Моргулис Ирина Ильинична

РАННЯЯ РЕАКЦИЯ ОРГАНИЗМА МЛЕКОПИТАЮЩЕГО НА ВОЗДЕЙСТВИЕ ХЛОРИДОМ КОБАЛЬТА

03.00.16 - экология 03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Красноярск - 2006

Работа выполнена в Международном научном центре исследований экстремальных состояний организма при Президиуме КНЦ СО РАН

Научные руководители:

доктор биологических наук_

профессор [Владимир Прокопьевич Нефедов! доктор физико-математических наук, профессор Рем Григорьевич Хлебопрос

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Валентина Александровна Кратасюк кандидат биологических наук, доцент Людмила Давидовна Пономаренко

Ведущая организация:

ФГОУ ВПО «Красноярский Государственный аграрный университет»

Ж

часов

Защита диссертации состоится 10 марта 2006 г. в на заседании диссертационного совета К 212.099.2 при ГОУ ВПО «Красноярский государственный университет» по адресу: 660041, Красноярск, пр. Свободный, 79.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Красноярского государственного университета

«С

Автореферат разослан « Ч ^ьУУиЛЯ 2006

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических С 7) ___

наук, доцент Г.Н. Скопцова

-coofa'A

Актуальность исследования. Одной из наиболее важных проблем экологии является исследование антропогенных влияний на живые организмы, в особенности на млекопитающих, поскольку к ним относится и человек. Ведущим инструментом исследований для этой проблемы является анализ физиологического отклика на экологическое неблагополучие окружающей среды. Физиологический отклик слагается из краткосрочных и долгосрочных эффектов, обусловленных экологическим неблагополучием. В данной работе рассмотрены краткосрочные, быстрые эффекты.

Живые организмы любой сложности вынуждены жить в условиях, предлагаемых средой, которая их окружает. В результате складывается ответная реакция организма, тем более сложная, чем сложнее сам организм, чем более продвинут он эволюционно. У высокоразвитых животных со специально выработанным для сохранения целостности собственного организма в постоянно меняющейся внешней среде приспособлением, гомеостазом (W.B. Cannon, 1929), эта реакция сложна, разветвленна и многоступенчата.

Любое экологическое воздействие (извне) вызывает цепь адаптивных реакций, реализующихся, пока гомеостатические механизмы не разрушены, в тесной пространственной (в пределах организма) и временной взаимосвязи. Концентрации веществ, даже жизненно необходимых для функционирования организма, имеют свои гомеостатические пределы, выход за рамки которых (избыток или недостаток) приводит к комплексу локальных и системных реакций, направленных на устранение результатов этого выхода.

Одним из экологически значимых для организма химических факторов является элемент № 27 Периодической системы Д.И. Менделеева - кобальт. Кобальт - микроэлемент, т.е. является жизненно необходимым для функционирования живых организмов. Но в избытке, как многие другие элементы или сложные вещества, он для организма токсичен и может быть губителен. Природный источник кобальта - минералы. В больших количествах он содержится в медно-никелевых рудах, добываемых на территории Красноярского края.

Вредное воздействие кобальта в высоких концентрациях связывают главным образом с тем, что избыточное поступление кобальта в организм сопровождается состоянием гипоксии, предположительно гистотоксической. А для нормального функционирования клеток любого организма кислород необходим. У простых беспозвоночных, состоящих из нескольких слоев клеток, для оксигенации достаточна простая диффузия кислорода непосредственно из окружающей среды. Например, у имаго Drosophila melanogaster система разветвленных трахеальных трубок доставляет воздух во все уголки тела, позволяя кислороду свободно диффундировать в отдельные клетки. Гораздо большие размеры тела у человека и других позвоночных потребовали развития сложной физиологической инфраструктуры, на базе которой развились и возможности для гибкой, достаточно быстрой и соответствующей потребности доставки кислорода клеткам в нормальных и отличающихся от нормы условиях.

Кислородный гомеостаз в сложном организме обеспечивается тонкими механизмами регуляции как на метаболическом, внутриклеточном уровне, так на уровнях ткани, органа, физиологической системы, целого организма (J. Marx, 2004). Специфически реагирующей на нехватку кислорода в организме тканью является кроветворная. В ее компетенции находится продукция эритроцитов - клеток, поставляющих кислород всем остальным тканям. Основным регулятором выработки эритроцитов является специфический гликопротеино-вый фактор роста эритроидных клеток эритропоэтин, содержание которого в крови в ответ на гипоксию любого генеза повышается во много раз (А J. Giac-cia et al., 2004). Однако усиление биосинтеза эритропоэтина - многостадийный процесс в организме, требующий такого промежутка времени (исчисляемого часами), в течение которого гипоксическое состояние клеток может оказаться необратимым, а судьба клеток - фатальной. Очень быстрые адаптивные реакции на острую гипоксию (выброс эритроцитов из депо, выброс дополнительных порций ретикулоцитов из мозга) явно недостаточны для того, чтобы компенсировать нехватку кислорода в течение нескольких часов до появления в крови эритропоэтина. В доступной нам литературе по этому вопросу мы не

нашли никаких сведений о кинетике красного кроветворения в первые 6 часов после начала острой нехватки кислорода, вызванной введением избыточных количеств кобальта (в виде хлористой соли СоСЬ)-

В то же время ясно, что непосредственный ответ со стороны кроветворения на введение избытка кобальта должен развиваться на фоне генерализованной стресс-реакции со стороны организма как целого, которая может включать как специфическую для гипоксических состояний (посредством эритропоэтина), так и общетоксическую составляющие.

Поэтому актуальными представляются как исследование ранних изменений кинетики эритроидного кроветворения и пролиферативной активности красного ростка костного мозга, так и оценка общефизиологического состояния животного после поступления в его организм избытка кобальта, рассмотренные в контексте отклика организма на экологическое воздействие.

Целью исследования явилось определение закономерностей кинетики эритроидных клеточных элементов костного мозга и их пролиферативной активности на фоне изменений функционирования организма животного (млекопитающего) в целом в первые 6 ч после введения в организм хлорида кобальта.

Задачи исследования.

1. Охарактеризовать кинетику клеточных эритроидных элементов костного мозга и их пролиферативную активность в первые 6 часов после введения хлорида кобальта в эксперименте in vivo на крысах и мышах.

2. Оценить уровень гипоксии и интоксикацию, развивающиеся у животных (мышей и крыс) в первые 6 часов после введения хлорида кобальта.

3. Исследовать изменения эритроидного кроветворения в изолированном перфузируемом костном мозге животных при добавлении в перфузионную среду хлорида кобальта.

4. Исследовать влияние хлорида кобальта на пролиферативную активность клеток в культуре.

5. Оценить возможность имитации кобальтом внутриклеточной гипоксии ab initio методом квантовой химии.

Новизна исследования.

Впервые исследована ранняя (в первые часы после воздействия) реакция системы красной крови животного на введение в организм избыточного количества хлористого кобальта.

Впервые реакция системы красной крови на введение избытка хлористого кобальта на ранних сроках исследована в сочетании с общей, генерализованной реакцией организма на данное стресс-воздействие и рассмотрена в контексте этой общей реакции.

Впервые в условиях воздействия хлористого кобальта получены данные, позволяющие предположить существование среди клеток красного ростка кроветворения резервной популяции клеток, готовых при создании особых (стрессовых) условий к выходу непосредственно в митоз.

Таким образом, эффекты хлористого кобальта впервые рассмотрены одновременно в двух аспектах: экологическом (как токсического агента, поступающего из окружающей среды) и физиологическом (как эффекты фактора, непосредственно и/или косвенно стимулирующего кроветворную функцию организма).

Практическая и теоретическая значимость работы. Результаты исследования могут быть использованы при оценке степени вреда, наносимого живым организмам избыточным содержанием в среде их обитания переходных металлов, в частности кобальта.

Кроме того, полученные в работе результаты вносят вклад в понимание того, в какой последовательности и через какие механизмы может быть реализована в организме млекопитающего генерализованная, сложная и многостадийная реакция на экологическое неблагополучие.

Положения, выносимые на защиту.

1. В ответ на поступление в организм из внешней среды избыточного количества кобальта в виде соли СоСЬ у животных в течение первых часов после воздействия развивается генерализованная реакция, выражающаяся в

значительном снижении удельной объемной скорости потребления кислорода, сопровождающемся признаками тяжелой интоксикации.

2. В ответ на поступление в организм из внешней среды избыточного количества кобальта в виде соли СоС12 у животных в течение первых часов после воздействия развивается реакция со стороны костного мозга - органа, непосредственно участвующего в продукции клеток, доставляющих тканям кислород, выражающаяся в усилении пролиферации клеток красного ряда и ускорении их созревания.

3. В костном мозге интактных животных существует резервная популяция эритроидных клеток, непосредственно готовая при необходимости к выходу в митоз и обеспечивающая быструю адаптивную реакцию при изменении требований со стороны окружающей среды.

Апробация работы. Основные результаты исследований были доложены на XIV Съезде Всесоюзного физиологического общества им. И.П. Павлова (Баку, 1983); на П Всесоюзном съезде гематологов и трансфузиологов (Львов, 1985); на VII Всероссийском симпозиуме «Коррекция гомеостаза» (Красноярск, 1996); на ХХХШ Международном конгрессе физиологов (С.Петербург, 1997); на VIII Всероссийском симпозиуме «Гомеостаз и окружающая среда» (Красноярск, 1997); на III Съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1997); на IX Международном симпозиуме «Реконструкция гомеостаза» (Красноярск, 1998); на Международной конференции, посвященной 150-летаю И.П. Павлова (С.-Петербург, 1999); на XVII Съезде физиологов России (Ростов на Дону, 1999); на Российской конференции «Организм и окружающая среда: жизнеобеспечение и защита человека в экстремальных условиях» (Москва, 2000); на X Международном симпозиуме «Концепция гомеостаза: теоретические, экспериментальные и прикладные аспекты»; на XI Международном симпозиуме «Гомеостаз и экстремальные состояния организма» (Красноярск, 2003); на XII Международном симпозиуме «Сложные системы в экстремальных условиях» (Саяны, 2004).

Публикации. Результаты работы изложены в 19 печатных работах, из которых 2 статьи в реферируемых журналах, 1 глава в коллективной монографии, 1 статья в международном электронном журнале, 13 тезисов и материалов конференций различного уровня, в том числе и международных, 2 статьи в тематических сборниках статей.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 112 страницах, содержит 11 таблиц и 24 рисунка. Библиография содержит 161 наименование.

Автор считает высоким долгом выразить свою благодарность научному руководителю работы, безвременно ушедшему три года назад профессору Владимиру Прокопьевичу Нефедову.

Автор глубоко благодарна нынешнему научному руководителю профессору Рему Григорьевичу Хлебопросу.

Автор благодарна профессору Николаю Александровичу Сеткову за ценную помощь в обсуждении работы и своим коллегам и соавторам Татьяне Всеволодовне Андреевой, Татьяне Алексеевне Романовой и Ольге Витальевне Круглик.

Содержание работы. Во Введении обоснованы актуальность, научная новизна, практическая и теоретическая значимость работы, определены цель исследования и вытекающие из нее экспериментальные задачи, сформулированы основные положения, выносимые на защиту.

Глава 1 - Эритропоэтическая функция организма и стресс: экологические аспекты - обзорная. В этой главе проанализированы данные научной литературы, касающиеся эритропоэтической функции организма на фоне стресса. В обзор включены разделы: Кроветворение и стресс, Организм и гипоксия, Микроэлементы и физиология: роль кобальта.

В результате анализа данных литературы в обзорной главе сделан вывод о том, что избыточное поступление из внешней среды в организм кобальта

приводит к токсическим эффектам, является стрессом не только для системы эритроидного кроветворения, но и для организма в целом. Опосредованное эритропоэтином влияние кобальта на кровь описано и проанализировано многократно. Доэритропоэтиновая же стадия, т.е. события, происходящие в организме в первые 6 ч после избыточного поступления кобальта из внешней среды в организм, исследована мало.

В Главе 2 описаны материалы и методы исследования, использованные в работе. Эксперименты in vivo проводили на крысах Wistar массой 200 -250 г, мышах ICR массой 18 - 22 г, которым подкожно вводили раствор СоС12 в физиологическом растворе (0.9% р-р NaCl) в стандартной дозе 250 мкмоль/кг массы животного. Животным контрольных групп вводили подкожно физиологический раствор в том же объеме. Количество животных в каждой группе - не менее десяти. Всего использовано 110 крыс и 250 мышей.

Перфузионные эксперименты проводились на изолированном кроветворном органе беспородных собак. Всего в эксперименте использовано 11 собак. Биотестирование эршропоэтической активности перфузатов проводили по модифицированному нами методу M. Cotes (1961) на мышах СВА массой 20-22 г. Всего в биотестировании использовано 100 мышей.

Культуральные исследования проводили на клетках линий L-929 и L-41.

Мазки костного мозга окрашивали по Романовскому-Гимза и по Папен-гейму и оценивали по классификации S.Killmann (1972), показатели периферической крови оценивали общепринятыми методами, подсчет ретикулоцитов осуществляли на мазках, окрашенных бриллианткрезиловым синим. Определение удельной объемной скорости потребления кислорода у крыс Wistar in vivo проводили с использованием специального метаболиметра, основанного на принципе известного аппарата Шатерникова.

Для исследования токсического действия вводимой соли кобальта мышам вводили хлорид кобальта в дозе 5 мкмоль на мышь (что соответствует = 250 мкмоль/кг), после чего определяли длительность плавания животных на

поверхности резервуара площадью 0.5 м2 при температуре 20° С (характеристика общего состояния животных) и длительность удержания на вращающемся валу (характеристика нейродефицита). Нейродефицит характеризуется неспособностью животных оставаться на вращающемся валу более 1 мин (N.W. Dunham, 1957).

Для перфузионных экспериментов использовали 11 беспородных собак в возрасте 2 - 3 г. массой 12 - 15 кг, у которых под общим наркозом выделяли и подключали к установке для искусственного жизнеобеспечения изолированного органа «Гомеостат 2» грудную кость, содержащую красный костный мозг. Подготовка животного к эксперименту, уникальная перфузионная установка «Гомеостат» и техника операции и перфузии разработаны в Международном научном центре исследований экстремальных состояний организма при Президиуме КНЦ СО РАН (ранее Лаборатории управления биосинтезом животных тканей Института биофизики СО РАН) под руководством профессора В.П. Нефедова (В.П. Нефедов и др., 1986).

Клетки линий L-929 (фибробласты мыши) и L-41 (клетки, полученные из лейкоцитов больного лейкемией) культивировали в смеси сред 199 и Игла (1:1), к которой были добавлены сыворотка крупного рогатого скота (10%) и антибиотики. Клетки высевали в пенициллиновые флаконы с покровными стеклами в концентрации (5 - 6) • 104 клеток на 1 мл и через 6-7 суток выращивания без смены среды получали культуры в стационарной фазе роста. Пролиферативную активность культуры оценивали по: средней плотности клеток (N) в поле зрения микроскопа диаметром 0.2 мм; митотическому индексу, выраженному числом митозов на одну тысячу клеток на фиксированных и окрашенных препаратах; числу живых и мертвых клеток, выявленному прижизненным окрашиванием 0.1 % раствором трипанового синего; содержанию в клетках белка, определяемому по методу Лоури. Клетки изолировали 0.0125 Н раствором КОН. Хлорид кобальта разводили раствором Хенкса.

Все полученные данные обрабатывали статистически с применением t-критерия Стьюдента.

С целью оценки возможного механизма универсального действия кобальта как имитатора гипоксии на субклеточном уровне исходя из гипотезы о том, что сенсорной молекулой, чувствительной и к недостатку кислорода, и к избытку кобальта, является гемопротеин, было предпринято исследование ab initio методом квантовой химии (Т.А. Романова и др., 2002). Исследовали атомную и электронную структуры комплексов металлопорфирин (МеР)-02 и МеР-Н20 в присутствии имидазола (Im) в качестве второго лиганда и без него (имидазольная группа гистидина - это ближайшая к гему функциональная группа глобина). Определяли энергию и особенности химической связи, а также изменения пространственной конфигурации гема в условиях гипоксии и при замещении атома железа в геме на атом кобальта.

В Главе 3 (Реакция организма млекопитающих на введение хлорида кобальта), состоящей из нескольких разделов, излагаются результаты исследования. В разделе 3.1 описано эритроидное кроветворение у крыс в первые 6 часов после воздействия хлорида кобальта. Данные морфологического анализа представлены на рис. 1.

0.5 1.5 3 6

Время после воздействия, ч

Рис. 1. Изменения показателей эритроидного кроветворения у крыс Wis-tar после подкожной инъекции хлорида кобальта в дозе 250 мкмоль/кг массы животного.

Е - эритроидные клетки трех степеней зрелости по классификации S.A. Kill mann (1972): Е1+Е2 - проэритробласты, ЕЗ - эритробласты, Е4+Е5 - нормобласты; Mi - мито-тический индекс.

Как видно из рис. 1, уже через 0.5 ч после введения хлористого кобальта содержание более ранних эритроидных клеток Е[+Е2 в костном мозге достоверно уменьшается, остается меньше исходной величины и через 1.5 ч, потом начинает увеличиваться и через 3 ч уже возвращается к норме (контрольному значению). Содержание клеток средней стадии зрелости Е3 убывает через 0.5 ч, но уже в следующей точке измерения, через 1.5 ч, начинает повышаться и остается далее выше контроля. Клетки Е4+Е5, наиболее близкие к выходу в периферическую кровь, претерпевают самые выраженные изменения: их содержание сразу начинает расти, максимально через 1.5 ч и остается достоверно выше контроля далее. Содержание пролиферирующих эритроидных клеток достоверно увеличено уже через 0.5 ч (107.78+1.21 % по отношению к контролю), еще больше через 1.5 ч (188.08±1.27 %), достигает максимума (342.5911.65 % по отношению к контролю) через 3 ч и остается достоверно больше через 6 ч после воздействия (122.11+0.14 %).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что активные процессы в костном мозге после избыточного поступления хлорида кобальта из внешней среды в организм происходят в первые три часа, а через шесть часов все исследованные показатели приближаются к норме. Поэтому на мышах ICR было предпринято более подробное исследование: показатели кроветворения и периферической крови снимали каждые 0.5 ч в течение первых трех часов после введения хлорида кобальта.

В разделе 3.2 рассмотрено кроветворение у мышей в первые три часа после введения хлорида кобальта.

На рис. 2 представлены данные, свидетельствующие об усилении эрит-роидного кроветворении, свидетельствующие о том, что содержание ретику-лоцитов в крови и пролиферирующих клеток в костном мозге повышено уже через 0.5 ч после инъекции хлорида кобальта, в следующие сроки наблюдения содержание ретикулоцитов немного повысилось к 1 ч после введения и далее заметных изменений не претерпевало, митотическая же активность

эритроидных клеток в костном мозге росла неуклонно и к трем часам после воздействия составляла почти 900 % от контроля.

Ретикулоциты -•— Митозы

^ 150 - *

0--

0.5

I 600'

5 450 -х

Ц зоо-

° ...

Рис. 2. Динамика содержания ретикулоцитов в периферической крови и мито-тическая активность клеток красного ростка костного мозга у мышей в разлитые сроки после воздействия хлоридом кобальта

1.5 2 3 ч

Эти результаты могут свидетельствовать о том, что при поступлении в организм животного хлорида кобальта в дозе, многократно превышающей физиологически необходимую, ответная реакция непосредственно со стороны кроветворения разворачивается уже в первые три часа после воздействия.

Одним из предположений об изменениях, вызываемых хлоридом кобальта на уровне целого организма, является то, что его введение в избыточных количествах приводит к так называемой гистотоксической гипоксии, т.е. к снижению потребления кислорода тканями организма при нормальной его доставке к ним.

Оценке такой возможности посвящен раздел 3.3, в котором удельную объемную скорость потребления кислорода на уровне целого организма у крыс Wistar in vivo определяли до инъекции хлористого кобальта, сразу (через 5 мин) после нее и через 3 и 6 часов. Исходное значение составило 38.45±3.08 единиц измерения (м^кг' с1 10"8), через 5 мин после введения хлорида кобальта потребление кислорода достоверно (Р< 0.01) снизилось до 20.20±3.20 ед., после чего средние значения скорости потребления кислорода увеличивались, оставаясь по-прежнему достоверно ниже исходной величины: 24.19±2.23 (Р< 0.05) и 26.05+0.94 (Р< 0.05) через 3 и 6 ч соответственно. Динамика представлена на рис. 3.

50 i 40

II 3<\

с 5 20 Н

о к

U

10 -I о

Исходная

5 мин

Зч 6ч

Время после инъекции

Рис. 3. Изменения удельной объемной скорости потребления кислорода (м3-кг1-с1- Iff8) у крыс Wistar после инъекции хлорида кобальта в дозе 250 мкмоль/кг массы. Сроки измерения: 5 мин, 3 и б ч после инъекции.

Для исключения влияния инъекции сравнивали изменения удельной скорости потребления кислорода через 5 мин после инъекций хлорида кобальта в физиологическом растворе (250 мкмоль/кг) и физиологического раствора в тех же объемах. При введении хлористого кобальта удельная скорость потребления кислорода уменьшалась до 74.79+0.75, а при введении физиологического раствора - увеличивалась до 114.8111.93 % от исходного значения (Р < 0.001). Таким образом, инъекция физиологического раствора, не содержащего кобальта, вызывает усиление потребления кислорода, т.е. наблюдаемое после введения хлорида кобальта снижение скорости потребления кислорода - не следствие вызванного инъекцией стресса. Визуально у животных сразу после введения хлористого кобальта наблюдались затрудненное дыхание, одышка, слабость. Быстрота ответной реакции позволяет предположить участие в ней нервной системы.

Степень токсического влияния введенного в организм хлорида кобальта оценивали на мышах по длительности плавания (тест на токсичность) и способности удерживаться на вращающемся валу (тест на нейротоксичность). Результаты этого исследования изложены в разделе 3.4.

Результаты измерения длительности плавания и длительности удержания на вращающемся горизонтальном валу мышей ICR после инъекции хлорида кобальта представлены в табл. 1.

Таблица 1. Длительность плавания и удержания на вращающемся валу

у мышей после введения хлорида кобальта, с

Тест Время после воздействия Длительность плавания, с Уровень Достоверности различия с исходным Длительность удержания на валу Уровень достоверности различия с исходным

Исходное 154.70+43.43 70.6ftt2.94

5 мин 58.80+3.75 Р< 0.001 41.00+2.50 Р< 0.001

30 мин 91.4±2.50 Р< 0.001 23.40+2.10 Р< 0.001

1ч 79.2±4.64 Р< 0.001 54.2±3.03 Р<0.01

Зч 116.4±2.84 Р< 0.001 56.4±2.81 Р< 0.01

6ч 110.2±3.62 Р< 0.001 55.7±2.97 Р<0.01

Из табл. 1 следует, что уже через 5 мин после введения хлористого кобальта способность животных плавать, их выносливость по отношению к физической нагрузке резко - = до 40 % от исходной величины - падает и остается достоверно ниже исходной величины во все сроки исследования, постепенно повышаясь.

Для исключения эффекта самой инъекции на д лительность плавания проводили дополнительный эксперимент. Мышам одной группы вводили хлорид кобальта, а животным контрольной группы - физиологический раствор в том же объеме. Исходная величина для всех мышей составила 157.00+4.45 с, через 5 мин после инъекции длительность плавания была: у мышей, которым вводили физиологический раствор - 172.0fttl3.19 с; у мышей, которым вводили хлористый кобальт - 52.25±3.74 с (Р< 0.001 как по сравнению с исходной величиной, так и по сравнению с длительностью плавания после инъекции физиологического раствора). Таким образом, стресс, вызванный инъекцией, не оказывает дополнительного влияния на длительность плавания. Что касается длительности удержания на вращающемся валу, то через 5 мин после воздействия эта величина составляла = 60 % от исходной величины, была минимальной через 30 мин - = 30 % от исходного уровня - и повышалась уже через 1 час после воздействия, оставаясь ниже исходного уровня во все рассмспрен-

ные сроки после воздействия. Состояние считается нейродефицитным, если животные могут продержаться на валу менее 1 мин. Исходная величина составила 70.60+2.94 с, т.е. мыши исходно пребывали в состоянии физиологической нормы. После воздействия во все сроки длительность удержания на валу была менее 1 мин, т.е. наблюдаемое после введения хлорида кобальта состояние животных можно характеризовать как нейродефицитное.

Краткий итог экспериментов in vivo: происходящая в ранние сроки после избыточного поступления в организм из внешней среды хлорида кобальта реакция со стороны кроветворения развивается на фоне тяжелого гипокси-чсского состояния всего организма, интоксикации и нейродефицита.

Для того, чтобы исследовать происходящие под воздействием хлорида кобальта в красном костном мозге изменения вне влияния организма как целого, были проведены эксперименты на изолированном перфузируемом костном мозге собаки, изложенные в разделе 3.5.

При перфузии без добавления хлорида кобальта концентрация клеток костного мозга в 1 мл после 6-часового эксперимента не превышала исходный уровень: (60±0.33) 109. Шестичасовая перфузия с кобальтом вызывала значительное (Р< 0.01) увеличение этого показателя до (4.35±0.33) 109.

Результаты анализа препаратов костного мозга представлены в табл. 2.

Таблица 2. Изменения костномозгового эритроидного кроветворения

после 6-часовой перфузии изолированной грудины собаки

Эритроидные клетки (на 1 тыс. ядросо-держащих) Исходный костный мозг (11=11) Уровень достоверности по сравнению с контролем Перфузия без хлорида кобальта (п=5) Уровень достоверности по сравнению с контролем Перфузия с добавлением хлорида кобальта (п=6)

Ej+EJ 7.00±0.80 Р< 0.01 4.09±0.34 Р<0.01 3.84±0.61

Еэ 39.01±2.54 Н.д. 30.80±3.59 Р< 0.001 23.08±2.13

Е4+Е5 53.93±2.62 Н. д. 65.00+5.01 Р< 0.001 73.11±2.35

M¡, %0 34.79±4.91 Н. д. 36.28±4.36 Р< 0.001 77.52±6.04

Эритроидные клетки, % 29.7Ctt2.00 Н.д. 30.72+3.13 Р< 0.001 53.44±1.68

Данные табл. 2 свидетельствуют о том, что перфузия костного мозга без хлорида кобальта мало изменяет показатели эршроидного кроветворения. Процентное содержание эритроидных клеток практически не изменялось, отмечался лишь незначительный сдвиг в сторону более зрелых элементов при статистически достоверном уменьшении содержания самых молодых.

При перфузии с хлоридом кобальта изменения по сравнению с исходными величинами хорошо выражены: достоверно снижено содержание клеток молодого и среднего возраста, а содержание наиболее зрелых клеток повышено. Митотический индекс эритроидных клеток более чем в 2 раза выше исходного (77.52±6.04 против 34.79±4.91 %о). Процентное содержание красных клеток также увеличено (53.44±1.68 против исходного 29.70±2.00 %).

Если рассмотреть различия между исследуемыми показателями в конце перфузии (табл. 2), то видна тенденция к уменьшению содержания клеток более молодого возраста при повышении содержания более зрелых. При этом различия в митотической активности существенны (Р< 0.001). Содержание эритроидных клеток также достоверно выше (Р< 0.001).

Краткий итог экспериментов по управляемой перфузии изолированного кроветворного органа: в отсутствие регуляторных влияний со стороны целого организма происходит активация эригроидного кроветворения хлоридом кобальта по крайней мере за счет усиления пролиферативной активности красных клеток костного мозга.

Для оценки возможности хлорида кобальта влиять на пролиферативную активность клеток было предпринято исследование на клетках в культуре, изложенное в разделе 3.6.

При добавлении хлорида кобальта в культуральную среду в на 7-е сутки культивирования в среде с 10 % сыворотки (стационарная фаза роста, состояние покоя) обнаружили усиление пролиферативной активности фиброб-ластов (Р< 0.001). Из рис. 4А следует, что митотический индекс клеток М1 максимален через 3 ч после введения хлорида кобальта в среду культивирования (=на 240 % по сравнению с контролем).

17

10 5 -\

О

ЕЖ

□ Контроль 40

ИОтог ^^

1^1:111

Исх 3 ч 6 ч

Время после добавления кобальта

Исх 3 ч 6 ч

Время после добавления кобальта

В

Рис. 4. Изменения митотического индекса (М) и средней плотности в поле зрения микроскопа (NJ клеток линии L-929 в состоянии покоя под влиянием хлорида кобальта в концентрации Iff6 М (добавление хлорида кобальта в питательную среду на 7-е сутки роста в среде с 10% сыворотки).

Средняя плотность клеток в поле зрения микроскопа (рис. 4В) максимальна через 6 ч после добавления в культуру хлорида кобальта. Эти данные свидетельствуют об усилении пролиферативной активности клеток L-929 под влиянием хлорида кобальта с максимальным значением митотического индекса через 3 ч после воздействия.

Краткий итог экспериментов in vitro: присутствие хлорида кобальта в среде культивирования оказывает стимулирующее действие на покоящиеся клетки, способствуя их выходу в состояние пролиферации.

Приведенные экспериментальные данные позволяют сделать предположение о том, что в различных клетках существует некий универсальный механизм ответа на избыточное поступление в клетку кобальта. Поэтому предприняли расчетное исследование, основанное на одной из гипотез о внутриклеточном механизме такого ответа - гипотезе гемопротеинового сенсора кислорода - и изложенное в разделе 3.7.

Основной результат исследования представлен в табл. 3, данные которой свидетельствуют о том, что атом кобальта в геме, находящемся в условиях нормального содержания кислорода, и атом железа в геме при гипоксии находятся приблизительно на одинаковых расстояниях от плоскости порфири-

нового кольца, т.е. комплекс кобальта с кислородом (кобальт при нормоксии) имитирует комплекс железа с водой (без кобальта, но в условиях гипоксии).

Таблица 3. Смещение атома металла по отношению к

порфириновому кольцу для различных лигандов, Á

Комплекс Смещение атома металла по от- Смещение атома металла после

ношению к порфириновому добавления дистального

кольцу лиганда

Ьп-СоР 0.176 -

Ьп-СоР-Ог -0.053 0.229

Ьп-СоР-Н20 0.040 0.136

Im-FeP 0.296 -

Im-FeP-Ог 0.182 0.114

ím-FeP-H20 0.102 0.194

Краткий итог: данные этого раздела предоставляют еще одно свидетельство тому, что избыточное поступление кобальта из окружающей среды в организм может ощущаться клетками этого организма как гипоксия.

Глава 4 - Обсуждение результатов исследования - завершается схематическим представлением о комплексной интегральной реакции организма млекопитающего как целого в первые часы после избыточного поступления кобальта.

Гипоксия

М нтоксикаичя

рганизм

Почка

Костный мозг

Увеличение содержания ретикувоцнто» периферической кровя

" Экспресс« паи :Постясний «РНКПошвяше бедка "сс ' эритропоэтнна ; эртропоээния * эригропогши

Убыль К1+К и ЕЗ ПИК "ИИТОЗОВ Нарастание Е4+Е5

Усиление прЬлыфератнгеоВ активности эритроадвых ютвток

Свхреци эритропоушн к кровь

Время, ч

Рис. 5. Схематическое представление о сложной многостадийной реакции, возникающей в организме животного в ответ на избыточное поступление хлорида кобальта

Завершают работу следующие

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ:

Подробно проанализировав быстрый (краткосрочный) отклик организма млекопитающего (на разных уровнях его иерархии: уровне целого организма, физиологических систем дыхания и крови, органном, клеточном и субклеточном) на антропогенное изменение экологической среды (избыточное содержание в среде и поступление в организм кобальта), можно полагать, что этот отклик сводится к следующему.

1. Поступление в организм хлорида кобальта в количествах, многократно превышающих необходимую норму, вызывает у животных (мышей и крыс) острое гипоксическое состояние, проявляющееся в резком снижении скорости потребления кислорода и сопровождающееся признаками тяжелой интоксикации.

2. В костном мозге животных (мышей и крыс) в первые шесть часов после введения хлорида кобальта в избыточных концентрациях происходит активация эритроидного кроветворения, выражающаяся в увеличении про-лиферативной активности и ускорении созревания клеток.

3. В изолированном от остального организма костном мозге собак, перфорируемом в течение шести часов раствором, содержащим хлорид кобальта, происходит увеличение пролиферативной активности эритроидных клеток.

4. Хлорид кобальта оказывает стимулирующее действие на покоящиеся фибробластоподобные клетки в культуре, способствуя их выходу в состояние пролиферации.

5. На внутриклеточном уровне кобальт прочнее связывается с гемом, чем железо; комплекс кобальтогема с кислородом (избыток кобальта и нормоксия) имитирует комплекс железогема с водой (обычный гем при гипоксии).

6. В костном мозге животных (мышей и крыс) существует резервная популяция эритроидных клеток, готовых при гипоксии и/или избыточном поступлении кобальта в организм немедленно выйти в митоз.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. В.П. Нефедов, В.П. Макаров, И.И. Моргулис и др. Анализ влияния ионов кобальта на эритроидное кроветворение // Гематол. и трансфузиол. -1984.-№6.-С. 40 - 43.

2. В.П. Нефедов, И.И. Моргулис. Гомеостаз эритропоэза и кобальт // Го-меостаз и регуляция физиологических систем организма / В.А. Лищук, Б. Лорд, В. Павлович-Кентера и др. - Новосибирск: Наука, 1992. - С. 222 - 229.

3. V.P. Nefedov, N.N. Astapkopvich, G.A. Dorrer, I.I. Morgulis. Mathematical modeling of red blood system homeostasis // Proc. XTV International Congress of Cybernetics - Namur, Belgium, 1995. - P. 26.

4. И.И. Моргулис, В.П. Нефедов. Некоторые компоненты физиологической реакции на воздействие ионами Со2* у крыс Wistar // Коррекция гомео-стаза. Материалы VII Всероссийского симпозиума, Красноярск, 17-22 марта 1996. - Красноярск: КНЦ СО РАН, 1996. - С. 90 - 92.

5. G.A. Dorrer, S.V. Oushanov, I.I. Morgulis, V.P. Nefedov. Modeling the homeostasis regeneration in the animal organism after cobalt administration // Homeostasis: new facts and hypotheses. Part II. - AMSE Press, Krasnoyarsk -Tassin, France. - 1996. - P. 97 - 108.

6. V.P. Nefedov, I.I. Morgulis, V.V. Nefedova. Artificial homeostasis in the study of visceral systems. The effect of environmental factors. // Abstracts of ХХХП1 International Congress of Physiological Sciences, St.Petersburg, June 30-July 5,1997. - SFb, 1997. -P041.38.

7.И.И. Моргулис, В.П. Нефедов. Изменения эршроидного кроветворения под воздействием ионов кобальта // Гомеостаз и окружающая среда. Материалы Vin Всероссийского симпозиума, Красноярск, 10-14 марта 1997. Т. 1. - Красноярск: КНЦ СО РАН, 1997. - С. 72-77.

8. И.И. Моргулис. Восстановление гомеостаза в организме животного после воздействия ионами кобальта // Тезисы докладов Ш съезда физиологов Сибири и Дальнего Востока. Новосибирск, 1997. - С. 152.

9. Е.В. Демиденко, Е.Г. Жуль, И.И. Моргулис, С.В. Ушанов, В.П. Нефедов. Моделирование физиологической реакции организма животного на введение ионов кобальта // Гомеостаз и окружающая среда. Материалы VIII Всероссийского симпозиума, Красноярск, 10-14 марта 1997. Т. 2. - Красноярск: КНЦ СО РАН, 1997. - С. 229 - 235.

10. Е.В. Демиденко, Е.Г. Жуль, И.И. Моргулис, С.В. Ушанов, В.П. Нефедов. Математическая модель реакции организма на воздействие ионами кобальта // Реконструкция гомеостаза. Материалы IX Международного симпозиума, Красноярск, 16-20 марта 1998. Т. 1. - Красноярск, 1998. - С. 268-274.

11. И.И. Моргулис, Е.Г. Жуль, В.П. Нефедов. Взаимодействие системы гемопоэза и системы дыхания при интоксикации // Тезисы докладов Международной конференции, посвященной 150-летию И.П. Павлова, 23 - 25 сентября 1999. - С.-Петербург, 1999. - С. 248.

12. Е.В. Демиденко, И.И. Моргулис, С.В. Ушанов. Моделирование реакции системы крови на стимуляцию кобальтом // Тезисы докл. XVII Съезда физиологов России, Ростов-на-Дону, сентябрь 1999. - Ростов-на-Дону, 1999.- С. 159.

13. В.П. Нефедов, И.И. Моргулис, О.В. Круглик. Коррекция гомеостаза организма в условиях действия неблагопрятных факторов окружающей среды в центральной части сибирского региона // Материалы Российской конференции «Организм и окружающая среда: жизнеобеспечение и защита человека в экстремальных условиях», Москва, 26 - 29 сентября 2000 г. В 2 т. Т. 2.-М., 2000.-С. 15.

14. В.П. Нефедов, И.И. Моргулис, О.В. Круглик, Г.А. Доррер, В.В. Нефедова. Гомеостаз организма и экстремальные состояния // Коррекция гомеостаза организма при экстремальных состояниях. Сб. науч. тр. - Новосибирск: Наука, 2000. - С. 5 - 15.

15. А.В. Коломейцев, Е.В. Бортников, И.И. Моргулис. Влияние хлорида кобальта на кроветворение у мышей в ранние сроки после воздействия // Гомеостаз и экстремальные состояния организма. Тезизы докладов XI Международного симпозиума, Красноярск, 19-23 мая 2003. - Красноярск, 2003. -С. 74-75.

16. О.В. Кравченко, Т.А. Романова, И.И. Моргулис, А.А. Кузубов, П. О. Краснов, П.В. Аврамов. Влияние природы металла на силу химического связывания молекулы кислорода железо- и кобальтопорфиринами // Гомеостаз и экстремальные состояния организма. Тезизы докладов XI Международного симпозиума, Красноярск, 19-23 мая 2003. - Красноярск, 2003. - С. 78 - 79.

17. Т.А. Романова, О.В. Кравченко, И.И. Моргулис, А.А. Кузубов, П.О. Краснов, П.В. Аврамов. Подтверждение гипотезы гемопротеинового сенсора ah initio методом квантовой химии // Координационная химия. - 2004. - Т. 30, №6.-С. 432-435.

18. Т.A. Romanova, l.l. Morgulis, P.O. Krasnov, P.V. Avramov. Hypothesis of Hemoprotein Sensor Confirmed by ab initio Quantum-Chemical Calculations // Internet Electronic Journal of Molecular Design. - 2005. - Vol. 4, No 5.

19. И.И. Моргулис. Организм и гипоксия // Сложные системы в экстремальных условиях. Материалы ХП Международного симпозиума, Саяны, 27 -31 июля 2004. - Красноярск, 2005. - С. 214 - 221.

Формат 60*84/16. Тираж 100 экз. Отпечатано в типографии «Город». 660125, г. Красноярск, ул. Водопьянова, 2-241

\

¿OOGb

047

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Моргулис, Ирина Ильинична

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ЭРИТРОПОЭТИЧЕСКАЯ ФУНКЦИЯ ОРГАНИЗМА И

СТРЕСС: ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ {ОБЗОР)

1.1. Кроветворение и стресс

1.2. Организм и гипоксия

1.3. Микроэлементы и физиология. Роль кобальта

1.3.1. Особенности химии кобальта и его соединений

1.3.2. Биологическая функция кобальта

1.3.3. Кобальт и эритроидное кроветворение

1.3.4. Кобальт и гипоксия

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Оценка показателей кроветворения

2.2. Измерение потребления кислорода

2.3. Исследование токсического действия хлорида кобальта

2.4. Управляемая перфузия изолированного кроветворного органа

2.5. Исследование на культурах клеток

2.6. Исследование возможного механизма 46 чувствительности клеток к избытку кобальта

Глава 3. РЕАКЦИЯ ОРГАНИЗМА МЛЕКОПИТАЮЩИХ НА

ВВЕДЕНИЕ ХЛОРИДА КОБАЛЬТА (РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ)

3.1. Эритроидное кроветворение у крыс в первые 6 часов после воздействия хлорида кобальта

3.2. Кроветворение у мышей в первые три часа после введения хлорида кобальта

3.3. Изменение потребления кислорода у крыс в ответ на введение хлорида кобальта

3.4. Токсическое влияние хлорида кобальта на организм в эксперименте на мышах

3.5. Управляемая перфузия изолированного костного мозга собаки

3.6. Влияние хлорида кобальта на пролиферативную активность клеток в культуре

3.7. Исследование внутриклеточных механизмов реакции организма на избыточное введение кобальта ab initio методом квантовой химии

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ранняя реакция организма млекопитающего на воздействие хлоридом кобальта"

Актуальность исследования.

Одной из наиболее важных проблем экологии является исследование антропогенных влияний на живые организмы, в особенности на млекопитающих, поскольку к ним относится и человек. Ведущим инструментом исследований для этой проблемы является анализ физиологического отклика на экологическое неблагополучие окружающей среды. Физиологический отклик слагается из краткосрочных и долгосрочных эффектов, обусловленных экологическим неблагополучием. В данной работе рассмотрены краткосрочные, быстрые эффекты.

Живые организмы любой сложности вынуждены жить в условиях, предлагаемых им той средой, которая их окружает. В этом взаимодействии складывается набор ответных реакций организма, всегда очень сложный, тем более сложный, чем сложнее сам организм, чем более продвинутым эволюцион-но он является. У высокоразвитых животных с их специально выработанным для сохранения целостности собственного организма в постоянно изменяющейся внешней среде приспособлением, которое Уолтер Кеннон (1929) назвал гомеостазом, эта реакция сложна, разветвленна и многоступенчата.

Любое экологическое воздействие (извне) вызывает цепь последовательных адаптивных реакций, реализующихся, пока гомеостатические механизмы не разрушены, в тесной пространственной (в пределах этого организма) и временной взаимосвязи. Концентрации веществ, даже жизненно необходимых для функционирования организма, имеют свои гомеостатические пределы, выход за рамки которых, будь то избыток или недостаток, приводит к комплексу локальных и системных реакций, направленных на устранение результатов этого выхода.

Одним из экологически значимых для организма химических факторов является элемент № 27 Периодической системы Д.И. Менделеева - кобальт. Кобальт относится к группе микроэлементов, т.е. является жизненно необходимым для функционирования живых организмов. Вместе с тем, в избытке, как и многие другие элементы или более сложные вещества, он для организма токсичен и даже может быть губителен. Природный источник кобальта -минералы. В больших количествах он содержится в медно-никелевых рудах, добываемых на территории Красноярского края.

Вредное воздействие кобальта в высоких концентрациях связывают главным образом и в первую очередь с тем, что избыточное поступление кобальта в организм сопровождается состоянием гипоксии, предположительно гистотоксической. А для нормального функционирования всех клеток любого организма кислород необходим. У простых беспозвоночных, состоящих из нескольких слоев клеток, для оксигенации достаточна простая диффузия кислорода непосредственно из окружающей среды. Например, у имаго Droso-phila melanogaster система разветвленных трахеальных трубок доставляет воздух во все уголки тела, позволяя кислороду свободно диффундировать в отдельные клетки. Гораздо большие размеры тела у человека и других позвоночных потребовали развития сложной физиологической инфраструктуры, на базе которой развились и возможности для гибкой, достаточно быстрой и соответствующей потребности доставки кислорода клеткам в нормальных и отличающихся от нормы условиях.

Кислородный гомеостаз в сложном организме обеспечивается тонкими механизмами регуляции как на метаболическом, внутриклеточном уровне, так и на уровнях ткани, органа, физиологической системы, целого организма. Специфически реагирующей на нехватку кислорода в организме тканью является кроветворная. Именно в компетенции кроветворной ткани находится продукция эритроцитов - клеток, поставляющих кислород всем остальным тканям организма. Основным регулятором выработки эритроцитов является специфический гликопротеиновый фактор роста эритроидных клеток эри-тропоэтин, содержание которого в крови в ответ на гипоксию любого происхождения повышается во много раз. В настоящее время это бесспорно доказанный факт. Однако усиление биосинтеза эритропоэтина - многостадийный процесс в организме, требующий такого промежутка времени (исчисляемого часами), в течение которого гипоксическое состояние клеток может оказаться необратимым, а судьба клеток - фатальной. Очень быстрые адаптивные реакции на острую гипоксию, такие как выброс эритроцитов из депо, выброс дополнительных порций ретикулоцитов из кроветворного органа костного мозга, явно недостаточны для того, чтобы компенсировать нехватку кислорода в течение нескольких часов до появления в крови эритропоэтина (6 ч, подробно в главе 1). В доступной нам литературе по этому вопросу мы не нашли никаких сведений о кинетике красного кроветворения в первые 6 часов после начала острой нехватки кислорода, вызванной введением избыточных количеств кобальта (в виде хлористой соли СоСЬ).

В то же самое время ясно, что непосредственный ответ со стороны кроветворения на введение избытка кобальта должен развиваться на фоне генерализованной стресс-реакции со стороны организма как целого, которая может включать как специфическую для гипоксических состояний, связанную с производством специального регулятора эритропоэтина, так и общетоксическую (подробно в главе 1) составляющие.

Поэтому актуальными представляются как исследование ранних изменений кинетики эритроидного кроветворения и пролиферативной активности красного ростка костного мозга, так и оценка общефизиологического состояния животного после поступления в его организм из окружающей среды избытка кобальта, рассмотренные в контексте отклика организма на экологическое воздействие.

Цель исследования.

Определить закономерности кинетики эритроидных клеточных элементов костного мозга и их пролиферативную активность на фоне изменений функционирования организма животного (млекопитающего) в целом в первые 6 часов после введения хлорида кобальта.

Задачи исследования.

1. Охарактеризовать кинетику клеточных эритроидных элементов костного мозга и их пролиферативную активность в первые 6 часов после введения хлорида кобальта в эксперименте in vivo на крысах и мышах.

2. Оценить уровень гипоксии и интоксикацию, развивающиеся у животных (мышей и крыс) в первые 6 часов после введения хлорида кобальта.

3. Исследовать изменения эритроидного кроветворения в изолированном перфузируемом костном мозге животных при добавлении в перфузион-ную среду хлорида кобальта.

4. Исследовать влияние хлорида кобальта на пролиферативную активность клеток в культуре.

5. Оценить возможность имитации кобальтом внутриклеточной гипоксии аЪ initio методом квантовой химии.

Новизна исследования.

Впервые исследована ранняя (в первые часы после воздействия) реакция системы красной крови животного на введение в организм избыточного количества хлористого кобальта.

Впервые реакция системы красной крови на введение избытка хлористого кобальта на ранних сроках исследована в сочетании с общей, генерализованной реакцией организма на данное стресс-воздействие и рассмотрена в контексте этой общей реакции.

Впервые в условиях воздействия хлористого кобальта получены данные, позволяющие предположить существование среди клеток красного ростка кроветворения резервной популяции клеток, готовых при создании особых (стрессовых) условий к выходу непосредственно в митоз.

Таким образом, эффекты хлористого кобальта впервые рассмотрены одновременно в двух аспектах: экологическом (как токсического агента, поступающего из окружающей среды) и физиологическом (как эффекты фактора, непосредственно и/или косвенно стимулирующего кроветворную функцию организма).

Практическая и теоретическая значимость работы.

Результаты исследования могут быть использованы при оценке степени вреда, наносимого живым организмам избыточным содержанием в среде их обитания переходных металлов, в частности кобальта.

Кроме того, полученные в работе результаты вносят вклад в понимание того, в какой последовательности и через какие механизмы может быть реализована в организме млекопитающего генерализованная, сложная и многостадийная реакция на экологическое неблагополучие.

Положения, выносимые на защиту.

1. В ответ на поступление в организм из внешней среды избыточного количества кобальта в виде соли C0CI2 у животных в течение первых часов после воздействия развивается генерализованная реакция, выражающаяся в значительном снижении удельной объемной скорости потребления кислорода, сопровождающемся признаками тяжелой интоксикации.

2. В ответ на поступление в организм из внешней среды избыточного количества кобальта в виде соли C0CI2 у животных в течение первых часов после воздействия развивается реакция со стороны костного мозга - органа, непосредственно участвующего в продукции клеток, доставляющих тканям кислород, выражающаяся в усилении пролиферации клеток красного ряда и ускорении их созревания.

3. В костном мозге интактных животных существует резервная популяция эритроидных клеток, непосредственно готовая при необходимости к выходу в митоз и обеспечивающая быструю адаптивную реакцию при изменении требований со стороны окружающей среды.

Апробация работы.

Основные результаты исследований были доложены на XIV Съезде Всесоюзного физиологического общества им. И.П. Павлова (Баку, 1983); на II Всесоюзном съезде гематологов и трансфузиологов (Львов, 1985); на VII Всероссийском симпозиуме «Коррекция гомеостаза» (Красноярск, 1996); на XXXIII Международном конгрессе физиологов (С.-Петербург, 1997); на VIII Всероссийском симпозиуме «Гомеостаз и окружающая среда» (Красноярск, 1997); на III Съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1997); на IX Международном симпозиуме «Реконструкция гомеостаза» (Красноярск, 1998); на Международной конференции, посвященной 150-летию И.П. Павлова (С.-Петербург, 1999); на XVII Съезде физиологов России (Ростов на Дону, 1999); на Российской конференции «Организм и окружающая среда: жизнеобеспечение и защита человека в экстремальных условиях» (Москва, 2000); на X Международном симпозиуме «Концепция гомеостаза: теоретические, экспериментальные и прикладные аспекты»; на XI Международном симпозиуме «Гомеостаз и экстремальные состояния организма» (Красноярск, 2003); на XII Международном симпозиуме «Сложные системы в экстремальных условиях» (Саяны, 2004).

Публикации.

Основные результаты работы изложены в 19 печатных работах, из которых 2 статьи в реферируемых журналах, 1 глава в коллективной монографии, 1 статья в международном электронном журнале, 13 тезисов и материалов конференций различного уровня, в том числе международных, 2 статьи в тематических сборниках статей.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 112 страницах, содержит 11 таблиц и 24 рисунка. Библиография содержит 161 наименование.

Заключение Диссертация по теме "Экология", Моргулис, Ирина Ильинична

выводы

Подробно проанализировав быстрый (краткосрочный) отклик организма млекопитающего (на разных уровнях его иерархии: уровне целого организма, „ физиологических систем дыхания и крови, органном, клеточном и субклеточном) на антропогенное изменение экологической среды (избыточное содержание в среде и поступление в организм кобальта), можно полагать, что этот отклик сводится к следующему.

1. Поступление в организм хлорида кобальта в количествах, многократно превышающих необходимую норму, вызывает у животных (мышей и крыс) острое гипоксическое состояние, проявляющееся в резком снижении скорости потребления кислорода и сопровождающееся признаками тяжелой интоксикации.

2. В костном мозге животных (мышей и крыс) в первые шесть часов после введения хлорида кобальта в избыточных концентрациях происходит активация эритроидного кроветворения, выражающаяся в увеличении про-лиферативной активности и ускорении созревания клеток.

3. В изолированном от остального организма костном мозге собак, пер-фузируемом в течение шести часов раствором, содержащим хлорид кобальта, происходит увеличение пролиферативной активности эритроидных клеток. * 4. Хлорид кобальта оказывает стимулирующее действие на покоящиеся фибробластоподобные клетки в культуре, способствуя их выходу в состояние пролиферации.

5. На внутриклеточном уровне кобальт прочнее связывается с гемом, чем железо; комплекс кобальтогема с кислородом (избыток кобальта и нор-моксия) имитирует комплекс железогема с водой (обычный гем при гипоксии).

6. В костном мозге животных (мышей и крыс) существует резервная популяция эритроидных клеток, готовых при гипоксии и/или избыточном поступлении кобальта в организм немедленно выйти в митоз.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Моргулис, Ирина Ильинична, Красноярск

1. Селъе Г. Очерки об адаптационном синдроме / Г. Селье М.: Медгиз, 1960. -315 с.

2. Селье Г. Профилактика некрозов миокарда / М.: Медгиз, 1961. - 206 с.

3. Селъе Г. На уровне целого организма / Г. Селье М.: Наука, 1971. - 121 с.

4. Селье Г. Концепция стресса как мы ее представляем в 1976 г. / Г. Селье // Новое о гормонах и механизме их действия. Киев: Наукова думка, 1977. -С.21— 51.

5. Горизонтов П.Д. Стресс и система крови / П.Д. Горизонтов, О.И. Белоусова, М.И. Федотова М.: Медицина, 1983. - 240 с.

6. Каро Дж. Молекулярные механизмы продукции эритропоэтина / Дж. Каро // Гомеостаз и регуляция физиологических систем организма. Новосибирск: Наука, 1992.-С. 80-89.

7. Гольдберг ЕД. Гомеостаз и регуляция кроветворения / Е.Д. Гольдберг, A.M. Дыгай // Гомеостаз и регуляция физиологических систем организма. Новосибирск: Наука, 1992. - С. 126 - 149.

8. Гольдберг ЕД. Новые данные о регуляции кроветворения в норме и при патологии / Е.Д.Гольдберг, A.M. Дыгай, В.А. Жданов // Коррекция гомеостаза организма при экстремальных состояниях / Под ред. В.П. Нефедова. Новосибирск: Наука, 2000. - С. 368 - 382.

9. Гольдберг ЕД. Роль вегетативной нервной системы в регуляции эритропоэза / Е.Д. Гольдберг, A.M. Дыгай, И.А. Хлусов- Томск, 1997. 218 с.

10. Гольдберг ЕД. Адренергические и холинергические механизмы регуляции кроветворения в у словиях экспериментальных невротических воздействий / Е.Д. Гольдберг, A.M. Дыгай, Е.Г. Скурихин и др. // Бюлл. экспер. биол. мед. 2000. - Т. 129, № 4. - с. 381-385.

11. Провалова Н.В. Механизмы действия адаптогенов на эритропоэз в условиях депривации парадоксальной фазы сна / Н.В. Провалова, Е.Г. Скурихин, О.В. Першина и др. // Бюлл. экспер. биол. мед. 2002. - Т. 133, № 5. - С. 496 — 500.

12. Г'азарян Г.К. Изучение механизма инактивации генома эритроцитов птиц. III. Пути терминальной дифференцировки эритроцитов / Г.К. Газарян, А.С. Кульминская // Онтогенез. 1975. - Т. 6, № 1. - С. 31-38.

13. Кульминская А.С. Пролиферативная активность клеток костного мозга и крови при фенилгидразиновой анемии у крыс / А.С. Кульминская, К.Г. Газарян // Онтогенез. 1980. - Т. 11, № 4. - С. 386-391.

14. Бабаева А.Г. Изменение характера дифференцировки эритроидного ростка костного мозга мышей под влиянием перитонеальных клеток доноров, подвергнутых кровопусканию / А.Г. Бабаева, Е.И. Белан // Онтогенез. 1988. -Т. 19, №2.-С. 125-131.

15. Белан Е.И. Роль перитонеальных Т-лимфоцитов и макрофагов в запуске стресс-эритропоэза in vivo после однократной массивной кровопотери у мышей / Е.И. Белан, JI.JI. Головкина // Бюлл. экспер. биол. мед. 1994. - Т. 118, №9.-С. 287-290.

16. Белан Е.И. Динамика изменения способности клеток перитонеального экссудата запускать различные механизмы эритроидной дифференцировки при массивной кровопотере у мышей / Е.И. Белан // Бюлл. экспер. биол. мед. -2000. -Т. 129, № 5. С. 521-524.

17. Gazaryan K.G. Genome activity and gene expression in avian erythroid cells / K.G. Gazaryan // Int. Rev. Cytol. 1982. - Vol. 74. - P. 95 -126.

18. Корвин-Павловская Е.Г. Характеристика путей дифференцировки эритроидных клеток птиц в условиях анемии / Е.Г. Корвин-Павловская, А.С Кульминская., Е.М. Коралова и др. // Цитология. 1983. - С. 148-155.

19. Ястребов А.П. Регуляция гемопоэза при воздействии на организм экстремальных факторов // А.П. Ястребов, Б.Г. Юшков, В.Н. Большаков Свердловск: УрО АН СССР, 1988. - 151 с.

20. Северин М.В. Регенерация тканей при экстремальных воздействиях на организм / М.В. Северин, Б.Г. Юшков, А.П. Ястребов Екатеринбург:УрГМИ, 1993.- 187 с.

21. Bondurant М.С. Anemia Induces Accumulation of Erythropoietin mRNA in the Kidney and Liver / M.C. Bondurant, M.J. Koury // Mol. Cell. Biol. 1986. - Vol. 6, No 7.-P. 2731-2733.

22. Nishida J. Detection of Erythropoietin Message in Hypoxic Mouse Kidney / J. Nishida, H. Hirai, M. Kubota et al. // Japan J. Exp. Med. 1986. - Vol. 56, No 6. -P. 321-323.

23. Bern N. Expression of Erythropoietin Gene / N. Bern, J. McDonald, C. Lacombe et al. // Mol. Cell. Biol. 1986. - Vol. 6, No 7. -P. 2571 -2575.

24. Schuster S.J. Physiologic Regulation and Tissue Localization of Renal Erythropoietin Messenger RNA / S.J. Schuster, J.H. Wilson, A.J. Erslev et al. // Blood. — 1987. —Vol. 70,Nol.-P. 316-318.

25. Killmann S.A. Mitotic Indices of Human Bone Marrow Cells. I. Number and Cytologic Distribution of Mitoses / S.A. Killmann, E.P. Cronkite, T.M. Fliedner et al. // Blood. 1962. - Vol. 19, No 6. - P. 743-750.

26. Епифанова О.И. Сравнительное изучение продолжительности митоза и ин-теркинеза в тканях мышей с помощью колхицина и облучения / О.И. Епифанова, А.И. Зосимовская, Л.Я. Ломакина и др. // Бюлл. экспер. биол. мед. -1963.-№!.-С. 96-100.

27. Наппа T.R.A. Shortening of the Cell-Cycle Time of Erythroid Precursors in Response to Anaemia / T.R.A. Hanna, R.G. Tarbutt, L.F. Lamerton // Brit. J. Haemat. 1969. - Vol. 16. -P. 381-387.

28. Monette F.C.I F.C. Monette, J. LoBue, A. S. Gordon et al. // Science. -1968. -Vol. 162.-P. 1132.

29. Воронин B.C. Продолжительность периодов митотического цикла эритро-поэтических клеток костного мозга крыс / B.C. Воронин, К.Н. Муксинова // Бюлл. экспер. биол. мед. -1973. № 4. -С. 91 -94.

30. Abrahamsen J.F. Orcadian Cell Cycle Variations of Erythro- and Myelopoiesis in Humans / J.F. Abrahamsen, R. Smaaland, R.B. Sothern et al. // Eur. J. Haematol. 1997. -Vol. 58. - P. 333 - 345.

31. Москалик К.Г. Суточная периодичность митотической активности, синтеза ДНК и длительности митоза в клетках костного мозга мышей / К.Г. Москалик // Бюлл. экспер. биол. мед. 1976. - № 5. - С.594- 59.

32. Carrol М. Erythropoietin-Induced Cellular Differentiation Requires Prolongation of the Gi-Phase of the Cell Cycle / M. Carrol, Y. Zhu, A.D. D'Andrea // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - Vol. 92. - P. 2869 - 2873.

33. Alippi RE. Enhanced Erythropoiesis Induced by Hypoxia in Hypertransfused, Posthypoxic Mice / R. Alippi, A.C. Barcelo, C.E. Bozzini // Exp. Hematol. 1983. -Vol. 11,No 9.-P. 878-883.

34. Loefler M. The Kinetics of Hematopoietic Stem Cells during and after Hypoxia / M. Loefler, B. Herkenrath, H.E. Wichmann et al. // Blut. 1984. - Vol. 49. - P. 424-439.

35. Lapidot-Lifson Y. Cloning and Antisense Oligodeoxy-Nucleotide Inhibition of a Human Homolog of cdc2 Required in Hematopoiesis / Y. Lapidot-Lifson, D. Pat-inkin, C.A. Prody et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. - Vol. 89. - P. 579 -583.

36. Matsushime H. Colony-Stimulating Factor 1 Regulates Novel Cyclins During the Gj Phase of the Cell Cycle / H. Matsushime, M.F. Roussel, R.A. Ashmun, C.J. Sherr // Cell. 1991. - Vol. 65. - P. 701 - 705.

37. Shimada Y. Erythropoietin-Specific Cell Cycle Progression in Erythroid Subclones of the Interleukin-3 Dependent Cell Line 32D / Y. Shimada, G. Migliac-cio, H. Shaw, A.R. Migliaccio // Blood. - 1993. - Vol. 81, No 4. - P. 935 - 941.

38. Perry H. Transcriptional Regulation of Erythropoiesis: Fine Tuning of Combinatorial Multi-Domain Elements / H. Perry, H. Soreq // Eur. J. Biochem. 2002. -Vol. 269.-P. 3607-3618.

39. Kingmller U. Multiple Tyrosine Residues in the Cytosolic Domain of the Erythropoietin Receptor Promote Activation of STAT5 / U. Kingmller, S. Bergel-son, J.G. Hsiao, H.F. Lodish // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - Vol. 93. - P. 8324-8328.

40. Kendall R.G. Erythropoietin / R.G. Kendall // Clin. Lab. Haemat. 2001. - Vol. 23.-P. 71-80.

41. Hermine O. An Autocrine Role for Erythropoietin in Mouse Hematopoietic Cell Differentiation / O. Hermine, N. Bern, N. Pech, E. Goldwasser // Blood. 1991. -Vol. 78. - P. 2253 - 2260.

42. Villeval J.L. Autocrine Stimulation by Erythropoietin (Epo) Requires Epo Secretion / J.L. Villeval et al. // Blood. 1994. - Vol. 84. - P. 2649 - 2662.

43. Choppin J. Characterization of Erythropoietin Produced by IW32 Murine Erythroleukemia Cells / J. Choppin et al. // Blood. 1984. - Vol. 64. - P. 341 -347.

44. Goldwasser E. Internal Autocrine Regulation of the Early Stages of Hemopoiesis / E. Goldwasser, O. Hermine, N. Pech, B. Stage-Marroquin // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1994. - Vol. 718. - P. 326 - 330.

45. Mitjavila M. T. Autocrine Stimulation by Erythropoietin and Autonomous Growth of Human Erythroid Leukemic Cells In Vitro / M. T. Mitjavila et al. // J. Clin. Invest. 1991. - Vol. 88. - P. 789 - 797.

46. Stage-Marroquin B. Internal Autocrine Regulation by Erythropoietin of Erythro-leukemic Cell Proliferation / B. Stage-Marroquin, N. Pech, E. Goldwasser // Exp. Hematol. 1996. - Vol. 24. - P. 1322 - 1326.

47. Stopka T. Human Hematopoietic Progenitors Express Erythropoietin / T. Stopka, J.H. Zivny, P. Stopkova, J.F. Prchal, J.T. Prchal // Blood. 1998. - Vol. 91. - P. 3766-3772.

48. Grisaru D. ARP, A Peptide Derived from the Stress-Associated Acetylcholinesterase Variant Has Haematopoietic Growth-Promoting Activity / D. Grisaru, V. Deutch, M. Shapira et al. // Mol. Med. 2001. - Vol. 7. - P. 93 - 105.

49. Sawyer S.B. Erythropoietin Stimulates 45Ca2+ Uptake in Friend Virus-infected Erythroid Cells / S. T. Sawyer, S.B. Krantz I I J. Biol. Chem. 1984. - Vol.259, No 5.-P. 2769-2774.

50. Kawane K. Requirement of DNase II for Definitive Erythropoiesis in the Mouse Fetal Liver / K. Kawane, H. Fukuyama, G. Kondoh et al. // Science. 2001. -Vol. 292.-P. 1546- 1549.

51. Анохин П.К. Кибернетика функциональных систем. Избранные труды / П.К. Анохин М.: Медицина, 1998.

52. Судаков КВ. Функциональная система, определяющая оптимальный уровень эритроцитов в организме / К.В. Судаков, Ю.М. Захаров // Клин. мед. -2002,- №4.-С.4 11.

53. Goldberg М.А. The Regulated Expression of Erythropoietin by Two Human Hepatoma Cell Lines / M.A. Goldberg, G.A. Glass, J.M. Cunningham, H.F. Bunn // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - Vol. 84, No 22. - P. 7972 - 7976.

54. Goldberg M.A. Regulation of the Erythropoietin Gene: Evidence That the Oxygen Sensor Is a Heme Protein / M.A. Goldberg, S.P. Dunning, H.F. Bunn // Science. 1988. - Vol. 242. - P. 1412 - 1415.

55. Goldberg M.A. Oxygen Sensing and Erythropoietin Gene Regulation / M.A. Goldberg, S. Imagawa, S.P. Dunning, H.F. Bunn // Contrib. Nephrol. 1989. -Vol. 76.-P.39-51.

56. Wang G.L. Hypoxia-inducible Factor 1 Is a Basic-Helix-Loop-Helix-PAS Het-erodimer Regulated by Cellular O2 Tension / G.L. Wang, B.-H. Jiang, E.A. Rue, G.L. Semenza // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - Vol. 92. - P. 5510 - 5514.

57. Jiang B.-H. Transactivation and Inhibitory Domains of Hypoxia-inducible Factor la / B.-H. Jiang, J.Z. Zheng, S.W. Leung et al. // J. Biol. Chem. 1997. -Vol.272, No 31.-P. 19253- 19260.

58. Ratcliffe P.J. Beyond Erythropoietin: The Oxygen Sensor / P.J. Ratcliffe, P.H. Maxwell, C.W. Pugh // Nephrol. Dial. Transplant. 1997. - Vol. 12. - P. 1842 -1848.

59. Романова ТА. Подтверждение гипотезы гемопротеинового сенсора ab initio методом квантовой химии / Т.А. Романова, О.В. Кравченко, И.И. Моргулис и др. // Координационная химия. 2004. - Т. 30, № 6. - с. 432 - 435.

60. Beck I. Enhancer Element at the 3 -Flanking Region Controls Transcriptional Response to Hypoxia in the Hyman Erythropoietin Gene / I. Beck, S. Ramirez, R. Weinmann, J. Caro // J. Biol. Chem. 1991. - Vol.266, No 24. - P. 15563 -15566.

61. Pugh C. W. Functional Analysis of an Oxygen-Regulated Transcriptional Enhancer Lying 3 to the Mouse Erythropoietin Gene / C.W Pugh., C.C. Tan, R.W. Jones, P.J. Ratcliffe // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - Vol. 88. - P. 10553 -10557.

62. Maxwell P.H. Inducible Operation of the Erythropoietin 3 Enhancer in Multiple Cell Lines: Evidenct for a Widespread Oxygen-Sensing Mechanism / P.H. Maxwell, C.W. Pugh, P.J. Ratcliffe // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - Vol. 90. -P. 2423 - 2427.

63. Semenza G.L. Hypoxia-Inducible Nuclear Factors Bind to an Enhancer Element Located 3' to the Human Erythropoietin Gene / G.L. Semenza, M.K. Nejfelt, S.M. Chi, S.E. Antonarakis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - Vol. 88. - P. 5680 -5684.

64. Wang G.L. Purification and Characterization of Hypoxia-Inducible Factor 1 / G.L. Wang, G.L. Semenza // J. Biol. Chem. 1995. - Vol.270. - P. 1230 - 1237.

65. Semenza G.L. HIF-1: Mediator of Physiological and Pathophysiological Responses to Hypoxia / G.L. Semenza // J. Appl. Physiol. 2000. - Vol. 88. - P. 1474-1480.

66. Semenza G.L. HIF-1 and Human Disease: One Highly Involved Factor / G.L. Semenza // Genes&Development. 2000. - Vol. 14. - P. 1983 - 1991.

67. Wenger R.H. Mammalian Oxygen Sensing, Signalling and Gene Regulation / R.H. Wenger // J. Exp. Biol. 2000. - Vol. 203. - P. 1253 - 1263.

68. Bruick R.K. Oxygen Sensing Gets a Second Wind / R.K Bruick., S.L. McKnight // Science. 2002. - Vol. 295. - P. 807 - 808.

69. Marx J. How Cells Endure Low Oxygen / J. Marx // Science. 2004. - Vol. 303.-P. 1454-1456.

70. Semenza G.L. Transcriptional Regulation of Genes Encoding Glycolytic Enzymes by Hypoxia-inducible Factor 1 / G.L. Semenza, P.H. Roth, H.-M. Fang, G.L. Wang // J. Biol. Chem. 1994. - Vol. 269, No 38. - P. 23757 - 23763.

71. Firth J.D. Hypoxic Regulation of Lactate Dehydrogenase A / J.D. Firth, B.L. Ebert, P.J. Ratcliffe // J. Biol. Chem. 1995. - Vol. 270. - P. 21021 - 21027.

72. Forsythe J.A. Activation of Vascular Endothelial Growth Factor Gene Transcription by Hypoxia-inducible Factor 1 / J.A. Forsythe, B.-H. Jiang, N.V. Iyer et al. // Mol. Cell. Biol. 1996. - Vol. 16. - P. 4604 - 4613.

73. Melillo G. A Hypoxia-responsive Element Mediates a Novel Pathway of Activation of the Inducible Nitric Oxide Synthase Promoter / G. Melillo, T. Musso, A. Sica et al. //J. Exp. Med.- 1995.-Vol. 182.-P. 1683- 1693.

74. Palmer L.A. Hypoxia Induces Type II NOS Gene Expression in Pulmonary Artery Endothelial Cells via HIF-1 / L.A. Palmer, G.L. Semenza, M.H. Stoler et al. // Am. J. Physiol. 1998. - Vol. 274. -P. L212-L219.

75. Rolfs A. Oxygen-regulated Transferrin Expression Is Mediated By Hypoxia-inducible Factor-1 / A. Rolfs, I. Kvietikova, M. Gassmann, R.H. Wenger // J. Biol. Chem 1997. - Vol. 272. - P. 20055 - 20062.

76. Lok C.N. Identification of a Hypoxia Response Element in the Transferrin Receptor Gene / C.N. Lok, P. Ponka // J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274. - P. 24147 -24152.

77. Epstein A.C.R. С. elegance EGL-9 and Mammalian Homologs Define a Family of Dioxygenases that Regulate HIF by Prolyl Hydroxylation / A.C.R. Epstein, J.M. Gleadle, L.A. McNeill et al. // Cell. 2001. - Vol. 107. - P. 43 - 54.

78. Ivan M. HIFa Targeted for VHL-Mediated Destruction by Proline Hydroxylation: Implications for 02 Sensing / M. Ivan, H. Kondo, H. Yang et al. // Science. -2001. Vol. 292. - P. 464 - 468.

79. Jaakkola P. Targeting of HIF-a to the von Hippel-Lindau Ubiquitilation Complex by 02-Regulated Prolyl Hydroxylation / P. Jaakkola, D.R. Mole, Y.-M. Tian et al. // Science. 2001. - Vol. 292. - P. 468 - 472.

80. Bruick R.K. A Conserved Family of Prolyl-4-Hydroxylases That Modify HIF / R.K. Bruick, S.L. McKnight // Science. 2001. - Vol. 294. - P. 1337 - 1340.

81. Yu F. HIF-la Binding to VHL Is Regulated by Stimulus-Sensitive Proline Hydroxylation / F. Yu, S.B. White, Q. Zhao, F.S. Lee // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2001. Vol. 98. - P. 9630 - 9635.

82. Lando D. Asparagine Hydroxylation of the HIF Transactivation Domain: A Hypoxic Switch / D. Lando, D.J. Peet, D.A. Whelan et al. // Science. 2002. - Vol. 295.-P. 858-861.

83. Goldwasser E. Mechanism of Erythropoietic Effect of Cobalt / E. Goldwasser, L.O. Jacobson, F. Fried et al. // Science. 1957. - Vol. 125. - P. 1086 - 1087.

84. Goldwasser E. II Studies on Erythropoiesis. V. The Effect of Cobalt on the Production of Erythropoietin / E. Goldwasser, L.O. Jacobson, F. Fried et al. // Blood.- 1958.-Vol. 13.-P. 55-60.

85. Gleadle J.M. Diphenylene Iodonium Inhibits the Induction of Erythropoietin and Other Mammalian Genes by Hypoxia. Implications for the Mechanism of Oxygen Sensing / J.M. Gleadle, B.L. Ebert, P.J. Ratcliffe // Eur. J. Biochem. 1995. -Vol.234.-P. 92-99.

86. Goldwasser E. Differential Inhibition by Iodonium Compounds of Induced Erythropoietin Expression / E. Goldwasser, P. Alibali, A. Gardner // J. Biol. Chem. 1995. - Vol. 270. - P. 2628 - 2629.

87. Моргулис И. И. Продукция эритропоэтина у крыс при сочетанном воздействии гипоксии и кобальта / И.И. Моргулис, В.П. Макаров, В.П. Нефедов // Гуморальная регуляция эритропоэза / Сб. науч. тр. 1982. - С. 11-15.

88. Wenger R.H. Optimal Erythropoietin Expression in Human Hepatoma Cell Lines Requires Activation of Multiple Signalling Pathways / R.H. Wenger, H.H. Marti, C. Bauer, M. Gassmann // Int. J. Mol. Med. 1998. - Vol. 2. - P. 317 - 324.

89. Maxwell P.H. The Tumour Suppressor Protein VHL Targets Hypoxia-inducible Factors for Oxygen-dependent Proteolysis / P.H. Maxwell, M.S. Wiesener, G.-W. Chang et al. // Nature. 1999. - Vol. 399. - P. 271 - 275.

90. Вернадский В.И. Биогеохимические очерки 1922 1932 гг. / В.И. Вернадский - М. - Л.: АН СССР, 1940. - 249 с.

91. Вернадский В.И. Очерки геохимии / В.И. Вернадский М.: Наука, 1983. -422 с.

92. Underwood E.G. Trace Elements in Human and Animal Nutrition / 4rd Ed. / E.G. Underwood- New York: Acad. Press, 1977.-402 p.

93. Войнар А.И. Биологическая роль микроэлементов в организме животных и человека / А.И. Войнар М.: Высшая школа, 1960. - 544 с.

94. Ковальский В.В. Геохимическая экология. Очерки / В.В. Ковальский М.: Наука, 1974.-299 с.

95. Ковальский В.В. Геохимическая среда и жизнь /В.В. Ковальский М.: Наука, 1982.-77 с.

96. Ковальский В.В. Современные направления и задачи биогеохимии / / В.В. Ковальский // Биологическая роль микроэлементов. М., 1983. - С. 3 - 17.

97. ЛвцынА.П. Микроэлементозы человека / А.П. Авцын // Клин. мед. 1987. - № 6. - С. 36.

98. Авцын А.П. Микроэлементозы человека / А.П. Авцын, А.А. Жаворонков, М.А. Риш, JI.C. Строчкова М.: Медицина, 1991. - 496 с.

99. Гончаревская О.А. Регуляция скорости проксимальной и дистальной реаб-сорбции при внутриканальцевом введении кобальта / О.А. Гончаревская, Ю.Г. Монин, Ю.В. Наточин // Физиол. журн. LXXI, № 10. - С. 1287 - 1292.

100. Yamagami К. Cd2+ and Со2+ at micromolar concentrations mobilize intracellular Ca2+ via the generation of inositol 1,4,5-triphosphate in bovine chromaffin cells / K. Yamagami, S. Nishimura, M. Sorimachi // Brain Res. 1998. - Vol.798. -P. 316 -319.

101. Comhaire S. Branchial cobalt uptake in the carp, Cyprinus carpio: Effect of calcium channel blockers and calcium injection / S. Comhaire, R. Blust, L. Van Ginneken et al. // Fish Physiol. Biochem. 1998. - Vol. 18. - P. 1 - 13.

102. Кудрин A.B. Металлы и протеолитические ферменты / А.В. Кудрин // Вопр. биол. мед. фарм. химии. 1999. - № 3. - С. 19-24.

103. Nieboer Е. Essential, toxic and therapeutic functions of metals (including determinant of reactivity) / E. Nieboer, W.E. Sanford // Rev. Biochem. Toxicol. 7. -New York, 1985. P. 205 - 245.

104. Young R.S. Cobalt / R.S. Young // Biochem. essent. ultratrace elem 1985. -P. 133- 147.

105. Taylor A. Cobalt: a review / A. Taylor, V. Marks // J. Hum. Nutr. 1978. -Vol. 32.-P. 165-177.

106. Taylor A. Detection and monitoring of disorders of essential trace elements / A. Taylor // Ann. Clin. Biochem. 1996. - Vol. 33. - P. 486 - 510.

107. Ueno M. Enhanced erythropoietin secretion in hepatoblastoma cells in response to hypoxia / M. Ueno, J. Seferynska, B. Beckman et al. // Am. J. Physiol. 1989. -Vol. 257, No 4. - P. C743 - C750.

108. Калиман ПА. Влияние хлорида кобальта на активность ключевых ферментов метаболизма тема в печени крысы / П.А. Калиман, И.В. Беловецкая // Биохимия. 1986.-Т. 51, №8.-С. 1307- 1308.

109. Shabaan A A. The role of pancreas in hyperlipaemic rats / A. A. Shabaan, V. Marks // Diabetologia. 1975. - Vol. 11. - P. 376.

110. Taylor A. Therapeutic use of trace elements / A. Taylor // Clin. Endocrinol. Me-tab. 1985. - Vol. 14. - P. 703 - 724.

111. Зак В.И. О механизме зобогенного действия кобальта / В.И. Зак // Бюлл. Экпер. Биол. Мед. 1968. - Т. 65, № 3. - С. 51 - 54.

112. Львова Г.Н. Защитные действия аскорбиновой кислоты в клетках людей, контактирующих с хлоридом кобальта / Г.Н. Львова, JI.B. Чопикашвили, И.М. Васильева и др. // Генетика. 1990. - № 7. - С. 1316 - 1319.

113. Heath J.S. The production of malignant tumours by cobalt in the rat: Intrathoracic tumours / J.S. Heath, M.R. Daniel // Brit. J. Cancer. 1962. - Vol. 16. - P. 473.

114. Осинский С. Селективность действия редокс-активных комплексов кобальта (III) на опухолевую ткань / С. Осинский, И. Левитин, Л. Бубновская и др. // Экспериментальная онкология 2004. - Т. 26, № 2. - С. 18 - 24.

115. Nemery В. Cobalt and possible oxidant-mediated toxicity / В. Nemery, C.P.L. Lewis, M. Demedts // Sci. Total Environ. 1994. - Vol. 150. - P. 57 - 64.

116. Edel J. Metabolic and toxicological studies on cobalt / J. Edel, G. Pozzi, E. Sabbioni et al. // Sci. Total Environ. 1994. - Vol. 150. - P. 233 - 244.

117. McKinney J. Metal bioavailability / J. McKinney, R. Rogers // Environ. Sci. Technol. 1992. - Vol. 26, No 7. - P. 1298 - 1299.

118. Ветров В.А. Микроэлементы в природных средах региона озера Байкал / В.А. Ветров, А.И. Кузнецова Новосибирск: Изд-во СО РАН НИЦ ОИГГМ, 1999.-234 с.

119. Anderson S.P.T. Nickel and cobalt: Their physiological action on the animal organism / S.P.T. Anderson // J. Anat. Physiol. 1883. - Vol. 17. - P. 89 - 123.

120. Izom G.E. Cyanide intoxication: Protection with cobaltous chloride / G.E. Izom, J.L. Way // Toxicol. Fppl. Pharmacol. 1973. - Vol. 24. - P. 449 - 456.

121. Esclapez M. Changes in GABA-immunoreactive cell density during motor focal epilepsy induced by cobalt in the rat / M. Esclapez, S. Trottier // Exp. Brain Res. 1989.-Vol. 76.-P. 369-385.

122. Waltner K. Kobalt und blut / K. Waltner, K. Waltner // Klin. Wschr. 1929. -Bd. 8.-S. 313.

123. Ястребов А.П. Исследование механизма действия кобальта на эритропоэз // Вопросы гематологии в эксперименте и клинике / А.П. Ястребов Свердловск, 1966.-С. 25-31.

124. Davis J.E. Cobalt polycythemia in the dog / J.E. Davis // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1937. - Vol. 37. - P. 96 - 99.

125. Warren C.O. Studies on the mechanism of cobalt polycythemia / C.O. Warren, O.D. Schubmehl, I.R. Wood // Am. J. Physiol. 1944. - Vol. 142, No. 4. - P. 173 -178.

126. Fisher J. W. Influence of cobalt, sheep erythropoietin and several hormones on eiythropoiesis in bone marrow of isolated perfused hind limbs of dogs / J.W. Fisher, B.Z. Roh, C. Cough et al. // Blood. 1964. - Vol. 23. - P. 87 - 98.

127. Naets J.P. Relation between erythropoietin plasma level and oxygen requirement / J.P. Naets // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1962. - Vol. 112, No 4. - P. 832 -836.

128. Barron A.J. Mechanism of cobalt polycythemia. Effect of ascorbic acid / A.J. Barron, E.S. Barron // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1936. - Vol. 35. - P. 467.

129. Fisher J.W. Influence of several hormones on erythropoiesis and oxygen consumption in the hypophysectomized rat / J.W. Fisher, J.J. Crook // Blood. 1962. -Vol. 19, No 5.-P. 557-585.

130. Necas E. Studies on the mechanism of cobalt action on erythropoietin production / E. Necas, J Neuwirt., J. Borova // Erythropoiesis / Eds K. Nakao, J.W. Fisher, F. Takaku. Baltimore: University Park Press, 1975. - P. 267 - 276.

131. Rodgers G.M. The role of renal adenosine 3',5'-monophosphate in the control of erythropoietin production / G.M. Rodgers, J.W. Fisher, W.J. George // Am. J. Med. 1975. - Vol. 58. - P. 31 - 38.

132. Ueno M. Enhanced erythropoietin secretion in hepatoblastoma cells in response to hypoxia / M. Ueno, I. Seferynska, B. Beckman et al. // Am. J. Physiol. 1989. -Vol. 257, No 4, pt 1. - P. C743 - C750.

133. Крохотина JI.B. Влияние кобальта на газовый состав крови, содержание 2,3-ДФГ в эритроцитах и уровень эритропоэтина в сыворотке крови / JI.B. Крохотина, А.Д. Павлов // Патол. физиол. 1986. - № 5. - С. 65 - 67.

134. Ambrosini M.V. Acid-base balance changes and erythropoietin production in the early stages of hypoxia or after C0CI2 treatment in the rabbit / M.V. Ambrosini, G.B. Principato, E. Giovannini et al. // Acta Haematol. 1979. - Vol. 62. - P. 32-40.

135. Miller M.E. Mechanism of erythropoietin production by cobaltous chloride / M.E. Miller, D. Howard, F. Stohlman et al. // Blood. 1974. - Vol. 44, No 3. - P. 339-346.

136. Fisher J. W. The production of erythropoietic factor by the in situ perfused kidney / J.W. Fisher, B.D. Birdwell // Acta. Haemat. 1961. - Vol. 26. - P.224 -232.

137. Fisher J.W. The influence of hypoxemia and cobalt on erythropoietin production in the isolated perfused dog kidney / J. W. Fisher, J. W. Langston II Blood. -1967.-Vol. 29, No l.-P. 114-125.

138. Schuster S.J. Stimulation of erythropoietun gene transcription during hypoxia and cobalt exposure / S.J. Schuster, E.V. Badiavas, P. Costa-Giomi et al. // Blood. 1989.- Vol. 73,No l.-P. 13-16.

139. Miller A. T. The effect of cobalt on the oxygen consumption of rats at various ambient temperatures / A. T. Miller, D.M. Hale // Arch. Int. Physiol. Biochem. -1970. Vol. 78. - P. 475 - 479.

140. ВладосХ.Х. Клиническая гематология / X.X. Владос -M.-Л., 1937.

141. Killmann S.A. Cell classification and kinetic aspects of normoblastic and megaloblastic erythropoiesis / S.A. Killmann // Cell Tissue Kinet. 1970. - No 3. -P. 217- 228.

142. Dunham N.W. Note of a simple apparatus for detecting neurological deficit in rat and mice / N.W. Dunham, T.S. Miya // J. Am. Pharm. Assoc. 1957. - Vol. 46.-P. 208.1.l

143. Нефедов В.П. Управление функциональной активностью органов при перфузии / В.П. Нефедов, В.А. Самойлов, Р.А. Гареев и др. Новосибирск: Наука, 1981. - 204 с.

144. Van Dyke D.S. Failure of cobalt to influence the life span of the eiythrocyte / D.S. Van Dyke, C.W. Asling, N.Y. Berlin et al. // Proc. Soc. Exp. Biol. 1955. -Vol. 88, No 3.-P. 488-489.

145. Епифанова О.И. Покоящиеся клетки. Свойства и функции в организме / О.И. Епифанова, В.В. Терских, В.А. Полуновский М.: Наука, 1983. - 176 с.

146. Cotes P.M. Bio-assay of erythropoietin in mice made polycythaemic by exposure to air at a reduced pressure / P.M. Cotes, D.R. Bangham // Nature (Lond.) -1961.-Vol. 191,No 1793.-P. 49-51.

147. Sato T. Erythroid progenitors differentiate and mature in response to endogenous erythropoietin / T. Sato, N. Maekawa, S. Watanabe et al. // J. Clin. Invest. -2000. Vol. 106. - P. 263 - 278.

148. Romanova Т.A. Hypothesis of Hemoprotein Sensor Confirmed by ab initio Quantum-Chemical Calculations / T.A. Romanova, I.I Morgulis., P.O. Krasnov et al. // Internet Electronic J. Mol. Design. 2005. - Vol. 4, No 5.