Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА КУЛЬТУРЫ РАСТИТЕЛЬНЫХ ТКАНЕЙ В ФИТОПАТОЛОГИИ (НА ПРИМЕРЕ МИЛДЬЮ ВИНОГРАДА И ВИРУСНОГО КОМПЛЕКСА ЗЕМЛЯНИКИ)

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА КУЛЬТУРЫ РАСТИТЕЛЬНЫХ ТКАНЕЙ В ФИТОПАТОЛОГИИ (НА ПРИМЕРЕ МИЛДЬЮ ВИНОГРАДА И ВИРУСНОГО КОМПЛЕКСА ЗЕМЛЯНИКИ)"



МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР

кишиневский сельскохозяйственный институт

им. М. В. ФРУНЗЕ

На правах рукописи

Абраменко Нина Михайловна

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА КУЛЬТУРЫ РАСТИТЕЛЬНЫХ ТКАНЕЙ В ФИТОПАТОЛОГИИ

(НА ПРИМЕРЕ МИЛДЬЮ ВИНОГРАДА И ВИРУСНОГО КОМПЛЕКСА ЗЕМЛЯНИКИ)

(06.01.11— фитопатология и защита растений)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кишинев—1972

МИШЕТЕРСТВО сЩмШ/хойдаш СССР НШИНЕВСКИЙ

оравах рукогасж

Няяа МихаДловва

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА КУЛЬТУРУ РАСТИТЕЛЬНЫХ ТКАНЕЙ В ФИГОПАТОЛОГИИ (НА ПШЕРЕ ЯВД1ДО ВИНОГРАДА И ВИРУСНОГО ШШШСА ЗЕМЛЯНИКИ

(06,01.11 - фитопатология и защита растений)

Автореферат диссертации на соискание ученой степенж кандидата биологических наук

- Кишинев - 1372

9

Г

ЦЕНТРАЛЬНАЯ НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА Моск. сольскохлэ ачадшю) им. К. Ау. Тимирязева

Йня. НйЖ^ШЛС—

Работа выполнена на кафедре защиты растений Кишиневского сельскохозяйственного института вм. М,В.Фрунзе и в лаборатории вирусологии Молдавского НИИ садоводства, виноградарства и виноделия.

Научный руководитель - заслуженный деятель науки UCCP* член-корреспондент АН НССР, доктор с.-х. наук, ' профессор Д.Д. ВердеревскиЙ.

Официальные оппоненты! доктор сельскохозяйственных наук» старший научный сотрудник Патершш ГД.,

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Дашкаева К.Н,

Ведущее учреждение - Украинский ваучно-исследователь-с кий институт с ел ьо кою зяйс твенной микробиологии.

Автореферат разослав JjjtjAl/J 1973 г.

Защита диссертации состоится °ol У" iL 1973 г. на заседании Ученого Совета Кишиневского сельскохозяйствен-^ ного института мы. М,В.Фрунзе ъ i (ул.Садовая, III).

шиневского сельскохозяйствен-

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Отзывы и замечания на автореферат просим направлять по адресу: МССР, 277014, г.Кишинев, ул. Садовая, III, сельскохозяйственной институт, ученому секретарю.

I

Ученый секретарь /) п С.С.Грушко

Биологическая наука наших дней характеризуется стремлением изыскивать метода исследований, позволяющие глубоко и всесторонне изучать процессы, происходящие в живых организмах, с целью управления ими и создания новых, более ценных сортов растений и пород животных.

Одним из таких методов является метод культур« изолированных тканей, нашедший в последние годы довольно широкое распространение* В 1968 году в Москве состоялась X Всесоюз«, нзя конференция но культуре изолированных органов, тканей и клеток растений» Сан факт созыва такой конференции говорит о том большом значении, которое приобрел в настоящее время метод культуры изолированных тканей для исследований в различных областях биологических наук. Как отмочено в решении конференции, "большой интерес к таким..* исследованиям определяется теми преимуществами, которые дает более простая модельная система органа, ткани и клетки» существующая в контролируемых условиях вне организма, для изучения актуальных проблей физиологии в биохимии растений, цитологии я генетики, растительной вирусологии и фитопатологии".

Метод позволяет решать как теоретические вопроси, так И чисто практические задачи, имеющие важное значение для сельского хозяйства. Дли $итоааюлогов метод привлекателен тем, что позволяет изучать взаимоотношение патогена и клеток рйстешт-хозяина ь условиях, исключащюс влияние посторонних факторов.

Разработа/шМорелем метод так называемых "ассоциированных культур" лает восмолноем, исследовать явления устойчивости растений к паразитный заболеваниям в строго контролируемых ус лоси,IX,

Получиший я последнее десятилетие широкое признание метод культуру верхушечных иеристеи вегетативно размножаемых растений позволил получить Се;вирусные клоны ценных сортов ряда растет;?;, полностью пораженных вирусными заболеваниями.

Нами метод культуры изолированных тканей использовался в двух аспектах:

1. Культура стеблевой ткани ъинограда дл^з изучений некоторых факторов иммунитета к ишлдыо.

2. Культура верхушечных меристем земляники с цепью регенерации свободных от вирусов растений,

I. Изучение некоторых факторов иммунитета винограда к милдью.

Наиболее радикальным и эфф&ктивньш способом борьбы с милдью является выведение а внедрение з производство устойчивых сортов винограда, не нуждавшихся в химической защите. Такая работа требует изучения взаимоотношений растения и патогена, изучения тех реакций, которые возникаю* в растении при контакте с возбудителен заболевания. . .

Важное место в той сложной цепи реакций, которыми отвечает растительный организм на внедрение патогена, отводится в настоящее время антимикробна лышм веществам (фитонцидам) /Токва, 196?; Бердеревский, 1Э63; Найденова, 1971; Купорицкая, 1971/.

Фиюнциди являются продуктами'осмена веществ, поэтому фитонцидноегь - свойство весьма динамичное, зависящее от многих факторов:' от физиологического состояния самого растения, его возраста, фазы развития; на фитонцидную активность влияют также климатические, погодные условия, время суток и пр. Зтим можно объяснить ряд неудач ъ некоторых исследованиях по изучению взаимозависимости устойчивости растьивя и его фитонцидных свойств*

Б задачу каких исследований входило изучение такой взаимозависимости, используя калнуоную ткан* стебля винограда, культивируемую в асептических, контролируемых условиях, которую искусственно заражали грибом р1авшорага ппесаа -^возбудителем милдьм. Помещенная в культуру 1п vit.ro изолированная ткань пролиферирует, образуя киялуснэм «несу, которая является ристогенетически и фиэш»ог;поски едяг,родной, лишена эпидермиса и устьиц, так что патоген имеет непосредственный контакт с клетками.

Морелем ( М0ге1 , 1948) и Бубальсоы ( ВоцЬа1й ■ ,1559)

установлено, что в культуре iB vitr0 сохраняются видовые и сортовые иммунологические особенности растений.

Изучалось:

I* фитонцидные особенности в процессе патогенеза pi, vitícola клеточного сока каллусов различных по устойчивости видов и сортов винограда}

2. характер развития ц. vitícola на поверхности каллусов - время появления воздушного ницелия и спороновения и скорость распространения их по всей поверхности каллуса; жизнеспособность спороношенля, выражающаяся в процентном соотношении жизнеспособных (т.е. прорастающих зооспорами) зоог--

еиорангиев от общего числа образованных на единицу площади; морфология "пушка".

3. анатомия развития гриба внутри каллуслых тканей различных по устойчивости видов.

НЛТЕР1ШЫ И МЕТОДЫ,

Исходным материалоц для получения каллусной ткани служили видч и сорта винограда, характеризующиеся различный ре-агированвеи на,заракение милдью- от иымунных до сильно восприимчивых:

Род сissus ;

С. antárctica - иммунный /О/

Род рцднаноствБив

р.quiüquifolia - ИШфЯШЙ /О/

Род VfTiq_L

V. aaurensis ,Rup. - устойчивый /II/

V. amurensie Hup, - ВОСПРИИМЧИВЫЙ /Ш

V, vinifera -1У/

сорт Шасла - сильно воспршш.

/У/

сорт Алвготэ - восприимчивый

Ссяск'диошш» отбор Сеянец й 2 - устойчивый /0-Ш/

Itiparia X Rupeetris 101-14 - ВЫСОКО УСТОЙЧИ-

ВЫЙ /1-П/.

Характеристика степени восприимчивосги к милдью приведена на основе данных оценки Вердеревского и Вийтович (1970), Для оценки авторами использована шкала Б^Оальса / Boubale , 1959/.

Подготовка материала и вычленение эксплантатов осуществлялись по общепринятой в работе по культуре изолированных растителъных-тканей методике /Бутенко, 1964/. Использовались зеленые побега, которые после соответствующей подготовки в саерильныг условиях разрезались на кусочки размером 1-1,5 см. Последние помещались на питательную среду в биологические пробирки так, чтобы базальная сторона была обращена кверху и находилась над средой. Культуры содержали в.термостате при постоянной температуре 25°С и относительной влажности 60$,

Из испытанных 24-х.вариантов питательных сред лучшей для каллусообразования оказалась среда Хеллера с об - наф-тилулсусной кислотой (АНУ) и кинетином.

После того, как базальная сторона отрезков сплошь покрывалась каллусом,.приступали к его инокуляции.

Приготовление суспензии зооспор и., vitícola и инокуляция каллусов осуществлялись по видоизмененной методике Ыо-реля A Morel , 1948/. Контролем служили капусты, па поверхность которых наносились капли стерильной дистиллированной воды.

Определение фитонцидных свойств клеточного сока кал^. -л'усяой ткани проводилось по методике проф. Вердеревского /1957/, в модификации Найденовой /1964/.

Срезы каллуслой ткани для анатомического изучения развития PI. vitícola делались вручную со свежего материала, "■окрашивались по Нобелю и просматривались под микроскопом МБИ-6 при увеличении 15 х 20.

' Определение фитонцидной активности клеточного сока каллусов различных по устойчивости к милдью ЗДров и сортов винограда.

Для проведения данных исследована, отбиралось по 100

б

Таблица I

Изменение фитонцидной активности клеточного сока каллусной тяани различных по устойчивости к еилдъю видов и сортов винограда в процессе патогенеза

На ка- 3 о е н я I в и я е н а я зооспор 1В сек»)

кой день аосле эараке- ния от-. биралась проба Виды и сорта в и н о г т> ара

Шасла : Алиготе * * * : с-г ¥ * * ЯГ.адагеп- ¡к", а« иге и- ЩАрапа ж. 4 а^о , " ип е ВТ; Ti.ii ;(восприии;(устойчивг у : оиотип) : биогия) : 101-14 *Р аи!паи1-; С»ап1агв-

опнтгкон-¡*гр. •Юпыт^кон* * ♦ * опыт;коя-.: :тР. ;опыт:кон-;опыт:кон-:опыт:кон-: :тр. : :тр. : :тр. :опыт:кон-:опыт;кон- ;тр. : ;тр. • * » *

—--1-

^ I I 284 600 230 500 120 300 139 427 84 106 43 50 25 30 17 20

В 45 593 135 520 80 300 90 420 55 100 50 55 24 30 16 20

Конец инкубационного

периода 600 590 500 510 90 290 430 423 93 110 49 52 21 31 ' 16 20

Сходная картина наблюдается и при заражении каллусов сорта Алиготд.

Появление налета на каллусе v. amurenais восприимчивого биотипа происходит несколько позже- на 6-ой день и распространение его по поверхности более медленнае. Вся поверхность каллуса захватывается грибом на 10-11 день. Зрительно cases менее густой, чем у предыдущих образцов. Воздушные гифы преобладают также нитевидные.

Таблица 2 Различия в инкубационных периодах развития Pj_,viticoia и в скорости распространения гриба по каллусу г зависимости от степени устойчивости сорта, вида винограда.

не ; пп : * « « » Исходный материал ¡продолжи- :число дней, дельность :необходчмых :инку<5ацион-:для захвата :ного перио-:грибницей !да (в днях):всего кал-

* ------- i..... •v* S* ; ■ :луса 4 4

I. Шасла ' 5 7-8

2. Алиготе. 5-6 7-8

3. Сеянец Иг 2 7-8 -

Biparia х Rupeetria IÛI-I4 5 15

5. Vit la amureiiaie /восир. биотип/ 8 10-11

,6* Vitis amurensia /устойч.биотип/ 12

На каллусе V. ашигепв1з -устойчивого биотипа появление налета замечается только на 12 деаь после заражения,дальнейшего распространения его не происходит* Спорокошение име-вид отдельных кустиков. Воздушные гифы преобладают короткие, сильно разветвленные. Встречаются единичные нитевидные.

На каллусах Сеянца № 2 Р1. проявляет се-

бя на'7 день. Картина проявления сходна с предыдущей.-Здесь такие наблюдаются отдельные кустики спороношенин, которые дальше места первоначального возникновения не распространяются. Воздушный мицелий состоит в основном из коротких, сильно разветвленных гиф.

Из полученных результатов молгна сделать общий вывод: чек вшче фитонцидность ткани, тем слабее развитие гриба: удлиняется инкубационный период, замедляется скорость распространения гриба по всей поверхности каллуса. На каллусах мунанх видов, у которых фитонцидность особенно высока, развитие патогена совершенно невозможно. Следовательно, фитонцидность является фактором, влияющим на рвввитие РЬ vitícola.

Из этой обшей схемы на первый взгляд выпадает устойчивый подвойный сорт I01-14. Как видно из таблицы fe I, фитонцидность клеточного сока его каллуса держится на высокой уровне в течение всего патогенеза, тем не менее заражений каллуса происходит. Однако, по данным Бубальса / Boubals , 1959/ устойчивость тканевой культуры определяется не только внешней картиной проявления, но и качеством образуемого патогеном спороношения.

Анализируя денные микроскопического исследования спс-роношения pi. vitícola на каллусах различных по устойчивости форм винограда, ш обнаружили характерные различия ¿табл. 3). При почти равном количестве зооспораигиев с единицу площади на каллусах Шаслы й 101-14 имеет место большое различие в количестве жизнеспособных зооспорангиев. Если на каллусе Иаслн из обаего числа их способны прорастать зооспорами 81,6%, то у 101-14 - всего ЗСfí« Действие фитонцидов отразилось в данном случае на качестве спороношения. У других устойчивых образцов подавляющий эффект фитонцидности проявился в уменьшении общего количества зооспорангиев.

Таким образом и данный показатель находится в коррелятивной зависимости со степенью фитонцидной активности.

Анатомическое изучение развития Pl. vitícola внутри каллусов, различающихся фитонцидной активностью.

Бубальс / Boubale , 1959/ считает, что внешней картине проявления патогена соответствует степень развития грибницы внутри ткани.'

Нами изучались срезы, приготовленные из инокулирован-ных каллусов сорта !3асла, селекционного отбора Сеянец Кг 2,

"II

Таблица 3. Различия в количестве жизнеспособных эоослорангиев на каллусах, различающихся по фитонцидным свойствам.

НЫВ па

Сорт, вид винограда

¡всего ;жизне- :неяиз-: % ;зооспо-:способ-:неспо-:жизне-;рангиев:них.- :с обных:спос об-;на еди-: : :ных

:ницу : ;площади:

I. Шасла 12 01 980 221 81,5

2. Алвготэ 900 778 122 86,4

3. V.amureasta J воепр.биотип/ 795 536 259 67,4

4. V.amureoela/устойч.биотип/ 189 118 71 62,4

5. Сеянец й 2 ' 222 156 66 70

б. Eiparia х

Rupeetria 101-14 Шб 332 ' 784 30

У, шпигепв18 . устойчивого и восприимчивого биотипов и Р.Ф^одииГоИа, . Микроскопическое исследование показало, что в каллусе сорта Шасла грибница захватывает вое ыеаяле-точные пространства, в каждую из прилегающих клеток внедряется гаусториями, часто по нескольку в одну клетку. Грибница пронизывает всю толщу каллуса. Сходная картина наблюдается и в каллусе восприимчивого биотипа V. шигеав1я , только здесь не столь многочисленны гаустории.

В каллусах устойчивого биотипа 1Г.ашш:еаа10 и Сеянца й 2 грибница обнаруживается только в поверхностных срезах, она менее развита, гаустории единичные.

Картина развития грибницы внутри кадлусшх тканей поясностью соответствует внешнему проявлению гриба: на каллусе восприимчивых образцов ббильное споройошение о большим количеством жизнеспособных аооспорангиев, у устойчивых - редкий напет, малое количество аооспораигвев, часть из которых нежизнеспособна. Как уже отмечалось, на каллусс иммунного вида Р. не было получено развития цилдыо. Иш;-

росяодическое изучение срезов каллуса такие не обнаружило никаких следов грибницы.

Данные наших исследования с применение« метода культуры изолированней ткани согласуются с результатами, подученными Найденовой /1971/ на целом растении. Зги данные свидетельствуют о ?0U| что фитонциды являются одним из существенных факторов иммунитета винограда к милдью.

. Кроме теоретических исследований метод культура изолированных тканей использован нами для решения практической задачи, Зоя этого была применена культура верхушечных меристем с целью регенерации растений, свободных от вирусной инфекции. Эта работа свяаана с вышеизложенной общим методически« решением, но имеет свои особенности, поэтому имело смысл методику исследований изложить отдельно.

П. Получение безвдрусных клонов земляники с помощью культуры изолированных верхушечных мери-т -дгем.

Общеизвестно серьезное снижение урожаев земляники в результате вирусных заболеваний. Так, в Бельгии эти потери составляют 25-30$, а у сорта Madam woutot - ад^ (Linden , 1963). Во Франции отмечено снижение урожая от вирусов на 70% ( Comuet , 1964). В ряде случаев вирусные заболевания вызвали г почти полное вырождение некоторых ценных сортов земляники ( Cornuet ( 1955),

Весовая вредоносность и массовое заражение вирусами промышленных сортов.привело к созданию в ряде стран - Швейцарии, Бельгии, *РРГt 1 США, Японии - специальных преграни фитосанитарной селекции земляники. В основе этих программ лежит получение здоровых.клонов путем отбора, термотерапии и культуры верхушечных меристем.

Несколько лет назад такая программа начала разрабатываться в Молдавском научно-исследовательском институте садоводства, виноградарства и виноделия в связи с приказом Министерства сельского хозяйства СССР {!!; 163 от 10 июня 19б?г) "О состоянии и мерах по развитию ягодоводства и выращиванию

здорового посадочного материала". Одним из звеньев разрабатываемой программы явился метод культуры верхушечных мери -сгем.

Б задачу исследований входило:

1. Изучение влияния искусственной питательной среды на развитие изолированных верхушечных меристем.

2. Влияние размера культивируемого эксплантата на регенерацию растения,

3. Оптимальные сроки отбора исходного материала.

Влияние предварительной термотерапии исходных растений на выход безвирусных регенерантов.

Материалы и методики исследований.

Исходным материалом едукили районированные в Молдавии сорта земляники с ярко выраженными вирусными симптомами,Верхушечные меристемы вычленялись в основном из столонов с момента их образования и до конца вегетации. Размер эксплантатов разнился от 0,2 до I мм. Для культивирования использовались биологические пробирки 22x220 мм. Испытывались питательные среды (¡"минеральными основами Готре, Хеллера, Уайта, Ку~ расиге и Снуга (Бутенко, 1964). Среды включали сахарозу или глюкозу, ПУК или АНУ, 2,4-Д, витамины, микроэлементы. Напутывалось также действие некоторых растительных экстрактов. Как правило, в питательную среду включался агар. Культуру содержались при_температуре от 15 до 25°С в осгеклонной камере с искусственным подсвечиванием люминесцентными лампами (25003000 люкс). Когда растеньица достигали примерно 3-4 см длины и имели хорошо развитые корни, их пересаживали в стерильную почвенную смесь в горжки и содержали в теплице. При достижении достаточного размера растения проверялись на вирусное содержание методом прививки на индикаторные клены РгаевПа тевса»

Развитие верхушечных не рис тем в культуре ^ у^го .

Питательная среда - важнейший фактор успешного развития меристем. Как показано рядом авторов, потребность я питательных элементах у верхушечных меристем различных тэдйг и даяе

сортов растений сильно разнится ( Кааsania , 1965jtlorel, 1966; Горбаренко, Кук, 1970). Вцсказывается предполокеаие, что различия в требованиях верхушечных меристем отражавт различия между растениями в способности к синтезу их апексами и таким образок различную степень зависимости от метаболитов из других частей растений ( Tine , Janea , 1969).

Верхушечные меристемы земляники разные исследователи культивируют на различных питательных средах, но все включают кокосовое молоко в качестве стимулятора развития,

В наших исследованиях мы стремились вначале найти наиболее благоприятное для развития верхушечных меристем земляники сочетание минеральной основы среды и рост стимулирующих веществ. Для этого к минеральным основам различного состава добавлялись одни и те же стимуляторы в одинаковой концентрации. На каждую из питательных сред высаживались верхушечные меристемы разного размера. Данные проведенного испытания показали, что среда Готре с ИУК обладает некоторым преимуществом в сравнении с другими испытанными сочетаниями минеральных основ и стимуляторов. При всех размерах культивируемых эксплантатов н& этой среде имеет место больший процент регенерации растений. В то жв время бросав .t б глаза, что количество меристем, развившихся в растеши, увеличивается о увеличением размера культивируемого кусочка ткани на всех видах питательных сред. Так, при размере 0,2 мы на среде Горте с ПУК получено всего Sf> регенерантов, тогда как меристемы размером 0,5 т и 0,8-1 мм дали 28 и 30% растений соответственно на той же среде. На среде Уайта ни с одним из стимулирующих веществ не было развития эксплантатов размером 0,2 мы. В то же время получено 23 и 30,7% растений из верхушечных меристем размером 0,5 и 0,8-1 мм соответственно.

Отобрав предварительно питательную среду в дальнейшем делались попытки повысить процент регенерации растений путем увеличения концентрации вводимой в среду ШК. Были испытаны дозировки в 0,5 и I мг/литр. Оказалось* что увеличение концентрации ИУК до 0,5 мг не оказывает заметного влияния на раз-

Таблица 4

Влияние времени изолирования верхумечных меристем земляники на процент регенерация

растений в культуре m vitro.

Время (айНяп Чяоло мерно- Число 1Мэрие- ! %

изолирова- 1„пт>иптп1.'Т9М погибших , |Иэрис- темы, реге-

НИЯ и поме- «игв.ян-'пт ив Пй?1тэм развив- нера-иения Я Образа- шиеся ции

культуру Й^ятйлЛ^ния 'ии! вавш* в «элыа меристем »""«Л®™. Сптя "лько раста-_"УНЯЙ \ стебли ния -

Пай 47 б 5 3 33 70

Июнь 91 2 3 82 90

Июль 59 5 - 2 52 88

Август 62 II 8 4 39 62,8

Сентябрь 88 37 16 9 26 29,6

Октябрь . 65 100 - - - -

ватели изолируют меристемы кз обработанных теплом растений, что по мнению ряда авторов, облегчает задачу оздоровления.

В наших исследованиях, как отмечалось выше, мы изолировали верхушечные меристемы размером от 0,2 до I мм.В начальный период работы мы не имели возможности применить комбинирование термотерапии и культуры верхушечных мерис-гэк.Но как показала предварительная индексация, растения, полученные из меристем размером I ми, несли вирусную инфекцию. Поэтому нас особенно интересовало изыскание возможности регенерации растений из минимальных кусочков ткани - 0,2 мм. Но нак ужа упоминалось, процент регенерации растений из таких эксплантатов очень невелик. Большинство из них погибает, незначительная часть развивает только стебли, которые впоследствии увядают. И только единичные эксплантаты развиваются в целые растения.

В связи с этим были предприняты попытки увеличить число

регенерирующих меристем путем улучшения культуральной среди. Для таких исследований была взята среда Готре^ с_ИУК_в концентрации ОцЗ.мг/лите, в которую добавлялись физиологически активные вещества. Испытаны следующие варианты:

1. Среда Готре + ИУК - основная (контроль).

2. Основная + дрожжевой ДО) + солодовый (10$) окстрак ты.

- 3. Основная + кокосовое молоко (10$).

Основная + гиббереллин + кинетин по I мг/л.

С сожалением приходится констатировать, что все испытанные препараты недали желаемого результата, ло крайней мере в примененных дозировках. Более того, гиббереллин с ки-нетином показали явный подавляющий эффект на развитие эксплантатов (только одно растение получено из 39 высаженных ме ристем). На среде с дрожжевым и солодовый экстрактами характер развития верхушечных меристем почти не отличался от тако вого на основной среде - большая часть эксплантатов погибла и только небольшое число их развилось в растеньица, чаще без корней. Несколько лучший рост наблюдался на среде с кокосовым молоком. Здесь около 1% меристем регенерировали растения Большая часть эксплантатов проявляла тенденцию к неорганизованному росту, что имело место примерно через неделю после высадки их иа питательную среду. Процесс этот длился около 1,5 месяцев, каллусная масса к этому времени увеличивалась примерно в 25 раз, и только тогда на поверхности каллуса возникал крохотный стебелек с бледно-зеленыщ листочками. Не сколько позже у основания стебелька появлялись корешки, вног да по 4-5 штук. Корешки удлинялись, росли по направлению к поверхности питательной среды и углублялись в нее. Но растения оставались слабыми, нитевидными, спустя некоторое время они отпирали. Попытка перенести такиз растения на новую питательную среду, лишенную стимуляторов роста, как рекомендует Вайн ( vine > .1968), положительного результата не дала.

Исхода из вышеизложенного, ш пришли к выводу о необходимости изолировать верхушечные «еристеш из предваритель-

во обработанных теплой растений, что дает возможность увели чить размер изолируемой ткани.

Культура изолированных верхушечных меристем земляники в сочетании с термотерапией исходных растений.

Репродукция вируса в клетке сопряжена с постоянным отмиранием более старых частиц. В нормальных условиях первый процесс преобладает над вторым, благодаря чему происходит накопление вирусных частиц в клетке и переход их в другие. При неблагоприятных условиях образование новых частиц не может компенсировать естественно идущего распада, в результате наблюдается убыль вируса и замедляется распространение его от клетки к клетке. Одним из таких неблагоприятных факторов является повышенная температура. Возможно, температура воздействует ве непосредственно на вирусные частицы, а активизирует образование каких-то веществ в клетке, способных инактивировать вирус. (Сухов, 1956). Следовательно,части растения, отроение лри условиях повышено?, температуры, должны быть свободными от вируса ("бег от ил$«кциип по выражении некоторых исследователей).

Комбинирование термотерапии с последующей культурой верхушечных меристем в последнее время все чаще применяют для оздеровления различных растений от вирусных инфекций ( Stone » 1957} 1962J Quak , 1965} Morel et al,I968) и Горбаренко, Жук, 1970; и др.). Этими работами доказана эффективность предварительной тепловой обработки растений, ив которых изолируются верхушечные меристемы.

Нами (совместно с Цуркан И.Г.) работа проводилась последующей методике: в октябре молодые хорошо укоренившиеся розетки с участка пересаживались в горшки с почвенной сые? сью. До наступления морозов растения содержались под открытым небом, затем переносились в теплицу. Термообработку начинали с апреля, для чего отбирались растения, у которых намечалось образование усов. Режим обработки был следующий: температура 3&*1°С г течение 3-х недель, освещение' 4000-6000

20

люкс,относительней влажность воздуха в термокамере 50-70%. По окончании обработки из усов изолировались верхушечные -меристемы разы эрой I ни. Для кулыиэдровааия применялась среда Готре с ПУК в концан«рации 0,5 иг/литр. Полученные растения проверялись ааотсутствие вирусов методой прививки на индикаторные клоны Рг.уезса . Данные проварки

представлены в таблице 5.

. . > 1аолица 5

Результаты индексации ьа отсутствие вирусов растений земляники, полученных из верхушечных меристем

Ш1 ПйсдЬ "típo4ISS них пп! Варианты опыта 1 варенных 1здоро-_I_1раотений 1вых

-

оздоровления

1. Без термотерапии исходных

растений 22 ^ 18

2. Исходные растения подвергались термообработке 31 16 51,6

Таким образом, применение культуры верхушечных меристем в сочетании с термотерапией исходного материала значительно увеличивает число растений-рэгэнерантов, освобожденных от вирусов.

Проваденяые исследования позволяют сделать следующие выводы;

1. Метод, культуры изолированных тканей оказался, с од ной стороны, удобной модельной системой для изучения факто ров иммунитета винограда к милдью, с другой, дея возможность получить свободные от вирусов растения земляники.

2. Исследованиями по изучению вваимоотновений воебуди тела милдью и к&ллусной ткани винограда, культивируемой ш vitro выявлена корреляция между устойчивостью s милдью листьев винограда и тканевой культуры соответствующего вида, сорте.

3. Устойчивость тканевой культуры проявляется: -

в) в различной продолжительности скрытого периода pas

вития возбудителя милдью внутри каллусных тканей; самый короткий инкубационный период - 5 дней - отмечен на каллусе сильно восприимчивого сорта Шасла, наиболее длительный -12 дней на каллусе устойчивого биотипа V.wnureneig •

б) в различной скорости распространения воздушного мицелия по поверхности каллусов. Ясли каллус сорта Шасла полностью захватывается грибом ухе на 7~8 день после инокуляции, то каллус устойчивого подвойного сорта 101-14 - только на 15-ый день, а на каллусах Сеянца (fe 2 я устойчивого биотипа у amurenaia гриб локализуется в одном месте. Каллусы иммунных ВИДОВ J.quinquifolia И с. antárctica t на листьях которых при заракении милдью возникают точечные некрозы и в природных условиях никогда пе образуется слоро-нсшения, совершенно непригодны для развития грибницы;

в) в неодинаковом характере образуемого патогеном спороношения - па каллусах восприимчивых обрзцов формируется большее количество зооспораягаев, и больная их часть является жизнеспособной, по сравнению с устойчивыми образцами,

4. Выявлена четкая корреляция мекду степенью развития р. vitícola на каллусах и степенью фитонцидной активно™

ста их клеточного сока. У образцов, проявивших более высокую фитонцидаость в течение всего патогенеза, наблюдается более слабое развитие паразита. Самый высокий уровень фитонцидно— ети у каллусов иммунных видов.

5. Отпечено резкое возрастание фитонцидной активности клеточного сока кзллусов восприимчивых образцов, что подтверждает мнение ряда авторов об активной сопротивляемости растительного организма внедрений патогена. К концу инкубационного периода фптонцидность резко снижается, борьба двух организмов заканчивается победой патогена.

6. Наряду с теоретическими исследованиями, метод культуры изолированных тканей использован в ваших исследованиях для решения чисто практической задачи - получения беэвирус-ных клонов земляники. В данном случае применена культура верхушечных меристем почек.

7* Для развития верхушечных меристем в изолированной культуре бояее благоприятной является среда Готре с ИУК в концентрации 0,5 иг/литр. Процент, регенерации растений возрастает о увеличением размера культивируемого эксплантата

8. Время, необходимое для полной регенерации растения, зависит от размера помещенного на питательную среду кусочка ткани. 8а 40-60 дней мокно получить растения из I мм эксплантатов; с уменьшением размера последних увеличивается продолжительность их развития до состояния, в котором они могут быть пересажены в почву,

9, Сортовые особенности исходного материала оказывают влияние на поведение верхушечных меристем в культуре Больший процент.регенерации получен у сортов Зенга-Ьенгана, Фрумушика, Мелитопольская ароматная; меньший - у сортов Ыи-«а Юиндлер, Фестивальная, Оригинальная.

10. Регенерирующая способность верхушечных меристем зависит от времени помещения их в культуру. Больший процент регенератов получен нами в июне-июле. С августа регенерирующая способность изолированных верхушечных меристем ослабевает, октябрьские посева полностью инфицируются сапрофитной микрофлорой, и получить растения в данном случае не удается.

11. Полученные в стерильной культуре из верхушечных меристем растения подлежат обязательной проверке на отсутствие вирусной инфекции прежде, чем они будут размножены под названием супер-супер элиты. Исследования показали, что регене-ранты, полученные из верхушечных меристем размером I мм, содержат вирусную инфекции, а меристемы меньшего размера плохо развиваются. Поэтому считаем целесообразным применять предварительную термотерапию исходных растений, что дает возможность получить безвирусные клоны из I мм эксплантатов.

В результате разработанной нами методики получено 20 бвзвирусных клоне» 4-х районированных в Молдавии сортов земляники, которые ускоренно размножаются в тепличном комплексе лаборатория вирусологии ВДИИСВиВ. В настоящее время имеется

Погпиоано в печзть 19.ХП 1972 г. АЮ$5Э6 . Формат бумаги 60x90 1/16. Печ.л.5_____Тирад: 200. Заказ 30.___________Бесплатно.__

Тш!0гра|ия издательства "Етииниа", Кипкп^,277004, ул. Ьеозарина, 10.