Применение каталитических маркеров на основе двухвалентного кобальта в планшетном иммуноанализе с визуальным учётом результатов

Филатов, Павел Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Применение каталитических маркеров на основе двухвалентного кобальта в планшетном иммуноанализе с визуальным учётом результатов
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Применение каталитических маркеров на основе двухвалентного кобальта в планшетном иммуноанализе с визуальным учётом результатов"

На правах рукописи

004611240

Филатов Павел Владимирович

Применение каталитических маркеров на основе двухвалептного кобальта в планшетном иммуноанализе с визуальным учётом результатов

03.01.06 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 1 ОКТ ?010

Кольцово-2010

004611240

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России

Ведущая организация ГУ НИИ биохимии СО РАМН (г. Новосибирск)

Защита состоится « 29 » октября 2010 г. в 9 часов на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при ФГУН Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559, тел. (383)336-74-28

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»

Автореферат разослан« 28 » сентября 2010 г.

Научный руководитель

доктор биологических наук, Полтавченко Александр Георгиевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Малыгин Эрнст Георгиевич

доктор биологических наук Татьков Сергей Иванович

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В настоящее время разработано большое количество различных иммунохимических тестов (Herzog D.P., 2006, Stewart B.J. et al., 2006). Из всего многообразия современных иммунодиагностических методов в практическом здравоохранении наибольшей популярностью пользуется иммунопероксидазный тест (Aurameas S., 1971, Jeanson А. et al., 1988) в постановке на планшетах для иммунологических реакций (Engvall Е. 1971). Этот метод хорошо зарекомендовал себя в клинических и лабораторных исследованиях, однако для количественного спектрофотометрического учёта результатов требуется специальная дорогостоящая аппаратура и высокая квалификация персонала. В условиях слабого финансирования здравоохранения, приобрести специальный спектрофотометр могут позволить себе только крупные диагностические центры.

В то же время потребность в серологическом контроле на местах велика. Это и контроль крови на наличие инфекционных заболеваний при оперативных вмешательствах и экстренных трансфузиях, и контроль инфекций, возбудители которых вызывают тератогенный эффект, а также выявление и дифференциация паразитарных и хронических инфекционных заболеваний. Большая часть лечебных учреждений не имеет возможности самостоятельно осуществлять иммунодиагностику и вынуждена пересылать образцы или направлять больных на обследование в диагностические центры. При значительном отдалении таких центров, особенно в восточной части России, получение результатов анализа затягивается на недели, что негативно отражается как на качестве иммунодиагностики, так и на здоровье пациентов.

Таким образом, создание чувствительных, но простых и недорогих тест-систем, позволяющих выполнять иммунологический анализ в условиях слабооснащенных медицинских учреждений или во внелабораторных условиях, весьма актуально и позволит сделать иммунологическое обследование населения более доступным, своевременным и эффективным.

Цель исследования: разработка планшетного метода иммуноанализа с надежным визуальным учетом результатов для повышения доступности и эффективности лабораторной диагностики инфекционных заболеваний.

Задачи исследования:

1. подбор условий получения иммунозолей на основе соединений двухвалентного кобальта и изучение их свойств;

2. отработка способов проявления кобальтсодержащих иммунозолей;

3. оптимизация условий применения кобальтсодержащих маркеров в планшетном варианте иммуноанализа;

4. оценка стабильности иммунозолей при хранении;

5. оценка эффективности применения кобальтсодержащих маркеров в иммуноанализе.

Научная новизна. В работе показано, что золи на основе соединений двухвалентного кобальта:

- могут быть использованы в качестве маркеров иммуноанализа на микротитровальных планшетах;

- по чувствительности и специфичности не уступают иммуннопероксидазным конъюгатам и, при этом, имеют перед ними преимущества по относительной простоте получения иммунозоля, а также по использованию стабильного и безвредного проявляющего раствора;

- позволяют создавать системы для иммунохимического тестирования с надежным бесприборным учетом результатов.

Практическая значимость работы:

- разработаны методы получения и применения в иммуноанализе иммунозолей на основе соединений двухвалентного кобальта;

- показано, что применение кобальтсодержащих иммунозолей позволяет создавать диагностические тест-системы с надежным визуальным учетом результатов по принципу «да/нет» для обеспечения иммунодиагностики в слабо оснащенных лабораториях городских и районных сельских больниц;

- описанная в настоящей работе система визуализации результатов иммунохимического анализа пригодна для производства диагностических наборов любой специфичности и может найти применение не только в диагностике инфекционных заболеваний, но и в других отраслях медицины, а также в ветеринарии, экологических исследованиях и научных экспериментах

- подана заявка на получение Патента РФ «Хромогенная система для визуализации результатов иммунохимического анализа в микротитровальных планшетах» (Per. №2010136265 от 27.08.2010). Основные положения, выносимые на защиту:

1. Теоретически и экспериментально обоснована возможность применения иммунозолей на основе двухвалентного кобальта в планшетном иммуноанализе.

2. Разработана методология проведения иммунокатапитического анализа с применением кобальтсодержащих маркеров.

3. Получено экспериментальное подтверждение эффективности иммунокатапитического анализа в сравнении с иммуноферментным анализом по чувствительности и специфичности.

Конкретное участие автора в получении результатов Вклад автора в представленные результаты заключается в личном участии во всех теоретических и экспериментальных исследованиях, обработке результатов и формулировании выводов. Все работы выполнены под руководством и в соавторстве с А.Г. Полтавченко. Часть исследований выполнена в соавторстве с Б.Н. Зайцевым, H.A. Кривенчуком, А.Н. Рыбаковым и A.M. Яковченко. Всем, принимавшим участие в данной работе, автор выражает искреннюю признательность. Апробация работы

Материалы диссертации представлены на следующих конференциях: междисциплинарном семинаре: «Микробициды для здоровья и репродукции человека, медико-социальные проблемы сексуально передаваемых инфекций» и международной научной конференции «Актуальные вирусные инфекции -теоретические и практические аспекты» (Санкт-Петербург, 2004 г.); международной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Ульяновск, 2006 г.). Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 113 страницах, содержит 13 таблиц и 11 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, выводов и списка литературы. Список литературы включает в себя 193 источника, из них 146 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы

В экспериментах использовали: азид натрия, ализарин (1,2-диоксиантрахинон), ализарин S (3,4-диоксиантрахинон-2-сульфокислота, натриевая соль), бычий сывороточный альбумин (БСА), поливинилпирролидон (ПВП) с молекулярной массой 10, 40 и 200 кДа, тайрон (4,5-дигидрокси-1,3-бензодисульфокислота), твин-20, трис-основание (Sigma, США); овальбумин, полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярной массой 6 и 20 кДа (Serva, Германия); белок A Staphylococcus aureus (SpA) (ВНИИ ОЧБ, С.-Петербург), БСА (НПО «Аллерген», Ставрополь), планшеты для иммунологических реакций с плоским дном (ПО «Енисей», Красноярск) или (ВНИИ «Биополимер», Москва), отечественные реактивы с квалификацией не ниже «чда». Концентрат блокирующего раствора (КБР), представляющего собой лизат клеток Е. coli, предоставлен И.Н. Бабкиной (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»). Во всех экспериментах использовали дважды дистиллированную воду.

Использовались следующие антигены: рекомбинантные аналоги антигенов Treponema pallidum с молекулярной массой 17 и 41 кДа, полученые в Е. coli в виде химер с ß-галактозидазой Е. coli или глутатион-8-трансферазой Shistosoma japonicum (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор») предоставлены П.А. Белавиным (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»), рекомбинантный аналог антигена CagA Helicobacter pylori (ЗАО «Медико-биологический союз», Бердск).

В работе использованы антитела: антитела кроличьи против Fc-фрагмента IgG человека (ICN, США), антитела козьи против всей молекулы IgG человека (Sigma, США), иммуноглобулины из нормальной сыворотки человека (НИИ ЭМ им. Г.Н. Габричевского, Москва).

В экспериментах использовались конъюгаты: коньюгат пероксидазы хрена с моноклональными антителами против всех субклассов IgG человека (ПХ-a/Hum-IgG (фирма «Капель», Москва), конъюгат пероксидазы хрена с белком A Staphylococcus aureus (ПХ-SpA) (Sigma, США).

Для выявления пероксидазы в планшетном варианте ИФА использовали субстраты на основе о-фенилендиамина (0,5 мг/мл ОФД и 0,02 М перекиси водорода на 0,05 М цитратно-фосфатном буферном растворе, pH 5,5) или субстрат на основе 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ) из тест-систем ЗАО «ИмДи».

Чувствительность и специфичность тест-систем оценивали с применением панелей сывороток производства ЗАО «Медико-биологический Союз», Бердск: стандартная панель сывороток, содержащих и не содержащих антитела к ВИЧ - ОСО 42 28-212-93, серия 009, экспериментальная панель сывороток, содержащих и не содержащих антитела к Т. Pallidum «Э-СИФ-01», панель сывороток с нормированным содержанием IgG к белкам р17 и р41 Т. pallidum, серия 001, рабочие панели сывороток, предоставленные ЗАО «ИмДи», и собранные самостоятельно в рамках научно-исследовательского проекта «Изучение динамики гуморального иммунитета при сифилитической инфекции и отработка новых методов иммуноанализа», утвержденного Этическим комитетом ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» 19.09.2002 г.

В сравнительных экспериментах использовались диагностические наборы: «ИФА-Анти-трепонема», «Токсоплазмоз IgG-антитела» (ЗАО «ИмДи-спектр», Новосибирск), «СИФ-^в-ДС-стрип (ФСП 42-0155-5191-04)» (ЗАО «Медико-биологический союз, Бердск), «РекомбиБест антипаллидум IgG стрип», «СИФ-IgG-ДС», «Анти-HCV» (ЛТД «Авиценна», С-Петербург), «ВИЧ-1, ВИЧ-2 ИФА-Авиценна» (ЛТД «Авиценна», Москва), «РекомбиБест анти-ВИЧ-1+2», «РекомбиБест анти-ВГС» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск).

Методы

Исследование структурно-дисперсных характеристик маркеров проводили методом электронной микроскопии на микроскопе JEM-100S фирмы «JEOL» (Япония).

Определение концентрации частиц маркера проводили методом фильтрации и взвешивания. 10 мл золя маркера фильтровали под вакуумом через предварительно взвешенный фильтр из нитрата целлюлозы с порами 0,22 мкм и промывали собранный на фильтре маркер небольшим количеством дистиллированной воды для удаления растворимых солей. Высушивали фильтр с маркером в течение суток при температуре 50-60 °С. Просушенные фильтры взвешивали на аналитических весах и, вычитая массу чистого фильтра, определяли массу маркера. Разделив полученное значение на профильтрованный объем (10 мл), получали весовую концентрацию маркера в 1 мл суспензии. Это значение использовали в расчетах соотношения маркер/иммунореагент при получении иммунозолей.

Адсорбционное связывание частиц маркера с иммунореагентами проводили методом «дробной нагрузки», внося при умеренном перемешивании в три приема с

интервалом 10-15 мин равные порции маркера в раствор иммунореагента. После 30 минутной инкубации в золь добавляли 10 %-ый водный раствор БСА (1/10 объема золя). Спустя еще 15 минут, в золь добавляли в соотношении 1:1 по объему стабилизирующий раствор.

Иммуноферментный анализ (ИФА) выполняли в объемах 100 мкл. Использовали разведения сывороток 1/10, или двукратно раститровывали сыворотки в РБР-С-Ф. Инкубации с сыворотками и с рабочим разведением пероксидазного конъюгата на РБР-К-Ф проводили по 30 мин при 37 °С. Отмывки выполняли пятикратно ФСБ-Т. Проявление в субстрате, содержащем 0,5 мг/мл о-фенилендиамина и 0,02 M перекиси водорода в цитратно-фосфатном буфере, рН 5,5, осуществляли в течение 15 мин при температуре 37 °С. Иммуноферментный анализ на коммерческих диагностических наборах выполняли в соответствие с инструкциями производителя.

Иммунокаталитический анализ (ИКА) выполняли по схеме, аналогичной ИФА, но, в зависимости от задач эксперимента, разведение сывороток и иммунозолей, а также отмывки и проявление выполняли с использованием различных растворов. Все отмывки в ИКА проводили пятикратно ТСБ-Т. Для разведения золей использовали раствор ТСБ-Т с добавкой 0,05 % (в/о) БСА (НПО «Аллерген», Ставрополь). Проявление иммунозолей проводили в индикаторном растворе, содержащем: концентрации (1-10 мМ) ализарина S и 20 мМ перекиси водорода в ФБ или ББ. Перед внесением индикаторного раствора ячейки планшета дополнительно ополаскивали дистиллированной водой.

Оптическую плотность образцов в планшетах для иммунологических реакций учитывали на сканирующем спектрофотометре «Multiskan-3 ЮС» (Flow Lab., Финляндия) при А.=492 нм (для ОФД) или при А,=450 нм (для ТМБ).

Корректировку водородного показателя растворов осуществляли 0,1 M растворами NaOH и НС1. Контроль рН проводили с помощью рН-метра типа рН-673М с погрешностью ±0,1 ед. рН.

Концентрацию белков определяли с использованием реактива Coomassie G-250 и спектрофотометра «Spekol» (Германия).

Взвешивание осуществляли на аналитических весах марки MA ВЛА - 200-М с погрешностью ± 0,001 г. Дозирование жидких препаратов осуществляли автоматическими пипетками переменного объема фирмы «Gilson» (Франция) с .относительной погрешностью ± 5 %.

Статистическую обработку количественных показателей для вероятности 95 % проводили с использованием квантилей распределения Стьюдента.

Медоды приготовления кобальтсодержащих маркеров описаны ниже.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ИФА в микротитровальных планшетах является одним из наиболее чувствительных и удобных методов иммунодиагностики, но требует сложной и дорогой аппаратуры для учета результатов, поскольку образцы с малым содержанием анализируемого вещества сложно отличить от фона отрицательных проб. Таким образом, если сделать разницу окраски таких образцов более наглядной (при сохранении общей схемы постановки теста) - это поможет расширить круг медицинских учреждений, способных выполнять такой анализ. В основу разработки положена идея использования в иммуноанализе неорганических каталитических маркеров — гидрозолей на основе соединений двухвалентного кобальта, способных в малых концентрациях вызывать показательные изменения цвета индикаторных растворов. В экспериментах использованы известные методы определения следовых количеств кобальта в сложных смесях (Крейнголд С.У., 1983; Мюллер X. и др., 1983). Однако эти методы были разработаны для гомогенных каталитических реакций и не могли дать представления ни об эффективности выявления золей, ни о влиянии биокомпонентов на такое выявление. До настоящего времени кобальтсодержащие золи в иммунохимических тестах не применялись.

В работе использовали золи сульфида и ферроцианида двухвалентного кобальта, приготовленные в условиях избытка катионов или анионов. Образующиеся в таких условиях химческие соединения имеют различный состав, а способ получения золя (при избытке катиона или аниона) может влиять как на процесс связывания белков поверхностью частиц, так и на чувствительность их выявления в индикаторной реакции. Сульфидные золи получали, смешивая 0,02 М растворы нитрата кобальта и сульфида натрия, а ферроцианидные золи - смешивая 0,02 М растворы нитрата кобальта и гексациано-(11)феррата калия (желтой кровяной соли). При получении золя с избытком катионов использовали объемное соотношение растворов - 3:1, а при получении золя с избытком анионов - 1:3, соответственно.

Оценку формы и размеров частиц золей проводили методом электронной микроскопии. Под электронным микроскопом такие золи выглядели как крупные скопления полигональных слегка вытянутых кристаллов (рис. 1).

Частицы золей имели средние размеры:

сульфид кобальта, полученный при избытке катиона (СКк) - 20x50 нм,

- сульфид кобальта, полученный при избытке аниона (СКа) - 20x30 нм,

- ферроцианид кобальта, полученный при избытке катиона (ФКк) - 20x30 нм,

- ферроцианид кобальта, полученный при избытке аниона (ФКа) - 15x20 нм.

После стабилизации белками крупные конгломераты в значительной степени

диссоциировали, однако, во всех препаратах можно было наблюдать агрегаты, содержащие до нескольких десятков частиц.

Определение концентрации частиц маркера выполняли методом фильтрации и взвешивания. Полученные значения использовали в расчетах соотношения по массе маркер/иммунореагент при получении иммунозолей.

- у

• ^

4 «Г

" : -

СКк-1йС

г ,: '

Ь Ч *

.Л/ > ^

ФКк-^С

Рис. 1. Изображения кобальтсодержащих золей под электронным микроскопом.

Ориентировочный масштаб для всех снимков, приведен на изображении ФК.

Связывание иммунореагентов (антивидовых иммуноглобулинов или ЭрА фракции из иммунных сывороток) с частицами золей проводили методом адсорбции, за несколько приёмов добавляя золь в раствор иммунореагента из расчета - 1000:1 по массе, соответственно. При таком подходе получался неравномерно нагруженный золь, но это не мешало поведению анализа и позволяло избежать

длительной и дорогой процедуры очистки конечного продукта от избытка реагентов. Дополнительную блокировку поверхности золя выполняли БСА. В дистиллированной воде (рН=5,8) золи с избытком катиона имели положительный, а с избытком аниона -отрицательный заряд.

Результаты экспериментальной оценки предела обнаружения золей в индикаторных системах разного состава приведены в таблице 1 и на рисунке 2.

Таблица 1

Условия, использованные в экспериментах по выявлению кобальтсодержащих золей, и

достигнутый при этом предел обнаружения

Восстановитель ([С], мМ) Н202 рн БР* Достигнутый предел обнаружения, нг/мл **

ФКк ФКа СКк СКа Со ФКк- СКк-

Ализарин 8 (9,0) 0,02 11,5 ФБ 13,0 20,0 6,0 10,0 - 80,0 60,0

(1,8) 0,02 11,5 ФБ 6,0 10,0 3,0 5,0 1,0 20,0 15,0

(0,9) 0,02 11,5 ФБ 1,0 2,0 1,0 2,0 0,5 15,0 10,0

(0,4) 0,02 11,5 ФБ 0,7 2,0 0,5 1,0 0,24 2,0 2,0

(0,2) 0,02 11,5 ФБ - - - - 0,2 - -

(9,0) 0,02 11,5 ББ 10,0 50,0 2,0 25,0 - 25,0 40,0

(1,8) 0,02 11,5 ББ 2,0 30,0 1,0 15,0 1,0 5,0 4,0

(0,9) 0,02 11,5 ББ 1,0 12,0 0,8 5,0 0,5 2,0 2,0

(0,4) 0,02 11,5 ББ 0,7 2,0 0,7 1,0 0,24 2,0 1,0

(0,2) 0,02 11,5 ББ - - - - 0,2 - -

Ализарин (2,0) 0,15 12,2 ББ 40,0 - 6,0 - 1,0 - 10,0

(0,4) 0,15 11,4 ББ 10,0 - 4,0 - 1,0 - 5,0

Тайрон (5,0) 0,10 10,5 ФБ 300 600 20,0 60,0 10,0 - 30,0

ДФК (5,0) Тайрон (20,0) 0,12 11,0 ББ 6,0 - 1,0 2,0 0,7 10,0 2,0

ДФК (1,5) Тайрон (20,0) 0,12 11,0 ББ 0,7 - 0,5 0,5 0,25 2,0 1,0

ДФК (0,7) Тайрон (10,0) 0,12 11,0 ББ 1,0 - 0,2 0,2 0,2 2,0 0,8

Пирокатехин (10,0) 0,05 11,5 ББ 3,0 15,0 2,5 10,0 0,7 2,0 2,0

Пирокатехин (10,0) 0,02 10,5 ББ 3,0 3,0 2,0 10,0 0,7 2,0 2,0

* БР - буферный раствор: ФБ - 0,1 М Ка-фосфатный и ББ - 0,1 М Ка-боратный.

** По общей массе золя без учета связанной воды, за 30 мин проявления при комнатной температуре, по визуально учитываемому переходу окраски индикатора. ДФК дифенилкарбазон.

Точный химический состав золей и количество связанной с их частицами воды неизвестны, поэтому приведённые в таблице 1 данные имеют ориентировочный характер.

Использованные в наших экспериментах индикаторные растворы значительно различались по пределу обнаружения золей кобальта и цветовой гамме проявления.

При использовании растворов тайрона появляется яркая оранжево-желтая окраска, которая в течение нескольких минут сменяется на бледно-желтую.

Скорость переходов окраски зависит от концентрации кобальта. Такая быстрая смена окраски неудобна, поскольку требует большого внимания оператора при учете результатов. При каталитическом окислении пирокатехина вначале развивается интенсивная оранжево-красная окраска, которая быстро меняется на желто-бурую. При увеличении концентрации пирокатехина можно повысить наглядность проявления, но предел обнаружения при этом резко снижается. Кроме того, для пирокатехина характерна слабая устойчивость при хранении и токсичность.

концентрация золе!

Л аттапчт. С (ЬчЛЛ Г^К ■ дттдшщ С ОгиЛ* КС

Рис. 2. Эффективность выявления золя сульфида кобальта, полученного при избытке катионов, в разных индикаторных системах (п=4, р=0,95).

Индикаторная реакция с дифенилкарбазоном, активированная тайроном,

является одной из самых чувствительных и избирательных для определения кобальта

(Долманова И.Ф. и др., 1973). В ходе проявления цвет этого индикаторного раствора

сначала изменяется с фиолетового на оранжевый, а затем на светло-желтый. С

применением этого индикаторного раствора, удается обнаружить золи кобальта в

концентрации менее 1 нг/мл, однако наглядность цветового перехода была невысокой, а индикатор в ходе реакции дважды менял окраску.

Ализарин в щелочной среде приобретает насыщенную бордовую окраску. Продукты его окисления слабо поглощают в видимой части спектра, что обеспечивают наглядный цветовой переход. Однако ализарин обеспечивает относительно низкий предел обнаружения золей, что делает его неперспективным для использования в качестве индикатора.

Ализарин Б является сульфопроизводным ализарина и обычно используется в индикаторных растворах на основе боратного или фосфатного щелочного буферного раствора. Боратно-щелочные растворы ализарина Б имеют темно-бордовую окраску, а фосфатно-щелочные - насыщенный фиолетовый цвет. И в той и в другой проявляющих системах для золей ферроцианида и сульфида кобальта, полученных при избытке катионов, достигается более низкий предел обнаружения, чем для их анионных аналогов. Следовательно, они более перспективны для использования в качестве маркеров иммуноанализа. Относительно небольшая разница в пределах обнаружения таких золей и растворов нитрата кобальта позволяет сделать вывод о том, что золи в процессе проявления частично растворяются и индикаторная реакция происходит в гомогенной фазе. Ускорению растворимости золей способствует щелочная среда и ионы буферной системы. В частности известно, что фосфаты эффективно растворяют ферроцианиды кобальта, образуя комплексные ионы (Перельман Ф.М., Заворыкин А.Н., 1975). Более короткий индукционный период и более высокую скорость проявления золей в фосфатных проявителях на основе ализарина Б по сравнению с аналогичными боратными растворами, вероятно, можно объяснить более энергичным растворением золей в фосфатном буферном растворе. Связывание поверхности маркера с белками увеличивает индукционный период. Эти явления связаны, возможно, с блокированием поверхностного слоя катализатора и наличием предварительного этапа десорбции белков. Вне индукционного периода скорость проявления чистых и связанных с белками золей примерно одинакова и после 30 минут проявления при комнатной температуре они достигают сходных пределов обнаружения. Инкубацией при 37 °С процесс можно ускорить в 2-3 раза.

Наиболее подходящими для визуального учета результатов (т.е. обеспечивающими приемлемое сочетание чувствительности, наглядности и скорости проявления) являются индикаторные растворы, содержащие 20 мМ Н202 и 1-2 мМ ализарина Б в фосфатном (рН 11,0-11,2) или боратном (рН 11,4-11,5) щелочных

буферных растворах. Каждый из этих проявителей имеет определенные преимущества и недостатки. Боратно-щелочной индикаторный раствор позволяет достигать немного более низкого предела обнаружения, чем фосфатный, однако проявленные им образцы имеют более насыщенный желтый цвет и переход окраски выглядит менее наглядным. Фосфатный индикаторный раствор обладает более высокой скоростью проявления, и позволяет достигать большей контрастности между отрицательными (фиолетовыми) и положительными (светло-желтыми) образцами. Скорость проявления ФКк-^в и в том и другом индикаторных растворах заметно выше, чем у СКк-^в (рис. 3).

Растворы ализарина Б стабильны и могут сохраняться без перекиси водорода более полугода. Индикаторные системы на основе ализарина Б удобны в применении, нечувствительны к свету и нетоксичны. Подобранные составы индикаторных растворов обеспечивают выявление золей при комнатной температуре в течение 20-30 мин, а полученная картина проявления сохраняется в течение нескольких часов (в ряде случаев до 2 суток).

Время, мин

- -Д-" СКк наФБ —О— ФКк на ФБ СКкнаББ —•—ФКкнаББ ..........зона перехода окраски

Рис. 3. Динамика проявления золей СКк-^в (пунктир) и ФКк-ДО (сплошная линия) с концентрацией 50 нг/мл в боратном (ББ) и фосфатном (ФБ) буферных растворах, рН 11,5, содержащих 2 мМ ализарина Б (п=4, р=0,95).

В белоксодержащей среде время проявления золей увеличивается. Причиной тому могут служить органические компоненты как связанные с поверхностью золя, так и присутствующие в дисперсионной среде. Чтобы проверить влияние наиболее широко использующихся в иммуноанализе компонентов на скорость проявления золей, в ячейках планшета готовили серии их десятикратных разведений (от 1 до 0,001 %) и вносили в них золи.

Спустя 30 мин добавляли индикаторный раствор и фиксировали результаты каталиметрической реакции через определенные промежутки времени. Определяли скорость индикаторной реакции (у=ДОГОД1) в начальном периоде с выраженной динамикой проявления и строили график зависимости скорости реакции от концентрации компонента. В ходе экспериментов установлено, что тормозящий эффект добавок менее выражен в фосфатном, чем в боратном проявителе. Органические компоненты меньше влияют на проявление золей ферроцианида, чем золей сульфида кобальта. Полиэтиленгликоли и твин-20 в использованных концентрациях практически не влияют на скорость реакции. Из сывороточных белков в меньшей степени замедляют проявление иммуноглобулины. Альбумины из сыворотки человека, крупного рогатого скота и лактальбумин в концентрации 0,1% примерно вдвое тормозят проявление золей в фосфатном проявителе. При проявлении сульфида кобальта в боратном проявителе они ингибируют проявление даже в концентрации 0,01 % более чем на 70 %.

Можно предположить две основных причины замедления проявления. Первая - блокирование белками поверхности маркера от контакта с индикаторным раствором. Вторая - закисление индикаторного раствора, поскольку наиболее выраженным тормозящим действием обладают компоненты, характеризующиеся значительной буферной емкостью и кислыми свойствами (глицин, казеин, желатин, лактальбумин), а при рН<11,0 скорость индикаторной реакции резко снижается. Вероятно, в отмеченные эффекты воздействия органических компонентов вносят свой вклад оба фактора.

При сравнительной экспериментальной оценке рабочих растворов, приготовленных с использованием буферных систем на основе фосфатов, глицина и трис, установлено, что для выполнения иммуноанализа с применением золей кобальта наиболее пригодны растворы для отмывок и разведения золей на основе трис, а добавки в них твин-20 позволяют эффективно снижать неспецифические взаимодействия как органических, так и неорганических компонентов. В условиях

наших экспериментов диапазон рабочих концентраций для того и другого золя составлял от 20 до 300 мкг/мл (оптимум - 50-100 мкг/мл). Применение таких концентраций иммунозолей позволяло достигать предела обнаружения иммуноглобулинов класса в человека около 3 нг/мл, сходного с показателями ИФА (рис. 4).

2 тОП,

■ СКк-a/IgG-Hum

■ ФКк-a/Ig-GHum

• ПХ-a/IgG-Hum

Зона перехода окраски

300 100 30

1 0,3 0,1

Рис. 4. Выявление IgG человека (сплошная линия) и кролика (пунктир) с использованием иммунопероксцдазного конъюгата и иммунозолей сульфвда (СКк) и ферроцианида (ФКк) кобальта на основе иммуноглобулинов против IgG человека (п=4, р=0,95).

Оценку эффективности применения кобальтсодержащих маркеров в иммуноанализе проводили на ряде коммерческих тест-систем: с применением стандартных и рабочих панелей сывороток и золя ферроцианида кобальта, связанного с антителами против IgG человека или белком A Staphylococcus aureus. При этом сначала выполняли ИФА в соответствии с инструкцией производителя, а затем заменяли пероксидазный конъюгат на иммунозоль, отмывочный раствор на ТСБ-Т, субстрат на индикаторный раствор, содержащий 1,5 мМ ализарина S в фосфатном буферном растворе (рН 11,2) и выполняли ИКА по схеме, аналогичной ИФА.

На рисунке 5 в графическом виде приведены результаты определения титров антител к Т. gondii с использованием набора «ToKCO-lgG-антитела, стрип» (ЗАО «ИмДи-спектр», Новосибирск) и иммунозоля ФКк-a/IgG-Hum. Сравнительные данные

по определению антител с применением пероксидазного конъюгата и иммунозоля приведены в таблице в верхней части рисунка.

Видно, что кобальтсодержащий маркер обеспечивает чувствительность определения антител не ниже, чем пероксидазный конъюгат.

№ образцов панели 8-13 7 6 5 4 3 2 1

Титр в ИФА отр 1:100 1:100 1:200 1:400 1:800 1:800 1:3200

Титр в ИКА отр 1:100 1:100 1:200 1:400 1:800 1:800 1:3200

1ЛООООООО© {N>/10000000 — СЧ 00 \0 -tf

—' чо

Рис. 5. Определение титров антител к Toxoplasma gondii в ИКА с использованием иммунозоля

ФКк-a/IgG-Hum и индикаторной системы с 1,5 мМ ализарина S (п=4, р=0,95). Цифрами обозначены номера образцов по таблице, где приведены сравнительные данные по определению

титров антител в ИФА и ИКА.

Сравнение указанных методов при выявлении IgG к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) проводили на коммерческих тест-системах: «ВИЧ-1, ВИЧ-2 ИФА-Авиценна» (ЛТД «Авиценна», Москва) и «РекомбиБест анти-ВИЧ-1+2» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск). В тест-системе «Авиценна» использовался коньюгат SpA-ПХ, а в тест-системе «Вектор-Бест» - конъюгат a/IgG-Hum-ПХ. ИКА на этих наборах проводили, соответственно, с иммунозолями ФКк-SpA и ФКк-a/IgG-Hum. Сравнение проводили на стандартной панели сывороток, содержащих антитела к вирусу иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) ОСО 42 28-212-93 серия 009, дополненной пятью образцами донорской сыворотки, не содержащими антитела к ВИЧ. Результаты приведены в таблице 2.

И в той и в другой тест-системе результаты ИФА и ИКА полностью совпадают. При этом в ИКА все негативные сыворотки имеют темно-фиолетовый, а все позитивные - светло-желтый цвет, что облегчает надежный визуальный учет результатов.

Таблица 2

Сравнение иммунозолей и пероксидазных конъюгатов в серийно выпускаемых тест-системах

для определения антител к ВИЧ

№ «ВИЧ-1.ВИЧ-2 ИФА Авиценна» «Рекомби-Бест анти-ВИЧ-1+2»

образца панели ИФА (БрА-ПХ) ОП407 ИКА (8рА-ФКк) ОП492 ИФА (^Оа/Ниш-ПХ) ОП492 ИКА (^Са/Ниш-ФКк) ОП4,7

1 1,698 + 0,222 + 1,796 + 0,263 +

2 1,437 + 0,226 + 1,475 + 0,282 +

3 1,094 + 0,253 + 0,916 + 0,255 +

4 1,386 + 0,240 + 1,048 + 0,252 +

5 1,011 + 0,265 + 0,863 + 0,242 +

6 1,765 + 0,227 + 0,956 + 0,296 +

7 1,482 + 0,247 + 1,915 + 0,231 +

8 1,164 + 0,234 + 1,878 + 0,277 +

9 0,987 + 0,263 + 1,234 + 0,283 +

10 0,848 + 0,254 + 0,965 + 0,306 +

11 1,097 + 0,265 + 0,994 + 0,246 +

12 < 0,964 + 0,342 + 0,817 + 0,272 +

13 0,946 + 0,278 + 0,936 + 0,266 +

14 0,769 + 0,296 + 0,649 + 0,285 +

15 0,815 + 0,312 + 0,873 + 0,282 +

16 0,734 + 0,336 + 0,915 + 0,268 +

отр 1 0,169 - 1,017 - 0,112 - 1,268 -

отр2 0,183 - 0,953 - 0,153 - 1,285 -

отр 3 0,111 - 1,275 - 0,085 - 1,344 -

отр 4 0,138 - 1,114 - 0,096 - 1,259 -

отр 5 0,162 - 1,236 - 0,124 - 1,246 -

ОПкрит 0,258 0,213

КИР 1,412 1,397

Диапазон перехода* 0,350-0,400 0,350-0,400

* при ОП менее 0,350 - цвет проявителя светло желтый, выше 0,400 - фиолетовый. КИР - контроль стабильности индикаторного раствора. Регистрация ОП при X = 492 нм, условия эксперимента в тексте.

Сравнение указанных методов при выявлении ¡^й к вирусу гепатита С (ВГС) проводили на наборах: «Анти-НСУ» (ЛТД «Авиценна» С-Петербург) и «РекомбиБест анти-ВГС» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск). В тест-системе «Авиценна» использовался коньюгат пероксидазы со стафилококковым белком А (БрА-ПХ), а в тест-системе «Вектор-Бест» - конъюгат пероксидазы с антивидовыми

иммуноглобулинами (а/^в-Нит-ПХ). ИКА на этих наборах проводили, соответственно, с иммунозолями ФК-ЭрА и ФК-а/^О-Ниш, а проявление выполняли в фосфатном индикаторном растворе с 2 мМ ализарина Б. Сравнение проводили на рабочей панели сывороток, содержащих и не содержащих антитела к ВГС, предоставленном ЗАО «ИмДи». Результаты анализа представлены в таблице 3.

Таблица 3

Сравнение иммунозолей и пероксидазных коньюгатов в серийно выпускаемых тест-системах

для определения антител к ВГС

№ образца Анти-НСУ«Авиценна» Рекомби-Бест а/ВГС

ЭрА-ПХ оп4,„ ФК-БрА ОП450 а/^О-ПХ ОП450 ФК-а/^С ОП45о

1 0,220 1,414 0,246 1,263

2 0,324 0,326 0,457 0,282

3 2,654 0,253 3,012 0,255

4 2,411 0,240 2,980 0,252

5 1,113 0,214 2,744 0,242

6 2,127 0,240 2,286 0,296

7 0,087 1,628 0,070 1,631

8 0,089 1,552 0,130 1,677

9 0,087 1,635 0,106 1,683

10 0,086 1,619 0,132 1,606

11 0,089 1,614 0,150 0,946

12 1,440 0,274 2,996 0,272

13 1,923 0,264 3,115 0,266

14 0,645 0,261 1,575 0,285

15 0,412 0,262 0,948 0,282

16 0,269 0,338 0,912 0,268

17 0,183 1,181 0,122 1,280

18 0,144 1,466 0,160 1,411

19 0,113 1,447 0,124 1,633

20 0,177 1,558 0,112 1,645

КК 0,090 1,645 0,081 1,463

ОПкрит 0, 250 0,260

КИР 1,865 1,771

Диапазон перехода 0,350-0,400 0,350-0,400

цвета индикатора*

*- при ОП менее 0,350 - светло желтый, при ОП выше 0,400 малиновый.

КК - контроль конъюгата.

КИР - контроль стабильности индикаторного раствора.

Регистрация ОП при Х=450 нм.

Жирным шрифтом в таблице выделены положительные результаты.

Сравнение указанных методов при выявлении к возбудителю сифилиса на тест-системах «РекомбиБест антипапидум стрип» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск) и «СИФ-^в-ДС» (ЗАО «Медико-биологический союз», Бердск) также показало полное совпадение результатов ИФА и ИКА. При этом в ИКА все негативные

сыворотки имели темно-фиолетовый, а все позитивные и слабоположительные образцы - светло-желтый цвет, что обеспечивало надежный визуальный учет результатов.

На рисунке 5 показан вид планшета после выявления антител к Helicobacter pylori в одной панели сывороток с использованием иммунопероксидазного конъюгата (ПХ-a/IgG-Hum) и иммунозоля ферроцианида кобальта (ФКк-a/IgG-Hum).

Рис. i. Вид планшета после параллельного выявления в образцах панели сывороток антител к Я. pylori с использованием пероксидазного конъюгата (ПХ-a/IgG) и иммунозоля ферроцианида кобальта (ФКк-a/IgG). Положительные сыворотки в первом блоке выделены пунктиром.

И пероксидазный конъюгат, и иммунозоль одинаково определяли наличие специфических антител в сыворотках, однако результаты, полученные с применением иммунозоля, были существенно нагляднее и позволяли без труда визуально регистрировать сигналы низкотитражных сывороток.

Оценка устойчивости иммунозолей в условиях длительного хранения в стабилизирующем растворе при 2-8°С показала, что иммунозоли на основе ферроцианида кобальта при хранении до 1 года (срок наблюдения) не изменяют заметно своих исходных характеристик. Проявление золей сульфида кобальта после 7 месяцев хранения немного замедляется.

Таким образом, кобальтсодержащие иммунозоли в сочетании с индикаторными растворами на основе ализарина S при сходной с пероксидазными конъюгатами чувствительности и специфичности анализа обеспечивают отчетливое различие оптических сигналов положительных и отрицательных образцов. Это позволяет создавать диагностические тест-наборы с надежным визуальным учетом результатов по принципу «да/нет» для обеспечения иммунодиагностики в

'5 3' » 5.

г-1

I I

•ПХ-a/IgG ДфКк-a/IgG

лабораториях, не имеющих регистрирующего оборудования. Из других достоинств разработанного теста можно отметить безвредность, стабильность и низкую стоимость используемых компонентов, а также устойчивость картины проявления (при комнатной температуре она сохраняется в течение нескольких часов).

Описанная в настоящей работе система визуализации результатов иммунохимического анализа может быть использована при производстве диагностических наборов любой специфичности и может найти применение не только в диагностике инфекционных заболеваний; но и в других отраслях медицины, а также в ветеринарии, экологических исследованиях и научных экспериментах.

выводы

1. Установлена возможность использования золей на основе двухвалентного кобальта в качестве маркеров иммуноанализа на микротитровальных планшетах. Показано, что золи, полученные при избытке катионов кобальта, обеспечивают более высокую чувствительность проявления по сравнению со своими аналогами, полученными при избытке анионов. При одинаковой чувствительности золь ферроцианида кобальта имеет преимущество по скорости, а золь сульфида кобальта - по наглядности проявления.

2. Предложено использование для иммуноанализа с визуальным учетом результатов индикаторных растворов на основе ализарина 8, обладающих большой разницей в скоростях каталитической и некаталитической реакций, а также наличием определенной концентрации золя, способной инициировать проявление. При этом боратно-щелочные индикаторные растворы обеспечивают более высокую чувствительность выявления золей, а фосфатно-щелочные - большую скорость проявления и наглядность результатов анализа.

3. Выявлено, что для выполнения иммунокаталитического анализа с использованием золей кобальта наиболее пригодны растворы для отмывок и разведения золей на основе трис, а добавки твин-20 в рабочие растворы позволяют при выполнении иммуноанализа эффективно снижать неспецифические взаимодействия как органических, так и неорганических компонентов.

4. Установлено, что иммунозоли обладают стабильностью при хранении в стабилизирующем буферном растворе при температуре 2-8 °С, при этом иммунозоль ферроцианида кобальта не изменяет своих характеристик в течение 1 года (срок наблюдения), а иммунозоль сульфида кобальта спустя 7 месяцев немного замедляет скорость проявления.

5. Показано, что в одинаковых условиях кобальтсодержащие иммунозоли имеют сходную с пероксидазным конъюгатом чувствительность и специфичность анализа но, в отличие от последнего, обеспечивают наглядное различие положительных и отрицательных образцов, что позволяет создавать диагностические тест-системы с надежным визуальным учетом результатов по принципу «да/нет» для обеспечения иммунодиагностики в недостаточно оснащенных лабораториях городских и сельских больниц.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ТО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Полтавченко А. Г., Филатов П. В., Яковченко A.M., Рыбаков А. Н. Изучение динамики гуморального иммунного ответа на белки р17, р41 и р47 Treponema pallidum на ранних стадиях сифилиса // Иммунология. - 2005. - № 5. - С. 101107.

2. Полтавченко А.Г., Филатов П.В., Зайцев Б.Н. Применение золей на основе соединений Co(II) как маркеров при иммуноанализе в микротитровальных планшетах с визуальным учетом результатов. 1. Получение и проявление кобальтсодержащих иммунозолей // Биотехнология. - 2005. - № 3. -С. 79-89.

3. Полтавченко А.Г., Филатов П.В. Применение золей на основе соединений Со(Н) как маркеров при иммуноанализе в микротитровальных планшетах с визуальным учетом результатов. 2. Оптимизация условий проведения иммунокаталитичесого анализа // Биотехнология. - 2005. - Ms 4. - С. 70-77.

4. Полтавченко А.Г., Филатов П.В. Применение золей на основе соединений Со(Н) как маркеров при иммуноанализе в микротитровальных планшетах с визуальным учетом результатов. 3. Применение кобальтсодержащих золей в иммунокаталитическом анализе //Биотехнология. - 2005. - № 5. - С. 72-77.

Публикации в материалах конференций

5. Полтавченко А.Г., Кривенчук H.A., Рыбаков А.Н., Филатов П.В., Яковченко A.M. Панель сывороток с нормированным содержанием антител класса IgG к антигенам р17 и p41 Treponema pallidum. - В сб. тр. международн. мультидисциплинарного семинара «Микробициды для здоровья и репродукции человека, медико-социальные проблемы сексуально передаваемых инфекций» и международн. конф. «Актуальные вирусные инфекции - теоретические и практические аспекты» (Санкт-Петербург, 2-5 ноября 2004 года). - М.: МАКС Пресс, 2004. - С. 135-136.

6. Полтавченко А.Г., Филатов П.В. Применение золей на основе соединений Со(Н) как маркеров иммуноанализа с визуальным учетом результатов. - В сб. мат. международн. конф. «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Ульяновск, 21-23 июня 2006 г.). - Ульяновск: ГСХА, 2006. - С. 123-126.

Патенты

1. Полтавченко А.Г,, Кривенчук Н.А., Рыбаков А.Н., Филатов П.В., Яковченко А.М. «Панель сывороток с нормированным содержанием антител класса IgG к антигенам р17 и p41 Treponema pallidum и способ ее получения». - Патент РФ № 2275635, приоритет от 03.06.2004, опубл. 27.04.2006, Бюл. № 12.

2. Полтавченко А.Г., Филатов П.В. «Хромогенная система для визуализации результатов иммунохимического анализа в микротитровальных планшетах». -Заявка на получение Патента РФ (Per. №2010136265 от 27.08.2010).

Список использованных сокращений:

ББ - боратный буферный раствор

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ВГС - вирус гепатита С

ДФК - дифенилкарбазон

ИКА - иммунокаталитический анализ

ИКР - индикаторная каталиметрическая реакция

ИФА - иммуноферментный анализ

К+ - положительный контроль

К- - отрицательный контроль

КБР - концентрат блокирующего раствора

ОП - оптическая плотность

ОПкрит - критическое значение оптической плотности

ОСО - отраслевой стандартный образец

ОФД - ортофенилдиамин

ПЭГ - полиэтиленгликоль

ПВП - поливинилпирролидон

ПХ - пероксидаза хрена

РБР-К-Ф - разводящий буферный раствор для конъюгата на основе фосфатов РБР-С-Ф - разводящий буферный раствор для сывороток на основе фосфатов СКк -золь сульфида кобальта, полученный при избытке катионов

СКа - золь сульфида кобальта, полученный при избытке анионов

ТМБ - тетраметилбензидин

ТСБ-Т - трис-солевой буферный раствор с твин-20

ФБ - фосфатный буферный раствор

ФКк - золь ферроцианида кобальта, полученный при избытке катионов ФКа - золь ферроцианида кобальта, полученный при избытке анионов ФСБ-Т - фосфатно-солевой буферный раствор с твин-20 ФСП - фармакопейная статья предприятия ЧДА - чистый для анализа

a/IgG-Hum - антитела против иммуноглобулинов класса G человека IgG - иммуноглобулины класса G SpA - белок A Staphylococcus aureus

Филатов Павел Владимирович

Применение каталитических маркеров на основе двухвалентного кобальта в

планшетном иммуноанализе с визуальным учётом результатов.

Автореф. дисс. на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Усл. печ. л. 1. Тираж 100 экз. Отпечатано в центре оперативной полиграфии ИП. Нестеров. П.Н. 630084 г. Новосибирск, ул. Кропоткина, 555

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Филатов, Павел Владимирович

Список использованных сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ПРИМЕНЕНИЕ ИММУНОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА В Q ДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ (Обзор литературы)

1.1. Иммунохимические методы в современной диагностике.

1.2. Твердофазние методы иммуноанализа.

1.3. Форматы твердофазных методов иммуноанализа.

1.3.1 .Анализ на плоских подложках.

1.3.1.1. Дот-блот иммуноанализ.

1.3.1.2. Многопрофильный дот-анализ.

1.3.2. Анализы, выполняемые на пористых подложках.

1.3.2.1. Иммунохроматография.

1.3.2.2. Иммунофильтрация.

1.3.3. Иммуноанализ на микрочастицах.

1.3.4. Иммуноанализ в микротитровальных планшетах.

1.4. Иммобилизация белков на твёрдой фазе.

1.5. Метки (маркеры), используемые в твердофазных методах.

1.5.1. Радиоизотопные маркеры.

1.5.2. Ферментные маркеры.

1.5.3. Фотоэмиссионные маркеры.

1.5.4.Корпускулярные маркеры.

1.5.5. Маркеры на основе неорганических катализаторов.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

Глава 3. РАЗРАБОТКА ПЛАНШЕТНОГО ВАРИАНТА ИММУНОАНАЛИЗА

С ВИЗУАЛЬНЫМ УЧЕТОМ РЕЗУЛЬТАТОВ НА ОСНОВЕ ПРИМЕНЕНИЯ В

КАЧЕСТВЕ МАРКЕРОВ КОБАЛЬТСОДЕРЖАЩИХ ЗОЛЕЙ.

3.1. Получение и свойства кобальтсодержащих иммунозолей.

3.2. Проявление кобальтсодержащих иммунозолей.

3.3. Оптимизация условий проведения иммуноанализа.

3.4. Оценка эффективности применения кобальтсодержащих иммунозолей

3.5. Оценка стабильности золей при хранении.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Применение каталитических маркеров на основе двухвалентного кобальта в планшетном иммуноанализе с визуальным учётом результатов"

Актуальность работы

В настоящее время разработано большое количество различных иммунохимических тестов [100, 168]. Из всего многообразия современных иммунодиагностических методов в практическом здравоохранении наибольшей популярностью пользуется иммунопероксидазный тест [55, 107] в постановке на планшетах для иммунологических реакций [84]. Этот метод хорошо зарекомендовал себя в клинических и лабораторных исследованиях, однако для количественного спектрофотометрического учёта результатов требуется специальная дорогостоящая аппаратура и высокая квалификация персонала. В условиях слабого финансирования здравоохранения, приобрести специальный спектрофотометр могут позволить себе только крупные диагностические центры.

В то же время потребность в серологическом контроле на местах велика. Это и контроль крови на наличие инфекционных заболеваний^ при оперативных вмешательствах и экстренных трансфузиях, и контроль инфекций, возбудители которых вызывают тератогенный эффект, а также выявление и дифференциация паразитарных и хронических инфекционных заболеваний. Большая часть лечебных учреждений не имеет возможности самостоятельно осуществлять иммунодиагностику и вынуждена пересылать образцы или направлять больных на обследование в диагностические центры. При значительном отдалении таких центров, особенно в восточной части России, получение результатов анализа затягивается на недели, что негативно отражается как на качестве иммунодиагностики, так и на здоровье пациентов.

Цель исследования

Разработка планшетного метода иммуноанализа с надежным визуальным учетом результатов для повышения доступности и эффективности лабораторной диагностики инфекционных заболеваний.

Задачи исследования:

1. подбор условий получения иммунозолей на основе соединений двухвалентного кобальта и изучение их свойств;

2. отработка способов проявления кобальтсодержащих иммунозолей;

3. оптимизация условий применения кобальтсодержащих маркеров в планшетном варианте иммуноанализа;

4. оценка стабильности иммунозолей при хранении;

5. оценка эффективности применения кобальтсодержащих маркеров в иммуноанализе.

Научная новизна

В работе показано, что золи на основе соединений двухвалентного кобальта:

- могут быть использованы в качестве маркеров иммуноанализа на микротитровальных планшетах;

Практическая значимость работы:

- подготовлена заявка на получение Патента РФ «Хромогенная система для визуализации результатов иммунохимического анализа в микротитровальных планшетах» (Per. № 2010136265 от 27.08.2010).

Работа выполнена в течение 2004-2010 гг. в инициативном порядке. Забор и использование сывороток крови пациентов осуществлялись в рамках научно-исследовательского проекта "Изучение динамики гуморального иммунитета при сифилитической инфекции и отработка новых методов иммуноанализа", утвержденного Этическим комитетом ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» 19.09.2002 г.

Основные положения, выносимые на защиту

2. Разработана методология проведения иммунокаталитического анализа с применением кобальтсодержащих маркеров.

3. Получено экспериментальное подтверждение эффективности иммунокаталитического анализа в сравнении с иммуноферментным анализом по чувствительности и специфичности.

Конкретное участие автора в получении результатов

Вклад автора в представленные результаты заключается в личном участии во всех теоретических и экспериментальных исследованиях, обработке результатов и формулировании выводов. Все работы выполнены под руководством и в соавторстве с А.Г. Полтавченко. Часть исследований выполнена в соавторстве с Б.Н. Зайцевым, Н.А. Кривенчуком, А.Н. Рыбаковым и A.M. Яковченко. Всем, принимавшим участие в данной работе, автор выражает искреннюю признательность.

Апробация работы и публикации

Материалы диссертации представлены на следующих конференциях: междисциплинарном семинаре: «Микробициды для здоровья и репродукции человека, медико-социальные проблемы сексуально передаваемых инфекциё», и международной научной конференции «Актуальные вирусные инфекции - теоретические и практические аспекты» (Санкт-Петербург, 2004 г.); Международной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Ульяновск, 2006 г.).

Материалы диссертации опубликованы в 4 статьях, рекомендованных ВАК РФ для публикации диссертационных материалов.

По результатам исследований получен 1 Патент РФ и подана 1 заявка на получение Патента РФ.

Структура и объем диссертации

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Филатов, Павел Владимирович

выводы

2. Предложено использование для иммуноанализа с визуальным учетом результатов индикаторных растворов на основе ализарина S, обладающих большой разницей в скоростях каталитической и некаталитической реакций, а также наличием определенной концентрации золя, способной инициировать проявление. При этом боратно-щелочные индикаторные растворы обеспечивают более высокую чувствительность выявления золей, а фосфатно-щелочные -большую скорость проявления и наглядность результатов анализа.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Филатов, Павел Владимирович, Кольцово

1. Барнард Д., Уильямз Д., Лейтон А., Шах Г. Флуоресцентный иммуноанализ с временным разрешением // Новые методы иммуноанализа / Под ред. У.П. Коллинз. - М.: Мир, 1991. - С. 150-167.

2. Быстрые и простые методы определения вирусных инфекций в лабораторной службе России. Методические рекомендации. М., 2004. -http://www.biograd.ru/publications/methodicalrecommendations/hiv/contents.

3. Венгеров Ю.Ю., Булгарина Т.В., Кущ А.А. и др. Современные методы иммуноанализа (иммуноферментного) для диагностики вирусных инфекций // Биотехнология. 1987. - № 3. - С. 291-295.

4. Вершинин В.И., Резник Б.Е. О каталитическом эффекте ионов кобальта(П) в реакции окисления о-дифенолов перекисью водорода // Ж. анал. хим. -1975. Т. XXX. - № 4. - С. 759-764.

5. Вершинин В.И., Чуйко В.Т., Резник Б.Е. Изучение комплексообразования кобальта(П), ализарина С и перекиси водорода//Ж. анал. хим. 1973. -Т. XXVIII. - № 4. - С. 709-714.

6. Воробьев А.А. Проблемы биологической безопасности на современном этапе // Вестн. РАМН. 2002. - № 10. - С. 9-12.

7. Гайер Г. Электронная гистохимия. М.: Мир, 1974. - 488с.

8. Джеймс Т.Х. Теория фотографического процесса. Л.: Химия, 1980.672 с.

9. Долманова И.Ф., Ушакова Н.М., Пешкова В.М. Кинетическое определение кобальта в присутствии никеля по реакции дифенилкарбазон-тайрон-перекись водорода // Ж. анал. хим. -1973. Т. XXVIII. - № 6. -С. 1131-1134.

10. Евстигнеев В.И. Проблемы обеспечения биологической безопасности России // В сб. материалов 11 сессии общего собрания РАМН «Медицинские проблемы биобезопасности» (3-6 апреля 2002 г., Москва) -http://www.bio.su/evr.htm

11. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа.- М.: Высш.шк., 1991. — 275 с.

12. Зимон А. Д., Лещенко Н.Ф. Коллоидная химия. М.: Химия. - 1995. -336 с.

13. Киселев А.В. Межмолекулярные взаимодействия в адсорбции и хроматографии. М.: Высшая школа, 1986. — 360 с.

14. Кохен Ф., Амир-Залъцман Ю., Страсбургер С. и др. Авидин-биотиновая реакция в иммуноанализе // Новые методы иммуноанализа / Под ред. У.П. Коллинз.-М.: Мир, 1991.-С. 65-77.

15. Краткая химическая энциклопедия: в 5 томах. М.: Сов. Энц., 1964. - Т.З. С. 230.

16. Крейнгольд С. У. Каталиметрия в анализе реактивов и веществ особой чистоты. М.: Химия, 1983. - 190 с.

17. Кривеня В.Я., Елигулашвили Р.К. Получение и исследование иммуноферментных комплексов // Вирусные гепатиты типов А и В. -Рига, 1983.- С. 110-115.

18. Кричка Л., Стотт Р., Торп Г. Иммуноферментный анализ с усиленной хемилюминесценцией // Новые методы иммуноанализа / Под ред. У.П. Коллинз.-М.: Мир, 1991.-С. 167-177.

19. Лабораторные работы и задачи по коллоидной химии/ Под ред. Ю.Г. Фролова. М.: Химия. - 1986. - С. 93-95.

20. Львов Д.К. Значение вновь возвращающихся инфекций для биобезопасности // Вестн. РАМН. 2002. - №10. - С. 25-28

21. Малеев В.В., Платонов А.Е. Новые и вновь возникающие инфекции в России. http://abstractsgamma.com/338.

22. Мюллер X., Отто М., Вернер Г. Каталитические методы в анализе следов элементов. М.: Мир. - 1983. - 195 с.

23. Новые методы иммуноанализа / Под ред. W.P. Collins. М.: Мир, 1991. -280 с.

24. Общая вирусология: В 2 томах / Под ред. С.Я. Гайдомович. М.: Медицина, 1982. - Т.1. - С. 437.

25. Одиторе-Харгивз К, Харгивз В. Анализ в кабинете врача и на дому // Новые методы иммуноанализа / Под ред. У.П. Коллинз. М.: Мир, 1991. -С. 78-90.

26. Папас М.Г. Точечный твердофазный иммуноферментный анализ / Новые методы иммуноанализа / Под ред. У.П. Коллинз. М.: Мир, 1991. -С. 117-137.

27. Парфит Г., Рочестер К. Адсорбция из растворов на поверхностях твердых тел. М.: Мир, 1986.- 488 с.

28. Перелъман Ф.М., Заворыкин А.И. Кобальт и никель. М.: Наука, 1975. -215 с.

29. Полтавченко А.Г., Сенъкин Ю.И., Караваев B.C. Использование каталитических свойств железосодержащих золей в иммуноанализе // Вопр. вирусол. 1997. - № 2. - С. 82-85.

30. Полтавченко А.Г., Лавриненко И.А., Костровский В.Г. и др. Применение серебряных иммунозолей для выявления ВИЧ-антител в микротитровальных планшетах // Вопр. вирусол. — 1997. № 3. -С. 120-123.

31. Полтавченко А.Г., Караваев B.C., Тузиков Ф.В. Использование золей серебра как маркеров иммуноанализа на микротитровальных планшетах // ЖМЭИ.- 1998. -№2. С. 108-111.

32. Полтавченко А.Г., Агафонов А.П., Ничеухина С.П. и др. Использование иммуносуспензий на основе углеродных маркеров для определения антител к вирусу паротита методом поверхностного дот-иммуноанализа // Биотехнология. 1999. - № 3. - С. 110-113.

33. Полтавченко А.Г., Яковченко A.M., Кривенчук Н.А. Многопрофильная иммунохимическая индикация возбудителей инфекционных заболеваний // Клиническая лабораторная диагностика. 2006. - № 5. -С. 39-42.

34. Полтавченко А.Г., Яковченко A.M., Кривенчук Н.А., Карпышев Н.Н. Многопрофильная серодиагностика инфекционных заболеваний. 3. Визуализация результатов анализа // Биотехнология. — 2007. № 2. -С. 63-71

35. Полтавченко А.Г., Яковченко A.M. Многопрофильная серодиагностика инфекционных заболеваний. 4. Лабораторные испытания многопрофильного теста // Биотехнология. 2007. - № 3. - С. 88-94.

36. Полтавченко А. Г. Бесприборная иммунодиагностика инфекционных заболеваний на основе высокодисперсных корпускулярных маркеров: Автореф. дис. .докт. биол. наук. Кольцово, 2008. - 49 с.

37. Расмунссен С.Е. Носители и реактивы / Новые методы иммуноанализа / Под ред. У.П. Коллинз. -М.: Мир, 1991. С. 52-64.

38. Сандахчиев Л.С., Мартынюк Р.А., Нетесов С.В. Исследовательские приоритеты и будущие программы исследований // Материалы 11 сессии общего собрания РАМН «Медицинские проблемы биобезопасности» (3-6 апреля 2002 г., Москва) http://www.bio.su/sar.htm.

39. Серегин С.В., Белавин П.А., Бабкина И.Н. и др. Получение рекомбинантных антигенов Treponema pallidum и их применение в иммуноферментной диагностике сифилиса // Вестник дерматол. и венерол. 2000. - № 2. - С. 5-8.

40. Скоупс Р.К. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985. - 358 с.

41. Смирнов Г.Б. Механизмы приобретения и потери генетической информации бактериальными геномами // Успехи современной биологии.- 2008.- Т. 128,- № 1.- С. 52-76

42. Тананаев И.В., Сейфер Г.Б., Харитонов Ю.А. и др. Химия ферроцианидов. М.: Наука, 1971. - 320 с.

43. Тернтон М. Современное состояние и перспективы развития иммуноанализа // Новые методы иммуноанализа / Под ред. У.П. Коллинз. -М.: Мир, 1991.-С. 14-24.

44. Файглъ Ф., Ангер В. Капельный анализ неорганических веществ. -М.: Мир, 1976.-Т. 2.-436 с.

45. Чепурнов А.А., Федосова Н.И., Егоричева И.Н. и др. Разработка метода экспресс-выявления антител и антигена вируса Эбола // Вопр. вирусол. -2007. -№ З.-С. 41-43.

46. Шевченко Ю.Л. Экология человека: Вызовы цивилизации, долг общества, ответственность здравоохранения // Вестн. РАМН. 2002. - № 10. - С. 3-6.

47. Щукин Е.Д., Перцов А.В., Амелина Е.А. Коллоидная химия.- М.: Высш. шк., 1992.-414 с.

48. Abuknesha R.A., Luk C.Y., Griffith Н.М. et al. Efficient labelling of antibodies with horseradish peroxidase using cyanuric chloride // J. Immunol. Meth. -2005.-Vol. 306.-P. 211-217.

49. AH E., Sengupta J., Dhar Т.К. Sandwich immunoassay of small molecules: I. Investigation with testosterone as a model hapten // J. Immunol. Methods. -1992.-Vol. 147.-P. 173-181.

50. Akhavan-Tafti H., de Silva R., Eickholt R. et al. Characterization of new fluorescent peroxidase substrates 11 Talanta. 2003. - Vol. 60. - P. 345-350.

51. Akman S., McLain C., Landon J. The development of an enzymeimmunometric assay for LH and the effects of the methods on the immunoreactivity of the conjugates // J. Immunoass. 1998. - Vol. 19. -P. 113-119.

52. Anderson R.R., Lee T.T., Saewert D.C. et al. Internally referenced ImmunoConcentration™ immunoassays // Clin. Chem. 1986. - Vol. 32. -P. 1692-1695.

53. Araujo F.G. A method for demonstration of antibodies to Tripanosoma cruzi by using antigen-coated nitrocellulose paper strips // Am. J. Trop. Med. Hyg. -1985.-Vol. 34.-P. 242-245.

54. Aurameas S., Ternynck T. Peroxidase-labelled antibody and fab conjugates with enhanced intracellular penetration // Immunochem. 1971. - Vol. 8. -№ 3. - P. 1175-1182.

55. Bates D.L. Enzyme amplification in diagnostics // Trends Biotechnol. 1987. -Vol. 5. - P. 204-209.

56. Bendayan M. Protein-A gold electron microscopic immunocytochemistry, methods, applications and limitations // J. Electron. Microsc. Tech. 1984. -№ l.-P. 243-248.

57. Bhattacharya D., Bhattacharya R., Dhar Т.К. A novel signal amplification technology for ELISA based on catalyzed reporter deposition. Demonstration of its applicability for measuring aflatoxin B1 //J. Immunol.Meth. 1999. -Vol. 230.-P. 71-86.

58. Bidwell D.E., Buck A.A., Diesfeld H.J. The enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) // Bull. W.H.O. 1976. - № 54. - 129 p.

59. Bobrow M.N., Harris T.D., Shaughnessy K.J., Litt G.J. Catalyzed reporter deposition. A novel method of signal amplification: I. Application to immunoassay // J. Immunol. Meth. 1989. - Vol. 125. - P. 279-286.

60. Bobrow M.N., Shaughnessy K.J., Litt G.J. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification: II. Application to membrane immunoassays // J. Immunol. Meth. 1991. - Vol. 137. - P. 103-111.

61. Bogen S.A., Sompuram S.R. Recent trends and advances in immunodiagnostics of solid tumors//BioDrugs.-2004.-Vol. 18.-№6.-P. 98-114.

62. Bonenberger J., Doumanas M. Overcoming sensitivity limitations of lateral-flow immunoassays with a novel labeling technique // IVDT. 2006. - № 4. -P. 41-46.

63. Boorsma D.M., Kalsbeek G.L. Comparative study of horseradish-peroxidase conjugates prepared with a one-step and a 2-step method // J. Histochem. Cytochem. 1975. - Vol. 23. - P. 200-208.

64. Bora U., Chugh L., Nahar P. Covalent immobilization of proteins onto photoactivated polystyrene microtiter plates for enzyme-linked immunosorbent assay procedures // J. Immunol. Meth. 2002. - Vol. 268. - P. 171-177.

65. Bos E.S., van der Doelen A.A., van Rooy N., Schuurs A.H. 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine as an Ames test negative chromogen for horse-radish peroxidase in enzymeimmunoassay // J. Immunoassay. 1981. - № 2. -P. 187-191.

66. Brenan M., Bath M.L. Indoxyl-tetranitro blue tetrazolium method for detection of alkaline hosphatase in immunohistochemistry // J. Histochem. Cytochem. -1989.-Vol. 37.-P. 1299-1306.

67. Butler J.E., Ni L., Nessler R. et al. The physical and functional behavior of capture antibodies adsorbed on polystyrene // J. Immunol. Meth. 1992. -Vol. 150.-P. 77-89.

68. Butler J.E. Solid supports in enzyme-linked immunosorbent assay and other solid-phase immunoassays // Methods. 2000. - Vol. 22. - № 1. - P. 4-23.

69. Cahill D. J. Protein and antibody arrays and their medical applications // J. Immunol. Meth. 2001. - Vol. 250. - P. 81-91.

70. Cantarero L.A., Butler J.E., Osborn J.W. The adsorptive characteristics of protein for polystyrene and their significance in solid phase immunoassays // Anal. Biochem. 1980. - Vol. 105. - P. 375-382.

71. Carney J., Braven H., Seal J., Whitworth E. Present and future applications of gold in rapid assays // IVDT. 2006. - №3. - P. 41-50.

72. Carville D. Microparticle technology in clinical diagnostics // IVDT. 2007. -№ 3. - P. 38-35.

73. Catt K.J., Tregear G.W., Burger H.G., Skermer C. Antibody-coated tube method for radioimmunoassay of human growth hormone // Clin. Chim. Acta. -1969.-Vol. 27.-P. 267-272.

74. Chan C.P.Y., Sum K.W., Cheung K.Y. et al. Development of a quantitative lateral-flow assay for rapid detection of fatty acid-binding protein // J. Immunol. Meth. 2003. - Vol. 279. - P. 91-99.

75. Communicable diseases 2000. Geneva: WHO/CDS. - 2000.

76. Cretich M., Damin F., Pirri G., Chiari M. Protein and peptide arrays: Recent trends and new directions // Biomolecular Engineering. 2006. - Vol. 23. — P. 77-88.

77. Douglas A.S., Monteith C.A. Improvements to immunoassay by use of covalent binding assay plates // Clin. Chem. 1994. - Vol. 40. - P. 833-838.

78. Ekins R. P. Ligand assays: from electrophoresis to miniaturized microarrays // Clin. Chem. 1998. - Vol. 44. - P. 2015-2030.

79. Ekins R.P, Chu F.W. Multianalitical microspot immunoassay-microanalytical "compact disk" of the future // Clin Chem. 1991. - Vol. 37. - P. 1955-1967.

80. Engvall E., Perlmann P. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitation of immunoglobin G // Immunochem. 1971. - Vol. 8. -P. 871-875.

81. Espina V., Woodhouse E.C., Wulfkuhle J. et al. Protein microarray detection strategies: focus on direct detection technologies // J. Immunol. Meth. 2004. -Vol. 290.-P. 121- 133.

82. Esser P. Principles in adsorption to polystyrene // Nunc Laboratories. -1997. Bulletin №6. - http://www.nuncbrand.com.

83. Falsey J.R., Renil M., Park S., Li S., Lam K.S. Peptide and small molecule microarray for high throughput cell adhesion and functional assays // Bioconjug. Chem. 2001. - Vol. 12. - № 3. - P. 346-353.

84. Faulk W., Taylor G. An immunocolloid method for the electron microscope // Immunochem. 1971. - № 8.-P. 1081-1087.

85. Frens G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions // Nat. Phys. Sci. 1973. - Vol. 241. -P. 20-31.

86. Frey A., Meckelein В., Externest D., Schmidt M.A. A stable and highly sensitive 3,3' ,5,5'-tetramethylbenzidine-based substrate reagent for enzyme-linked immunosorbent assays // J. Immunol. Meth. 2000. - Vol. 233. - P. 47-56.

87. Fukushima K., Ikehara Y., Kanai M. et al. A p-N-acetylglucosaminyl phosphate diester residue is attached to the glycosylphosphatidylinositol anchor of human placental alkaline phosphatase // J. Biol. Chem. 2003. - Vol. 278. -P. 36296-36302.

88. Ge H. UP A, a universal protein array system for quantitative detection of protein-protein, protein-DNA, protein-RNA and protein-ligand interactions // Nucleic Acids Res. 2000. - Vol. 28. - № 2. - P. 3-9.

89. Gibbs J., Root D.M. Evaluation of protein binding to 96 well plates by enhanced colloidal gold labeling // Costar Research Newsletter. 1988. -Vol.1.-Issue 2.-P. 42-57.

90. Gosling J.P. A decade of development in immunoassay methodology // Clin. Chem. 1990. - Vol. 36. - P. 1408 -1412.

91. Guesdon J.L., Ternynck Т., Avrameas S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques // J. Histochem. Cytochem. 1979. - Vol. 27. -P. 1131-1143.

92. Hashida S., Tanaka K., Kohno Т., Ishikawa E. Novel and ultrasensitive sandwich transfer enzyme immunoassay for antigens // Anal. Lett. 1988. -Vol. 21.-P. 114-121.

93. Hemmila I. Europium as a label in Time-Resolved Immunofluorometric Assays// Anal. Biochem. 1984. - Vol. 137. - P. 335-343.

94. Hermann J.E., Collins M.F. Quantitation of immunoglobulin adsorption to plastic // J. Immunol. Methods. 1976. - Vol. 10. - P. 363-367.

95. Herzog V., Fahimi H. A new sensitive colorimetric assay for peroxidase using 3,3'-diaminobenzidine as hydrogen donor // Anal. Biochem. 1973. -Vol. 55.-P. 554-561.

96. Herzog D.P. Emerging trends in lab automation and instrumentation // IVDT. -2006. № 5. - P. 44-47.

97. Heymann D.L. Strengthening global preparadness for Defense against infections disease threats. Geneva: WHO. - 2001.

98. Holgate C.S., Jackson P.I., Cowen P.N., Bird C.C. Immunogold silver staining: new method of immunostaining with enhanced sensitivity // J. Histochem. Cytochem. - 1983. - Vol. 31. - P. 938-944.

99. Izquierdo M.P. Amino, chloromethyl and acetal-functionalized latex particles for immunoassays: A comparative study // J. Immunol. Meth. 2004. -Vol. 287.-P. 159-167.

100. James Т.Н. The reduction of silver ions by hydroquinone // J. Am. Chem. Soc. -1939.-Vol. 61.-P. 648-652.

101. James Т.Н. Reduction of silver ions by hydroquinone and p-phenylenediamine in alkaline solution // J. Phys. Chem. 1941. - Vol. 45. -P. 223-233.

102. Jauho E. S., Boas U., Wiuff C. et al. New technology for regiospecific covalent coupling of polysaccharide antigens in ELISA for serological detection // J. Immunol. Meth. 2000. - Vol. 242. - P. 133-143.

103. Jeanson A., Cloes J.M., Bouchet M., Rentier B. Comparison of conjugation procedures for the preparation of monoclonal antibody-enzyme conjugates // J. Immunol. Meth. 1988. - Vol. 111. - P. 261-268.

104. Johannsson A., Stanley C.J., Self C.H. A fast highly sensitive colorimetric enzyme immunoassay system demonstrating benefits of enzyme amplification in clinical chemistry // Clin. Chim. Acta. 1985. - Vol. 148. - P. 119.

105. Kamaruzaman M, Asim E. A blocking agent and a blocking step are not needed in ELISA, immunostaining dot-blots and Western blots // J. Immunol. Meth.-1989.-Vol.117.-№ l.-P. 141-145.

106. Kawasaki E., Eisenbarth G.S. High-throughput radioassays for autoantibodies to recombinant autoantigens // Frontiers in Bioscience. — 2000. Vol. 5. — P. 181-190.

107. Kendall C., Ionesco-Matiu I., Dressman G.R. Utilization of the biotin/avidin system to amplify the sensitivity of the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) // J. Immunol. Methods. 1983. - Vol. 56. - P. 329-337.

108. Kricka L.J., Carter T.J., Burt S.M. et al. Variability in the adsorption properties of microtiter plates used as solid supports in enzyme immunoassay // Clin. Chem. 1980. - Vol. 26. - P. 741-746.

109. Kricka L.J., Cooper M., . Ji X. Synthesis and characterization of 4-iodophenylboronic acid: a new enhancer for the horseradish peroxidase-catalyzed chemiluminescence of luminol // Anal. Biochem. 1996. -Vol. 240.-P. 119.

110. Kusnezow W. Jacob A., Walijew A. et al. Antibody immunoarrays: an evaluation of production parameters // Proteomics. 2003. - Vol. 3. -P. 254-264.

111. Kusnezow W., Hoheisel J.D. Solid supports for microarray immunoassays // J. Mol. Recognit. 2003. - Vol. 16. - № 4. - P. 165-176.

112. Lasne F. Double-blotting: a solution to the problem of non-specific binding of secondary antibodies in immunoblotting procedures // J. Immunol. Meth. -2001.-Vol. 253.-P. 125-131.

113. Leung W., Chan P., Bosgoed F. et al. One-step quantitative Cortisol dipstick with proportional reading // J. Immunol. Meth. 2003. - Vol. 281. -P. 109-116.

114. Lewinson G., Twist P. The reduction of silver ions on nuclei by hydroquinone// J. Photogr. Sci. Eng. 1973. - Vol. 21. - P. 211-219.

115. Lidgard G. Simplifying detection technologies // IVDT. 2006. - № 5. -P. 30-35.

116. Lin T.M., Halbert S.P. Rapid dot enzyme immunoassay for the detection of antibodies to cytomegalovirus // J. Clin. Microbiol. 1986. — Vol. 24. -P. 7-11.

117. Lingwood D., Ballantyne J.S. Alkaline phosphatase-immunoglobulin conjugate binds to lipids in vitro, independent of antibody selectivity // J. Immunol. Meth. -2006. Vol. 311. - P. 174-177.

118. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with Folin's phenol reagent// J. Biol. Chem. 1951. - Vol. 193. - P. 265-275.

119. Moeremans M., Daneels G., Dijck D.V. et al. Sensitive visualization of antigen- antibody reactions in dot and blot immune overlay assays with immunogold and immunogold/silver staining // J. Immunol. Meth. 1984. -Vol. 74. - P. 353-360.

120. Montoya A., Castell J.V. Long-term storage of peroxidase-labelled immunoglobulins for use in enzyme immunoassay // J. Immunol. Meth. -1987.-Vol. 99.-P. 13-20.

121. Morals S., Maquieira A., Puchades R. Selection and characterisation of membranes by means of an immunofiltration assay. Application to the rapid and sensitive determination of the insecticide carbaryl // J. Immunol. Meth. -1999.-Vol.224.-P. 101-109.

122. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugation // J. Histochem. Cytochem. 1974. - Vol. 22. - № 12, -P. 1084-1091.

123. Nielsen U., Geierstanger B. Multiplexed sandwich assays in microarray format 11 J. Immunol. Meth. 2004. - Vol. 290. - P. 107- 120.

124. Norde W. The adsorption of proteins at solid surfaces // Adhesion and Adsorption of Polymers. 1979. - Vol. 12. - P. 801-825.

125. O'Farrell В., Bauer J. Developing highly sensitive, more-reproducible lateral-flow assays. Part 1: new approaches to old problems // IVDT. 2006. -№5. - P. 63-71.

126. O'Farrell В., Bauer J. Developing highly sensitive, more-reproducible lateral-flow assays. Part 2: new challenges with new approaches // IVDT. -2006. №6. - P. 67-75.

127. Oliver C. Use of immunogold with silver enhancement // Meth. Mol. Biol. -1994.-Vol. 34.-P. 211-217.

128. O'Keeffe M., Crabbe P., Salden M. C. et al. Preliminary evaluation of a lateral flow immunoassay device for screening urine samples for the presence of sulphamethazine // J. Immunol. Meth. 2003. - Vol. 278. - P. 117-124.

129. Okrongly D. The AD VIA Centaur® imunoassay system—designed for infectious disease testing // J. Clin. Virol. 2004. - Vol. 30. - P. 18-21.

130. Pappas M.G., Hajkowski R., Hockmeyer W.T. Dot enzyme-linked immunosorbent assay (Dot-ELISA): a micro method for the rapid diagnosis of visceral leishmaniasis // J. Immunol. Meth. 1983. - Vol. 64. -P. 205-214.

131. Pappas M.G. Rapid serodiagnosis of parasitic infections by Dot-ELISA using dipsticks // Trans. Roy. Trop. Med. Hyg. 1986. - Vol. 80. - P. 1006.

132. Park R. The evolution of assay development // IVDT. 2006. - № 3. -P. 36-38.

133. Patent Eur. N 0217403 (1987) Solid-phase analytical device and method for using same // Brown W., Deverauh S., Knigge K. and al. // Abbott lab., Chicago, US.

134. Patent Eur. № 0258963 (1987) Immunoassay method using colloidal gold // Graham H., Mochnal D., Chang C., Kang J. // Ortho Diagnostic Systems Inc., New Brunswick, U.S.

135. Patent Eur. № 0296398 (1988) Immunoassay method for detecting antibodies and antigens // Todd W., Barstad P. // Uehkull & Stolberg, Hamburg, BDR.

136. Patent Eur. № 0298368 (1988) Immunoassay with unmetal colloidal particles// Yost D., Russell J., Yang H. // Abbott lab., Chicago, US.

137. Patent Eur. № 0321008 (1988) Immunoassay with using unmetall labels // Van Doom A., Wichers J., Van Gelder W. // Holland Byotechnology B.V., NL.

138. Patent U.S. N 4775636 (1988) Blot overlay assay using colloidal metal particles // Moermans M., Daneels G., De Mey J.// Jenssen Pharmaceutica N.V., Beerse, Belgium.

139. Patent US 5252496 (1980) Carbon black immunochemical label // Princeton J.K, Wyckoff Y., Edison Y.H.

140. Patton W.F., Lam L., Su Q., Lui M. Metal chelates as reversible stains for detection of electroblotted proteins: application to protein microsequencing and immunoblotting // Anal. Biochem. 1994. - Vol. 220. - № 2. -P. 324-335.

141. Paweletz C.P., Charboneau L., Bichsel V.E. et al. Reverse phase protein microarrays which capture disease progression show activation of pro-survival pathways at the cancer invasion front // Oncogene. 2001. -Vol. 20.- P. 1981-1989.

142. Peluso P., Wilson D.S., Do D., Tran H. et al Optimizing antibody immobilization strategies for the construction of protein microarrays // Anal. Biochem. -2003.-Vol. 312.-P. 113-120.

143. Porstmann В., Porstmann Т., Nugel E. Comparison of chromogens for the determination of horseradish peroxidase as a marker in enzyme immunoassay // J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1981. - Vol. 19. - P. 435442.

144. Presentini R., Terrana B. Influence of the antibody-peroxidase coupling methods on the conjugates stability and on the methodologies for thepreservation of the activity in time // J. Immunoass. 1995. — Vol. 16. — P. 309-316.

145. Robertson W.R., Lambert A., Loveridge N. The role of modern bioassays in clinical endocrinology // Clinical Endocrinology. 1987. - Vol. 27. - № 2. -P. 259-278.

146. Robinson N. Immunogold conjugation for IVD applications // IVDT. -2002. -№3. -P. 33-36.

147. Rubenstein A.S., Hostler R.D., White C.C. et al. Particle entrapment:1. ТА f

148. S• о -oo oo с Application to ICON 1 immunoassay // Clin.iChem. 1986. - Vol. 32. - P.1073-1075.

149. Ru-Qiang L., Cui-Yan Т., Kang-Cheng R. Colorimetric detection of protein microarrays based on nanogold probe coupled with silwer enhancement // J. Immunol. Meth. 2004. - Vol. 285. - P. 157-163.

150. Schmitt J. Recombinant autoantigens for diagnosis and therapy of autoimmune diseases // Biomedicine and Pharmacotherapy. 2003. -Vol. 57.-№7.-P. 261-268.

151. Self C.H., Cook D.B. Advances in immunoassay technology // Current Opinion Biotechnol. 1996. - Vol. 7. - P. 60-65.

152. Sengupta J., Dhar Т.К., Ali E. Sandwich immunoassay of small molecules: II. Effects of heterology and development of a highly specific and sensitiveenzyme immunoassay of testosterone // J. Immunol. Meth. 1992. -Vol. 147.-P. 181-188.

153. Sezholtz D. Paramagnetic particles for optimized biological separations // IVDT. 2005. - № 2. - P. 39^3.

154. Shalev A., Greenberg A.H., McAlpine P.J. Detection of attograms of antigen by a high-sensitivity enzyme-linked immunosorbent assay Hs-ELISA using a fluorogenic substrate//J. Immunol. Meth. 1980. - Vol. 38. - P. 125-134.

155. Shavali S., Samejima M, Uchida K. et al. Improved enzyme immunoassay method for melatonin: application to the determination of serum melatonin in rats, sheep, and humans // Clin. Chem. 1999. - Vol. 45. - P. 690-695.

156. Shuman D.C., James Т.Н. Kinetics of physical development // J. Photogr. Sci. Eng.-1971.-Vol. 15.-P. 42-47.

157. Snowden K., Hommel M. Antigen detection immunoassay using dipsticks and colloidal dyes // J. Immunol. Meth. 1991. - Vol. 140. - P. 57-64.

158. Snyder J.W., Wolcott M.J. The role of diagnostics in bioterrorism // IVDT. -2007. № 4. - P. 26-32.

159. Soini E., Kojola H. Time-resolved fluorimetr for lanthanide chelates a new generation non-isotopic immunoassays // Clin. Chem. - 1983. - Vol. 29. -№ l.-P. 65-68.

160. Spielberg F., Kabeya C.M., Ryder R.W. et al. Field testing and comparative evaluation of rapid, visually read screening assays for antibody to human immunodeficiency virus // Lancet. 1989. - Vol. 8638. - P. 580- 584.

161. Stewart B.J., Houghton R.L., Morrow W.J.W., Raychaudhuri S. Design considerations for immunodiagnostics // IVDT. 2006. - № 4. - P. 40-51.

162. Sulimenko Т., Draber P. A fast and simple dot-immunobinding assay for quantification of mouse immunoglobulins in hybridoma culture supernatants // J. Immunol. Meth. 2004. - Vol. 289. - P. 89-95.

163. Takatsy, G. Acta Microbiol. Hung. 1955. - № 3. - P. 191-193.

164. Tijssen P., Kurstak E. Highly efficient and simple methods for preparation of peroxidase-antibody conjugates for enzyme immunoassays // Anal. Biochem. 1984. - Vol. 136. - № 2.-451-457.

165. Tijssen P., Adam A. Enzyme-linked immunosorbent assay and developments in techniques using latex beads. Review // Curr. Opin. Immunol. 1991. -Vol. 3. -№2. - P. 233-237.

166. Tonkinson J.L. Smaller is better // IVDT. 2003. - № 9. - P. 29-34.

167. Towbin H., Gordon J. Immunoblotting and dot immunoblotting current status and outlook//J. Immunol. Meth. - 1984.-Vol. 72.-P.313-340.

168. Tu S.I. Factors affecting the bacterial capture efficiency of immuno-beads. A comparison between beads with different size and density // J. Rapid Meth. Automation in Microbiol. 2003. - Vol. 11. - P. 35-36.

169. Turner D.R., Wolowoiuk C. Electroless copper plating as an image amplifier for electrolytic printing // J. Electrochem. Soc. 1971. - Vol. 118. - № 7. -P.1235-1239.

170. Urbanek R., Kemeny D.M., Samuel D. Use of the enzyme linked immunosorbent assay for measurement of specific antibodies // J. Immunol. Meth. 1985.-Vol. 79. - P. 123-131.

171. Valkirs G.E., Barton R. ImmunoConcentration™ a new format for solid phase immunoassay // Clin. Chem. - 1985. - Vol. 31.-P. 1427-1431.

172. Van Beek L.K.H. Special properties of physical development process // J. Photogr. Sci. Eng. 1976. - Vol. 20. - № 2. - P. 88-91.

173. Van Noorden C.J., Jonges G.N. Quantification of the histochemical reaction for alkaline phosphatase activity using the indoxyl-tetranitro ВТ method // Histochem. 1987. - Vol. 19. - P. 94-99.

174. Voogd C.E., van der Stel J.J., Jacobs J.A. On the mutagenic action of some enzyme immunoassay substrates // J. Immunol. Meth. 1980. - Vol. 36. -P. 55-58.

175. Walton B.C., Pappas M.G., Sierra M.Jr. et al. Field use of the Dot-ELISA test for human visceral leishmaniasis in Honduras // Bull. P.A.H.O. 1986. -Vol. 20.-P. 147-155.

176. Wang X., Zhan W., Xing J. Development of dot-immunogold filtration assay to detect white spot syndrome virus of shrimp // J. Virol. Meth. 2006. -Vol. 132.-№ 1-2.-P. 212-215.

177. Waris M.E., Meltola N.J., Soini J.T. et al. Two-photon excitation fluorometric measurement of homogeneous microparticle immunoassay for C-reactive protein // Anal. Biochem. 2002. -Vol. 309. - № 1. - P. 67-74.

178. Weinryb I. The oxidation of horseradish peroxidase by periodate // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1968. -Vol. 31.-P. 110-115.

179. Wilson D.S., Nock S. Recent developments in protein microarray technology // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2003. - Vol. 42. - P. 494.

180. Wilson M.B., Nakane P.K. The covalent coupling of proteins to periodate-oxidized sephadex: a new approach to immunoadsorbent preparation // J. Immunol. Meth. 1976. - Vol. 12. - P. 171-181.

181. Xiang X., Tianping W., Zhigang T. Development of a rapid, sensitive, dye immunoassay for schistosomiasis diagnosis: a colloidal dye immunofiltration assay // J. Immunol. Meth. 2003. - Vol. 280. - P. 49- 57.

182. Yamasaki Osuga D.T., Feeney R.E. Periodate oxidation of methionine in proteins // Anal. Biochem. 1982. - Vol. 126.-№ l.-P. 183-189.

183. Zhan H., Meyerhoff M.E. Gold-coated magnetic particles for solid-phase immunoassays: Enhancing immobilized antibody binding efficiency and analytical performance // Anal. Chem. 2006. - Vol. 78. - P. 609-616.

184. Zhu H., Snyder M. Protein chip technology // Curr. Opin. Chem. Biol. -2003.-Vol. 7. -№ l.-P. 55-63.

185. Zhu L. Filter-based microfluidic device as a platform for immunofluorescent assay of microbial cells // Lab. Chip. 2004. - Vol. 4. - P. 337-341.

186. Zhu Y, He W., Liang Y et al. Development of a rapid, simple dipstick dye immunoassay for schistosomiasis diagnosis // J. Immunol. Meth. 2002. -Vol. 266.-P. 1-5.

Информация о работе

Филатов, Павел Владимирович
кандидата биологических наук
Кольцово, 2010
ВАК 03.01.06

Диссертация

Применение каталитических маркеров на основе двухвалентного кобальта в планшетном иммуноанализе с визуальным учётом результатов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Применение каталитических маркеров на основе двухвалентного кобальта в планшетном иммуноанализе с визуальным учётом результатов - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы