Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пробиотический потенциал штаммов Propionibacterium freudenreichii и микробиологическая защита хлеба

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Пробиотический потенциал штаммов Propionibacterium freudenreichii и микробиологическая защита хлеба"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

М

ЛИ ХАО (КНР)

□□3477438

ПРОБИОТИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ ШТАММОВ РЯОРЮШВА СТЕШиМ Р11ЕиОЕМ11Е1СНН И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯЗАЩИТАХЛЕБА

Специальность 03.00.07 - Микробиология

2 4 СЕН 2009

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва - 2009

003477438

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук Рыжкова Евгения Петровна (03.00.07) Офциальные оппоненты:

доктор биологических наук Ушакова Нина Александровна кандидат биологических наук Бонарцева Гарина Александровна

Ведущее учреждение: Московский государственный университет пищевых производств, кафедра «Биотехнология»

Защита диссертации состоится 23 октября 2009 г. в 15 ч 30 мин на заседании диссертационного совета Д 501.001.21 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991 Москва, Ленинские горы, МГУ, д. 1, корп. 12, Биологический факультет, аудитория 557.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан " 10 " сентября 2009 г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Н.Ф. Пискункова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Выявление микроорганизмов-пробиотиков, изучение их пробиотически значимых свойств, исследование воздействия на физиологию макроорганизма (животного и человека), создание новых способов применения как биоконсервантов пищевых продуктов -всё это в целом современная обширная проблема, которую решают специалисты разных областей. Актуальность её определяется стремлением людей к экологическим (биологическим) подходам в поддержании здоровья: сокращению применения химических препаратов (химиотерапия) и любых ксенобиотков, включая антибиотики. И это действительно возможно: лечение многих заболеваний достигается с помощью пробиотиков именно потому, что они настраивают (регулируют) иммунную систему человека (животных), способны нормализовать микробиоту желудочно-кишечного тракта благодаря избирательной антимикробной активности (без антибиотиков), вызывать апоптоз некоторых опухолей. Последнее относится и к пропионовокислым бактериям (ПКБ), действующим, например, против аденокарциномы прямой кишки [Jan et al., 2004]. Все эти наблюдения и достигнутые результаты исследователей в Мире по сути иницированы русским учёным, лауреатом Нобелевской премии 1908 г, И. И. Мечниковым, который в своё время «вылечил Балканы» от желудочно-кишечных заболеваний с помощью только одной полезной бактерии: Lactobacillus delbrueckii.

Понятие «пробиотик» в настоящее время расширяется по смыслу по сравнению с первоначальным [Rolfe, 2000; Шендеров, 2001; Nomoto, 2005; Суворов, 2007; Adams, Huang, 2008] и по определению ВОЗ (2002) подразумевает живой микроорганизм, поступивший в организм естественным путём, улучшающий его общее физиологическое состояние. Пробиотики в настоящее время условно подразделяют на три категории: антимикробные, и ммуно модулирующие и метаболические [Суворов, 2007]. Возможно и комплексное воздействие пробиотических микроорганизмов. Пробиотики могут быть инди-генными (резидентными, автохтонными) или транзиторными, которые проявляют неспецифическую слабую адгезию на эпителии и не колонизируют его.

Пробиотическое действие обусловлено видом микроорганизма, его метаболизмом. Биологической особенностью классических ПКБ (по сравнению, например, с МКБ) является способность продуцировать ряд метаболитов-нутрицевтиков, включая витамины группы В, в том числе фолиевую кислоту, витамин В^ [Воробьёва, 1976; Hugenholtz, 2002] и бифидогенные факторы [Kaneko et al., 1994; Isawa et al., 2002; Warminska-Radiko et al., 2002], выделение пропионовой кислоты (пропионатов) и полипептидов, обладающих

антимикробными [Holo et al., 2002] и антимутагенными свойствами [Vorobjeva, 2000], наличие в клетках ферментов-антиоксидантов [Краева, Воробьёва, 1981] и другое. В последнее время выявляется штаммовая специфичность пробиотических эффектов микроорганизмов [Warminska-Radiko, 2002; Lan et al., 2007; Kekkonen et al., 2008]. Поэтому выявление новых пробиотиков, в том чиле среди штаммов P. freudenreichii, актуально.

Микробиологическая защита пищевых продуктов от порчи всегда актуальна и является альтернативой применению вредных для человека химических препаратов и дорогостоящих физических факторов. Она во все века применялась человеком (эмпирически, без знания микробиологии), например, сыроделие, в котором ПКБ участвуют, зародилось как способ консервирования молочного белка, казеина, а не как производство деликатесов. Вместе с тем, разработки новых способов ведут к улучшению результатов в плане эффективности защиты пищевых продуктов и её безопасности, особенно если в основе способов лежит знание биологии микроорганизмов. Именно это актуально.

Классические или «молочные» пропионовокислые бактерии в настоящее время активно прокладывают себе путь в обоих этих направлениях.

Безопасность P. freudenreichii признаётся Европейским комитетом (European Food Safety Authority, EFSA), основанном в 2002 году: статус QPS (Qualified presumtion of Safety, httpV/www.efsa.europa.eu/EFSA/en.html). Комитет США (Food and Drug Administration) также недавно включил эту бактерию в список GRAS (Generally Recognized AS Safe) под номером: 21 CFR133.195 [Lan et al., 2007].

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы явилось обнаружение действия исследуемых штаммов классических пропионовокислых бактерий (р. Propionibacterium) в качестве пробиотиков, начальное изучение их пробиотически значимых свойств и разработка новых способов защиты пшеничного хлеба от гнилостного поражения.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1) идентифицировать имеющиеся в лаборатории штаммы ПКБ с применением молекуляр-но-биологическиго метода (сиквенс фрагментов гена 16S рРНК) и филогенетического анализа;

2) исследовать жизнеспособность штаммов пропионовокислвх бактерий в условиях модели желудочно-кишечного тракта;

3) испытать штаммы ПКБ на животных в отношении их действия как возможных пробиотиков;

4) оценить пробиотически значимые свойства исследуемых штаммов пропионовокислых

бактерий: их иммунотропую, антимикробную, антиоксидашную активности, а также способность к образованию некоторых специфических полезных экзометаболитов; 5) разработать основы накопительной заквасочной технологии производства пшеничного хлеба, устойчивого к бактериальной деструкции («картофельной болезни»)

Научная поввзна работы

Биология классических пропионовокислых бактерий достаточно полно изучена. Она позволяет прогнозировать их активность в качестве пробиотиков. P. jensenii 702 уже признана эубиотиком, способным к адгезии на слизистой и размножению в ЖКТ [Adams, Huang, 2008]. Вместе с тем адгезия и колонизация эпителия рассматривается как полезное, но необлигатное пробиотическое свойство. Более важным является выживаемость и функциональная активность полезного для человека (животного) транзиторного микроорганизма в ЖКТ. Научные предпосылки указывают на штаммовую детерминированность тех или иных свойств бактерий-пробиотиков. Штаммы P. freudenreichii ещё не получили статуса истинного или автохтонного пробиотика (эубиотика), однако немногочисленные испытания, в том числе и проведённые в нашей работе, свидетельствуют о пробиотиче-ском действии этой бактерии на организм животного. Важное значение работы состоит в оценке и обобщении имеющейся в литературе информации по биологии и пробитически значимым свойствам классических ПКБ.

Новизна настоящей работы состоит, во-первых, в оригинальной оценке выживаемости бактерий - кандидатов в пробиотики в агрессивной среде ЖКТ при использовании разработанной нами модели, а также в обнаружении положительного воздействия Р. freudenreichii на организм животного на примере птицы; во-вторых, в выявлении пробио-тически значимых свойств (в жидких культурах, культуральных жидкостях и в суспензиях живых клеток) новых изолятов классических ПКБ, которые были филогенетически идентифицированы нами как штаммы P. freudenreichii. Так, показано, что P. freudenreichii подавляет развитие как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий, причём в нейтральной среде, за счёт пропионатов и бактериоцин-подобных веществ. Проведена оценка внеклеточного содержания витамина Вп и активности некоторых экзоферментов. Впервые выявлены антиоксидантные свойства жидких культур P. freudenreichii, что существенно для их пробиотического действия в ЖКТ, и показана иммунотропная активность клеток бактерии (результаты получены практически одновременно с финскими исследователями). Эти наблюдения свидетельствуют о возможности реализации биологии классических ПКБ в ЖКТ животных, определяющей пробиотические эффекты.

В-третьих, при разработке заквасочного способа применения бактерии для защиты

пшеничного хлеба от гнилостного поражения обнаружили способность P. freudenreichii развиваться на мучной среде только вслед за МКБ. Установили, что трофическая цепь между Lactobacillus delbrueckii и P. freudenreichii на мучной среде действует. Предварительное культивирование термофильной молочнокислой бактерии обеспечивает развитие пропионовокислой культуры, предположительно, вследствие накопления лактатов и ферментативной модификации белков мучной среды с образованием стимуляторов её роста.

Практическая значимость работы

Полученные научные результаты показывают целесообразность использования наших штаммов P. freudenreichii в пробиотических препаратах.

Исследованные штаммы P. freudenreichii готовы для испытаний в качестве пробиотических препаратов, которые могут быть применены как в животноводстве, так и в клиническом или профилактическом питании пациентов-добровольцев. Поскольку данные бактерии, скорее всего, транзиторные пробиотики, их потребление должно быть перманентным (периодическим) при высокой исходной концентрации клеток (не менее 108 -109) и их экзометаболитов.

Выявленные пробиотические эффекты и свойства исследуемых штаммов Р. freudenreichii позволяют использовать их в пищевой промышленности в качестве биоконсервантов не только с уверенностью в безопасности, но и достигая обогащения пищевых продуктов клетками-пробиотиками и их полезными экзометаболитами.

Разработан способ приготовления пшеничного хлеба, устойчивого к «картофельной болезни», с использованием пропионовокислой закваски, которую можно накапливать в условиях хлебозаводов перед внесением в дрожжевое тесто на мучной среде в требуемом количестве. Этот удобный и экономичный способ включает трофическую цепь между L. delbrueckii и P. freudenreichii. Он даёт возможность накапливать пропионовокислую закваску в нестерильных условиях (без контаминаций), которая содержит натуральные про-пионаты, в геометрической профессии путём её двукратного разбавления свежей мучной средой, предварительно ферментированной L. delbrueckii. Способ испытан в условиях, соответствующих производственным. Достигнуты практически важные результатов в хранении хлеба и улучшении его качества (способ патентуется).

Апробации результатов

Результаты диссертационной работы были доложены на Всероссийском симпозиуме «Автотрофные микроорганизмы». Москва. МГУ имени М.В. Ломоносова, биологический факультет, декабрь 2005; на Международном Конгрессе «Пробиотики, пребиоти-ки, синбиотки и функциональные продукты питания». Санкт-Петербург, май 2007 г.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Исследуемые штаммы безопасны для животных и человека на основании их принадлежности к Propionibacterium freudenreichii.

2. Выживаемость исследуемых штаммов Р. freudenreichii в в модельной пищеварительной системе даёт возможность их применения в качестве метаболизирующих пробиотиков.

3. Пробиотическое действие в отношении животного организма выявлено на примере двух исследуемых штаммов.

4. Пробиотически значимые свойства исследуемых штаммов Р. freudenreichii: имму-нотропная, антиоксидантная, избирательная антимикробная активности, а также образование полезных внеклеточных соединений (в том числе бактериоцин-подобных веществ, витамина В|2 и некоторых экзоферментов) служат объяснению их общего пробиотического действия.

5. Применение ПКБ для защиты пшеничного хлеба от поражения гнилостными бактериями на основе заквасочной технологии (в крупномасштабном производстве хлеба) может быть успешно реализована с использованием трофической цепи между L. delbrueckii и Р. freudenreichii.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, получено положительное решение по заявке на Патент РФ. Объём и структура диссертации

Диссертация содержит: Введение, Обзор литературы, раздел Объекты, материалы и методы, Результаты и обсуждение, Заключение, Выводы, Список цитируемой литературы (всего 141 наименование), Список публикаций соискателя. Работа изложена на 174 страницах, включает 16 таблиц, 28 рисунков и список сокращений.

Рабата выполнена в рамках Договора № 5 (2006-2009 гг) о научном и учебно-методическом сотрудничестве между Биологическим факультетом МГУ имени М.В. Ломоносова и Институтом систематики и экологии животных СО РАН (куратор Серебров В.В.).

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

Оъекты, материалы и методы

В работе использовали иггаммы классических бактерий р. Propionibacterium (рабочее обозначение Рг 1- Рг 7), ранее изолированные из Швейцарского сыра, которые фенотипически существенно различаются между собой. Для их видовой идентификации применили молекулярно-биологический метод, основанный на ПЦР гена 16S рРНК и включающий анализ продуктов ПЦР при помощи электрофореза в геле агарозы, выделение, очистку и секвенирование фрагментов генов длиной более 1300 нуклеотидов. Филогенетический анализ штаммов ПКБ на основе установленной последовательности генов проведён с использованием базы данных GenBaak по последовательностям генов 16S рРНК. Работу проводили на базе Центра «Биоинженерия» РАН.

Культивирование бактерий р. Propionibacterium Рг 1 - Рг 7 проводили при 30° С периодическим способом (в колбах Эрленмейера, 70% заполнение объёма) при свободном доступе воздуха (статичная культура, концентрация кислорода ~ 0,024 мМ или 0,7 мг/л) на жидких средах нескольких вариантов, а также на «твёрдой» среде.

ГКС = глюкозо-кукурузная среда («богатая»), на которой поддерживали, временно (до 3-х месяцев при + 6°С) хранили культуры ПКБ и использовали в опытах.

ГКС-тв = среда ГКС с добавлением агара и мела. Инкубирование засеянной ГКС-тв на чашках Петри проводили в течение 5-6 суток при 30°С в анаэростате.

ЛКС = лактатно-кукурузная среда имела тот же состав, что и ГКС, но вместо глюкозы был взят лактат натрия.

мСС = минимальная синтетическая или глюкозо-минеральная среда содержала глюкозу, соли и витамины: пантотенат кальция, тиамин и биотип. Концентрация хлористого кобальта — 1,0 мг/л. Вода диет.; pH 6,8-7,0. Время культивирования варьировали от 48 до 96 часов.

пСС-А = полусинтетическая среда: глюкозо-минеральная среда (мСС), обогащенная триптоном или пептоном, содержит 1,0 мг/л хлористого кобальта.

пСС-Б = то же, соль кобальта - 0,1 мг/л.

Выживаемость штаммов Р. freudenreichii в агрессивной среде ЖКТ оценивали используя в качестве реактора (модельный ЖКТ) резервуар, содержащий овсяные хлопья «Геркулес» в качестве пищи, желудочный сок (аптечный) или/и эмульсию желчи (аптечной) в разных сочетаниях. Время инкубирования варьировали. Температуру поддерживали равной 36,6°С. Перед контрольными высевами ПКБ pH среды доводили до нейтрального значения. Анализ микробиологической чистоты культур проводили с помощью светого микроскопа Laboval-4 (Zeiss, Germany) в фиксированных окрашенных препаратах. Количественную оценку роста осуществляли по А540 (Specol 10, Germany), а также по КОЕ/мл.

Пробиотические эффекты в отношении животного организма (на примере перепелов) оценивали по показателям развития, сохранности и продуктивности птицы при ежедневном введении в питьевую воду КЖ штаммов Рг 2 и Рг 4 из расчета 0,1 мл на голову в сутки в течение 10 суток. Выборка птицы по принципу аналогов составила 50 голов. Базой для испытаний служила перепелиная ферма: физиологический двор ГНУ СибНИПТИЖ СО Россельхозакадемии.

Иммунотропную активность исследуемых штаммов ПКБ выявляли и измеряли по концентрации цитокинов, образуемых в крови ex vivió [Рябичева и др., 2006] под влиянием введённых клеток ПКБ. Концентрацию цитокинов определяли с помощью наборов для иммуноферментного анализа производства ЗАО «Векгор-Бест» (п. Кольцово, Новосибирская обл.). Положительным контролем являлся комерческий препарат «Иммунал». Количественным параметром служило соотношение концентрации цитокина в пробе с препаратом к концентрации цитокина в пробе без препарата, т.е. отношение индуцированной продукции цитокинов к спонтанной продукции (индекс стимуляции, ИС).

Обнаружение внеклеточного витамина Вп (суммарных корриноидов) у штаммов P. freudenreichii Рг 1 - Рг 7, выращенных на пСС, с увеличнной концентрацией хлористого кобальта (5,0 мг/л), было сделано спектрофотометрическим сканированием их КЖ, а также растворов белков, сконцентрированных после высаливания сульфатом аммония из КЖ. Критерием присутствия корриноидов служило появление абсорбции в области длины волны 360 нм в результате обработки препаратов раствором нитрита натрия [Канопкайте, 1978; Pratt, 1982; Канопкайте, Рачкус, 1991]. Измерение концентрации корриноидов (суммарных соединений группы витамина В^) в КЖ проводили микробиологическим методом с тест-культурой Е. coli 113-3, ауксорофу по В]2 или метионину. Чувствительность метода - 0,025 нг.

Общую активность протеолитических ферментов свежеприготовленных культу-ральных жидкостей ПКБ (в нейтральных и кислых условиях) измеряли спектрофотометрическим методом с использованием искусственного субстрата: азоказеина, который в своём составе содержит азокраситель, высвобождаемый при гидролизе белка [Vinokurov et al., 2006]. Измерение активности выполнили в Отделе биохимии белков Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ имени М.В. Ломоносова.

Суммарную активность липолитических ферментов в КЖ штаммов ПКБ, выращенных на мСС, измеряли также по гидролизу хромогенного субстрата - пара-нитрофенилбутирата. Метод основан на спектрофотометрическом измерении концентрации пара-нитрофенола, который выделяется при гидролизе синтетического субстрата под действием липазы. Анализ проводили в лаборатории проф. С.П. Синеокого (ВКПМ).

Антимикробную активность штаммов P. freudenreichii исследовали по отношению к некоторым микроорганизмам-мишеням, которые культивировали при 30°С на следующих средах:

МКБ-пСС или MPC - полусинтетическая среда для молочнокислых бактерий (г/л) глюкоза - 20; пептон - 10; дрожжевой экстракт - 5,0; (NH4)2S04 - 5,0; КН2РО4 - 1,5; MgS04-7H20 - 0,5; Ca(N0i)2-4H20 - 0,1; микроэлементы (мг/л) MnS04-5H20 - 5,0 или МпС12-4Н20 -4,0; ZnS04-7H20 - 0,01; FeCl3-6H20 - 0,005; вода диет., pH 6,8.

Среда А для Bacillus sp. и Pseudomonas sp. (г/л) глюкоза - 20; (NH4)2S04 - 5,0; КН2Р04 - 1,5; MgS04-7H20 - 0,5; Ca(N03)2-4H20 - 0,1; микроэлементы (мг/л); вода дистиллированная; pH 6,8-7,0.

Среда В для Е. coli и Pseudomonas sp. (г/л): глюкоза - 20; пептон- 1,0; (NH4)2S04 -3,0; КН2Р04 - 1,0; MgS04-7H20 - 0,25; дрожжевой экстракт - 1,0; микроэлементы (мг/л) MnS04 -5Н20 - 5,0 или МпС12-4Н20 - 4,0; ZnS04-7H20 - 0,01; FeCl3-6H20 - 0,005; вода дистиллированная; pH 6,8-7,0.

Среда С для S. cerevisiae (г/л) глюкоза - 60, (NH4)2S04 - 5.0, КН2Р04 - 1.5, MgS04-7 Н20 - 0.5, Ca(N03)2- 4 Н20 - 0,1, кукурузный экстракт -1,0, микроэлементы (мг/л): MnS04 -5Н20 - 5.0 или МпС12-4Н20 - 4,0; ZnS04-7H20 - 0,01, FeCl3-6H20 - 0,005, вода дистиллированная; pH 6,8-7,0.

Плотные среды, используемые для газонов бактерей-мишеней при анализе АНМФ: Bacillus subtilis и В. cereus культивировали на среде А с добавлением 2% агара, поддерживали на скошенном картофельном агаре. Аэробный рост газонов бацилл - 24 ч при 30°С. На поверхность среды наносили по 1 капле жидких культур.

В. coagulons растили на среде: (%) NaCl - 1,0; пептон - 1,0 с добавлением бульона Хоттингера [Стоянова и др., 2006]. Аэробный рост - 24 ч при 55°С.

Pseudomonas sp. и Е. coli растили также аэробно на плотной среде В при 30° менее

суток.

Для молочнокислых бактерий на чашках использовали среду MPC с добавлением агара (2%) и мела (0,5%). L. plantarum и L. fermentum растили анаэробно (в анаэросгатах), остальные МКБ - в присутствии воздуха. Выращивали в течение двух суток.

Качественный и количественный анализ ЛЖК (пропионовая и уксусная кислоты) проводили методом газовой хроматографии с использованием аппаратно-програмируемого комплекса на базе газового хроматографа «Кристалл 2000М», производитель СКБ «Хроматэк», г. Йошкар-Ола, Россия. Параметры колонки HP FFAP составляли 50 х 0,32 х 0,5 мм. Детектор - пламенно-ионизационный. Образцы готовили путем перевода солей ЛЖК в форму кислоты. Концентрацию молочной кислоты измеряли методом ВЭЖХ.

Выявление бактериоцин-подобных веществ (БПВ). Культуры выращивали на разных средах. В первом опыте - на ГКС в течение 4-х суток. В последующих опытах по выявлению бактериоцинов - на мСС в течение 5-6 суток. КЖ штаммов ПКБ получали центрифугированием культур при 17000 об/мин (30000gJ, 20 мин с охлаждением. Центрифуга фирмы «Beckman» (США), модель J2-21. Диализ проводили в 0,02 M К-фосфатном буфере с использованием бензоилированных диализных мешков фирмы

«Sigma» (США) с размером пор, пропускающих молекулы от 1200Да и менее. Осаждение полимеров из КЖ культур, выращенных на мСС, проводили постепенным добавлением (на магнитной мешалке) насыщенного раствора сульфата аммония до конечной концентрации насыщения 77% при комнатной температуре. Осадки собирали на мембранных фильтрах с диаметром пор 0,4 мкм, перерастворяли в 0,02 М К-фосфатном буфере pH 7,0, диализовали ночь при 6°С. Диализное соотношение 1:200. Измеряли концентрацию белка и обрабатывали протеиназой К фирмы «Amresco» (ClllA)/«Helicon» (Россия). Для выявления БПВ использовали метод диффузии в агар: в лунки (0 = 0,8 см) на свежезасеянных газонах вносили препараты штаммов Pr 1 - Рг 7 по 0,1 мл КЖ. Два часа выдерживали при комнатной температуре и затем инкубировали при 30°С 18-20 ч или 4248 ч (МКБ). Контроль за микробиологической чистотой культур ПКБ и микроорганизмов-мишеней проводили путём световой микроскопии с помощью микроскопа LABOVAL-4 (Carl Ceizz, Yean). Рост жидких культур измеряли на спектрофотометре "Specol", model 10, Germany, при 540 нм и прямым подсчётом клеток в поле микроскопа и по КОЕ/мл. А54о (по суспензии клеток Рг 4) в 1 см кювете = 0,301 мг/мл АСБ = 3,3 х 108 КОЕ/мл.

Для оценки антиоксидантной активности использовали жидкие культуры штаммов P. freudenreichii (Рг 2) и P. freudenreichii (Рг 4), выращенные на мСС в течение 72 ч при 30°С при свободном доступе воздуха с периодической нейтрализации образуемых кислот. Концентрация живых клеток в конце культивирования составляла (3-4) х 109 КОЕ/мл. Для измерения антиоксидантной активности штаммов бактерии использовали электрохимический метод катодной вольтамперометрии. Методика эксперимента заключалась в получении вольтамперограмм катодного восстановления кислорода с помощью портативного программируемого анализатора «Антиоксидант» (фирма «Полиант», г. Томск). В основе метода лежит модельная реакция электровосстановления Ог, протекающая на индикаторном электроде по механизму, аналогичному восстановлению кислорода в тканях и клетках организмов, способных к кислородному дыханию. В данном способе (pH в измерительной ячейке 6,8-7,0) рассматривается одноэлеетронное восстановление кислорода с образованием активных кислородных радикалов Ог" . Снижение их концентрации в растворе регистрируется по уменьшению катодного тока ЭВ О* на ртутно-пленочном электроде в области потенциалов от 0 до - 0,7 В. Измерения проводили на каф. биофизики Томского гос. университета.

В процессе разработки способа приготовления хлеба, устойчивого к «картофельной болезни, использовали следующие мучные среды:

Мучная среда I (оМПЗ) или «осахаренкая» мучная пшеничная заварка. Для приготовления оМГО пшеничную 2 сорта заваривали водой с температурой 85-90°С (соотношение мука:вода=1:3). После охлаждения заварки до 55°С вносят ферментные препараты а-амилазы (Bakezyme P500BG, пр-во фирмы DSM, Германия) и глюкоамилазы (Bakezyme AG800BG, производство фирмы DSM, Германия) в количестве 0,001% и 0,01% к массе муки в заварке соответственно. Продолжительность гидролиза при температуре 55° С 1,5 часа.

Мучная среда 2 (MC 2). Среду готовили путем заваривания муки кипящей дрожжевой водой в том же соотношении и после охлаждения обрабатывали амилазами, как описано выше, а также протеолитическими ферментами (DSM Bakery Ingredients; Bakezyme В 500 (нейтральная бактериальная протеаза). Дозировка: 0,5 - 3,0 г/100кг.

Водный экстракт осахаренной мучной среды (ЭМС). Для приготовления ЭМС оМПЗ центрифугировали: 45 мин при 9000 тыс. об/мин. В результате получали прозрачный водный раствор, сводный от нерастворимых компонентов оМГО.

Экстракт мучной среды оМПЗ, предварительно ферментированный с помощью L. delbrueckii, обозначен как ЭМС/LD.

Lactobacillus delbrueckii штамм 40 получен из коллекции ГосНИИ ХП. Штамм депонирован в ВКПМ под номером В-3887. Бактерию поддерживали на солодовом сусле (12%) с дробиной, культивируя 24 - 48 ч при 50 - 52°С. Выращенную культуру хранили при 6 - 10°С. В опытах L. delbrueckii культивировали (18 - 20 ч при 50°С) на оМПЗ.

Моделирование процесса накопления закваски на основе ПКБ для внесения её в дрожжевое пшеничное тесто состояло в последовательном (поэтапном) двукратном разбавлении культуры P. freudenreichii, выращенной на ЭМС/Ld, с помощью этой же среды. Значение pH сразу после разбавления поддерживали нейтральным. Накопление закваски в условиях, соответствующих производственным, проводили на натуральной нестерильной оМПЗ (без центрифугирования). Подавление развития контаминирующих муку молочнокислых бактерий достигалось предварительной 2 ч экспозицией смеси (на каждом этапе) в присутствии молочной кислоты, образованной L. delbrueckii.

Световую микроскопию фиксированных окрашенных препаратов проводили с помощью микроскопа Laboval-4, Zeiss, Germany. Компьютерное изображение получено с помощью микроскопа Axioskop (Zeiss, Germany) системы автоматического анализа изображений KS 300, Zeiss (Germany). Увеличение при съемке хЮОО.

Статистическую обработку полученных результатов выполняли с применением разных подходов в зависимости от количества повторных измерений. Среднее арифметическое значение со стандартным отклонением вычисляли в опытах с большим количеством вариант (программа SigmaPlot 3.02). Медиану (Me), т.е. среднее по величине показание с максимальным отклонением (в %), использовали в экспериментах с тремя повторностями [Венчиков, Венчиков, 1974].

Результаты исследования

1. Секвеиирование фрагментов 16S рРНК и филогенетический анализ исследуемых штаммов ПКБ

На основании подробного сравнительного филогенетического анализа с использованием базы данных GenBank были получены результаты, позволившие найти положения новым штаммам на филогенетическом дереве [Van de Peer, De Wächter, 1994]. Уровень гомологии последовательностей анализируемых штаммов с типовым штаммом Р. freudenreichii DSM 4902т (GenBank АС number У10819) был высоким, более 99 % (для Рг 4 = 99,6%). Все исследуемые штаммы вошли в кластер, образованный имеющимися в базе данных штаммами вида Р. freudenreichii, включая типовые штаммы двух подвидов этого вида: Р. freudenreichii ssp. freudenreichii и Р. freudenreichii ssp. shermanii (рис. 1). Штаммы Pr 1 - Pr 7 имели близкие последовательности генов 16S рРНК с высоким процентом сходства между собой (99,3 - 99,6%). При этом секвенированные фрагменты генов 16S рРНК изучаемых штаммов обнаружили высокий уровень гомоло-гий с аналогичными последовательностями различных штаммов Р. freudenreichii (99,1 -99,9%). Ранее столь же высокий уровень сходства генов 16S рРНК (доступных из базы данных GenBank) был обнаружен между штаммами, принадлежащими к различным видам рода Propionibacterium: не только Р. freudenreichii, но и других, например, Р. acidipropionici (98,9-100%) и Р. acnes (98,1 - 100%). Следовательно, обнаруженный нами уровень сходства генов I6S рРНК исследуемых штаммов с известными представителями вида Р. freudenreichii соответствует наблюдаемым уровням внутривидового сходства у других видов рода Propionibacterium. Согласно существующим представлениям [Stackebrandt, Goebel, 1994], этот уровень соответствует внутривидовому. При этом уровень сходства последовательностей изучаемых штаммов с представителями других (помимо Р. freudenreichii) видов рода Propionibacterium был заметно ниже (91,1 - 95,7%). На основании полученных данных можно идентифицировать изучаемые штаммы Pr 1 - Рг 7 как представителей вида Р. freudenreichii.

Штамм Рг 4 был заявлен в GenBank и зарегистрирован как Р. freudenreichii RVS-4-irf (International GenBank АС number EU418709). Штаммы Pr 2 {Р. freudenreichii RVS-2-ims) и Pr 4 (P. freudenreichii RVS-4-irf) депонированы в ВКПМ.

100 ff I/

Propionibacterium acnes #1447 ( AB041617) Propionibacterium acnes #8261 (ABW2291) Propionibacterium acnes WD1 (AY642054) Propionibacterium acnes #8644 (AB10&477) Propionibacterium acnes #5255 (AB108482) Propionibacterium acnes (DQ631890) Propionibacterium acnes 76995 (AF146370) Propionibacterium acnes IFM10239 (AB097215) Propionibacterium acnes E02001-04 (AY741059) Propionibacterium acnes MZ 169082 (AF154832) — Propionibacteria acnes 63597 (AF145256) Propionibacterium acnes LIP4 (Y12288) Propionibacterium acnes DSM 1897T(X53218) Propionibacterium acnes #8800 (AB 108481) Propionibacterium acnes #7375 (ABM2290) Propionibacterium avidum DSM4901T (AJ003055)

-Propionibacterium g-anutasum DSM 20700T(AJ0030S1)

Propionibacterium jenserúi NCFB 571 (AJ937773) Propionibacterium jensenii DSM 20535T (AJ704571) 'Propionibacterium thoenti DSM20276T (X53220) Propionibacterium microaerophilum M5T (AF234623) Propionibacterium acidipropionici DSM20272 (X53221) Propionibacterium acidipropionici DH42 (AY360222) Propionibacterium acidipropionici ATCC 4955 (AY533299) Propionibacterium acidipropionici NCFB 563T (AJ7Ü4569) Propionibacterium australiense LCDC-98 A072T ( AF225962) Propionibacterium tyclohexanicum ATCC 7004291" (D82046) Propionibacteriumfreudenreichii ssp. freudenreichii DSM 2027IT (X53217)

Pr-2

%

Г

1 p¡

■ Propionibacterium freudenreichii JS53 (AJ009989) | Propionibacterium freudenreichii ssp shermanii DSM 4902T (Y10819)

■Pr-5 ^Pr-l rPr-7 ■ Pr-4 jPr-6

r Propionibacterium freudenreichii ISU P59 (A Y533300)

'Pr-3

jPropionibacteriumpropionicum DSM 43307T(X53216)

■ Propionibacterium propionicum VA1535 00 (AF285117)

• Tessaracoccus bendigoniensis ACM 5119T (AF038504) — Propionimicrobium fymphophilum DSM49031 (AJ003056)

■ Luteococcus japonicw DSM 10546T (Z78208)

\

-Brooklawniacerclae BL-34T(DQ196625)

Microlunatusphosphovorus DSM 105 55T (Z78207)

——— Propmiferan innocua ATCC 49929т (AF227165) Рис. 1. Филогенетическое положение штаммов Р. freudenreichii Pr 1 - Pr 7

2. Пробиотически значимые свойства исследуемых штаммов Р./геш1епге1ски и их действие на макроорганизм

2.1. Выживаемость штаммов Р. &еис1епге1сЫ1 в условиях модельного (неполного) ЖКТ Наблюдали, что все семь штаммов исследуемых ГЖБ росли на ГКС после их предварительного инкубирования (3 ч при температуре тела) в присутвии желудочного сока, который вводили в среду до конечного значения рН 2,5 - 3,0, или 0,5 - 1,0 % эмульсии желчи (конечный рН 8,0 - 8,4) после нейтрализации среды способны к росту.

Данные представленные на рис. 2, показывают, что после инкубирования клеток в условиях «желудка» или «тонкого кишечника», жизнеспособность культуры Рг 4 сохранялась. Снижение роста ПКБ на богатой среде по сравнению с контролем, очевидно, вызвано гибелью или инактивированием части клеток в агрессивных условиях.

Оценили уровень выживаемости ПКБ в неполном модельном ЖКТ (по концентрации живых клеток) в результате последовательного инкубирования в условиях «желудка» (3 ч, смесь А) и, после нейтрализации кислот, «тонкого кишечника» (5 ч, смесь Б). Перед вторым этапом инкубирования смеси хранили в течение ночи при 6°С и при нейтральном значении рН (табл. 1).

Время,ч

Рис. 2. Способность Р. /геис1епге1сЬи Рг 4 к росту на богатой среде (ГКС) после инкубирования в условиях искусственного желудка и (параллельно) тонкого кишечника: 1- контроль: рост на ГКС, в качестве посевного материала (10%) использовали 3-х суточную культуру, выращенную на ГКС; 2 - опыт: рост на ГКС после экспозиции культуры в

реакторе с желудочным соком (модель "желудок"). 3 - опыт: рост на ГКС после экспозиции с желчью (модель «тонкий кишечник»).

Таблица 1.

Выживаемость P. freudenreichii Рг 4 в условиях модельного (неполного) ЖКТ

Повторные (независимые) эксперименты До начала экспозиции (без инкубации), контроль 0-времени После экспозиции (инкубация в смесях А—>Б), опыт

КОЕ/мл log % по log КОЕ/мл log % по log

1. 2,8 х 109 9 100 4,6 х 106 6 66,7

2. 3,7 х 109 9 100 1,0 х 106 6 66,7

3. 9,7 х 108 8 100 9,1 х 105 5 62,5

Среднее (Me) 3,7 х 10' 1,0 х 106

Таким образом, на примере P. freudenreichii штамм Рг 4 мы показали, что ПКБ более чем на 60% (по log КОЕ/мл) могут сохранять жизнеспособность в ЖКТ. Выживание в агрессивной среде ЖКТ клеток пропионовокислых бактерий - важное условие для проявления их пробиотического (метаболически обусловленного) действия в ЖКТ, а также основание для изучения их пробиотически значимых свойств.

2.2. Действие штаммов P. freudenreichii на макроорганизм

Мы провели испытания двух штаммов классических ПКБ (P. freudenreichii, Рг 2 и Рг 4) на развитие, сохранность и продуктивность птицы (перепелов). В результате проведённых исследований под влиянием введённой КЖ пропионовых бактерий наблюдали увеличение сохранности поголовья птицы, прирост живой массы и сокращение расхода кормов. Данные, полученные в экспериментах, представлены в таблице 2.

Таким образом, введение культуральной жидкости (экзометаболитов) штаммов Р. freudenreichii в рацион животных обеспечивает повышение сохранности особей, стимулирует их развитие, снижает расходы корма на единицу продукции. По сути, в данном случае мы констатируем положительное действие экзометаболитов ПКБ, которые содержатся в культуральной жидкости, но не рассматриваем здесь вопрос о функции собственно живых клеток ПКБ в ЖКТ птиц.

Таблица 2.

Эффект культуралыюй жидкости Р. /геш!гпге1ски двух штаммов на состояние птицы (перепела) в условиях фермы при введении в рацион

Группа

Контрольная I опытная II опытная III опытная

Сохранность, % 91 95 96 93

Живая масса в начале опыта, г 8,4±0,08 8,3±0,09 8,2±0,10 8,2±0,08

Живая масса в конце опыта, г 169,0±2,7 175,б±2,4 177,5±2,8 172,2±3,0

Прирост живой массы, г:

Абсолютный 160,4±3,7 167,3±4,2 169,3±4,8 164,0±2,4

Среднесуточный 2,67±0,02 2,79±0,03 2,82±0,04 2,73±0,06

% к контролю 100 104,3 105,6 102,2

Потреблено кормов на 1 голову, кг 0,890 0,880 0,891 0,900

Затраты корма на 1 г прироста, г 5,55 5,26 5,26 5,49

Контроль — птицу содержали на стандартном рационе

I группа — птице дополнительно скармливали КЖ штамма Рг 2

II группа — птице дополнительно скармливали КЖ штамма Рг 4

III группа — птице (в качестве контроля) скармливали среду Блаурока.

Последнее требует специального изучения, однако полученные результаты позволяют прогнозировать положительный эффект цельных культур классических ПКБ на физиологию животных (и человека). Результаты данного эксперимента - показатель пробиотического потенциала классических пропионовокислых бактерий вида Р. freudenreichii, а именно исследуемых штаммов.

2.3. Иммунотропные свойства исследуемых штаммов P. freudenreichii

Ранее было известно, что кожные (cutaneous) ПКБ, например, P. acnes и некоторые другие виды, способны проявлять иммунотропные свойства в отношении организма животного и человека [Воробьёва, 1995]. Мы впервые наблюдали, что все семь исследуемых штаммов, которые принадлежат классической («молочной») ПКБ, P. freudenreichii, обладают иммунотропной активностью (в разной степени), и это является проявлением одного из её пробиотических свойств. В исследовании применили модель ex vivo, в которой оце-

15

нивали образование цитокинов в крови человека под действием клеток исследуемых штаммов классической ПКБ. Полученные результаты по образованию разных цитокинов (их абсолютные концентрации) под действием клеток семи штаммов представлены в рукописи диссертации. Результаты были получены в трех независимых опытах при трёхкратном повторении измерений для каждого штамма. Стимуляция синтеза цитокинов (некоторых интерлейкинов ИЛ, интерферона ИНФ-г, фактора некроза опухолей, ФНО-а) клетками ПКБ как правило превышала таковую препаратом «Иммунал», особенно в отношении синтеза ФНО-а. В табл. 3 представлены данные по ИС в отношении некоторых цитокинов.

Таблица 3.

Индекс стимуляции (ИС*) образования некоторых цитокинов под действием клеток ПКБ (2 мкг/мл сырой биомассы) в системе ex vivo

Препарат ПКБ Индекс стимуляции образования цитокинов

ИЛ 1-РА ИЛ-8 ФНО-а ИНФ-г

Pri _] 6,61 18,2 295,9 2,04

Рг2 6,13 22,5 247,2 2,04

РгЗ 5,30 18,1 515,21 0,66

Рг4 5,51 18,3 641,51 0,87

Рг 5 6,57 П,2 275,63 0,97

Ргб 4,71 20,4 566,86 0,00

Рг 7 5,78 16,9 632, 67 0,97

Иммунал (мкг/мл):

300 0,33 8,65 2,80 0,51

30 0,00 4,46 2,95 0,77

3,0 0,00 1,60 2,51 0,41

* ИС рассчитывали относительно показаний спонтанно образованных цитокинов в каждом отдельном эксперименте. Данные представляют собой медиану при отклонениях менее 10% для трёх вариант типичного из трёх независимых экспериментов.

Подтверждением полученным нами результатам служит работа, выполненная в Финляндии независимо и практически одновременно с нашей. На изолированных моно-нуклеарных клетках крови человека in vitro установлена способность клеток разных бак-терий-пробиотиков (в том числе P. freudenreichii JS), взятых в соотношении 1:1 (клетки бактерий: моноциты), индуцировать синтез цитокинов. Эта способность сильно варьировала у разных штаммов бактерий [Kekkonen et al., 2008]. Для клеток другой классической пропионовокислой бактерии: P. jensenii 702, недавно показаны адъювантные эффекты (на крысах) в отношении вакцины на основе Mycobacterium tuberculosis [Adams, Huang, 2008].

2.4. Внеклеточный витамин Вп (корриноиды) и некоторые Ферменты культуральной жидкости штаммов Р. [геис/енге/сИИ

Экзометаболиты пробиотиков непосредственно влияют на метаболизм макроорганизма-хозяина в результате их всасывания в кровь, но и микроорганизмы, составляющие микробиоту ЖКТ, находятся под их влиянием. Среди экзометаболитов пробиотиков есть не только ингибиторы, так и стимуляторы (например, бифидогенные факторы) роста бактерий. ПКБ образуют широкий спектр метаболитов (см. таблицу 1 в рукописи диссертации), полезных для человека. Особое место среди них занимает витамин В12, который в животном организме участвует в двух метаболических процессах: биосинтезе метионина и катаболизме жирных кислот через пропионил-КоА. Он содержится внутри клеток ПКБ [Рыжкова (Иордан), 2003].

Мы попытались измерить его внеклеточное содержание в среде (мСС с повышенным содержанием соли кобальта) с тем, чтобы в предварительном плане оценить его доступность для клеток эпителия в ЖКТ. Наши исследования цельной КЖ и осаждённых из неё белков показали, что в среду выделяется очень малое количество соединений группы витамина В|2 Оно на 3 - 4 порядка ниже, чем в клетках бактерии (по расчётам на единицу объёма культуры) и составляет 0,1 - 0,3 пг/мл. Поэтому ПКБ как источник внеклеточного витамина может иметь реальное значение, только если цельная культура будет поступать в ЖКТ в сконцентрированном виде.

Вместе с тем, КЖ штаммов Р. /геис1епге!ски проявили разную по величине протео-литическую активность (ПА), которая зависела от состава среды, времени культивирования и рН культуральной жидкости (рис. 3). При этом соотношение общих ПА (в 100 мкл КЖ) для штаммов в целом сохранялось. После вычетания контроля и с учетом концентрации белка в КЖ мы рассчитали удельные активности протеаз, которые выражали как А440/МГ белка. Активность КЖ в нейтральных условиях была наибольшей у штамма Рг 2 (0,3); средней у штаммов Рг 1, 5 - 7 (0,13 - 0,16 - 0,2 - 0,16 соответственно) и наименьшей у штамма Рг 4 (0,1). В кислых условия (рН 4,5) активность КЖ у всех штаммов была ниже, чем при значении рН, равном 7,0. Пробиотическое значение ПА штаммов Р. /геи(1епге1скИ может заключаться в протеолизе трудноперевариемых белков, например, коллагена или гликопротеидов, если цельная культура будет поступать в ЖКТ животного в сконцентрированном виде.

Липолитическую активность, которая в принципе свойственна классическим ПКБ, развивающимся в сырах, выявить не удалось, возможно, из-за культивирования бактерий в данных условиях опытах на минимальной среде без индукторов.

018 от

3 014 i 013 I Ol

E сое

cä О 04

1Шл»м ПКБ

S

ШУУЛМ

t 1 ) * J f 7

Шггин ПКБ

Рис. 3. Протеолитическая активность ЮК штаммов ПКЬ А 48-ч культуры; Б. 96ч культуры

Обозначения ■ на ГКС, рН=7 на FKC, рН<7', -на мСС,рН=7; -на мСС, рН<7, ГКС; □- мСС

2.5. Избирательная антимикробная активность исследуемых штаммов Р. freudenreich!i

Поддержание (регуляция) баланса микроб йоты в ЖК'Г - сложный и малоизученный процесс. Однако именно он рассматривался как первейшая функция проб котиков [Rolfe, 2000; Шендеров, 2001] Здесь возникает двойственная проблема: пробиотикн должны подавлять развитие нежелательных микроорганизмов в ЖЕСТ, но, по крайней мере, не влиять негативно на состояние автохтонных Пробиомков. Пробиотикн условно подразделяют на и ммуно Модулирующие, метаболические и антимикробные [Суворов, 2007}. Классические ПКБ и, в частности Р. freudenreichit, можно отнести ко всем трем категориям. Антимикробная активность имеет большое значение для нормализации физио-

логического состояния животного и человека мутйм регулирования микробиоты ЖКТ,

Мы выявили подавляющее действие Р freudenreichii семи исследуемых шаммов (fr 1- Рг 7). а отношении [рамположительных и грамотрицательных бактерий. Некоторые из них (Е, coli) .могут вызывать дисбаланс микробиоты ЖКТ (колит). Другие имеют прямое отношение к порче пищевых продуктов (бациллы, пес в до.монады) Отметим, "fro определенные штаммы Bacillus subtilis являются пробиотиками для животных, переваривающих клетчатку (работы группы л.б н Н.А Ушаковой), поэтому в случае подавления их развития ПКБ совместное их применение в комплексных препаратах нецелесообразно.

Испытывали цельные жидкие культуры штаммов ПКБ. выращенных на пСС среде при нейтральном значении р([. Наблюдали зоны подавления роста для следующих бактерий-мишеней: Bacillus subtilis 40, /i. cereus 9, Pseudomonas pulida 96. Ps. aeruginosa 50. E. coli 85. E. coli Ifl9 Эффект подавления был наиболее выражен в отношении В. subtilis, Ps, pulida и отсутствовал для В. coagulans (здесь не показано) На рнс. 4 выборочно представлены качественные данные по антибактериальной активности семи штаммов Р. freudenreichii. Подавление роста патогенных энтеробактерий: Yersinia entercolitica, Salmonella sp и Listeria monocytogenes, разными штаммами классических ПКБ ранее установили исследователи из Польши | Warm i л ska-Radi ко et al., 2001; 2002; Laniewska-Troekenhem el al., 2004). Антагонистическое действие ПКБ против некоторых мнцелиаль-ных грибов (плесеней) констатировано в Швеции [Lind el at., 2007]. Важным фактом оказалась толерантность L. casei к культуре P. freudenreichii, указывающая на возможную биосовместимость МКБ и ПКБ. При нейтральном значании pH антимикробными факторами (АНМФ) исследуемых штаммов P. freudenreichii ввились пропионаты п впервые обнаруженные у изучаемых штаммов бактерноцин-подобныевещества.

Влияние культур Р. freudenreichii (Рг 1 - Рг 7 ) на рост некоторых бактерий-ми шеи ей на плотных средах. Нижние фото: (слеза) «вертикальный» штрих - L.casei С1; (срава) «вертикальный» штрих - ['.freudenreichii Рг 4

Мы установили действующие концентрации пропноната натрия, вызывающие 90% подавление роста, на некоторые микроорганизмы-мищеии, растущие на жидких средах Данные выборочно представлены на рнс. 5. Наибольшую чувствительность проявили штаммы р. Bacillus и Pseudomonas. Достаточно устойчивыми к П-Na в высокой концентрации (0,5% и более) оказались дрожжи и молочнокислые бактерии (МКБ).

Выявленные разные действующие концентрации пропноната косвенным образом позволяют прогнозировать эффективность штаммов Р. freudenreuchii как антимикробных агентов в ЖКТ (в толстом кишечнике при pN, близком к нейтральному) против тех или иных м икр организма в. Кроме того эти данные важны для применения ПК Б в качестве биоконсерваптоп.

Badiiasiiiiäis 40

\

Pseudomonas aeruginosa 50 (I) ё Ps. putiäo 96 (2) j ärtüaaa А

О OL 02 0 3 0 4 OS Об

К'онжнтрнцня прел шпата, %

*

о

02 0,4 0.6 O«

KoBwvrpeoHH иростоиатя, %

13)

& certyisae Y625

E. coli 85

0

0.1

03

01

0

0.5

L5

2

Кшадолрюя гфапкмтц •/•

Рис. 5. Выявление действующих концентраций пропионата натрия как АНМФ на рост микроорганизмов-мишений

Испытание КЖ P. freudenreuchii в аналогичных опытах с бациллами как мишенями показало её более сильное действие по сравнению с чистым пропионатом, взятом в тех же концентрациях, что и в КЖ. Это указывало на образование клетками данной пропионовой бактерии других АНМФ помимо пропионатов. Впервые у наших штаммов обнаружили антибактериальные экзометаболиты, отличные от ЛЖК и их солей, которые, предположительно, имеют полипептидую природу (молекулярная масса - более 1200 кДа) и действуют в нейтральной среде (Таблица-схема 4). Эти бактериоцин-подобные вещества (БПВ) проявили ингибирующее действие в отношении бактерий pp. Bacillus (штаммы Pr 1, Рг 4 - 7); Escherichia (coli) - штамм Рг 6; Lactobacillus: L. casei ( Pr 3), L. acidophilus (Pr 1, 3, 5); L. plantarum (Pr 1); L. brevis (Pr 1 - 6). Действия бактериоцин-подобных веществ различались, если препараты были получены при культивировании штаммов P. freudenreichii на разных средах (богатой или минимальной) и по-разному приготовлены. Оно также зависело от штамма бактерии-мишени.

Таблица-схема 4.

Выявление антибактериального действия белковых препаратов из КЖ штаммов ПКБ, выращенных на минимальной среде

Бактерии-мишени Propionibacterium freudenreichii

Prl Pr 2 РгЗ Pr 4 Pr5 Pr6 Pr7

Bacillus subtilis 40

В. cereus 9

В. coagulons 429

Pseudomonas putida 96

Ps. aeruginosa 50 ?

E. coli 85

E. coli 109

Lactobacillus, casei Cl ? Ü ?

L. acidophilus 146 ?

L. brevis 5 ъ Ü

L. brevis 78 Ü

L. plantarum A63

L. plantarumiQ

L.fermentum 34

Ф - выявлена активность БПВ. "хД* - Препараты обработаны протеиназой К (контроль на белок). Пропуск - активности нет.

2.6. Антиоксидантпые свойства жидких культур штаммов Р. А-ешкпгегски

Снижение избыточной концентрации активных форм кислорода в организме животного (человека) благоприятно отражается на его жизнедеятельности. Клетки данной бактерии обладают ферментами антиоксидантной защиты: супероксиддисмутазой, катала-

зой и пероксидазой. В пробиотическом отношении важно, чтобы не только клетки-пробиотики защищали себя, но культура в целом, в случае её потребления макроорганизмом, обладала антиокислительными возможностями. С использования высокочувститель-ного метода катодной вольтамперометрии на примере двух штаммов выявили выраженную антиоксидангную активность жидких культур Р. /геис!епге1сИИ (рис. 6 и табл. 5).

Таким образом, новые штаммы Р. /геи<1епге1сЬИ проявляют пробиотическое действие на макроорганизм и обладают свойствами, частично объясняющими это действие. Исследование не ограничивается полученными результатами и требует продолжения, однако представленные штаммы классической пропионовокислой бактерии на основании выявленных свойств можно отнести к пробиотикам всех трёх категорий.

Рис. 6. Вольтамперограммы электровосстановления кислорода в отсутствие (1) и в присутствии (2-6) образца культуры Р. /геис1епге1с11И (штамм Рг 2) при разбавлении 1:100 (А), 1:20 (В) и 1:10 (С) и при времени опыта 1=4 мин (2), 1=8 мин (3), 1=12мин (4), 1=16 мин (5) 1=20 мин (6)

Таблица 5.

Значения кинетического критерия антиоксидантной активности К образцов жидких культур ПКБ и питательной среды (п = 3, Р = 0,95)

Наименование образца Разбавление К„, мкМ/ мин Эг

Р. /геийепгасЬи Я УЯ-2-ипз:

образец 1а 1 100 0,41 0,084

1 20 1,62 0,071

1 10 4,12 0,031

образец 16 1 100 0,53 0,047

1 20 1,84 0,038

1 10 1,84 0,014

Р. /геиЛепгаски Я КУ-4чг/:

образец 1а 1 100 0,51 0,031

1 20 1,53 0,016

1 10 3,68 0,020

образец 16 1 100 0,41 0,057

1 20 1,56 0,049

1 10 3,82 0,020

Питательная среда 1 100 0,12 0,021

1 20 0,24 0,023

1 10 0,38 0,022

К5Г - кинетический критерий антиоксидантной активности; отражает количество прореагировавших с анализируемым образцом кислородных форм во времени 8Г - относительное стандартное отклонение:

3. Разработка способов применения Р. /гешкигасИи для защиты пшеничного хлеба от «картофельвой болезни», вызываемой развитием бацилл

Р. /гешкпгккИ как биоконсервант пищевых продуктов перспективна и уже давно применяется, если учесть древнее сыроделие как стихийный способ консервирования молочного белка-казеина. Эту бактерию относят к «пищевым» микроорганизмам, а с учётом её пробиотических свойств применение в защите продуктов от порчи становится особенно привлекательным. Отметим, что в отличие от молочной и уксусной кислот пропионо-вая кислота (пропионаты) как антимикробный фактор активна и при нейтральном значении рН. Последнее важно для протекции пищевых продуктов без их подкисления. При этом в результате воздействия ПКБ на пищевой субстрат (продукт) происходит его обогащение веществами-нутрицевтиками.

Положительный эффект пропионовой кислоты (пропионата) и ПКБ в защите хлеба от гнилостного поражения известен давно. Проблема состоит в способе применения в крупномасштабном производстве. Мы предложили разные подходы: производство биомассы ПКБ на подходящих для пищевых продуктов средах с обеспечением высокого уровня образования пропионатов, получение водных растворов пропионовой кисло-ты/пропионата путём сбраживания Сахаров суспензиями клеток ПКБ. Иммобилизация клеток ПКБ, с их реактивацией, для получения пропионовой и уксусной кислот была разработана в нашей лаборатории ранее. Эти способы требуют отдельных производств.

Способ защиты хлеба должен быть экономичным и удобным для хлебозаводов. В России давно применяют так называемую заквасочную технологию на основе молочнокислых бактерий, которая позволяет накапливать закваску (перед внесением её в дрожжевое тесто при замесе) в геометрической прогрессии путём двукратного поэтапного разбавления свежей мучной средой.

Мы установили, что ПКБ, в отличие от МКБ, слабо развиваются на обычной мучной среде и постепенно «вымываются» из неё при разбавлениях. В результате проведённой работы по её обогащению (с использованием в опытах водного экстракта мучной среды, ЭМС) удалось «заставить» ПКБ удваивать биомассу в течение требуемого периода времени для поэтапного разбавления, однако этот подход имел ограничения.

Успешным оказался способ с предварительным выращиванием на мучной среде L. delbrueckii: в этом случае лактат служит субстратом для ПКБ. По нашим наблюдениям (и в соответствии с литературными сведениями) в результате развития L. delbrueckii может происходить модификация белков муки с образованием пептидов-стимуляторов для роста ПКБ. Кроме того 2-ч экспозиция с молочной кислотой (на каждом этапе, перед нейтрализацией среды) препятствовует развитию в нестерильной натуральной закваске контами-нирующих МКБ, обычно вытесняющих ПКБ.

Модельные опыты проводили с применением ЭМС/Ld, т.е. ферментированного с помощью L. delbrueckii водного экстракта осахаренной мучной заварки, оМПЗ (рис. 7), а затем использовали натуральную нестерильную мучную среду для культивирования Р. freudenreichii RVS-4-irf вслед за L. delbrueckii 40. В последнем случае условия были близки производственным. Натуральная закваска на основе двух культур длительно сохраняла неизменными исходные параметры (концентрацию клеток ПКБ и пропионатов), а также и микробиологическую чистоту (рис. 7). Выпеченный пшеничный хлеб не только значительно дольше не портился: (в камере ускоренного старения): в 4,5 раза по сравнению с контролем, но и обладал улучшенными органолептическими (приятный ореховый аромат, сдобный вкус) и физическими свойствами (больший объём и пористость).

12 3 i 5 й 7 S 9 Этапы |>:i ion или mill их \ G n]i :in ли ич

Hue, 7, Модель накопительной закваски па основе МКБ + Г1 КБ: поэтапное удвоение биомассы P. Jreudenreichii на среде ЭМС/ld после её двукратного разбавления той же средой и инкубирования

--п-ГТ---*-7—

\ • Lvl '' ■

¿ж *

V tL^/ «

__

V

J

■ м

Рис, 8. Световая микроскопия комплексной закваски натуральной мучной среды на основе /_,. с1е1Ьгиеск.И и Р.ргеиАепшскИКа- первый этап; 6- пятый этап

Таким образом, исследованные штаммы Р. /геиЛетекИИ проявили пробиотическое действие на животной организм, частично выживали в условиях агрессивной среды ЖКТ и обладали существенными пробиотическими свойствами. Учитывая признанную безопасность бактерии, её биопротекторные возможности, мы рекомендуем по крайней мере два наших штамма: Р./ге^епгекИИ ЯУ8-2-1тз и Р. [ггиЛгпге 'юЬИ 11У5-4-пТ и для испытаний на добровольцах в функциональном (клиническом) питании, и для биоконсервирования пищевых продуктов.

ВЫВОДЫ

1. Филогенетической анализ семи штаммов p. Propionibacterium, изолированных и фенотипнчески охарактеризованных ранее, позволил установить их принадлежность к одному н том же виду: Р. freudenreichü, несмотра на существенные фено-типические различна. Принадлежность к этому виду свидетельствует о безопасности данных бактерий для животных н человека. Два штамма: RVS-2-ims и RVS-4-irf, депонированы в ВКПМ; последний заявлен и зарегистрирован в International GenBank (AC number EU418709).

2. На примере Р. freudenreichü штамм RVS-4-irf с использованием модельного (неполного) желудочно-кишечного тракта показали, что пропиоповокислые бактерии способны сохранять жизнеспособность, при этом концентрация живых клеток снижается с 109 до 106.

3. Проведены испытания действия штаммов Р. freudenreichü RVS-2-ims н RVS-4-irf на организм животного (птицы). Пробиотический эффект штаммов обнаружен.

4. Выявлены и частично изучены пробиотически значимые свойства исследуемых штаммов:

- иммунотропные (по стимуляции образования цитокинов в крови в системе ex v;vo);

- избирательные антимикробные на основе пропионатов и бактериоцин-подобных веществ, действующих в нейтральных условиях;

- антиокислительные (показано для жидких культур методом катодной вольтамперомет-рии);

- экзометаболитные и экзоферментные (низкое внеклеточное содержание витамина Вп может быть существенным в сконцентрированных препаратах; протеолитическая активность проявляется как в кислых, так и в нейтральных условиях).

Для испытаний и применения в качестве пробиотических препаратов могут быть рекомендованы штаммы Р. /геиЛептсИи ЯУИ-ш и ЯУв^-И как наиболее изученные и эффективно действующие.

5. Разработан новый способ применения Р. /геиёептски в заквасочной технологии производства пшевичного хлеба для его защиты от гнилостных бактерий («картофельной болезни» хлеба): он включает последовательное культивирование на мучной среде £. ЛМтиесШ и пропионовокислой бактерии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Поландова Р.В., Быковченко Т.Б., Рыжкова Е.П., Данилова И.В., Хао Ли (КНР), Шес-таков А.И. Состояние и перспективы использования пропионовокислых бактерий в производстве пшеничного хлеба // Хранение и переработка сельхозсырья. 2007. № 5. С. 54-57.

2. Рыжкова Е.П., Ли Хао, Быковченко Т.В., Данилова И.В., Поландова Р.Д. Микробиологическая защита пшеничного хлеба с использованием трофической цепи Lactobacillus delbrueckii и Propionibacterium frcudenreichii // Биотехнология. 2009. № 2. С. 29-37.

3. Драчева JI.B., Дорожко Е.В., Аврамчук О.А., Короткова Е.И., Рыжкова Е.П., Ли Хао, Данилова И.В. Вольтамперометрическое исследование антиоксидантной активности жидких культур пропионовокислых бактерий // Вестник Московского университета. Биология. 2009. № 4. (в печати).

4. Поландова Р.Д., Быковченко Т.В., Ли Хао (КНР), Данилова И.В., Александрийская Г.В., Рыжкова Е.П. Способ предотвращения заболевания хлеба картофельной болезнью // Патент РФ (Регистрационный № 2008146213 от 25.11.2008, положительное решение).

5. Данилова И.В., Ли Хао., Быковченко Т.В., Рыжкова Е.П. «Пропионовокислые бактерии в защите пищевых продуктов от посторонней микробиоты». Тезисы и доклад на Всероссийском симпозиуме «Автотрофные микроорганизмы». МГУ, биологический факультет, декабрь 2005. Москва. Макс Пресс. 2005. С. 87.

6. Данилова И.Д., Ли Хао (КНР), Мао Ю (КНР), Рыжкова Е.П.

«Биосовместимость пропионовокислых бактерий с другими пробиотическими культурами». Тезисы и доклад на Международном конгрессе «Пробиотики, пребиотики, синбиотки и функциональные продукты питания». Санкт-Петербург, 15-16 мая 2007 г. Опубликовано в журнале «Клиническое питание» 2007. № 1-2. А37.

Подписано в печать 04.09.09 Формат 60x88 1/16. Объем 2 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 818 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ли Хао (КНР)

Введение.

Обзор литературы

Биология Propionibacterium Jreudenreichii в связи с решаемой проблемой.

1. Молекулярно-биологическая идентификация микроорганизмов и филогения пропионовокислых бактерий.

2 (А). Физиология и биохимия классической ПКБ (P. jreudenreichii) в основе её пробиотических и технологически значимых свойств.

Б). P. freudenreichii как кандидат в пробиотики: пробиотическое действие и пробиотически значимые свойства бактерии.

3. Практическое значение P. Jreudenreichii: применение и разработка способов микробиологической защиты пищевых и сельскохозяйственных продуктов.

Цель и задачи работы.

Экспериментальная часть.

Объекты, материалы и методы.

Результаты и обсуждение.

1. Секвенирование фрагментов 16S рРНК и филогенетический анализ исследуемых штаммов ПКБ.

2. Пробиотически значимые свойства исследуемых штаммов

P. freudenreichii и их действие на макроорганизм.

2.1. Выживаемость штаммов P. jreudenreichii в условиях модельного ЖКТ.

2.2. Действие штаммов P. freudenreichii на макроорганизм.

2.3. Иммунотропные свойства исследуемых штаммов P. freudenreichii.

2.4. Внеклеточный витамин В12 (корриноиды) и некоторые ферменты культуральной жидкости штаммов P. freudenreichii.

2.5. Избирательная антимикробная активность исследуемых штаммов

P. freudenreichii.

2.6. Антиоксидантные свойства жидких культур штаммов P. freudenreichii.

3. Разработка способов применения P. freudenreichii для защиты пшеничного хлеба от «картофельной болезни», вызываемой развитием бацилл.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Пробиотический потенциал штаммов Propionibacterium freudenreichii и микробиологическая защита хлеба"

Поиск новых пробиотиков - современная и актуальная проблема. Слова «пробиотики» и «антибиотики» противоположны по смыслу. Понятие «пробиотики» (ПРО) подразумевает живые микроорганизмы с их эк-зометаболитами, поступившие в организм естественным путём, например, перорально, и благоприятно воздействующие на физиологическое состояние макроорганизма: животного и человека (см. определение ВОЗ, 2002).

Одним из проявлений их действия является нормализация (регуляция) микробиоты желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) животного и человека. Возникновению и развитию концепции этого нового направления «на стыке» смежных наук: физиологии и экологии животных (человека), общей микробиологии, клинической микробиологии, науке о питании человека и других дисциплин, мы обязаны прежде всего русскому учёному, лауреату Нобелевской премии, Илье Ильичу Мечникову. В 1908 году он опубликовал работу по применению болгарской палочки (L. delhrueckii subsp. bulgaricus) в кисломолочных продуктах, что привело к массовому излечиванию желудочно-кишечных заболеваний на Балканах. Понятие «пробиотики» впервые упоминается Лиллеем и Стилвелом (Lilley, Stillwell) в 1965 году, однако исследования стали широко проводится только с 2000 года.

Важные вопросы, которые сейчас являются открытыми, состоят в следующем: обязательно ли ПРО должны выживать в ЖКТ (болгарская палочка нежизнеспособна), прикрепляться к эпителию кишечника, колонизировать его (размножаться), вносят ли они вклад в здоровье человека (животного) в целом и какой конкретно.

Среди пробиотических эффектов пробиотиков упоминаются: подавление нежелательной микробиоты и стимуляция истинных (индигенных, автохтонных, хозяйских) пробиотиков или эубиотиков в ЖКТ, иммуно-тропное действие (иммуномодуляция, иммуностимуляция), снижение воспалительных и аллергических реакций, противораковое действие и в целом оздоровление организма животного и человека. [Rolfe, 2000; Шендеров, 2001; Tannock, 2004; Jan, 2004; Nomoto, 2005; Суворов, 2007; Adams, Huang, 2008]. Эти эффекты ПРО-микроорганизмов определяются устойчивостью к агрессивным факторам ЖКТ, способностью функционировать в ЖЕСТ в транзиторном состоянии (если они не являются эубиотиками), а главное, пробиотическими свойствами, обусловленными их специфической физиологией и метаболизмом.

Поиск новых ПРО и правильное их использование, например, в функциональном (клиническом) питании, нацелено на уменьшение применения химических медицинских препаратов, в том числе антибиотиков.

В- пищевых технологиях микроорганизмы широко используются. Выбор микроорганизмов для тех или иных микробиологических (пищевых) производств заведомо оправдан, если они уже признаны ПРО, хотя не все «пищевые» микроорганизмы могут и должны, относится к ПРО. Важно, чтобы они были безопасными для человека и осуществляли целевой процесс. Вместе с тем, защита пищевых и сельскохозяйственных продуктов от портящих микроорганизмов и в настоящее время, не исключает применения химических препаратов-ксенобиотиков. Среди них - бензоаты, сорба-ты, антибиотики и значительно более вредные химические агенты, например, серный ангидрид.

В настоящей работе мы разрабатывали микробиологическую технологию производства пшеничного хлеба, защищенного от поражения гнилостными бактериями, его «картофельной болезни». Микробными агентами служили классические пропионовокислые бактерии.

Изоляты бактерий-были получены раньше в нашей лаборатории из сыра и по физиологии и морфологии были, отнесённые к р. Propionibacterium. Они имеют фенотипические разницы, но в результате филогенического анализа были признаны нами как принадлежащие к одному виду: Propionibacterium freudenreichii.

Эта бактерия с 2007 г. имеет статус QPS (Qualified presumtion of Safety) Европейского комитета по безопасности микроорганизмов (EFSA), который действует с 2002 года, и внесена в Список GRAS: Generally Recognized As Safe, USA [Lan et al., 2007]. Подвид этой бактерии (P. freudenreichii ssp. shermanii) на коловиквиумах GRAS обсуждался дважды: в 2003 и 2008. В настоящее время P. freudenreichii рассматривают в качестве кандидата в пробиотики.

Выявлению и начальному изучению пробиотических свойств семи исследуемых штаммов P. freudereichii, а также разработке эффективного способа приготовления пшеничного хлеба, устойчивого к заболеванию «картофельной болезнью», посвящена настоящая работа.

Работа выполнена в рамках Договора (2006-2009 гг) о научном и учебно-методическом сотрудничестве между Биологическим факультетом МГУ имени М.В. Ломоносова и Институтом систематики и экологии животных СО РАН.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Биология Propionibacterium freudenreichii в связи с решаемой проблемой

Пропионовокислые бактерии (ПКБ) образуют компактный филогенетический кластер в домене (империи или надцарстве) Bacteria. Они принадлежат к царству или филетической линии «Грамположительные бактерии», ветви с высоким содержанием ГЦ-пар в хромосомной ДНК. ПКБ объединены в род Propionibacterium, который входит в состав семейства Propionibacteriaceae.

Philum В XIY Actinobacteria Class I Actinobacteria Subclass I Actinobacteridae Order I Actinomycetales Suborder XII Propionibacterineae Family 1 Propionibacteriaceae Genus I Propionibacterium

Бактерии рода Propionibacterium по местообитанию и специальным фенотипическим и генотипическим характеристикам подподают под одну из двух категорий [Cummins, Johnson, 1992; Glatz 1992]: классические или "молочные" и "кожные"(си1епеоиз). В настоящее время идентифицированы (признаны) следующие виды пропионовокислых бактерий (ПКБ):

Классические (молочные) ПКБ P. freudenreichii (ssp. freudenreichii и ssp. shermanii) P. acidipropionici P.jencenii P, thoenii

Кожные ПКБ P. acnes P. avidum P. granulosum

P. propionicus (Arachnid propionica). P. limphophilum

ПКБ, имеющие особые местообитания

P. innocuum = Propioniferax innocula (1991) -обитает на коже людей, но имеет фенотип класических ПКБ;

P. cyclohexanicum (1997) выделена из сбраживаемого апельсинового сока, физиологически близка P. freudenreichiv,

P. microaerophilum (2001) - выделена из промывных вод оливок.

Taxonomic Outline of the Procaryotes Bergeys Manual of Systhematic Bacteriology, Second Edition. Release 3.0 July 2002 http://dx.doi.org/10.1007/bergeysoutline2Q0210

Основным объектом настоящей работы является классическая ("молочная") бактерия Propionibacterium freudenreichii (Pfr, ПКБ), поэтому именно ей мы уделяем внимание в настоящем Обзоре.

Местообитания Pfr — молоко и молочные продукты: свежее коровье молоко [Cummins, Johnson, 1981; Fessler et al., 1999 (а)], кисломолочные продукты длительного хранения, например, сброженная жирная сметана (каймак)[Шакирзянова и др., 2002], "твёрдые" и "полутвёрдые" сычужные сыры (индигенная микробиота, ПКБ) с высокой температурой второго нагревания (52 - 55°С), которые долго созревают (до 3-х месяцев и более) при пониженной температуре [Cummins, Johnson, 1981; Fessler et al., 1999 (b)]. Источником Pfr являются также сброженные травы, силос [Воробьёва, 1995; Merry, Davies, 1999].

В каймаке, сырах и силосах классические ПКБ имеет трофическая связь (образуют трофическую цепь) с молочнокислыми бактериями, которые предварительно сбраживают углеводы (лактозу, глюкозу, мальтозу) с образованием молочной кислоты, которую в форме лактатов ПКБ используют в качестве источников углерода и энергии.

Подходящие ("богатые") натуральные среды для культивирования Pfr в лабораторных и производственных условиях - это глюкозо- или лак-татно-кукурузная среда, лактатная молочная сыворотка и другие натуральные среды. Отдельные штаммы Pfr способны использовать лактозу, т. е. расти на обезжиренном молоке.

Вышесказанное свидетельствует о том, что Pfr тяготеет к пищевым субстратам, причём не вызывая порчи модифицируют их качество. Поэтому эту бактерию можно назвать "пищевым микроорганизмом".

Безопасность P. freudenreichii признаётся Европейским комитетом (European Food Safety Authority, EFSA), основанном в 2002 году: статус QPS(Qualified presumtion of Safety, http://www.efsa.europa.eu/EFSA/en.html'). Комитет США (Food and Drug Administration) недавно включил эту бактерию в список GRAS (Generally Recognized Absolutely Safety) под номером: 21 CFR133.195 [Lan et al., 2007].

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Ли Хао (КНР)

выводы

1. Филогенетический анализ семи штаммов p. Propionibacterium, изолированных и фенотипически охарактеризованных ранее, позволил установить их принадлежность к одному и том же виду: Р. freudenreichii, несмотря на существенные фенотипические различия. Принадлежность к этому виду свидетельствует о безопасности данных бактерий для животных и человека. Два штамма: RVS-2-ims и RVS-4-irf, депонированы в ВКПМ; последний заявлен и зарегистрирован в International GenBank (AC number EU418709).

2. На примере P. freudenreichii штамм RVS-4-irf с использованием модельного (неполного) желудочно-кишечного тракта показали, что пропионовокислые бактерии способны сохранять жизнеспособность, при этом концентрация живых клеток снижается с 109 до 106.

3. Проведены испытания действия штаммов P. freudenreichii RVS-2-ims и RVS-4-irf на организм животного (птицы). Пробиотический эффект штаммов обнаружен.

4. Выявлены и частично изучены пробиотически значимые свойства исследуемых штаммов:

- иммунотропные (по стимуляции образования цитокинов в крови в системе ex vivo);

- избирательно антимикробные на основе пропионатов и бактериоцин-подобных веществ, действующих в нейтральных условиях;

- антиокислительные (показано для жидких культур методом катодной вольтамперометрии);

- экзометаболитные и экзоферментные (низкое внеклеточное содержание витамина Bi2 может быть существенным в сконцентрированных препаратах; протеолитическая активность проявляется как в кислых, так и в нейтральных условиях).

Для испытаний и применения в качестве пробиотических препаратов нами рекомендованы штаммы P. freudenreichii RVS-2-ims и RVS-4-irf как наиболее изученные и эффективно действующие.

5. Разработан новый способ применения P. freudenreichii в заквасочной технологии производства пшеничного хлеба для его защиты от гнилостных бактерий («картофельной болезни» хлеба): он включает последовательное культивирование на мучной среде L. delbrueckii и про-пионовокислой бактерии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Классическая («молочная») пропионовокислая бактерия Propionibacterium freudenreichii признана безопасным «пищевым» микроорганизмом. Применение её штаммов в пищевой промышленности и сельском хозяйстве в настоящее время расширяется: это стартерные культуры в производстве твёрдых сыров (с 90-х годов прошлого века), силосов, ферментированных молочных и овощных продуктов, источники ферментов-антиоксидантов и других ферментов. Важнейшим является её антимикробный потенциал, используемый в биоконсервировании. Следует отметить, что штаммы Pfr способны продуцировать биологически активные веще-ства-нутрицевтики, полезные для обмена веществ человека (животного) и для микробиоты ЖКТ. Среди них - витамины группы В, в том числе фо-лиевая кислота и витамин В12, бифидогенные факторы и другие экзомета-болиты.

Ведётся поск новых штаммов, активных в отношении образования ЛЖК (пропионовой и уксусной кислот), бактериоцинов, витамина Bi2 и других биологически активных веществ. Propionibacterium freudenreichii является наиболее изученной и широко распространённой в природе. В сыром молоке коров и твёрдых сырах более 80% всех ПКБ составляет именно эта бактерия. Поиск новых штаммов Pfr, изучение их биологических свойств актуально в связи с проблемой пробиотиков. Эту бактерию в последнее время интенсивно изучают в качестве кандидата в пробиотики (пропионовокислым бактериям посвящают специальные международные симпозиумы). Сложность состоит в том, что она, по-видимому, истинным пробиотиком (эубиотиком) не является, а относится, скорее, к транзитор-ным.

Располагая штаммами классических пропионовокислых бактерий, изоляты которых были получены в нашей лаборатории ранее (в конце 80-х годов прошлого столетия) и изучены фенотипически, мы с использованием молекулярно-биологических методов и филогенетического анализа идентифицировали их как Propionibacterium Jreudenreichii. При этом исследуемые штаммы, имея общие признаки, заметно различаются фенотипически.

Приступили к выявлению и начальному изучению их пробиотиче-ского потенциала. Под влиянием КЖ PJr двух штаммов с наиболее активным образованием ЛЖК и витамина В12: P. Jreudenreichii RVS-2-ims (Рг 2) и RVS-4-irf (Рг 4), перепела с перепелиной фермы (Физиологический двор Государственного научного учреждения Сибирского научно-исследовательского и проектно-технического института животноводства Сибирского отделения Россельхозакадемии, ГНУ СибНИПТИЖ) проявили по сравнению с контролями большую сохранность и прирост живой массы (на несколько процентов) при меньшей потребности в кормах. Необходимо провести более широкие испытания'пробиотического действия штаммов Р. Jreudenreichii на млекопитающих, а также клинические эксперименты с привлечением пациентов-добровольцев.

Исследовали ряд свойств, позволяющих подойти к объяснению выявленного пробиотического эффекта (на перепелах).

Все исследуемые штаммы PJr после их предварительного инкубиро-ванияь в присутвии желудочного сока или эмульсии желчи оказались способными к росту в жидких культурах. В' модельном ЖКТ на примере штамма RVS-4-irf (Рг 4) установили, что ПКБ более чем на 60% (по* log КОЕ/мл) сохраняет свою жизнеспособность.

Для всех семи исследуемых штаммов P. Jreudenreichii впервые показали, что они индуцируют синтез разных цитокинов в цельной крови в системе ex vivo. Наибольший эффект нативных клеток ПКБ проявился в отношении образования интерлейкина ФНО (фактор некроза опухолей). В целом полученные данные по стимуляции синтеза цитокинов в крови человека показывают, что клетки классических («молочных») ПКБ способны воздействовать на иммунную систему человека. Эти результаты для Р. Jreudenreichii получены нами в 2007-2008 годах, т.е. практически одновременно с группой Кекконена, работа которых на моноцитах с использованием штамма P. freudenreihii ssp. shermanii JS (PJS) была опубликована в 2008 году [Kekkonen et al., 2008].

Витамин В i2, синтезируемый ПКБ, является незаменимым метаболи-том-нутрицевтиком для животных и человека. Обычно он поступает в организм чеовека с животной пищей. В связи с пробиотическими свойствами бактерии важно его присутствие не столько в клетках бактерии, сколько выделение в окружающую среду. Установили, что КЖ штаммов Pfr содержат витамин В12 , но в очень малых количествах (на 3-4 порядка меньше) по сравнению с его внутриклеточным-содержанием. Не исключено, что присутствие витамина в среде после выращивания ПКБ является следствием автолиза части клеток. Поэтому трудно рассматривать Pfr как существенный источник витамина В12 в ЖКТ. Эти бактерии, скорее всего, там не размножаются. Только перманентное потребление концентрированных препаратов культур Pfr, содержих не только клетки, но и их экзомета-болиты, может заменить естественное потребление витамина В12 с животной пищей.

Исследуемые штаммы P. freudenreichii обладают внеклеточной про-теолитической активностью, которую можно считать невысокой в данных конкретных условиях определения. Важно, что ПКБ способны её проявлять не только в кислой, но и в нейтральной среде, которая характерна для толстого кишечника человека и животного. Её предположительное значение состоит в гидролизе белков, непереваренных пищеварительными ферментами желудка и тонкого кишечника (пепсинами и трипсинами).

Антимикробная активность штаммов Pfr- носила избирательный характер. Мы выявили антагонизм культур в отношении некоторых бацилл, псевдомонад и кишечной палочки. Вместе тем, молочнокислая бактерия L. casei, которая относится к эубитикам, оказалась толерантной к культуре ПКБ, что указывает на возможную биосовместимость ПКБ и МКБ. Кроме того, в присутствии культуры ПКБ возрастала концентрация живых клеток

L. acidophilus.

Пропионат (натрия) как основной антимикробный фактор ПКБ по разному действовал на микроорганизмы-мишени: бацилы, псевдомонады и кишечная палочка были высокочувствительны (эффект ингибирования роста зависел от состава среды), а МКБ: L. casei, L. acidophilus, L. brevis, L. fermentum, Streptococcus thermophilus, — достаточно устойчивы. Последнее характерно и для Saccharomyces cerevisiae. Эти наши наблюдения (наряду с известным стимулирующим действием ПКБ на рост бифидобактерий), обращают внимание на новую проблему: избирательность действия ПКБ в отношении разных микроорганизмов, в том числе присутствующих в желудочно-кишечном тракте. Можно допустить существование сообществ пробиотиков в ЖКТ и мутуализм между ними. Эти предположения требуют соответствующих экспериментальных подтверждений.

У наших штаммов мы впервые выявили антимикробную активность, не обусловленную ЛЖК (пропионатом), а имеющую белковую природу. Речь идёт о бактериоцин-подобных веществах (БПВ), которые недавно были описаны у ПКБ. Интересно, что одни и те же бациллы оказались мишенями не только для пропионата, но и БПВ. БПВ разных штаммов Pfr действовали против разных бактерий-мишеней, но частично их спектры совпадали. В предварительном плане можно заключить, что штаммы Рг 1, Рг 3, Рг 5 и Рг 6 в качестве пробиотиков применять нежелательно, поскольку их БПВ негативно действовали на L. casei и L. acidophilus.

Две культуры Pfr (штаммы Рг 2 и Рг 4), обладающие высокой антимикробной активностью и высоким уровнем образования витамина BJ2, обследовали на антиокидантную активность методом высокочувствительной вольтамперометрии. Активность обеих культур оказалась высокой. Представленные данные свидетельствуют о том, что культуры исследованных штаммов обладают выраженными антиоксидантными свойствами. При этом образцы культур штамма Рг 2 проявили более высокую антиокислительную активность по сравнению с образцами штамма Рг 4, о чём судили по величинам кинетического критерия вольтамперметрии. Поэтому исследованные штаммы пропионовокислых бактерий могут рассматриваться в качестве эффективно действующих биоантиоксидантов. Это свойство также расширяет пробиотический потенциал ПКБ, которые целесообразно использовать, например, при создании физиологически функциональных продуктов питания.

В совокупности обнаруженные пробиотические эффекты и свойства исследованных штаммов ПКБ позволяют отнести их сразу к трём условно выделяемым категориям пробиотиков [Суворов, 2007]: метаболическим, иммуномодулирующим и антимикробным. Остаётся открытым вопрос: есть ли среди наших штаммов эубиотики (авохтонные, индигенные или резидентные пробиотики)? Для ответа на него требуются специальные исследования по оценке адгезии (колонизации) эпителия кишечника, подсчету живых клеток пропионовокислых бактерий не только в стуле, но и непосредственно в ЖКТ. Такие исследования должны проводиться совместно со специалистами - физиологами животных и человека. Пока нет «запрета» на ожидание положительного результата. Отметим, что адгезию и размножение в ЖКТ показали только для одного штамма классических ПКБ: Р jensenii 702 [Huang et al., 2003; Adams, Huang, 2008]. Пять испытанных авторами штаммов P. freudenreichii-. SCCC 2200, 2201, 2206, 2207, 2216, вообще не проявили адгезии, хотя для штамма P. freudenreichii JS ранее была показана 12% степень адгезии [Lehto, Salminen, 1997], т. е. адгезия зависит от штамма ПКБ.

Поиск эубиотиков среди новых штаммов P. freudenreichii недавно продолжен в группе проф. Жана (Франция) [Lan et al., 2007], хотя облигат-ным пробиотическим свойством адгезия (и колонизация эпителия ЖКТ), по-видимому, не является. Важнее выживаемость клеток, их метаболизм и пробиотическое действие при прохождении ЖКТ. Корпорация Standa Industrie (Франция) разрабатывает препарат «Propiofidus» на основе штамма P. freudenreichii SI41 [Jan et al., 2002]. Для перманентного длительного потребления используют капсулы, содержащие большие количества живых клеток ПКБ (5x10ю). Данные о значении этого штамма в функциональном (клиническом) питании людей, видимо, являются закрытыми (нами в литературе не найдены).

Научные предпосылки (сведения из литературы) и полученные нами данные свидетельствуют о широком спектре свойств классической ПКБ, которые имеют значения для проявления её пробиотических эффектов, однако испытаний для выявления пробиотического действия Р. freudenreichii на животных проведено немного (практически, всего три вместе с нашими опытами на птице). Расширение таких исследований на животных и пациентах-добровольцах должно стимулировать разработку и применение пробиотических препаратов на основе P. freudenreichii. Настоящая работа, по сути, пропагандрует эту классическую пропионовокислую бактерию, и прежде всего рассматриваемые штаммы, в качестве новых пробиотиков.

Нами был разработан способ ведения пропионовой закваски, которую можно накапливать в условиях хлебозаводов в нужном количестве и количественно вводить в конечное дрожжевое тесто при замесе. Способ подразумевает размножение ПКБ в мучной среде и, после удвоения биомассы клеток, двукратное разбавление свежей средой с повторением циклов. При этом пропионовокислая культура на нестерильной мучной среде (ПКБ-закваска) не должна быть вытеснена контаминирующей микрофлорой. Эта технологическая стратегия для ПКБ оказалась возможной только на основе трофической цепи: МКБ - ПКБ. Сами по себе пропионовые бактерии, как мы установили, не способны к росту на мучной среде. Вместе с тем, термофильная МКБ: L. delbrueckii превращает глюкозу, но преимуще-ственнно мальтозу «осахаренного» жидкого теста (заварки), в молочную кислоту, которая, с одной стороны, подавляет развитие спонтанных бактерий (МКБ), а с другой - после превращения её в лактат, является источником углерода и энергии для развития ПКБ. Этот простой (экономичный и удобный) способ позволил решить проблему защиты пшеничного хлеба от картофельной болезни» при улучшении его органолептических, физических и нутрицевтических свойств. Предположительно хлеб обогащается биологически активными веществами, выделяемыми P. freudenreichii, а убитые нагреванием (при выпечке) клетки способны, возможно, оказывать иммунотропное действие (аналогия с P. jensenii 702).

Таким образом, на наш взгляд, поставленные в работе цель и задачи в целом решены.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ли Хао (КНР), Москва

1. Афанасьева О.В. Микробиология хлебопекарного производства. — К.: Береста, СПб Ф ГОСНИИ ХП, 2003. С. 221с.

2. Белобородова Н.В., Белобородов С.М. Метаболиты анаэробных бактерий (летучие жирные кислоты) и реактивность макроорганизма // Антибиотики и химиотерапия. 2000. № 2. С. 28-36.

3. Богатырева Т.Г. Научные основы технологий хлебобулочных изделий с направленным культивированием микроорганизмов /Автореферат докторской диссертации. М. 2000.

4. Богатырева Т.Г., Иордан Е.П., и др. Способ предотвращения заболевания хлеба картофельной болезнью /Патент на изобретение № 1608849 от 17 июня 1992. Приоритет-29 сентября 1988 г.

5. Богатырёва Т.Г., Прянишникова Н.И., Иордан Е.П. Исследование про-теолитической активности молочнокислых, пропионовокислых бактерий и дрожжей, применяемых в хлебопечении // Межд. журнал Биотехнология у управление. 1994. Т. 1. № 4. С.40 -43.

6. Бонарцева Г.А. Об аэробном метаболизме пропионовокислых бактерий. Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук. М.: МГУ, 1973.

7. Брюхачёва Н.Л., Воробьёва Л.И., Бонарцева Г.А. Об* окислительном фосфорилировании у пропионовокислых бактерий // Микробиология. 1975. Т. 44. № 1. С. 11-14.

8. Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Марусина А.И., Турова Т.П., Кравченко И.К., Быкова С.А., Колганова Т.В., Гальченко В.Ф. // Микробиология. 2002. Т. 71. №4. С. 1-9.

9. Быховский В.Я., Зайцева Н.И. Микробиологический синтез тетрапир-рольных соединений. Итоги науки и техники. М.: ВИНИТИ. Серия:

10. Биологическая химия, 1989. 176 с.

11. Венчиков А.И., Венчиков В.А. Основные приёмы статистической обработки результатов наблюдений в области физиологии. М.: Медицина, 1974. 152 с.

12. Воробьева Л.И. Пропионовокислые бактерии и образование вита MHHaB.2. М.: Издательство Московского университета, 1976. 264с.

13. Воробьёва Л.И. Пропионовокислые бактерии. М.: МГУ, 1995. 235с.

14. Воробьёва Л.И., Аль-Судани С., Краева Н.И. Пероксидаза пропио-новокислых бактерий // Микробиология. 1986. Т. 55. № 5. С. 750- 753.

15. Воронцова К.Е. (а) Влияние пропионовокислых бактерий на жизнедеятельность картофельной палочки // Хлебопекарная и кондитерская промышленность. 1971. № 4. С. 14-17. С. 206-216.

16. Воронцова К.Е. (б) Использование пропионовокислых бактерий в хлебопечении // Хлебопекарная и кондитерская промышленность. 1971. № 6. С. 10-13.

17. Галактионов В.Г. Иммунология (3-е издание). М.: Издательский центр «Академия», 2004. 528 с.

18. Данилова И.В., Богатырева Т.Г., Быковченко Т.В., Рыжкова Е.П., Положительное действие Propionibacterium freudenreichii на рост Sac-charomyces cerevisiae при совместном культивировании // Прикладная биохимия и микробиология. 2006. Т.42. №3. С. 326-331.

19. Драчева Л. В. 2007. Антиоксидантная активность пробиотических биоантиоксидантов // Клиническое питание. № 1-2. 39.

20. Драчева Л.В., Короткова Е.И., Дорожко Е.В. Применение вольтаме-рометрического метода при изучении биоантиоксидантов //Пищевая промышленность. 2008. № 4. 28-29.

21. Иконников Н.П., Иордан Е.П., Воробьева Л.И. Выделение нуклеотидов и их производных иммобилизованными клетками Propionibacterium shermanii II Прикл. биохим. и микробиол. 1982. Т. 8. № 1. С. 34-40.

22. Иконников Н.П. Образование органических кислот, нуклеотидов и их производных иммобилизованными клетками Propionibacterium shermanii. Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук. М.: МГУ, 1984.

23. Канопкайте С.И. Кобаламины. Вильнюс: Мокслас, 1978. 144 с.

24. Канопкайте С.И., Рачкус Ю.А. Биохимические и медицинские аспекты кобаламинов (В12). Вильнюс: Academia, 1991. 267с.

25. Краева Н.И., Воробьёва Л.И. Супероксиддисмутаза, каталаза и перок-сидаза пропионовокислых бактерий //Микробиология. 1981. Т. 50. № 5. С. 813-817.U

26. Ленгерер И., Древе Г., Шлегель Г. Современная микробиология. Прокариоты (в 2-х томах). М.: Мир, 2005. Т. 1. С. 350, 383 -384.

27. Моргун К.Д., Ведерникова Е.И., Павлюк Р.Ю. Средства борьбы с картофельной болезнью // Хлебопекарная и кондитерская промышленность. 1973. № 11. С. 16 18.

28. Познанская А.А., Корсова Т.Л. //Успехи соврем, биол. 1980. Т. 90. № 1(4). С. 49-50.

29. Познанская А.А. Корсова Т.Л. //Успехи соврем, биол. 1984. Т. 98. № 3(16). С. 382-364.

30. Практикум по микробиологии п/р проф. А.И. Нетрусова. М.: Издательский центр "Академия", 2005. 606 с.

31. Рыжкова Е.П. Кобальт и корриноиды в биологии Propioibacterium freudenreichii. Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук. М.: МГУ, 2003.

32. Рыжкова Е.П. Лекции для студентов 4-го курса каф. микробиологии МГУ (1992-2009).

33. Рыжкова (Иордан) Е.П. Множественные функции корриноидов в биологии прокариотических организмов //Прикл. биохим. и микробиол. 2003. Т. 39. № 2. С. 133-159 (обзор).

34. Скулачев В.П. Кислород в живой> клетке: добро и зло // Природа (естественно-научный журнал РАН). 1997. № 11. С. 26-35.

35. Стикс Г. Всепожирающее пламя // В мире науки (Scientific American). 2007. № 11. С. 18-26.

36. Стоянова Л.Г., Сультимова Т.Д., Ботина С.Г., Нетрусов А.И. Выделение и идентификация низинобразующих штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis из молока // Прикл. биохим. микробиол. 2006. Т. 42. № 5. С. 560-568.

37. Суворов А.Н. Теоретические аспекты клинического использования пробиотиков // Клиническое питание (Научно-практический журнал). 2007. № 1-2. (243). С. А68.

38. Хамагаева И.С., Качанина Л.М. Кисломолочный напиток «Целебный» //Молочная промышленность. 2005. № 5. С. 66-68.

39. Шакирзянова М.Р., Рузиева В.М., Абдульмянова Л.И., Суйдаметова Э.А., Гулямова Т.Г. Способность некоторых штаммов пропионовокислых бактерий, выделенных в Узбекистане, к синтезу витамина В12 // Микробиология. 2002. Т. 71. № 4. С. 570.

40. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональ161ное питание (в трёх томах). Т. III. Пробиотики и функциональное питание. М.: ГРАНТЪ. 2001. 286 с.

41. Adams М.С., Huang Yang. Probiotic Propionibacterium. United States Patent 7427397 (2008).

42. Ahern W. P., Andrist D. F., Skogerson L. E. Production of fermented whey containing calcium propionate. United States Patent, 4,676,987, April 24, 1984.

43. Al-Zoreky N., Ayres J.W., Sandine W.E. Antimicrobial activity of Micro-gard-against food spoilage and pathogenic microorganisms // J. Dairy Sci. 1991.V. 74. P. 758-763.

44. Ayres J. W. , Sandine W. E., Weber G. H. Preserving foods using metabolites of propionibacteria other than propionic acid // United States Patent 5,096,718, March 17, 1992.

45. Babuchowski A., Laniewska-Moroz L., Warminska-Radyko I. Propionibacteria in fermented vegetables // LAIT. 1999. V. 79. N.l. P. 113-124.

46. Barefoot S. F., Nettles C. G. Antibiosis revisited: bacteriocins produced by dairy starter cultures // J. Dairy Sci. 1993.V. 76. P. 2366-2379.

47. Bodie E. Propionic acid fermentation of ultra-high-temperature sterilized whey using mono- and mixed cultures // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1987. V. 25. N. 5. P. 434-437.

48. Bougie D., Roland N., Lebeurrier F., Arhan P. Effect of propionibacteria supplementation on fecal Bifidobacteria and segmental colonic transit-time in healthy human subjects source // Scandinavian J. Gastroenterology. 1999. V. 34. N. 2. P. 144-148.

49. Bouton Y., Guyot P., Beuvier E., Tailliez P., Grappin R. Use of PCR-based methods and PFGE for typing and monitoring homofrementative lac-tobacilli during Comte cheese ripening // Int. J. Food Microbiol. 2002. V. 31. P. 59-68.

50. Brede D.A., Faye Т., Johnsborg O., Odegard I., Nes I.F., Holo H. Molecular and genetic characterization of propionicin F, a bacteriocin from Propionibacterium freudenreichii //Appl. Environ. Microbiol. 2004 V. 70. N. 12. P. 73037310.

51. Brede D.A., Faye Т., Stierli M.P., Dasen G., Theiler A., Ness I.F., Meile L., Holo H. Heterologous production of antimicrobial peptides in Propionibacterium freudenreichii I I Appl. Eviron. Microbiol. 2005. V. 71. N. 12. P. 8077-8084.

52. Brock M., Buckel W. On the mechanism of action of the antifungal agent propionate // Eur. J. Biochem. 2004. V. 271. N. 15. P. 3227-3241.

53. Chaia A.P., Zarate G. Oliver G. The probiotic properties of propionibacteria//Lait. 1999. V. 79. N. 1. P. 175-185.

54. Chamba J.-F., Perreard Ё. Contribution of propionic acid bacteria to lypolysis of Emmental cheese // Lait. 2002. V. 82. N. 1. P. 33-44.

55. Charfreitag O., Stackebrandt E. Inter- and intrageneric relationships of the genus Propionibacterium as determined by 16S rRNA sequences // J. Gen. Microbiol. 1989. V. 135. P. 2065-2070.163

56. Chermesh I., Eliakim R. Probiotics and the gastrointestinal tract: Where are we in 2005 // World J. Gastroenterol. 2006. V. 12. N. 6. P. 853-857.

57. Cummins C. S., Johnson J.L. The Genus "Propionibacterium". In: The Prokaryotes. A handbook on habitats, isolation, and identification of bacteria. Starr M.P. et al. (eds). Berlin etc.: Springer, 1981. V. 2. P. 1894-1902.

58. Cummins C. S., Johnson J.L. The Genus "Propionibacterium". In: The Prokaryotes. Second edition. Balows et al. (eds). New York etc.: Springer-Verlag, 1992. V. 2. P. 834-849.

59. Daniels L., Hanson R.S., Phillips J.A. Chemical analysis. In: Methods for general and molecular bacteriology. Gerhardt et al. (eds). Washington DC: American Society for Microbiology, 1994. P. 542-544.

60. Dasen G., Smutny J., Teuber M., Meile L. Classification and identification of propionibacteria based on ribosomal RNA genes and PCR // System. Appl. Microbiol. 1998. V. 21. P. 251-259.

61. De Vries W., Wijck-Kapteijn (van) W.M.C., Stouthamer A.H. Influence of oxygen on growth, cytochrome synthesis and fermentation pattern in propionic acid bacteria // J. Gen. Microbiol. 1972. V. 71. N 3. P. 515-524.

62. Edwards U., Rogall Т., Bloeker H., Ende M.D., Boeettge E.C. Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes , characterization of gene coding for 16S ribosomal RNA // Nucl. Acids Res. 1989. V.17. P.7843-7853.

63. El-Ziney M.G., De Meyer H., Debevere J.M. Growth and survival kinetics of Yersinia enterocolitica IP 383 0:9 as affected by equimolar concentrations of undissociated short-chain organic acids // Int. J. Food Microbiol. 1997. V. 34. N. 3. P. 233-247.

64. Faye Th., Brede D.A., et al. Bacteriocins of propionic acid bacteria. 3-rd International Symposium on Propionibacteria, 8-11 July 2001, ETH Zurich, Switzerland. Abstract Book, S-8, P. 16.

65. Fessler D., Casey M.G., Puhan Z. Propionibacteria flora in Swiss raw mil from lowlands and Alps // Lait. 1999 (a). V. 79. P. 201-209.

66. Fessler D., Casey M.G., Puhan Z. Identification of propionibacteria isolated from brown spots of Swiss hard and semi-hard cheeses // Lait. 1999 (b). V. 79. P. 211-216.

67. Frohlich-Wyder M.-T., Bachmann H.-P., Casey M.G. Interaction between propionibacteria and starter/non-starter lactic acid bacteria in Swiss-type cheeesees // Lait. 2002. V. 82. N. 1. P. 1-15.

68. Glatz B.A. The Classical Propionibacteria: their past, present, and future as industrial organisms //Am. Soc. Microbiol. News. 1992. V. 58. N. 4. P. 197-201.

69. Gollop N, Toubia D, Shushan GB, Zakin V. High Production System of the Antibacterial Peptide PLG-1 // Biotechnol. Prog. 2003. V. 19. N. 2. P. 436-439.

70. Heilig H.G., . de Vos W.M (всего 6 авторов) Molecular diversity of Lactobacillus spp. and other lactic acid bacteria in human intestine // Appl. Env. Microbiol. 2002. V. 68. N. 1. P. 114-123.

71. Herve C., Fondrever M., Cheron F., Barlow-Huber F. , Jan G. Transcarboxylase mRNA: a marker which evidences P. freudenreichii survival and metabolic activity during its transit in the human gut // Int. J. Food Microbiol. 2007. V. 113. N. 3. P. 1303-314

72. Holo H., Faye Т., Brede D.A., Nilsen Т., 0degard I., Langsrud Т., Brendenhaug J., Nes I.F. Bacteriocins of propionic acid bacteria // Lait. 2002. V. 82. P. 59-68.

73. Hugenholtz J., Hunik J., Santos H., Smid E. Nutraceutical production by propionibacteria// Lait. 2002. V. 82. N 1. P. 103-112.

74. Isawa K., Hojo К. (всего 9 authors). Isolation and identification of a new bifidogenic growth stimulator produced by Propionibacterium Jreudenreichii ET-3 //Biosci. Biotechnol. Biochem. 2002. V. 66. N. 3. P. 679-681.

75. Jan G., Leverrier P., Roland N. Survival and beneficial effects of propionibacteria in human gut: in vivo and in vitro investigations /З-rd International Symposium on Propionibacteria, ETH Zurich, 8-11 July 2001. Abstract Book. P. 24.

76. Jan G., Leverrier P., Proudy I., Roland N. Survival and beneficial effects of propionibacteria in human gut: in vivo and in vitro investigations // Lait. 2002. V. 82. No l.P. 131-144.

77. Javanainen P.V., Linko Y.Y. Linko P., Propionic acid formation by mixed cultures // Proc. 4-th Eur. Congr. Biotechnol. Amsterdam. June 14-19. 1987. V. 3. Amsterdam etc., 1987. P. 313-316.

78. Jore J.P., van Luijk N„ Luiten R.G., van der Werf M.J., Pouwels P.H. Efficient transformation system for Propionibacterium Jreudenreichii based on a novel vector //Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. N. 2. P. 499-503.

79. Kaur P. Survival and growth of Bacillus cereus in bread. J. Appl. Bacterid. 1986. V. 60. N. 6. P. 513-516.

80. Kekkonen R.A.Korpela R. (всего 10 авторов). Probiotic intervensionhas strain-specific anti-inflammatory effects in healthy adults // World J. Gastroenterol. 2008. V. 14. N. 13. P. 2029-2036.

81. Lan A., Bruneau A., . Jan G. (всего 9 авторов) Survival and metabolic activty of selected strains of Propionibacterium freudenreichii in the gastrointestinal tract of human microbiota-associated rats // Br. J. Nutr. 2007.1. V. 97. N. 4. P. 714-724.

82. Lehto E.M., Salminen S. // Bioscience Microflora. 1997. V. 16. P. 13-17.

83. Lind, H., Jonsson H., Schnurer J. Antifungal effect of dairy propionibac-teria contribution of organic acids. // Int. J. Food Microbiol. 2005. V. 98. № 1. P. 157-165.

84. Lind H., Sjugren J., Gohil S, Kenne L.J., Broberg A. Antifungal compounds from cultures of dairy propionibacteria type strains // FEMS Microbiol. Lett. 2007. V. 271. N. 2. P. 310-315.

85. Majehrzak R., Duszkiewicz W., Lewczuk J., Kijewska A. // Technologia Poino-Spotywecza. 1977. V. 12. P. 23-36.

86. Marshall D.L., Odame-Darkwah J.K. Mechanism of inhibited growth of Bacillus pumilus by Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii II Int. J. Food Microbiol. 1994. N. 1. P. 11-22.

87. Merry R. J., Davies D. R. Propionibacteria and their role in the biological control of aerobic spoilage in silage // Lait. 1999. V. 79, N. 1. P. 149-164.

88. Mori H.,. Kaneko Т. (всего 8 авторов) Isolation and structural identification of bifidogenic growth stimulator produced by Propionibacterium freudenreichii // J. Dairy Sci. 1997. V. 80. P. 1959-1964.

89. N. Van Luijk, .Meile L. (всего 10 авторов) Genetics and molecularbiology of propionibacteria // Lait. 2002. v. 82. N. 1. P. 45-58.

90. Nomoto K. Prevention of infections by probiotics // J. Biosci. Bioengi-neering. 2005. V. 100. N 6. P. 583-592 (review).

91. Odame-Darkwah J.K., Marshall D.L., Interactive behavior of Saccharo-myces cerevisiae, Bacillus pumilus and Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii. /Vint. J. Food Microbiol. 1993. V. 4. P. 259-269.

92. Ouwehand A.C., Suomalainen Т., Tolkko S., Salminen S. In vivo Adhesion of propionic acid bacteria to human intestional mucus // Lait. 2002. V. 82. N. l.P. 123-130.

93. Pattison TL, Lindsay D, Von Holy A. In vitro growth response of bread-spoilage Bacillus strains to selected natural antimicrobials // J. Basic Microbiol. 2003. V. 43. N. 4. P. 341-347.

94. Pelshenke, 1950. Цитировано no: Spicher G. Baked goods. In: Biotechnology. Food and Feed Production. Weinheim: Verlag Chemie, 1983. V. 5. P. 15-20.

95. Pelshenke P. Wissenschaftliche und technische Fortschritte bei der Beklmflung von Brotkrankheiten // Brot und Geback. 1954. H. 2. S. 27-32.ч

96. Рере О., Blaiotta G., Moschetti G., Greco Т., Villani F. Rope-producing strains of Bacillus spp. from wheat bread and strategy for their control by lactic acid bacteria // Appl. Env. Microbiol. 2003. V. 69. N. 4. P. 2321-2329.

97. Pratt J.M. Coordination chemistry of the В i2 dependent isomerase reaction. In: «В|2» V. 1 (Chemistry), ed. D. Dolphin. John Willey & Sons. 1982. Ch. Ten. P. 325-392. 348-349.

98. Pritchard G.G., Asmundson R.V. Aerobic electron transport in Propionibacterium shermanii. Effects of cyanide // Adv. Microbiol. 1980. V. 126. P. 167-173.

99. Pritchard G.G., Wimpenny J.W.T., Morris H.A., Levis M.W.A., Hughes D.E. Effects of oxygen on Propionibacterium shermanii grown in continuous culture //J. Gen. Microbiol. 1977. V. 102. N 1. P. 223-233.

100. Riedel K.-H. J., Wingfield B.D., Britz T.J. Justification of the "classical" Propionibacterium species consept by analysis of the 16S ribosomal RNA genes" // System. Appl. Microbiol. 1994. V. 17. P. 536-542.

101. Rolfe D. The role of probiotic cultures in the control of gastrointestinal health. //JNutr. 2000 V. 130 (2S Suppl). P.396S-402S. Review.

102. Rossi F. Peptidases of Propionibacterium freudenreichii: occurence and expression in cheese // 3-rd Int. Symp. on Propionibacteria. Zurich, Switzerland. 8th-11th July 2001. Abstract Book. S2. P. 8.

103. Sahl H.-G. Pore formation in bacterial membranes by cationic lantibi-otics. In: Nisin and novel lantibiotics. Ed. by Jung G., Sahl H.-G., Escom, Leiden, The Netherlands, 199LP. 347-358.

104. Schwartz A.C. Anaerobiosis and oxygen consumption of some strains of Propionibacterium and a modified method of comparing the oxygen sensitivity of various anaerobes // Zeitschrift Allgemeine Mikrobiologie. 1973. V. 13. P. 681-691.

105. Schwartz A.C., Sporkenbach J. The electron transport system of the anaerobic Propionibacterium shermanii. Cytochrome and inhibitor studies. // Arch. Microbiol. 1975. V. 102. P. 261-273.

106. Skrinjar M, Danev M, Dimic G. Interactive effects of propionic acid and temperature on growth and ochratoxin a production by Penicillium auran-tiogriseum // Folia Microbiol (Praha). 1995. V. 40. N. 3. P. 253-256.

107. Stackebrandt E., Goebel B.M. Taxonomic note: A place for DNA-DNA re-association and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology // Int. J. Syst. Bacteriol. 1994, V. 44. N 4. P. 846-849.

108. Suhr KI, Nielsen PV. Effect of weak acid preservatives on growth of bakery product spoilage fungi at different water activities and pH values // Int. J. Food Microbiol. 2004. V. 95. N. 1. P. 67-78.

109. Suomalainen Т.Н., Mayramakinen A.M., Propionic-acid bacteria as protective cultures in fermented milks and breads. //Lait. 1999. V. 79. № 1. P. 165-174.

110. Tannock G.W. Intestinal microbiota and probiotics /Proc. Int. Symp. on Propionubacteria and Bifidobacteria: dairy and probiotic application. (INRA-STANDA INDUSTRIE, 2004). France. Saint-Malo, June 2st-4th 2004. Session 3-1. Presentation 1400.

111. Van de Peer Y., De Wachter R. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment // Comput. Applic. Biosci. 1994. V. 10. P. 569-570.

112. Vinokurov K.S., Elpidina E.N., Oppert В., Prabhakar S., Zhuzhikov D.P., Dunaevevsky Y.E., Belozersky M.A. название // Сотр. Biochem. Physiol. 2006. B145. S. 126-137.

113. Vorobjeva L. Physiological peculiarities of propionibacteria present facts and prospective applications //Science Progress. 2000. V. 83. N 3. P. 277-301.

114. Warminska-Radyko I., Laniewska-Moroz L., Babuchowski A. Possibilities for stimulation of Bifidobacterium growth by propionibacteria // 3-d Int. Symp. on Propionibacteria. Switzerland. 8-11 July 2001. ETH Zurich. Abstract Book. S-13.P. 21.

115. Warminska-Radiko I., Laniewska-Moroz L., Babuchowski A. Possibilities for stimulation of Bifidobacterium growth by propionibacteria // Lait.1732002. V. 82. N. l.P. 113-121.

116. Yamazaki S., Капо К., Ikeda Т., Isawa К., Капеко Т. Mechanistic study on the roles of a bifidogenetic growth stimulator based on physico-chemical characterization // Biochim. Biophys. Acta, General subjects. 1998. V. 1425.N.3. P. 516-526.

117. Ye K.V., Shiojo V., Miyano R., Shimzu K. Metabolic pathway of Propionibacterium growing with oxygen // Biotechnology Progress. 1999. V. 15. N. 2. P. 201-207.

118. Zarate G, Morata de Ambrosini VI, Chaia AP, Gonzalez SN. Adhesion of dairy propionibacteria to intestinal epithelial tissue in vitro and in vivo // J. Food Prot. 2002. V. 65. N 3. P.534-539.