Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

РАДИОИНДИКАТОРНОЕ ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА ПОГЛОЩЕНИЯ ИОНОВ КАЛЬЦИЯ И РУБИДИЯ КЛЕТКАМИ КОРНЯ РАСТЕНИЙ

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "РАДИОИНДИКАТОРНОЕ ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА ПОГЛОЩЕНИЯ ИОНОВ КАЛЬЦИЯ И РУБИДИЯ КЛЕТКАМИ КОРНЯ РАСТЕНИЙ"

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

• , . — . На правах рукописи

Михаил Николаевич БАРАБАНЩИКОВ

РАДИОИНДИКАТОРНОЕ ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА ПОГЛОЩЕНИЯ ИОНОВ КАЛЬЦИЯ И РУБИДИЯ КЛЕТКАМИ КОРНЯ РАСТЕНИЙ

Специальность 03.00.12 — физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА — ¡980

ТсоЩШлЛ

Работа- выполнена на кафедре прикладной атомной- фнзи- * _ ки н радиохимии Московской ордена Ленина и ордена-Трудо-.-.' вого Красного Знамени сельскохозяйственной академии им.

К; А. Тимирязева- . - -

. Научный руководитель —доктор химических наук, профес- ■ и сор В. В. Рачинский. '

Официальные оппоненты: '

— доктор биологических;наук Д. Б. Вахмистров;:

— кандидат биологических наук, доцент Л; Г» Яглова.

Ведущее' предприятие —кафедра ботаники и физиологии: ,

растений Университета.дружбы народов им. П. Лумумбы. ;

Защита состоится;« * Т . » .ДбфК'Л . 1980 года -о/3-е. на заседании Специализированного совета К-120.35.06 в.Мо-. ' сковской сельскохозяйственной академии им.'К;-А. Тнмиря-■ зева,. ... ■ *.

Адрес: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 47. Ученый совет ТСХА. ■ „ - " " .;

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНЕ ТСХА.

- Автореферат разослан «

О^ОЛл^ ^ ,1980 г.

Ученый секретарь А

Специализированного совета— " '

кандидат биологических наук . . '

' _ В. Г. /Иарьенко. .

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Одним из вопросов, привлекающих внимание при исследовании минерального питання растений, является выяснение механизма поглощения ионов. Сложность изучения этого вопроса состоит в том, что поглощение зависит от целого ряда факторов — температуры, возраста растения и др. Уже в ранних исследованиях поглощения ионов растением были выявлены различия в их накоплении по длине корня (P. Prevot, 1936; F. С. Steward, 1942). В последующем подтвердилось существование, как правило, двух максимумов накопления ионов, относящихся к зонам растяжения и корневых волосков (J. В. Hanson, 1957; R. Handley, 1965; Y. Wai-sel, 1973). В ряде работ была сделана попытка вскрыть различия в механизмах поглощения ионов и охарактеризовать его как энергозависимый или энергонезависимый процесс. Критериями энергозависпмого поглощения являются его уменьшение при изменении температуры или добавления ингибиторов дыхания. Было выявлено, что энергонезависимое поглощение таких ионов, как натрий, стронций, хлор и рубидии, происходит в меристеме, а в клетках других зон оно энергозависимо (R, Handley, 1961, 1965; Е. Eisel, 1973). В последнее время для описания поглощения ионов клеткой широко используется электрохимическая концепция, которая применялась при нзучешш закономерностей ионного транспорта в клетках высших и низших растений. С электрохимических позиций было исследовано поглощение ионов корневыми клетками ряда растений: фасоли, бобов, кукурузы.

Таким образом, работы, посвященные поглощению ионов различными участками корня, являются в основном феноменологическими, не рассматривающими вопроса о его механизме, а исследования с позиций электрохимической концепции проводились либо на отделенных, либо на больших по размеру участках корня. Поэтому весьма актуально изучение потоков и электрохимического состояния ионов в клетках разных зон корня для выяснения того, как происходит формирование поглотительного аппарата.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы было выявление возможных изменений поглотительного ап*

(Центр. iijriHii Икблшш | i

Шея, <грд. Лежа садьхоз. I шд. и». К. А. Тгш^язгза j

парата клетки по мере дифференцяровкн первичного корня. В связи с этим перед нами стояли следующие задачи:

1) определение потоков меченого кальция и рубидия в клетках различных зон корня кукурузы; 2) измерение величин разности потенциалов в клетках различных зон корня; 3) построение математической модели для интерпретации полученных данных. Расчет электрохимических градиентов н коэффициентов проницаемости.

Объект исследования. В экспериментах использовались отрезки корней кукурузы сорта Стерлинг (элита), а также корнн проростков фасоли Харьковская и виндзорских бобов Пензенскне-16.

Научная новизна. Впервые измерены значения потоков ионов кальция и рубидия {химнческнй'аналог калия) в клетках строго определенных зон корня кукурузы. Полученные данные и установленная величина разности потенциалов были использованы для оценки электрохимического состояния ионов в клетках разных зон корня и коэффициентов проницаемости мембран. Обнаружено различие в кинетических кривых выхода элемента из зоны меристемы корней кукурузы, фасоли и бобов. Для объяснения результатов предложена соответствующая модель, Измерены вакуоли в меристем этической клетке. Использование современных методов позволило охарактеризовать изменение механизма поглощения ионов вдоль корня с позиций электрохимической концепции поглощения^ - ;

Практическая ценность и реализация результатов исследования. Результаты исследований могут быть использованы при изучении потоков ионов в растительных клетках, в построении общей картины изменений в клетках корня в процессе его днфференцнровкн, а также прн обосновании способов и сроков внесения минеральных удобрений.

Объем и апробация работы. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста, экспериментальные данные представлены в виде 37 таблиц, 9 рисунков п 22 приложений. Список литературы включает 262 наименования, в том числе 202 на иностранных языках.

Результаты исследований были доложены на Первой Всесоюзной конференции по сельскохозяйственной радиологии в 1979 г., Первом Московском семинаре по лонному обмену растений в 1979 г., конференции молодых ученых ТСХА в 1979 г.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИИ

Опыты проводились с проростками кукурузы сорта Стерлинг. Для более быстрого н равномерного прорастания семена кукурузы выдерживали 5 минут в горячей (60°) и 2 часа

в теплой (45е) воде, а затем помещали в кюветы на влажную фильтровальную бумагу и проращивали, в термостате при-28° в течение двух дней. Семена фасоли и'бобов без предвари^ тельной тепловой обработки проращивал» в аналогичных условиях. Для работы использовали 3-дневные проростки фасоли и 7-дневные прорости» бобов. Измерение потоков ионов кальция (45Са) и рубидия (86КЬ) проводили для клеток зон меристемы, растяжения и корневых волосков по кинетике выхода элемента из ткани.

Границы зон для корней кукурузы были взяты из работы Е. А. Бнбергаль, Ю. Я- Мазель (1975), а для меристемы корней фасоли п бобов определены с помощью светового микроскопа. Они лежали.на расстоянии соответственно до 1 и 3 мм от кончика корня. Проростки вначале помещали для насыщения в питательную среду, содержащую меченый элемент. Состав среды следующий: кальций н калий в концентрации Ю-4 или 10~3М; глюкоза—10 г/л. Время насыщения в зависимости от характера опыта колебалось от 3 до 17 часов, удельная активность раствора составляла 0,1—0,4 мкКи/мл,

После насыщения отделяли участки корня, относящиеся к различным зонам, и отмывали их немеченым раствором того же состава не менее С часов. Пробы отбирались под вакуумом, что обеспечивало возможность быстрой смены раствора, особенно в начале опыта.

Для определения количества элемента, вымытого из ткани,' отбирали аликвоты промывного раствора. Измерение их радиоактивности проводили на жидкостно-сциитилляцнонном р-спектрометре МАРК-П с применением жидкого сцинтилля-тора Брея, Для определения остаточной активности корни после окончания опыта высушивали и помещали во флаконы с жидким сцинтиллятором. Расчеты проводили на сырую массу во всех случаях. В опытах с зоной меристемы у корней проростков перед насыщением удаляли корневой чехлпк для предотвращения сорбции ионов на коллоидах слизи. При изучении влияния ингибиторов дыхания на значения потоков ионов в среду насыщения добавляли карбонилцианнд-м-хлор-феинлгндразон (КЦХФГ) в концентрации 10~6М и азид натрия -г 10"3М.

Интенсивность дыхания клетками разных зон корня 2-дневных проростков кукурузы определяли полярографическим методом.

Размеры вакуолей п мернстематических клетках корня 2-дневных проростков кукурузы получали непосредственным измерением их на фотографиях, сделанных с помощью электронного микроскопа при увеличенииX30 ООО.

Количество клеток в различных зонах корня кукурузы оп-

ределялн непосредственным подсчетом на фотографиях, сделанных с парафиновых срезов при помощи микрофотонасад-К1(, увеличениеX30.

В качестве механической части установи» для микроэлектродных исследовании использовали микроманнпулятор с жестко фиксированным на нем микроскопом МББ. Для определения мембранных потенциалов использовали стеклянные микроэлектроды, которые представляли собой солевые мостики, заполненные ЗМ КС1 + 0,2М М^СЬ. Микроэлектроды изготовляли на автоматической установке МЭ-3.

Мнкроэлектроды соединяли с А^/АёС! стандартными хлор-серебряными полуэлементами типа ЭВЛ-1. С полуэлементов сигнал поступал на измерительный прибор рН-340 и регистрировался на самопишущем микровольтметре КСП-4. Введение контролировали визуально под микроскопом МББ с бинокулярной насадкой АУ-12 при увеличенииХ300.

Определение содержания микроэлементов по длине корня 2-диевных проростков кукурузы проводилось методами рент-генофлуоресцентного анализа и пламенной фотометрии.

Величины потоков и содержание ионов в индивидуальных компартментах рассчитывали исходя из параметров графического разложения кривом выхода меченого элемента из ткани и представлений о трехкомнартментальной модели клетки.

Система уравнений, описывающих распределение меченого элемента в такой модели, следующая:

(1)

= -¡-Фус5\ — (Фсо + (0СУ)5(; (2)

. _-^¿«ф^-ф^, (3)

где = — для массы меченого элемента от общего со-

держания элемента в комлартменте;

У| — масса меченого элемента в 1-м компарт-меите;

Фц — поток между 1-м и у'-м компартментами; — содержание нона в компартмеите; о, с, у — индексы, относящиеся к внешнему раствору, цитоплазме н вакуоли соответственно.

Уравнения относятся к уравнениям баланса массы для каждого из компартментов клетки. Такая система дифференциальных уравнений легко решается при условиях независимости от времени потоков и содержания элемента в компартмеите, равенства потоков на каждой из мембран Ф0С=ФС0 и фс„=фте , когда общий поток на мембране равен нулю Ф = 0.

КЗ-ЛЬуШл

руеидии.

р.

ю"чм

К..6. ^

10%

Электрохимическое состояние ионов кальция и рубидия в клетках" зга корня кукурузы Р, * -ч»она растяжения •

. К.В, - зова корневых волосков

|—1 • - - шаэшшеша

V у/А - тоноаласт ' ,

------- активный транспорт

•—_- ■■ ■ »-- - пассивный транспорт ■

, Как было показано С. К. Pallaghy, В. I. Н. Scott (1969), неизвестные величины потоков и содержание элемента в ком-партменте можно рассчитать, используя параметры графического разложения кривой меченого элемента из ткани (константы Кс> Кч и отрезки по осн Y—Ус, Уv), величину времени насыщения (Т) и 50. Авторы приводят следующие урав-

нения (метод I): .

<tV-0 JS0)(k,-S+kv-L); ' (4)

Ф„^S.LibS+kr.L)] • [(5)

Q=(1/S0)(S + L), ' (6)

' ' <7>

5=ycyTl-exp(-fecr)], (8)

¿ = ПД1_ехр(-йуГ)]. (9)

С помощью уравнений (4—7) определяются потоки на плазмалемме (4) и тонопласта (5), содержание элемента в клетке (6) и цитоплазме (7).

Когда потоки изменяются во времени или существует общин поток (Ф=/=0), нельзя получить общего решения исходной системы дифференциальных уравнений, В этом случае можно предложить, что ткань находится в квазистаиионарном состоянии, т. е.

-ф-о. (Ю)

При этом потоки н содержание иона в компартменте можно вычислить следующим образом (метод II).

Фус=(1+а) (Ф1п-Ф).

Ос-(1+а) +ф,а_ф)/6е.

Р-(Фи,—Ф)УАт+Уе(1+а)/50.

Ф^Фос—Фсо=Фсу—Фус-

(11)

(12)

(13)

(14)

(15)

(16) (17)

. Графическое разложение кинетической кривой и необходимые расчеты проводили по составленным нами программам па миникомпыотере «Ин-90» (фирма Интертехннк, Франция). Полученные экспериментальные данные подвергались статистической обработке.

. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Потоки меченого кальция (43Са) в клетках зон корня

кукурузы

Графическое разложение суммарной кинетической кривой обычно приводит к появлению трех составляющих, относящихся к вакуоли, цитоплазме и свободному пространству (P. G. Pitman, 1963; W. J. Cram, 1968; W. S, Pierce, N. Hi-fiinbotham, 1970).

Поведение нона можно охарактеризовать также временем полувыведення, которое зависит как от природы исследуемого иона, так и от объекта. Для вакуоли оно колеблется от 120 до 6000 мин, цитоплазмы — от 10 до 40 мин, свободного пространства— менее 2 мин (P. G. Pitman, 1963; W. J. Cram, 1968; Л. Е. S. Macklon, 1970). Рассчитанное нами время полувыведення из вакуоли составило 107—596 мин, из цитоплазмы — 15—47 мин, из свободного пространства — 0,73— 3,83 мин. Обнаружены различия во времени полувыведення из комнартментов для разных зон корня.

В большей степени изменялось время полувыведення из вакуоли' в сторону его уменьшения от зоны корневых волосков к меристеме. С целью выяснения, происходит ли изотопный обмен со всем пулом или какая-то часть связана с ком-партментом, обладающим большим значением Т>., , был поставлен ряд экспериментов с зоной корневых волосков корня

Таблица 1

Потоки меченого калышя в клетках зоны корневых волосков корня кукурузы прн различном времени насыщения. Концентрация раствора Ю-3 Л\

Q Qt <bvc «»со <t>cv

мэкв/кг мэкв/кг-ч

Вречм насыщения 17 часов, Ф0с —1,46 i 0,02

' 5,0

3,0

1,69 ±0,01

М4±0,05

l,S9i:0,05

Время насыщения 4 часа, Ф0с = 1,39=0,21

1,74±0,17

1,29-0,ОГ.

1,922:0.17

0,72 iO.Oli

0,76 ±0,09

при времени насыщения «17 часов н продолжительности отмывания ткани немеченым раствором 10 часов (табл. 1).

Из табл. 1 видно, что измерение времени насыщения не приводит к достоверным различиям в значениях потоков, а графический анализ кинетической кривой выхода не выявил дополнительного комнартмента.

При срапненпи потоков в корнях растений, выращенных на водопроводной и дистиллированной воде, существенных различий не обнаружено (табл. 2).

Таблица '2

Потоки меченого кальция в клетках зоны корневых волосков корня при квазцстационарных условиях. Концентрация раствора Ю-3 М .

<Эе Фус Фсо Фсу ,

мэкв/кг м^кв/кг.ч

Водопроводная пода, Ф0с = 1,39 ±0,21

10,0

10,0

2,60 ±0,27

2,92 ±0,1 Г.

3,08±0,26

Дистиллированная вода, Фос 1,31 =0,03

3,07 ±0,07

2.21 ±0,01

2,26=0,01

1,21 — 0,15

1,2Э±0,01

Результаты опытов с отрезками корней зоны корневых волосков как со стелью, так и без нее также сопоставимы. Полученные значения потоков следует относить к компартмсн-там клеток коры корпи.

Если исходить из стационарных условий, .то можно рассчитать общее содержание попа в клетках разных зон корня (табл. 3). Содержание кальция, вычисленное таким образом,

Таблица 3 Потоки меченого кальция в зонах корня кукурузы при стационарных условиях

Концентрация, М Я Ос Фсо ф (V

мэкв/кг мэкв/кг. ч

10-" ю-3

Ю-1 Ю-3

Участок корня 3—5 мм от кончика

3.25 ±0,13 11,28 ±0,62

1,83±0,11 5,43 ±0,52

2,28 ±0,21 4,62±0,18

Участок корня 15—30 мм от кончика

1,00 ±0,11 3,12-0,41

0,42-0,03 1,58 ±0,25

0,5 5 ±0,04 1,62 ±0,25

0,60 ±0,03 2,02 ±0,06

0,!3±0,01 0,56 ~ 0,09

оказалось ниже полученного химическим путем. Это указывает на отсутствие стационарных условий поглощения. Наиболее близкие к ним условия, вероятно, существуют в клетках зоны растяжения при концентрации раствора Ю-^М.

Когда потоки изменяются во времени и неравны Друг другу, расчеты следует производить исходя из квазнстацио-нарных условий. При вычислении потоков на мембранах необходимо знать величину обшего потока через систему (Ф = (1>ос—Фсо =Фс¥ —Ф»с )• Максимальное значение потока может быть получено при использовании данных о содержании кальция и ткани, определенного химическим путем, однако оно несомненно завышено, поскольку кальций в клетке находится преимущественно в связанном состоянии. Минимальное значение общего потока будет определяться концентрацией иона в клетке. Исходя из этого, значения О варьировали в пределах от 0,8 до 10 мэкв/кг. При расчетах потоков в квазнстационарных условиях для некоторого значения наблюдалось изменение знака у общего потока через систему. Таким образом, можно предположить, что в квазистационарных условиях в зависимости от потребностей клетки ион либо поступает в нее, либо выходит из нее. Из рассчитанных величии потоков наиболее вероятными являются значения, близкие к значению при котором происходит изменение знака общего потока.

В квазистационарных условиях при'концентрации раствора 10-<М значения потока из внешнего раствора в цитоплазму составили 1,96±0,19 и 0,51 ±0,03 мэкв/кг>ч для клеток зон растяжения и корневых волосков соответственно. Десятикратное увеличение концентрации приводило к возрастанию этого потока для тех же зон в 1,97 и 2,72 раза. Было обнаружено' различие и в других потоках для клеток зон корня.

Таблица 4

Потоки мечного кальция в клетках зон растяжения и корневых волосков корня кукурузы. Концентрация раствора 10-* Л1

Вариант С <5с Фуе Ф со Фет

мэкв/кг мэкв/кг • ч

1 2 3,40 0,77*0.04 1,72*0,11 0.77*0,10 0,92±0,0» 1,03*0,06 2,23*0,18 0,25±0,03 0,65*0,03

1 2 8,00 1,-15*0,12 2,93*0,25 1,92*0,21 2,81*0,11 1,96*0,16 3,65*0,21 0,4 7 ±0,06 1,13±0,09-

1 2 10.00 1,74*0,15 3.47^:0.32 2,4 2 ±0,30 3,04*0,14 2,36^0,20 4,2 7 ±0,22 0,57*0,08 1,34*0,11

Примечание: 1 — зона корневых волосков {15—30 мм от кончика); 2 —зона растяжения (3—5 мм от кончика НОРНА

При поглощении из раствора 10~4М в клетках зоны растяжения поток из цитоплазмы во внешний раствор и потоки на1 1 тонопласте были больше, чем в клетках зоны.корневых волосков (табл. 4). Для каждого значения О поток из цитоплазмы во внешний раствор в зоне растяжения был выше в 2, а для Феу и Фус —примерно в 2,5 п 1,5 раза.

2. Влияние ингибиторов дыхания на значения потоков нона кальция

I

Для выявления энергонезаписимостн или энергозависимости транспорта мы исследовали влияние ингибиторов окислительного фосфорилпрованин КИХФГ н азида натрия на зна- -чения потоков кальция на мембранах.

Таблица 5

Поток меченого кальция из внешнего раствора в цитоплазму в клетках различных зон корня при квазнсгационарных условиях

Концентрация, М Участок корня, мм от кончика Контроль КЦХФГ Контроль Азид натрия

мэкв/кг. ч

Ю-4 ю-5 3—5 15—30 3-5 15—30' 1,81*0,15 0,72±0,02 5,90 ±0,31 1,89 ±0,28 / 1,99^0,07 0,59±0.05 4,92*0,10 ],82±0,10 4,07±0,26 0,64*0,01 3,61 ±0,11 0.58 ±0,01

Добавление в среду ингибиторов не приводило к достоверному уменьшению потока из внешнего раствора в цитоплазму как в клетках зоны растяжения, так и в клетках зоны корневых волосков (табл. 5). При этом значение потока в контроле для разных зон корня по сравнению с его значением, определенным ранее при обеих концентрациях, получалось выше. Увеличение потока в контроле, возможно, происходит из-за частичного повышения проницаемости мембран при действии этанола.

В присутствии КЦХФГ при концентрации раствора Ю~4М в зоне корневых волосков было установлено достоверное увеличение потока из цитоплазмы в вакуоль, которое составило 39% (табл.6).

Потоки Фс0 и достоверно не изменялись. При кон-

центрации внешнего раствора 10~3М"потоки на мембранах уменьшались, но недостоверно. >

В клетках зоны растяжения корня в присутствии КЦХФГ -при концентрации раствора 10-4М происходило достоверное увеличение (на 36—40%) потока иона кальция из цитоплазмы в вакуоль, другие потоки не изменялись. При возрастании

Таблица 6

Влияние КЦХФГ на потоки меченого кальция в клетках юны корневых волосков корня кукурузы при к ваз и стационарных условиях. Концентрация раствора Ю-1 М

Вариант а ' Ос •Рус Фсо Фсу

мэкп/кг мэкв/кг. ч

1 О 3,60 1,13±0.03 1,54 ±0,07 0,74±0,07 0,77 ±0,06 1,16=0,10 0,90±0,03 0,30 ±0,01 0,46±0,04

о 7,20 1.ад ±0,03 2,62 ±0,18 1,6|±0,15 1,71-0,13 1,86±0,17 1,52 ±0,01 0,48 ±0,01 0,78 ±0,08

1 о 10,00 2,32 ±0,0:2 3,46±0.26 2,29 0,21 2,44±0,)8 2,40 ±0,23 2,00^:0,02 0,62 ±0,02 1,03±0,)2

При меч а н не. 1. — контроль; 2 — КЦХФГ,

концентрации раствора характер изменений потоков Ф^ и Фтс остался прежним, поток из цитоплазмы в вакуоль возрос в 1,4 раза. При >том наблюдалось уменьшение потока из цитоплазмы во внешний раствор на 30%. Такое изменение потоков на мембранах приводило к возрастанию содержания иона кальция в шгсонлаз'ме.

В присутствии другого ингибитора — азида натрия — при концентрации раствора 10-4М наблюдалось изменение потоков лишь в зоне растяжения: уменьшался поток из цитоплазмы во внешний раствор и увеличивался ноток в вакуоль. Возрастание потока Ф1У и присутствии как КЦХФГ, так и азида натрия было примерно одинаковым — 1,5—1,7 раза. Уменьшение потока из цитоплазмы во внешний раствор для клеток зоны растяжения при концентрации 10-4М составило 23— 28%.

3. Потоки меченого рубидия (&6ЯЬ) в клетках зон растяжения н корневых волосков

Кинетическая кривая выхода нона рубидия из клеток зон растяжения н корневых волосков по своему характеру не отличалась от кривой, полученной для иона кальция. Ее разложение выявило три составляющие, относящиеся к вакуоли, цитоплазме и свободному пространству. Время полувыведе-иня иона рубидия из вакуоли — 420—7709 мин, из цитоплазмы— 28—54 мин, из свободного пространства — 0,4—6,1 мин.

В результате опыта с длительным временем насыщения было установлено, что 4 часа достаточно для полного протекания изотопного обмена в компаргментах клетки.

Сравнение потоков на нлазмалемме н топопласте разных зон корня показало, что в клетках зоны растяжения они были ю

сыте (табл. 7). Рассчитанное, значение содержания нона оказалось ниже полученного химическим путем. Это указывав ет на отсутствие стационарных условий поглощения нона в клетках обеих зон корня.

При проведении расчетов для квазистацпоиарных условий величина <2 изменялась от 10 до 100 мэкв/кг, последняя соответствует содержанию, определенному "химическим путем.

Таблица 7

Потоки иона рубидия (8бйЬ) в клетках зон корня кукурузы при стационарных условиях (метол 1)

Концентрация, М а <5с Ф со Ф СУ

мэкв/кг мэкв/кг. ч

Участок корня 3—5 мм от кончика

|0-< Ю-'

ю-*

ю-3

81,7=6,0 71,4+1,20

5,9 ±1,4 6,39 ±0,26

2,54 ±0,41 4,00=1:0,08

Участок корня 15—30 мм от кончика

29,4 ±3,9 112,21 ±0,89

2,54 ±0,31 4,32 ±0,26

1,2 4 ±0,05 2,66 ±0,06

2,46 ±0.24 2,78 ±0,12

1,13±0,09 1,97 ±0,05

В клетках зоны растяжения поток из внешнего раствора в цитоплазму при концентрации раствора был 2,43:±0,37,

что выше, чем в клетках зоны корневых волосков, где он составлял 1,18^:0,06 мэкв/кг-ч, а при концентрации 10~3М разница между зонами достигала 1,5 раза.

-бк'летклх Тоблииа'8

Потоки меченого рубидня^зон растяжения и корневых волосков корня кукурузы при к в аз и стационарны к условиях. Концентрация раствора 10"-* М

Вариант (3 Ос Ф« Ф со Фее

мэкв/кг мэкв/кг .4

2 10,0 3,05 ±0,76 1,88 ±0,27 0,2 4 ±0,03 0,60±0,12 1,34±0,21 0,83 ±0,04 1,33 ±0,14 0,95=0,11

1 2 15,0 3,26 ±0,80 2,33 ±0,40 0,42 ±0,05 0,95=0,20 1,42 ±0,25 0,96 ±0,03 1,42±0,15 1,16±0,16

1 о 85,0 6,3 ±1,5 8,6 ±2,2 3,01 ±0,46 5,8 ±1,3 2,64 ±0,48 2,88 ±0,28 2,80 ±0,34 4,13±0,94

I о 100,0 6,9 ±1,7 9,9 ±2,3. 3,6 7 ±0,53 6,9 ±1,5 2,90 ±0,53 3,29 ±0,33 3,09 ±0,38 4,8 ±1,1

Примечание. 1 — зона растяжения (3—5 мм); 2-левых волосков (15—30 мм).

•зона кор-

Сравнение потоков в клетках зон растяжения и корневых волосков для концентрации раствора 10-4М' показывает достоверное увеличение потока: из вакуоли в цитоплазму при переходе к более базальной зоне корня, .(табл. 8). Изменение других потоков недостоверно. Сопоставление потоков в зонах для концентрации Ю_3М указывает на обратное поведение потока из вакуоли в цитоплазму. При этом происходит достоверное возрастание потоков из цитоплазмы в вакуоль и во внешний раствор в клетках зоны растяжения, которое составляет 40%.

4. Влияние ингибиторов дыхания па значения потоков , иона рубидия

Установленное снижение значения потока ФСе (табл. 9) при внесении ингибиторов дыхания было достоверным для всех вариантов, за исключением зоны растяжения н зоны корневых волосков при Ю-Ш-г КЦХФГ. В присутствии КЦХФГ и концентрации поток в клетках зоны корневых во-

лосков уменьшался в 1,6 раза. Азид натриявызывал уменьшение в клеткахэтой зоны в 1,5 и 1,3 раза соответственно при концентрации раствора 10-\н 10**3М.

* . Таблица 9

Влияние ингибиторов дыхания на потоки меченого рубидия в клетках различных зон корня кукурузы

Концентрация, М Участок корня, мм от кончика Контроль КЦХФГ Контроль Лзнд натрия

мэкв/кг. ч

10-* 3—5 15—30 2,74 ±0,31 0,91 ±0,] 1 1,95±0,19 0,71 ±0,02 2,16±0,13 0,89*0,07 1,18±0,|5 0,60+0,02

10-» 3—5 15-30 3,78^:0.13 2,69 ±0,16 3,28 + 0,12 1.71±0,!4 2,43+0,21 1,86+0,12

Было установлено различное действие КЦХФГ на потоки в клетках зон корня.

При концентрации раствора 10_3М КЦХФГ вызывал достоверное уменьшение потока из цитоплазмы во внешний раствор в клетках зоны корневых волосков, которое сопровождалось незначительным увеличением содержания иона в цитоплазме. Добавление ингибитора в среду не затрагивало потоки на тонопласте в клетках этой зоны. В зоне растяжения изменение Фсо по сравнению с контролем начиналось лишь прн 0^50,0 мэкв/кг. На тонопласте в клетках данной зоны наблюдалось достоверное уменьшение потоков независимо от 12

значения 0, л.степень ингнбировання колебалась в пределах от 40 до 62%.

При концентрации раствора 10~*М значения потоков в клетках зоны корневых волосков в присутствии КЦХФГ не отличались от контроля. Однако в зоне растяжения корня поток нз вакуоли в цитоплазму все же был достоверно выше, чем и контроле (на 34%). Наблюдаемое возрастание потока нз цитоплазмы в вакуоль недостоверно.

Обнаруженное уменьшение потока нз цитоплазмы во внешний раствор в присутствии КЦХФГ при концентрации Ю-ЭМ наблюдалось и при использовании другого ингибитора—азида натрия. В этом случае различия значений потоков между контролем н опытом колебались в пределах от 0,74 до 0,90 мэкв/кг-ч, а степень ингнбировання составляла 39—47%.

5. Потоки иона кальция к рубидия в меристематических клетках корня кукурузы

Кинетические кривые выхода меченого элемента из меристематических клеток корня кукурузы отличались от кривых для других зон корня. Если в случае зон растяжения и корневых волосков кинетическая кривая остается гладкой в течение всего эксперимента, то кривая выхода нз этой зоны характеризуется появлением «плеча». Однако наличие последнего нетипично для всех кривых, полученных экспериментальным путем. Оно появлялось обычно к 80—120 мин после начала отмывания ткани немеченым раствором.

С целыо выявления степени достоверности обнаруженной «аномальности» в кривой выхода были проведены аналогичные опыты с меристематической зоной проростков фасоли к бобов. На некоторых кривых, как и в опыте с корнями кукурузы, было отмечено «плечо». По всей видимости, его появление типично для меристематических клеток и связано с иным характером' перераспределения меченого вещества в клетке, чем для трехкомпартментальной модели. Затрудняет также рассмотрение модели этой зоны наблюдаемое изменение объема вакуолей, характерное для меристематической клетки. Нами была проведена оценка распределения вакуолей по объему. Анализ показал, что у наибольшего числа вакуолей он составляет 0,0001—0,1 X Ю-'8 ммэ.

Обычно выделяемым комиартментам клетки соответствуют определенные физические объемы. В первом приближении вакуоли меристематической клетки можно разделить на два компартмента: вакуоли объемом до 0,1Х10-1г мм3 и вакуоли большего объема.

Исходя из имеющихся в настоящее время данных, можно предположить следующую модель: обмен протекает между

внешним раствором и цитоплазмой, .между двумя компарт-ментамн,'относящимися к вакуолям, между ними и цнтоплаз-■ мой. Появление «плеча» на кривой выхода соответствует резкому выходу меченого нона нз одного из вакуолярных ком-лартментов на фоне выхода нз других.

' - - 6. Электрохимическое состояние ионов кальция и рубидия в клетках зон корня кукурузы

• Для оценки транспорта в квазистационарных условиях (Ф-£0) используется уравнение Уссиига-Теорелла, При расчетах содержание нона в компартментах необходимо пересчитать в концентрацию и полученные данные умножить на коэффициент активности. Для расчетов требуются также данные о количестве клеток в различных зонах, их объеме и поверхности. ■ ■

Определение количества клеток в зонах растяжения и корневых волосков мы проводили непосредственным их подсчетом- на фотографиях, оно оказалось равным соответственно 12300 и 9200 на 1 мм. Общий объем, занимаемый в зоне корня вакуолью и цитоплазмой, вычисляли, считая, что на них приходится 90-н 10% объема клетки. В зоне "растяжения их объемы составили соответственно 644,5 и 71,61, в зоне корневых волосков — 1011 и 112,38 мм3/г\

- Определение отношения электрохимических потенциалов проводили для нескольких значений общего содержания иона: максимального, установленного химическим путем; близлежащих к точке, для которой Ф = 0; минимального. Необходимые для расчетов значения .мембранного потенциала клеток различных зон были определены с помощью микроэлектродной ^ехникн.

При введении электрода в объект, как правило, выявлялось два уровня мембранного потенциала — 0—10 и 80— 130 мВ. Низкие его значения не принимались во внимание, поскольку они относились к локализации кончика микроэлектрода в межклеточном пространстве. Для клеток зоны корневых волосков н зоны растяжения значения мембранного потенциала составили 114;Ь6 н 107±7 мВ, что, по-видимому, указывает на существование эквипотенциальности клеток по длине корня кукурузы. Это явление в клетках однородной ткани было установлено в работах Л, Оип1ор, Р. Л. И. Во\уНлд (1971), Р. ^ Р. Вош1т£ (1972), М. С. Красавиной (1974).

Отношение электрохимических потенциалов для плазма-леммы оказалось значительно больше, чем для потоков, что свидетельствует об активном транспорте иона кальция нз ц»- топлазмы во внешний раствор. Такая зависимость обнаруживалась для обеих исследованных зон при концентрациях Ю-4. 14

н 10_3М, Вне зависимости от мембранного потенциала на тонопласте или Еу= 10 мВ) отношение потоков было ниже отношения электрохимических потенциалов, поэтому можно предположить существование активного выкачивания иона кальция из вакуоли в цитоплазму (рис. 1).

Вычисление отношении для плазмалеммы в случае нона рубидия при концентрации 10-4М показывает существование активного поступления его для клеток зоны растяжения и корневых волосков. При увеличении концентрации раствора поглощение нона рубидия через плазмалемму клеток зоны растяжения происходило по электрохимическому градиенту. При этом в клетках зоны корневых волосков нон рубидия активно выкачивался из цитоплазмы во внешний раствор.

Сравнение транспорта на тонопласте в клетках различных зон также, свидетельствует об его изменении. В полностью дифференцированной клетке транспорт иона рубидия может быть либо пассивным, либо активным, когда нон поступает в вакуоль. В клетке зоны растяжения на тонопласте существует активный транспорт попа в вакуоль.

Полученные нами данные позволили рассчитать значение коэффициента проницаемости плазмалеммы и тонопласта в клетках различных зон корня (табл. 10). Как видно из табл. 10, коэффициент проницаемости плазмалеммы для нона рубидия в дифференцированной клетке несколько ниже, чем в клетке зоны растяжения. Значение коэффициента проницаемости плазмалеммы клетки зоны корневых волосков для нона кальция было почти в 3 раза выше, чем для клетки зоны растяжения. Вычисленные нами значения коэффициентов проницаемости плазмалеммы и тонопласта для нона рубидия (калия) оказались сопоставимыми с коэффициентами, полученными на других объектах.

Таблица 10

Коэффициент проницаемости плазмалеммы и тонопласта клеток различных зон корня (10-® см.с-1)

Са КЬ

Мембрана Зона корня, мм ог кончика

3-5 15-30 3-5 1 15-30

Плазмалемма Тонопласт 2,90 2,13 6,05 2,47 0,34 1.21 0,26 1,'J7

Таким образом, дифференцпровка клетки корня сопровождается изменением проницаемости плазмалеммы и тонопласта для обоих ионов.

Выводы.

1. Рассмотрены методы расчета-потоков ионов в стационарных (Ф = 0) и квазистационарных . (Ф^-0). условиях поглощения. Установлено, что-поглощение исследованных ионов клетками различных зон корня-в большинстве случаев не соответствует стационарным- условиям. Проведена оценка общих условий поглощения ионов исходя из трехкомпартмен-тальной модели клетки. Переход клетки из зоны растяжения в'зону корневых волосков характеризуется уменьшением значения потоков иона кальция, и рубидия на мембранах.

2. Ион кальция при концентрациях раствора Ю-4 и 10"3М активно транспортируется из цитоплазмы во внешний раствор и из вакуоли в цитоплазму в клетках зон растяжения и корневых волосков.

3. Ион рубидия при концентрации раствора 10~4М активно транспортируется в цитоплазму и вакуоль в клетках зоны растяжения. При возрастании концентрации его распределение на плазмалемме происходит по электрохимическому градиенту. При обеих концентрациях раствора в клетках зоны растяжения-существует активный транспорт иона в вакуоль.

4. В клетках зоны корневых волосков при концентрации раствора 10-4М ион рубидия активно поступает из внешнего раствора в цитоплазму, а при 10~3М направление активного транспорта изменяется на противоположное. В полностью дифференцированной клетке ион рубидия может либо пассивно распределяться на тонопласте, либо активно накачиваться в вакуоль.

5. Переход клетки из зоны растяжения в зону корневых волосков сопровождается увеличением проницаемости плазма леммы для иона кальция н снижением для иона рубидия. При этом наблюдается возрастание проницаемости тонопла-ста для обоих исследованных ионов.

6. В присутствии ингибиторов дыхания КПХФГ и азида натрия поток нона "кальция из цитоплазмы во внешний раствор в клетках зоны растяжения уменьшался. При этом наблюдалось возрастание потока из цитоплазмы в вакуоль в клетках обеих зон корня. Добавление КЦХФ Г и аЗида натрия в среду приводило к уменьшению потоков нопа рубндня на плазмалемме и тонопласте в клетках зон растяжения н корневых волосков. Полученные результаты'подтверждают наши выводы о электрохимическом состоянии ионов в клетках.

7. Кинетические кривые выхода меченого элемента (каль-цняч! рубидия) из клеток меристемы корней кукурузы, фасоли и бобов в ряде случаев отличаются от кривых, полученных для зон растяжения и корневых волосков. Они характеризуй

(отся появлением «плеча» через 80—120 мня после начала вымывания элемента из ткани.

Для интерпретации данных предложена четырехкомпарт-ментальная модель меристематической клетки.

По материалам- диссертации были опубликованы следующие работы: 1. М. Н. Барабанщиков, Ю. Я. Мазель. Применение компартмент-аналнза для определения потоков нона кальция в клетках корня кукурузы. — Известия ТСХА, 1979, вып. 1.

2. М. Н. Барабанщиков, Ю. Я. Мазель. Потоки иона кальция в зонах корня кукурузы.— Известия ТСХА, 1979, вып. 5.

3. М. Н. Барабанщиков. Радиоиндикаторный метод и физико-математическое моделирование для изучения потоков ионов в клетках растений. Первая Всесоюзная конференция по с.-х. радиологии. М., 1979.

Л 49174 7/V—80 г.

Объем 1 '/< п, л.

Заказ 972.

Тираж 100

Типография Московской с.-х. академии им. К. А, Тимирязева 127550, Москва II-550, Тимирязевская ул., 44