Радиочувствительность потомков опухолевых клеток, выживших после γ-облучения в больших дозах

Сланина, Светлана Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Радиочувствительность потомков опухолевых клеток, выживших после γ-облучения в больших дозах
ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Радиочувствительность потомков опухолевых клеток, выживших после γ-облучения в больших дозах"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

им. М.В. ЛОМОНОСОВА р^р 0Д

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ 1 ^ Д^

На правах рукописи УДК 576:539.1.04

СЛАНИНА Светлана Викторовна

РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ПОТОМКОВ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК, ВЫЖИВШИХ ПОСЛЕ у-ОБЛУЧЕНИЯ В БОЛЬШИХ ДОЗАХ

03.00.01. - Радиобиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2000

Работа выполнена на кафедре "Биофизики, радиационной физики и экологии" Московского государственного инженерно-физического института (технического университета), а также в лаборатории Молекулярно-биологических методов исследования РОНЦ РАМН им. H.H. Блохина

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Г.С.Календо кандидат биологических наук Е.Г.Тырсина

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор И.И.Пелевина кандидат биологических наук И.М.Пархоменко

Ведущее учреждение:

Институт Биофизики Клетки РАН, г.Пущино

Защита диссертации состоится 14 декабря 2000 г. в 1530 часов на заседании Диссертационного Совета Д.053.05.74 в Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, г.Москва, ГСП, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологический факультета МГУ. Отзывы просим направлять в Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, г.Москва, ГСП, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет, Диссертационный Совет Д.053.05.74.

Автореферат разослан " ноября 2000 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор биологических наук, профессор

О.Р.Кольс

Ftft.u, о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Ионизирующее излучение широко эльзуется в качестве терапевтического агента при лечении онкологических >леваний. Наряду со значительными успехами, достигнутыми в лучевой 1пии опухоли, многие вопросы остаются нерешенными. В ряде случаев даже не больших лучевых нагрузок и, казалось бы, полного уничтожения холи, через некоторое время вновь наблюдается возобновление опухолевого га - возникает рецидив.

Серьезным препятствием в лечении рецидивов является значительное ышение их устойчивости к повторному облучению. Выяснению причин мкновения и повышения устойчивости рецидива может способствовать <ение свойств потомков клеток, выживших после облучения опухолевой уляции in vitro.

Изучению различных свойств потомков облученных опухолевых клеток, ученных в условиях in vitro, посвящено множество работ. Однако лишь в ногих из них исследовалась радиочувствительность потомков. К тому же, ющиеся в литературе данные весьма противоречивы. Только в единичных отах сообщалось о получении более радиорезистентного потомства (Rüssel al. 1995; Mitsuhashi et al., 1996), остальные не отмечали повышения иоустойчивости у потомков облученных клеток (Hill et al., 1990; Brown and tt, 1994; Tarnawski et al., 1998; Тапонайнен и др., 1987). Кроме того, в занных работах изучалась выживаемость клеток после радиационного аействия, но не оценивалась пролиферативная активность выживших гок, которая в значительной мере определяет скорость постлучевой опуляции опухоли.

Исходя из вышеизложенного, весьма актуальным является проведение стороннего и целенаправленного исследования радиочувствительности и собности к постлучевой репопуляции потомков облученных клеток

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы был< исследование радиочувствительности и способности к постлучево! репопуляции отдаленных потомков опухолевых клеток, выживших посл< однократного у-облучения в больших дозах.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи.

1. Получить in vitro экспериментальную модель - линии потомко1 фибробластов джунгарского хомячка, выживших после у-облучения в доза) 10 и 20 Гр - ГТОК-10 и Г10К-20. Дать им морфологическую и хромосомнук характеристики.

2. Изучить радиочувствительность потомков облученных клеток (ПОК) i клеток исходной линии.

3. Провести сравнительное исследование способности ПОК и родительскш клеток к постлучевой репопуляции.

4. Сравнить эффективность восстановления от радиоиндуцированны> повреждений (СЛП и ПЛП) клеток родительской линии и ПОК.

5. Провести сравнительное изучение туморогенной активности исследуемых культур.

Научная новизна полученных результатов. Предложен новый способ выделения in vitro потомков облученных клеток (ПОК), с помощью которого после однократного у-облучения в дозах 10 и 20 Гр фибробластов джунгарского хомячка были получены линии ПОК-10 и ПОК-20.

Показано, что ПОК значительно отличаются от исходных клеток по ряду свойств: морфологии, распределению клеток по числу хромосом, клоногенной способности, радиочувствительности, способности к постлучевой репопуляции.

Впервые обнаружена чрезвычайно высокая радиоустойчивость ПОК, значение D0 которых в 2-3 раза превышало D0 родительских клеток. Наличие межклеточных контактов у потомков в момент облучения способствовало выявлению гетерогенности клоногенных клеток ПОК по радиочувствительности. Высокая радиорезистентность потомков облученных

ток была также подтверждена при их росте независимо от субстрата - в [ужидкой среде.

При изучении in vitro способности ПОК к постлучевой репопуляции рвые показано, что в отличие от клеток родительской линии, потомки :трее и эффективнее восстанавливали свою численность после у-облучения в 1ьших дозах (8-15 Гр).

Впервые обнаружено, что туморогенная способность необлученных и (ученных в дозах 5, 10 и 15 Гр ПОК не различалась. Выявленные in vitro йства ПОК - высокая радиоустойчивость и способность к быстрой и [активной постлучевой репопуляции, были подтверждены в опытах in vivo.

Научная и практическая значимость работы. Результаты тоящей работы представляют теоретический интерес для разработки >блемы отдаленных последствий действия ионизирующего излучения на 'холевую популяцию.

Полученные в работе данные способствуют пониманию процессов обновления роста опухоли после больших лучевых нагрузок, а также можных механизмов повышения радиорезистентности рецидивов к торному облучению.

Наличие общих количественных закономерностей, выявленных in vitro и vivo свидетельствует о том, что предложенная нами экспериментальная точная модель может быть полезна для разработки новых и ершенствовання имеющихся методов в лучевой терапии опухолей.

Апробация результатов исследования. Материалы диссертации ладывались на заседаниях кафедры "Биофизики, радиационной физики и логии" Московского государственного инженерно-физического института эпического университета), а также на семинарах Отдела молекулярно->логических и радиоизотопных методов исследования РОНЦ РАМН им. H.H. >хина. Основные результаты работы были доложены на 1 Съезде онкологов ан СНГ (Москва, 3-6 декабря, 1996), 3-м Съезде по радиационным ледованиям (Москва, 14-17 октября, 1997), Научных сессиях МИФИ

(Москва, января, 1998, 1999), II Съезде биофизиков России (Москва, 23-27 августа, 1999).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи, 9 тезисов и 1 статья принята в печать.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, основных выводов и библиографии; материал изложен на 128 стр., включая 11 фотографий, 12 рисунков и 9 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. В работе использовали линию эмбриональных фибробластов джунгарского хомячка ДХ-ТК", трансформированных вирусом 8\М0, а также линии потомков этих клеток, выживших после облучения в дозах 10 Гр (ПОК-Ю) и 20 Гр (ПОК-20)

Условия культивирования клеток. Клетки выращивали в среде ДМЕМ с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотика гентамицина при +37°С в термостате с подачей увлажненного воздуха с 5% С02 согласно общепринятой методике ведения культур (Адаме, 1983).

7-Облучение проводили на установке "Агат-Р" (Россия) с источником излучения 60Со мощностью 0,82 Гр/мин (расстояние до источника - 70 см) при комнатной температуре. Радиационному воздействию подвергали клетки в экспоненциальной фазе роста.

Выделение потомков облученных клеток. Для получения линий ПОК клетки родительской линии ДХ-ТК* в состоянии конфлуентного монослоя однократно облучали в дозах 10 или 20 Гр. Далее клетки инкубировали при +37°С в течение 16-20 суток со сменой среды каждые 2-3 суток. Наблюдение за состоянием облученной культурой вели под инвертированным микроскопом ("Ьекг", Германия), ежедневно производя фотосъемку в фазовом контрасте при помощи фотоаппарата ("ОгЛота!", Германия).

Когда вновь выросшие клетки-потомки через 2-3 недели заполняли всю культуральную подложку, их пересевали и в дальнейшем культивировали согласно обычной методике. Полученные таким образом популяции потомков облученных в дозах 10 и 20 Гр клеток, обозначили ПОК-10 и ПОК-20 соответственно. Свойства потомков облученных клеток исследовали с 5 по 80 пассаж после получения.

анализ числа хромосом. Хромосомные препараты экспоненциально растущих культур готовили по стандартной методике (Какпакова и др., 1976), затем их окрашивали по методике (БегЬ^М, 1971) красителем Гимза. Подсчет числа хромосом проводили по 50 метафазным пластинкам для каждой

гльтуры клеток. Процентное содержание полиплоидных клеток определяли, ¡следуя 200 метафаз.

Исследование радиочувствительности клеток. Использовали >зы у-радиации в диапазоне от 2.5 до 20 Гр. Определяли выживаемость клеток подом (Puck and Markus, 1956). В одних экспериментах облучали одиночные 1етки через 3-4 часа после посева, в других - контактирующие между собой, споненциально растущие клетки, которые затем тестировали на шониеобразование.

За эффективность клонирования (ЭК) принимали отношение числа фосших полноценных (>50 клеток) колоний в чашках к количеству посеянных еток. Выживаемость оценивали по отношению эффективности клонирования >и данной дозе облучения к ЭК необлученных клеток этой же линии.

По полученным данным строили дозовые кривые выживаемости, пгематическую обработку которых проводили согласно одноударной югомишенной и линейно-квадратичной моделям, определяли параметры D0, п, ,, а и ß.

Рост клеток в полужидкой среде. Изучение способности облученных и облученных в дозе 10 Гр клеток расти в полужидкой среде юводили согласно методу (Ставровская и др., 1982) с использованием льтуральной среды, содержащей 1,2% метилцеллюлозы. Под микроскопом «считывали число полноценных колоний (>50мкм) и с помощью окуляр-жрометра определяли их диаметр.

Изучение кинетики роста клеток. Оценивали динамику роста еточной популяции без облучения и после у-облучения в дозах 8, 10, 12.5 и Гр. Суспензии одиночных клеток разливали в 24-х луночные плато 04кл./мл/лунку) и далее инкубировали при +37°С в термостате с 5% С02. кедневно в течение 9 дней в камере Горяева подсчитывали количество [росших в лунках клеток (3-4 лунки для каждой группы). По полученным иным строили кривые роста, определяли время удвоения популяции и отность клеток в стационарной фазе роста.

Изготовление цитологических препаратов для световой и 1уоресцентиой микроскопии. Суспензии интактных и облученных в дозе Гр клеток рассевали на покровные стекла, помещенные в 24-луночные плато 2-4-10 кл./мл. Далее клетки инкубировали в течение 4 дней при +37 С с дачей 5% СОг, ежедневно отбирая по 3-6 стекол каждой опытной группы для иготовления цитологических препаратов.

Препараты для световой микроскопии 15 мин фиксировали в жидкости 1рнуа, затем 15 мин окрашивали гематоксилином Караччи и 2-3 мин - водным 1% раствором эозина. Материал для исследования под флуоресцентным [кроскопом 10 мин фиксировали в метиловом спирте при -20°С и 20 мин рашивали флуоресцентным красителем Hoechst 33258.

Цитологические препараты анализировали при помощи светового [кроскопа ("Leitz", Германия) и флуоресцентного микроскопа ("Orthomat", рмания). Определяли среднее количество клеток в поле зрения, готический индекс (МИ), долю многоядерных и апоптотических клеток.

Метод проточной цитофлуориметрии. Исследовали распределение клеток по фазам клеточного цикла в необлученных культурах, а также через 6, 8, 12 и 18 ч после радиационного воздействия в дозе 12.5 Гр. В приготовленные для тестирования суспензии одиночных клеток добавляли 0,4% раствор тритона Х-100, итидиум бромид 500 мкг/мл, РНК-азу А 100 мкг/мл и проводили измерения на цитофлуориметре Coulter Epics-C (США).

Оценка эффективности восстановления клеток от ПЛП и СЛП, Способность клеток к постлучевому восстановлению от ПЛП изучали пс изменению их выживаемости в зависимости от длительности инкубации (0-6ч в среде без сыворотки.

Восстановление клеток от СЛП выявляли с помощью расщепления дозь; 10 Гр на 2 фракции: 6 Гр и 4 Гр. Интервал между облучениями составлял от С до 4 часов. Количественной мерой восстановления клеток от СЛП служи/ "коэффициент восстановления" (КВ), равный отношению суммарной дозь фракционированного облучения (6+4=10 Гр) к найденной по кривым "доза-эффект" дозе однократного облучения, соответствующей такому же значеник выживаемости.

Прививка клеток животным. Для определения туморогенноГ способности необлученные клетки в количестве 103-106 кл. в 0,1 мл растворг Хенкса вводили подкожно новорожденным джунгарским хомячкам. Послс прививки животных еженедельно пальпировали, определяли количестве животных с опухолями, а также отмечали сроки появления опухоле? (латентный период). По полученным данным определяли TD50 - количестве клеток, после прививки которого опухоли возникали у 50% животных.

При определении влияния облучения на туморогенную способности клеток каждому животному прививали по 106 клеток. Перед прививкой клети однократно облучали в дозах 5, 10 и 15 Гр, а затем готовили суспензш одиночных клеток для введения животным. Длительность эксперимента был. ограничена 2 месяцами с момента прививки.

Статистическая обработка полученных результатов Статистическую обработку полученных результатов проводили согласнс стандартной методике для малых выборок (Рокицкий, 1967). Достоверности различий между средними проверяли с помощью критерия Стьюдента (р<0,05).

Регрессионный анализ дозовых кривых выживаемости и кривых рост! клеток проводили методом наименьших квадратов с помощью компьютерно! программы Microsoft Excel 97.

Значения TDSo и их доверительные интервалы при р<0,05 вычисляли i помощью пробит-метода (Урбах, 1975).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. получение и характеристика потомков облученных клеток.

В процессе выделения потомков облученных клеток под микроскопом :лись наблюдения за происходящими в исходной популяции ДХ-ТК" ¡менениями. Обнаружено, что радиационное воздействие в дозах 10 и 20 Гр лзывало существенную реорганизацию облученного монослоя. После 1ссовой гибели клеток (2-5сутки) в поле зрения выявлялись лишь гигантские, тогоядерные и патологически измененные клетки. Затем, через 9-14 дней >сле у-облучения отмечалось появление зон роста, состоящих из молодых 1бробластов, сконцентрированных вокруг гигантских многоядерных руктур. Наши наблюдения о возникновении молодых клеток вокруг ¡гантских многоядерных клеток, и аналогичные данные других авторов !алендо, Демидова, 1994) позволяют предположить, что эти структуры могут [аствовать в формировании зон обновленного роста опухолевой популяции, грез 2-3 недели, когда молодые клетки заполняли всю поверхность подложки, : пересевали и в дальнейшем культивировали параллельно с исходной льтурой ДХ-ТК' обычным способом. Полученные таким образом популяции, стоящие из потомков облученных в дозах 10 и 20 Гр родительских клеток, юзначили ПОК-Ю и ПОК-20 соответственно.

Микроскопические исследования показали, что потомки облученных еток значительно отличались от клеток родительской линии по морфологии, эи росте на твердом субстрате клетки сублиний ПОК имели вытянутую, ретеновидную форму, в отличие от полигональных клеток линии ДХ-ТК", о, скорее всего, связано с разной способностью клеток контактировать с бстратом. Плотность клеток на единицу поверхности в популяциях ПОК в 1.5 за превышала плотность родительских клеток.

Отличия между исходными клетками и потомками, выявленные при сте клеток в монослое, сказывались и на морфологии образованных ими лоний. Колонии родительской культуры ДХ-ТК' имели округлую форму с вольно ровными краями, а клетки в них располагались мозаично, без какой-

либо упорядоченной ориентации. Колонии, образованные клетками линии ГЮК-20, имели вытянутую эллипсоидную форму с неровными краями. Клетки в таких колониях были ориентированы по длине параллельно друг другу. Колонии, образованные потомками, были более компактными и многослойными, чем колонии, состоящие из клеток ДХ-ТК'. На основании этих данных можно предположить, что у ПОК изменилась не только адгезия к субстрату, но и межклеточные взаимодействия.

Сравнительный анализ числа хромосом в клетках исходной линий ДХ-ТК* и линий ПОК-10 и ГЮК-20 показал, что все исследованные линии являются гиподиплоидными. В популяции ДХ-ТК" модальный класс (64%) составляли клетки с 26 хромосомами. Однако, в линиях ПОК не наблюдалось четкс выраженного модального класса: 90% клеток линии ПОК-10 имели 25-2'/ хромосом, 80% клеток линии ПОК-20 содержали по 26-27 хромосом. При этом диапазон варьирования числа хромосом в клетках ПОК был шире.

Исследование плоидности клеток показало, что в линии ДХ-ТК" дол5 полиплоидных клеток равнялась 2.5%, тогда как в популяции ПОК-1С полиплоидные клетки составляли 4%, а в линии ПОК-20 - 7.5%.

Результаты хромосомного анализа свидетельствуют о больше? гетерогенности популяции потомков облученных клеток по числу хромосом пс сравнению с исходной линией, что, вероятно, является следствиел радиоиндуцированной хромосомной нестабильности в выживших поел» радиационного воздействия клетках.

У клеток сублиний ПОК-Ю и ПОК-20 на твердом субстрате н; протяжении всего периода исследования была отмечена высокая клоногенна; способность, близкая к 100%, достоверно превышающая эффективносп клонирования родительских клеток в 3-6 раз.

Таким образом, были получены две линии потомков облученны: опухолевых клеток - ПОК-10 и ПОК-20, которые отличались от исходно! линии ДХ-ТК" по ряду признаков: морфологии, хромосомной характеристике 1 клоногенной способности.

2. радиочувствительность потомков облученных клеток.

Основной задачей настоящего исследования являлось изучение вствительности потомков облученных опухолевых клеток к радиационному здействию.

На рисунке 1 представлены кривые выживаемости клеток линий ДХ-ТК' ГЮК-20 после облучения одиночных и контактирующих (монослой) клеток. 1Дно, что независимо от наличия межклеточных контактов в момент лучения ПОК намного более радиоустойчивы, чем клетки исходной линии: , для клеток линии ГЮК-20 в 2-3 раза превышает О0 для клеток исходной льтуры ДХ-ТК" (табл. 1).

После облучения контактирующих клеток ПОК-20 на кривой (живаемости в диапазоне доз 10-20 Гр появляется более пологая компонента: I на этом отрезке кривой в 1,5 раза больше, чем при облучении клеток в дозах 0 Гр. Наличие двух участков с разными значениями О0 на дозовой кривой ■живаемости потомков означает, что клетки в популяции ПОК гетерогенны | радиочувствительности.

При сравнении кривых, полученных после у-облучения «тактирующих или одиночных клеток, оказалось, что наличие межклеточных нтактов в момент воздействия существенно повышает выживаемость щительских клеток во всем диапазоне доз: в 1.5 раза увеличивается О0 и !еньшается плечо на кривой "доза-эффект". В то же время, различия в диочувствительности одиночных и контактирующих клеток ПОК-20 юявляются только в диапазоне доз 10-20 Гр: здесь значение О0 для ¡лученных в монослое ПОК также в 1,5 раза превышает О0 для одиночных ЭК. Можно предположить, что в популяции потомков присутствует которая доля клеток, выживаемость которых значительно повышается при хранении межклеточных контактов в момент лучевого воздействия, так что ановится заметным их вклад в радиочувствительность всей популяции, гновная же масса потомков даже при облучении в одиночном состоянии ¡ладает чрезвычайно высокой радиоустойчивостью: О0 = 5,1 ± 0,3 Гр.

Доза облучения, Гр

Рисунок 1. Дозовые зависимости выживаемости клеток культур ДХ-ТК" (3,4) и ПОК-20 (1,2) после у-облучения одиночных (2,4) и контактирующих (1,3) клеток.

Таблица 1. Параметры дозовых

кривых выживаемости клеток ДХ-ТК' и ПОК-20.

Линии ДХ-ТК" ПОК-20

Облучение контактирующих клеток

Диапазон Доз 0-20 Гр 0-10 Гр 10-20 Г

О», Гр 2,4 ± 0,6 5,9 ±0,7* 8,1 ±0,6

п 3,6 ± 1,4 1,4 ±0,1 —

Облучение одиночных клеток

Эо, Гр 1,7 ±0,1 5,1 ±0,3*

п 6,3 ± 1,3 2,4 ±0,1*

* - значения параметров для линий ПСЖ-10 и ПСЖ-20, которые достоверно (р<0.05) отличаются от величин, определенных для родительских клеток ДХ-ТК".

В следующей серии экспериментов изучали способность родительских клеток и ПОК формировать колонии независимо от субстрата, при культивировании в полужидкой среде.

Эффективность клонирования необлученных клеток обеих линий в полужидкой среде достоверно не различалась, составляя 29,5 ± 7,8 % и 25,7 ± 2,4 % для ДХ-ТК" и ПСЖ-20, соответственно. Однако после облучения в дозе ЮГр выживаемость ПОК-20 (24%) в 20 раз превышала выживаемость исходных клеток (1%). Таким образом, при росте независимо от субстрата (в полужидкой среде) была подтверждена высокая радиорезистентность потомков облученных клеток.

Важным радиобиологическим параметром является пролиферативный статус клоногенных клеток, оцениваемый по размеру образуемых ими колоний. Данные о распределении колоний в полужидкой среде для линий ДХ-ТК* и ГТОК-20 в норме и после облучения в дозе 10 Гр представлены на рисунке 2.

? 60 -

sj С

О -<

-» э

«S —»

о =t

40 -

я X

о ч

о «

- 60

Л ДХ-ТК"

о ю о ю о уз о lo N. О С\/ ю о

1— т— т— т— Су

в ДХ-ТК", 10 Гр

,о (О о

«о ^ о

1— 1— 1— С\

Диаметр колоний, мкм

ПОК-20

—I-1—1-1

О lo о ю о ю о lo N. О С\| lO N. О 1— т— т— т— C\j

Г Г10К-20, 10 Гр

"э Р s>

c\l io N. о rv

Диаметр колоний, мкм

сунок 5. Распределение колоний по диаметру для культур ДХ-ТК" и ГТОК-20 в полужидкой среде. А, Б - необлученные культуры, В, Г - после у-облучения в дозе 10 Гр.

Видно, что для необлученных клеток исследуемых линий характер спределения существенно различался. В то время, как размеры колоний нии ДХ-ТК" широко варьировали от 50 до >200 мкм (рис.2а), колоний аметром более 150 мкм у ГЮК-20 не было обнаружено, а модальный класс -% - составляли колонии ПОК малого диаметра: 50-75 мкм (рис.26).

После у-облучения родительских клеток в дозе 10 Гр их юлифератнвная активность в полужидкой среде значительно снижалась, что

выражалось в уменьшении диаметров их колоний: доля малых колоний (50-75 мкм) увеличилась втрое: с 27,8 до 76,5 % (рис.2а,в). В отличие от родительских клеток, характер распределения колоний по размеру для интактных и облученных в дозе 10 Гр клеток линии ПОК-20 практически не различался (рис.2б,г). Это свидетельствует о том, что клетки ПОК-20, способные формировать колонии в полужидкой среде, высоко радиоустойчивы.

Таким образом, независимо от наличия межклеточных контактов или условий культивирования (твердый субстрат или полужидкая среда) клетки ПОК показали резкое повышение радиоустойчивости по сравнению с родительскими клетками. Такой высокой радиоустойчивости потомков облученных клеток, полученных in vitro после однократного облучения исходной популяции, ранее не было обнаружено. В ряде работ сообщалось или об отсутствии различий в радиочувствительности между потомками и исходными клетками (Brown and Trott, 1994), или, наоборот, о повышении радиочувствительности ПОК (Тапонайнен и др., 1986; Tarnawski et al., 1998). Только в одной из обнаруженных нами работ были выделены ПОК с повышенной радиорезистентностью, которая стойко сохранялась в течение 100 пассажей (Mitsuhashi et al., 1996). По нашему мнению, это может быть связано как с различиями в методике выделения ПОК (условия и режим облучения, способ культивирования клеток), так и с генетическими особенностями клеточных линий.

3. Репопуляция потомков облученных клеток после радиационного

воздействия.

Способность к репопуляции родительских клеток ДХ-ТК" и клеток линий ПОК-10 и ПОК-20 после облучения в различных дозах 8, 10, 12.5 и 15 Гр оценивали по кривым роста. При этом изучали цитоморфологические изменения, происходящие в культурах в течение 1-4 суток после облучения.

10000

. 1000

\ ХДХ-ТК"

! опок-ю

i впсж-20

0123456789 Время после посева, сутки

Рисунок 3. Кривые роста популяций ДХ-ТК", ПОК-Ю и ПЮК-20.

Таблица 2. Распределение клеток линий ДХ-ТК", ПОК-Ю и ПСЖ-20 по фазам клеточного цикла.

Фаза легочного цикла Доля клеток, %

ДХ-ТК" ПОК-Ю ПОК-20

б0/С1 51,3 ± 1,6 57,9 ±2,0 56,3 ± 1,6

8 24,9 ± 1,4 23,0 ±2,1 23,3 + 1,3

б2/М 23,9 ± 1,3 19,2 ±2,8 20,4+1,3

Таблица 3. Значения времени удвоения числа клеток в популяции (12) для интактных и облученных культур ДХ-ТК", ПОК-Юи ПСЖ-20.

)ЗЫ, '2,4.

Гр ДХ-ТК" ПОК-Ю Г10К-20

0 15,6 ± 1,4 15,3 ± 1,0 14,0 ±0,3

8 22,8 ±3,0 21,8 ±2,8 16,3 + 2,1

10 34,5 + 4,8 .... 24,2 ± 1,3

2,5 30,8 ± 7,2 21,4 ± 1,1 23,3 ±2,1

15 — 24,1 ± 1,6 29,1 ±2,5

В условиях без облучения не было обнаружено различий в кинетике роста ПОК-Ш, ПСЖ-20 и ДХ-ТК" (рис. 3). Также существенно не различались распределение клеток этих линий по фазам клеточного цикла (табл.2) и митотический индекс.

Кривые роста клеток ДХ-ТК" и ПОК-20 после их облучения в дозах 8, 10 и 15 Гр представлены на рисунке 4. Видно, что отличия в кинетике роста родительской линии ДХ-ТК' и популяции потомков ПОК-20 возрастали с увеличением дозы радиационного воздействия. При этом как для исходных клеток, так и для ПОК с возрастанием лучевой нагрузки наблюдалось увеличение времени удвоения популяции (табл.3).

После облучения в дозе 8 Гр кривые роста для потомков и клеток ДХ-ТК" отличались лишь углом наклона - нарастание клеточной массы в популяции исходных клеток проходило медленнее (рис.4а,б, табл.3).

А Б

Время после посева, сутки Время после посева, сутки

Рисунок 4. Кривые роста культур (А) ДХ-ТК" и (Б) ГЮК-20 после у-облучения в дозах 8,10 и 15 Гр.

После облучения в дозах 10 и 15 Гр различия в динамике восстановления численности исследуемых популяции проявлялись наиболее ярко. В родительской культуре в течение первой недели происходило неуклонное снижение клеточной массы (рис.4а). К концу периода наблюдения численность родительской популяции, облученной в дозе 10 Гр, едва достигала исходного уровня клеток при посеве, а после радиационного воздействия в дозе 15 Гр была даже в 10 раз ниже этого уровня. В отличие от родительских клеток, численность популяции ПОК-20 начинала экспоненциально увеличиваться уже со 2-х суток после облучения как в дозе 10 Гр, так и 15 Гр (рис.4б). К 9-м суткам роста количество клеток в облученной культуре ПОК-20 достигало контрольного уровня и в 50 раз превосходило число посеянных клеток.

-т-г-

3 6 9 12 15 18

О 3 6 9 12 15 18

О 3 6 9 12 15 18 Время после облучения, ч

Р*- ГЮК-20 -о-ДХ-ТК

Рисунок 5. Распределение клеток з популяциях ДХ-ТК" и ПОК-20 то фазам клеточного цикла после ^-облучения в дозе 12,5 Гр.

Морфологический анализ

состояния популяций ГЮК-20 и ДХ-ТК" в течение четырех дней после облучения в дозе 10 Гр, проведенный с помощью фазово-контрастной и флуоресцентной микроскопии, выявил значительные качественные различия в реакции этих клеток на воздействие радиации.

Снижение количества клеток в облученной популяции ДХ-ТК" в этот период сопровождалось усилением лучевого патоморфоза: резко возрастала доля патологических митозов (многополюсные,

трехгруповые и к-митозы); процент гигантских многоядерных клеток увеличивался с 1 до 50% к 4-м суткам после облучения. Обнаруженные цитоморфологические изменения

связаны с различными аномалиями клеточного деления, вызванными у-излучением, и свидетельствуют о значительных нарушениях

репродуктивного потенциала

облученных родительских клеток ДХ-ТК". Резкое падение митотического индекса, зарегистрированное в культуре ДХ-ТК" на 3 сутки после облучения, совпадает с массовой

гибелью клеток, отмеченной в эти сроки при изучении кривых роста родительских клеток. В те же сроки после облучения в популяции ГТОК-20 происходило постоянное увеличение числа клеток, при этом митотический индекс мало отличался от такового в необлученной популяции потомков. Уровень лучевого патоморфоза у потомков был низок (<1%) и не превышал доли выявляемых аномалий ПОК в нормальных условиях.

Таким образом, ПОК значительно быстрее и эффективнее восстанавливали численность своей популяции после больших лучевых нагрузок, чем родительские клетки. Сопоставив результаты цитоморфологического анализа с выявленными у ПОК высокой эффективностью клонирования и радиорезистентностью можно заключить, что именно

высокорадиорезистентные клоногенные клетки вносят основной вклад в восстановление численности популяции потомков.

Методом проточной цитофлуориметрии была изучена кинетика продвижения клеток линий ПОК-20 и ДХ-ТК" по клеточному циклу в первые сутки после облучения в дозе 12,5 Гр (рис.5). Видно, что в обеих культурах в ответ на лучевое воздействие происходит задержка деления - 02/М-блок. Кроме того, в облученной популяции ДХ-ТК" выявляется блок Б/02, отсутствующий у потомков.

Остановка клеток в цикле после облучения связана с процессами реализации повреждений и их репарации. Блокирование большой доли облученных родительских клеток ДХ-ТК" в Б-фазе, вероятно, свидетельствует о том, что в этих клетках существуют значительные повреждения, вызванные радиацией.

4. Восстановление клеток от повреждении.

Одним из основных факторов, определяющих устойчивость клеток к облучению, является эффективность их восстановления от радиоиндуцированных повреждений. На клеточном уровне в радиобиологии различают восстановление от сублетальных (СЛП) и потенциально-летальных (ПЛП) повреждений.

На рисунке 6а представлены данные по восстановлению клеток линий ДХ-ТК" и Г10К-20 от СЛП. Видно, что выживаемость родительских клеток с возрастанием интервала между фракциями облучения увеличивалась в большей степени, чем выживаемость ПОК. Можно было бы заключить, что клетки ДХ-ТК" восстанавливаются от СЛП более эффективно. Однако следует учесть, что их выживаемость возрастала с 2 до 10 %. В то же время выживаемость ПОК-20 даже в отсутствие перерыва между радиационным воздействием превышала выживаемость родительских клеток более чем в 20 раз и составляла 28%.

А Б

Рисунок 6. Зависимость выживаемости клеток культур ДХ-ТК" и ГТОК-20 (А) от интервала между дозами 6 и 4 Гр;

(Б) от длительности инкубации в бессывороточной среде после однократного у-облучения в дозе 10 Гр.

Динамику восстановления клеток линий ДХ-ТК" и ПОК-20 от ПЛП отражает рисунок 66. Видно, что повышение выживаемости клеток обеих линий было менее значительным, чем при восстановлении от СЛП. Тем не

менее, исходная выживаемость потомков (при рассеве клеток сразу после облучения) в 20 раз превосходила уровень выживаемости родительских клеток.

Таким образом, проведенное исследование не выявило значительных отличий в эффективности восстановления родительских клеток ДХ-ТК" и их радиорезистентного варианта ПОК-20 как от СЛП, так и от ПЛП. Тем не менее, в этих опытах обращала на себя внимание большая разница в исходной выживаемости исследуемых клеточных линий, тестируемых сразу после лучевого воздействия. Возможно, что к моменту рассева на колониеобразование - в процессе облучения и в первые минуты после него, клетки успевают отрепарировать основную долю повреждений ("быстрый" этап репарации). Возможно также, что способность к репарации не является определяющим фактором повышения радиорезистентности ПОК. Высокая выживаемость, а также отсутствие блока Б/С2 у потомков может отражать более низкий уровень радиоиндуцированных повреждений ПОК, например, из-за высокой активности антиоксидантных систем или изменения структуры хроматина.

5. Тумогогенность клеток

Исходные клетки ДХ-ТК" являются туморогенными. Представляло интерес выяснить, обладают ли клетки выделенной нами линии ПОК-20 способностью расти в виде опухоли при прививке хомячкам.

Исследование прививаемости необлученных клеток исходной линии ДХ-ТК' и ПОК-20 показало, что в условиях без облучения для обеих линий клеток при увеличении дозы введенных клеток увеличивалась вероятность возникновения опухолей, и сокращались сроки их появления. Туморогенная способность необлученных ПОК и исходных клеток достоверно не различалась: ТБ50 для ДХ-ТК- составляла 5,4-104 клеток, а ТО50для ПОК-20 -4,2-104 клеток. Между клетками обеих линий не наблюдалось заметной разницы и в длительности латентного периода. Таким образом, показано, что клетки линии ПОК-20, также как и клетки родительской линии ДХ-ТК" были способны вызывать опухоли у животных.

Различия в прививаемости родительских клеток и потомков выявлялись только после облучения клеток и возрастали с увеличением лучевой нагрузки. Данные о прививаемости и длительности латентного периода для предварительно облученных в дозах 5, 10 и 15 Гр клеток ДХ-ТК" и ПОК-20 приведены в таблице 2.

Видно, что облучение исходных клеток ДХ-ТК" приводило к снижению их прививаемости при резком увеличении сроков появления опухолей. Наибольшее падение прививаемости - на 70%, наблюдалось при лучевом воздействии на родительские клетки в дозе 15 Гр, при этом средний латентный период появления опухолей увеличивался более чем в пять раз. В то же время, при этой же дозе прививаемость клеток линии ПОК-20 практически не отличалась от прививаемости необлученных потомков без изменения длительности латентного периода.

Таблица 2. Прививаемость у-облученных клеток линий ДХ-ТК" и ПОК-20 новорожденным джунгарским хомячкам (106 кл./ жив.).

Линии ДХ-ТК" ПОК-20

Доза, Гр Доля животных с опухолью % выросших опухолей Латентный период, сут. Доля животных, с опухолью % выросших опухолей Латентный период, сут.

0 19/19 100 + 0 9,6 + 0,3 18/18 100 + 0 14,1 + 1,3

5 14/17 82,4 + 9,2 23,6 ± 15,3 15/15 100 ±0 9,6 ± 0,4

10 16/22 72,7 + 9,5 24,9 ± 1,3 14/15 93,3 ± 6,5 11,4 + 0,3

15 6/21 28,6 ± 9,9 54,8 ± 12,7 10/11 90,9 + 8,7 11,2 ±0,6

Данные, полученные на животных, хорошо согласуются с результатами, полученными in vitro. Без облучения различия между родительскими клетками и потомками отсутствовали как в туморогенной активности, так и в способности формировать колонии в полужидкой среде, а также в кинетике роста клеток (рис.3). Как и в опытах in vivo, отличия в кинетике роста и в

выживаемости клеток при росте в полужидкой среде выявлялись только после облучения клеток исследуемых линий в больших дозах.

Следует особо отметить, что выявленные свойства потомков облученных клеток сохранялись на протяжении длительного периода культивирования (80 пассажей), что может свидетельствовать об их наследственном закреплении.

Наличие общих количественных закономерностей in vitro и in vivo даёт нам право предположить, что предложенная нами экспериментальная модель может отражать реальные процессы, происходящие при облучении опухолевых клеток в организме. Таким образом, клеточные линии потомков облученных клеток - ПОК-Ю и Г10К-20, можно использовать для исследования процессов, лежащих в основе возобновления опухолевого роста после больших лучевых нагрузок, а также для изучения механизмов повышения радиорезистентности потомков облученных клеток.

ВЫВОДЫ

1. Получены длительно пассируемые популяции потомков фибробластов джунгарского хомячка линии ДХ-ТК", выживших после у-облучения в дозах 10 и 20 Гр (ПОК-Ю и ПОК-20). Показано, что ПОК значительно отличаются от исходных клеток по ряду свойств: морфологии, распределению клеток по числу хромосом, клоногенной способности, радиочувствительности, способности к постлучевой репопуляции.

2. Установлено, что потомки у-облученных клеток являются намного более радиоустойчивыми, чем исходные клетки: значение D0 для ПОК в 2-3 раза превышало D0 родительских клеток линии ДХ-ТК". При облучении контактирующих клеток выявлена гетерогенность по радиочувствительности популяций ПОК-Ю и ПОК-20.

таковую клеток исходной линии ДХ-ТК' в 20 раз. Обнаружено, что облучение в этой дозе не изменяет пролиферативную активность клоногенных клеток ПОК.

4. Показано, что ПОК способны к более быстрой и эффективной репопуляции после у-облучения в дозах 8, 10, 12.5 и 15 Гр, чем клетки родительской линии ДХ-ТК'.

5. Не выявлено различий в эффективности восстановления ПОК-20 и клеток ДХ-ТК' от индуцированных облучением потенциально летальных и сублетальных повреждений.

6. Обнаружено, что туморогенная способность необлученных и облученных в дозах 5, 10 и 15 Гр клеток ПОК-20 не различалась, как по частоте индукции опухолей у хомячков, так и по срокам появления опухолей. В то же время, после предварительного облучения родительских клеток в дозе 15 Гр, их прививаемость снижалась на 70% при увеличении латентного периода в 5 раз.

Таким образом, в опытах in vivo были подтверждены высокая эадиоустойчивость ПОК и их способность к быстрой и эффективной тостлучевой репопуляции, выявленные in vitro.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Тырсина Е.Г., Календо Г.С., Сланина C.B. Резкое повышение пролиферативной активности у потомков опухолевых клеток, выживших после облучения большими дозами // ДАН России. - 1996. - Т.347, №5. - С.699-703.

2. Тырсина Е.Г., Календо Г.С., Сланина C.B. Появление высокорезистентной фракции опухолевых клеток с повышенной клоногенной способностью после облучения в больших дозах радиации // I съезд онкологов стран СНГ. Тезисы докладов. Москва, 3-6 декабря 1996. - 4.1. - С.219.

3. Тырсина Е.Г., Календо Г.С., Сланина C.B. Возникновение фракции радиорезистентных клеток в облученной большими дозами популяции фибробластов // Радиационная биология. Радиоэкология. - 1997. - Т.37, вып.2. - С.79-84.

4. Тырсина Е.Г., Календо Г.С., Сланина C.B. Повышенная эффективность клонирования в полужидкой среде трансформированных клеток, выживших после у-облучения в больших дозах // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, - 1997. - Т. 124, № 11. - С.566-569.

5. Тырсина Е.Г., Календо Г.С., Сланина C.B., Малявина Ю.А. Повышенная клоногенная способность потомков клеток, выживших после у-облучения в больших дозах // Третий съезд по радиационным исследованиям. Тезисы докладов. Москва, 14-17 октября, 1997. -T.L - С.134.

6. Тырсина Е.Г., Календо Г.С., Сланина C.B. Высокие радиорезистентность и способность к репопуляции потомков клеток, переживших у-облучение в больших дозах // Третий съезд по радиационным исследованиям. Тезисы докладов. Москва, 14-17 октября, 1997.-Т.1. - С.166.

7. Календо Г.С., Тырсина Е.Г., Сланина C.B. Возможные механизмы эффективной репопуляции потомков облученных опухолевых клеток после повреждающего воздействия у- радиации // Научная сессия МИФИ-98. Сборник научных трудов. Москва, 1998. - 4.1. - С.88-90.

8. Тырсина Е.Г., Календо Г.С., Сланина C.B. Кинетика роста потомков опухолевых клеток в норме и после у- облучения // Научная сессия МИФИ-98. Сборник научных трудов. Москва, 1998. - 4.1. - С.114-115.

9. Тырсина Е.Г., Календо Г.С., Сланина C.B. Особые свойства потомков опухолевых клеток, выживших после у-облучения в больших дозах // Научная сессия МИФИ-98. Сборник научных трудов. Москва, 1998. - 4.1. - С.116-118.

10. Тырсина Е.Г., Какпакова Е. С., Сланина C.B., Календо Г.С. Сохранение высокой злокачественности у радиорезистентных клеток джунгарского хомячка после у-облучения в больших дозах // Научная сессия МИФИ-99. Сборник научных трудов. Москва, 1999. -Т.1. - С.82-83.

11. Сланина C.B., Тырсина Е.Г., Календо Г.С. Индукция эффективной репопуляции у потомков опухолевых клеток, облученных у-радиацией в

больших дозах . // II съезд биофизиков России. Москва, 23-27 августа, 1999. -Т. 3. - С.842-843.

12. Тырсина Е.Г., Сланииа C.B., Календо Г.С. Повышенная жизнеспособность потомков опухолевых клеток, выживших после у-облучения в больших дозах // II съезд биофизиков России. Москва, 23-27 августа, 1999. - Т. 3. - С.849.

13. Календо Г.С., Ягубов A.C., Тырсина Е.Г., Сланина C.B., Бажутова Г.А. Исследование механизмов, обеспечивающих восстановление популяции опухолевых клеток после облучения в летальных дозах // Российский онкологический журнал. (В печати.)

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сланина, Светлана Викторовна

список сокращений.

Введение.

I. Обзор литературы.

1.1. Отдаленные эффекты воздействия радиации на клетки млекопитающих.

1.1.1. Летальные и нелетальные эффекты в отдаленном потомстве облученных клеток.

1.1.2. Радиоиндуцированная нестабильность генома.

1.1.3. Отдаленные эффекты излучения в опухолевых клетках.

1.2. Проблема возобновления опухолевого роста после облучения.

1.2.1. Репопуляция опухоли после радиационного воздействия.

1.2.2. Повышение радиоустойчивости опухоли к повторному облучению.

1.3. Исследование радиочувствительности потомков облученных опухолевых клеток в условиях in vitro.

II. Материалы и методы исследования.

11.1. Линии клеток, условия культивирования и облучения.

11.2. Получение линий потомков облученных клеток.

11.3. Подготовка и анализ хромосомных препаратов.

11.4. Радиочувствительность клеток.

11.5. Рост клеток в полужидкой среде.

11.6. Кинетика роста клеточных популяций.

11.7. Подготовка цитологических препаратов для светового и флуоресцентного микроскопирования.

11.7.1. Цитологические препараты для световой микроскопии.

11.7.2. Цитологические препараты для флуоресцентной микроскопии.

II. 8. Распределение клеток по фазам клеточного цикла (метод проточной цитофлуориметрии).

11.9. Восстановление клеток от радиоиндуцированных повреждений.

11.10. Прививка клеток животным.

11.11. Статистическая обработка полученных результатов.

Результаты собственных исследований.

III. Получение и цитоморфологическая характеристика потомков облученных клеток.

III. 1. Динамика изменений в облученной популяции клеток ДХ-ТК".

111.2. Морфологическая характеристика полученных популяций потомков облученных клеток - ПОК-Ю и ПОК-20.

111.3. Хромосомная характеристика линий потомков облученных клеток.

IV. Радиочувствительность потомков облученных клеток.

IV. 1. Дозовые кривые выживаемости линий ДХ-ТК", ПОК-Ю и ПОК-20. 51 IV. 1.1. Зависимость формы дозовых кривых выживаемости от материала подложки.

IV.1.2. Зависимость формы дозовых кривых выживаемости от сохранения межклеточных контактов.

IV.2. Радиочувствительность потомков облученных клеток при росте в полужидкой среде.

V. Репопуляция потомков облученных клеток после радиационного воздействия.

V.l. Кривые роста линий ДХ-ТК", ПОК-Ю и ПОК-20 в норме и после облучения в дозах 8, 10, 12,5 и 15 Гр.

V.2. Динамика цитоморфологических изменений в клеточных популяциях в первые 4 суток после облучения в дозе 10 Гр.

V.3. Распределение клеток по фазам клеточного цикла после облучения в дозе 12,5 Гр.

VI. Эффективность восстановления потомков облученных клеток от радиоиндуцированных повреждений.

VI. 1. Восстановление от ПЛП.

VI.2. Восстановление от СЛП.

VII. Туморогенность клеток.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Радиочувствительность потомков опухолевых клеток, выживших после γ-облучения в больших дозах"

Ионизирующее излучение широко используется при лечении онкологических заболеваний. Наряду с большими успехами, достигнутыми в лучевой терапии (ЛТ) опухоли, многие вопросы до сих пор остаются нерешенными. Как в эксперименте, так и в клинической практике, наряду с регрессией опухолей после больших лучевых нагрузок также отмечали феномен ускоренной репопуляции опухолевых клеток [58, 83, 166, 168, 171, 183] и повышение радиоустойчивости новообразований [3, 48, 129, 137]. Появление рецидивов, повышение их резистентности к повторным курсам облучения является одним из основных факторов, снижающих эффективность ЛТ злокачественных новообразований.

До сих пор нет ясности, за счет каких клеток или процессов происходит возобновление роста опухоли после облучения в высоких дозах. Не ясны и причины повышения резистентности рецидивов к последующему облучению.

Полагают, что репопуляция опухолевых клеток происходит либо за счет предсуществующих, устойчивых к радиации клеток (в состоянии гипоксии или резистентной фазе цикла, обладающих эффективной репарацией повреждений, эндогенными радиопротекторами и т.д.) [93, 138, 141, 149, 170, 186], либо (и) за счет возникших заново под действием радиации новых клонов радиорезистентных клеток, генетически отличных от исходных [18, 22, 131]. Возможно, в результате первого курса лучевой терапии погибает наиболее чувствительная фракция клеток и происходит отбор (селекция) более радиорезистентной субпопуляции. Вероятно также, что большие дозы радиации индуцируют в выживших клетках глубокие качественные изменения. В результате этого потомки клеток, переживших облучение в больших дозах, способны быстро и эффективно восстанавливать опухолевый рост.

Решение проблем возобновления опухолевого роста после больших лучевых нагрузок и повышения резистентности опухоли к повторному 7 облучению непосредственно связано с изучением отдаленных последствий действия ионизирующего излучения на популяцию опухолевых клеток. Этому во многом могло бы способствовать сравнительное исследование свойств исходной опухолевой популяции и потомков облученных опухолевых клеток в условиях in vitro.

Изучению различных свойств потомков облученных опухолевых клеток, полученных в условиях in vitro, посвящено множество работ. Однако лишь в очень немногих из них исследовалась радиочувствительность потомков. Полученные данные весьма противоречивы. Только в единичных работах удавалось получить более радиорезистентное потомство [43, 153], в большинстве же исследований у потомков облученных клеток не отмечалось повышения радиоустойчивости [36, 50, 134]. В указанных работах изучалась выживаемость клеток после радиационного воздействия, но не оценивалась пролиферативная активность выживших клеток, которая в значительной мере определяет скорость постлучевой репопуляции опухоли.

Исходя из вышеизложенного, весьма актуальным является проведение всестороннего и целенаправленного исследования радиочувствительности и способности к постлучевой репопуляции потомков облученных клеток (ПОК).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование радиочувствительности и способности к постлучевой репопуляции отдаленных потомков опухолевых клеток, выживших после однократного у-облучения в больших дозах.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи.

1. Получить in vitro экспериментальную модель - линии потомков фибробластов джунгарского хомячка, выживших после у-облучения в дозах 10 и 20 Гр - ПОК-Ю и ПОК-20. Дать им морфологическую и хромосомную характеристики.

2. Изучить радиочувствительность потомков облученных клеток и клеток исходной линии.

3. Провести сравнительное исследование способности ПОК и родительских клеток к постлучевой репопуляции.

4. Сравнить эффективность восстановления от радиоиндуцированных повреждений клеток родительской линии и ПОК.

5. Провести сравнительное изучение туморогенной активности исследуемых культур.

Научная новизна полученных результатов. Предложен способ выделения in vitro потомков облученных клеток, с помощью которого после однократного у-облучения в дозах 10 и 20 Гр фибробластов джунгарского хомячка были получены линии ПОК-10 и ПОК-20.

При изучении in vitro способности ПОК к постлучевой репопуляции впервые показано, что, в отличие от клеток родительской линии, потомки быстрее и эффективнее восстанавливали свою численность после у-облучения в больших дозах (8-15 Гр).

Впервые обнаружено, что туморогенная способность необлученных и облученных в дозах 5, 10 и 15 Гр ПОК не различалась. Выявленные in vitro свойства ПОК - высокая радиоустойчивость и способность к быстрой и эффективной постлучевой репопуляции, были подтверждены в опытах in vivo.

Научная и практическая значимость работы. Результаты настоящей работы представляют теоретический интерес для разработки проблемы отдаленных последствий действия ионизирующего излучения на опухолевую популяцию.

Полученные в работе данные способствуют пониманию процессов возобновления роста опухоли после больших лучевых нагрузок, а также возможных механизмов повышения радиорезистентности рецидивов к повторному облучению.

Наличие общих количественных закономерностей, выявленных in vitro и in vivo, свидетельствует о том, что предложенная нами экспериментальная клеточная модель может быть полезна для разработки новых и совершенствования имеющихся методов в лучевой терапии опухолей.

Апробация результатов исследования. Материалы диссертации докладывались на заседаниях кафедры "Биофизики, радиационной физики и экологии" Московского государственного инженерно-физического института (технического университета), а также на семинарах Отдела молекулярно-биологических и радиоизотопных методов исследования РОНЦ РАМН им. H.H. Блохина. Основные результаты работы были доложены на I Съезде онкологов стран СНГ (Москва, 3-6 декабря, 1996), 3-м Съезде по радиационным

10 исследованиям (Москва, 14-17 октября, 1997), Научных сессиях МИФИ (Москва, январь, 1998, 1999), II Съезде биофизиков России (Москва, 23-27 августа, 1999).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 9 тезисов, 1 статья принята в печать.

Заключение Диссертация по теме "Радиобиология", Сланина, Светлана Викторовна

ВЫВОДЫ

2. Установлено, что потомки у-об лученных клеток являются намного более радиоустойчивыми, чем исходные клетки: значение D0 для ПОК в 2-3 раза превышало D0 родительских клеток линии ДХ-ТК". При облучении контактирующих клеток выявлена гетерогенность по радиочувствительности популяций ПОК-10 и ПОК-20.

3. Высокая радиоустойчивость ПОК была подтверждена в условиях независимого от субстрата роста: выживаемость клеток линии ПОК-20 в полужидкой среде после радиационного воздействия в дозе 10 Гр превышала таковую клеток исходной линии ДХ-ТК" в 20 раз. Обнаружено, что облучение в этой дозе не изменяет пролиферативную активность клоногенных клеток ПОК.

4. Показано, что ПОК способны к более быстрой и эффективной репопуляции после у-облучения в дозах 8, 10, 12,5 и 15 Гр, чем клетки родительской линии ДХ-ТК".

5. Не выявлено различий в эффективности восстановления ПОК-20 и клеток ДХ-ТК" от индуцированных облучением потенциально летальных и сублетальных повреждений.

6. Обнаружено, что туморогенная способность необлученных и облученных в дозах 5, 10 и 15 Гр клеток ПОК-20 не различалась как по частоте индукции опухолей у хомячков, так и по срокам появления опухолей. В то же время, после предварительного облучения родительских клеток в дозе 15 Гр, их прививаемость снижалась на 70% при увеличении латентного периода в 5 раз. Таким образом, в опытах in vivo были подтверждены высокая

109 радиоустойчивость ПОК и их способность к быстрой и эффективной постлучевой репопуляции, выявленные in vitro.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сланина, Светлана Викторовна, Москва

1. Алов И.А. Цитофизиология и патология митоза. - М.: Медицина, 1972. - 263с.

2. Альферович A.A., Готлиб В.Я., Пелевина И.И. Влияние облучения в малых дозах на выживаемость клеток и их потомков. // Известия РАН. Серия биология. 1995. - Т.2. - С. 137-141.

3. Балмуханов С.Б., Ефимов М.Л. Радиочувствительность опухолей в эксперименте. Алма-Ата: Наука, 1971. - 170 с.

4. Барамия М.Г. Канцерогенез, старение и продолжительность жизни: потенциал трансформированных клеток и торможение старения (гипотеза). // Успехи современной биологии. 1997. - Т.118, вып.4. - С.421-439

5. Биологические основы лучевой терапии опухолей. / С.П. Ярмоненко, A.A. Вайнсон, Г.С. Календо, Ю.И. Рампан. М.: Медицина, 1976. - 368 с.

6. Выживаемость облученных клеток млекопитающих и репарация ДНК. / И.И. Пелевина, A.C. Саенко, В.Я. Готлиб, Б.И. Сынзыныс. М: Энергоатомиздат, 1985,- 120 с.

7. Готлиб В.Я., Тапонайнен Н.Я., Пелевина И.И. Длительное существующие повреждения ДНК и выживаемость клеток млекопитающих. // Радиобиология. 1985. - T.XXV, вып.4. - С.435-443.

8. Деденков А.Н., Пелевина И.И., Саенко A.C. Прогнозирование реакции опухолей на лучевую и лекарственную терапию. М.: Медицина, 1987. -160с.

9. Дубинин Н.П. Нерешенные вопросы современной молекулярной теории мутаций // Молекулярные механизмы генетических процессов. М.: Наука, 1972. - С.5-35.

10. Ю.Ефимов М.Л. Некоторые аспекты радиочувствительности опухолей (экспериментальное исследование): Диссертация. Алма-Ата, 1967.

11. П.Какпакова E.C., Массино Ю.С. Получение и характеристика линии клеток джунгарского хомячка (ДХ-ТК"), резистентной к 5-бромдезоксиуридину. // Генетика. 1978. - Т. 14, вып. 11 - С.2025-2028.

12. Календо Г.С. Межклеточные взаимодействия и популяционный уровень защиты. // Медицинская радиология. 1975. - Т.1. - С.28-33.

13. Календо Г.С. Может ли пострадиационное слияние клеток быть фактором защиты клеточной популяции? // Радиобиология. Т.ЗЗ, Вып.1. - 1993. -С.76-80.

14. Календо Г.С. Системная защитная реакция популяции опухолевых клеток на облучение в больших дозах. // Радиационная биология. Радиоэкология. -1997. Т.37, вып.4. - С.522-525.

15. Календо Г.С., Демидова Н.И. Кинетика образования поликарионов в культуре клеток HeLa после облучения в дозах 5 и10 Гр. // Радиационная биология. Радиоэкология. -1994. Т.34, вып.1. - С.94-99.

16. Кальман Р.Ф., Тэпли Н. Чувствительность к облучению и характер восстановления спонтанных и изологично трансплантированных опухолей мышей. Труды 8 Международного противоракового конгресса. М., 1963. -Т.4. - С. 166-169.

17. Клиническая радиобиология. / С.П. Ярмоненко, А.Г. Коноплянников, A.A. Вайнсон. М.: Медицина, 1992. - 320 с.

18. Клонально-селекционная концепция опухолевого роста. / Ю.Б. Бахтин, В.Г. Пинчук, И.Н. Швембергер, З.А. Бутенко. Киев: Наукова Думка, 1987. -215 с.

19. Клональный анализ независимости размножения опухолевых клеток от субстрата. / A.A. Ставровская, Т.П. Стромская, P.M. Бродская, Ю.М. Васильев // Генетика. 1982. - Т. 18, вып.З. - С.434-440.

20. Козлова A.B. Лучевая терапия злокачественых опухолей. М.: Медицина, 1971.-351 с.

21. Культура животных клеток. Методы: Пер. с англ. / Д. Конки, Э. Эрба и др.; под ред. Р. Фрешни. М.: Мир, 1989. - 333 с.

22. Лобко Г.Н., Порубова Г.М. Резистентность опухолей: Генетические аспекты. Минск: Наука и техника, 1989. - 143 с.

23. Лушников Е.Ф. Лучевой патоморфоз опухолей человека. М.: Медицина,1977.- 328 с.

24. Марков Г.Г. Исследования приобретенной радиорезистентности асцитной опухоли Эр лиха. Труды 8 Международного противоракового конгресса. М., 1963.-Т.4.-С.112-113.

25. Некоторые аспекты биологического действия малых доз радиации. / В.Я. Готлиб, И.И. Пелевина, Е.Ф. Конопля и др. // Радиобиология. 1991. - Т.31, вып.З.-С.318-32526.0батуров Г.М. Биофизические модели радиобиологических эффектов. М:

26. Энергоатомиздат, 1987. 152 с. 27.0када Ш. Радиационная биохимия клетки: Пер. с англ. / Под ред. Ю.Б. Кудряшова, А.Г. Тарасенко. - М.: Мир, 1974. - 407 с.

27. Пелевина И.И., Афанасьев Г.Г., Готлиб В.Я. Клеточные факторы реакции опухолей на облучение и химиотерапевтические воздействия. М.: Наука,1978.-304 с.

28. Повреждения ДНК, их репарация и апоптоз в отдаленных поколениях клеток L5178Y(R). / Г.Г. Афанасьев, Т. Иваненко, М. Крушевский, И.И. Пелевина // Цитология 1997. Т.39, вып.8. - С.740—746.

29. Пролиферативная активность, синтез ДНК и репродуктивная гибель ближайших и отдаленных потомков облученных клеток / Н.Я. Тапонайнен, В.Я. Готлиб, A.A. Конрадов, И.И. Пелевина // Радиобиология. 1987. -T.XXVII, вып.1. - С.30-36

30. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. Минск: Вышэйш. школа, 1967. 328 с.

31. Роль межклеточных контактов в радиочувствительности клеток культуры HeLa. / Г.С. Календо, В.А. Журбицкая, Н.П. Винская, Г.Р. Восканян // Радиобиология. 1975. - Т. 15, вып.З. - С.348-355.

32. Свойства потомков облученных клеток. / И.И. Пелевина, В.Я. Готлиб, О.В. Кудряшова и др. // Цитология. 1998. - Т.40, вып.5. - С.467-477.

33. Сравнение закономерностей отдаленной гибели клеток после воздействия генотоксических агентов. / В.Я. Готлиб, A.M. Серебряный, С.Б. Черникова и др. // Цитология. 1996. - Т.38, вып.9. - С.974-982

34. Тапонайнен Н.Я., Готлиб В.Я., Пелевина И.И. Чувствительность к воздействиям ингибиторов пострадиационной репарации и повторного облучения потомков облученных клеток. // Радиобиология. 1986. - Т.26, вып.6. - С.755-760.

35. Тапонайнен Н.Я. Нерепарированные повреждения ДНК в потомках облученных клеток млекопитающих: Автореферат дис. канд. биол. наук. Л., 1987.-23 с.

36. Урбах В. Ю. Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях. М.: Медицина, 1975. - 295 с.

37. Урываева И.В. Полиплоидизирующие методы и биологический смысл полиплоидии в клетках печени. // Цитология. 1979. - Т. 12. - С. 1427-1437.

38. Хансон К.П., Комар В.Е. Молекулярные механизмы радиационной гибели клеток. М: Энергоатомиздат, 1985. - 152 с.

39. Эммануэль Н.М., Евсеенко Л.С. Количественные основы клинической онкологии. М.: Медицина, 1976. - 264 с.

40. Марков Г.Г. Изучивания върху придобитата лъчерезистентность на туморите. I. Получаване на подлинии от асцитная карциномы на Ерлих с повышена лъчеустойчивость. // Известия института биологии. Бълг. АН. -1961.-Т.П.-С.301-311.

41. A mammalian cell cycle checkpoint pathway utilizing p53 and GADD45 is defective in ataxia-telengiectasia / M.B. Kastan, Q. Zhan, W.S. El-Deiry et al. // Cell. 1992. - Vol.71. - P.587-597.

42. Alper T., Mothersili C.B., Seymour C.B. Lethal mutations attributable to misrepair of Q-lesions // International Journal of Radiation Biology. 1988. -Vol.54. - P.525-530.

43. Alpha-particle-induced chromosomal instability in human bone marrow cells / M.A. Karhim, S.A. Lorimore, M.D. Hepburn et al. // Lancet. 1994. - Vol.344. -P.987-988.

44. Alpha-particle-induced p53 protein expression in a rat lung epithelial cell strain./ A.B. Hickman, R.J. Jaramillo, I.F. Lechner, N.F. Johnson // Cancer Research. 94.- Vol.54. P.5797-5800.

45. Bailly M., Bertrand S., Dore J. F. Increased spontaneous mutation rates and prevalence of karyotype abnormalities in highly metastatic human meanoma cell lines. // Melanoma Research. 1993. - Vol.3. - P.51-61.

46. Balmukhanov S. B., Yefimov M. L., Kleinbock T. S. Acquired radioresistance of Tumor cells. //Nature 1967. - Vol.216. - P.709-711.

47. Born R., Trott K. R. Clonogenicity of the progeny of surviving cells after irradiation. // International Journal of Radiation Biology. 1988. - Vol.53, no.2 -P.319-330.

48. Brown D. C., Trott K. R. Clonal heterogeneity in the progeny of HeLa cells which survive X-irradiation. // International Journal of Radiation Biology. 1994. -Vol.66. -P.151-155.

49. Cancer of the prostate: results of radiotherapy. Multicenter study. / Y.M. Allain, M. Bolla, J. Douchez et al. // Bulletin du Cancer. 1985. - Vol.72, no.6. -P.559-567.

50. Cell population kinetics of the rhabdomyosarcoma R1H of the rat after single doses of X-rays / H. Jung, H.J. Kruger, I. Brammer et al. // International Journal of Radiation Biology. 1990. - Vol.57, no.3. - P.567-589.

51. Chan G.L., Little J.B. Induction of ouabain-resistant mutations in C3H 10T1/2 mouse cells by ultraviolet light. // Proceedings of the National Academy of Sciences of USA. 1978. - Vol.75. - P.3363-3366.

52. Chang W.P., Little J.B. Delayed reproductive death as a dominant phenotype in cell clones surviving X-irradiation // Carcinogenesis. 1992. - Vol.13, no.6. -P.923-928

53. Chang W.P., Little J.B. Delayed reproductive death in X-irradiated Chinese hamster ovary cells. // International Journal of Radiation Biology. 1991. -Vol.60, no.3.-P.483-496.

54. Chang W.P., Little J.B. Evidence that DNA doubl-strand breaks initiate the phenotype of delayed reproductive death in Chinese hamster ovary cells. // Radiation Research. 1992. - Vol.131. - P.53-59.

55. Chang W.P., Little J.B. Persistently elevated frequency of spontaneous mutation in progeny of CHO clones surviving X-irradiation: association with delayed reproductive death phenotype // Mutation Research. 1992. - Vol.270. - P. 191199.

56. Changes in TCD50 as a measure of clonogen doubling time in irradiated and unirradiated tumors. 7 L. Milas, S. Yamada, N. Hunter et al. // International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 1991. - Vol.21. - P. 1195-1202.

57. Chatterjee A., Hodgkiss R.J., Rojas A. Contribution of lethal mutations to excision assays for tumour cell survival. // Acta Oncologica. 1995. - Vol.34. - P.493-498.

58. Chatterjee A., Rojas A., Hodgkiss R.J. Induction of lethal mutations in experimental tumours after single and fractionated irradiations in vivo. // International Journal of Radiation Biology. 1998,- Vol.74, no.l - P. 119-127.

59. Clonal analisis of delayed kariotipic abnormalities and gene mutations in radiation-induced genetic instability / A.J. Grosovsky, K.K. Parks, C.R. Giver, S.L. Nelson // Molecular and Cellular Biology. 1996. - Vol.16. - P.6252-6262.

60. Clonal chromosomal aberrations and genomic instability in X-irradiated human T-lymphocyte cultures. / K. Holmberg, S. Fait, A. Johannson, B. Lambert. // Mutation Research. 1993. - Vol.286. - P.321-330.

61. Clone size analysis in the study of cell growth following single or during continious irradiation. / A.H.W. Nias, C.W. Gilbert, L.G. Lajtha, S. Lange // International Journal of Radiation Biology. 1965. - Vol.9. - P.275-290.

62. Conger A.D., Luippold H. Studies on the mechanism of acquired radioresistance in cancer. // Cancer Research. 1957. - Vol.17. - P.897.

63. Delayed chromosomal instability in human T-lymphocyte clones exposed to ionizing radiation. / K. Holmberg, A. E. Meijer, G. Auer, B. Lambert. // International Journal of Radiation Biology. 1995. - Vol.68 - P.245-255.

64. Division probability and division delay in diploid Syrian hamster cell following a range of X-ray doses. / G.P. Joshi, W.J. Nelson, S.H. Revell, C.A. Shaw // International Journal of Radiation Biology. 1982. - Vol.41, no.4. - P.443-448.

65. Durand R.E., Sutherland R.M. Effects of intercellular contact on repair of radiation damage. // Experimental Cell Research. 1972. - Vol.71. - P.75-80.

66. Durand R.E., Sutherland R.M. Growth and radiation survival characteristics of V7(1716) Chinese hamster cells: a possible influence of intercellular contact. // Radiation Research. 1973. - Vol.56 - P.513-527.

67. Expression of lethal mutations is suppressed in neoplastically transformed cells and after treatment of normal cells with carcinogens. / C. Mothersill, F. Lyng, S. O'Reilly et al. // Radiation Research. 1996. - Vol.145. - P.714-721.

68. Ferroux R., Regaud C., Samsonow L. Increase of radioresistance of seminal epitelium by small doses of roentgen rays. // Radiophysiology. 1927. - Vol.3. -P.278-296.

69. Fitzek M., Trott K.R. Clonal heterogeneity in delayed decrease of plating efficiency of irradiated HeLa cells. // Radiaton and Enviromental Biophysics. -1993. Vol.32. -P.33-40.

70. Fowler J.F. Potential for increasing the differential response between tumors and normal tissues: can proliferation rate be used? // International Journal of Radiation, Oncology, Biology, Physics. 1986.- Vol.12. - P.641-645.

71. Genomic instability in Chinese hamster cells after exposure to X rays or alpha particles of different mean linear energy transfer. / L. Manti, M. Jamali, K. M. Prise et al. // Radiation Research. 1997. - Vol.147. - P.22-28.

72. Genomic instability induced by ionizing radiation / W.F. Morgan , I.P. Day, M.L. Karlan et al. // Radiation Research. 1996. - Vol.146. - P.247-258.

73. Gorgojo L., Little J.B. Expression of lethal mutations in progeny of irradiated mammalian cells. // International Journal of Radiation Biology. 1989. - Vol.55, no.4. - P.619-630.

74. Grosovsky A.J. Radiation-induced mutations in irradiated DNA // Proceedings of the National Academy of Sciences of USA. 1999. - Vol.96. - P.5346-5347.

75. Harper K., Lorimore S. A., Wright E. G. Delayed appearance of radiation-induced mutations at the hprt locus in murine haemopoietic cells. // Experimental Hematology. 1997. - Vol.16. - P.263-269.

76. Hermans A. F., Barendsen G. W. Changes of all proliferation characteristics in a rat rhabdomyosarcoma before and after x-radiation. // European Journal of Cancer. -1969. Vol.5. - P. 173-189.

77. Hopwood L.E., Tolmach L.J. Manifestation of damage from ionizing radiation in mammalian cells in the postirradiation generation. In: Advances in Radiation Biology. Academic Press, 1979. - Vol.8. - P.317-362.

78. Horikawa M., Dolida I., Sugahara T. Cytogenetic studies on radioresistant cells derived from mouse strain L cells in cell culture. // Radiation Research. 1964. -Vol.22. - P.478-488.

79. Hornsey S. The relationship between total dose, number of fractions and fraction size in the response of malignant melanoma in patients. // British Journal of Radiology. 1978 - Vol.51 - P.905-909.

80. Hurwitz C., Tolmach L.J. Tame-lapse cinematographic studies of X-irradiated HeLa cells. I. Cells progression and cell disintegration. // Biophysical Journal. -1969.-Vol.9. P.607-633.

81. Increased mutation rate at the hprt locus accompanies microsatellite instability in colon cancer. / J.R. Eshleman, E.Z. Lang, G.K. Bowerfind et al. // Oncogene. -1995. Vol.10. -P.33-37.

82. Jaffe D.R., Williamson J.F., Bowden G.T. Ionizing radiation enhances malignant progression of mouse skin tumors. // Carcinogenesis. 1987. - Vol.8. - P. 17531755.

83. Jamali M., Trott K. R. Persistent increase in the rates of apoptosis and dicentric chromosomes in surviving V79 cells after X-irradiation. // International Journal of Radiation Biology. 1996. - Vol.70, no.6. - P.705-709.

84. Jamali M., and Trott K. R. Persistent micronucleus frequency in the progeny of irradiated Chinese hamster cells. // International Journal of Radiation Biology.1996.-Vol.69.-P.301-307.

85. Kadhim M.A., Marsden S.J., Wright E.G. Radiation-induced chromosomal instability in human fibroblasts: temporal effects and the influence of radiation quality // International Journal of Radiation Biology. 1998. - Vol.73, no.2. -P.143-148.

86. Kennedy A.R. Is there a critical target gene for the first step in carcinogenesis? // Environmental Health Perspectives. 1991. - Vol.93. - P. 199-203.

87. Kennedy A.R., Cairns J., Little J.B. Timing of the steps in transformation of C3H 10T 1/2 cells by X-irradiation. //Nature. 1984. - Vol.307 - P.85-86.

88. Kennedy A.R., Little J.B. Evidence that a second event in X-ray-induced oncogenic transformation in vitro occurs during cellular proliferation. // Radiation Research. 1984. - Vol.99. - P.228-248.

89. Kennedy A.R., Little J.B. Investigation of the mechanism for enhancement of radiation transformation in vitro by 12 O - tetradecanoylphorbol - 13 - acetate. // Carcinogenesis. - 1980. - Vol.1. - P.1039-1047.

90. Kronenberg A. Radiation-induced genomic instability. // International Journal of Radiation Biology. 1994. - Vol.66, no.5. - P.603-609.

91. Kwok T.T., Sutherland R.M. The influence of cell-cell contact on radiosensitivity of human squamous carcinoma cells. // Radiation Research. -1991. Vol.126.-P.52-57.

92. Latent expression of p53 mutations and radiation-induced mammary cancer. / C.S. Selvanayagam, C.M. Davis, M.N. Comforth, R.L. Ullrich. // Cancer Research. 1995. - Vol.55. - P.3310-3317.

93. Lehnert S. Changes in radiosensitivity of V79 cells accompanying growth and cell division. // Radiation Research. 1975. - Vol.63 - P.326-335.

94. Little J.B. Changing views of cellular radiosensitivity. // Radiation Research. -1994. Vol.140. -P.299-311.

95. Little J.B. Radiation-induced genomic instability // International Journal of Radiation Biology. 1998. - Vol.74, no.6. - P.663-671.

96. Little J.B. Repair of sub-lethal and potentially lethal radiation damage in plateu phase cultures of human cells. // Nature. 1969. - Vol.224 - P.804-806.

97. Little J.B., Gorgojo L., Vetrovs H. Delayed appearance of lethal and specific gene mutations in irradiated mammalian cells. // International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 1990 - Vol.19. - P. 1425-1429.

98. Loeb L.A. Mutator phenotype may be required for multistage carcinogenesis. // Cancer Research. 1991. - Vol.51. - P.3075-3079.

99. Maity A., McKenna G.W., Muschel R.J. The molecular basis for cell cycle delays following ionizing radiation: a review. // Radiotherapy and Oncology. -1994.-Vol.31.-P.l-13.

100. Manifestations and mechanisms of radiation-induced genomic instability in V-79 Chinese hamster cells. / K.R. Trott, M. Jamali, L. Manti, A. Teibe. // International Journal of Radiation Biology. 1998. - Vol.74, no.6. - P.787-791.

101. Marder B.A., Morgan W.F. Delayed chromosomal instability induced by DNA damage. // Molecular Cell Biology. 1993. - Vol.3. - P.6667-6677.

102. McMillan T.J., Peacock J.H. Molecular determinants of radiosensitivity in mammalian cells. // International Journal of Radiation Biology. 1994. - Vol.65. -P.49-55.

103. Mendonca M.S., Redpath J.L. Isolation of human cell hybrids (HeLa x skin fibroblast) expressing a radiation-induced tumour-associated antigen. // British Journal of Cancer. 1989. - Vol.60. - P.324-326.

104. Mitchell J.B., Glatstein E. Radiation Oncology: past achievements and ondoing controversies. // Cancer Research. 1991. - Vol.51. - P.5065-5073.

105. Modrich P. Mismatch repair, genetic stability, and cancer. // Science. 1994. -Vol.266.-P. 1959-1960.

106. Morgan W.F., Murnane J.P. A role for genomic instability in cellular radioresistance? // Cancer and Metastasis Reviews. 1995. - Vol.14, no.l. - P.49-58.

107. Mothersill C., Seymour C.B. Survival of human epithelial cells irradiated with cobalt 60 as microcolonies or single cells. // International Journal of Radiation Biology. 1997. - Vol.72. - P.597-606.

108. Mothersill C., Seymour C.B. The influence of lethal mutations on the quantification of radiation transformation frequencies. // International Journal of Radiation Biology. 1987. - Vol.51. - P.723-729.

109. Mulcahy R.T., Gould M.N., Clifton K.H. Radiogenic initiation of thyroid cancer: a common cellular event. // International Journal of Radiation Biology and Related Studies in Physics, Chemistry and Medicine. 1984. - Vol.45. - P.419-426.

110. Murnane J.P. Role of induced genetic instability in the mutagenic effects of chemicals and radiation // Mutation Research. 1996. - Vol.367. - P.l 1-23.

111. Murnane J.P. The role of recombinational hotspots in genome instability in mammalian cells: a historical perspective. // Cancer and Metastasis Reviews. -1990.-Vol.12.-P.577-581.

112. Murray A.W. The genetics of cell cycle checkpoints. // Current Opinion in Genetics and Development. 1995. - Vol.5. - P.5-11.

113. Mutation rate of normal and malignant human lymphocytes. / R. Seshadri, R.J. Kutlaca, K. Trainor et al. // Cancer Research. 1987. - Vol.47. - P.407-409.

114. Mutator phenotypes in human colorectal carcinoma cell lines. / N.P. Bhattacharyya, A. Skandalis, A. Ganesh et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences of USA. 1994. - Vol.91. - P.6319-6323.

115. Nice C.M. Radioresistance in limphosarcoma. 8th internat. Congr. Radiol. Mexico, 1956. P.248-249.

116. No association between p53 status and a-particle-induced chromosomal instability in human lymphoblastoid cells / M.A. Kadhim, C.A. Walker, M.A.

117. Plumb, E.G. Wright. // International Journal of Radiation Biology. 1996. -Vol.69. -P.167-174.

118. Nowell P.C. The clonal evolution of tumor cell progression for multistage carcinogenesis. // Science. 1976. - Vol.194. - P.23-28.

119. Olive P.L., Durand R.E. Drug and radiation resistance in spheroids: cell contact and kinetics. // Cancer and Metastasis Reviews. 1994. - Vol.13. - P. 121138.

120. O'Reilly S., Mothersill C., Seymour C. B. Postirradiation expression of lethal mutations in an immortalized human keratinocyte cell line. // International Journal of Radiation Biology. 1994. - Vol.66. - P.77-83.

121. Overexpression of P-glycoprotein in mammalian tumor cell lines after fractionated X-irradiation in vitro. / B.T. Hill, K. Deuchars, L.K. Hosking et al. // Journal of National Cancer Institute. 1990. - Vol.82, no.7. - P.607-612.

122. Pampfer, Streffer C. Increased chromosome aberration levels in cells from mouse fetuses after zygote X-irradiation. // International Journal of Radiation Biology. 1989. - Vol.55. - P.85-92.

123. Paquette B., Little J.B. In vivo enhancement of genomic instability in minisatellite sequences of mouse C3H/10T1/2 cells transformed in vivo by X-rays. // Cancer Research. 1994. - Vol.54. - P.3173-3178.

124. Pearson A.E. Serial irradiation of mouse tumours: changes in radiosensitivity. // British Journal of Cancer. 1959. - Vol.13. - P.477-485.

125. Peters L.J., Ang K.K., Thames H.D.Jr. Accelerated fractionation in the radiation treatment of head and neck cancer. // Acta Radiológica. 1988. - Vol.27. - P.185-194.

126. Pigott K, Dische S., Saunders M.I. Where exactly does failure occur after radiation in head and neck cancer? // Radiotherapy and Oncology. 1995. -Vol.37, no. 1 - P. 17-19.

127. Plating efficiency as a function of time post-irradiation: evidence for the delayed expression of lethal mutations. / M.S. Mendonca, W. Kurohara, R. Antoniono, J.L. Redpath. // Radiation Research. 1989. - Vol.119. - P.389-393.

128. Powell S.N., Abraham E.H. The biology of radioresistance: similarities and interactions with drug resistance. // Cytotechnology. 1993. - Vol.12. - P.325-345.

129. Puck T.T., Marcus P.I. Action of X-rays on mammalian cells. // Jornal of Experimental Medicine. 1956. - Vol.103. - P.653-666.

130. Quiet C.A., Weichselbaum R.R., Grdina D.J. Variation in radiation sensitivity during the cell cycle of two human squamous cell carcinomas. // International Journal of Radiation, Oncology, Biology, Physics. 1991. - Vol.20. - P.733-738.

131. Radiation induced genomic instability and persisting oxidative stress in primary bone marrow cultures. / S.M. Clutton, K.M.S. Townsend, C. Walker et al. // Carcinogenesis. 1996. - Vol.17. - P. 1633-1639.

132. Radiation therapy for early stage (T1-T2) sarcomatoid carcinoma of true vocal cords: outcomes and patterns of failure. / M.T. Ballo, A.S. Garden, A.K. El-Naggar et al. // Laryngoscope. 1998. - Vol.108, no.5. - P.760-763.

133. Radiation therapy for giant cell tumor of bone. / C.J.Jr. Bennett, R.B.Jr. Marcus, R.R. Million, W.F. Enneking. // International Journal of Radiation, Oncology, Biology, Physics. 1993. - Vol.26, no.2 - P.299-304

134. Radiation-induced genomic instability: delayed cytogenetic aberrations and apoptosis in primary human bone marrow cells. / M.A. Kadhim, S.A. Lorimore, K.M. Townsend et al. // International Journal of Radiation Biology. 1995. -Vol.67.-P.287-293.

135. Radiation-induced genomic instability: delayed mutagenic and cytogenetic effects of X rays and alpha particles. / J. B. Little, H. Nagasawa, T. Pfenning, H. Vetrovs // Radiation Research. 1997. - Vol.148. - P299-307.

136. Ramsamooj P., Notario V., Dritschilo A. Enhanced expression of calreticulin in the nucleus of radioresistant squamous carcinoma cells in response to ionising radiation. // Cancer Ressearch. 1995. - Vol.55. - P.3016-3021.

137. Relationship berween X-ray exposure and malignant transformation in C3N 10T1/2 cells./ A.R Kenedy, M. Fox, G. Murphy, J.B. Little. // Proceedings of the National Academy of Sciences of USA. 1980. - Vol.77. - P.7262-7266.

138. Relationship between x-ray exposure and malignant transformation in C3H 10T 1/2 cells. / A.R. Kennedy, M. Fox, G. Murphy, J.B. Little // Proceedings of the National Academy of Sciences of USA. 1984. - Vol.77 - P.7262-7266.

139. Revesz L., Norman U., Richards B. Variation of radiosensitivity in tumour cell populations. // Svedish Cancer Soc., Yearbook. 1963. - Vol.4. - P.360-362.

140. Russell J., Wheldon T.E., Stanton A. Radioresistant variant derived from a human neuroblastoma cell line is less prone to radiation-induced apoptosis. // Cancer Research. 1995. - Vol.55, no.21. - P.4915-4921.

141. Sabatier L., Dutrillaux B., Martin M.B. Chromosomal instability. // Nature. -1992.-Vol.357.-P.548.

142. Sasaki H. Cell killing and division delay in asynchronous and synchronized HeLa cells irradiated with alpha paticles or X rays. // Radiation Research. 1984. -Vol.99. -P.311-323.

143. Seymour C.B., Mothersill C. All colonies of CHO-K1 cells surviving y-irradiation contain non-viable cells. // Mutation Research. 1992. - Vol.267. -P. 19-30.

144. Seymour C.B., Mothersill C. Lethal mutations, the survival curve shoulder and split-dose recovery. // International Journal of Radiation Biology. 1989 -Vol.56, no.6. -P.999-1010.

145. Seymour C.B., Mothersill C., Alper T. High yields of lethal mutations in somatic mammalian cells that survive ionizing radiation. // International Journal of Radiation Biology. 1986. - Vol.50. - P. 167-179.

146. Sherr C.J. Cancer cell cycles. // Science. 1996. - Vol.274. - P. 1672-1677.

147. Sinclair W.K X-ray-induced heritable damage (small colony formation) in cultured mammalian cells. // Radiation Research. 1964. - Vol.21. - P.584-611.

148. Sinclair W.K. Sensitivity to mitotic delay and stage in the cycle. // Current Topics in Radiation Research. 1972. - Vol.7. - P.323-327.

149. Smith B.D., Haffty B.G. Molecular markers as prognostic factors for local recurrence and radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma. // Radiation Oncology Investigations. 1999. - Vol.7, no.3. - P. 125-144.

150. Specific chromosome instability induced by heavy ions: a step towards transformation of human fibroblasts? / M. B. Martins, L. Sabatier, M. Ricoul et al. // Mutation Research. 1993. - Vol.285. - P.229-237.

151. Spontaneous mutation rates of tumorigenic and nontumongenic Chinese hamster embryo fibroblast cell lines. / D. Kaden, I.K. Gadi, L. Bardwell et al. // Cancer Research. 1989. - Vol.49. - P.3374-3379.

152. Su N.L., Little J.B. Prolonged cell cycle delay in radioresistant human cell lines transfected with activated ras oncogene and/or simian virus T-antigen. // Radiation Research. 1993. - Vol.133. - P.73-79.

153. Suit H. D., Urano M. Repair of sublethal radiation injury in the hypoxic cells of a C3H mouse mammary carcinoma. // Radiation Research. 1969. - Vol.37. -P.423-434.

154. Suit H.D. Radiation biology: the conceptual and practical impact on radiation therapy. // Radiation Research. 1983. - Vol.94. - P. 10-40.

155. Suit H.D., Howes A.E., Hunter N. Dependence of response of a C3H mammary carcinoma to fractionated irradiation in fraction number and intertreatment interval. // Radiation Research. 1977. - Vol.72. - P.440-454.

156. Tarnawski R., Kummermehr J., Trott K.R. The radiosensitivity of recurrent clones of an irradiated murine squamous cell carcinoma in the in vitro megacolony system. // Radiotherapy and Oncology. 1998. - Vol.46, no.2. - P.209-214.

157. Terasima R., Tolmach L. J. X-ray sensitivity and DNA synthesis in synchronous populations of HeLa cells. // Science. 1963. - Vol.140. - P.490-492.

158. The accelerated repopulation during the fractionated irradiation of a murine fibrosarcoma, FSa-II, and linear quadratic model. / Y. Abe, L. Kenton, M. Urano,

159. C. G. Willet. // International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. -1991.-Vol.21. -P.1529-1534.

160. The effect of combined modality therapy on local control and survival. / V.T. De Vita, M. Lippman, S.M. Hubbard et al. // International Journal of radiation Oncology, Biology, Physics . 1986. - Vol.12. - P.487-501.

161. The evolution of chromosomal instability in Chinese hamster cells: a changing picture? / B. Ponnaiya, C.L. Limoli, J. Corcoran et al. // International Journal of Radiation Biology. 1998. - Vol.74, no.6. - P.765-770.

162. The human mutator gene homolog MSH2 and its association with hereditary nonpolyposis colon cancer. / R. Fishel, M.K. Lescoe, M.R.S. Rao et al. // Cell. -1993.- Vol.75. -P.1027-1038.

163. The influence of local tumor ulceration on the effectiveness of endocavitary radiation for patients with early rectal carcinoma. / W. P. Reed, P. A. Cataldo, J. L. Garb et al. // Cancer. 1995. - Vol.76. - P.967-971.

164. Thompson L.H., Suit H.D. Proliferation kinetics of X-irradiated mous L cells studied with time-lapse photography. II // International Journal of Radiation Biology. 1969. - Vol.15. - P.347-362

165. Todd P. Defective mammalian cells isolated from X-irradiated cultures. // Mutation Research 1968. - Vol.5. - P. 173-183

166. Transmission of chromosomal aberrations and genomic instability after plutonium a -particle irradiation. / M.A. Kadhim, D.A. McDonald, D.T. Goodhead et al. // Nature. 1992. - Vol.355. - P.738-740.

167. Trott K.R., Hug O. Intraclonal recovery of division probability in pedigrees of single X-irradiated mammalian cells. // International Journal of Radiation Biology. 1970.-Vol.17.-P.483-486.

168. Tubiana M. L.H. Gray medal lecture: cell kinetics and radiation oncology. // International Journal of Radiation, Oncology, Biology, Physics. 1982.- Vol.8. -P.1471-1489.

169. Tubiana M. The combination of radiotherapy and chemotherapy a review. // International Journal of Radiation Biology. 1989. - Vol.55, no.4. - P.497-511.

170. Ullrich R.L., Ponnaiya B. Radiation-induced instability and its relation to radiation carcinogenesis. // International Journal of Radiation Biology. 1998. -Vol.74, no.6. - P.747-754.

171. Van Peperzeel H.A. Effects of single doses of radiation on lung metastases in man and experimental animals. // European Journal of Cancer. 1972. - Vol.8. -P.665-675.

172. West C.M., Keng P.C., Sutherland R.M. Growth phase related variation in the radiation sensitivity of human colon adenocarcinoma cells. // International Journal of Radiation Oncology, Biology and Physics. 1988. - Vol.14. - P.1213-1219.

173. Westra A., Barendsen G.W. Proliferation characteristics of cultured mammalian cells after irradiation with sparsely and densely ionizing radiation. // International Journal of Radiation Biology. 1966,- Vol.11. - P.477-485

174. Withers H.R., Taylor J.M.G., Maciejewski B. The hazard of accelerated tumor clonogen repopulation during radiotherapy. // Acta Oncologica. 1988. -Vol.27-P.131-146.

Информация о работе

Сланина, Светлана Викторовна
кандидата биологических наук
Москва, 2000
ВАК 03.00.01

Диссертация

Радиочувствительность потомков опухолевых клеток, выживших после γ-облучения в больших дозах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы