Продленный мутагенез и морфогенез у растений при действии радиации, алкилирующих мутагенов и гербицидов

Сидоров, Виктор Павлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Продленный мутагенез и морфогенез у растений при действии радиации, алкилирующих мутагенов и гербицидов
ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Продленный мутагенез и морфогенез у растений при действии радиации, алкилирующих мутагенов и гербицидов"

-я' -I и Я

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М. В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

СИДОРОВ Виктор Павлович

ПРОДЛЕННЫЙ МУТАГЕНЕЗ И МОРФОГЕНЕЗ У РАСТЕНИЙ ПРИ ДЕЙСТВИИ РАДИАЦИИ, АЛКИЛИРУЮЩИХ МУТАГЕНОВ И ГЕРБИЦИДОВ

Специальность 03.00.01 — Радиобиология 03.00.15 — Генетика

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Москва — 1992

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте химизации лесного хозяйства.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, академик Б. С. Пристер

доктор биологических наук, профессор В. А. Шевченко доктор биологических наук, профессор М. М. Асланян

Ведущая организация —

Институт биологии Коми научного центра Уральского отделения РАН

Защита состоится « 2 2» (О/1.7 1992 года

в __ часов на заседании Специализированного совета

Д.053.05.74 в Московском Государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899, г. Москва, ГСП, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ. Отзывы просим направлять по адресу: 119899, г. Москва, ГСП, Ленинские горы, биологический факультет, Специализированный совет Д.053.05.74.

Диссертация разослана « / ? » Я Л 1992 г.

Ученый секретарь

РОССИЯСХЛЯ

гуда. -ЛАЯ ( е-БЙВЛИОТЕКА

В В ГД ПГИ Е

Актуальность проблемы. В настоящее время ионизирующие излучения, химические мутагены и гербициды являются мот,ныли факторами, загрязняющими окружающую среду. В многочисленных работах установлена их высокая мутагенная активность. При действии радиации и химических соединений в ДНК хромосом возникают локальные первичные молекулярные повреждения - одно- и двунитевке разрывы, алкилированные основания, сшивки. Дальнейшая судьба первичных повреждений ДОК хромосом зависит от функционального состояния генома кок в момент, так и после воздействия мутагенами. Большой вклад в разработку теоретических и экспериментальных основ радиобиологии внесли отечественные ученые(Кузин, Газиев, 1969; Кузин, 1986, Корогодин, 1964; Тимофеев-Ресовский, 1968; Лучник, 1968; Кудряшов, 1980,1985).Были сформулированы и разработаны основные вопросы теории хромосомного мутагенеза (Дубинин, Тарасов, 1969; Дубинин, Акифьев, 1969,1970; Дубинин,Македонов и др.,1972). Обоснованы новые подходы к изучению молекулярных механизмов образования структурных мутаций хромосом (Тарасов, 1975; Акифьев, 1989), в частности в двух последовательных клеточных делениях (Сидоров, 1974; Сидоров, Тарасов, 1979), механизмов додификации повреждений, индуцированных различии«! типами мутаге-■юв и роли генетических процессов в возникновении мутаций. Во лногом эти процессы, начиная с момента возникновения первичных ювреждений до их реализации в аберрации хромосом, бьшг неясны 1 требовали экспериментального изучения. В особенности это кажется повреждений, реализация которых в аберрации хромосом фоисходит в ряду последовательньос клеточных делений, т.е. спустя 1Лителыюе время с момента мутагенного воздействия. В этом плане [резвычпКную остроту приобрели исследования повреждающего дейст-|ия радиации на древесные растения и другие организмы после [варии на Чернобыльской АЭС, в результате острого и хронического блучения в малых дозах (Пеленина и др., 1990).

Проблема возникновения повреждений в ДНК хромосом вследст-ие облучения и последующей их рг^изацни в хромосомные и генные утопии в ряду последовательных клеточных поколений в онтогенезе

древесных растений в теоретическом и экспериментальном плане практически не разработана. Между тем, именно эти исследования позволили бы по-новому осмыслить процессы продленного мутагенеза, проблемы накопления генетического груза и изменения генетической структуры популяций.

Кроме того, в последние годы становится все более ясным, что действие радиации и химических соединений на живые организмы носит комплексный характер. В большинстве своем комбинированное действие радиации и химических соединений приводит к усилению мутагенных эффектов, хотя и известны специфические химические соединения, защищающие генетический аппарат от мутагенного действия физических и химических факторов (Гончаренко, Кудряшов, 1980; Кудряшов,1585,1587,1989; Рождественский, 1585; Алекперов, 19*/8; Сейсебаев, 1991). Поэтому важную роль в понимании закономерностей мутагенеза и реализации поврездений в последовательных клеточных делениях, играют исследования по модификации ци-тогенетических эффектов облучения мутагенами химической природы, а также ингибиторами синтеза ДНК, блокирующими нормальные генетические процессы, протекающие в клетке в различные периоды интерфазы. Результаты по комбинированному действию мутагенов имеют и большое самостоятельное научно-практическое значение, так как показывают, что генетические эффекты при действии одного мутагена могут быть значительно усилены последующим воздействием другим мутагеном, либо химическим соединением . немутагенной природы (Ярмонснко, 1988). Молекулярные механизмы такого взаимодействия в настоящее время мало изучены.

В связи с вниесказанным в задачи настоящей работы входили исследования:

1. Закономерностей мутационного процесса в ряду последовательных клеточных делений при действии мутагенов различного типа - радиации, алкилкрующих соединений и гербицидов.

2. Механизмов мутагенного действия в зависимости от типов первичных повреждений и генетических процессов, протекающих в С,-фазе митотического цикла.

3. Закономерностей образования аберраций хромосом в двух последовательных клеточных делениях при комбинированном действии радиации и химических мутагенов.

4. Проблемы неспецифичности в индукции аберраций хрокосОг.; при действии радиации и алкилирующих мутагенов.

5. Морфологических изменений, хромосомных мутаций и изменений в функциональной активности генов, ответственных за синтез изоферментов пероксидазы у сосни обыкновенной под действием облучения в результате аварии на Чернобыльской АЭС.

6. Реализации индуцированных повреждений в хромосомные мутации в процессе дифференциации и дедифференциации клеток древесных растений.

Научная новизна. Установлено, что при однократном действии мутагенов различного класса таких как радиация, алкилирующие соединения и гербициды, в ДНК хромосом возникает несколько типов повреждений различной молекулярной природы, которые способны переходить ряд синтезов ДНК и реализоваться в аберрации хромосом в двух последовательных клеточных делениях.

Изучен механизм образования хромосомных аберраций, индуцированных радиацией в -фазе первого митоза. Установлено, что эффективная реализация повреждений происходит в генетически активных локусах ДНК хромосом, в которых ингибируется 5-аминоура-цилом и 5-фтордезаксиуридином спонтанный дополнительный синтез ДНК. Следовательно, аберрации хромосомного типа возникают на основе двунитевого разрыва, образующегося в изолокусе в результате совпадения спонтанного и индуцированного радиацией однонитевого разрыва.

Из экспериментов по комбинированному действию следует новый, имеющий принципиальное значение вывод о том, что каждый из мутагенов по отношению к действию первого обладает модифицирующим эффектом за счет изменений молекулярной природы первичных повреждений или внутрихромосомннх генетических процессов, что приводит к усилению или торможению процессов реализации повреждений на протяжении нескольких последовательных клеточных делений.

Впервые на клетках хвои сосны-, обыкновенной изучена мутагенная активность гербицидов. Показшю, что гербициды у сосны обыкновенной пн.цуцируют разнообразные мор^озы, хромосомные аберрации и изменения в регуляции генов, ответственных за синтез изоферментов пероксидазы.

Показано, что изученные нами мутагены различной пря^ды не обладают специфичностью и индуцируют сходный ряд морфологических изменений, коротко- и длительногшвуцие потенциальные повреждения. Этот вывод особенно важен с точки зрения оценки опасности отдаленных генетических последствий.

Открыто новое явление передачи повреждений, индуцированных радиацией и гербицидами, в процессе д/.фференцировки и дедкфферен-цировки клеток сосны на протяжении нескольких вегетационных периодов.

Процесс передачи повреждений носит универсальный характер и имеет место при делении как специализированных, так и недифференцированных соматических клеток сосны обыкновенной.

Впервые в мировой практике изучена дозиметрическая обстановка в лесах 30-километровой зоны после аварии на Чернобыльской АЗС. Установлены зоны поражения древесных растений.

Во вновь созданных культурах сосны на площадях с плотностью загрязнения радионуклидами от 5до 10000 Ки/км^ изучены морфологические изменения, хромосомные аберрации и нарушения регуляции генов, ответственных за синтез изоферментов пероксидазы в зависимости от накопленной дозы хронического облучения. Накопленную дозу определяли м.етодом ТЛД-дозиметрии, что позволяет корректно интерпретировать полученные результаты.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту. I. Радиация, алкилирующие мутагены и гербициды в результате однократного воздействия, индуцируют в ДНК хромосом несколько типов первичных повреждений, способных переходить через ряд последовательных синтезов ДНК и реализоваться в хромосомные и хроматидные аберрации в диплоидных и тетраплоидных клетках.

Реализация повреждений различного типа в аберрации хромосом происходит в зависимости от конкретных генетических процессов, протекающих в определенной фазе митотическо;'о цикла, таких как неиндуцированнь'й дополнительный синтез ДНК.

2. Совместное воздействие мутагенами различной природы приводит к усилению мутагенного эффекта и модификации повреждений,реаяизирующихся в аберрации хромосом в двух последовательных клеточных делениях.

3. Радиация, алкилируюцле мутагены и гербициды не обладают

специфичностью в индукции хромосомных, морфологических и биохимических изменений.

4. Индуцированные радиацией и химическими мутагенами повреждения реализуются в хромосомные аберрации при делении специализированных и инициальных клеток растений в процессе ди-фференциропки и дедифференцировки.

Теоретическая и практическая значимость работы. Представленные в работе экспериментальные материалы позволили развить высказанные ранее чисто феноменологические положения теории потенциальных изменений (Дубинин, Тарасов,1969; Дубинин,Лкифьев, 1959). В результате были сформулированы и экспериментально обоснованы основополагающие в современной теории мутагенеза положения о многоэтапном характере образования структурных аберраций хромосом, в частности, в двух последовательных клеточных делениях (Сидоров, 1974; Сидоров и др.,1979).

Вперике в нашей р.-боте установлено, что различные классы лутагенов индуцируют несколько типов первичных повреждений, реа-1изация которых в хромосомные и хрематидные аберрации происходит з ряду последовательных митотичссяих делений соматических клеток метений.

Реализация различных' типов первичных повреждений происходит з зависимости от конкретных генетических процессов, протекающих з клетке в определенной фазе митоза, таких как спонтанный допел-адтельный синтез ДНК в ^-периоде и репликативный в 2 -фазе. 1ервичные повреждения от момента их возникновения до реализации з мутации могут подвергаться модификации повторным воздействием сак мутагенов, так и соединениями, ингибирующими нормальные гене-■ические процессы. В этом случае конечный выход мутаций моке. г начительной степени изменяться.

Процессы взаимодействия мутагенов могут осуществляться как а уровне первичных повреждений, так и на уровне модификации ■епетических процессов путем стимуляции или ингибирования локусов сромосом, в которых протекает дополнительный синтез.

На клетках растений впервые показано, что индуцируемые радиацией и гербицидами повреждения способны проходить не только )яд последовательных клеточных делений, т.е.ряд репликатнвных лнтезов ДНК, но и процессы дифференцировки и дедифференцировки

клеток. Это означает, что первичные повреждения, первоначально возникшие в неспециализированных клетках, переходят в специализированные, и их реализация Зависит от конкретных молекулярных генетических процессов, таких как репарация, дополнительный синтез ДНК, амплификация или пуффинг (Буторина, Исаков,1991). В этом случае спектр исследований генетических механизмов, связанных с реализацией индуцированных мутагенами повреждений, зна чительно расширяется.

Очевидно, чем активнее в генетическом плане специализированные клетки, тем с большей вероятностью происходит реализация повреждений в мутации или их восстановление.

Напротив, в генетически неактивных, . неделящихся, наприме] в клетках почки растений в период покоя, повреждения могут существовать длительное время.Их реализация или восстановление происходит в момент активного функционирования генетических ло-кусов в начале вегетационного периода при дифференциации неспециализированных инициальных клеток почки.

Открытие свойства индуцированных мутагенами повре?гсдений переходить из недифференцированных, инициальных клеток в дифференцированные показывает, что процессы передачи повреждений носят общий характер.

Установление факта неспецифического характера действия мутагенов различных классов в индукции повреждений, реализующихся в мутации во время,отдаленное от момента воздействия,имеет не только теоретическое значение в плане доказательства эталнос-ти мутагенеза, но и указывает, что облучение и использование гербицидов может приводить к отдаленным генетическим последствиям и канцерогенезу.

Впервые в мировой практике при исследовании последствий острого и хронического облучения в малых дозах в результате аварии на Чернобыльской АЭС осуществлен комплексный подход при анализе морфологических, хромосомных и биохимических изменений на одних и тех же тест-растениях сосни обыкновенной. Причем, поглощенная доза определялась на основе ТЛД-дозиметрии, что позволило корректно интерпретировать полученные результаты.

Практическая энач;алость работы состоит в том, чго установление мутагенного характера действия гербицидов, радиации и алкилирующих мутагенов позволяет оценить их отдаленные генети-

эские последствия, внести изменения в гигиенические принципа эрмирования химических соединений. Это позволит, в конечном чете, изменить ассортимент, технологию и стратегию применения имических средств и радиации в народном хозяйстве. Результаты ^следований индуцированных морфологических, хромосомных и 'Юхкмических изменений при облучении древесных растений в ре-/льтате аварии на Чернобыльской АЭС капли широкое применение 1Я оценки радиочувствительности, изменений в генотипической фуктуре популяций, жизнеспособности насаждений, что послужило :новой для разработки практических рекомендаций по ведению зсного хозяйства в зоне радиоактивного загрязнения и составлено прогнозов экологических последствий аварии на ЧАЭС.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались получили положительную оценку на научных семинарах и Ученых )ветсх Института общей генетики АН СССР (1973,1974гг.), Всесоюзно научно-исследовательского института биологических исследо-¡ний АК СССР (1974-1977гг.), Всероссийского научно-нсследователь-:ого института химизации лесного хозяйства (1977-1991 гг.), на ¡рвом Советско-американском симпозиуме (Москва, 1974 г.), >етьей Всесоюзной конференции по теоретическим вопросам мутагена (Вильнюс, 1980),Первой Всесоюзной конференции по ликвидации следствий аварии па ЧАЭС (Обнинск, 1989),Первом всесоюзном дисбиологичсском съезде (Москва, 1989г.), Первой и второй все-юзпых конференциях по ликвидации последствий аварии на ЧАЭС ернобыль, 1989,1990 гг.),Первой международной конференции иологические и радиоэкологические аспекты последствий аварии ЧАЭС (пос.Зеленый мыс, 1990 г.), на совещании Европейского общества по атомной радиации (Брюссель, 1991 г.).

Объем и структура работы. Диссертация представлена в форме учного доклада по совокупности опубликованных научных работ, стоит из введения, 7 глав, выводов и списка основных опублико-нных по материалам диссертации рг'ют.

.Личный вклад автора заключается в обосновании проблемы,раз-ботке методических подходов, экспериментальных моделей, получе-и, обработке и обобщении экспериментальных результатов, форму-роьелии научного направления.

Объекты и методы исследований. В качестве тест-объекта при исследовании возникновения аберраций хромосом в двух последовательных клеточных делениях*при действии радиации, этиленимина и гербицидов использовали семена0гсрз.г с.-рШт!?, Четкое морфологическое различие по величине к форме хромосом, обозначаемых ка1 А,Д,С, позволяет проводить детальный анализ структурных мутаций, включая симметричные транслокации. Существенно, что клетки семя! естественно синхронизированы в с,-фазе. Параметры первого клеточного цикла изучены в работе Протопоповой с соавторами (Протопопова и др., 1967).

Для характеристики клеточной популяции в двух последовател! ных митотических циклах мы проводили авторадиографические экспе] менты с применением специфического меченого предшественника биосинтеза ДНК Н3-тимидина. Установлено, что пик митотической а! тивности наступал через 10-12 часов после отмывания 5-аминоурац! ла с падением количества меченых митозов к 14 часам. Этот резул! тат позволяет сделать заключение, что через 12 часов после отмывания 5-амироурацила клетки вступают в Б -период (Сидоров,Маке-донов, 1974).

Следовательно, 24-часовая обработка прорастающих семян ингибитором синтеза ДНК приводит к появлению четко выраженной синхронизации клеточных делений. Молекулярный механизм синхронизирующего действия 5-аминоурацила на различных объектах был изучен в ряде работ (Мсо!) щ<1 Тг.-.в1:о ,1965; I гспП-.у ,-гЛ 1965; СеИ 1пс1у ,19(35; "г-Ьег гпй 11г.у1йг;оп ,1971; Пс'аеиегтпп гп(3 К1рГГке-ЪрЪп1оа 1973). В нашей работе на клетках о герз.^

cf.pill-.ris было установлено, что 5-аминоурацил замедляет теш репликативного синтеза, что приводит к накоплению клеток в Э -периоде (Македонов, Сидоров, 1975).

Таким образом, нами была разработана экспериментальная модель с точными параметрами клеточного цикла в двух последовател! ных клеточных делениях (рис. 5). Это позволяет маркировать цито-генетический эффект мутагенов по типу и времени реализации стру турных мутаций хромосом в зависимости от фазы клеточного цикла, в которой проводилась мутагенная обработка на протяжении двух последовательных митозов, а также проследить за реализацией нескольких типов первичных повреждений в условиях торможения сшгге: ДНК.

При изучении количественных закономерностей и механизмов реализации повреждений, индуцированных радиацией и химическими мутагенами в аберрации хромосомного и хроматидного типов в двух последовательных клеточных делениях, использовали метод модификации ингибиторами синтеза ДНК 5-ам:;ноурацилом (5-АУ) и 5-фтордезоксиуридином (ФУДР).

Структурные мутации хромосом в клетках хвои сосны обыкновенной при действии радиации и гербицидов изучали анафазньм методом по специально разработанной нами методике при проращивании семян в лабораторных условиях (Сидоров и др., 1309).

Исследование спектра изофер:»;сктов пероксидазы в хвое сосны проводили методом электрофореза в полиакриламидном геле на различных стадиях онтогенеза сосны при облучении на гамма-установке ГУЛОС и действии хронических мачых доз радиации в результате аварии на ЧАЭО.

Анализ морфологических изменений, аберраций хромосом и генных нутаций, контролирующих синтез изофпрмептоз пероксидазы,проводили 1а одних и тех же тест-растениях сосны обыкновенной.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПКРЖга 1ТЛЛЫШХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Современная теория хромосомных мутаций должна базироваться 1а экспериментальных результатах по анализу молекулярной природы нервичннх повреждений, индуцированных мутагенами различного типа действия и внутриклеточных процессов, при которых происходит эеализация повреждений в структурные мутации. По картине конечно го цитогенетического эффекта мм пытаемся проследить последова-■ельность событий, происходящих в клетке, начиная с момента му-•эгенного воздействия до периода фиксации повреждений в мутации ! представить их в конкретных молекулярных терминах.

В результате экспериментальных исследований, проведенных >анее, было сформулировано представление о том, что в момент или ;ппосрсдсгьспно после мутагенного Лозл/^гстгня в ДОС хромосом ормируются потенциальные повреждения и дана их подробная класси-■икацин (Дубинин и др. 197%1СЛ',9,1970). Предполагалось, что в роцосеп реализации в струкгурныо мутации хромосом происходит меньшонне числа повреждений за счет пострадиационного восстонов-сния и, что вероятность их реализации раина единице. Считалось

также, что при действии гсжа-лучеГ. в б, -пер:',оде воэникаиг исключительно аберрации хромосомного типа, а цптогенетический эффект проявляется полностью в первом пострадиационном клеточном делении. В этой связи ионизирующую радиацию принято было относить к мутагенам с так назьгааемь,м"незадер::;ан1шм" типом действия (ПгЛг.'г. ,1963,1964).

Напротив, при действии этиленимина в пресинтетическом периоде аберрации хромосомного типа но наблюдаются. Хроматидные аберрации возникают лань ь тех клетках, которые продли репликацию ДНК. Поэтому алкилиругащие соединения относили к мутагеном с "задер/лапнкм" типом действия ( ,1963,19о4¡Немцова,1965).

Работы пс изучению мутагенной активности гербицидов в двух последовательных кл01 очных делениях в литературе до нсаих исследовании отсутствовали (Сидоров, 19159).Можно предположить, что их генетическая актишюсть ограничивается лишь перьем клеточным делением (Касьянепко, Королева, 1972; Курпнный, Иилинская, 1976).

Однако, к? к было показано в дальнейших роботах (Тарасов, 1973,1975; Сидоров, 1974-1991), ни одно из перечлслсннъ'х предположений полностью не подтвердилось.

Для выяснения природы первичных повреждении, индуцируем;« мутагенами различного типа, таких как гамма-лучи, ятиленимин и гербициды, механизмов их реализации в хромосомные мутации, воз-душо-сухис и прорастающие семена крспис однократно облучали и обрабатывали химическими мутагенами в сп -периодах. Аберрации хромосом анализиро!али г двух последовательных митотичееких циклах.

i. возникновение авьггсэдЗ! хгишя в дьух пс&рлршшшкх

щ1кллх ПРИ ДЙ'СТЬИй гл1и-л"!ся,0тглл13я21а и РЕРБ;?[ИДОВ

При облучении воздушно-сухих с-емпн в диплоидных клетках возникает в основном аберрации хромосомного типа. Однако облучение прорастающих семян приводит к появлению значительного числа хромосомных ч хроматиднгх аберрации как г диплоидных, так и в тетраптопдных клетках (Сидоров, 1974; рис. I).

Во всех изученных концентрациях огиленпмг.н р диплоидных клетках индуцирует преимущественно хроматидные аберрации. Однгко при действии этиленимина в высокой концентрации наблюдаются аберрации хромосомного типа. В тетрапдопдных клетках наряду с размне-

Pre Л Д'Ъ ГЧц;'.;' >РС"-ГГО'\ Г:"^!'1^" ПП< i ''CT й>М ГЭ^'Ч-^че^.

женными аберрациями хромосомного типа, переведшими из первого митоза, мы наблюдали одиночные вновь возникшие хроматидные аберрации. При действии этиленпмина на прорастающие семена выход хроматидных аберраций значительно увеличивается по сравнению с обработкой воздушно-сухих семян (рис. 2).

Все исследуемые гербициды: 2,4-Д, глифосат, бутифос, пикло-рам и дипиридилфосфат при действии в G> -фазе первого митоза в концентрациях от 0,001 до 0,1$ индуцируют в основном аберрации, хроматидного типа (рис. 3),что позволяет их отнести к мутагенам типа алкилирующих соединений. Более высокие концентрации гербицидов (1%-Ю%) полностью блокируют клеточные деления.

При обработке гербицидами в фазе синтеза ДНК наблюдаются аберрации как в диплоидных, так и в тетраплоидных клетках. Основным типом являются хроматидные аберрации, однако наблюдаются и одиночные вновь возникшие аберрации хромосомного типа, т.е. герби циды, как радиация и алкилируюцие мутагены, индуцируют в ДНК хромосом повреждения, способные проходить два цикла репликации и реализоваться в хромосомные аберрации ь диплоидных и тетраплоидных клетках. Мутагенез, как и при действии радиации и этиленимина имеет продленный характер. Не наблюдается линейной зависимости выхода аберраций от концентрации гербицидов. Отсутствие подобной зависимости объясняется тем, что из-за сильного цитотоксич-эского эффекта, очевидно, нарушаются процессы деления клеток и,следовательно, реализации повреждений. Однако эти повреждении существуют в ДНК хромосом длительное время, носят так называемый "скрытый" характер (Дубинин, Македонии, 1972) и могут выявляться при допол нителыюм воздействии ингибитором синтеза ДНК 5~лминоурац'ллом,как ото показано нами на примере бутифоса.

Таким образом,полученные нами экспериментальные результаты свидетельствуют о том, что цитогепстический эффект гамма-лучей, этиленимина, иптрозсыетплмочсьипы и гербицидов при однократном воздействии в с.,-з -фазе не ограничивается первым клеточным циклом, а определенная часть повреждений проходит две репликации ДНК и реализуется в аберрации ь тетраплоидных клетках. Молекулярной основой для образования cuрукгурнкх мутаций гнляргся повреждения ДНЬГфомосом.

В экспериментах с изолированной и облученной in vivo Д1гК показано, чго в последней ьозмихаиг одно- и дьунитоы-'е ралрысы (Цейтлин и др.,1967; Пвзлних.Глбченко и др.,19С5;Тарасов, 19У2).

АБЕРРАЦИЯ НА 100 ИЕТЙМ1

г.<>-1 г п цп зи МВДНИЕ КЛЕТКИ

КИЯ

1—1

г.«-» г и цп эк

ТЕТРШОЙЛНИЕ КЛЕТКИ

н«м

Рис.3 *о.?ичэ::еэ а$еррац.иА хрокосзн, индуцированных гербицидами к диплоидных и тетраплоидных клетках. К - контроль; 2.4—Д; Г - глк^асат; П - пиклорап; ЛЯ - дипиридил»ос1ап 5И - этиленииин; НИМ - нитрозонешпочееина

Алкилирующие мутагены, в том числе и этиленимин, индуцируют повреждения, искажающие вторичную структуру ДНК (Уланов и др. 1950; Фриз,1954; Тарасов, 1982).

Однако, как было установлено позднее, на фоне основных первичных повреждений, характерных для данного типа мутагенов (однонитевке разрывы для ионизирующей радиации п алкилирован-ные нуклеотиды для химических мутагенов "задержанного"типа действия), могут возникать и другие первичные повреждения.Например, односпиральныс разрывы для алкклирую'фх мутагенов (еЪ &1., 1971; vcier.ir.nicy 1972) и повреждения, способные реализоваться в хроматидные аберрации при прохождении синтеза ДНК для ионизирующих излучений. Очевидно, начиная с определенной дозы мутагенов, число таких неосновных для данного мутагена повреждений возрастает настолько, что приводит к заметному изменению цнтоге-нетического эффекта, а именно, при облучении в с, -периоде возникают хроматидные аберрации, а при действии химических мутагенов - аберрации хромосомного типа,что и доказано в наших экспериментах. Следовательно, деление мутагенов на "задержанный" г "незадержанный" типы действия является весьма условным.

•Более того,как следует из наших экспериментов этиленимин и гамма-лучи при однократном воздействии в с., -периоде пндуц-.фуют в ДНК хромосом по крайней мере три типа первичных повреждений. Первый тип повреждений реализуется в пределах о, -фазы первого митоза в аберрации хромосомного типа; второй тип проходит одну репликацию ДНК и реализуется в хроматидные аберрации в диплоидных клетках и третий тип - проходит две репликации ДНК и реализуется в хроматидные аберрзции в тетраллоидных клетках.

Следовательно, реализация индуцированных мутагенами повреждений различного типа происходит спустя длительное время после однократного воздействия, а вероятность их реализации- в аберрации хромосом не равна единице и очевидно будет зависеть от конкретных генетических процессов, протекающих в той или иной фазе мито-тического цикла. с.

Таким образом, полученные нами экспериментальные материалы свидетельствуют о недостаточности и весьма условном феноменологическом характере классификации потенциальных повреждений на коротко- и длительноживущие (Дубинин,Лкифьев,1989). Опровергают представления о незадержанном и задержанном характере действия радиации и алкилиру#!ди* соединений. Все изученные нами мутагены

очевидно еле,дует признать опасными с точки зрения отделенных генетических последствий.

Естественно предположить, что молекулярная пр/рода попреж-дений, переходящих два цикла репликации ДНК, долит существенно отличаться от повреждений, реализующихся б аберрации хромосомного и хроматидного типов в первом клеточном делении. Доказательством справедливости высказанных предположений могли бы быть экспериментальные результаты по различной кодификационной способности повреждений различного типа ингибитором синтеза ДНК 5-амино-урацилом.

2. ВОЗНИКНОВЕНИЕ АБЕРРАЦИЙ ХРОМОСОМ В ДВУХ ЛССЛЕДОВАТЕЛЬШХ КЛЕТОЧНЫХ ДЕЛЕНИЯХ В УСЛОВИЯХ ЬЮДИФИКАЦИИ 5 -АМИ1ЮУРАЦИЛОМ

В литературе сложилось хорошо обоснованное представление о том, что возникшие в Д1К под действием мутагенов повреждения неоднозначно приводят к появлению структурных хромосомных аберраций. Эти повреждения являются продмутационными к связаны с появлением хромосомных аберраций вероятностно, при этом вероятность их появления зависит от характера протекания внутриклеточных процессов уже после действия мутагенов. Такими процессами, которые в конечном счете и определяют переход первичных повреждении в фиксированные хромосомные мутации, являются процессы так называемого пострадиационного восстановления и реализации (Лучник, 19Г>8; Дубинин, Тарасов,1909; Тарасов, 1975).

В последнее время появились экспериментальные данные, позволяющие конкретизировать эти общие феноменологические представления о процессах мутирования. В первую очередь ото относится к результатам, полученный при изучении процесса репарации ДЦК,роли репликации в трансформации определенных типов повреждений, возникающих при действии мутагенов, а также роли генетических процессов, протекающих в клетке ь норме. К таким процессам относится дополнительный, не индуцированный мутагенами синтез ДНК, протекающий в пред- и пострепликатишыи периоды ( ^ог'^с'.че -1. ,1907, 1969,1970; С1е:ус-г ,1969; с^ •1., 1970), и сьязанный

с ним процесс возникновения однонитевых брешей по длине хромосомной ДНК (Тарасов, 1975).Предполагается, что эти процессы наряду с различными типами первичных повреждений, возникающих в ДМ

хромосом при действии мутагенов, будут определять специфику опро-текаиия мутагенеза как в количественном, так и в качественном отношении.

В связи с этим в качестве инструмента для выяснения природы первичных повреждений и некоторых этапов формирования хромосомных мутаций мы использовали ингибитор, подавляющий синтез нормальных предшественников оснований ДНК.

Наличие такого процесса в -периоде, при котором в ДНК сначала возникают спонтанные бреии, а затем застраиваются с помощью дополнительного синтеза, показано в ряде работ (Djordje-Vic ct al.,1967; Cleaver ,1969; Evan? et 5,U970; Парибок,Семенова, 1971; Акифьев, Айнгорн, 1971). Установлено, что дополнительный синтез чувствителен к таким ингибиторам как Ь-фггордезаксиури-дин и гидроксимочевина ( Vrunamoto ot- al. ,1959; Yu, Sincler , I960; Oche;-, нчч ,I9Gü; Акифьев, Айнгорн, 1971).

В настоящем разделе работы изучен цитогенетический эффект этиленимина и гамма-лучей при введении ингибитора синтеза ДНК б-аминоурпцнла в конце п,-периода. В этом случае удается специфически и деленапреклонно блокировать генетические процессы, протекающее в норме, и тем самым выяснить их участие в возникновении хромосомных мутаций в зависимости от типа первичных повреждений.

Как следует из наших экспериментов (рис. 4),под действием гамма-лучей в первом клеточном цикле в основном наблюдается возникновение аберраций хромосомного типа. Введение ингибитора синтеза ДНК сразу после облучения приводит к увеличению час-готы аберраций хромосомного типа. Следовательно, 5-оминоурацил оказывает влияние на процесс, протекающий в с, -периоде нитотического цикла, увеличивая вероятность реализации индуцированных радиацией повреждений в стадии предсиптеза. Очевидно, при торможении дополнительного синтеза ДНК С-пминоурпцнлом время жизни спонтанных однсспирэльпых брешей увеличивается, следовательно, возрастает и вероятность их совпадения с индуцированными радиацией разрывами. В результате мы наблюдали увеличение выхода аберраций хромосомного типа в диплоидных клетках, необходимым условием для образования которых является двунитевой разрыв.

Правильность такого вывода была убедительно подтверждена в нашей работе и с 5-фтордсзокоиурндином, который вводили в 6, -периоде до облучения (Тарасов,Сафонова,Сидоров,I97G). Блокируя дополнительный синт23 да тем самым кок бы накапливали спонтанные

бреши, возникающие регулярно в строго определенных местах ДНК хромосом,т.е. в генетически активных локусах. Существование таких локусов, в которых происходит образование аберраций с повышенной частотой, показано на примере околоцентромерного участка длинного плеча П хромосомы (Шевченко, 1968).

В ная'ей работе по модификации 5-аминоурацилом цитогенети-ческого эффекта радиации и протекторов также обнаружено большое число гепов, хроматкдных и изолокусных разрывов в околоцентромер-ном участке у хромосомы (Сидоров,1981). Полученные экспериментальные данные с ингибиторами синтеза ДНК свидетельствуют в пользу того, что аберрации хромосом с повиненной частотой образуются в генетически активных локусах хромосом, где протекает дополнительный синтез ДНК (Лкифьев, Айкгорн, 1971; Тарасов, 1975).

В специальных опытах нами показано, что при облучении и введении в конце с > -периода 5-аыиноурацила в смеси с тимпдином модифицирующий эффект полностью исчезал.Из этих данных следует, что, по крайней мере в наиих экспериментальных условиях, сенсибилизирующий эффект 5-аминоурацила, по-видимому, связан с возникновением деф.ицкта по тимидинтрифюсфату ( ОХег.уег ,1959), который необходим для дополнительного синтеза ДНК.

Таким образом установлено, что при торможении дополнительного синтеза ДНК 5-аминоурацилом и 5-фтордезоксиуридином вероятность возникновения аберраций хромосомного типа в с 1 -периоде возрастает. Образование полных разрывов ДНК хромосом происходит путем совпадения индуцированных однонитевнх разрывов с разрывами, образующимися в результате протекания нормальных генетических процессов.

Наряду с аберрациями хромосомного типа, радиация, как и этиленимин, индуцируют хроматидные аберрации в с,-периоде клеточного цикла. Однако обращает на себя внимание принципиально разная реакция хромосом в ответ па постмутагеннос введение 5-аминоураци-ла. Если при облучении число хроматидкых аберраций в первом клеточном цикле растет, то количество.аберраций этого типа, индуцированных атиленимином, резко снижается. Причина этого может заключаться в тем, что в основе хроматидных аберраций, индуцированных радиацией и алкилируощпм мутагеном, лежат различные типы первичных повреждений.

Б случае ионизирующего излучения такими повреждениями,' очевидно, являются однонитевые разрывы, возникшие непосредственно в результате взаимодействия квантов излучения с молекулой ДНК и дожившие до стадии репликации хромосом.

При действии этиленкмина - это алкилкро ванные нуклеотиды, дающие бреши в оппозитных . местах во вновь синтезируемых нитях ДНК в з -периоде клеточного цикла. Последний процесс в настоящее время описан как для пиримидкновых димероЕ, возникающих при УЕ-облучении ( Ьектг-п ,1972), так и для повреждений, индуцированных рядом алкилирующих мутагенов ( КсФегЧи, Иагй ,1973; "Гга51:с ct а1. ,1973). Следовательно, механизм образования хроматидных аберраций в диплоидных клетках в случае индукции радиацией одно-нитевьгх разрывов, а ал копирующими соединениями - повреждений, искажающих вторичную структуру ДНК хромосом, будет различен. Во втором случае доя образования хроматидного разрыва потребуется дополнительная стадия вырезания повреждений типа димеров и алки-лированных нуклеотидов или рспликативный синтез.

Кроме аберраций, возникающих б первом митозе,радиация и этиленимин индуцируют аберрации хромосомного и хроматидного типов во втором клеточном делении. Если допустить, что а осниВс индуцированных радиацией аберраций хромосомного и хроматидного типов, реализующихся в первом митотическом цикле,лежат одноните-вые разрывы, то вторым классом повреждений, реализующихся в аберрации хромосом в тетраплоиднь'Х клетках, однонитевые разрывы быть не могут. Полагая, что хромосома двунптчата, трудно представить, каким образом однонитевые разрывы могут пройти стадию репликации и перейти во второй клеточный цикл в скрытой форме. Следовательно, в основе аберраций,индуцированных радиацией и реализующихся во втором клеточномгрлении,лежат повреждения другого типа, по-видимому аналогичные тем, которые возникают при действии этиленимина. Этот тип повреждений и определяет цичогенетический эффект радиации во втором клеточном цикле. Подтверждением однотипности молекулярных повреждений, пнгуцнрпьанных радиацией и эгиленими-ном, рсатизуюцпхея в тетраплоидных метких, е-луяпт одинаковая реакция этих поврездений в сторону уменьшения выхода аберраций на введение ингибитора синтеза ДНК С'-аминоурацила. Уменьшение выхода аберраций в тетраплоидных клетках,очевидно, связано с торможением репликативного синтеза ДНК. В этом случае клетка имеет больше времени для репарации псЕрекдснпй, реализация которых приз

рочена к фазе репликативного синтеза. Идея о эффективности р*.' парации повреждений, искажающих вторичную структуру ДНК и экспериментальные исследования механизма образования аберраций хромосомного типа, путем совпадения повреждений в изолокусе подтверждены в блестящих работах Салганика и Карамыпевой с соавторами (Солганик и др.,1981; 1Сарамызева и др.,1991).

Таким образом, в этой серии экспериментов установлено,что в диплоидных и тетраплоидных метках возникают аберрации как хромосомного, так и хроматидного типов, что подтверждает вывод о том,что этиленимин и- гамма-лучи индуцируют по крайней мере три типа первичных повреждений. Первый тип (однонитевые разрывы) реализуется в аберрации хромосомного типа в пределах С, -фазы путем совпадения в изолокусе с однонитевыми разрывами, образующимися при протекании генетических процессов.

Второй тип в процессе репликации ДНК реализуется в хрома-тидиые аберрации.в диплоидных клетках. Основой для их образования могут быть как однонитевые разрывы, индуцируемые непосредственно под действием мутагенов,.так и однонитевые разрывы, образующиеся в комплементарной нити ДНК напротив алкилированных нуклеотидов или димеров.Третий тип проходит две репликации ДНК и реализуется в хромосомные и хроматйднке аберрации в тетраплоидных клетках, что и определяет продленный характер мутагенеза. Причем с помощью разработанной нами методики впервые удалось установить, что аберрации хромосомного типа являются не перешедшими из первого митоза ео Еторой, а вновь возникшими б тетраплоидных клетках. Механизм образования хромосомных и хроматидньтх аберраций зависит как от типа первичных повреждений, так и от конкретных генетических процессов, протекающих в той или иной стадии клеточного цикла. Дополнительные сведения о свойствах первичных повреждений и их модификации при различных этапах мутагенеза могут быть получены в экспериментах по совместному действию мутагенов различной природы.

3. ЦИТОГЕНЕГИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ СОВМЕСТНОГО ДЕЙСТВИЯ ГЛША-ЛУЧЕЙ И ЭТИЛЕНИМИН

Различия в цитогенетическом эффекте ионизирующей радиации и алкилирующих агентов, по-видимому, в первую очередь, обусловлены спецификой первичных молекулярных повреждений ДНК. Можно полагать, что вторая мутагенная обработка изменяет вероятность реачизации повреждений, индуцигсоаниых первым воздействием, за счет химичес-

ких изменений в ДНК, так как этапность мутагенеза - это процесс превращения первичных повреждений, в том числе их переход в химически стабильное состояние. В этом случае взаимодействие различных мутагенных факторов будет основано главным образом на модификации структуры ДНК. С другой стороны, изменение цитоге-нетического эффекта при комбинированном действии мутагенов может быть связано с влиянием на внутрихромосошше процессы, такие как репликация и дополнительный синтез ДНК, т.е. процессы, приуроченные к определенной фазе митотического.цикла. Следовательно, эффект взаимодействия мутагенов может изменяться в том случае, если повторное воздействие оказывает влияние на протекание нормальных внутрихромосомных процессов, при которых временно нарушается структурная целостность ДНК хромосом. Чтобы факты цитогенетических исследований были адекватны поставленной вше задаче, опыты должны планироваться таким образом, чтобы первое и второе мутагенное воздействие было не только разделено каким-либо интервалом времени, но и осуществлялось в строго определенной фазе митотического цикла.

Экспериментальная модель по изучению совместного действия этиленимина и гамма-лучей в различные периоды митоза представлена на рис. 5. Семена крепис обрабатывали этиленимином в концентрации 9,3Л0-3М три часа, мутаген отмывали и проращивали на фильтровальной бумаге б часов, а затем облучали гамма-лучами в

и с„-фазе первого митоза (вар.1,2,3) и с, -фазе второго митотического цикла (вар.4).

В этой серии экспериментов установлено, что в диплоидных клетках совместная обработка этиленимином и гамма-лучами в 2,-

-периоде Приводит к резкому увеличению цитогенетического эффекта по сравнению с суммой эффектов отдельных мутагенов (Сидоров к др. 1974). Все 100# клеток оказались пораженными. Хромосомы полностью пульверизованы на микрофрэгменты, которые в большинстве своем представлены микрокольцвми. Сверхаддитивный эффект обеспечивается за счет увеличения выхода аберраций хромосомного типа, изолокусов без воссоединения и в особенности микрофрагментов. Выход аберраций хроматидного типа несколько снижается. Во втором клеточном цикле число аберраций как хромосомного, так и хроматидного типа не превышало аддитивный уровень (рис. 6). Иными словами, дополнительное облучение увеличивает вероятность реализации повреж-

Фиксация диплоидных Фиксация тетра-^

клеток плоидных клеток

I 2 3 гамма- гамма- гамма-лучи лучи ■ лучи [ —1 —1 4 гамма-лучи 1

ЭК 5-АУ

3 отмы- прора- 24 отмы- прора- колхи-■¡а- воние щивание ча- вание щива- цин са I час 6 чес са 15 ние Зчаса мин 9 час откыва- прора- колхи-ние щива- цин 15 мин ние Зчаса 12час

с 1 -фаза ' 3-фаза 2- -фаза с > -фшза 3 -фаза с-~-фаза

м2

Рис. 5. Экспериментальная модель по изучении совместного действия этиленимина и гамма-лучей (1-4 варианты опыта)

декий.индуцированных этиленимином,в пределах первого клеточного цикла. Наблюдается своеобразный эффект дереализации повреждений, индуцированных этиленимином. Более того, анализ динамики выхода аберраций в различные сроки фиксации показывает, что реализация первичных повреждений, индуцированных этиленимином, не только усиливается в результате повторного облучения, но при этом для хроматидных аберраций форма кривых в случае раздельного и совместного действия практически совпадает (рис. 7). Очевидно в' местах алкилировзния ДНК сенсибилизирована к действию радиации.

Другая возможность, способная обсспечпгь изменение цитогене-тического эффекта при совместном действии мутагенов, может быть связана с взаимодействием первичных повреждений, индуцированных в ДНК каждым из мутагенов в отдельности.

Установлено, что удаление повреждений, искажающих вторичную конфигурацию молекулы ДНК типа димеров и алкклированпых нуклео-тидов, протекает довольно медченпо ( СгаЗЗаск ,1969; Нагхксгаз еI а1. ,1971). Следовательно, в случае предрадиационной об-

работки этиленимином в момент радиационного воздействия число индуцированных химически;.', мутагеном повреждений заметно не изменяется, так что в хромосомах существуют практически все индуцированные повреждения. В этом случае застройка индуцированных

♦о

35 30 25

ЙКРРЙЦК* НА 100 ИЕТА*йЗ го

270

г«

гю

180

150

120

гт

270 (40

сю

190 150 120 90 (0 30

та.,.

/ !

1ЯПЛЭИХНЫЕ ИШ1

ЭИ*¥-лучн*5АЗ

270 240 210 180 150 120 90 ¿0 30

и /

270

240

210

180

150

120

Г*

ЗАВ У-«учи«5АУ ЗИ»5А!1

НТРЙШИЩНК ЮТ»

Рис.Ь Тип» и частота Иелрацт хражгсон, ммимях • ре1у«тте сммсткага я ридвитсго дейетаи! ЭИ и У-дучей I 61-триадс первого нитотшеского цикм ■ метках Сори сарШагм

хрокатиднке

* хроносапнм

С-«

а 4

^ 2

Р,

о 0

•о

С1

---- 3

Рис. 7.

52 46 44 40 36

2сЗ

16 0

I 2 3 4 5

Динамика выхода аберраций хромосом при совместном действии ЭИ и ¥ -лучей а - хромосомные и б-хроматидные аберрации; I - ЭИ,2,3.10" М; 2 - У -лучи, 20 Грей; 3 - ЭИ + у -лучи; 1-5 - номера фиксации

радиацией однсспиральных брешей, располоаеинь'х б оппозитных по отношению к ачкил кроватным нуклеог'идам участках молекулы ДНК, может быть в значительной мере затруднена. Время жизни таких брс шей увеличивается и, следовательно,возрастает вероятность образования полных разрывов ДК и их реализации в аберрации хромосомного типа в •;-, -периоде первого клеточного деления. Однако предположение о нарушении процессов репарации односпирольных разрывов, индуцированных радиацией, не дает исчерпывающего представления о механизме возникновения двуспира [ышх разрывов, являющихся необходимым условием при образовании аберраций хромосомного типа в первом после воздействия радиации митозе.

Как показано в нашей работе по модификации эффекта гамма-облучения ингибиторами синтеза ДНК [З-амшюурацшюм и 5-фтордезик-сиуридином (Сидоров, Тарасов, 1979; Тарасов, Сафонова,Сидоров, 1976), механизм появления д.чуспирелыачс°разрывов молекулы ДНК хромосом заключается в совпадении индуцированных радиацией одно-спиральных разрывов с разрывали, образующимися в оппозиций цепи ДНК при протекании дополнительного синтеза ДМл, не индуцированного мутагенами (Парибок, Семенова,1971 ;Лйнгорн,Лкиф:.ев, 1971,1972). Следовательно, торможение дополнительного синтеза ДНК может в значительной степени увеличить эффект совместного действия мутагенов в с,-периоде.

Этот вывод подтверждается экспериментами, где повторное облучение осуществляли в о - и -периодах первого клеточного деления и в а, -фазе второго митотического цикла (вар.2-1), т.е. после удаления из среды 5-амшоурацила. Ни в одном ил этих экспериментов не получен сверхадцнтирный эффект. Следовательно, взаимодействие между двумя мутагенами, приводящее к сверхаДднтивпому эффекту, осуществляется лишь г том случае, когда н результате мутагенной обработки подавляется шутрихромосошкй процесс, протекающий в той или иной фазе квтотнческогс цикла. При этом возникновение аберрации происходи г ь тс::-: мостах хромосом, где проходят активные генетические процессы, связанные с. 1-ременным нарушением структурной целостности ДНК.

И наконец, один или 1.6а из используемых мутагенов могут 1л::.пгъ на метаболические системы клетки (Кузнецова, 1973), обуславливающие прпгеканио п;ч-цессе1* 1.осстс.Ч'Л'лси»:я или реализации возникших локс-".ьных повреждений хромосом. В этом случае изменение

типов первичных повреждений и вероятности реализации при комбинированной обработке может определяться тем, что внутриклеточная система, ответственная за процессы восстановления, может быть сама чувствительна к мутагенному воздействию (Тарасов, 1975). Однако наиболее экспериментально обоснованными нам представляются два первых механизма, объясняющих сверхаддитивный эффект.

В другой серии экспериментов, где облученные семена подвергались воздействия этилонимином, сверхаддитивный результат установлен лишь в тетраплоидных клетках, т.е. в этом случае наблюдается своеобразная задержка в реализации повреждений хромосом (Сидоров, 1974). Различия в модифицирующем эффекте при изменении порядка действия мутагенов указывают на принципиальную возможность перевода части повреждении, индуцировзнных радиацией в , -периоде в длительноживущую форму, реализация которых происходит в процессе последовательных клеточных делений.

Таким образом, в экспериментах по раздельному и совместному действию радиации, апеллирующих мутагенов и гербицидов установлен продленный характер в реализации повреждений различного типа в ряду, последовательны;: клеточных делении. Показано также, что реализация первичных повреждений в аберрации хромосом происходит в местах протекания генетических процессов, связанных с временным нарушением структурной целостности ДНК хромосом в различные периоды интерфазы.

В этой связи представляло большой теоретический и практический интерес изучить закономгрности продленного мутагенеза на .другом растительно:.? объекте - сосне обыкновенной, позволяющем на одних и тех же тест-растениях учитывать хромосомные аберрации, биохимические кутании по изменению синтеза изоферментов перокси-дазы и морфологические изменения.

4. МОК&ОЛОШЧИСКИЕ И ХРОМОСОМНЫЕ ИЗМЕНЫШ У СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ ПОД Д$£ПОД| ШБлВДОВ

При действии гербицидов у др;."■'•.есных растений могут возникать морфологические изменения, которые, как правило, носят временный характер. Впоследствии рост и развитие растений восстанавливается. С другой стороны, многие гербициды обладают мутагенной активность:? (Куринный, Нилинскпп, 1976). В этом случае у растений возникают мутации, которые в подавляющее больгсингтпе лгллетея вредными,

ухудшают рост и развитие растений и очевидно могут передаваться из поколения в поколение при делении клеток. В этой связи нами было изучено действие пиклорака и бромацила на саженцы сосны, выращенные в вегетационных сосудах. В каждый вегетационный сосуд вносили строго определенную дозу изучаемых гербицидов (от 0,025 до 0,3 мг/кг почвы).

Как видно из таблицы I, под действием бромацила и пиклорама во всех изученных дозах возникают морфологические изменения побегов и хвои в год обработки саженцев сосны. Наблюдается четкая зависимость степени повреждения с увеличением дозы гербицидов. Бромацил в дозе 0,3 мг/кг почвы вызывает гибель и сильное угнетение саженцев сосны. В дозе от 0,1 до 0,025 мг/кг под действием бромацила возникают укороченные "кактусовидные" побеги, а в ряде случаев они полностью отсутствуют. Рост и развитие хвои на протяжении вегетационного периода претерпевает значительные изменен« Так, если в начале вегетации хвоя сильно угнетена, имеет бурую окраску и некротировапа, то в конце сезона происходит ее сильное развитие из верхушечных почек. Хвоя в этом случае имеет темно-зеленую окраску, мясистая, длинная.

По сравнению с бромацилом ппклорам обладает более сильным угнетающим действием. Доза 0,3 кг/кг вызывает сильное угнетение растений и их гибель в первый и второй годы после обработки.

Побеги имеют укороченную "кактусовидную" форму, полностью ли-дены хвои и точек роста. Доза 0,1 мг/кг вызывает также укорочение побегов, отсутствие и недоразвитие хвои. Под действием пиклорама и бромацила морфологические изменения наблюдаются и в следующий после обработки год. Поэтому вполне логично было предположить, что морфологические изменения, наблюдаемые в течение длительного времени,обусловлены изменениями на клеточном и хромосомном уровнях. С этой целью у саженцев с ярко выраженными морфологическими изменениями отбирали и фиксировали охвоенные побеги. Показано, что в клетках меристемы хвои пнклорам в концентрации 0,1 мг/кг почвы индуцирует повреждения хромосом в различные сроки роста (табл. 2).

Наибольший процент мутаций хромосом наблюдается в более поз,п ние сроки вегетации. Наличие хромосомных аберраций свидетельствует о сильном повреждении процессов клеточного деления, что на

Таблица I

!'«ор5олог;пэс:'л1э кзгензкгя, воо::п:<К1е у С8не!~т.ев сосна лсяде^сгвием

Сро;.:ец2ла пкклорама

Год

досади

;Гол

! Герб::-

!цпд 1

тгп„, ¡Количество :

,Ч-Мс1 [наблгкае:.^-:-: г

¡всего !

! ! С;) 1

лор:_.слог1гчес1а!е изменения

1978

побег

год наслпдекпя т—

1979

1578

1979

хвоя

1978 1576 контроль -

гкклорам

0,1 0,3 0,1

0,3

100

бромадил С,025 100 0,05 1С0

100

О 20

укорочеккий II глгз-з:" побег отсутствие глазного побега

II II

веерообразное располокение

отсутствие прироста

растения сильно угнетены

100 100

67 кактусов::*- Утаетоп- отсутствие нодоразви-

ная с.<ор"а побегов

жге побей: хвои

отсутствие прироста

тпе хвок

отсутствие хвои

II - нормальное развитие побегоз и хвок

Таблица 2

Частота и ткпы atícr.pamiii космосом, зпэдтдоовшзшх шхзорамом в клетках

ХЗОЛ СОСПН ОбШСШ&тЮЁ

Срок

i ::z:cc.

тлеза .j-VT/l-J? * ; П01ЗК

^срселсгзгчосгсго *"изменения побегов

d'cVu'ov^O-'

! клзтеге

Абер^аци: xpo.voco."

ВОСГО! .'.'СОТ!! ! Опзгмоктн

ibv i r.o.;:::- tira JXv

•:cc?-j ! чсство ! а:гг£:гз preciso jr.npfan no ' ' ! ! ' __

03.07.79г. к К 757 II т 1 ,4+0,4 3 0,4+0,2 8 1,0+0,3

од ка:сусов:кная 4SG :з 9 J ,"'+0,7 2 0,4+0,3 II 2,2+0,6

J- • 4.' < • ' w _ » к V 3.19 о П ^ Í Г,Г\ / 1 ^ » П 0 о 0,^+0,4

0,1 335 J.J. з, 0 ГУ II 3,1+0,2

I5.07.79r,, -Л 84? 12 — J И • О /1 1 > ± С о 1,4+0,/х

С, I 583 31 - J " . Л Г) I ->£- » ^ I г, ? 30 О , J. + . , „

X ta. кст* тс ель

7-7 - пер ;:слм:се разз::?; :е побэгов

феиоттшчоском уроыге гыражаотся в замедлен:::! пли иолио«- отсутствии хвои, появлении укорочен;¡ь,л и "кактусобидных" форм побегов.

Таким образом установлено, что гербициды при внесении в почву индуцируют у саженцев сосны разнообразные морфологические изменения побегов, хвои и почек, ухудшают их рост и развитие. Существенно, что морфологические изменения проявляются не только в первый после воздействия осгстацисглшП период, а наблюдаются в течение 2-3-х лет после прекращен:! л роздейсгвия. Это указывает на их тесную связь с повреждения:':: процессов клеточных делений и возник, овениег.; хромосомных аберраций, которые,как нами установлено, могут передаваться в процесс-1 Нчм'ледэ кегельных китотических делений и разные сроки развитая хио. . Однако процессы деления спецкллизировакных геристемшх клеток вклэча.)? в себя процессы ежегодной дпффирепцкровкн инициалм&х клеток ночкг. в клетки хвои, побегов и других органов в начале веге-.-ациеннего пзрнода и дедн-фференыировки клеток побеюв а клетки почки в кенце сезона.

Следовательно, естественно предположигь, что индуцируемые аоррендония переходят не только р.чд послсдорягельнкх синтезов Д:!д г.ри делении специализированных клотик,как ато было установлено над и на кропие и хвое сосны, но и г.средаются из клетки в клетку в процессе их днф^еренцнровкп и дециффергкцпровкп. В отом случае аберрации хромосом наблюдаются на сле.цу~дп? год поело обработки (таол.2). Более детальное изучение открытого наг.-« явленнл передачи позрецдеш?., инцуцррокшных гербицида;.и в процессе д-.цференци-ровки и деди'рференцировки кле.ток в точение нескольких вегетационных периодов, проведено на:.".: п последующих работах при облучении сосны в результате авария на Чернобыльской А2С в лабораторных :)ксаер;;мснтах при однократном облучен:;:: .: обработка мало перспс-тонтнм?.и гербицидами.

5. хрсасйшв изажн/д У СОСНЫ

ОБЫШОВЕННСЛ ига ОБЛУЧАЙ В РЕЗУЛЬТАТЕ АВАРИИ ПА ЧЬРНСБЫлЬСКОЛ АХ

Первые результаты у,о деЛс.ччгэ ионизирующих излучений на лесной биогеоценоз были выполнены зпруселажг:! автора.-.и в период с 1962 по 1972 it.('Vo>oxi ,196.:; ¡1 *л , 1903:1905). Более детально проблема р-\ц::оаколо:;:;: .: радиобиологи;', ле.-а изучены в сс-ногополагающих работах О'гечэетгецццх учс:;>::-:(Лле:;сах;:н ,1963,19с2; Ллекеахин и др. ,1970,1973,1977; К^рабань, Тихомиров, 1971; Тихомиров,1972; Кнра^ань, Прнетер, Алексах:::: :: др. ,1977;Т;'Хс:'Нр'-=, Седого?, Пр.'.стер, Ремезе?л, 1977; Кр..:гслу:.г,:;1. Тихомиров,

Федоров, Покаржевский, Таскаев, 1938; Шевченко, 1990).

Однако аналогов по изучению действия ионизирующих излучений на лесной биоценоз после аварии на Чернобыльской АЭС в мировой практике не было. Поэтому эти исследования имеют большое теоретическое и практическое значение.

В процессе поражения древесного яруса после аварии на Чернобыльской ЮС, можно Еыделить два четко различающихся периода. Первый - это пораж.ение леса за счет внешнего острого облучения в зонах с максимальной мощностью дозы (ЗД) и плотностью загрязнения радионуклидами. В этих зонах в первую очередь пострадали хвойные породы как наиболее радиочувствительные. Второй, более длительный период, охватывает несколько десятилетий с хроническим характером облучения. Нами установлено, что в начале второго вегетационного периода после аварии (19з7г.) достаточно четко выделилось четыре зоны поражения лесов. В зоне полной гибели доза облучения хвои за год составила 100 Гр и выше. В зоне среднего поражения погибли отдельные деревья хвойных пород. Лиственные были повреждены, но сохранили свою жизнеспособность. Доза облучения хвои достигала 50 Гр. В зоне среднего поражения (4-5 Гр) наблюдалась гибель хвои в нишей части кроны, точек роста и генеративных органов. В четвертой зоне при дозе 0,5-2 Гр видимого поражения не наблюдалось. На второй год после облучения в этой зоне у сосны наблюдалось большое число морфологических изменений (Козубов, Таскаев и др., 1990; Тихомиров,Сидоров,Козубов,Таскаев, 1992).

Продленный характер морфогенеза и хромосомного мутагенеза при действии радиации изучен нами на культурах сосных 10-12-летнего возраста и вновь созданных нами 1-3-лётних культурах на площадях с плотностью загрязнения от 5 до 10000 Ки/кьг. Мощность дозы измеряли прибором ДРГ-01Т. Поглощенную дозу радиации определяли методом ТЛД-дозиметрии. Дозиметры конструкции лаборатории дозиметрии МПУ позволяли оценить вклад бета и гамма-излучений. По нашим данным вклад бета-излучения в общую дозу в 3-10 раз превышает гамма-излучение. Доля"мягкой" компоненты с Е^- 50 кэВ не -превышает 6-10 процентов от "жесткой".

Наиболее характерные морфологические изменения приведены в таблице 3.

Таблица 3

Морфологические изменения у сосни обыкновенной в зависимости от

поглощенной дозы

(расчетные дозы за 1966 г. приведены на стр.32)

Вари-

Поглощенная доза Рад/год

Деревья с морфологическими изменениями в 1987г. (%)

Сумма | пожелтение • ппипос-п |Щ>обу-!гибель

! хвои ! прирост ! где гаю!центр.

|сла-|йе1с-1Уко- | „пп„ ¡Штан- {спящих¡верхуш.

¡бое ¡роз |роч. } Н0рм,!тск. ?почек !побегао

К 0,25 0,17 0,13

1 4,3 0,55 0,43

2 43 4,3 4,0

3 120,9 43 34,5

4 345,0 112,3 69,1

0,13 0,68 0 0 7 86 7

0,35 5,6 39 5 14 26 О

2,5 53,8 48 3 55 29 15

21,6 220,0 64 36 88 12 О

47,5 573,9 100 100

отсутствует

О 39 68 О О

О 2 3 12 100

Уменьшение величины прироста у большинства деревьев начинается при поглощенной в 1987 г. дозе 43 Рад. Полное отсутствие прироста наблюдается при дозе 345 Рад/год.

У некоторых деревьев наблюдаются сильно укороченные "какту-совидные" и "ананасовидные" побеги 1936г. Укорочение побегов прс исходило до такой степени,что листовые рубцы практически наклад! вались один на другой. Хвоя на таких побегах отсутствовала. К к'с цу вегетационного периода 1987 г. хвоя 1936 года в основном поп ла.На отдельных побегах текущего года хвоя отличалась более мои? развитие;/; и по длине превышала в 2-3 раза хвои I9cJo г.

При дозе 345 Рад в мае текущего 19^7 года признаков роста i культурах отмечено не было. При повторно:.; обследовании участка s конце вегетационного периода (октябрь) у деревьев отмечен рост коротких утолщенных 4-х гранных побегов с различными видоизменениями хвои и почек. Хвоя по форме кривая, мясистая, темная и кес кая у основания шириной до 4 мм. Длина побегов в центральной и нижней части кроны составляла 3-7 см, у вершины - 15-35 см. Кол* чество почек на таких побегах колебалось от I до 3-х и более. Пс размера!.; почки значительно превосходили контрольные, растущие нг площадях с более низкими мощностями дозы. У нескольких деревьев новые побеги появились прямо на стволах. Отмочено образовать 5-ти побегов на расстоянии 5,10,20 см от последней мутовки.

Пробуждение спящих почек у сосны наблюдалось только при малых дозах облучения (4,3-43 Рад). У 4-х деревьев были отмечень центральные почки, чешуйки которых раскрылись и образовали "звег дочку". При дозе 43 Рада почти у 100% деревьев на центральном побеге количество почек составляет 9-II шт. На боковых побегах -меньше. У некоторых деревьев отмечается образование "ведьминой метлы".

Как и в экспериментах с гербицидами у деревьев с выражении!: морфологическими изменениями мы фиксировали охвоенные побеги и в меристеме хвои анализировали хромосомные аберрации.

Установлено, что при действии радиации наблюдаются как абер рации хромосом, так и нарушения клеточных делений в количестве, достоверно превышающем контрольный уровень (табл.4). Спектр абер раций представлен хромосомными и хроматпдиыми моста-;и, микрофраг ментами. Специфика представленных результатов заключается в том, что при максимальной дозе, поглощенной за I9d7 г., уровень ш:.ду-

Таблица 4

Частота аоерраций ::ро;.;осом к нарушении клеточных делений в зависимости

от дозы облучения

Вапианты !Год ¡Поглощенная лсследо-! доза |вшня ! Рад/год

т1исло аберраций ! на 100 !

анафаз !

Число нарушений (выходы и отставания! , хромосом) на 100 ! Jha-i.c

клеш1'

1987 0,25 0,5+ 0,1 5,1 ± 0,4 3,5

1988 0,17 0,5 + 0,1 3,8+ 0,3 4,7

1989 0,13 0,6 + 0,1 4,о"+ 0,3 5.8

I9S0 0,13 0,5 ¿ 0,1 5,0 + 0,5 5,4

1987 43,0 Г, 5 + 0,1 7,0 + 0,4 3,2

1988 4,3 1,9 ± 0,2 6,8 + 0,4 3,0

19 89 3,3 1,1 + 0,2 5,6 + 0,4 5,5

1990 2,5 1,1 + 0,2 6,9 1 0,6 8,0

1987 120,9 1,3 + 0,2 8,1 ¿ 0,5 4,1

19 88 09,1 2,2 + 0,2 9,2 + 0,5 3,1

1989 34,5 1,4 + 0,2 5,9 + 0,4 3,4

1990 21,6 1,1 ± 0,2 10,0 1 0,8 4,5

1987 345,0 3,3 ¿ 0,4 12,3 ¿ 0,8 3,6

1988 112,0 2,1 ± 0,3 8,7 + 0,7 3,7

1989 69,1 1,4 + 0,2 8,5 ± 0,5 4,9

1990 47,5 1.4 ± 0,3 8,1 ± 0,7 5,9

цируемых аберраций и других нарушений был практически одинаковым вплоть до 1990 г., хотя ежегодная поглощаемая доза снизилась в 5-10 раз. Наблюдаемая особенность очевидно связана не столько с накоплением потенциальных повреждений в ДНК хромосом в условиях хронического облучения в период покоя с сентября по май, сколько с реализацией повреждений в относительно короткий 10-15 дневный (июнь) промежуток времени. В этих условиях часть повреждений, по-видимому, не реализуется и способна передаваться от одного клеточного поколения другому в процессе дифференцировки и дедифферещи-

РОБКИ.

Таким образом установлено, что в результате облучения у сосны возникают различные морфологические изменения и хромосомные повревдения. Существенно, что морфологические изменения сохраняются в течение нескольких лет,что подтверждает вышесделанный нами вывод о том, что между повреждениями процессов клеточного деления и продленным морфогенезом наблюдается тесная корреляция. Действительно, наблюдаемые в течение нескольких вегетационных периодов хромосомные аберрации *л повреждения процессов клеточного деления могут быть молекулярной основой для формирования морфологических признаков, которые проявляются в нескольких поколениях (Сейсебаев, 1991). С другой стороны, возникновение аберраций хромосом в течение нескольких вегетационных периодов свидетельствует о передаче первичных повреждений от неспециализированных клеток почки в специализированные клетки меристемы хвои при дифференци-ровки в начале вегетационного периода. Процесс передачи повреждений имеет противоположную направленность в конце вегетационного периода, когда из дифференцированных клеток побегов формируются недифференцированные клетки почки. Таким образом, при облучении, как и при действии гербицидов.установлено новое ранее неизвестное свойство повреждений передаваться в процессе дифференцировки -дедифхфербнцироЕки клеток. Сам факт появления аберраций хромосом в клетках меристемы хвои в последующем, после осеннего облучения, году был показан в 1977г. в работе Тихомирова и др. (Тихомиров, Федотов, Пристер,1977), но не нашел должного объяснения. "

Следует сказать, что в этой серии экспериментов в условиях хронического облучения сохраняется возможность ежегодной дополнительной индукции повреждений. Поэтому, корректные результаты, доказывающие истинный характер передачи повреждений в процессе ди-

ническое облучение и длительное действие гербицидов.

С этой целью семена сосны облучали гамма-лучами ^^Сз в дозе 500 Рад на установке ГУПОС Института общей генетики АН СССР и обрабатывали гербицидами: симазином, хлорсульфуронон и терба-цилом. Обработанные семена высевали в питомнике и на третий год роста сеянцев анализировали аберрации хромосом в клетках хвои. Установлено, что хромосомные аберрации возникают как при действии гамма-лучей, так и гербицидов спустя три года после однократного воздействия. Комбинированная обработка гамма-лучами и гербицидами увеличивает число повреждений клеточных делений и аберраций хромосом (табл.5).

Таким образом, в экспериментах, исключающих дополнительное возникновение повреждений ДНК хромосом, как это могло бы быть в условиях хронического облучения и длительного цейстзия гербицидов при внесении в почву, установлено новое свойство повреждений передаваться в последовательных клеточных делениях з процессе диффе-ренцировки и дедифференцировки. Это открывает новое направление и возможности в изучении механизмов продленного мутагенеза, тесно связанного с генной активностью не только в различные периоды интерфазы, как это было установлено Hav.ii на клетках крепнс при ин-гибировании дополнительного синтеза ДНК, но и в процессе пуффинга, амплификации генов.(Буторнна, "саков,1991) и дифференцировки -дедифференцировки (Сидоров,1989) клеток. Изменения в функционировании генов в результате облучения изучены нами на примере изофер-кентов пероксидазы.

о. ИЗОФЕРМЕНТНЫЛ СОСТАВ ПЕРОКСИДАЗИ Б ХВОЕ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ НА РАЗНЫХ ЭТАПАХ ОНТОГЕНЕЗА ПРИ ДЕЙСТВИИ РАДИАЦИИ И ГЕШЩЦЦОВ

В последнее десятилетие исследования генетически контролируемых изоферментных систем у древесных растений методом электрофореза находят все большее применение. Изо^ерменты, являясь своеобразными маркерами работы генов (Диксон М.Уобб, 1932), открывают широкие возможности при изуче; ::и функциональной активности и регуляции генов в процессе онтогенеза, спонтанного и индуцированного мутагенеза.

Таблица 5

Частота аберраций хромосом, возникших в результате действия галка-на^учэння и гер&щпдов в клетках хвои

Вариант ~к:сло ! Число Л^спгашп: Нпрупенкя клеточных делега1й

проана-ллз::оо-ванннх КЛЭТОК !ло !аоопга-!абср-!ЦП:': по. хроматнд^гие ;.:остн »фрагмент:-! ! \ исходи п отс тавания хромосом

¡ра- ! 1'ОУ ¡клеток гп1с ло -ша юо ¡клеток ] чнс-"ло »на ±ии ¡клеток : кс ! ло -1 на 1ии { клеток !чис !ло - ¡па кллчне-!клеток!ло ц-:а 1Ш ¡клеток

Контроль 900 5 0,7+0,3 — _ 6 0,7 30 3,3+0,6 19 2,1 II 1,2

гамуа^лучк 900 16 1,8+0,5 2 0,2 14 1,6 53 5,8+0,8 36 4,0 II 1,2

ганка + с^назин 200 27 3,0+0,6 I 0,1 26 2,9 70 7,8+0,9 52 5,8 1С 2,0

Скнлэю! 900 16 1,8+0,5 - - 16 1,8 60 6,7+0,2 47 о,2 13 1,4

г«г'иа + гдарусулъ-фурой £00 32 3,6+0,6 6 0,6 26 3,0 87 9,7+1,0 72 8,0 15 1,7

Хлогсуль-сурок 900 16 1,8+0,5 2 0,2 14 "г со 7,2+0,2 51 5,7 14 1,6

гамлга + Тербацпл 200 24 3,0+0,6 2 0,2 25 2,8 71 7,2+0,9 54 6,0 17 1,9

Тербацнл 200 13 1,4+0,4 13 1,4 67 7,4^0,9 59 6,6 8 0,9

Воздушно-сухие се;/еиа облучал;; га: :ма-лучами цезия-137 в дозе 503 Рад и обрабатывали гербицидами снмазином (С), хлорсуль-фуроном (х/с) в концентрации 0,001%.

Обработанные семена проращивали в лабораторных условиях, вторую партию семян высевали в питомнике. Изоферментный состав пероксидазы изучали в хвое 15-суточных проростков и хвое трехлетних саженцев (табл. 6,7).

Установлено, что при. раздельном действии количество изоформ и их частота несколько снижаются по сравнению с контролем. Совместная обработка радиацией и гербицидам!; приводит к резкому снижению количества и частоты встречаемости диффузных и осноэ..ых изоформ в популяции по сравнению с сум: ой эффектов двух мутагенов.

В диффузной фракции изоферментов наблюдается большое количество вновь синтезируемых и репрессируемых изоформ условно обозначаемых как + и - соответственно. В основном виде изоформ наблюдается репрессия некоторых изоформ (табл.6).

Через три года после облучения и обработки гербицидами в хвое саженцев число изоформ, их активность и частота встречаемости в популяции практически.не отличаются от контроля, т.е. происходит восстановление синтеза. Однако в вариантах с совместным воздействием резко уменьшаются число изоформ и частота их встречаемости в популяции по сравнению с суммой эффектов двух мутагенов. Это касается как диффузного, так и основного вида изоформ. Следовательно, совместная обработка приводит к длительному снижения синтеза изоформ. Их число и частота встречаемости через три года после воздействия не достигают контрольного уровня. Во всех вариантах опытов в диффузной фракции изоформ наблюдается появление и репрессия синтеза некоторых изоформ. Эти факты свидетельствуют о нарушении генной активности в процессах деления и дифферен-и-ровки - дедифференцировки клеток спустя длительное время после воздействия.

Синтез основных жизнеобеспечивающих изоформ в трехлетней хвое полное-ыо восстанавливается (табл.7).

Таким образом установлено, что при облучении и обработке семян гербицидами наблюдаются многочисленные изменения количества и частоты встречаемости изоферментов перохеидазы. Происходит репрессия и синтез новых субъединиц. Наличие нарушений процесса синтеза изоформ спустя три года после облучения и обработки герби-

Таблица 6

Количество л частота вотречаоглости нзофоол псрокспдазы в хвое 15-сугочшх проростков соси: обшз:ове:пюй

-Варианты | Количество ¡Частота '.Ссктез'Рсцрессг ^¿аАкц,^ ¡опыта !нзо$ор;л ! встречаемое?:;! +

Основные

Е30С]}0р2.Щ

К 9 199

Г 9 152 0+ - 0~

с 8 153 0+ - 0~

ш 6 75 0+ - I"

совместное

деСстзле

/ + с 8 175 0+ - т-

¿г + х/ с 6 142 0+ - 2~

суша

эсдасктов

Г + с 17 310 0+ - 0~

г + х/с 15 227 0+ - г

Дпдаузпыо

УУС '

совместное дейстЕле

{ + Vо

сумма в^ектов

Г + с г + У о

31 25 29 32

28 45

54 57

201 210 227 404

250 595

437 614

6+ - 12" 6+ - Б-7+ - IГ

7+ - 12" 7+ - 8"*

12+ - 20" 13+ - 23"

Обозначения: К - контроль;

)С - гамла-лучи; С - симазин; 3/с - хлорсулн;.урон

Таблица 7

Количество к частота встречаемости пзоформ пероксидазы в хвое трехлетие: сакенцев соски обыкновенной

! Частота 'Синтез!Репрессия ! встречаемости!- + !

-,„„„__, ¡Ваопаитн ! Количестве ^акции I опыта ! изоформ

)сковше 'зофорш

К Г С

з/с

совместное действие

/ +С ,

У + Уа

сумма эффектов

Г+

ус

10 10 II II

10 12

21 21'

429 362 283 339

281 337

645 701

0+ - О"

0+ -

О" О"

0+ - О" 0+ - О"

додзпые зо;;ормы

132

г 22 154 6+ - 5"

с 22 224 6+ - 3"

ус 22 ■ 191 5+ - 5"

совместное действие

(+ С

¡Г + Х/С

сутша

зйфектов

Г + С г + Ус

25 25

44 44

229 172

378 345

7 -

8+ -

12+ -

II"1" -

Г 2"

9" 1Г

бозначекш:

К - контроль; ¿Г - гамма-лучи; С - спмазин; У С - хлорсульфурон

цидами видимо свидетельствует, кик и в случае с хромосомными аберрациями, о передаче повреждений ДНК в процессе дифференциров-ки - дедифференцировки клеток на протяжении нескольких вегетационных периодов, что подтверждает выдвинутые нами положения о продленном характере хромосомного мутагенеза в случае однократного воздействия мутагенами.

7. НЕСПЕЩФИЧЕСКИй ХАРАКТЕР ДЕЙСТВИЯ РАДИАЦИИ, МКИЛИРУЩИХ МУТАГЕНОВ И ГЕРЪУВДДОВ

Изучение морфологических и биохимических изменений, хромосомных аберраций и нарушений процессов клеточных делений показало, что радиация и гербициды у сосны обыкновенной, индуцирует в принципе сходный основной ряд изменений.

В зависимости от дозы наблюдаются малоохвоенные укороченные побеги, часто встречаются "кактусовидные" и "аначасовидные" формы побегов с наложенными один на другой листовыыи рубцчми. Набладаот-ся кисчи побегов с укороченной хвоей - "ведьмина метла".

На облученных и обработанных в больших дозах гербицидами деревьях хвоя часто некротировача, имеет желтую или темно-оранжевую окраску. Срок жизни даяе Енешне зеленой хвои сокращается до одного-двух лет. При более низких дозах хвоя по фор^.е кривая, саблевидная, мясистая или уплощенная, по цвету темно-зеленая, иногда с серебристым налетом, жесткая, у основания до Л мм.

Идентичные изменения при облучении и действии гербицидов наблюдается и в строении почек. Почечные чешуйки часто раскрываются, образуя звездочку, или трансформируются в листообразные образования, имеют яркую красноватую окраску. Часто встречается много-почечность и неупорядоченное их расположение.

Среди нарушений процессов клеточных делений наиболее часто встречаются выходы и отставания хромосом, хроматидные тельца.

В цитогенетических исследованиях установлено, что радиация, гербициды и алкилирующие мутагены индуцируют по крайней море три типа повреждений в ДНК хромосом, которые рсал_.зуютен в аберрации хромосомного и хрокатидкого аила в ряде последовательных клеточных делений на протяжении нескольких вегетационных периодов после однократного воздействия и передаются в процессе дифференцировки и дедефференцировки клеток сосны обыкновенной.

И наконец, радиация и гербициды индуцируют сходный спектр вменений изоферментов пероксидазы.

Иными словами, весь спектр индуцируемых морфологических, ромосомных и биохимических изменений указывает на неспецифический :арактер действия радиации, гербицидов и алкилкрующпх мутагенов [а клетки растений. Если можно так выразиться, универсальным для :рех классов мутагенов является лишь то, что мутации наблюдаются длительное время спустя после однократного воздействия, что ука-¡ывает на их генетическую опасность.

ВЫВОДЫ

В современной теории мутаций все более обоснованным экспериментально становится представление о том, что пои действии физических и химических мутагенов в ДНК хромосом возникают повреждения различной молекулярной природы.

Процесс реализации этих повреждений в аберрации хромосом юсит многоэтапный характер г. зависит как от типов первичных ловр-зжденин, так и от вну-трнхромосомних процессов, протекающих в :юрме и связан с нарушением структурной целостности ДНК хромосом.

Первичные или сформированные на их основе повреждения способны передаваться в ряду последовательных митотических делений, включая процессы дпфферен;;ировки и додиф^еранцировк;: соматических клеток растений. Выдвинутые положения находят все большее -экспериментальное подтверждение.

Г. Установлено, что при действии алкилпруоцих мутагенов гамма-лучей и 1ербипндов в ДНК хромосом возникают перви.чные повреждения различно;'! молекулярной природы, с-.аеебные переходить ряд последовательных синтезов ДНК и реализоваться в хроматидные хромосомные аберрации и диплоидных и тетрдгтлопдннх клелках. Иными словами, хромосомный мутагенез в соматических клетках растений, имеет продленный характер.

2; Торможение цолоянитольного синтеза ДНК с помощью 5-a.vir.iO-уряцилз и {>-4-тордооокскурид1!.чя привод:: г к редкому увеличению выхода кндуцнро яашп:х радиацией гберргцшй хроксео? кого типа з диплоидных клетках. Следовательно, реализация повреждений в г-перподе происходит в генетически активных локусах ДНК хромосом, при протекании спонтанного дополни 1 елыюго синтеза. Аберрации хромосомного

типа, очевидно, возникает на основе дпунитсБых разрывов, образующихся в пзолокусе в результате совпадения спонтанных и индуцированных радиацией однонктевых брз

3. Экспериментальные данные,полученные при комбинированном действии ыутагеиои показывают, что в количественном отношении происходит увеличение выхода аберрации хромосом, а при изменении последовательности в действии мутагенов наблюдаются и качественные изменения в типах аберраций. А именно, если облучению подвергаются предварительно обработанные химически:.: мутагеном есмена, то реализация аберраций хромосом происходит в основном в пределах первого митоза. Наблюдается своеобразный о'ффект дореалиуадки позрездрний, индуцированных химически/ ыутагенсм. Напротив, если химкческиы мутагеном обрабатывается предварительно оСлучсшшо соысно, то сверх-аддит-иЕНый эффект наблюдается ь тетраплокдных '".летках т.е. происходит оэдерзка р роализаци.. поврездений. Наблюдаем^ свопхадднттш-ный цитогснс-тичс-скнй эффект в случае совместного действия свидетельствует о том, чтэ катдай из мутагенов по о'шот.оннэ к первому обладает модн,фициру'г;::м о ф-фекгоч. Прячем годв^икодм момст осуществляться как на уровне первичных погрегу^ош:!!, так и внутрпхромо-сомных процессов, опрздолявзос вероятность перехода кндуцировагиегх повреждений ь "¿ккеированнив мутации.

4. Впервые на клетках хь:л: сосны обыкновенно:; показано, что как и классически': мутагены, гербициды способны индуцировать у растен;;;: разнообразные морфологические изменения, хромосомные аберрации, нарушения процессов iu.otочных делений и регуляции работы генов, ответе;венных за синтез проферментов пороксидазы.

5. Радиация, ьягалируя^е мутагены и гербициды не обладают специфичностью и индуцируют сходни;; ряд морозов у сосны обыкновенной, коротко- и цкктелыюх/.ьу,4'.:е ирсде>тациончио повреждения ДНК хромосом, реализующиеся в аберрации спустя длительное время после однократного воздействия. Это указывает на их отдаленнуi

г ен е ти ч е с ку ю опасность.

6. Впервые в мировой практике изучена дозиметрическая обстановка в лесах после аварии на Чернобыльской АЭС, установлены четыре зоны поражения дрегссных насаждении. Во вновь созданных культурах сосны на площадях с плотностью загрязнения радионуклидами от 5 до 10000 Ки/кк^ изучены морфологические и Снох:"/ ическио изменения изофер:.ентов пероксидазы, хромосомные мутации в зависи-

ыости от накопленной дозы, определенной методом ТЛД-дози2.:етрии.

7. Открчто новое свойство повреждений, индуцированных радиацией и гербицида?, и, передаваться в процессе д;.фференцкровки и дедн-фференцировки плеток сосны на про теснин нескольких вегетационных периодов. Ото означает, что первичные повреждения, первоначально возникшие н неспециализированных инициальных клетках почки сосны,переда}тся при делении и дифференциации в специализированные стволовые ;; мерке темные клетки хвои. В конце вегетационного периода процесс, имеет обратный характер, т.е. повреждения переходят из стволовых клетск п неспециализированные вновь закладываемые клетки почки. Реализация повреждений в моруозы, х?о;.'ОСО!.з!ые пли биохимические нарушения з ото:.: случае очевидно будет зависеть от конкретных генетических процессоп, протекающих в клетке, таких как дополнительны.! синтез ДНК, репарации, а*аллокация или пуффинг генов.

в. Полученные в работе ->ке«ори:.:енталыше данные при однократном воздействии уутагенауи физической и химической природы позволили установить связь между различными типами первичных повреждений, реализующихся в аберрации хрох:осо?.* в пределах двух последовательных клеточных делений и генетическими процессами, связанный с временным наруяенпем структурной целостности ДИК хромосом, что является принципиально новым направлением в изучении и построении теории продленного мутагенеза.

9. Результаты по совместному воздействия физических и химических мутагенов найдут свое применение в теории и практике гигиенического нормирования вредных веществ, в расчетах приемлемого риска при комбинированном действии мутагенов.

10. Установление продленного характер:', возникновения морфологических, хромосомных и биохимических изменений при облучении древесных растений в результате апприи на Чернобыльской АЭС позволило по новому осветить вопросы радиочувствительности, изменений гснотиинческой структуры популяции древесных растений и жизнеспособности нлеатдений. ^то послу.кило основой дтя составления прогнозов генетических и экологических последствия аварии на Чернобыльской АЭС. Результаты работы нашли практическое применение при разработке "Руководства п ведению лесного хозяйства в условиях радиоактивного загрязнения", "Рекомендаций по затесенно территорий с плотностью загрязнения иО Кн/км*" и вше" и ряде других нормативных докуг.ентсв, рнедрешшх в лесном хозяйство России.

uuiUtíHOS СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОТРА2ЕНО В СЩШфК ДШРЙАЦЖ

1. Сидоров В.П. Эффект совместного действия гамма-лучей и •тлсниккна на сухие семена Crop!" c-pUl-Сообщения АН Грузинской ССР, 1973. К- I, с .153-155.

2. Сидоров В.И. Изменение вероятности реализации потенциальных изменений, индуцированных ЭИ в аберрации хромосом последующим гамма-облучениеу клеток "rejí: с-vil"! • "-^Сообщения АН Грузинской ССР, 1974. К' I, с. I6I-Î64.

3. Сидоров В.Г1. Совместное действие гамма-лучей и ЭИ в пред-синтетическом периоде митотического цикла на клетки семян ~vcp:.-с'7.г11гг1п. Генетика, 1974. I, с.34-41.

4. Сидоров В.П. Нитогенетичеокое исследование эффекта совместного действия ЭИ и гамма-лучей на клетки семян'-1"-Р1" «^iUuri": в двух последовательных гиютических циклах. Генетика, 1974.

í 2, с.33-41.

5. Сидоров В.П. Цитогенетпчзский анализ аберраций хромосом, индуцированных т-ъа-лучами и ЭИ в клетках семян Cr-opir- с г-pill cris в условиях торможения синтеза ДНК. В кн.: Молекулярные механизмы генетических процессов. Мутагенез и репарация. М. Наука, 1973,с.56.

6. Сидоров В.П., Тарасов В.А. Исследование эффекта совместного действия ?И и гамма-лучей при торможении синтеза ДНК. Генетика, 1974, 10, с .3ci-4ô.

7. Сидоров В.П., Македонов Г.П. Цитогснетический анализ эффекта совместного действия ЭИ и гамма-лучей на клетки семян Crépi- с-, pill-г: а в кн.: Оперативно-информационные материалы. Радиоцитолог'Ия-73. ленинградски/ институт ядерной физики. Ленинград, 1974, с.52.

8. Сидоров 8.11., ¡.'акедочок Г. П. Исследование эффекта пострадиационной и пргдрздиапионноп обработки ЭИ клеток Crepir: (.-pi; L--rir> В кн. : Оперативно-информационные материалы. Радиоци-тология-73 (Ленинградский институт ядерной физики). Ленин!рад, 1974, с.51.

9. Сидоров В.il., Македонов Г.П. Изучение тффектя комбинированного воздействия ионизирующей радиации и ЭИ е пр^р^ста^.^/х семенахre pi г; с.т pillar ir; Генетика, 1974, ,'í II, c.44-b¿.

10. Сидоров В.П., Македонов Г.П. Комбинированная обработка ЭИ и гамма-лучами клеток на разных стадиях митотического цикла. Генетика, 1974, 5 12, с.26-35.

11. Сидоров В.П., Македонов Г.П. Исследование действия ингибитора синтеза ДНК и 5-аминоурацила на митотичесхий цикл клеток прорастающих семян. Цитология, 1975, 12, с. 26-35.

12. Сидоров В.П., Тарасов В.А. Индуцированные мутагеном хромосомные аберрации, реализующиеся в двух последовательных клеточных делениях. Генетика, 1979, № 2, с.226-232.

13. Тарасов В.А., Сафонова Г.М., Сидоров В.П. Сенсибилизирующий эффект 5-фтордезоксиуридина в предсинтетическом периоде клеточного цикла. Генетика, 1976, № 3, с.44-49.

14. Тарасов В.А., Портянко Н.&., Сидоров В.П. Модифицирующий эффект 5-фтордезоксиуридина б отношении цитогенетических повреждений, индуцированных гамма-квантами в стимулированных и нес-тимулированных лимфоцитах человека. Радиобиология, i960, т.20, вып. 2,с. 435-439.

15. Сидоров В.П. Научный отчет по спецтеме. ВНИИХлесхоз, I97Ü, инв. № 32, с. 156-165.'

16. Сидоров В.П. Научный отчет по спецтеме. ВНИИХлесхоз, 1979, инв. № 56, с.92-105.

17. Сидоров В.П. Научный отчет по спецтеме. ВНИИХлесхоз, 1979, инв. № 72, с. II8-I29.

It3. Сидоров В.П. Научный отчет по спецтеме. ВНИИХлесхоз, 1930, инв. № 106, с.135-147. '

19. Сидоров В.П. Модификация радиозащитного эффекта циста-мина и мексамина ингибитором синтеза ДНК-аминоурацилом. В кн.: Чувствительность организмов к мутагенным фактора:.: и возникновения мутации. 3-я конференция по теоретическим вопросам ыутаглнеза. Вильнюс, i960, с.19.

20. Сидоров В.П. Изучение радиозащитного эффекта цистамина

и мексамина в двух последовательных клеточных делениях. Радиобиология, Л9о1, т.21, вып.З, c.36d-373.

21. Сидоров i3.II. Научный отчет по спецтеме. ВНИИХлесхоз, I9aI, инв. № 132, с.24-26.

22. Сидоров В.П. Научный отчет по спецтеме. ВНИИХлесхоз, 19оЗ, инв. J," 169, с.Id,105-123.

23. Сидоров В.П. Научный отчет по спецтеме., ЕНИИХлеехоз, 1934, инв. !5 215, с.52-63.

24. СидороЕ В.П. Научный отчет по спецтеме. ВНИИХлесхоз, 19о5, инв. 15 255, с.190-205.

25. Сидоров В.П. Научный отчет по спецтеме. ВНИИХлесхоз, i960, инв. № 107, c.IÜ-19.

26. Сидоров В.П. Научный отчет по сиецгеке. ШИИХлесхоз, 1933, инв. 15 0120, с.24.

27. Сидоров В.П. Научный отчет по спецтеме. ВНИИХлесхоз, I9c3d, инв. J5 0121, с. 52.

23. Сидоров В.1-1. Научный отчет по спецтеме. ВНИИХлесхоз, ISöo, инв. № 436, с. Ьо.

29. Сидоров В.П. Научный отчет по спецтеме. ВНИИХлесхоз, 19о7, инв. )5 46d, с.147.

30. Сидоров В.П. и др. Мутагенный эффект 2,4-Д натриевой соли в двух последовательных клеточных делениях. Цитология и генетика, I9od, с.71-74.

31. Сидоров В.П. и др. Научный отчет по спецтеме. ВНИИХлесхоз 1933, инв. >5 502, c.4d.

32. Сидоров B.I1. и др. Научный отчет по спецтсме.ВНИИХлесхоз, I9ö9, инв. )5 0129, c.I6d.

33. Сидоров В.П. и др.Научный отчет по спецтеме.ВНИИХлесхоз, 1990, инн. }? 0103, с.129.

34. Сидоров В.11. и др. Научный отчет по спецтемз.ВНИИХлесхоз,

1990, инв. .'50104, с. 115.

35. Сидоров В.II. и др.Научный отчет по спецтеме.ВНИИХлесхоз,

1991, инв. J5 15з, с.55.

36. Сидоров B.fi. и др. Научный отчет по спецтеме.ШИИХлесхоз, 1991, инв. 15 013-i, с.73.

37. Сидоров В.П. и др.Научный отчет по спецтеме.ВНИИХлесхоз, 1991, инв. № 0136, с.50.

33. Сидоров В.П. и др.Научный отчет но епсцтсме.ВНИИХлс.е.хоэ, 1991, инв. J5 0137, C.3--J.

39. Сидоров В.П. и др.Научный отчет по спецтсме.ВНИИХлесхоз, 1939, инв. № 0130, с. 69.

40. Сидоров B.I1. и др. Изучение спектра кзоферментов иерок-сидазы семян после обработки 2,4-Д аминноЛ соли молопдяков сосны обыкновенной. Сб.трудов.г.Минск,19-25 октября 19^7, c.Iü-II.

41. Сидоров B.II, и др. Каучение мутагенной активности 2,4-Д натриевой соли на клетках скерды и сосны обыкновенной. Генетика, 1989.т.25, с.761-765.

42. Сидоров В.П. и др.Изоферментныл спектр пероксидазы сосны обыкновенной на различных стадиях онтогенеза. Лесоведение, 1939, .V» 2, с.85-88.

43. Сидоров В.П. и др. Последствия радиоактивного загрязнения лесов в зоне ЧАЭС. Сборник трудов Госкомгидромета СССР, АН СССР, 1989, с.85-92.

44. Сидоров В.П. и др. Влияние ионизирующих излучений на сосну обыкновенную. Сборник трудов Госкомгидромета СССР,АН СССР, 1989, C.I0I-II2.

45. Сидоров З.П. и др. Научные основы ведения лесного хозяйства в условиях радиоактивного загрязнения. Сборник трудов Госкомгидромета СССР, АН СССР, 1989, с.235-244.

46. Сидоров В.П., Тихомиров 5.А. Биологические эффекты облучения сосны обыкновенной в зоне аварии на Чернобыльской АЭС. Сб.трудов I Всесоюзного радиобиологического съезда, г.Москва, 1989.

47. Сидоров З.П. и др. Поступление радионуклидов в продукцию лесного хозяйства в условиях радиоактивного загрязнения. Сб.трудов I Всесоюзного радиобиологического съезда, г.Москва, I9Ö9.

48. СидороЕ В.П..Тихомиров S.A. Итоги 2-х летней работы по ликвидации последствий аварии на ЧАЭС. Сб.трудов. Чернобыль, 1989, т.4, с.90-110.

49. Сидоров В.П. Последствия радиоактивного загрязнения в лесных биогеоиенозах. Сб.трудов Всесоюзного совещания. г.Чернобыль, 1990, с.51-66.

50. Тихомиров >5.А., Сидоров З.П. Радиационное поврекдение леса в зоне ЧАЭС. Сб.трудов I Международной конференции. 1990. с. 18.

5Г. Панфилов A.B., Панфилова E.H., Сидоров В.П. Радиочувствительность и санитарное состояние сосновых насаждений в зоне аварии на ЧАЭС. Сб.трудоЕ I 1де:здународной конференции, 1990, с.19.

52. Сидоров В.П., Дьяков B.JI., Тихомиров Ф.А. Динамика плодоношения культур соснн обыкновенной при воздействии ионизирующих излучений. Сб.трудов Всесоюзной конференции. г.Пушкино, 1990, с.lid.

53. Сидоров В.П..Тихомиров S.A. Радиационное поражение леса в зоне ЧАЭС. Сб.трудов Всесоюзного совещания, г.Припять, 1990.

54. Сидоров В.П., Панфилов A.B., Тихомиров Ф.А. Концепция Еедения лесного хозяйства в условиях радиоактивного загрязнения. Сб.трудов конференции. г.Гомель, 1990, с.З.

55. Сидоров В.П.,Дьяков В.Л..Чернов С.А. Изучение факторов, снижающих выживаемость культур сосны в зоне отселения ЧАЭС.

Сб.трудов конференции. г.Гомель, 1990, с.33.

56. Сидоров В.П., Тихомиров ¿.А., Марадудин И. Я. К вопросу об искусственном обселении с/х угодите плотность'о радиоактивного загрязнения С* -137 свыше оО Ки/кг.г. Сб.трудов конференции. г.Гомель, 1990, с.37.

57. Сидоров В.П. и др. Изучение действия ионизирующего излучения и средств химии на проростки сосны обыкновенной биохимическими и цитогенетическими методами. Сб.трудов конференции. г.Гомель, 1990, с.II.

5d. Тихомиров А..Сидоров В.П.,Козубов ГЛ.1.Даскаев А.И. Актуальные проблемы лесной радиоэкологии. Журнал "Успехи совестс-кой науки". 1992.

59. Сидоров В.П..Чилимов А.И. Научные основы ведения лесного хозяйства в условиях радиоактивного загрязнения. Радиац. аспекты Чернобыльской аварии: сб.Всесоюзной конференции г.Обнинс.ч 19&J. - с.20-25.

60. TikHor.irov I'./... rr-chclov ,'..J., Cidorov V.P. rorests s^d foroctry: rodi'-tior. protze', Iojj ncniuioc viith cpecir.l referee te Cherr.obyl ccci«5ar.t zo.-.c: ..cier.cc of the ?otrl ,:.-.vironraor.J. Г roe of & C:x V.'orichop or. tke rel-tive cffocti-ver.es:- of rgricultural соur.teratt-cure tccfcr.iquec. I-',. OKt.I'¡'Л. Ьги:-г;о1г;.Юrj\ . (in I re:;.

Информация о работе

Сидоров, Виктор Павлович
доктора биологических наук
Москва, 1992
ВАК 03.00.01

Автореферат

Похожие работы