Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Продукция в растениях биологически активных миелоцитокинов человека

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Продукция в растениях биологически активных миелоцитокинов человека"

003484248

На правах рукописи

Зверева Анна Сергеевна

Продукция в растениях биологически активных мпелоцнтокинов человека

03.00.06 - Вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2009 г.

003484248

Работа выполнена на кафедре вирусологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научные руководители:

академик РАН, доктор биологических наук, профессор Атабеков Иосиф Григорьевич

доктор биологических наук, профессор Долгих Дмитрий Александрович Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Доброе Евгений Николаевич кандидат биологических наук Эльдаров Михаил Анатольевич

Ведущая организация:

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится «^Ф» октября 2009 г. в АЬ на заседании диссертационного совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, стр. 40, НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского, ауд. 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

.Крашенинников И. А.

Актуальность проблемы.

В течение последних 20 лет мировой спрос на рекомбинантные белки непрерывно возрастает. Такие белки применяют в клинической медицине, в качестве вакцин для людей и животных, промышленных ферментов, с их помощью создают новые материалы, они являются компонентами новейших наночастиц различного назначения. Большинство рекомбинантных белков синтезируют в клеточных культурах млекопитающих и бактерий, а также в клетках дрожжей и насекомых. Однако данные технологии обладают специфическими ограничениями и не могут в полной мере удовлетворить растущий спрос на рынке. Поэтому на протяжении последних десятилетий ученые разрабатывали альтернативную экономически выгодную систему безопасной, широкомасштабной продукции рекомбинантных белков -продукцию в растениях. Помимо создания стабильно трансформированных (трансгенных) растений, экспрессирующих целевые белки, в последнее время растущей популярностью пользуются системы временной экспрессии, в том числе на основе вирусов-векторов растений. Хотя первые опыты по генетической модификации вирусов растений с целью создания векторов для гетерологичной экспрессии проводились еще в середине 1980-х годов, современное понимание растительной вирусологии и прогресс в молекулярной биологии позволили значительно усовершенствовать систему векторной экспрессии. Новые достижения способствовали появлению разнообразных вирусных систем экспрессии и их дальнейшему использованию в научных и промышленных целях. Производство рекомбинантных белков в растениях может стать выгодной альтернативой существующим методам.

Цель и задачи исследования.

Целью данной работы было создание вирусов-векторов для продукции в растениях биологически активных миелоцитокинов человека: гранулоцитарного и гранулоцитарно-макрофагального

колониеспшулирующих факторов человека (Ьв-СЭР и ЬОМ-СБР, соответственно).

Были решены следующие задачи:

1. Создание вирусных векторов для экспрессии целевых генов.

2. Разработка методики выделения целевых белков из растительного материала.

3. Определение биологической активности рекомбинантных 1Ю-С8Р и ЬОМ-СБР, полученных путем экспрессии в растениях.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Впервые был создан вирус-вектор для временной экспрессии ЬС-СЭР и ЬвМ-СБР в растениях. Используемый вектор является первым вирусом-вектором на основе тобамовирусов, геномная РНК которого транскрибируется под контролем эукариотического промотера.

ИО-ОБР регулирует образование и созревание функционально активных нейтрофильных гранулоцитов. Рекомбинантный ЬО-С8Р широко используется в онкологии, поскольку химиотерапия часто сопровождается снижением количества нейтрофилов, а также при лечении таких заболеваний, как инфаркт миокарда и церебральная ишемия. ЬО-СБР оказался эффективен для профилактики и лечения гнойно-септических инфекций в хирургии, в том числе в онкохирургии и при лечении больных с рефрактерными хроническими инфекциями, т.к. Ьв-СвР активизирует различные механизмы защиты организма от инфекции. Ьв-СБР также применяют для стимуляции «выброса» стволовых клеток из костного мозга.

ЬвМ-СБР регулирует пролиферацию и созревание предшественников миелоидных клеток, а также функции зрелых нейтрофилов, эозинофилов и моноцитов. В клинической практике его применяют для лечения миелодиспластических синдромов, миелосупрессии в результате химиотерапии; апластической анемии, нейтропении, а также для снижения риска инфекций, связанных с пересадкой костного мозга. Кроме того, на

основе hGM-CSF создают противораковые вакцины для онкологических больных.

В настоящее время в России зарегистрированы и имеются в продаже рекомбинантные импортные препараты этих цитокинов, которые, наряду со стимуляцией гранулопоэза (hG-CSF, hGM-CSF) и моноцитопоэза (hGM-CSF), обладают иммуномодулирующими свойствами. Высокая стоимость препаратов колониестимулирующих факторов существенно ограничивает их широкое применение. Использование вирусных векторов для синтеза hG-CSF и hGM-CSF в растениях может способствовать значительному снижению стоимости их производства и, следовательно, удешевить лечение разных заболеваний, в том числе и онкологических.

По сравнению с другими системами экспрессии растения имеют ряд особенностей и преимуществ: низкая стоимость выращивания растений; сельскохозяйственные масштабы; отсутствие общих патогенов у растений и человека; простота переноса экзогенных ДНК в растительный геном; в растениях осуществляется гликозилирование и правильная укладка белков, сходные с таковыми в клетках млекопитающих. Использование вирусов-векторов для временной экспрессии позволяет увеличить выход целевого белка. Скорость мультипликации вирусной РНК в растениях чрезвычайно высока, за счёт чего достигается высокая копийность транскриптов чужеродных генов в цитоплазме заражённых клеток. Поэтому продуктивность вирусной системы экспрессии в среднем на 2 порядка выше по сравнению со стабильной трансформацией растений. Разработанная система экспрессии может быть использована для дешевой и безопасной продукции hG-CSF и hGM-CSF.

Апробация работы.

Результаты работы были представлены на 4-м международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2007; на 33-м международном конгрессе FEBS «Biochemistry of Cell

Regulation», Греция, 2008; на 1-м международном форуме по нанотехнологиям «Rusnanotech», Москва, 2008; на 34-м международном конгрессе FEBS «Life's molecular interactions», Чехия, 2009.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 4 тезисов.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 89 страницах и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 13 рисунками. Список литературы содержит 230 источников.

Результаты и обсуждение.

Целью данной работы была разработка метода экспрессии миелоцитокинов человека hG-CSF и hGM-CSF с помощью вируса-вектора на основе крВТМ (вируса табачной мозаики, заражающего растения сем. Brassicaceaé) в растениях Nicotiana benthamiana и последующее определение их биологической активности.

До настоящего времени растительная экспрессия hG-CSF была получена только в клеточных культурах трансгенных растений с низким выходом продукта (105 мкг/л). hGM-CSF синтезировали в семенах трансгенного табака, где уровень целевого продукта достигал 0,03% от растворимого белка; в трансформированных клетках табака с выходом целевого белка 130 мкг/л; в трансформированных клетках табака (250 мкг/л). Более высокий уровень экспрессии hGM-CSF (980 мкг/л) был достигнут в суспензии клеток табака за счет повышения осмотического давления при

добавлении в клеточную среду маннитола, а также в других трансгенных клеточных культурах растений с незначительным выходом целевого белка. Высокий уровень экспрессии был достигнут благодаря использованию вектора на основе X вируса картофеля, при этом содержание hGM-CSF в листьях достигало 20 мг на 1 г зеленой массы, однако в этой работе не проводили выделение и характеристику очищенного препарата рекомбинантного цитокина.

Конструирование плазмид для экспрессии целевых цитокинов в растениях.

Для экспрессии колониестимулирующих факторов в клетках растений гены целевых белков hG-CSF и hGM-CSF были клонированы в вектор на основе крВТМ. Следует отметить, что это первый вектор на основе тобамовирусов, геном которого эффективно транскрибируется под контролем эукариотического промотера гена актина из Arabidopsis thaliana. Ранее было показано, что ВТМ - один из наиболее эффективных вирусов для продукции целевых белков. Например, количество белка GFP, синтезированного с использованием вектора ВТМ:30В, составляло 10 % от растворимого белка зараженного листа N. benthamiana. Известно, что листья растений являются не лучшей системой для продукции белков. В частности, содержание белка в незараженном зрелом листе N. benthamiana составляет 8 - 10 г на кг сырой биомассы, 50% которого приходится на Rubisco (ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase-oxygenase). Однако данные ограничения могут быть компенсированы исключительной способностью ВТМ переключать клеточный синтез на вирусные белки в зараженных клетках. Например, ранее была отмечена высокая продуктивность векторов на основе крВТМ — содержание целевого белка достигало 80% растворимого белка клетки. Использование крВТМ для создания систем экспрессии оказалось еще более эффективным, чем ВТМ, возможно, благодаря использованию сильного промотера Кроме того, у крВТМ шире круг хозяев, что, при необходимости,

позволяет использовать различные виды растений семейства Brassicaceae для наработки целевых белков.

В качестве базового был использован вектор crTMV-CP-GFP (рис. 1). Его особенность состоит в том, что открытые рамки трансляции ТБ (транспортного белка) и БО (белка оболочки) перекрываются. Ген ТБ содержит субгеномный промотер гена БО, под контролем которого экспрессируется целевой белок. Кроме того, ТБ обеспечивает межклеточный транспорт вируса за пределы зоны агроинъекции. В данном векторе сохранена последовательность, кодирующая первые 26 аминокислот БО, следом за которой расположена последовательность гена GFP (green fluorescent protein, зеленого флуоресцирующего белка) в той же ОРТ. В результате, целевой белок содержит дополнительный фрагмент БО на N-конце. Предполагалось, что экспрессия GFP будет проходить эффективнее, благодаря имитации природного контекста гена БО, а также в связи с тем, что часть последовательности субгеномного промотера гена БО находится после стартового AUG-кодона.

Однако при экспрессии белков медицинского назначения в первую очередь важна их биологическая активность и низкая иммунногенность. Предположительно, дополнительный N-концевой фрагмент может нарушать функции цитокинов и вызывать нежелательный иммунный ответ. Поэтому для клонирования выбрали версию этого вектора, в которой стартовый кодон гена БО был мутирован (триплет ATG заменен на ACG), в результате чего целевой белок должен был синтезироваться с природной N-концевой последовательностью. Однако, в последовательности гена ТБ есть еще один стартовый кодон в рамке считывания БО, с которого может начаться трансляция. Для того, чтобы мутировать и этот кодон, была проведена полимеразная цепная реакция ПЦР-1 (на матрице crTMV-CP-GFP с праймерами сгМР-р и crMP_G-CSF-m).

crTMV-CP-GFP

LB

Lp=V

n_MZ,/L

EcoRI

crMP

CFP Инга

RB

&1

pGGF8

G-CSF-6Hl»-m

pCambia 1300

ПЦР продукт 1 с мутированными страховыми кодонами гена БО

ciUP-p erMP_G-CSF-m

I ПЦР 1

—i.. tiG-csp:......."_}-

/oupji-csF-p

SiSF-iWi-m

I LftS^Sg^fflfei П14Р продукт 2

S'-конец продукта 2 перекрывается с З'-юнц»! продукта 1

м

сгМР

ПЦРЗ

.he-CSF-6He

XI» I

ПЦР продукт 3

LB РД 10523

crRdRp

EcoR I

Ц crMP

S

Рестрщдо и лигарование ПЦР продукта Э в вектор crTMV-CP-GFP по сайтам EcoRl-ХЬв I

RB

HG-CSF; 6Hfa

J к

pCambia 1300

Рис. 1. Схема конструирования плазмиды рА10523 для экспрессии bG-CSF. LB (left border) и RB (right border) - левая и правая границы Т-ДНК соответственно. Arab.act2 - акишоаый промотер, crRdRp (crTMV RNA dependent RNA polymerase) -ген репликазы крВТМ, crMP (crTMV movement protein) - ген транспортного белка крВТМ, crCP (crTMV coat protein) - первые 78 нуклеотидов гена белка оболочки крВТМ, GFP - ген зеленого флуоресцирующего белка, hG-CSF- ген цигокина, NTR (non-translatable region) - ЗИТО (нетранслируемая область), Tnos (terminator of nopaline synthase) - терминатор гена нопалинсинтазы.

Для амплификации гена hG-CSF при помощи ПЦР-2 использовали ДНК плазмиды pGGF8 в качестве матрицы и праймеры: crMP_G-CSF-p и G-CSF-6His-m. Полученный ПЦР-продукт 2, содержал ген hG-CSF с шестью гистидиновыми кодонами на З'-конце (рис. 2). Праймеры crMP_G-CSF-p и crMP_G-CSF-m содержат перекрывающиеся участки, благодаря которым ПЦР-продукты 1 и 2 были объединены с помощью дополнительного раунда ПЦР-3 с праймерами сгМР-р и G-CSF-6His-m. Итоговый ПЦР-продукт 3 был клонирован в вектор crTMV-CP-GFP по сайтам EcoRl - Xbal.

GGGCAGAGCCCATTCCGACGCTTAAC »TG iCACCATIAGGTCCTGCITCGAGTCTGCCCCAGAGCTTCCTGCTCAAGTGC

RAEPIPTLN И TPLGPASSLPQSFLLKC

TTAGAGCAAGTGAGGAAGATCCAGGGCGATGGCGCAGCGCTCCAGGAGAAGC TGTGTGCCACCTACAAGC TTTGCCACCC

---.---,---1---1---.---1---1----L )60

LEOVRK IQGOGAALQEKLCA TYKLC HP

CGAGGAGCTGGTGCTGCTCGGACACICIC TGGGCATCCCC1GGGCTCCCCTGAGTAGCTGCCCAAGCCAGGCCCTCCAGC

---1----1----1---------1---1---- 240

EELVLLGHSLGIPVAPLSSCPSOALO

TGCCAGGCTGCTTGAGCCAACTCCATAGCGGCCTTTTCCTCTACCAGGGGCTCCTACAGGCCCTGGAAGGCATCTCTCCA

-------.-1->-1------.---.---.---- 320

LAGCLSOLHSGLFLYQCLLQALECISP

CAGTTGGGTCCCACCTTGGACACACTTCAGCTCGACGTCGCTGACTTTGCCACCACCATCTGGCAGCAGATGGAAGAACT

---,-----------------,-------1 400

ELGPTLOTLOLDVADFATT I V D Q H E E L

GGGAATGCCACCTGCACTGCAGCCCACCCAGGGTGCCATGCCGGCCTTCGCC TCTGC TTTCCAGCGCCGGGCAGGAGGTG

-.-■................'.■---'---- W

GHAPALOPTDGAMPAFASAFORRAGG

TTCTAGTTGCCTCCCATCTCCAGAGCTTCCTGGAGGTGTCGTACCGCGTTCTACGCCACC TTGCCCAGCCCCATCACCAT

-----_-------------j---------1. 560

VLVASHLQSFLEVEYRVLRHLAQPHHH

pal t

CACCATCACTAATCTAGA

---1--—► 57B

H H H . 8 R

Рис. 2. Нуклеотндная последовательность ПЦР продукта 2. Прямоугольником отмечен стартовый кодон ОРТ (открытой рамки трансляции) hG-CSF. В З'-концевой области гена расположена последовательность, кодирующая 6 гистидинов.

Амплификацию гена hGM-CSF проводили в аналогичных условиях на матрице ДНК плазмиды pFGM17 с использованием праймеров GM-CSF-p и GM-CSF-Sa/Z-m (ПЦР-продукт 4) (рис. 3). Последовательность из шести гистидиновых кодонов вместе с сайтом расщепления энтеропептидазой (ПЦР-продукт 5) была получена с помощью ПЦР-5 и олигонуклеотидов Ent-p и Ent-m. Праймеры Ent-m и GM-CSF-p содержат перекрывающиеся участки, благодаря которым ПЦР-продукты 4 и 5 были объединены при помощи дополнительного раунда ПЦР-6 с праймерами Ent-p и GM-CSF-Sa/Z-m. Была проведена рестрикция ПЦР-продукта 6 (рис. 4) по сайтам ÄirGI - Sali. С

помощью ПЦР-7 (на матрице рА 10523 с праймерами сгМР-р и сгМР-&/-С1-ш) был введен сайт В.чг(]\ в З'-концевую последовательность гена ТБ. Затем была проведена рестрикция ПЦР-продукта 7 ферментами по сайтам ЕсоШ -ВягОI. После чего, ПЦР-продукты 6 и 7 были одновременно лигированы в вектор рА10523 предварительно обработанный рестриктазами ЕсоШ -БаП.

Рис. 3. Схема конструирования плазмиды рА 12633 для экспрессии hGM-CSF.

LB (left border) и RB (right border) - левая и правая границы Т-ДНК соответственно. Arab.act2 - актиновый промотер, crRdRp - ген репликазы крВТМ, сгМР - ген транспортного белка крВТМ, сгСР - первые 78 нуклеотидов гена белка оболочки крВТМ, hGM-CSF - ген цитокина, NTR (non-translatable region) - З'НТО, Tnos (terminator of nopaline synthase) - терминатор гена нопалинсинтазы, Ent - сайт расщепления энтеропептидазы.

В результате, на основе бинарного вектора pCambia 1300 были сконструированы плазмиды рА 10523 и рА 12633, содержащие гены репликазы крВТМ, ген ТБ, целевой ген и З'НТО, необходимую для репликации вируса-вектора. Вся кассета экспрессировалась под контролем актинового промотера из A. thaliana и терминатора гена нопалинсинтазы из Agrobacterium tumefaciens. 3'- и 5'-концевые части генов hG-CSF и hGM-CSF, соответственно, содержали последовательности, кодирующие по 6 остатков

гистидина для облегчения последующей очистки целевых белков методом металлоаффинной хроматографии. Известно, что в некоторых случаях гексагисгидиновый участок оказывает негативное влияние на структуру и биологическую активность рекомбинантных белков. Кроме того, наличие дополнительных аминокислот является нежелательным при использовании лекарственной формы белка, поскольку может способствовать развитию патологического иммунного ответа организма. Поэтому в случае ИвМ-СЭР между кодонами гистидинов и последовательностью гена был введен сайт расщепления энтеропептидазы для изучения возможности последующего отщепления гексагистидинового участка.

ВзтО

тетдсд ДТЁ ЗАССАТСАТСЛТСАТСАТССАСДТСТСССТДСССАССДССАСАДСССАССТССТДСАТСТССАДСТСС ТТС

с т к ЕЛ ННННННРВ1.СТ|0001С|АРА1!8Р8РБ

ТАСТСААССАТССЕААСЛССТСААСЕСТДТССАССААССТССТССТСТСС ТСААССТСТСТДСАБАСАССССТССССААА —-1--..-.-----,---1---1-,----^ 160

ТОРУЕНУНА10ЕА1г|!1.1-И1.51гОТААЕ

ТСААССАААСТСаТТБААБТСАТАТССБАААТСТТССАССТТСААСААСССАССТССС ТССААДСАССТСТССАСС Т&ТАТ -,-,---,------„---_-,-------,. 2ад

МНЕТУЕУ18ЕИР01_0ЕРТС1_0Т1г|.Е1.У

АААСААСБТС Т&СБТСС ТТСТСТСАСТДДССТТДААССДССССТСДССДТСДТСССТТСДСДСТАСДДССАССДСТйССС -------.---,---.---1---,-.-1---1 320

К0С1-ИП5|_ТК|_КСР|_ТПМА5НУКаНСР

АССТАСТССССАСАССТСТТСТБСТАСССААДТСАТСАСС ТТССАДТССТТСААССААААССТСАДССАС ТТССТСС ТБС

---1---1-—-1---1-.-1---1--------- чоо

РТРЕТ8С А Т О I I ТРЕ5РКЕМ1_К0Г1-1.

ра1!

ТТАТТССАТТССАТТСС ТСССДАССССТССАССАСТААСТССАС ---л-----1-----► адч

У1РГ0С«ЕРУ0Е.У0

Рис. 4. Нуклсотидная последовательность ПЦР продукта б. Прямоугольниками отмечены стартовый кодон ОРТ ЬвМ-СЗР и сайг расщепления энетропептидазы.

Для доставки вирусных векторов в листья растений был использован метод агроинъекции с помощью культур клеток А. Ште/айет,

предварительно трансформированых конструкциями рА10523 и рА 12633. Для стимуляции продуктивности и повышения уровня экспрессии вируса-вектора опыты проводились в условиях совместной агроинъекции смесью агробактерий, несущих геном вируса-вектора и агробактерий, содержащих ген белка р19 из вируса кустистой карликовости томатов. Белок р19 является супрессором противовирусной реакции клеток растения-хозяина -«умолкания генов» вирусной РНК. Эффект ингибирования посттранскрипционного умолкания генов (ПТУГ) достигается за счет способности белка р19 образовывать комплекс с короткими интерферирующими РНК, что блокирует систему передачи сигнала ПТУГ. Поэтому агроинъекция гена р19 позволяет повысить стабильность РНК вируса-вектора.

Экспрессия hG-CSF в листьях N. benthamiana.

Для оценки эффективности экспрессии гена hG-CSF в растениях проводили экстракцию белков из листьев и измеряли содержание рекомбинантного цитокина при помощи белкового электрофореза и Вестерн-блот анализа. Интенсивность полос на иммуноблоте, соответствующих растительному phG-CSF (plant-made hG-CSF) сравнивали с известным количеством rhG-CSF, выделенным из Е. coli. Для определения времени максимального накопления белка в листьях проводили сравнительный анализ содержания белка в зараженных листьях каждые 24 ч после агроинъекции. Установлено, что на пятые сутки после заражения содержание phG-CSF в листьях достигало максимума - 500 мг/кг сырой зеленой массы (рис. 5, а). Дополнительные полосы с молекулярной массой около 34 кДа, окрашиваемые антителами к hG-CSF, представляют собой, по-видимому, димеризованный белок. Это может быть связано с тем, что повышенный уровень экспрессии в гетерологичной системе сопровождается нарушением фолдинга части рекомбинантного белка, при этом экспонированные гидрофобные участки обладают склонностью к образованию агрегатов.

Возможно в связи с этим, большая часть целевого белка находится в нерастворимой фракции.

1

2 3

кДа 20,1

1

2

Í

14,4 ..... 1

а

б

Рис. 5. Экспрессия hG-CSF в листьях N. benthamiana. a - Вестерн-блот анализ. Положительный контроль - rhG-CSF, полученный из Е. coli (дорожка 1). Неинокулированный лист (отрицательный контроль - дорожка 2). Экстракта листа, агроинокулированного конструкцией рА10523 (дорожка 3), Слева показаны положения маркеров молекулярной массы белков («Fermentas»), Стрелкой отмечены белковые полосы, соответствующие phG-CSF; звездочкой - предполагаемые димеры hG-CSF. б - электрофорез методом Лэммли hG-CSF, полученного экспрессией в Е. coli (дорожка 1) и очищенного phG-CSF (дорожка 2)

Для выделения белка из экстракта растительных клеток был использован метод металло-аффинной хроматографии на №2+-1ЧТА-агарозе. Гексагистидиновые участки в составе гидрофобных молекул белка должны быть доступны для связывания с аффинной смолой, поэтому стадию нанесения проводили в денатурирующих условиях. Затем постепенно снижали концентрацию денатурирующих агентов, чтобы белок смог принять нативную пространственную конформацию. Для элюции использовали имидазол-содержащий буфер без денатурантов.

После выделения и очистки с помощью белкового электрофореза в препарате рЬС-СЬР была выявлена одна полоса с молекулярной массой 17

кДа, соответствовавшая целевому белку с гексагистидиновым участком (рис. 5, б). Чистота полученного белка превосходит 95%. Выход очищенного белка составил 100 мг/кг зеленой массы, что значительно превышает выход, полученный в предыдущих исследованиях.

Определение биологической активности рИС-С^Р.

Для определения колониестимулирующей активности клетки костного мозга мыши культивировали в присутствии очищенного препарата рИО-СйР из листьев растений, а затем проводили подсчет образовавшихся колоний нейтрофилов. Исследование пролиферации мышиных миелобластов является стандартным тестом для ЬО-С5Рт поскольку мышиный и человеческий белки обладают межвидовой кросс-реактивностью.

80 -|

Физиологический раствор Neupogen (20 нг/мл) phG-CSF (20 нг/ил)

Рис. 6. Биологическая активность phG-CSF. КОЕ-К - колониеобразующие единицы в культуре.

В качестве положительного контроля использовали препарат hG-CSF Neupogen фирмы «F.Hoffmann-La Roche» (Швейцария). Установлено, что phG-CSF обладает такой же активностью, как и контрольный препарат (рис.

6). Следовательно, используемые методы очистки не приводят к потере биологической активности Ьв-СЗР.

Экспрессия hGM-CSF в листьях N. benthamiana.

Экспрессия гена hGM-CSF в составе плазмиды рА12633, оценка уровня накопления целевого белка и очистка phGM-CSF проводились по аналогии с рА10523 и phG-CSF. Согласно результатам Вестерн-блот анализа, на пятый день после заражения содержание phGM-CSF (plant-made rhGM-CSF) в листьях достигало 300 мг/кг сырой зеленой массы (рис. 7, а). Дополнительные полосы с молекулярной массой около 45 кДа, окрашиваемые антителами к hGM-CSF, также представляют собой, по-видимому, димеры белка. Большая часть белка также находится в нерастворимой фракции. При помощи электрофореза в ПААГ (полиакриламидном геле) по методу Лэммли в препарате очищенного целевого белка обнаруживается единственная полоса, подвижность которой соответствует рассчитанной молекулярной массе hGM-CSF с гексагистидиновым участком и сайтом расщепления энтеропептидазы (24 кДа, рис. 7, б). Выход белка после очистки составил около 50 мг/кг зеленой массы. Чистота полученного белка превосходит 95%.

Рис. 7. Экспрессия hGM-CSF в листьях N. benthamiana. а - Вестерн-блот анализ. В качестве положительного контроля использован rhGM-CSF, полученный путем экспрессии в Е. coli (дорожка /), в качестве отрицательного контроля -неинокулированный лист (дорожка 2). Лист, агроинокулированный конструкцией рА12633 (дорожка 3). Слева показаны положения маркерных белков и их молекулярные массы; стрелкой - белковые полосы, соответствующие phGM-CSF; звездочкой - предполагаемые димеры phGM-CSF. б - электрофорез по Лэммли hGM-CSF, полученного из Е. coli (дорожка 1) и очищенного phGM-CSF (дорожка 2). в -Вестерн-блот анализ препаратов phGM-CSF после обработки энтеропептидазой (дорожка 4), 20 и 50 нг очищенного phGM-CSF после обработки энтеропептидазой (дорожки 2, 3 соответственно), очищенного phGM-CSF до обработки ферментом (дорожка 5), hGM-CSF, полученного из Е. coli (дорожка 1)

Для получения рекомбинантного hGM-CSF с природной аминокислотной последовательностью был проведен подбор условий обработки полученного белка препаратом энтеропептидазы. Установлено, что полный гидролиз одного мг белка осуществляется тремя единицами фермента в течение 16 ч при комнатной температуре. Эти условия были выбраны для препаративного гидролиза целевого белка. В результате гидролиза был получен рекомбинантный phGM-CSF с молекулярной массой, совпадающей с массой белка, выделенного из бактериального продуцента.

При этом полоса нерасщепленного белка в препарате Вестерн-блотом не детектируется (рис. 7, в, дорожка 4). Таким образом, данные электрофореза и Вестерн-блота дают основания предполагать, что отщепление гексагистидинового участка в нашем случае произошло полностью, и N-концевая последовательность полученного нами белка соответствует природной.

Для разделения продуктов гидролиза проводили повторную хроматографию на Ni2+-NTA -агарозе. При этом продукты гидролиза, имевшие в своем составе последовательность из шести гистидинов (недорасщепленный гибридный белок, который не детектируется с помощью иммуноблота, и гексагистидиновый фрагмент), а также примесные белки, обладавшие неспецифическим сродством к задерживались

смолой. Молекулярная масса очищенного рекомбинантного phGM-CSF совпадала с массой белка, выделенного из бактериального продуцента (рис.

7, в, дорожки 2, 3).

Определение биологической активности phGM-CSF.

Колониестимулирующую активность рекомбинантного GM-CSF определяли по уровню стимуляции пролиферации линии клеток эритролейкоза человека TF-1. В качестве контроля был взят рекомбинантный rhGM-CSF, выделенный из Е. coli, активность которого совпадала с активностью рекомбинантного hGM-CSF Sargramostim Leukine фирмы «Immunex» (США), полученного путем экспрессии в клетках дрожжей. Степень стимуляции пролиферации определяли по включению [3Н]тимидина. Установлено, что диапазоны активности белков несколько различаются (рис.

8, а). Максимальная стимуляция пролиферации достигается при добавлении 1 нг/мл phGM-CSF, а доза, необходимая для 50%-ной стимуляции (EDJ0) составляет 86 пг/мл, что в 4.7 раз больше, чем у контрольного препарата (18 пг/мл). Однако, после удаления гексагистидинового участка с помощью

энтеропептидазы (рис. 7, в) значения ЕОм для рИОМ-СвР и ЛОМ-СЭР практически совпадали (11 и 10 пг/мл соответственно) (рис. 8, б).

Концентрация, нг/мл

Рис. 8. Биологическая активность рЬвМ-СвК а - активность рЬвМ-СЯР (кривая 2) по сравнению с гЬСМ-СБР (кривая 1); б - активность рЬвМ-СЭР после обработки энтеропептидазой и последующей очистки (кривая 2) по сравнению с гЬОМ-СБР (кривая 1). За 100% принимали включение [3Н]тимидина в контрольные (не стимулированные) клетки. Кривые соответствуют уравнению ИС = 100 + (ИСцш - 100у(1 + ЕБ5(у'[М]), где ИС - индекс стимуляции, ИСщ» - предельная величина ИС, [М] - концентрация миелоцигокина. Использованные значения Н05о (равные 18,86 (а) и 11,10 (б) для кривых 1 и 2 соответственно) и ИСцщ определены методом нелинейной регрессии.

Полученный результат можно объяснить тем, что наличие достаточно протяженного заряженного пептида (гексагистидинового тага и участка

расщепления энтеропептидазы) на М-конце молекулы ЬСМ-СБИ каким-то образом мешает формированию правильной пространственной структуры белка, необходимой для взаимодействия с клеточным рецептором. После обработки энтеропептидазой природная аминокислотная и, предположительно, пространственная структуры цитокина восстанавливаются, в результате чего колониестимулирующая активность препарата возрастает до уровня контрольной.

Существует несколько направлений усовершенствования полученной системы экспрессии. Модификации генома вируса-вектора, такие как введение интронов в последовательность генов вектора и оптимизация кодонов генов целевых белков могут привести к стимуляции их экспрессии. Возможно увеличить эффективность экспрессии целевых белков с помощью системной экспрессии. Для этого нужно восстановить последовательность гена белка оболочки, который необходим для транспорта вирусной инфекции. Интересно было бы изменить клеточную локализацию продуктов экспрессии генов цитокинов, присоединив к ним сигнальные последовательности, направляющие их в эндоплазматический ретикулум или апопласт. Другое направление - изменение техники агроинъекции. В некоторых исследованиях показано, что вакуумная инфильтрация целого растения суспензией агробактерий или техника заражения корней растений, выращенных методом аэропоники, оказываются наиболее эффективными.

Таким образом, в результате проделанной работы сконструирована система экспрессии цитокинов в листьях растений, обеспечивающая достаточно высокий уровень синтеза - 300-500 мг/кг листьев. Разработанные методы выделения белков из листьев растений позволяют получать биологически активные препараты высокой чистоты, что подтверждает наличие широких перспектив использования вирусной системы для

экспрессии генов различных цитокинов и других фармацевтических белков в

растениях.

ВЫВОДЫ

1. Впервые получены вирусные векторы на основе тобамовирусов для продукции рекомбинантных цитокинов Ьв-СвР и ИвМ-СвР в растениях.

2. Разработана методика заражения и культивирования зараженных растений ШсоНапа Ьеп1Ьат\апа. Установлено, что максимальный уровень синтеза рекомбинантных цитокинов наблюдается на пятые сутки после заражения.

3. Разработана методика выделения рекомбинантных цитокинов из растений, позволяющая получать биологически активные препараты ЬО-СБР и ИОМ-СБР с высоким выходом.

4. Показано, что синтезированные в растениях Ьв-СвР и ЬОМ-С81' обладают такой же колониестимулирующей активностью, как и аналогичные препараты, уже применяемые в медицине.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Зверева А.С., Петровская Л.Е., Родина А.В., Иванов П.И., Фролова О.Ю., Шингарова Л.Н., Комарова Т.В., Дорохов Ю.Л., Долгих Д.А., Кирпичников М.П., Атабеков И.Г. (2009). Продукция в растениях биологически активных миелоцитокинов человека. Биохимия (Москва), 74,1459- 1468.

2. Комарова Т.В., Скулачев М.В., Зверева А.С., Шварц A.M., Дорохов ЮЛ., Атабеков И.Г. (2006). Новый вирусный вектор для эффективной продукции целевых белков в растениях. Биохимия (Москва), 71,846 - 850.

3. A. Zvereva (2009). Production of biologically active human granulocyte and granulocyte macrophage colony-stimulating factors in Nicotiana benthamiana. Abstracts of 3,4th FEBS Congress, FEBS Journal 276,397.

4. A. Zvereva (2008). New approach to expression of cytokine in plants. Abstracts of 33d FEBS Congress FEBS Journal 275,365.

5. A.S. Zvereva (2008). Expression of human cytokines (G-CSF and GM-CSF) in Nicotiana benthamiana plants. Abstracts of Nanotechnology international forum "Rusnanotech" , Russia, Moscow, December 3 - 5, 183.

6. Зверева A.C. (2007). Экспрессия Г-КСФ в растениях Nicotiana benthamiana. Сборник тезисов Четвертого московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» март 12-16,126.

Подписано в печать:

21.09.2009

Заказ № 2563 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Зверева, Анна Сергеевна

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ПРОИЗВОДСТВО РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ В РАСТЕНИЯХ.

II. 1. Экспрессия рекомбинантных белков в трансгенных растениях.

Продукция рекомбинантных антител в трансгенных растениях.

Недостатки трансгенной технологии.

II.2. Системы экспрессии на основе вирусов-векторов растений.

Типы вирусных веторов.

Продукция антител с помощью вирусов-векторов в растениях.

Продукция антигенов с помощью вирусов-векторов в растениях.

Применение вирусов-векторов растений в нанотехнологии.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Создание конструкций для экспрессии миелоцитокинов в растениях.

Экспрессия hG-CSF в листьях N. benthamiana.

Определение биологической активности phG-CSF.

Экспрессия hGM-CSF в листьях N. benthamiana.

Определение биологической активности phGM-CSF.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Зверева, Анна Сергеевна

1. Впервые получены вирусные векторы на основе тобамовирусов для продукции рекомбинантных цитокинов hG-CSF и hGM-CSF в растениях.2. Разработана методика заражения и культивирования зараженных растений Nicotiana benthamiana. Установлено, что максимальный уровень синтеза рекомбинантных цитокинов наблюдается на пятые сутки после заражения.3. Разработана методика выделения рекомбинантных цитокинов из растений, позволяющая получать биологически активные препараты hG-CSF и hGM-CSF с высоким выходом.4. Показано, что синтезированные в растениях hG-CSF и hGM-CSF обладают такой же колониестимулирующей активностью, как и аналогичные препараты, уже применяемые в медицине.БЛАГОДАРНОСТИ Хочу поблагодарить людей, с помощью которых состоялась эта работа.В первую очередь своих научных руководителей: Атабекова Иосифа Григорьевича за ценные советы и направление в нужное русло, Долгих Дмитрия Александровича за помощь в интерпретации результатов и написании работы, Кирпичникова Михаила Петровича за сотрудничество, Дорохова Юрия Леонидовича за формирование моей стойкости. Особую признательность выражаю Петровской Ладе Евгеньевне за многочисленные обсуждения, тщательное редактирование данной работы и моральную поддержку. Большое спасибо Иванову Петру Алексеевичу за обучение хитростям молекулярной методологии и внимательную правку работы.Благодарю Фролову Ольгу Юрьевну за бесчисленные консультации в проведении экспериментов, Шварца Антона Марковича, Комарову Татьяну Валерьевну и Шевелеву Анну Александровну за дружескую атмосферу и поддержку в сложных ситуациях. Отдельная благодарность Скулачеву Максиму Владимировичу за разжигание интереса к науке, помощь и оптимизм и Пугину Михаилу Михайловичу за придание этой работе ускорения и конструктивные советы и замечания.Большая благодарность Дризе Нине Иосифовне и Шипуновой Ирине Николаевне за определение биологической активности phG-CSF, Родиной Алле Валерьевне за определение биологической активности phGM-CSF, Гаспарян Марине Эдуардовне за предоставленный препарат энтеропептидазы и Сухачевой Елене Александровне за препарат мышиных антител к rhG-CSF.