Программируемая клеточная смерть Saccharomyces cerevisiae, вызванная феромоном

Кнорре, Дмитрий Алексеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Программируемая клеточная смерть Saccharomyces cerevisiae, вызванная феромоном
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Программируемая клеточная смерть Saccharomyces cerevisiae, вызванная феромоном"

На правах рукописи

КНОРРЕ Дмитрий Алексеевич

Программируемая клеточная смерть БассИаготусев сетеу'тае, вызванная феромоном

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в отделе Биоэнергетики Научно Исследовательского Института Физико-Химической Биологии им А.Н.Белозерского при МГУ им. М.В .Ломоносова

Научный руководитель: академик РАН В.П.Скулачев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Звягильская P.A.

доктор биологических наук, профессор Самуилов В.Д.

Ведущая организация: ГУ Российский Онкологический научный центр им. H.H. Блохина РАМН

Защита состоится « 1% Шонл 2005 года в часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук в Институте биохимии имени А.Н. Баха РАН по адресу: 119071 Москва, Ленинский пр-т. 33, корп. 2

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071 Москва. Ленинский пр-т. 33, корп. 2

Автореферат разослан «Ii » 2005 года

Ученый секретарь диссертационного совет кандидат биологических наук

9/Y о//S

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1. Актуальность темы

Контролируемая элиминация клеток играет важную роль в онтогенезе, функционировании иммунитета и поддержании тканевого гомеостаза. До недавних пор считалось, что программируемая клеточная смерть (апоптоз) свойственна только многоклеточным животным или растениям (Vaux et al., 1996). Однако увеличение количества полностью отсеквенированных геномов позволило обнаружить гомологи апоптотических белков в одноклеточных эукариотах и даже в бактериях (Koonin & Aravind, 2002). Одновременно было найдено, что программируемую клеточную смерть, сходную по цитологическим признакам с апоптозом высших эукариот, можно вызвать различными искусственными и природными индукторами у целого ряда одноклеточных организмов: дрожжей, кинетопластид, инфузорий, одноклеточных водорослей (см. Гордеева и др., 2004).

До недавнего времени основным объектом исследования при изучении апоптоза были клеточные линии высших эукариот. Между тем использование дрожжей Saccharomyces cerevisiae в качестве модельного организма значительно удобнее в экспериментальном плане. Половой феромон (а-фактор) в высоких концентрациях вызывал программируемую гибель небольшой фракции клеток дрожжей дикого типа (Severin & Hyman 2002), но при использовании штаммов, сверхчувствительных к половому феромону, практически все клетки, обработанные феромоном, были нежизнеспособны. Такая система открывает широкие возможности для проведения поиска генов, участвующих в регуляции программируемой гибели дрожжей.

Для линий клеток многоклеточных животных в ряде случаев достаточно

подробно изучен механизм реализации программы самоубийства, тогда как в

случае пекарских дрожжей до—сиу п^р получены только

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ | 3БИБЛНОТЕКА I СПетервурм. (У »

_оэ Щш&Ьг I

предварительные сведения, не раскрывающие механизмов этой программы. Поскольку цитологические и молекулярные признаки программируемой гибели одноклеточных организмов во многом схожи с таковыми для клеток многоклеточных животных, то есть основание полагать, что исследование механизма программируемой гибели дрожжей позволит выявить некоторые общие закономерности апоптоза.

Особый интерес в этой связи представляет собой исследование роли митохондрий в программе самоубийства дрожжевой клетки. Для клеток млекопитающих было показано, что митохондрии играют важную роль в регуляции программы самоубийства. Кроме того, энергетический статус клетки находится в значительной степени предопределяется функциональным состоянием митохондрий. При апоптозе клеток многоклеточных животных митохондрии являются основным источником активных форм кислорода. In vitro было показано, что митохондрии дрожжей также могут образовывать активные формы кислорода (Chance, 1979). Однако до сих пор оставалось неизвестным, являются ли митохондрии источником активных форм кислорода (АФК) in vivo. Исследование этого вопроса позволило бы в определенной степени управлять процессом программируемой смерти в одноклеточных организмах.

Понимание механизмов контролируемой клеточной смерти дрожжей имеет значение не только в связи с тем, что позволяет проводить аналогии с апоптозом высших эукариот. Очевидно, что механизмы самоубийства клеток грибов и млекопитающих могут иметь более или менее существенные отличия, на основе этих отличий возможно создание новых специфических антигрибковых препаратов (Philips et al. 2003).

2. Цель и задачи работы

Целью данной работы было исследование механизма запрограммированной гибели дрожжей Saccharomyces cerevisiae, вызванной их половым феромоном, а также поиск генов, кодирующих белки,

участвующие в распространении или регуляции этого процесса. Особенное внимание предполагалось уделить роли митохондрий, которые в других системах являются ключевыми регуляторами запрограммированной гибели клеток.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Провести поиск генов, кодирующих белки, участвующие в распространении каскада самоубийства у дрожжей.

2. Методами флуоресцентной микроскопии определить последовательность внутриклеточных событий, наблюдаемых в ответ на добавление к клеткам дрожжей феромона в высокой концентрации.

2. Провести ингибиторный анализ, определить, на каком этапе каскада действуют различные ингибиторы электронтранспортной цепи, разобщители, антиоксиданты и ингибиторы синтеза белка.

4. Определить роль идентифицированных белков в каскаде самоубийства.

3. Научная новизна

Разработана экспериментальная система, в которой добавление неспецифического активатора кальциевых каналов (амиодарона), вызывающая повышение концентрации внутриклеточного кальция, приводит к тем же внутриклеточным событиям (образование АФК, фрагментация ДНК, фрагментация митохондрий и клеточная смерть), что и добавление полового феромона.

Установлена последовательность событий при самоубийстве 5 сегегшае, вызванной физиологическим фактором - высокой концентрацией полового феромона.

1) Активация МАР-киназного каскада

2) Увеличение концентрации внутриклеточного кальция

3) Гиперполяризация митохондрий

4) Образование митохондриями активных форм кислорода

5) Выход цитохрома с из межмебранного пространства митохондрий

6) Деполяризация и фрагментация митохондрий

7) Гибель клеток

Идентифицирован новый белок Ysplp (Yeast suicide protein), который действ) ет на этапе фрагментации митохондрий. Показано, что образование активных форм кислорода является не побочным проявлением программы самоубийства, вызванной высокой концентрацией феромона, а необходимым этапом. Показано, что феромон-индуцированная гибель дрожжей, также как и апоптоз клеток высших эукариот, сопровождается фрагментацией ядерной ДНК.

4. Научно-практическая ценность

Работа имеет теоретическое значение для понимания базовых принципов механизмов реализации апоптотического каскада в различных клетках. Наличие в одноклеточных организмах физиологической программы самоубийства делает дрожжи не только удобным инструментом для изучения механизмов апоптоза, но также и многообещающей моделью для изучения общих принципов "альтруистической" смерти организмов.

5. Апробация работы

Диссертация апробирована и рекомендована к защите на совместном семинаре отдела биоэнергетики НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского при МГУ имени М.В. Ломоносова и кафедры биохимии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Материалы диссертации были представлены на международной конференции «Российская биоэнергетика: от молекул к клетке».

6. Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (7 глав), раздела «Методы исследования» (7 глав), результатов (10 глав), обсуждения и выводов. Диссертация изложена на 157 страницах, содержит 47 рисунков и 7 таблиц. Список литературы включает 222 работы из них 213 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Обзор литературы

В обзоре литературы рассмотрено большинство известных к настоящему моменту примеров активной гибели одноклеточных организмов. Обсуждаются механизмы реализации и регуляции каскада самоубийства у одноклеточных, вызванного различными индукторами. Рассмотрены известные механизмы образования АФК в дрожжах.

2. Материалы и методы

В работе были использованы штаммы дрожжей 5 сегеч'шае W303-1B, W303-1B ст(11-б, W303 ЛсусЗ и \V303 р. Кроме этого, в ходе работы были получены несколько штаммов, устойчивых к высоким концентрациям полового феромона, в том числе >Л303-1В Ау.чр1. Дрожжи выращивали на богатых средах, содержащих в качестве истоника углерода галактозу и раффинозу или, при проведении генетического скрининга, на среде, содержащей в качестве источника углерода глюкозу. Для приготовления твердых сред в указанные выше среды добавляли бакто-агар (20 г/л). Клетки выращивали и инкубировали при температуре 30° С, при этом работали с культурой, находящейся в логарифмической фазе роста.

Программируемую гибель индуцировали половым феромоном (100 мкг/мл) или амиодароном (80 мкМ). Для определения процента выживания после обработки феромоном или амиодароном, суспензию клеток разводили

и высеивали на твердую среду. Через 48 часов подсчитывали количества образовавшихся колоний В тех случаях, когда процент гибели был низким (менее 40%), выживаемость определяли по окрашиванию метиленовым синим или пропидий иодидом. Образование активных форм кислорода определяли по окрашиванию клеток дихлорфлуоресцеином диацетатом. Потенциал митохондрий в целых клетках оценивали по флуоресценции тетраметилродамина или потенциалзависимого митотрекера оранжевого.

Для определения скорости дыхания целых клеток и митохондрий использовали полярографический метод

3. Результаты

3.1. Исследование зависимости гибели клеток от концентрации полового феромона показало, что при концентрации феромона 100 мкг/мл достигается максимальный процент гибели, дальнейшее увеличение концентрации не приводила к увеличению процента мертвых клеток (Рис.1). Для проведения генетического скрининга необходимо было создать систему, где процент выживания клеток не превышал 3-4%. Показано, что фаза клеточного цикла и репликативный возраст клетки не влияли на восприимчивость клеток штамма \V303-1B к летальной концентрации полового феромона. Поэтому для проведения генетического скрининга и исследования действия ингибиторов нами был выбран штамм Д¥303-1В ст(11-б. гиперчувствительный к половому феромону. Феромон в концентрации 100 мкг/мл вызывал гибель более 95% клеток (Рис.1).

Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в суспензии клеток штамма \V303 стсИ-6 через час сокращалось на 20-25%, тогда как окраска прижизненным красителем метиленовым синим не выявляла даже 1% в этот временной интервал. Это наблюдение служит важным подтверждением того,

что клетки этого штамма, обработанные а-фактором, не лизировались неспецифически, а гибли активным способом.

>s s

о с; о

X О

S -J-

100 80 60 40 20 Н

W303-1B cmdl-6

50 100 150 200 а-фактор, мкг/мл

Рисунок 1. Зависимость гибели дрожжей штаммов W303 и W303 cmdl-б от концентрации а-фактора.

3.2. Исследовали влияние антиоксидантов: водорастворимого N-ацетилцистеина и жирорастворимого а-токоферола, а также ингибиторов дыхательной цепи: миксотиазола (ингибитора комплекса III) и KCN (ингибитора цитохромоксидазы), на программируемую гибель клеток штамма W303 cmdl-б, вызванную избытком феромона (Рис.2). Оказалось, что все они в той или иной мере спасали клетки от гибели, однако ингибиторы дыхательной цепи и а-токоферол в концентрации 10 мкМ ингибировали и «классический» ответ на феромон, т. е. вызывали арест клеточного цикла и предотвращали образование половых выростов. Поэтому осталось непонятным, что именно оказывает ингибирующее действие: блокирование дыхательной цепи (в случае с миксотиазолом и KCN) или

подавление каких-либо ранних этапов ответа на феромон, возможно, общих для «классического» ответа и феромон-индуцируемой гибели.

х о с;

о ^

о с; о

100

60-

40-

20-

л С о о. ь

ю о

а>

=г с

Ф П)

с; о о.

ш -&

с о о. а>

■е

Рисунок 2 Влияние антиоксидантов и ингибиторов дыхательной цепи на гибель дрожжей, вызванную феромоном (100 мкг/мл)

3.3 Для дальнейшего изучения молекулярных механизмов самоубийства дрожжей был проведен генетический скрининг генов, кодирующих белки, участвующих в этом каскаде. Для этого был использован штамм W303 стсИ-6, гиперчувствительный к половому феромону. Мы трансформировали этот штамм транспозоном, который замещал случайный участок последовательности геномной ДНК. Полученную смесь мутантов обрабатывали феромоном и высеивали на твердую среду.

Устойчивость к высокой концентрации феромона могла возникать в следующих случаях: (1) нарушение каскада самоубийства; (2) нарушение общего учасгка каскада для самоубийства и полового ответа на феромон; (3)

потеря функциональных митохондрий (согласно работе Severin & Hyman, 2002): (4) компенсация гиперчувствительности к феромону.

Транспозонная библиотека дрожжевого генома

Дрожжевая геномная ДНК

Обработка рестриктазой ЫоИ

Дрожжевая геномная ДНК

трзяспозон

Высокоэффективная интегративная трансформация штамма S. cerevisiae, Гиперчувствительного к а -фактору

Список идентифицированных генов

Определение места интеграции транспозона и нарушенного гена

Набор фертильных мутантов & сегеу/аае, устойчивых к высоким концентрациям а -фактора (~3%)

Набор мутантов Э. сегемв/зе, растущих на среде без лейцина

| Обработка феромоном 1 а-фактором (100 мкг/мл)

Набор мутантов в. сегеу/яае, устойчивых к высоким концентрациям феромона (100%) ^^

Тест на стерильность^

Набор фертильных мутантов & cerevisiae, устойчивых к высоким концентрациям а-фактора (~30%)

т Обработка / а -фактором / (100 мкг/мл)

Набор фертильных мутантов & сегв^Шае, устойчивых к высоким концентрациям а -фактора (~4%)

Обработка

а-фактором (100 мкг/мл)

Рисунок 3. Схема генетического скрининга. Проценты в скобках обозначают процент клеток, оставшихся после соответствующего теста. За 100 % принято количество мутантных клеток после первичного теста на устойчивость к феромону

Для того чтобы исключить пункт 2, мы проверяли способность выживших клеток спариваться с клетками противоположного типа спаривания и в дальнейшем рассматривали только эти мутанты. Для исключения пункта 3 мы проверяли способность клеток расти на

несбраживаемом субстрате (глицерине) и в дальнейшем использовали только эти мутанты . Полученный набор мутантов мы проверяли еще два раза на устойчивость к феромону и, если они проявляли стабильную устойчивость, определяли какого участка геномной ДНК они лишены (схема генетического скрининга представлена на рисунке 3).

В полученных мутантных линиях клеток определяли расположение вставки транспозона. Для этого из дрожжей выделяли геномную ДНК и расщепляли рестриктазой Hind III. В кассете генов, содержащейся в транспозоне, содержался единственный сайт для рестриктазы Hind III, поэтому в результате рестрикции мы получали смесь фрагментов геномной ДНК и фрагмент ДНК, содержащей наряду с геномной ДНК участок транспозона до сайта рестрикции Hind III. Полученную смесь фрагментов лигировали с плазмидой рВС KS+, обработанной рестриктазой Hind III и ДНК фосфатазой. Далее смесь плазмид трансформировали методом электропарации в бактерии Е coli линии XL-1 Blue. Трансформированные бактерии выращивали на твердой среде с добавленными хлорамфениколом и ампициллином. В этих условиях вырастали только те бактерии, в которые была трансформирована плазмида, содержащая фрагмент транспозона и, следовательно геномной ДНК дрожжей. Из полученных штаммов бактерий выделяли плазмидную ДНК и секвенировали ее. Полученные последовательности сравнивали с помощью программы для выравнивания последовательностей BLAST с геномной ДНК дрожжей и идентифицировали ген (или гены), нарушенные в результате встраивания транспозона. В результате, были идентифицировано 28 генов, которые представленны в таблице 1.

Обсуждение роли каждого конкретного гена, обнаруженного в результате скрининга, выходит за рамки работы. Все обнаруженные гены могут быть разделены на несколько групп.

Таблица 1. Гены, предположительно участвующие в регуляции или реализации каскада клеточного самоубийства дрожжей, вызванного высокой концентрацией полового феромона.

N ORF Названия гена

1 YCR105W ADH7

2 YHR155W YSP1"

3 YFR044C YFR044C

4 YLR044C PDC1

5, YPL064C CWC27

6 CWC27

7 YLR371W ROM2

8 YOR121C YOR121C

9-10 YDR335W MSN5

11 YDR102C и YDR103W YDR 102с и STE5

12 YLL021W SPA2/FUS6/PEA1

13 YDL005C MED2

14 YDR181C SAS4

15 YOR213C SAS5

16 YNL257C SIP3

17 YNL236W SIN4/BEL2/GAL22/MED16

18 YDL135CU РРН21 RDI1 и РРН1

19 RDN58-1, RDN18-1/ RDN58-2, RDN58-1, RDN18-1/ RDN58-2,

RDN18-2 RDN18-2

20-21 YLR163C MAS1/MIF1

22-23 YLR119W SRN2/SRN10/VPS37

24 YDR336W YDR336W

25 YPR148C YPR148C

26 YMR114C и/или YMR115W YMR114с и/или FMP24

27 YLR162W YLR162W

28 YBR108W YBR108W

Одни из них (MSN5, STE5 и SPA2) участвуют в регуляции полового каскада и, следовательно будут оказывать влияние и на апоптотический каскад, вызванный феромоном. Однако в настоящей работе нас в большей степени интересовали белки, участвующие на поздних этапах каскада самоубийства. Второй группой генов оказались транскрипционные факторы и глобальные регуляторы транскрипции (MED2, SAS4, SAS5, SIP3); нарушение их функции влияет на уровень экспрессии очень большого числа генов, поэтому мы также не стали получать клеточные линии, лишенные этих генов. Также, в рамках работы, нас не интересовали гены рибосомальной РНК. гены, инактивация которых легальна (MAS1) или приводит к значительному замедлению роста на несбраживаемых субстратах (YDR336W). Из оставшихся генов для дальнейшего изучения были выбраны 6 генов: ADH1, YHR155W, PDC1, YLR044C, CWC27 и YOR121C. Мы полагали, что интерес представляют гены с неизвестными функциями, а также ген CWC27, который оказался гомологом генов, кодирующих циклофилины, которые входят в состав Са2+-зависимой, CsA-чувствительной поры митохондрий многоклеточных животных. Поэтому дальнейшая наша задача заключалась в том, чтобы определить, будет ли направленная инактивация обнаруженных нами генов понижать восприимчивость клеток к половому феромону. Для этого методом ПЦР мы сконструировали фрагмент ДНК, состоящий из гена HIS1, фланкированного участками геномной ДНК дрожжей, соответствующих участкам ДНК, фланкирующим гены, которые необходимо было инактивировать . Этими фрагментами ДНК мы

трансформировали штамм W303-1B cmdl-6 Таким

образом, было получено 7 мутантов: Ayfr044c, Acwc27, Apdcl, Ayhrl55w, Aycrl05w, Arom2, , Ayorl21 . Однако 4 из 7 полученных мутантов (Acwc27, Apdcl, Ayorl21 и Arom2) оказались неустойчивыми к половому феромону, что указывало на то, что эффективность нашего скрининга составляет приблизительно 40%. В оставшихся мутантных клетках мы определили скорость роста в среде, содержащей глицерин в качестве источника

углеродов и отбросили мутант Лу!т044с, у которого скорость удвоения в этих условиях оказалась в 1,7 раза меньше, чем у остальных мутантов и родительской линии.

На основании полученных данных для дальнейшего изучения был выбран белок, кодируемый геном УНК155\У. Он был инактивирован у клеток штамма ^^303-1В с помощью той же конструкции, что была использована на клетках \V303-1B стс11-б Инактивация гена приводила к резкому снижению процента гибели клеток в ответ на высокие (100 мкг/мл) концентрации а-фактора (Рис. 4). При этом клетки, лишенные гена УБР1, были даже несколько более чувствительны к низкой концентрации полового феромона.

хО 30%-

Рисунок 4. Снижение процента гибели клеток в штамме с инактивированным геном УБР1 или в присутствии антиоксидантов' 20 мкМ а-токоферола или 30 мМ Ы-ацетилцистеина. ПКС дрожжевых клеток индуцировали а-фактором (100 мкг/мл) и оценивали по окраске метиленовым синим через 4 часа после добавления индуктора.

Известно, что добавление даже низких концентраций полового феромона вызывает накопление ионов Са2+ клетками дрожжей (Ша сЧ а1. 1990). Мы предположили, что повышение концентрации Са2+ в цитоплазме

(как и в случае некоторых вариантов апоптоза многоклеточных) может являться сигналом в каскаде самоубийства клеток, вызванного высокой концентрацией полового феромона. Поэтому мы сравнили действие феромона с действием веществ, искусственно повышающих концентрацию внутриклеточного Са2+: Са2+ -переносчика А23187 и неспецифического активатора Са2+-каналов амиодарона. Оказалось, что все эти вещества приводят к (1) повышению мембранного потенциала

митохондрий, (2)

образованию АФК и (3) гибели клеток (Рис.5). Однако в случае А23187 все эти внутриклеточные события наблюдались только в 10% клеток, тогда как амиодарон вызывал быстрый ответ практически во всех клетках. Более того, гиперполяризация митохондрий, образование АФК и гибель клеток в ответ на амиодорон происходили в той же последовательности, что и при обработке клеток высокой концентрацией феромона, однако в случае амиодарона отсутствовал полуторачасовой лаг-период. На основание этих наблюдений мы предположили, что амиодарон вызывает ту же цепь событий внутри клетки, что и феромон, но на более поздней стадии - повышении концентрации внутриклеточного кальция. Поэтому для проведения ингибиторного анализа и дальнейшего изучения последовательности молекулярных событий программируемой клеточной смерти мы использовали амиодарон. Гибель клеток, вызванная амиодароном, происходила независимо от синтеза белка. Добавление 15 мкг/мл циклогексимида не приводило к увеличению процента выживших клеток, обработанных 80 мкМ амиодароном. Мутации, делающие клетки дрожжей стерильными (неспособными к половому размножению), также не влияли на их восприимчивость к амиодарону. В нашей лаборатории А. Позняковским и Ф. Севериным было показано, что в клетках, обработанных амиодароном наблюдалась фрагментация ядерной ДНК и выход цитохрома с в цитоплазму (Рогшакоуэку й а1. 2005). Для количественной оценки выхода цитохрома с был использован метод, описанный нами ранее (Кпогге й а1. 2002). Однако

оказалось, что обработка клеток амиодароном сильнейшим образом влияла на метод выделения митохондрий на этапе получения протопластов, поэтому от использования этого метода в системе с амиодароном пришлось отказаться.

Рисунок 5. Повышение мембранного потенциала митохондрий и образование АФК клетками дрожжей в ответ на повышение концентрации внутриклеточного кальция Флуоресценция митотрекера оранжевого (а-с1), ДХФ-ДА (е^) и дифференционно-интерференционный контраст (Ь) Контрольные клетки (а.е.11); А23187, 50 мкМ (Ь,0; амиодарон, 80 мкМ, (с^); феромон, 100 мкг/мл ((1) Фотография (Ь) показывает то же поле зрения, что и (е), но в проходящем свете.

3.5. Мы исследовали на восприимчивость к амиодарону различные мутантные линии 5 сегеушяе: штамм (УЗ03 АсусЗ, лишенный цитохром с-гем лиазы, ответственной за образование обоих изоформ цитохрома с из апоцитохромов; р- клетки, лишенные митохондриальной ДНК; штамм 1¥303 /¡у.5р1; а также клетки, обработанные различными ингибиторами дыхательной цепи, разобщителями и антиоксидантами (Рис.6).

о с; о

6050 Н 4030 Н 2010-

с; о о.

ч-

о"

о." о о

со

о." о о и.

<в

з1 с

с; о о. 4)

Рисунок 6 Действие различных ингибиторов и мутаций на восприимчивость клеток дрожжей к 80 мкМ амиодарону. Миксотиазол добавляли до конечной концентрации 7 мкМ; М-ацетилцистеин - 30 мМ; а-токоферол - 20 мкМ. РССР -трифлуорометоксикарбонилцианид фенилгидразон

Оказалось, что клетки, обработанные миксотиазолом, ингибитором дыхательной цепи, а также мутанты, лишенные активной дыхательной цепи (АсусЗ и р-), были в значительной степени менее восприимчивы к амиодарону. Антиоксиданты (жирорастворимый витамин Е и водорастворимый М-ацетилцистеин) также предотвращали гибель, вызванную амиодароном. Из этого мы сделали вывод, что образование АФК и функционирующая дыхательная цепь митохондрий необходимы для реализации каскада событий, вызванного добавлением амиодарона.

3.6. Исследования методами флуоресцентной микроскопии показали, что образование АФК (по флуоресценции ДХФ-ДА, предварительно загруженного в клетки) происходило через 10-15 минут после добавления

амиодарона, в то время как потенциалзависимые митотрекер и тетраметилродамин (зонды на потенциал на митохондриальных мембранах) увеличивали интенсивность флуоресценции практически сразу же после добавления амиодарона. Интересно, что гиперполяризация наблюдалась как в клетках, выращенных на галактозе с раффинозой (то есть с нормально функционирующими митохондриями), так и в экспоненциально растущих на глюкозе клетках, то есть в условиях глюкозной репрессии.

В опытах по измерению дыхания целых клеток амиодарон вызывал резкое увеличение отношения скорости дыхания в присутствии FCCP к скорости дыхания в присутствии олигомицина, что хорошо коррелирует с данными флуоресцентной микроскопии и указывает на то, что амиодарон вызывает повышение трансмембранного потенциала (Рис.7). При этом важно отметить, что амиодарон не оказывал описанного выше эффекта на выделенные митохондрии, а в высоких концентрациях даже ингибировал дыхание. Это указывало на то, что на целых клетках гиперполяризацию митохондрий вызывает некий промежуточный фактор. Возможно, что таким фактором являются ионы кальция. Perez-Vazquez и сооавторы (2003), показали увеличение дыхательного контроля митохондрий дрожжей S cerevisiae за счет закрытия ионами кальция неспецифического митохондриального канала.

Из рисунка 7 видно, что амиодарон в концентрации 5 мкМ не вызывал изменения скорости дыхания. Олигомицин в концентрации от 10 мкг/мл до 100 мкг/мл также не влиял на скорость дыхания целых клеток S cerevisiae, однако при одновременном добавление амиодарона (5 мкМ) и олгиомицина (10 мкг/мл) наблюдалось уменьшение скорости дыхания клеток (Рис.2). Аналогичный эффект наблюдался в случае FCCP. Добавление 1 мкМ FCCP приводило к стимуляции дыхания дрожжевых клеток всего в 1,4 раза, тогда как в присутствии амиодарона FCCP стимулировал дыхание более чем в 2,6 раза.

Рисунок 7. Действие амиодарона на дыхание целых клеток. Скорость дыхания клеток (6*106 клеток/мл) измеряли полярографическим методом Числа у кривых соответствуют скорости дыхания, нмоль Ог/минуту на 107 клеток). Концентрация миксотиазола составляла 3,5 мкг/мл.

Этим эффектам, на наш взгляд, возможно два объяснения. Возможно, что амиодарон каким-то образом влиялет на проницаемость цитоплазматической мембраны для этих веществ, или, действительно, происходила гиперполяризация митохондрий за счет (1) сокращения утечки протонов через внутреннюю мембрану и (2) активации ЫАБН дегидрогеназ. В пользу второго варианта свидетельствуют данные флуоресцентной микроскопии (в первые минуты после добавления амиодарона наблюдалось увеличение флуоресценции только потенциалзависимого митотрекера, но не других флуоресцентных зондов).

Было показано, что низкие концентрации ИССР (0,4 мкМ) вызывали увеличение выживаемости клеток, обработанных амиодароном, тогда как дальнейшее увеличение концентрации уменьшало этот эффект, а высокие концентрации (6 мкМ) даже немного увеличивали восприимчивость клеток к амиодарону. Аналогичный эффект наблюдали с другими разобщителями. Кроме того, низкие концентрации РССР предотвращали образование АФК, тогда как высокие - нет (Рис. В). Полученные данные были подтверждены в нашей лаборатории Ф.Ф. Севериным флуоцитометрическими методами (РогшакоУБкл сЧ а1. 2005).

Рисунок 8 Образование АФК в ответ на добавление амиодарона в присутствии различных ингибиторов Контроль, без амиодарона (а); амиодарон, 80 мкМ (h-g): FCCP, 0,4 мкМ (b), FCCP, 6 мкМ (с); миксотиазол 2 мкМ (f); антимицин 10 мкМ (g).

Таким образом мы показали, что предотвращение гиперполяризации митохондрий предотвращает и образование АФК. Однако полная деполяризация митохондрий, происходившая в ответ на добавление 6 мкМ FCCP, не предотвращала образования АФК. Мы полагаем, что это связано с тем, что митохондрии, являясь основным источником АФК, одновременно являются и важным фактором, поддерживающим уровень антиоксидантов в клетке. Это согласуется с данными Grant и др. (Grant et. al., 1997), показавшими, что р° клетки дрожжей более восприимчивы к окислительному стрессу. Мы предположили, что местом образования АФК в дыхательной цепи митохондрий дрожжей является Q-цикл III дыхательного комплекса. Действительно, добавление миксотиазола подавляло образование АФК в ответ на добавление амиодарона. а антимицин А, предотвращающий перенос электронов между цитохромами b и, таким образом, стабилизирующий убихинон в форме Q", усиливал образование АФК (Рис.7).

3.7. После образования АФК в клетках происходила деполяризация и фрагментация митохондрий. Добавление антиоксидантов (N-ацетилцистеина) предотвращало образование АФК и фрагментацию митохондрий (Рис. 9). На основание этого мы заключили, что фрагментация митохондрий индуцируется АФК. Заметим, что фрагментация митохондрий происходит и в некоторых вариантах апоптоза животных клеток (Skulachev et al. 2004).

Рисунок 9. Фрагментация митохондрий в родительской линии клеток \У303-1В (а-с) и в мутанте Лу5р1 (ё). Объемная реконструкция серии снимков с меняющимся фокусом клеток, окрашенных митотрекером оранжевым. Контрольные клетки (а), клетки, обработанные амиодароном (М), клетки, обработанные амиодароном и 30 мМ М-ацетилцистеином (с).

3.8. Мы решили исследовать, на каком этапе каскада действует идентифицированный нами белок Узр1р. Анализ аминокислотной последовательности этого белка выявил, что он содержит один трансмембранный домен и РН (ркхЫп homology)-дoмeн, который, по-видимому, выполняет регуляторную функцию. Анализ информации, имеющейся в общедоступных базах данных (БвО) указывал на то, что этот белок локализован в митохондриях, хотя и не содержит в себе митохондриальной адресной последовательности. Эти данные подтверждались тем, что в наших условиях УБр1р, соединенный с ОРР (зеленым флуоресцентным белком), колоколизовался с митотрекером оранжевым в клетках. Мы показали, что мутанты, лишенный гена УЯР1, более устойчивы к феромону и амиодарону (Рис 4, 6), однако гиперполяризация митохондрий и образование АФК, вызываемые этими веществами, оказались такой же интенсивности, как и у клеток дикого

штамма. Единственное отличие заключалось в том, что на поздней стадии процесса не происходило деполяризации и фрагментации митохондрий (Рис

9).

амиодарон

феромон рецептор

о ^

81е 20р

1(3,

, (1а)

увеличение (6) концентрации ..-■'" цитоппазматического кальция

транскрипционным фактор

синтез белка

циклогексимид

увеличение скорости дыхания, "" увеличение сопряжения

<7> | 1— РССР

увеличение ДН*

(8)^1— миксотиазол

образование АФК

(9)^)— антиоксиданты фрагментация митохондрий

- дуэр1

деполяризация митохондрий, выход цитохрома с

гибель клеток

Рисунок 10. Предполагаемая схема каскада программируемой гибели ЗассИаготусех сегеушае, вызванной феромоном или амиодароном.

4. Заключение

На основании полученных данных нами была предложена следующая схема событий, вызываемых добавлением высокой концентрации феромона к

клеткам противоположного типа спаривания (Рис. 10). Феромон в высокой

концентрации активирует каскад МАР-киназ, что приводит к экспрессии некоторых генов (Рис. 10, 1-4). Активность продуктов этих генов вызывает увеличение концентрации цитоплазматического кальция, что, в свою очередь, непосредственно или при помощи определенных белков вызывает сокращение утечки протонов сквозь внутреннюю мембрану митохондрий и

активации NADH дегидрогеназ (Рис. 10.5-6). Это, в свою очередь приводит к увеличению трансмембранного потенциала на внутренней мембране митохондрий, что служит причиной увеличения скорости образования АФК комплексом III дыхательной цепи. АФК вызывают деполяризацию и фрагментацию (или набухание) митохондрий, выход цитохрома с из межмембранного пространства митохондрий (Рис. 10, 7-10). Инактивация гена YSP1 подавляет фрагментацию митохондрий и снижает процент гибели клеток.

5. Основные выводы

1. Предложена схема событий, происходящих в клетках дрожжей S cerevisiae при клеточной смерти, вызванной феромоном. При повышении концентрации цитоплазматического кальция амиодароном или А23187 наблюдается гиперполяризация митохондрий и образование активных форм кислорода. Показано, что повышение АЧ* митохондрий является причиной образования АФК.

2. Показано, что добавление антиоксидантов предотвращает фрагментацию митохондрий и гибель клеток, вызванные амиодароном.

3.АФК являются не эпифеноменом клеточной смерти, вызванной феромоном или амиодароном, а необходимым компонентом каскада самоубийства.

4. Идентифицированы гены, предположительно участвующие в реализации или регуляции программируемой клеточной смерти у дрожжей Показано, что функция гена YSP1 необходима для протекания программы самоубийства клеток, вызванной амиодароном или избытком феромона.

5. Идентифицирована функция гена YSP1, который оказался необходим для фрагментации митохондрий, вызываемой АФК при программируемой гибели клеток. Показана митохондриальная локализация продукта этого гена.

6. Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Knorre. D.A.. Dedukhova, V.I., Vyssokikh, М Yu , and Mokhova, E.N. (2003) Cyclosporin A-sensitive cytochrome с release and activation of external pathway of NADH oxidation in liver mitochondria due to pore opening by acidification of phosphate-containing incubation medium. Bioscience Reports 23 (2-3): 67-75.

2. Knorre. D.A.. Smimova, E.A, and Severin, F.F. (2005) Естественные условия для запрограммированной гибели дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Биохимия 70 (2): 323-326.

3. Pozniakovsky, A I., Knorre. DA. Markova, O.V., Hyman, A.A., Skulachev, V.P. and Severin, F F. (2005) Role of mitochondria in the pheromone- and amiodarone-induced programmed death of yeast. J. Cell. Biol. 168 (2). 257-269 4 Кнорре, Д A, Дедухова, В И , Мохова, Е.Н (2002) Уменьшение рН среды инкубации вызывает активацию внешнего пути окисления экзогенного NADH, открытие Са2+-зависимой циклоспорин А чувствительной поры и выход цитохрома С из митохондрий печени крысы III съезд биохимического общества (2002), Санкт-Петербург, Россия, с 248-249.

5. Knorre, DA, Pozniakowski, A, Hyman, A A., Severin, FF (2003); Genetic screen for activators of pheromone induced apoptosis-like death in yeast Europ. J Biochem., Supplement 1, P4.8-31

6 Кнорре, Д.А., Смирнова, EA, Северин, ФФ. (2004) Роль митохондрий в запрограммированной гибели Saccharomyces cerevisiae, вызванной половым феромоном. Ломоносовские чтения, с. 63

7. Knorre, D.A., Markova, E.A, Smimova, EA, Rikhvanov, E.G., Severin, F F. (2005) Fate of mitochondria in yeast programmed death Международная конференция «Российская биоэнергетика от молекул к клетке», Москва, МГУ, с. 28.

»-Sf 5

РНБ Русский фонд

2006^4 ~5448~

Подписано в печать 12 мая 2005 г Заказ 461. Формат 60 х 90/16 Тираж 100 экз Отпечатано в салоне оперативной печати ПКФ Москва, Садовая-Черногрязская, ЗБ Тел 778-97-47

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кнорре, Дмитрий Алексеевич

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Феномен программируемой клеточной смерти.

Характерные признаки апоптоза.

Функции апоптоза у многоклеточных.

Компоненты каскада самоубийства.

Роль митохондрий в апоптозе многоклеточных.

Терминология типов клеточной смерти.

Апоптотические домены и механизмы апоптоза в разных систематических группах.

Глава 2. Запрограммированная гибель одноклеточных организмов.

Инфузории.

Паразитиеские кинетопластиды.

Слизевики.

Одноклеточные автотрофы.

Архемонады.

Дрожжи.

Глава 3. Молекулярные механизмы программируемой клеточной смерти дрожжей.

Дрожжевая метакаспаза.

Протеаза От\.

Роль митохондрий в программируемой клеточной смерти дрожжей.

Неспецифическая митохондриальная пора дрожжей.

Глава 4. Феромонный каскад дрожжей.

Биология дрожжей.

Клеточный ответ на половой феромон.л.

Гибель клеток Э. сегеу'мае, вызванная а-фактором.

Глава 5. Кальций в дрожжах.

Методы измерения внутриклеточного кальция в S. cerevisiae.

Поддержание кальциевого гомеостаза в S. cerevisiae.

Амиодарон.

Глава 6. Особенности митохондрий пекарских дрожжей.

Глава 7. Активные формы кислорода.

Особенности образования и детоксикации АФКу дрожжей S.cerevisiae.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 1. Культивирование дрожжей.

Гэнотипы использованных штаммов дрожжей.

Приготовление среды для культивации.

Условия культивации.

Глава 2. Тесты на выживание дрожжей.

Индукция ПКС.

Оценка выживаемости по количеству КОЕ.

Микроскопические методы.

Глава 3. Синхронизация культуры дрожжей.

Глава 4. Методы флуоресцентной микроскопии.

Окрашивание клеток на АФК.

Окрашивание клеток на митохондрии.

Окрашивание клеток на Са2+.

Окрашивание клеток на ДНК+.

Определение репликативного возраста клеток.

Глава 5. Выделение митохондрий из Saccharomyces cerevisiae и измерение скорости поглощения кислорода.

Глава 6. Молекулярно биологические методы.

Выделение плазмидной ДНК из E.coli на колонках Qiagen miniprep kit.

Выделение геномной ДНК дрожжей.

Расщепление и лигирование ДНК дрожжей.

Аналитический электрофорез ДНК в агарозных гелях.

Трансформация клеток Е.соН методом электропорации.

Интегративная трансформация дрожжей.

Получение мутантных линий с полностью инактивированным геном.

Глава 7. Список использованных реактивов.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Глава 1. Исследование модели программируемой клеточной смерти дрожжей штамма W303-1B, вызванной избытком феромона.

Глава 2. Исследование ПКС, индуцированный высокой концентрацией феромона на линии клеток W303-1B cmd1-6.

Глава 3. Влияние ингибиторов и антиоксидантов на ПКС клеток W303

1В cmd1-6.

Глава 4. Скрининг генов, участвующих в регуляции программы самоубийства Saccharomyces cerevisiae, вызванного избытком фермона.

Описание скрининга.

Результаты скрининга.

Анализ мутантов на предмет устойчивости к ПКС, вызванной избытком феромона.

Глава 5 Индукция программируемой клеточной смерти на промежуточных этапах.

Индукция ПКС пекарских дрожжей перекисью водорода и менадионом.

Искусственное повышение концентрации цитоплазматического кальция.

А23187.

Амиодарон.

Глава 6. Характерные признаки апоптоза, наблюдаемые в клетках обработанных амиодароном.

Глава 7. Гиперполяризация митохондрий, вызванная амиодароном.

Изменения дыхания дрожжевых клеток, вызванные амиодароном.'¡'¡Б

Глава 8. Образование АФК клетками, вызванное амиодароном.

Глава 9. Фрагментация митохондрий.

Глава 10. Исследование функции гена УЭР1.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Программируемая клеточная смерть Saccharomyces cerevisiae, вызванная феромоном"

Исследование механизмов программируемой клеточной смерти имеет большое теоретическое и практическое значение. Контролируемая элиминация клеток играет важную роль в онтогенезе, функционировании иммунитета и поддержании тканевого гомеостаза. До недавних пор считалось, что программируемая клеточная смерть (апоптоз) присуща только многоклеточным животным или растениям (Vaux et al., 1996, Huettenbrenner et al., 2003). Такое мнение было основано на том факте, что анализ геномов одноклеточных организмов не выявлял гены, гомологичные генам, кодирующих апоптотические белки многоклеточных животных.Однако увеличение количества полностью отсеквенированных геномов, а также обнаружение новых семейств апоптотических белков, позволило обнаружить их гомологи в одноклеточных эукариотах и даже в бактериях (Aravind et al., 1999, Koonin & Aravind, 2002). Одновременно было обнаружено, что программируемую клеточную смерть, сходную с апоптозом высших эукариот по цитологическим признакам, можно вызвать различными искусственными и природными индукторами у целого ряда одноклеточных организмов: дрожжевых грибов, кинетопластид, инфузорий, одноклеточных водорослей (см Гордеева и др., 2004).До последнего времени основным объектом исследования при изучении апоптоза были клеточные линии высших эукариот, тогда как использование дрожжей Saccharomyces cerevisiae в качестве модельного организма значительно удобнее в экспериментальном плане. Пекарские дрожжи, в отличии от клеточных линий многоклеточных, значительно более удобны для всевозможных генетических манипуляций, в том числе и для проведения широкомасштабного генетического скрининга. В 1998 году был проведен скрининг дрожжевых клеток, экспрессирующих библиотеку кДНК человека на предмет устойчивости к действию проапоптоического белка Вах, который также был экспрессирован в этих клетках. В результате этого скрининга был идентифицирован новый антиапоптотический белок, ингибитор Вах — ВИ (Xu et al., 1998). Однако подобный генетический скрининг так и не был осуществлен с естественными индукторами программируемой клеточной смерти пекарских дрожжей. Это упущение было связано с тем, что большинство известных к тому времени индукторов программируемой смерти вызывали программируемую гибель лишь в части клеток, тогда как остальные клетки гибли либо неспецифическим способом (их смерть не подавлялась ингибиторами синтеза белка), либо оставались живы (в случае гибели клеток, вызванной старением или мутаций в шапероне гистонов). Однако совсем недавно был обнаружен еще один естественный индуктор программируемой клеточной смерти пекарских дрожжей. Оказалось, что половой феромон (а-фактор) в высоких концентрациях вызывает программируемую гибель небольшой фракции клеток дрожжей дикого типа (Severin & Hyman, 2002). Но если использовать штаммы, сверхчувствительные к половому феромону, то можно создать условия, где практически все клетки, обработанные феромоном, будут нежизнеспособны. Затем, если такие гиперчувствительную штаммы трансформировать транспозоннои библиотекой для инактивации случайных фрагментов генов (или целых генов) и обработать их высокой концентрацией феромона, можно идентифицировать мутантные линии с нарушенной программой самоубийства. Идентифицировав положение вставки, можно узнать, какие гены дрожжей являются необходимыми для реализации этой программы. Проведение такого скрининга и идентификация роли найденных генов в программе самоубийства дрожжей были поставлены в качестве задач настоящей работы.Для линий клеток многоклеточных животных, в ряде случаев, достаточно подробно изучен механизм реализации программы самоубийства, тогда как в случае пекарских дрожжей до сих пор были получены только предварительные сведения, не раскрывающие механизмов этой программы. Поэтому, перед нами была поставлена задача выяснить последовательность и взаимосвязь процессов, происходящих в клетке при активации программы самоубийства половым феромоном.Поскольку цитологические и молекулярные признаки программируемой гибели одноклеточных организмов во многом схожи с таковыми для клеток многоклеточных животных, то есть основание полагать, что исследование механизма программируемой гибели дрожжей позволит выявить некоторые общие закономерности апоптоза.Особый интерес в этой связи представляет собой исследование роли митохондрий в программе самоубийства дрожжевой клетки. Для клеток млекопитающих было показано, что митохондрии играют важную роль в регуляции программы самоубийства. Предполагается, что явление апоптоза могло возникнуть одновременно с возникновением митохондрий (цит. по Koonin & Aravind 2002), что объясняет важную сигнальную роль этой органеллы в апоптозе. Кроме того энергетика клетки находится в сильной зависимости от функционального состояния митохондрий. При апоптозе клеток многоклеточных животных митохондрии являются основным источником активных форм кислорода. In vitro было показано, что митохондрии дрожжей также могут образовывать АФК (Chance 1979).Однако до сих пор оставалось неизвестным, являются ли митохондрии источником АФК in vivo. Исследование этого вопроса позволило бы в определенной степени управлять процессом программируемой смерти в одноклеточных организмах. Поэтому, перед нами была также поставлена задача выяснить судьбу и роль митохондрий в программируемой клеточной смерти дрожжей.Понимание механизмов контролируемой клеточной смерти дрожжей имеет значение не только в связи с тем, что позволяет проводить аналогии с апоптозом высших эукариот. Очевидно, что механизмы самоубийства клеток грибов и млекопитающих имеют более или менее существенные отличия, что позволяет надеяться на создание новых специфических антигрибковых препаратов (Philips et al., 2003). ш

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кнорре, Дмитрий Алексеевич

выводы

1. Предложена схема событий, происходящих в клетках дрожжей Э. cerevisiae при клеточной смерти, вызванной феромоном. При повышении концентрации цитоплазматического кальция амиодароном или А23187 наблюдается гиперполяризация митохондрий и образование активных форм кислорода. Показано, что повышение ДФ митохондрий является причиной образования АФК.

3. АФК являются не эпифеноменом клеточной смерти, вызванной феромоном или амиодароном, а необходимым компонентом каскада самоубийства.

4. Идентифицированы гены, предположительно участвующие в реализации или регуляции программируемой клеточной смерти у дрожжей. Показано, что функция гена УБР1 необходима для протекания программы самоубийства клеток, вызванной амиодароном или избытком феромона.

5. Идентифицирована функция гена УЗР1, который оказался необходим для фрагментации митохондрий, вызываемой АФК при программируемой гибели клеток. Показана митохондриальная локализация продукта этого гена.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Knorre. D.A. Dedukhova, V.I.,. Vyssokikh, M.Yu, Mokhova, E.N. (2003) Bioscience Reports 23(2-3): 67-75 Cyclosporin A-sensitive cytochrome с release and activation of external pathway of NADH oxidation in liver mitochondria due to pore opening by acidification of phosphate-containing incubation medium

2. Кнорре. Д.А. Смирнова E.A. и Северин Ф.Ф. (2005) Биохимия 70 (2): 323326 Естественные условия для запрограммированной гибели дрожжей Saccharomyces cerevisiae

3. Pozniakovsky, A.I., Knorre, D.A, Markova, O.V., Hyman, A.A., Skulachev, V.P. and Fedor F. Severln (2005) J. Cell, Biol. 168 (2):257-269 Role of mitochondria in the pheromone-and amiodarone-induced programmed death of yeast.

4. Кнорре Д.А., Дедухова В.И., Мохова Е.Н (2002) III съезд биохимического общества (2002), Санкт-Петербург, Россия, стр. 248-249. Уменьшение рН среды инкубации вызывает активацию внешнего пути окисления экзогенного NADH, открытие Са2+-зависимой циклоспорин А чувствительной поры и выход цитохрома С из митохондрий печени крысы.

5. Knorre D.A., Pozniakowski A., Hyman А.А., Severin F.F. European Journal of Biochemistry (2003); Supplement 1 P4.8-31 Genetic screen for activators of pheromone induced apoptosis-like death in yeast

6. Кнорре Д.А., Смирнова E.A., Северин Ф.Ф. (2004) Ломоносовские чтения

Роль митохондрий в запрограммированной гибели Saccharomyces cerevisiae, вызванной половым феромоном.

7. Knorre, D.A., Markova, Е.А., Smirnova, Е.А., Rikhvanov, E.G., Severin F. F. (2005) Международная конференция «Российская биоэнергетика: от молекул к клетке», Москва, МГУ, стр. 28 Fate of mitochondria in yeast programmed death

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кнорре, Дмитрий Алексеевич, Москва

1. Бабьева И.П., Чернов И.Ю. (1992) М: Изд-во Моск. ун-та; Биология дрожжей.

2. Горленко М.В. и др. (1976) изд. «Просвящение», Москва, т 2:91107; Жизнь растений

3. Гривенникова В.Г., Виноградов А.Д. (2003) Успехи биологической химии 43:19-58; Митохондриальный комплекс I

4. Котельникова А.В. Звягильская Р.А. (1973) изд. «Наука», Москва; Биохимия дрожжевых митохондрий

5. Льюис К. (2005) Биохимия 70(2):327-335; Персистирующие клетки и загадка выживания биопленок

6. Колесова Г.М., Карнаухова Л.С., Ягужинский Л.С. (1991) Биохимия 56(10) :1779-1786; Взаимодействие менадиона и дурохинина с Q-циклом в условиях работы ДТ-диафоразы

7. Кулинский В.И. (1999) Соросовский образовательный журнал (1):2-7\ Активные формы кислорода и оксидативная модификация макромолекул: польза, вред и защита

8. Самуилов В.Д., Олескин А.В., Лагунова Е.М. (2000) Биохимия 65(8): 1029-1046; Программируемая клеточная смерть

9. Щербаков В.П. (2005) Журнал Общей Биологии (в печати). Эволюция как устойчивость к энтропии

10. Adams J.M. (2003) Genes Dev. 17(20):2481-95; Ways of dying: multiple pathways to apoptosis.

11. Alberts, Bray, Raff, Roberts and Watson (1990) 3rd Edition, Garland Publishing; Molecular Biology of the Cell

12. Aravind L„ Dixit V.M., Koonin E.V. (2001) Science. 291 (5507): 127984. ; Apoptotic molecular machinery: vastly increased complexity in vertebrates revealed by genome comparisons.

13. Balzan R., Sapienza K., Galea D.R., Vassallo N., Frey H., Bannister W.H. (2004) Microbiology. 150(Pt 1):109-15 ; Aspirin commits yeast cells to apoptosis depending on carbon source.

14. Barros M.H., Netto L.E., Kowaltowski A.J. (2003) Free Radio Biol Med. 35(2): 179-88 ; H(2)0(2) generation in Saccharomyces cerevisiae respiratory pet mutants: effect of cytochrome c.

15. Bettiga M„ Calzari L„ Orlandi I., Alberghina L., Vai M. (2004) FEMS Yeast Res. 5(2):141-7; Involvement of the yeast metacaspase Yca1 in ubplODelta-programmed cell death.

16. Bodrova M.E., Dedukhova V.I., Mokhova E.N., Skulachev V.P. (1998) FEBS Lett. 435(2-3):269-74 ; Membrane potential generation coupled to oxidation of external NADH in liver mitochondria.

17. Boustany L.M., Cyert M.S. (2002) Genes Dev. 16(5):608-19 ; Calcineurin-dependent regulation of Crzlp nuclear export requires Msn5p and a conserved calcineurin docking site.

18. Bradshaw P.C., Jung D.W., Pfeiffer D.R. (2001) J Biol Chem. 276(44):40502-9 ; Free fatty acids activate a vigorous Ca(2+):2H(+) antiport activity in yeast mitochondria.

19. Brand M.D., Affourtit C., Esteves T.C., Green K., Lambert A.J., Miwa S„ Pakay J.L., Parker N. (2004) Free Radic Biol Med. 37(6):755-67 ; Mitochondrial superoxide: production, biological effects, and activation of uncoupling proteins.

20. Burhans W.C., Weinberger M., Marchetti M.A., Ramachandran L., D.'Urso G., Huberman J.A. (2003) Mutat Res. 532(1-2):227-43; Apoptosis-like yeast cell death in response to DNA damage and replication defects.

21. Burke P.V., Raitt D.C., Allen L.A., Kellogg E.A., Poyton R.O. (1997) J Biol Chem. 272(23):14705-12; Effects of oxygen concentration on the expression of cytochrome c and cytochrome c oxidase genes in yeast.

22. Butler G., Kenny C., Fagan A., Kurischko C., Gaillardin C., Wolfe K.H. (2004) Proc Natl Acad Sci USA. 101(6):1632-7; Evolution of the MAT locus and its Ho endonuclease in yeast species.

23. Camougrand N., Grelaud-Coq A., Marza E., Priault M., Bessoule J.J., Manon S. (2003) Mol Microbiol. 47(2):495-506; The product of the UTH1 gene, required for Bax-induced cell death in yeast, is involved in the response to rapamycin.

24. Carafoli E., Balcavage W.X., Lehninger A.L., Mattoon J.R. (1970) Biochim Biophys Acta. 205(1): 18-26; Ca2+ metabolism in yeast cells and mitochondria.

25. Carlson K., Ehrich M. (1999) Toxicol Appl Pharmacol. 160(1):33-42 ; Organophosphorus compound-induced modification of SH-SY5Y human neuroblastoma mitochondrial transmembrane potential.

26. Del Carratore R., Delia Croce C., Simili M., Taccini E., Scavuzzo M., Sbrana S. (2002) Mutat Res 513(1-2): 183-; Cell cycle and morphological alterations as indicative of apoptosis promoted by UV irradiation in S. cerevisiae.

27. Chance В., Sies H., Boveris A. (1979) Physiol Rev. 59(3):527-605 ; Hydroperoxide metabolism in mammalian organs.

28. Chauhan D., Pandey P., Ogata A., Teoh G., Krett N„ Halgren R., Rosen S., Kufe D., Kharbanda S., Anderson K. (1997) J Biol Chem. 272(48):29995-7 ; Cytochrome c-dependent and -independent induction of apoptosis in multiple myeloma cells.

29. Cheung W.L., Ajiro K., Samejima K., Kloc M., Cheung P., Mizzen C.A., Beeser A., Etkin L.D., Chernoff J., Earnshaw W.C., Allis C.D. (2003) Cell. 113(4):507-17 ; Apoptotic phosphorylation of histone H2B is mediated by mammalian sterile twenty kinase.

30. Chose O., Noel C., Gerbod D., Brenner C., Viscogliosi E., Roseto A. (2002) Exp Cell Res 276(1 ):32-9 ; A form of cell death with some features resembling apoptosis in the amitochondrial unicellular organism Trichomonas vaginalis.

31. Chose O., Sarde C.O., Noel C., Gerbod D., Jimenez J.C., Brenner C., Capron M., Viscogliosi E., Roseto A. (2003) Ann N Y Acad Sci. 1010:121-5 ; Cell death in protists without mitochondria.

32. Christensen S.T., Sorensen H., Beyer N.H., Kristiansen K., Rasmussen L., Rasmussen M.I. (2001) Cell Biol Int. 25(6):509-19; Cell death in Tetrahymena thermophila: new observations on culture conditions.

33. Cohen J.J., a.l.-Rubeai M (1995) Trends Biotechnol. 13(8):281-3 ; Apoptosis-targeted therapies: the 'next big thing' in biotechnology?

34. Cornillon S., Foa C., Davoust J., Buonavista N., Gross J.D., Golstein P. (1994) J Cell Sci. 107 ( Pt 10):2691-704 ; Programmed cell death in Dictyostelium.

35. Courchesne W.E. (2002) J Pharmacol Exp Ther. 300(1 ):195-9 ; Characterization of a novel, broad-based fungicidal activity for the antiarrhythmic drug amiodarone.

36. Courchesne W.E., Ozturk S. (2003) Mol Microbiol. 47(1):223-34 ; Amiodarone induces a caffeine-inhibited, MID1-depedent rise in free cytoplasmic calcium in Saccharomyces cerevisiae.

37. Cunningham K.W., Fink G.R. (1994) J Exp Biol. 196:157-66; Ca2+ transport in Saccharomyces cerevisiae.

38. Das M., Mukherjee S.B., Shaha C. (2001) J Cell Sci. 114(Pt 13):2461-9 ; Hydrogen peroxide induces apoptosis-like death in Leishmania donovani promastigotes.

39. Daugas E., Susin S.A., Zamzami N., Ferri K.F., Irinopoulou T., Larochette N., Prevost M.C., Leber B., Andrews D., Penninger J., Kroemer G. (2000) FASEB J. 14(5):729-39 ; Mitochondrio-nuclear translocation of AIF in apoptosis and necrosis.

40. Davermann D., Martinez M., McKoy J., Patel N., Averbeck D., Moore C.W. (2002) Free Radic Biol Med. 33(9):1209-20 ; Impaired mitochondrial function protects against free radical-mediated cell death.

41. Davidson J.F., Whyte B., Bissinger P.H., Schiestl R.H. (1996) Proc Natl Acad Sci USA. 93(10):5116-21 ; Oxidative stress is involved in heat-induced cell death in Saccharomyces cerevisiae.

42. Davis M.C., Ward J.G., Herrick G., Allis C.D. (1992) Dev Biol. 154(2):419-32; Programmed nuclear death: apoptotic-like degradation of specific nuclei in conjugating Tetrahymena.

43. Debrabant A., Lee N., Bertholet S., Duncan R., Nakhasi H.L.Int J Parasitol 2003Mar;33(3):257-67 ; Programmed cell death in trypanosomatids and other unicellular organisms.

44. Debrabant A., Nakhasi H. (2003) Kinetoplastid Biol Dis. 2(1):7; Programmed cell death in trypanosomatids: is it an altruistic mechanism for survival of the fittest?

45. Denis V., Cyert M.S. (2002) J Cell Biol. 156(1):29-34 ; Internal Ca(2+) release in yeast is triggered by hypertonic shock and mediated by a TRP channel homologue.

46. Deryabina Y.I., Isakova E.P., Shurubor E.I., Zvyagilskaya R.A. (2004) Biochemistry (Mosc). 69(9): 1025-33; Calcium-dependent nonspecific permeability of the inner mitochondrial membrane is not induced in mitochondria of the yeast Endomyces magnusii.

47. Desagher S„ Martinou J.C. (2000) Trends Cell Biol. 10(9):369-77; Mitochondria as the central control point of apoptosis.

48. Doi S., Tanabe K., Watanabe M., Yoshimura M. (1989) Arch Microbiol. 151(1):20-5; Chloroquine, a lysosomotropic agent, inhibits zygote formation in yeast.

49. Dzimiri N. Almotrefi A.A. (1993) Eur J Pharmacol. 242(2): 113-8; Actions of amiodarone on mitochondrial ATPase and lactate dehydrogenase activities in guinea pig heart preparations.

50. Earnshaw W.C., Martins L.M., Kaufmann S.H. (1999) Annu Rev Biochem. 68:383-424; Mammalian caspases: structure, activation, substrates, and functions during apoptosis.

51. Edinger A.L., Thompson C.B. (2004) Curr Opin Cell Biol. 16(6):663-9 ; Death by design: apoptosis, necrosis and autophagy.

52. Ejercito M., Wolfe J.J Eukaryot Microbiol. 2003 Nov-Dec;50(6):427-9; Caspase-like activity is required for programmed nuclear elimination during conjugation in Tetrahymena.

53. Elion E.A. (2000) Curr Opin Microbiol. 3(6):573-81; Pheromone response, mating and cell biology.

54. Erdman S„ Snyder M. (2001) Genetics. 159(3):919-28 ; A filamentous growth response mediated by the yeast mating pathway.

55. Fadok V.A., Voelker D.R., Campbell P.A., Cohen J. J., Bratton D.L., Henson P.M. (1992) J Immunol. 148(7):2207-16; Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages.

56. Fahrenkrog B., Sauder U., Aebi U. (2004) J Cell Sci. 117(Pt 1):115-26 ; The S. cerevisiae HtrA-like protein Nma111p is a nuclear serine protease that mediates yeast apoptosis.

57. Fang J., Beattie D.S. (2003) Free Radic Biol Med. 34(4):478-88 ; External alternative NADH dehydrogenase of Saccharomyces cerevisiae: a potential source of superoxide.

58. Fannjiang Y., Cheng W.C., Lee S.J., Q.i. B., Pevsner J., McCaffery J.M., Hill R.B., Basanez G„ Hardwick J.M. (2004) Genes Dev. 18(22):2785-2797 ; Mitochondrial fission proteins regulate programmed cell death in yeast.

59. Foury F., Roganti T„ Lecrenier N., Purnelle B. (1998) FEBS Lett. 440(3):325-31 ; The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae.

60. Franklin D.J., Berges J.A. (2004) Proc R Soc Lond B Biol Sci.271 (1553):2099-107; Mortality in cultures of the dinoflagellate Amphidinium carterae during culture senescence and darkness.

61. Gasch A.P., Spellman P.T., Kao C.M., Carmel-Harel O., Eisen M.B., Storz G„ Botstein D., Brown P.O. (2000) Mol Biol Cell. 11(12):4241-57 ; Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes.

62. Gimeno C.J., Ljungdahl P.O., Styles C.A., Fink G.R. (1992) Cell. 68(6): 1077-90; Unipolar cell divisions in the yeast S. cerevisiae lead to filamentous growth: regulation by starvation and RAS.

63. De Giorgi F., Lartigue L., Bauer M.K., Schubert A., Grimm S., Hanson

64. G.T., Remington S.J., Youle R.J., Ichas F. (2002) FASEB J. 16(6):607-9 ; The permeability transition pore signals apoptosis by directing Bax translocation and multimerization.

65. Godon C., Lagniel G., Lee J., Buhler J.M., Kieffer S., Perrot M., Boucherie H„ Toledano M.B., Labarre J. (1998) J Biol Chem. 273(35):22480-9 ; The H202 stimulon in Saccharomyces cerevisiae.

66. Goffeau A., Barrell B.G., Bussey H., Davis R.W., Dujon B., Feldmann

67. H., Galibert F., Hoheisel J.D., Jacq C., Johnston M., Louis E.J., Mewes H.W., Murakami Y„ Philippsen P., Tettelin H., Oliver S.G. (1996) Science. 274(5287):546, 563-7; Life with 6000 genes.

68. Gordeeva A.V., Labas Y.A., Zvyagilskaya R.A. (2004) Biochemistry (Mosc). 69(10):1055-66; Apoptosis in unicellular organisms: mechanisms and evolution.

69. Grant C.M., Maclver F.H., Dawes I.W. (1997) FEBS Lett. 410(2-3):219-22 ; Mitochondrial function is required for resistance to oxidative stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae.

70. Grynkiewicz G., Poenie M., Tsien RY (1985) J Biol Chem. 260(6):3440-50 ; A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.

71. Gross A., Pilcher K., Blachly-Dyson E., Basso E., Jockel J., Bassik M.C., Korsmeyer S.J., Forte M. (2000) Mol Cell Biol. 20(9):3125-36. ; Biochemical and genetic analysis of the mitochondrial response of yeast to BAX and BCL-X(L).

72. Guo J., Lemire B.D. (2003) J Biol Chem. 278(48):47629-35 ; The ubiquinone-binding site of the Saccharomyces cerevisiae succinate-ubiquinone oxidoreductase is a source of superoxide.

73. Gupta S.S., Ton V.K., Beaudry V., Rulli S., Cunningham K., Rao R. (2003) J Biol Chem. 278(31):28831-9 ; Antifungal activity of amiodarone is mediated by disruption of calcium homeostasis.

74. Gustin M.C., Albertyn J., Alexander M., Davenport K. (1998) Microbiol Mol Biol Rev. 62(4): 1264-300 ; MAP kinase pathways in the yeast Saccharomyces cerevisiae.

75. H.a. H.C., Snyder S.H. (1999) Proc Natl Acad Sci U S A.96(24): 13978-82 ; Poly(ADP-ribose) polymerase is a mediator of necrotic cell death by ATP depletion.

76. Haber J.E. (1998) Annu Rev Genet 32:561-99 ; Mating-type gene switching in Saccharomyces cerevisiae.

77. Herker E., Jungwirth H., Lehmann K.A., Maldener C., Frohlich K.U., Wissing S., Buttner S., Fehr M„ Sigrist S., Madeo F. (2004) J Cell Biol. 164(4):501-7 ; Chronological aging leads to apoptosis in yeast.

78. Jakubowski W., Bartosz G. (2000) Cell Biol Int. 24(10):757-60; 2,7-dichlorofluorescin oxidation and reactive oxygen species: what does it measure?

79. Jaso-Friedmann L, Leary J.H. 3rd, Evans D.L. (2000) Exp Parasitol. 96(2):75-88 ; Role of nonspecific cytotoxic cells in the induction of programmed cell death of pathogenic protozoans: participation of the Fas ligand-Fas receptor system.

80. Jeon B.W., Kim K.T., Chang S.I., Kim HY (2002) J Biochem (Tokyo) 131(5):693-9 ; Phosphoinositide 3-OH kinase/protein kinase B inhibits apoptotic cell death induced by reactive oxygen species in Saccharomyces cerevisiae.

81. Jiang Y.W., Stillman D.J. (1992) Mol Cell Biol. 12(10):4503-14; Involvement of the SIN4 global transcriptional regulator in the chromatin structure of Saccharomyces cerevisiae.

82. Jung D.W., Bradshaw P.C., Pfeiffer D.R. (1997) J Biol Chem. 272(34):21104-12; Properties of a cyclosporin-insensitive permeability transition pore in yeast mitochondria.

83. Kampranis S.C., Damianova R., Atallah M., Toby G., Kondi G., Tsichlis P.N., Makris A.M. (2000) J Biol Chem. 275(38):29207-16 ; A novel plant glutathione S-transferase/peroxidase suppresses Bax lethality in yeast.

84. Kashiwagi A., Hanada H., Yabuki M., Kanno T., Ishisaka R., Sasaki J., Inoue M., Utsumi K. (1999) Free Radie Biol Med. 26(7-8):1001-9; Thyroxine enhancement and the role of reactive oxygen species in tadpole tail apoptosis.

85. Katzmann D.J., Stefan C.J., Babst M., Emr SD (2003) J Cell Biol. 162(3):413-23; Vps27 recruits ESCRT machinery to endosomes during MVB sorting.

86. Kawli T., Venkatesh B.R., Kennady P.K., Pande G., Nanjundiah V. (2002) Differentiation. 70(6):272-81 ; Correlates of developmental cell death in Dictyostelium discoideum.

87. Kerr J.F., Wyllie A.H., Currie A.R. (1972) Br J Cancer. 26(4):239-57; Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics.

88. Kirsch D.G., Doseff A., Chau B.N., Lim D.S., d.e. Souza-Pinto N.C., Hansford R., Kastan M.B., Lazebnik Y.A., Hardwick J.M. (1999) J Biol Chem. 274(30):21155-61 ; Caspase-3-dependent cleavage of Bcl-2 promotes release of cytochrome c.

89. Kluck R.M., Bossy-Wetzel E„ Green D.R., Newmeyer D.D. (1997) Science. 275(5303): 1132-6 ; The release of cytochrome c from mitochondria: a primary site for Bcl-2 regulation of apoptosis.

90. Kluck R.M., Bossy-Wetzel E., Green D.R., Newmeyer D.D. (1997) Science. 275(5303): 1132-6 ; The release of cytochrome c from mitochondria: a primary site for Bcl-2 regulation of apoptosis.

91. Kobayashi T., Endoh H. (2003) Cell Death Differ. 10(6):634-40 ; Caspase-like activity in programmed nuclear death during conjugation of Tetrahymena thermophila.

92. Koonin E.V., Aravind L. (2000) Trends Biochem Sci. 25(5):223-4 ; The NACHT family a new group of predicted NTPases implicated in apoptosis and MHC transcription activation.

93. Koonin E.V., Aravind L. (2002) Cell Death Differ. 9(4):394-404 ; Origin and evolution of eukaryotic apoptosis: the bacterial connection.

94. Korshunov S.S., Skulachev V.P., Starkov A.A. (1997) FEBS Lett.416(1): 15-8 ; High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria.

95. Kroemer G., Zamzami N., Susin S.A. (1997) Immunol Today. 18(1):44-51; Mitochondrial control of apoptosis.

96. Laun P., Pichova A., Madeo F., Fuchs J., Ellinger A., Kohlwein S., Dawes l„ Frohlich K.U., Breitenbach M. (2001) Mol Microbiol. 39(5): 1166-73. ; Aged mother cells of Saccharomyces cerevisiae show markers of oxidative stress and apoptosis.

97. Larroy C., Pares X., Biosca J.A. (2002) Eur J Biochem. 269(22):5738-45; Characterization of a Saccharomyces cerevisiae NADP(H)-dependent alcohol dehydrogenase (ADHVII), a member of the cinnamyl alcohol dehydrogenase family.

98. Lehninger A.L. (1951) J Biol Chem. 190(1):345-59; Phosphorylation coupled to oxidation of dihydrodiphosphopyridine nucleotide.

99. Lemeshko V.V. (2000) FEBS Lett. 472(1 ):5-8 ; Mg(2+) induces intermembrane electron transport by cytochrome c desorption in mitochondria with the ruptured outer membrane.

100. Lesage P., Yang X., Carlson M. (1994) Nucleic Acids Res. 22(4):597-603; Analysis of the SIP3 protein identified in a two-hybrid screen for interaction with the SNF1 protein kinase.

101. Lewis K. (2000) Microbiol Mol Biol Rev. 64(3):503-14 ; Programmed death in bacteria.

102. L.I. P.F., Dietz R., von Harsdorf R. (1999) EMBOJ. 18(21):6027-36 ; p53 regulates mitochondrial membrane potential through reactive oxygen species and induces cytochrome c-independent apoptosis blocked by Bcl-2.

103. Ligr M., Madeo F., Fröhlich E., Hilt W, Fröhlich K.U., Wolf DH (1998) FEBS Lett. 438(1-2):61-5; Mammalian Bax triggers apoptotic changes in yeast.

104. Locke E.G., Bonilla M., Liang L., Takita Y., Cunningham K.W. (2000) Mol Cell Biol. 20(18):6686-94 ; A homolog of voltage-gated Ca(2+) channels stimulated by depletion of secretory Ca(2+) in yeast.

105. Longo V.D., Gralla E.B., Valentine J.S. (1996) J Biol Chem. 271(21):12275-80 ; Superoxide dismutase activity is essential for stationary phase survival in Saccharomyces cerevisiae. Mitochondrial production of toxic oxygen species in vivo.

106. Longo V.D., Liou L.L., Valentine J.S., Gralla E.B. (1999) Arch Biochem Biophys. 365(1): 131-42. ; Mitochondrial superoxide decreases yeast survival in stationary phase.

107. L.u. E„ Wolfe J. (2001) Cell Death Differ 8(3):289-297 ; Lysosomal enzymes in the macronucleus of Tetrahymena during its apoptosis-like degradation.

108. Ludovico P., Sousa M.J., Silva M.T., Leao C., Corte-Real M. (2001) Microbiology 147(Pt 9):2409-15 ; Saccharomyces cerevisiae commits to a programmed cell death process in response to acetic acid.

109. Ludovico P., Rodrigues F., Almeida A., Silva M.T., Barrientos A., Corte-Real M (2002) Mol Biol Cell 13(8):2598-606 ; Cytochrome c release and mitochondria involvement in programmed cell death induced by acetic acid in Saccharomyces cerevisiae.

110. Madeo F., Fröhlich E., Fröhlich K.U. (1997) J Cell Biol. 139(3):729-34. ; A yeast mutant showing diagnostic markers of early and late apoptosis.

111. Madeo F., Fröhlich E., Ligr M., Grey M., Sigrist S.J., Wolf D.H., Fröhlich KU (1999) J Cell Biol 145(4):757-67 ; Oxygen stress: a regulator of apoptosis in yeast.

112. Madeo F., Engelhardt S., Herker E., Lehmann N., Maldener C., Proksch A., Wissing S., Fröhlich KUCurr Genet 2002a Jul;41(4):208-16 ; Apoptosis in yeast: a new model system with applications in cell biology and medicine.

113. Madeo F., Herker E., Maldener C., Wissing S., Lachelt S., Herlan M., Fehr M„ Lauber K„ Sigrist S.J., Wesselborg S„ Fröhlich K.U.Mol Cell 2002b Apr;9(4):911-7 ; A caspase-related protease regulates apoptosis in yeast.

114. Madeo F., Herker E., Wissing S., Jungwirth H., Eisenberg T., Fröhlich K.U. (2004) CurrOpin Microbiol. 7(6):655-60. ; Apoptosis in yeast.

115. Maercker C„ Kortwig H„ Nikiforov M.A., Allis C.D., Lipps H.J. (1999) Mot Biol Cell. 10(9):3003-14 ; A nuclear protein involved in apoptotic-like DNA degradation in Stylonychia: implications for similar mechanisms in differentiating and starved cells.

116. Majno G., Joris I. (1995) Am J Pathol. 146(1):3-15; Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death.

117. Manon S., Chaudhuri B., Guerin M. (1997) FEBS Lett. 415(1):29-32 ; Release of cytochrome c and decrease of cytochrome c oxidase in Bax-expressing yeast cells, and prevention of these effects by coexpression of Bcl-xL.

118. Manon S., Roucou X., Guerin M., Rigoulet M., Guerin B (1998) J Bioenerg Biomembr. 30(5):419-29 ; Characterization of the yeast mitochondria unselective channel: a counterpart to the mammalian permeability transition pore?

119. Marek S.M., W.u. J., Louise Glass N„ Gilchrist D.G., Bostock R.M.2003) Fungal Genet Biol. 40(2): 126-37 ; Nuclea r DNA degrad.

120. D.i. Matola T., D.'Ascoli F., Fenzi G., Rossi G., Martino E., Bogazzi F., Vitale M. (2000) J Clin Endocrinol Metab. 85(11):4323-30; Amiodarone induces cytochrome c release and apoptosis through an iodine-independent mechanism.

121. Mazzoni C., Mancini P., Verdone L., Madeo F., Serafini A., Herker E., Falcone C. (2003) Mol Biol Cell 14(2):721-9 ; A Truncated Form of KILsm4p and the Absence of Factors Involved in mRNA Decapping Trigger Apoptosis in Yeast.

122. MintaA., Kao J.P., Tsien R.Y. (1989) J Biol Chem. 264(14):8171-8 ; Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores.

123. Moraitis C„ Curran B.P. (2004) Yeast. 21 (4):313-23 ; Reactive oxygen species may influence the heat shock response and stress tolerance in the yeast Saccharomyces cerevisiae.

124. Moser M.J., Geiser J.R., Davis T.N. (1996) Mol Cell Biol. 16(9):4824-31 ; Ca2+-calmodulin promotes survival of pheromone-induced growth arrest by activation of calcineurin and Ca2+-calmodulin-dependent protein kinase.

125. Mpoke S., Wolfe J. (1996) Exp Cell Res 225(2):357-65 ; DNA digestion and chromatin condensation during nuclear death in Tetrahymena.

126. Muller E.M., Locke E.G., Cunningham K.W. (2001) Genetics. 159(4): 1527-38 ; Differential regulation of two Ca(2+) influx systems by pheromone signaling in Saccharomyces cerevisiae.

127. Muller E.M., Mackin N.A., Erdman S.E., Cunningham KW(2003) J Biol Chem. 278(40):38461-9 ; Figlp facilitates Ca2+ influx and cell fusion during mating of Saccharomyces cerevisiae.

128. Murray J., Zhang B., Taylor S.W., Oglesbee D., Fahy E., Marusich M.F., Ghosh S.S., Capaldi R.A. (2003) J Biol Chem. 278(16):13619-22; The subunit composition of the human NADH dehydrogenase obtained by rapid one-step immunopurification.

129. Myers L.C., Gustafsson C.M., Hayashibara K.C., Brown P.O., Kornberg R.D. (1999) Proc Natl Acad Sci USA. 96(1):67-72; Mediator protein mutations that selectively abolish activated transcription.

130. Nakajima-Shimada J., lida H., Tsuji F.I., Anraku Y. (1991) Proc Natl Acad Sci USA. 88(15):6878-82 ; Monitoring of intracellular calcium in Saccharomyces cerevisiae with an apoaequorin cDNA expression system.

131. Nakajima-Shimada J., Sakaguchi, S., lida H., Tsuji F.I., Anraku Y. (2000) Cell Structure and Function 25:125-131; Ca2+ signal is generated only once in the mating pheromone response pathway in Saccharomyces cerevisiae

132. Nagasawa T„ Suzuki S., Takeda T., DeGroot L.J. (1997) Endocrinology. 138(3): 1276-81 ; Thyroid hormone receptor beta 1 expression in developing mouse limbs and face.

133. Nagy G., Koncz A„ Perl A. (2003) J Immunol. 171 (10):5188-97 ; T cell activation-induced mitochondrial hyperpolarization is mediated by Ca2+-and redox-dependent production of nitric oxide.

134. Narasimhan M.L., Damsz B., Coca M.A., Ibeas J.I., Yun D.J., Pardo J.M., Hasegawa P.M., Bressan R.A. (2001) Mol Cell. 8(4):921-30; A plant defense response effector induces microbial apoptosis.

135. Nicholson D.W., Stuart R.A., Neupert W. (1989) J Biol Chem. 264(17): 10156-68 ; Biogenesis of cytochrome c1. Role of cytochrome c1 heme lyase and of the two proteolytic processing steps during import into mitochondria.

136. Nicotera P., Melino G. (2004) Oncogene. 23(16):2757-65 ; Regulation of the apoptosis-necrosis switch.

137. Norbury C.J., Zhivotovsky B. (2004) Oncogene. 23(16):2797-808 ; DNA damage-induced apoptosis.

138. Olie R.A., Durrieu F., Cornillon S., Loughran G., Gross J., Earnshaw W.C., Golstein P. (1998) CurrBiol 8(17):955-8 ; Apparent caspase independence of programmed cell death in Dictyostelium.

139. Osorio H., Moradas-Ferreira P., Gunther Sillero M.A., Sillero A. (2004) Arch Microbiol. 181(3):231-6; In Saccharomyces cerevisiae, the effect of H202 on ATP, but not on glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, depends on the glucose concentration.

140. Overkamp K.M., Bakker B.M., Kotter P., van Tuijl A., d.e. Vries S., van Dijken J.P., Pronk J.T. (2000) J Bacteriol. 182(10):2823-30 ; In vivo analysis of the mechanisms for oxidation of cytosolic NADH by Saccharomyces cerevisiae mitochondria.

141. Overton M.C., Blumer K.J. (2000) Curr Biol. 10(6):341-4 ; G-protein-coupled receptors function as oligomers in vivo.

142. Palmer C.P., Zhou X.L., Lin J., Loukin S.H., Kung C„ Saimi Y. (2001) Proc Natl Acad Sci USA. 98(14):7801-5 ; A TRP homolog in Saccharomyces cerevisiae forms an intracellular Ca(2+)-permeable channel in the yeast vacuolar membrane.

143. Papa S„ Skulachev V.P. (1997) Mol Cell Biochem. 174(1-2):305-19; Reactive oxygen species, mitochondria, apoptosis and aging.

144. Pastorino J.G., Tafani M., Rothman R.J., Marcinkeviciute A., Hoek J.B., Farber J.L. (1999) J Biol Chem. 274(44):31734-9 ; Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore.

145. Perl A, Gergely P. J.r., Nagy G., Koncz A., Banki K. (2004) Trends Immunol. 25(7):360-7; Mitochondrial hyperpolarization: a checkpoint of T-cell life, death and autoimmunity.

146. Phillips A. J., Sudbery I., Ramsdale M. (2003) Proc Natl Acad Sci U S A. 100(24): 14327-32; Apoptosis induced by environmental stresses and amphotericin B in Candida albicans.

147. Piacenza L., Peluffo G„ Radi R. (2001) Proc Natl Acad Sci USA. 98(13):7301-6 ; L-arginine-dependent suppression of apoptosis in Trypanosoma cruzi: contribution of the nitric oxide and polyamine pathways.

148. L.a. Piana G., Marzulli D., Gorgoglione V., Lofrumento N.E. (2005) Arch Biochem Biophys. 436(1):91-100 ; Porin and cytochrome oxidase containing contact sites involved in the oxidation of cytosolic NADH.

149. S.t.-Pierre J., Buckingham J.A., Roebuck S.J., Brand M.D. (2002) J Biol Chem. 277(47):44784-90 ; Topology of superoxide production from different sites in the mitochondrial electron transport chain.

150. Posas F., Takekawa M., Saito H. (1998) Curr Opin Microbiol. 1(2):175-82 ; Signal transduction by MAP kinase cascades in budding yeast.

151. Punj V., Chakrabarty A.M. (2003) Cell Microbiol. 5(4):225-31 ; Redox proteins in mammalian cell death: an evolutionarily conserved function in mitochondria and prokaryotes.

152. Q.i. H., L.i. T.K., Kuo D„ Nur-E-Kamal A., Liu L.F. (2003) J Biol Chem. 278(17):15136-41 ; Inactivation of Cdc13p triggers MEC1-dependent apoptotic signals in yeast.

153. Raff M. (1998) Nature. 396(6707): 119-22 ; Cell suicide for beginners.

154. Reers M., Smith T.W., Chen L.B. (1991) Biochemistry. 30(18):4480-6; J-aggregate formation of a carbocyanine as a quantitative fluorescent indicator of membrane potential.

155. Rikhvanov E.G., Rachenko E.I., Varakina N.N., Rusaleva T.M., Borovski G.B., Voinikov V.K. (2004) Russ. J. Genetics. 40(4) 341-347; The induction of Sacharomyces cerevisiae Hsp104 synthesis by heat shock is controlled by mitochondria

156. Sanchez-Alcazar J.A., Ault J.G., Khodjakov A., Schneider E. (2000) Cell Death Differ. 7(11):1090-100 ; Increased mitochondrial cytochrome c levels and mitochondrial hyperpolarization precede camptothecin-induced apoptosis in Jurkat cells.

157. Sarin A., Williams M.S., Alexander-Miller M.A., Berzofsky J.A., Zacharchuk C.M., Henkart P.A. (1997) Immunity. 6(2):209-15; Target cell lysis by CTL granule exocytosis is independent of ICE/Ced-3 family proteases.

158. Saupe S.J. (2000) Microbiol Mol Biol Rev. 64(3):489-502 ; Molecular genetics of heterokaryon incompatibility in filamentous ascomycetes.

159. Sedlak T.W., Oltvai Z.N., Yang E., Wang K., Boise L.H., Thompson C.B., Korsmeyer S.J. (1995) Proc Natl Acad Sci U S A. 92(17):7834-8 ; Multiple Bcl-2 family members demonstrate selective dimerizations with Bax.

160. Segovia M., Haramaty L, Berges J.A., Falkowski P.G. (2003) Plant Physiol. 132(1):99-105 ; Cell death in the unicellular chlorophyte Dunaliella tertiolecta. A hypothesis on the evolution of apoptosis in higher plants and metazoans.

161. Severin F.F., Hyman A.A. (2002) Curr Biol 12(7):R233-5 ; Pheromone induces programmed cell death in S. cerevisiae.

162. Sherman F., Stewart J.W., Helms C., Downie J.A. (1978) Proc Natl Acad Sci USA. 75(3):1437-41; Chromosome mapping of the CYC7 gene determining yeast iso-2-cytochrome c: structural and regulatory regions.

163. Sherman F. (2002) Method Enzymol. 75(3): 1437-41; Getting started with yeast

164. Shi Y. (2002) Mol Cell. 9(3):459-70 ; Mechanisms of caspase activation and inhibition during apoptosis.

165. Shuster JR (1982) Mol Cell Biol. 2(9): 1052-63; Mating-defective ste mutations are suppressed by cell division cycle start mutations in Saccharomyces cerevisiae.

166. Skulachev V. P. (1996) FEBS Lett. 397(1 ):7-10 ; Why are mitochondria involved in apoptosis? Permeability transition pores and apoptosis as selective mechanisms to eliminate superoxide-producing mitochondria and cell.

167. Skulachev VP (1998) FEBS Lett. 423(3):275-80; Cytochrome c in the apoptotic and antioxidant cascades.

168. Skulachev V.P. (1999) Mol Aspects Med. 20(3): 139-84 ; Mitochondrial physiology and pathology; concepts of programmed death of organelles, cells and organisms.

169. Skulachev V.P. (2002) FEBS Lett. 528(1 -3):23-6 ; Programmed death in yeast as adaptation?

170. Skulachev V.P. (2002) Ann N YAcad Sci. 959:214-37; Programmed death phenomena: from organelle to organism.

171. Small W.C., McAlister-Henn L. (1998) J Bacteriol. 180(16):4051-5 ; Identification of a cytosolically directed NADH dehydrogenase in mitochondria of Saccharomyces cerevisiae.

172. Sperandio S., d.e. Belle I., Bredesen D.E. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A. 97(26):14376-81; An alternative, nonapoptotic form of programmed cell death.

173. Sprague G.F. J.r., Blair L.C., Thorner J. (1983) Annu Rev Microbiol. 37:623-60 ; Cell interactions and regulation of cell type in the yeast Saccharomyces cerevisiae.

174. Sugioka R., Shimizu S., Tsujimoto Y. (2004) J Biol Chem. 279(50):52726-34 ; Fzo1, a protein involved in mitochondrial fusion, inhibits apoptosis.

175. Starkov A.A. (1997) Biosci Rep. 17(3):273-9; "Mild" uncoupling of mitochondria.

176. Steinmetz L.M., Scharfe C., Deutschbauer A.M., Mokranjac D., Herman Z.S., Jones T., Chu A.M., Giaever G., Prokisch H., Oefner P.J., Davis R.W. (2002) Nat Genet. 31(4):400-4 ; Systematic screen for human disease genes in yeast.

177. Tao W„ Kurschner C., Morgan J.I. (1998) J Biol Chem. 273(37):23704-8; Bcl-xS and Bad potentiate the death suppressing activities of Bcl-xL, BcI-2, and A1 in yeast.

178. Varbiro G., Toth A., Tapodi A., Veres B., Sumegi B., Gallyas F. J.r. (2003) Biochem Pharmacol. 65(7):1115-28 ; Concentration dependent mitochondrial effect of amiodarone.

179. Vardi A., Berman-Frank I., Rozenberg T., Hadas O., Kaplan A., Levine A. (1999) CurrBiol. 9(18): 1061-4 ; Programmed cell death of the dinoflagellate Peridinium gatunense is mediated by CO(2) limitation and oxidative stress.

180. Vaux D.L., Strasser A. (1996) Proc Natl Acad Sci USA. 93(6):2239-44; The molecular biology of apoptosis.

181. Viladevall L., Serrano R., Ruiz A., Domenech G., Giraldo J., Barcelo A., Arino J. (2004) J Biol Chem. 279(42):43614-24 ; Characterization of the calcium-mediated response to alkaline stress in Saccharomyces cerevisiae.

182. Vincent A.M., Olzmann J.A., Brownlee M., Sivitz W.I., Russell J.W. (2004) Diabetes. 53(3):726-34; Uncoupling proteins prevent glucose-induced neuronal oxidative stress and programmed cell death.

183. Vitols E„ North R.J., Linnane A.W. (1961) J Biophys Biochem Cytol. 9:689-99; Studies on the oxidative metabolism of Saccharomyces cerevisiae. I. Observations on the fine structure of the yeast cell.

184. Wada T., Penninger J.M. (2004) Oncogene. 23(16):2838-49 ; Mitogen-activated protein kinases in apoptosis regulation.

185. Wang X., Yang C„ Chai J„ Shi Y., Xue D. (2002) Science. 298(5598):1587-92 ; Mechanisms of AlF-mediated apoptotic DNA degradation in Caenorhabditis elegans.

186. Wiens M., Krasko A., Muller C.I., Muller W.E. (2000) J Mol Evol. 50(6):520-31 ; Molecular evolution of apoptotic pathways: cloning of key domains from sponges (Bcl-2 homology domains and death domains) and their phylogenetic relationships.

187. Wissing S., Ludovico P., Herker E., Buttner S., Engelhardt S.M., Decker T., Link A., Proksch A., Rodrigues F., Corte-Real M., Frohlich K.U., Manns J., Cande C., Sigrist S.J., KroemerG., Madeo F. (2004) J Cell Biol. 166(7):969-74

188. An AIF orthologue regulates apoptosis in yeast.

189. Withee J.L., Mulholland J., Jeng R., Cyert M.S. (1997) Mol Biol Cell. 8(2):263-77; An essential role of the yeast pheromone-induced Ca2+ signal is to activate calcineurin.

190. Witte C„ Jensen R.E., Yaffe M.P., Schatz G. (1988) EMBO J. 7(5):1439-47; MAS1, a gene essential for yeast mitochondrial assembly, encodes a subunit of the mitochondrial processing protease.

191. Wysocki R., Kron S.J. (2004) J Cell Biol. 166(3):311-6; Yeast cell death during DNA damage arrest is independent of caspase or reactive oxygen species.

192. Wright M.E., Han D.K., Carter L., Fields S„ Schwartz S.M., Hockenbery D.M. (1999) FEBS Lett. 446(1):9-14; Caspase-3 inhibits growth in Saccharomyces cerevisiae without causing cell death.

193. X.u. Q„ Reed J.C. (1998) Mol Cell. 1(3):337-46; Bax inhibitor-1, a mammalian apoptosis suppressor identified by functional screening in yeast.

194. Yamaki M., Umehara T., Chimura T., Horikoshi M. (2001) Genes Cells 6(12): 1043-54 ; Cell death with predominant apoptotic features in Saccharomyces cerevisiae mediated by deletion of the histone chaperone ASF1/CIA1.

195. Yang J., Liu X., Bhalla K., Kim C.N., Ibrado A.M., Cai J., Peng T.I., Jones D.P., Wang X. (1997) Science. 275(5303): 1129-32; Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome c from mitochondria blocked.

196. Yuan J., Shaham S., Ledoux S„ Ellis H.M., Horvitz H.R. (1993) Cell. 75(4):641-52; The C. elegans cell death gene ced-3 encodes a protein similar to mammalian interleukin-1 beta-converting enzyme.

197. Zangger H„ Mottram J.C., Fasel N. (2002) Cell Death Differ. 9(10):1126-39; Cell death in Leishmania induced by stress and differentiation: programmed cell death or necrosis?

198. Zou H„ L.i. Y., Liu X., Wang X. (1999) J Biol Chem. 274(17): 11549-56 ; An APAF-1 .cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9.

Информация о работе

Кнорре, Дмитрий Алексеевич
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.04

Диссертация

Программируемая клеточная смерть Saccharomyces cerevisiae, вызванная феромоном - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Программируемая клеточная смерть Saccharomyces cerevisiae, вызванная феромоном ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Программируемая клеточная смерть Saccharomyces cerevisiae, вызванная феромоном"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кнорре, Дмитрий Алексеевич

Введение Диссертация по биологии, на тему "Программируемая клеточная смерть Saccharomyces cerevisiae, вызванная феромоном"

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кнорре, Дмитрий Алексеевич

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кнорре, Дмитрий Алексеевич, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Программируемая клеточная смерть Saccharomyces cerevisiae, вызванная феромоном
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия