Превращения динитрозильных комплексов железа в организме и их действие на сердечно-сосудистую систему

Тимошин, Александр Анатольевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Превращения динитрозильных комплексов железа в организме и их действие на сердечно-сосудистую систему
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Превращения динитрозильных комплексов железа в организме и их действие на сердечно-сосудистую систему"

На правах рукописи

ТИМОШИН Александр Анатольевич

ПРЕВРАЩЕНИЯ ДИНИТРОЗИЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЖЕЛЕЗА В ОРГАНИЗМЕ И ИХ ДЕЙСТВИЕ НА СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТУЮ

СИСТЕМУ

03.01.02 - биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

2й

Я №Р

Москва-2012

005051138

Работа выполнена в НИИ экспериментальной кардиологии ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздравсоцразвития России.

Официальные оппоненты:

Научный консультант: руководитель лаборатории ФГБУН

«Институт химической физики имени Н.Н.Семёнова РАН», доктор биологических наук, профессор Ванин Анатолий Фёдорович

руководитель лаборатории ФГБУН «НИИ физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства», доктор биологических наук, профессор Азизова Офелия Ахатовна

руководитель лаборатории ФГБУН «Институт биохимической физики имени Н.М.Эмануэля РАН», доктор биологических наук Каламкаров Григорий Рафаэльевич

ведущий научный сотрудник ФГБУН «Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН», доктор биологических наук Реутов Валентин Палладиевич

ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И.Пирогова» Минздрава России

Защита состоится « 2?» ии Г^ 2013 г в . часов на заседании

диссертационного совета Д 208.057.01 в ФГБУН «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства» по адресу: 119435, г.Москва, ул. Малая Пироговская, 1а. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУН НИИ ФХМ ФМБА России. Автореферат

разослан « I 6 » 2013 г.

Ведущая организация:

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Мурина М.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Известно, что заболевания сердца и сердечно-сосудистой системы являются одной из основных причин летальности или существенных нарушений состояния здоровья животных и человека. Среди таких патологий одно из основных мест занимают необратимые повреждения органов и тканей, вызванные нарушениями их кровоснабжения, сопровождающимися развитием в них региональной или тотальной ишемии. Установлено, одним из основных факторов, приводящих к серьёзным и необратимым повреждениям ткани, в таких условиях является окислительный стресс, вызванный генерацией большого количества короткоживущих высокотоксичных кислородных радикалов. Поэтому в клинической практике широко применяются препараты, оказывающие вазодилататорное действие, способное восстанавливать нарушенное кровоснабжение ткани органов. Кроме того, для уменьшения уровня кислородных радикалов, возникающих в ходе восстановления кровоснабжения ишемизированной области, а также снижения их повреждающего действия, используются также препараты, способные подавлять образование кислородных радикалов, осуществлять перехват этих высокотоксичных соединений, а также нейтрализовывать их токсичные вторичные продукты, например, терминируя процессы перекисного окисления липидов.

Хорошо известно, что такое соединение, как оксид азота (N0), в организме является эндогенным вазодилататором, регулирующим тонус сосудов, способным также оказывать антиоксидантное действие, перехватывая кислородные радикалы и нейтрализуя вторичные продукты ПОЛ. Поэтому для профилактики и лечения последствий ишемических повреждений ткани органов широко применяются препараты, являющиеся источником оксида азота (N0) в организме. Тем не менее, N0, как высокоактивное соединение, обладает хорошо выраженным дихотомическим действием, и его гиперпродуцирование может вызывать отрицательный и даже токсичный эффект. Однако, в организме основная часть пула N0 присутствует в связанной форме, формируя квазистабильные нетоксичные комплексы, что способно существенно уменьшать неблагоприятное действие избытка N0.

Исследование механизмов действия таких комплексов, содержащих N0 в депонированной форме, представляет собой актуальную научную проблему, причём сразу по нескольким причинам. Во-первых, это связано с тем, что накопление и перенос NO к мишеням действия осуществляют именно стабилизированные комплексы NO, поэтому ими во многом определяются содержание и активность NO в разных областях организма. Во-вторых, такие формы депонирования NO обладают собственной метаболической активностью, а также способны мигрировать и накапливаться в разных областях организма, что является одним из факторов их избирательности действия на разные органы и/или их участки. В-третьих, учитывая то, что эти комплексы являются природными формами связывания NO, это может означать возможность их применения в качестве эффективных и безопасных лекарственных препаратов - доноров NO, обладающих также антиоксидантными свойствами

Поэтому исследование физиологических комплексов, содержащих депонированный N0, является актуальной проблемой и неотъемлемой частью изучения роли и механизмов действия N0 в организме млекопитающих, в том числе в различных физиологических формах, и при разных условиях кровоснабжения органов и/или их участков. Цель и задачи исследования.

Целью работы являлось выяснение роли взаимных превращений различных физиологических форм NO в механизмах гипотензивного и кардиопротекторного действия динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ) при разных условиях кровообращения органов и тканей.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучение свойств динитрозильных комплексов железа с различными тиол-содержащими лигандами в модельных системах и биологических жидкостях, а также кинетик их спонтанного или индуцированного распада.

2. Исследование действия динитрозильных комплексов железа, как переносчиков и доноров NO в условиях естественного кровообращения организма. Анализ переноса ДНКЖ из крови в ткань органов in vivo.

3. Изучение влияния динитрозильных комплексов железа и других доноров N0 на уровень NO в различных органах и тканях. Разработка методических подходов

для оценки уровня N0 в условиях in vivo и в интерстиции ткани органов in situ.

4. Исследование кардиопротекторного действия динитрозильных комплексов железа в условиях регионального или тотального нарушения кровоснабжения миокарда. Изучение их взаимодействия с короткоживущими активными формами кислорода в условиях окислительного стресса.

5. Анализ накопления динитрозильных комплексов железа в ткани органов и его изменений в результате нарушений кровоснабжения миокарда.

6. Исследование влияния ДНКЖ на компоненты дыхательной цепи митохондрий сердца при различных условиях кровоснабжения.

7. Сравнение полученных гипотензивного и кардиопротекторного эффектов ДНКЖ

с другими препаратами, обладающими аналогичным действием в организме. Научная новизна работы.

В результате проведённых исследований получены новые представления о физико-химических свойствах и механизмах действия ДНКЖ с тиол-содержащими лигандами на сердечно-сосудистую систему млекопитающих в условиях естественного кровообращения, а также при региональной ишемии и реперфузии миокарда. В результате введения таких комплексов с низкомолекулярными лигандами в организм происходит образование связанных с белками ДНКЖ и S-нитрозотиолов, которые осуществляют перенос и депонирование оксида азота, а также оказывают гипотензивное и кардиопротекторное действие. 1. В работе показано, что в плазме регистрируется связывание ДНКЖ с альбумином, а в эритроцитарной массе - с гемоглобином, причём содержание парамагнитных ДНКЖ в плазме существенно больше, чем в эритроцитах. Эти комплексы способны сохраняться в цельной крови животного в течение длительного времени. После попадания ДНКЖ в кровь происходит быстрый переход и накопление ДНКЖ в ткани органов, причём в сердце, лёгком, печени и в цельной крови его содержание сразу достигает своих максимальных значений и далее постепенно снижаются. Кроме того, в органах происходит образование S-нитрозотиолов. Далее инициируется медленный распад этих комплексов с высвобождением NO, что приводит к длительному гипотензивному эффекту.

2. В ходе выполнения работы методом микродиализа с использованием спиновых ловушек впервые проведён комплексный мониторинг уровня NO в организме in vivo и его изменения в результате введения доноров NO (ДНКЖ, Изокет). Впервые установлено, что базальные уровни NO в интерстиции ткани сердца, печени и почки достоверно между собой не различаются. Показано, что в результате введения ДНКЖ регистрируется увеличение уровня N0 в интерстиции ткани сердца, лёгких, печени и почки, при этом действие этого препарата является неспецифичным по отношению к исследуемым органам.

3. В работе показано, что при введении в кровоток ДНКЖ с глутатионом (ДНКЖ-Глт) наиболее существенное увеличение общего NO (как свободного, так и связанного) регистрируется в сердце животного, причём величина этого эффекта существенно превышает рост уровня свободного NO в ткани миокарда. Напротив, при введении животным в качестве донора N0 водорастворимого аналога нитроглицерина (Изокета) увеличение уровня свободного NO в сердце существенно превышает аналогичное повышение содержания его связанных форм.

4. Установлено, что в условиях региональной ишемии после введения низкомолекулярных ДНКЖ происходит эффективное накопление связанных с белками ДНКЖ в ишемизированной зоне, что объясняется быстрой регенерацией ДНКЖ в зоне окклюзии в условиях гиперпродуцирования NO. Связывание избытка N0 с образованием ДНКЖ в условиях ишемии снижает вероятность формирования избытка пероксинитрита, образующегося в реакции свободного N0 с супероксидом.

5. Показано, что в условиях восстановления кровоснабжения участка миокарда ДНКЖ выступает, как эффективный перехватчик супероксидов, в результате чего происходит эффективный распад этих комплексов.

6. Установлено, что введение ДНКЖ способно влиять на редокс-состояние переносчиков электронов дыхательной цепи митохондрий сердца.

7. Установлено, что ДНКЖ с низкомолекулярными лигандами могут являться источником газообразного NO при продувании воздуха через водный раствор этого комплекса.

Научно-практическая значимость работы.

1. На основании полученных результатов в ФГБУ "РКНПК" Минздравсоцразвития РФ создаётся новый гипотензивный препарат, активным веществом которого являются ДНКЖ с глутатионом в качестве тиол-содержащего лиганда.

2. На основании проведённого в работе сравнительного исследования влияния ДНКЖ на уровни NO в различных органах животного появляется возможность делать оценки эффекта введения этого комплекса на содержание NO в интерстиции ткани сердца, печени и почки на основании неинвазивной регистрации N0 в выдыхаемом воздухе.

3. Результаты, полученные на моделях региональной или тотальной ишемии миокарда, свидетельствуют о возможном применении ДНКЖ в качестве кардиопротектора при нарушениях кровоснабжения сердечной мышцы.

4. Полученные в работе результаты показывают возможность применения водного раствора препарата ДНКЖ, как источника газообразного оксида азота в ингаляторе Макхольда.

Апробация работы.

Основные результаты исследований докладывались на 28 российских и международных конференциях и симпозиумах, в том числе: 3rd International Symposium on Hypoxia. (Berlin, Germany, 1994); IX, X и XI Международных конференциях «Магнитный резонанс в химии и биологии» (Звенигород, 1996, 1998, 2001); XYIIl"1 European Section Meeting of the International Society for Heart Research (Versailles, France, 1997); XIXth Congress of the European Society of Cardiology (Stockholm, Sweden, 1997); I Евразийском конгрессе «Медицинская физика - 2001» (Москва, 2001); III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); II Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика - 2005» (Москва, 2005); 4-й, 5-й и 6-й национальных научно-практических конференциях с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2005, 2007 и 2009); Международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, Беларусь, 2006); VII Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2006); XV и XVI Международных конференциях «Новые информационные технологии в медицине,

биологии, фармакологии и экологии» (Ялта-Гурзуф, Украина, 2007 и 2008); VIIth International Workshop on EPR (ESR) in Biology and Medicine (Krakow, Poland, 2007); 4-й и 5-й Международных Крымских конференциях «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии» (Судак, Украина, 2008 и 2009 гг); Международной научной конференции и восьмом съезде белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков (Минск, Беларусь, 2008); Joint Conference of the 13th In Vivo ESR/EPR Spectroscopy & Imaging and the 10th International EPR Spin Trapping/Spin Labeling: EPR2008 (Kyushu, Japan, 2008); 19th and 21st European Meetings on Hypertension (Milan, Italy, 2009 and 2011); XVII национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010); 20th European Meeting on Hypertension (Oslo, Norway, 2010); III Евразийском Конгрессе по Медицинской Физике и Инженерии «Медицинская физика-2010» (Москва, 2010); 2nd International Conference «Recent advances in health and medical sciences» (Paphos, Cyprus, 2010); Всероссийской конференции с международным участием «Спектроскопия и томография электронного парамагнитного резонанса в химии и биологии» (Москва, 2011 г).

Апробация диссертационной работы проводилась на межлабораторном заседании (с приглашением членов учёного совета) НИИ экспериментальной кардиологии ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздравсоцразвития России 19 марта 2012 г. Публикации.

По материалам диссертации опубликованы 29 статей, в том числе в российских журналах - 19, в иностранных - 10, в изданиях, входящих в перечень ВАК России - 24 статьи. Кроме того, в трудах конференций или в специальных выпусках журналов опубликовано 32 тезисов докладов по данной работе. Структура и объём диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, пяти глав, посвященных описанию полученных результатов и их обсуждению, заключения, выводов, и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 298 страницах, содержит 87 рисунков и 6 таблиц. Список литературы содержит 347 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Обзор литературы

В данном разделе диссертационной работы представлены общие сведения об оксиде азота (NO), как высокореакционном соединении, обладающим широким спектром биологического действия. Известно, что NO в организме обладает хорошо выраженным дихотомическим эффектом, проявляя в зависимости от концентрации как положительное (активация гуанилатциклазы, перехват кислородных радикалов, нейтрализация токсичных продуктов перекисного окисления липидов, модулирование активности каспаз), так и отрицательное действие (прооксидантный эффект, вызванный гиперпродуцированием пероксинитрита, модификация железосерных белков, эндосептический шок). Известно, что N0 образуется в организме ферментативно с помощью N0 синтаз (NOS), но кроме того, возможен также и неферментативный синтез NO. В результате ишемии происходит интенсивное образование большого количества N0, что может привести к гиперпродуцированию пероксинитрита.

На основании приведённых данных наиболее эффективным и безопасным средством, способным оказывать вазодилататорное и кардиопротекторное действие, но не приводящим к высвобождению большого количества свободного NO, можно рассматривать такие физиологические формы депонирования NO, как динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ). В Российской федерации в этой области наиболее известны работы профессора А.Ф.Ванина и его коллег. Известно, что ДНКЖ в организме осуществляют накопление, внутри- и межклеточный перенос NO и иона нитрозония N0+. Эти комплексы обладают также собственным антиоксидантным действием - они способны перехватывать супероксидные радикалы с образованием нетоксичных продуктов, а также разлагать перекись водорода. На основании обзора литературы поставлены цель и задачи исследования, связанные с выяснением механизмов действия вводимых экзогенно ДНКЖ при различных физиологических условиях.

Глава 2. Методика эксперимента

В работе использовался препарат динитрозильных комплексов железа с

тиосульфатом - Na2[Fe2(S203)2(N0)4]-4H20, полученный в результате реакции

FcS04'7H20 с Na2S203-5H20 в токе газообразного NO. ДНКЖ с цистеином был получен путём обработки растворов сульфата железа и L-цистеина газообразным N0. Лиофилизированный препарат ДНКЖ с глутатионом (ДНКЖ-Глт) синтезирован путём смешивания растворов FeS04»7H20 и S-нитрозоглутатиона в фосфат-цитратном буфере с дальнейшим лиофильным высушиванием полученного продукта. В работе использовались два препарата ДНКЖ-Глт, различающиеся между собой по составу. Так, для работы в условиях естественного кровоснабжения применялся «стандартный» ДНКЖ-Глт, а в условиях ишемии миокарда и постишемической реперфузии- «дестабилизированный» препарат ДНКЖ-Глт, отличающийся от предыдущего меньшим содержанием глутатиона и большим - цитрата Na. Другие реактивы были получены от фирм Sigma и Aldrich.

При работе на модели изолированного сердца в экспериментах использовались крысы Wistar. Перфузия проводилась по методам Лангендорфа и Нили раствором Кребса-Хензелейта, насыщенным карбогеном при +37°С. Тотальная ишемия создавалась путём полной остановки коронарного потока. Для инфузии раствора, содержащего ДНКЖ-Глт, при перфузии сердца по методу Лангендорфа, данный препарат подавался в аортальную канюлю с помощью шприцевого насоса. Для регистрации кардиопротекторного эффекта ДНКЖ-Глт в других опытах инфузия данного препарата проводилась в начале постишемической реперфузии. Для фиксации образцов миокарда проводилось быстрое замораживание сердец щипцами Волленбергера, охлаждёнными в жидком азоте. В контроле проводилась аналогичная инфузия стандартным раствором без ДНКЖ. Проводились также специальные контрольные серии экспериментов, в которых сердца перфузировались стандартным раствором без ДНКЖ по методам Лангендорфа и Нили, когда замораживание сердец проводилось в ходе аэробной перфузии, тотальной ишемии и постишемической реперфузии. В других опытах фиксация образцов осуществлялась после длительного «бессубстратного оксигенирования», т.е. перфузии сердца стандартным оксигенированным раствором, не содержащим глюкозы. Далее проводилась регистрация спектров ЭПР замороженной ткани сердца при температуре жидкого азота и при -40°С.

При изучении действия ДНКЖ в крови животных в условиях in vivo эксперименты проводились на кроликах. Животным ставили катетер в краевую

вену уха, через который вводили анестетик (кетамин), доноры N0 (ДНКЖ, Изокет), комплексы а также собирались образцы крови. Кроме того, в

ряде опытов кроликам ставился мочевыводящий катетер. Для анализа ДНКЖ в крови и её компонентах после введения разных доз этих комплексов собирались образцы крови, в которые добавляли гепарин, после чего они сразу замораживались и хранились в жидком азоте. Для исследования ДНКЖ в плазме и эритроцитарной массе часть образцов крови после их получения и добавления гепарина центрифугировали и отделяли плазму от эритроцитов, после чего их также замораживали. При исследовании действия комплексов Ре1+-МОС2 эти соединения вводились внутривенно, после чего проводился сбор образцов цельной крови и мочи животного. Все образцы сразу же замораживались и хранились в жидком азоте, и размораживались перед регистрацией их спектров ЭПР.

При исследовании гипотензивного действия ДНКЖ в условиях естественного кровообращения эксперименты проводились на наркотизированных крысах в условиях ¡п вки. Для оценки уровня свободного N0 в ткань левого желудочка сердца, а также печени и почки имплантировали диализные волокна, через которые прокачивали 30 мМ раствор спиновой ловушки Рс"1+-МСВ2. Образцы диализата, вытекающего из каждого волокна, собирались последовательными фракциями в охлаждаемые микропробирки, после чего полученные образцы использовали для регистрации их спектров ЭПР. Одновременно с регистрацией уровня N0 в ткани органов проводилась также оценка содержания оксида азота в выдыхаемом воздухе. Для этого в канал активного выдоха аппарата искусственной вентиляции лёгких устанавливалась проточная кювета, содержащая стандартный раствор спиновой ловушки Ре3+-М002. Время пропускания воздуха через такие образцы ловушки составляло 20 мин, после чего их замораживали в жидком азоте и использовали далее для регистрации спектров ЭПР. При использовании в качестве экзогенного донора N0 ДНКЖ с тиосульфатом этот препарат вводили внутривенно болюсно (концентрация - 2,5 мМ, доза введения - 1,0 мл) через 40 мин после начала сбора диализата и анализа выдыхаемого воздуха. После этого также по стандартной методике регистрировали содержание ДНКЖ в цельной крови. При использовании в качестве гипотензивного средства препарата Изокет (Изосорбитдинитрат) его

внутривенное введение проводилось непрерывно (15 мкл/мин ОД % раствора препарата), начиная с 40-й минуты после начала сбора диализата и анализа выдыхаемого воздуха и продолжалось до конца эксперимента. Для регистрации содержания связанных с белками ДНКЖ в ткани органов и в цельной крови на разных этапах опыта после введения ДНКЖ-Глт (0,8 мкмоль/кг массы тела) проводилась экстракция и промывка ткани органов, после чего регистрировались спектры ЭПР полученных образцов при комнатной температуре и температуре жидкого азота. Образцы мочи животного брались через прокол мочевого пузыря. В других опытах для регистрации уровня N0 (включая его депонированные формы) в гидрофобных областях клеток в качестве спиновой ловушки применялись липофильные комплексы Ре-ОЕТС2. В этом случае внутривенное введение ДНКЖ-Глт проводилось через 20 мин после инъекции компонентов этой ловушки, а ещё через 10 мин проводились экстракция и быстрое замораживание образцов органов с дальнейшим их анализом методом ЭПР.

При изучении кардиопротекторного действия ДНКЖ-Глт в условиях нарушения и восстановления кровоснабжения т вки эксперименты проводились на крысах \Vistar. Региональная ишемия в части левого желудочка создавалась путём окклюзии передней нисходящей коронарной артерии (ПНА). Продолжительность ишемии составляла 40 мин, после чего лигатуру снимали, и в ишемизированном участке миокарда происходила реперфузия. В ходе экспериментов проводились мониторинг параметров общей гемодинамики сердца, а также оценка размеров инфарктной зоны с помощью гистохимического анализа. Препарат ДНКЖ-Глт ("дестабилизированный"; 3,1 мкмоль/кг массы тела) вводился через венозный катетер одновременно с началом окклюзии, в контрольных опытах вместо него вводили эквивалентное количество физиологического раствора. В ходе экспериментов проводили мониторинг уровня короткоживущих АФК и свободного N0 в ишемизируемой и интактной зонах миокарда. Для этого в интактную и в ишемизируемую зоны миокарда имплантировали диализные волокна. Через них прокачивался раствор спиновой ловушки. Диализат, вытекающий из обоих диализных волокон, собирали последовательными фракциями в охлаждаемые микропробирки и использовали далее для регистрации методом ЭПР образованных спиновых аддуктов (Рис. 1). Для оценки уровня N0 в обеих исследуемых областях

миокарда, как и ранее, использовали комплексы Ре"+-МОВ2. Для регистрации короткоживущих кислородных радикалов применяли стандартную ловушку 5,5 -диметил-Ьпирролин-Г^-оксид (ОМРО). Целью других экспериментов был анализ содержания парамагнитных ДНКЖ в исследуемых зонах миокарда, а также в печени и в цельной крови на различных этапах опыта после введения ДНКЖ-Глт. Для этого в разных опытах через 2 и 40 мин после начала окклюзии, а также через 60 мин после начала реперфузии вырезали зону риска и интактную зону миокарда, а также часть печени. Далее полученные образцы замораживали и хранили в жидком азоте. Кроме того, на тех же этапах опыта собирали и аналогичным образом фиксировали образцы цельной крови животного. Далее регистрировали спектры ЭПР всех образцов ткани и крови при температуре жидкого азота.

Рис. 1. Схема регистрации уровня N0 и кислородных радикалов в миокарде в условиях нарушения и восстановления кровоснабжения с использованием метода

микродиализа. На схеме: 1-диализатор в интактной области левого желудочка; 2- диализатор в ишемизируемой области левого желудочка; 3- окклюдер; 4- шприцы насоса для прокачки раствора спиновой ловушки

При исследовании ДНКЖ, как источиика N0 вне организма,

эксперименты проводились на наркотизированных крысах \Vistar. Животным делали трахеотомию, подключали к аппарату искусственной вентиляции лёгких. В канал вдоха устанавливалась проточная кювета, содержащая водный раствор ДНКЖ с тиосульфатом (5 мг/мл). В контроле дыхание крыс осуществлялось обычным воздухом. Одновременно с началом ингаляции крысам путём инъекций вводили компоненты стандартной спиновой ловушки Ре-ОЕТС2. Через 30 мин животных забивали, после чего вырезали, промывали в физиологическом растворе и замораживали образцы ткани органов (сердце, лёгкое, печень, почка, скелетная мышца), а также цельной крови. Далее регистрировали спектры ЭПР полученных образцов при температуре жидкого азота. Для оценки влияния пропускания

воздушного потока через раствор ДНКЖ на уровень NO в воздухе применялась другая проточная кювета, содержащая раствор Fe3+-MGD2, через которую проходил воздух после раствора ДНКЖ. В этом случае, как и ранее, уровень NO оценивался исходя из содержания в этом растворе аддуктов NO-Fc2+-MGD2, образующихся после пропускания через него исследуемого воздуха.

Глава 3. Изучение экзогенных диннтрозильных комплексов железа в крови животных в условиях in vivo

В данном разделе диссертационной работы представлены исследования физико-химических свойств ДНКЖ в кровотоке животного после внутривенного введения разных доз данного препарата с низкомолекулярными лигандами. Все эксперименты проводились на бодрствующих кроликах или находящихся под лёгким кетаминовым наркозом. При исследовании этих комплексов требовалось их сохранение в крови в течение длительного времени, поэтому в данных экспериментах в качестве лиганда применялся тиосульфат, что позволяло защитить ДНКЖ в кровотоке от деструктивного эффекта супероксида.

Внутривенное введение животным ДНКЖ с тиосульфатом (5,23 мкмоль/кг массы тела) вызывало появление в крови асимметричного сигнала ЭПР с центром g=2,03. На рисунке 2 представлены характерные спектры этого комплекса, полученные через 5 мин после введения данного препарата, в цельной крови (спектр 1), а также в плазме и эритроцитарной массе (спектры 2 и 3, соответственно). Из рисунка видно, что их форма в плазме и эритроцитах значительно отличаются друг от друга, а спектр цельной крови можно рассматривать, как их суперпозицию. При этом ДНКЖ в плазме могли характеризоваться сигналом ЭПР с ромбической симметрией g-фактора со значениями 2,05, 2,03 и 2,014. Амплитуда этого сигнала была существенно больше, чем для эритроцитарной массы, что свидетельствовало о том, что содержание парамагнитных ДНКЖ в плазме выше, чем в эритроцитах. Сигнал ЭПР ДНКЖ в эритроцитарной массе может быть охарактеризован аксиальной симметрией g-фактора со значениями g± = 2,040 и g|| = 2,014. Исходя из формы этих сигналов следует, что ДНКЖ в данных образцах присутствовали исключительно с высокомолекулярными лигандами, которыми являются тиол-содержащие белки.

Очевидно, что образование таких ДНКЖ в крови являлось следствием переноса Fe+(NO+)2 групп ДНКЖ с тиосульфата на белковые лиганды.

Аналогичные переходы Fe+(NO+)2 групп могли быть легко достигнуы на модельных системах путём добавления ДНКЖ в раствор BSA или гемоглобина в фосфатном буфере. Установлено, что в обоих случаях положение, ширина и форма сигналов ДНКЖ в данных модельных системах были очень близки к сигналам этих комплексов в плазме крови и эритроцитарной массе, соответственно. Следовательно, ДНКЖ, связанные с альбумином, как с доминирующим тиол-содержащи м белком плазмы, являлись в этой фракции крови основным источником такого сигнала ЭПР. Исходя из положения и формы сигналов ЭПР ДНКЖ в эритроцитарной массе, можно заключить, что они являлись следствием перехода Fe+(NO+)2 групп и формирования комплексов ДНКЖ с гемоглобином.

Амплитуду сигналов ЭПР ДНКЖ в крови и её компонентах оценивали с помощью параметра I] (Рис. 2). На рисунке 3 представлены зависимости значений II, полученных через 5 мин после введения разных доз этого препарата.

МЬгштное попе, мТл [ЦНОК|, мкмоль/кг

Рис. 2 /левая панель/. Спектры ЭПР цельной крови (1), плазмы (2), и эритроцитарной массы (3), полученных через 5 мин после введения животному ДНКЖ с тиосульфатом (5,23 мкмоль/кг массы тела). Запись сигналов - при комнатной температуре.

Рис. 3 /правая панель/. Амплитуды сигналов ЭПР ДНКЖ с белковыми лигандами в цельной крови /1/, а также в плазме /2/ и эритроцитарной массе /3/ через 5 мин после инъекции разных доз этого препарата с тиосульфатом.

Из рисунка видно, что при её увеличении до 2,61 мкмоль/(кг массы тела) рост амплитуды сигналов ЭПР происходил практически линейно, а при её

дальнейшем возрастании он замедлялся для образцов цельной крови и плазмы и оставался линейным для эритроцитарной массы. Вероятно, что такой ход этих концентрационных кривых отражает насыщение пула акцепторов Ре+(МО+)2 групп в плазме с увеличением дозы вводимых ДНКЖ в области более 2,61 мкмоль/(кг массы тела). Установлено, что через 5 мин после введения ДНКЖ в дозе 2,61 мкмоль/(кг массы тела) содержание связанных с белками ДНКЖ в плазме было в 13,8 раз выше, по сравнению с эритроцитарной массой.

Нами показано, что ДНКЖ, связанные с белками, могли регистрироваться в кровотоке кролика в течение длительного времени. Установлено, что в течение 48 часов после инъекции препарата эти сигналы существенно уменьшались по амплитуде вследствие спонтанного распада в крови, а также выхода комплекса из кровотока. При этом через 48 часов после его введения как для плазмы, так и для эритроцитарной массы содержание ДНКЖ составляло 12-20% от исходного, причём для эритроцитов такое падение сигнала за этот период было несколько менее выражено, чем для плазмы. На рис. 4 представлены характерные изменения содержания ДНКЖ в цельной крови в течении первых 240 мин после введения препарата, когда животное находилось только в бодрствующем состоянии. Доза введения ДНКЖ в таких опытах составляла 2,61 мкмоль/(кг массы тела), при которой в крови ещё не наблюдалось насыщения по акцепторам Ре+(1ЧО+)2 групп. Из этого рисунка видно, что в результате введения ДНКЖ его концентрация сразу же достигала своего максимального значения, после чего медленно уменьшалась (не более 47 % от своего максимального значения за 240 мин). При этом форма спектров, а следовательно, и характер молекулярного движения парамагнитных ДНКЖ практически не менялись за весь период опыта.

В другой части работы нами исследовалось взаимодействие в организме ДНКЖ с комплексами ионов железа и МСО (Рс3+-М002). Как было установлено ранее, такие комплексы обладают высоким сродством к N0 (в том числе в депонированной форме), и в результате их взаимодействия происходит образование парамагнитных комплексов МО-Ре2+-МОБ2. При этом интенсивность образования таких аддуктов N0 часто используется для оценки уровня N0 в организме. В данной работе проводилась серия экспериментов, в ходе которых в кровь животных последовательно вводились ДНКЖ и комплексы Ре -МС02. Их

целью являлось изучение взаимодействия этих двух комплексов в крови, а также оценка с помощью влияния ДНКЖ на уровень NO в организме in vivo.

На рисунке 5 представлены спектры ЭПР крови животных, когда через 15 мин после инъекции ДНКЖ (2,61 мкмоль/кг массы тела) с тиосульфатом внутривенно вводилась также Fe3+-MGD2 (20 мкмоль/кг массы тела).

¡1,2

5 е» ¡V

3 0,2 0,0]

• Mil

'Ni-

i.....,

■Í-H1

|д=2,оз

250

-I-.-[--

310 315 320 325 330 Магнитное попе, мТл

100 150 200 Время, м«

Рис. 4 /левая панель/. Изменения содержания белковых ДНКЖ в цельной крови кролика в течение 240 мин (1-животные, получавшие только 2,61 мкмоль/(кг массы тела) ДНКЖ с тиосульфатом; 2-е последующим введением 20 мкмоль/(кг массы тела) Ре3+-МС02). 0 мин - введение ДНКЖ, 15 мин - введение Рс3+-\Ш02. Рис. 5 /правая панель/. Спектры ЭПР цельной крови кролика (группа животных, которым через 15 мин после введения 2,61 мкмоль/(кг массы тела) ДНКЖ с тиосульфатом делалась инъекция 20 мкмоль/(кг массы тела Ре3+- МС02): 1.-15 мин после введения ДНКЖ (до введения Ре3+- МОЙ,); 2. - 20 мин после введения ДНКЖ; 3. - 80 мин после введения ДНКЖ; 4. - 180 мин после введения ДНКЖ.

Из этого рисунка видно, что в результате введения этой ловушки N0 происходило заметное уменьшение амплитуды сигнала ДНКЖ в крови с одновременным появлением трёх дополнительных узких линий в этом спектре (спектр 2), принадлежащих парамагнитному спиновому аддукту N0- Ре2+-М002. Нами показано, что данный аддукт присутствовал в крови не более 65 мин. Далее он не регистрировался, и в спектрах образцов крови до конца опыта наблюдался только остаточный сигнал связанного с белком ДНКЖ (спектры 3 и 4). Вероятно, что относительно более быстрое исчезновение в крови сигнала аддукта NO-Fe2+-МСБ2 обусловлено, в основном, удалением этого соединения через почки в мочу.

Из рисунка 4 видно, что в результате введения ловушки регистрировалось 73% уменьшение содержания ДНКЖ. Это означало, что N0, входящие в состав этих комплексов, эффективно взаимодействовали с молекулами Fe3+-MGD2, обладающими большим сродством к N0, по сравнению с самими ДНКЖ.

Используя комплексы Fe3+-MGD2 в качестве спиновой ловушки NO, в данной работе сделана попытка регистрации уровня NO в условиях in vivo, а также его изменений в результате введения ДНКЖ и других доноров N0. Учитывая, что спиновые аддукты NO-Fe2+-MGD2 в крови после введения ДНКЖ регистрировались только ограниченное время, то для такого анализа проводилась оценка содержания аддуктов NO, экскретируемых в мочу животных.

На рис. 6 представлены характерные спектры ЭПР мочи кролика, полученные до инъекции ловушки NO (сигнал А), а также через 30 (Б) и 120 мин (В) после введения этого препарата. Из рисунка видно, что в исходном образце сигнал отсутствовал, а в результате инъекции на начальном этапе опыта в моче регистрировались спектры ЭПР, которые представляли собой суперпозицию двух триплетных частично перекрывающихся сигналов. Первый, с центром при g=2,04 принадлежал комплексу NO-Fe2+-MGD2 (спектр Б, компоненты 1,2,3), а второй был обусловлен тремя низкопольными компонентами 4-х компонентной СТС сигнала комплексов двухвалентной меди с MGD (спектр Б, компоненты 4,5,6.).

На рис. 7 представлена характерная кинетика амплитуды низкопольной компоненты сигнала ЭПР комплекса NO-Fe2+-MGD2 (1ь см. рис. 6, спектр Б). Из рисунка видно, что она достигала своего максимума в моче через 30-40 мин после инъекции ловушки, далее постепенно уменьшалась, и после 120 мин практически переставала регистрироваться. Парамагнитные комплексы Cu -MGD,, содержание которых в моче оценивалось по амплитуде компоненты 5 (12, см. рис. 6, спектр Б), регистрировались более длительное время (Рис. 7).

Известно, что в организме в результате взаимодействия Fe3+-MGD2 с NO происходит вначале образование диамагнитного аддукта NO-Fe3+-MGD2, который далее частично переходит в ЭПР-детектируемую форму путём восстановления эндогенными восстановителями или по механизму восстановительного нитрозирования. Нами показано, что восстановление образцов мочи аскорбатом приводило в среднем к 1,46 - кратному росту сигнала NO-Fe2+-MGD2, что

свидетельствует о том, что в моче действительно присутствовали диамагнитные аддукты но большая их часть была уже в восстановленной форме.

310 320 330 1№п*иное попе, мТл

100 150 200 Время, мин

250

Рис. 6 /левая панель/. Спектры ЭПР образцов мочи кролика: А. - Исходная (до инъекции комплексов железа и МСЮ); Б. - Через 30 мин после инъекции ловушки; В. - Через 120 мин после инъекции ловушки.

Рис. 7 /правая панель/. Кинетики амплитуды низкопольной компоненты сигнала ЭПР 1\Ю-Ре2+-МС02 (1|) и центральной компоненты Си-МОСЬ (12) для образцов мочи кролика. О мин - инъекция ловушки.

Для оценки содержания комплексов Ре1+-М002 в моче животных далее все образцы обрабатывали донором N0 - 5-нитрозоглутатионом, что инициировало в реакционной среде интенсивную генерацию радикалов N0, вследствие чего находящаяся в образцах мочи ловушка практически полностью переходила в парамагнитную форму аддукта М0-Ре2+-МС02, регистрируемую методом ЭПР. Содержание аддуктов, регистрируемых после такой обработки, приблизительно на два порядка превышало уровень эндогенных 1Ч0-Ре2+-МС02. При этом важно отметить, что характер кинетики экскреции комплексов Ре3+-М002 с учётом экспериментальной ошибки практически полностью соответствовал форме этой кривой для аддуктов в образцах нативной мочи (Рис. 7).

На основании полученных данных нами сделана попытка оценки влияния двух разных доноров N0 - ДНКЖ с тиосульфатом и стандартного лекарственного препарата Изокет (Изосорбитдинитрат) на уровень N0 в организме. Как известно, комплекс спинового аддукта К0-Ре2+-МС02 образуется в организме в результате

взаимодействия молекулы ловушки и радикала N0. Поэтому об уровне NO в организме представлялось возможным судить по концентрации образовавшегося аддукта (после восстановления мочи аскорбатом), нормированной на содержание ловушки для каждого этапа опыта. Учитывая, что кинетические кривые экскрекции ловушки и аддукта N0 имели одинаковую форму, а интенсивность сигналов ЭПР этих соединений в образцах мочи отражала их содержание в организме, то количественную оценку уровня NO в условиях in vivo оказалось возможным произвести по формуле N=([NO-Fe-MGD2]/[Fe3+-MGD2])MOO %.

В ходе работы в соответствии с предложенной методикой оценки уровня NO исследования проводились на трёх группах кроликов: интактных (контроль) (1); получавших инъекцию ДНКЖ с тиосульфатом (2,61 мкмоль/кг массы тела, что соответствовало практически полному насыщению по акцепторам Fe(NO)2 групп в плазме крови) за 15 мин до введения Fe3+-MGD2 (2); а также получавших непрерывно внутривенно препарат Изокет (3). В этом случае эффективная доза применения препарата Изокет выбиралась исходя из результатов его применения другими авторами и рекомендуемой его дозировки в клиническом применении.

В результате были получены следующие значения параметра N, характеризующие уровень NO in vivo: N (контроль) = 1,33 ± 0,13 %; N (+ ДНКЖ) = 2,20 ± 0,31 %; N (+ Изокет) = 1,62 ± 0,12 %. Таким образом, в результате введения обоих доноров NO происходило увеличение уровня NO в организме, регистрируемое с помощью спиновои ловушки Fe3+-MGD2, при этом эффект ДНКЖ был несколько выше, по сравнению с Изокетом. Можно предположить, что больший эффект ДНКЖ, как донора N0, по сравнению с Изокетом, не приводил к негативному эффекту на организм, так как образование данных спиновых аддуктов являлось следствием взаимодействия ловушки не только со свободным NO, но и с физиологическими формами депонирования NO (ДНКЖ, S-нитрозитилы).

Глава 4. Динитрозильные комплексы железа, как доноры NO в условиях естественного кровоснабжения организма

Данный раздел посвящен изучению действия ДНКЖ в организме в интактных условиях. В работе впервые проведено избирательное исследование свободного NO в интерстиции ткани органов крыс in situ с применением

микродиализа и использованием водорастворимой спиновой ловушки Ре3+-МС02, причём оценивались как уровень базального N0, так и его изменения в результате введения ДНКЖ с тиосульфатом, а также Изокета. Нами сделана попытка регистрации свободного N0 в интерстиции сердца, печени и почки путём пропускания раствора ловушки через диализные волокна, имплантированные в ткани органов, и регистрации методом ЭПР спиновых аддуктов N0 в вытекающем диализате. Нами показано, что в результате такого прохождения комплексов Ре3+-М002 через диализатор часть его молекул в результате взаимодействия с N0 переходила в форму диамагнитных аддуктов:

Ре3+-М002 + N0 К0-Ре3+-МС02 , которые далее восстанавливались дитионитом до своей парамагнитной формы:

М0-Ре3+-М002+е" Ш-Ре2+-М002, обладающей характерным триплетным сигналом ЭПР в области g=2,04 (Рис. 8, спектр. 2). В то же время, образование таких спиновых аддуктов происходило именно в результате взаимодействия ловушки с нестабильным N0 и не было связано с проникновением в диализатор более стабильных ДНКЖ и Б-нитрозотиолов с низкомолекулярными лигандами, а также нитрита, поскольку, как показали контрольные эксперименты, сбор диализата при отсутствии в нём спиновой ловушки и последующие добавления в него Ре3+-1УЮ02 и дитионита не приводили к образованию парамагнитных аддуктов N0 (Рис. 8, спектр 3).

При исследовании эффекта ДНКЖ с тиосульфатом на содержание свободного N0 в интерстиции ткани сердца, печени и почки, в образцах диализата, соответствующих всем трём исследуемым органам, регистрировалось содержание спиновых аддуктов, причём как до, так и после введения ДНКЖ. Изменения содержания Г^О-Не-МОПЬ в диализате в результате инъекции ДНКЖ представлены на рисунке 9. Из этого рисунка видно, что до введения ДНКЖ (период 0-40 мин от начала опыта) содержание аддукта в образцах, соответствующих всем трём органам, между собой достоверно не различались. Это свидетельствует о том, что базальный уровень N0, как одного из универсальных регуляторов биохимических и физиологических процессов, в ткани исследуемых органов был примерно одинаковым. Очевидно, что поддержание уровня N0 постоянным для разных органов является необходимым условием нормального режима жизнедеятельности

клеток и тканей в организме. Из рисунка 9 также видно, что в результате инъекции ДНКЖ с тиосульфатом (40 мин от начала эксперимента) в интерстиции ткани сердца, печени и почки происходило увеличение уровня N0.

1,5

314 316 318 320 322 324 326

1,0 0,5 0,0

20 40 60 80 100 120 140

а> о.

Магнитное попе, мТл Время, мин

Рис. 8 /левая панель/. Спектры ЭПР диализата, соответствующего сердцу до введения доноров N0. Спектры 1 и 2- через диализное волокно в течение 20 минут пропущен раствор Ре3+-М002 (30 мМ) в фосфатном буфере (рН 7,4) без добавления и с добавлением дитионита в собранный раствор (соответственно 1 и 2). Спектр 3 -через диализное волокно пропущен фосфатный буфер без Ре3+-МОВ2 с последующим добавлением в собранный раствор Ре3+-МОБ2 (30 мМ) и дитионита. Рис. 9 /правая панель/. Значения концентрации РГО-Ре-МОБт в образцах диализата, соответствующих сердцу, печени и почке крысы до и после введения ДНКЖ с тиосульфатом. 40 мин - болюсное введение препарата.

Для оценки уровня свободного N0 в ткани лёгких до и после введения ДНКЖ методом ЭПР регистрировали образование спиновых аддуктов N0 в проточной кювете, содержащей раствор Ре^-МвЦг, через которую проходил выдыхаемый воздух. В результате в образцах раствора ловушки после пропускания через него выдыхаемого воздуха и добавления в них дитионита были обнаружены спиновые аддукты Г\Ю-Ре2+-МОВ2, содержание которых возрастало в результате инъекции ДНКЖ.

В ходе работы большой интерес представляло также сравнение в стандартных экспериментальных условиях полученного действия ДНКЖ с тиосульфатом с аналогичным эффектом стандартных и широко применяемых препаратов-доноров N0. В качестве такого препарата, как и в предыдущей главе, был использован Изокет. Это лекарственное средство вводилось непрерывно

внутривенно, начиная с 40-й минуты от начала эксперимента, регистрация N0 осуществлялась по стандартной методике.

Для оценки избирательности действия ДНКЖ и Изокета на уровень N0 в разных органах в данной работе проводился расчёт степени возрастания содержания спиновых аддуктов в диализате и растворе, через который проходил выдыхаемый воздух, в результате введения донора N0. Такие результаты для обоих доноров N0 представлены на рис. 10.

Рис. 10. Увеличение концентрации 1чЮ-Ре2+-М002 в образцах диализата, соответствующих сердцу,

печени и почке крысы также в растворе после пропускания через него выдыхаемого воздуха в результате введения ДНКЖ или Изокета. [1ЧО-Ре2+-МОВ2]исх - усреднённые значения содержания аддукта N0 за период 0-40 мин (т.е. до введения донора N0); [N0-- усредненные значения содержания аддукта за период 100-140 мин.

СЕРДЦЕ ПЕЧЕНЬ ПОЧКИ ЛЕГКИЕ

*Р<0,05.

Из этого рисунка видно, что в результате инфузии Изокета наиболее значительное увеличение уровня свободного N0 наблюдалось для сердца животного. Возможно, что этот факт - результат более избирательного действия в нём Изокета. Из рис. 10 также видно, что в результате внутривенного введения ДНКЖ с тиосульфатом степень увеличения содержания М0-Ре2+-1УЮ02 в образцах диализата, соответствующих сердцу, печени и почке крысы, а также в растворе Ре"+-М002 после пропускания через него выдыхаемого из лёгких воздуха, была приблизительно одинаковой. Это означает, что ДНКЖ, как донор свободного N0, действует неспецифично по отношению к разным органам животного.

В результате проведённого мониторинга АД установлено, что в результате введения ДНКЖ с тиосульфатом в условиях открытой грудной клетки наблюдался очень сильный гипотензивный эффект (снижение АД на 40-50 %), а в результате длительной инфузии Изокета данный эффект данный эффект был более слабым

(30-40 % снижение АД). В то же время, из рис. 10 видно, что в результате действия Изокета эффект увеличения уровня N0 в сердце и почке был выше, по сравнению с ДНЮК с тиосульфатом, а для печени и лёгкого достоверных различий не наблюдалось. Это означало, что в условиях достижения несколько большего гипотензивного эффекта в результате инъекции ДНКЖ, в сердце и почке происходило высвобождение меньшего количества свободного N0, по сравнению с инфузией Изокета. Вероятно, это было связано с тем, что в условиях применения ДНКЖ происходило эффективное депонирование этих комплексов с белковыми лигандами в крови и ткани органов, что позволяло создать существенный гипотензивный эффект, но избежать при этом высвобождения избытка N0 в сердце и почке, способного вызвать неблагоприятное воздействие на ткань этих органов.

При исследовании фармакокинетики ДНКЖ в ткани разных органов эксперименты проводились с использованием препарата ДНКЖ с лигандом глутатионом (ДНКЖ-Глт). Это было вызвано тем, что глутатион является природным соединением, способным оказывать антиоксидантное и кардиопротекторное действия. Доза его введения (0,8 мкмоль/кг массы тела) была меньше, чем вводимого ранее ДНКЖ с тиосульфатом, а максимальный гипотензивный эффект через 10 мин после его болюсной инъекции не превышал 20-25 %, что не могло привести к неблагоприятным последствиям. Для контроля содержания ДНКЖ в крови и ткани органов после введения этого препарата были выбраны три временные точки - 10 (максимальный гипотензивный эффект - 20-25 %,), 50 (гипотензивный эффект - 10-15 %) и 90 мин от момента введения препарата в организм (гипотензивный эффект - 5-10 %). На этих этапах в разных опытах проводились изоляция органов и забор цельной крови для регистрации их спектров ЭПР. Установлено, что на всех этапах опыта в крови и ткани органов присутствовали ДНКЖ только с белковыми лигандами.

На рисунке 11 представлены усреднённые значения содержания ДНКЖ в крови и ткани органов, полученные через 10, 50 и 90 мин после введения ДНКЖ-Глт. Из этого рисунка видно, что для всех образцов, кроме ткани почки, содержание ДНКЖ после его введения в кровоток сразу достигало своих максимальных значений и далее постепенно снижалось, что отражало распад этих комплексов с выделением N0, а также выход их из кровотока или органа. Характер

изменений содержания ДНКЖ в ткани почки имел другую форму, поскольку, с учётом экспериментальной погрешности, в течение первой части опыта (в период 10-50 мин) оно практически не менялось. Вероятно, что вследствие эффективного перехода этих комплексов из кровотока в почки, в ткани этих органов в этот период достигалось насыщение по акцепторам Ре+(ЫО+)2 групп, вследствие чего концентрация этих парамагнитных комплексов могла оставаться практически неизменной в течение длительного времени. В ходе второй части опыта (интервал 50-90 мин) наблюдалось снижение содержания препарата во всех исследуемых органах и в крови, причём в этот период максимальная концентрация препарата регистрировалась в почках животного. Из рис. 11 видно, что к концу второй части опыта (+90 мин) его остаточное содержание в цельной крови, а также в ткани сердца, лёгких и печени были приблизительно одинаковыми.

Нами также показано, что, несмотря на накопление связанных с белками ДНКЖ в почках, экскреция этих комплексов с мочой отсутствовала, что могло свидетельствовать о том, что в этих органах они подвергались полному распаду.

Таким образом, введённые в кровоток ДНКЖ-Глт сразу переносились на белковые лиганды, далее эффективно накапливались в ткани разных органов, после чего подвергались распаду с высвобождением N0, N0* и Б-нитрозотиолов. Учитывая, что основная часть ДНКЖ локализуется внутри клеток и именно там подвергается распаду, то важным вопросом является анализ уровня N0 (включая его связанные формы) в гидрофобных областях клеток в интактных условиях, а также его изменений в результате введения доноров N0 (ДНКЖ-Глт, Изокет). Для регистрации этого пула N0 в данной работе применялись липофильные спиновые ловушки (комплексы ионов железа и диэтилдитиокарбамата, Ее-ОЕТС2). Применение такой методики позволяло регистрировать N0 в гидрофобных областях клеток, и при этом данная ловушка могла взаимодействовать не только со свободным N0, но и с его депонированными формами (Б-нитрозотиолы, ДНКЖ).

Данные исследования проводились на интактных крысах, а также получавших ДНКЖ-Глт и Изокет. Всем животным вводили компоненты спиновой ловушки, далее через 30 мин их забивали, после чего методом ЭПР в замороженных образцах их органов определяли содержание спиновых аддуктов N0- Ее-ОЕТС2 (параметр К), образующихся в результате взаимодействия спиновой

к.

Л] §

2 х

ст т I

а 5-&

ловушки с N0 (включая его связанные формы). Эффект введения ДНКЖ-Глт и Изокета на уровень N0 в гидрофобных областях клеток оценивали с помощью соотношений М+ДНкж/Мконтр. и м+изокет^Контр.> соответственно. Их значения, полученные для всех исследуемых органов животных, представлены на рис. 12.

18 16 14 12 10 8 6 4 2 О

ЕЗШКОЕ ЕЗГВ&Ь 1ПОКА ■ КРОВЬ

N / N

<ДНКЖ-Глт КОНТР. ^ чИЗОКЕТ I ^ КОНТР.

+10 Л/ИН +50 ГД4Ч +00

СЕРДЦЕ ГЁГКОЕ ПЕЧЕНЬ ПОЧКА

Рис. 11 /левая панель. Усреднённые значения содержания связанных с белками ДНКЖ в цельной крови и в ткани органов животного на разных этапах опыта. Рис. 12 /правая панель/. Увеличение содержания спиновых аддуктов N0- Ре2+-БЕТСт в органах крыс в результате инъекции ДНКЖ-Глт (М+ДНкж^контр.) и инфузии Изокета (К^зокет^контр.)

Из этого рисунка видно, что в результате введения ДНКЖ-Глт наибольший рост параметра N регистрировался для сердца и почки животного (14,6- и 9,4-кратное увеличение, соответственно), что отражало аналогичный рост уровня N0 в гидрофобных областях ткани этих органов. Характерно, что значения М+днкж/Г^контр Для всех органов существенно превышали рост уровня свободного N0 в интерстиции сердца, сердца, печени, почки, а также в лёгких в результате инъекции ДНКЖ с тиосульфатом (Рис. 10), несмотря на то, что доза этого препарата была выше, чем ДНКЖ-Глт. Это означает, что при образовании аддуктов МО-Ре-БЕТС2 основной вклад вносило взаимодействие липофильной спиновой ловушки Ре-ОЕТС2 с депонированными формами N0.

Важно отметить, что для достижения столь значительного эффекта увеличения содержания спиновых аддуктов 1ЧО-Ре-ОЕТС2 в органах в результате введения ДНКЖ-Глт требовалось большее количество N0, находящихся в депонированной форме, чем присутствовало в ткани в начале опыта в составе моноядерных ДНКЖ (Рис. 11). Вероятно, что это происходило вследствие

накопления в ткани органов не только связанных с белками ДНКЖ, но и диамагнитных 8-нитрозотиолов (Я8-Ж)), находящихся с ними в химическом равновесии. На основании произведённых оценок нами было показано, что содержание ИЯ-ЫС) в ткани сердца, лёгких и печени в начале опыта составляло 8,7; 4,3; и 26,6 нмоль/г, соответственно, т.е. они были сравнимы с концентрациями ДНКЖ в тех же органах (Рис. 11).

Усреднённые соотношения N+J|зoкEт^Nкoнтp.^ характеризующие степень увеличения уровня N0 в клетках в результате длительной инфузии Изокета, также представлены на рис. 12. Из этого рисунка видно, что для всех исследуемых органов полученный эффект Изокета был более слабый, по сравнению с ДНКЖ-Глт, а в гидрофобных областях ткани сердца и лёгких в результате его инфузии наблюдались лишь незначительные увеличения уровня N0.

Таким образом, в результате введения Изокета регистрируется увеличение уровня свободного N0, причём наиболее заметное - в ткани миокарда (Рис. 10), а рост содержания депонированных форм N0 в ткани сердца и лёгких - существенно более слабый (Рис. 12), что позволяет для этих органов рассматривать Изокет, как источник главным образом свободного N0. Напротив, введение ДНКЖ-Глт приводит в большей степени к увеличению именно связанных форм N0. При этом ДНКЖ-Глт, как источник депонированных форм N0, включая КБ-Ж), действует более избирательно на сердечную мышцу, по сравнению с другими исследованными органами (Рис. 12).

Глава 5. Защитное действие динитрозильных комплексов железа в условиях региональной ишемии и реперфузии миокарда

В данном разделе работы проведено исследование кардиопротекторного действия "дестабилизированного" препарата ДНКЖ-Глт, вводимого внутривенно одновременно с началом 40-минутной региональной ишемии миокарда крыс.

Установлено, что в контрольной группе животных (без введения ДНКЖ) окклюзия ПНА не приводила к достоверным изменениям АД и ЧСС, что отражало тот факт, что ишемия носила локальный характер и не оказывала существенное влияние на показатели общей гемодинамики организма. Тем не менее, методом микродиализа нами было показано, что в результате наложения окклюзии ПНА в

части левого желудочка инициировалась ишемия, что вызывало локальный ацидоз ткани миокарда. В другой группе животных после инъекции ДНКЖ-Глт (3,1 мкмоль/кг массы тела) в течение первых двух минут ишемии АД снижалось до уровня 51 ±7 % от исходного и далее постепенно восстанавливалось, что указывало на вазодилататорный эффект ДНКЖ-Глт, связанный с высвобождением N0. Кроме того, введение данного препарата оказывало кардиопротекторное действие, на что указывали существенные уменьшение зоны инфаркта, а также подавление нарушений ритма сердца.

Поскольку ДНКЖ является как формой депонирования N0, так и антиоксидантом, то его введение может влиять на уровни как кислородных радикалов, так и N0 в условиях окислительного стресса т вки. Поэтому в данной работе методом микродиализа с использованием спиновых ловушек нами впервые проводилось комплексное избирательное исследование уровней АФК и N0 в ишемизируемой и интактной зонах миокарда в условиях ишемии и реперфузии, а также влияния на них предварительного введения ДНКЖ-Глт.

На рис. 13 представлены значения содержания аддукта БМРО-ОН в образцах диализата, соответствующих обеим областям миокарда в группе контрольных животных. Из этого рисунка видно, что после 40-минутной окклюзии коронарной артерии регистрировалось существенное увеличение содержания этого аддукта в образцах, соответствующих ишемизируемой области миокарда, что свидетельствовало об аналогичном увеличении уровня АФК в интерстиции этой зоны сердечной мышцы. Полученные данные могут быть связаны с существенным увеличением скорости генерации АФК митохондриальной дыхательной цепью в начале восстановления кровоснабжения в ишемизированном участке миокарда.

На рис. 14 представлены значения содержания аддукта М0-Рс-МС;02 в образцах диализата, соответствующих уровню свободного N0 в окклюдируемой и интактной областях сердечной мышцы животных из контрольной группы. Из этого рисунка видно, что в начале ишемии инициировался существенный рост содержания аддукта в образцах диализата, соответствующих ишемизируемой зоне, что свидетельствовало об аналогичном увеличении уровня N0, который далее несколько снижался после снятия окклюзии, но оставался повышенным вплоть до конца эксперимента. Из рисунков 13 и 14 также видно, что в образцах,

соответствующих интактной зоне миокарда, в ходе всего опыта не наблюдалось никаких достоверных изменений содержания аддуктов ОМРО-ОН и Ы0-Ре-МС02, что означало, что в ткани этой области миокарда уровни АФК и N0 также оставались практически неизменными. Следовательно, в результате окклюзии ПНА в части левого желудочка развивалась ишемия, но такие ишемические нарушения носили локальный характер, не влияя на соседние области сердечной мышцы.

1,6

М<Н I I 1-5

1,4 5 1,3

-Ц-ГГ. ЗОНА -ЗОН* РИСКА

Е 0,35г

о 0Д>-|

О о.

£<0,25]

20 40

60 80 100 120 140 Браде, №И

5. 1-2 о" 1,1

I 1,0

^ 0,9 6

2. 0,7 0,6 0,5

20 40 60 80 100 120 140

Вре*/я, гл1н

Рис. 13 /левая панель/. Содержание ОМРО-ОН в образцах диализата на всех этапах опыта при использовании спиновой ловушки ПМРО. /контроль/. Стрелками обозначены начало и конец окклюзии ПНА.

Рис. 14 /правая панель/. Содержания М0-Ре-М002 в образцах диализата на всех этапах опыта при использовании спиновой ловушки Ре-М002. /контроль/. Стрелками обозначены начало и конец окклюзии ПНА.

В другой экспериментальной группе аналогичные исследования проводились на животных, получавших ДНКЖ-Глт перед началом окклюзии. На рис. 15 представлены значения содержания адцукта ОМРО-ОН в обеих исследуемых областях миокарда на всех этапах опыта. Из этого рисунка видно, что в этом случае в ишемизируемой зоне в начале реперфузии регистрировался некоторый рост содержания ОМРО-ОН, который далее постепенно снижался. При этом полученный эффект был существенно слабее аналогичного увеличения содержания этого аддукта в опытах, соответствующих контрольной группе животных (Рис. 13). Следовательно, в результате введения ДНКЖ-Глт инициировалось существенное подавление роста уровня АФК во время реперфузии. Вероятно, что полученный эффект был следствием перехвата

супероксидных радикалов молекулами ДНКЖ с образованием нетоксичных продуктов. Из рис. 15 также видно, что в интактной зоне введение ДНКЖ-Глт не приводило к заметным изменениям содержания ОМРО-ОН, что свидетельствовало о том, что в таких условиях в ткани изменений уровня АФК также не происходило.

На рис. 16 представлены значения концентрации спинового аддукта 1\Ю-Ре-МСЭ2 в образцах диализата на всех этапах опыта, соответствующих ишемизируемой и интактной областям миокарда крыс, получавших препарат ДНКЖ-Глт. Из этого рисунка видно, что в условиях естественного кровоснабжения в результате введения ДНКЖ-Глт наблюдалось увеличение содержания этого аддукта N0, причём далее этот повышенный уровень сохранялся в течение длительного времени, что отражало распад комплексов ДНКЖ с высвобождением N0 в ткань миокарда. Из рис. 16 также видно, что в зоне риска в результате введения ДНКЖ-Глт и начала окклюзии также регистрировалось некоторое увеличение содержания аддукта N0 в диализате, но существенно более слабое, по сравнению с животными из контрольной группы (Рис. 14). Полученные данные могут свидетельствовать о том, что введение этого комплекса способно оказывать защитное действие, предохраняя ткань от избытка N0 и его токсичных метаболитов, образующихся в результате региональной ишемии.

-Т-ШГ.ЭСНА "•-ХИМИКА

60 80 100 120 140 Е^эеш, ми

20 40 60 80 ЮО 120 140 Е^и/ц гли

Рис. 15 /левая панель/. Содержание БМРО-ОН в образцах диализата на всех этапах опыта при использовании спиновой ловушки БМРО. Стрелками обозначены начало и конец окклюзии ПНА. 40 мин - введение ДНКЖ-Глт.

Рис. 16 /правая панель/. Содержание 1\'0-Ре-М002 в образцах диализата на всех этапах опыта при использовании спиновой ловушки Ре-М002. Стрелками обозначены начало и конец окклюзии ПНА. 40 мин - введение ДНКЖ-Глт.

Можно предположить, что при введении в кровоток "дестабилизированного" ДНКЖ-Глт инициировался их частичный распад с высвобождением Б-нитрозотиолов, негемового железа и глутатиона. Кроме того, в ходе ишемии при наличии коллатерального кровотока в кардиомиоцитах происходил индуцированный распад этих комплексов в результате их взаимодействия с супероксидными радикалами, в результате чего также происходило высвобождение ионов железа и КБ-Ж). После этого N0, интенсивно образующийся в условиях локального ацидоза в клетках ишемизируемой ткани миокарда в результате ферментативного и неферментативного восстановления нитрита, далее эффективно взаимодействовал с негемовым железом и глутатионом, и вновь образовывал ДНКЖ, которые сразу после этого переходили на высокомолекулярные белковые лиганды внутри клеток. Учитывая то, что с помощью микродиализа регистрируется уровень только свободного N0, выходящего из клеток в интерстицию ткани, то предполагаемый механизм позволяет объяснить существенно более слабое увеличение уровня N0 во время окклюзии после введения ДНКЖ-Глт. Таким образом, вероятно, что механизм действия ДНКЖ зависил от физиологического состояния участка миокарда - в условиях ишемии введение этих комплексов приводило к стимулированию депонирования N0, а после восстановления кровоснабжения они эффективно перехватывали короткоживущие супероксиды.

Для проверки такого предположения нами проводился мониторинг содержания ДНКЖ в разных областях миокарда в ходе регионального нарушения и восстановления кровоснабжения участка сердечной мышцы. В ходе работы после введения ДНКЖ-Глт в разных опытах во время начала и окончания ишемии (2 мин и 40 мин от начала окклюзии, соответственно), а также для 60-й мин реперфузии в зоне риска и интактной зоне миокарда, а также в печени и цельной крови животного определяли содержание парамагнитных ДНКЖ с белковыми лигандами. Полученные в этих опытах результаты представлены на рис. 17.

Из этого рисунка видно, что в результате инъекции ДНКЖ-Глт содержание связанных с белками ДНКЖ в исследуемых органах сразу достигало своих максимальных значений и далее постепенно снижалось. При этом его содержание в

миокарде было выше, чем в печени, что отражало более эффективное накопление этих комплексов в ткани сердечной мышцы после введения препарата.

Из рис. 17 также видно, что как в начале, так и в конце ишемии средние значения содержания ДНКЖ, соответствующие зоне риска, были несколько выше, по сравнению с интактной зоной. Полученный эффект подтвердил сделанное нами ранее предположение о дополнительном синтезе связанных с белками ДНКЖ в ишемизированной области в условиях гиперпродуцирования N0.

На рис. 18 представлены кинетики уменьшения содержания ДНКЖ в исследуемых органах и в крови, приведённые в полулогарифмических координатах. Из рисунка видно, что с учётом экспериментальной погрешности зависимости, соответствующие интактной зоне миокарда, печени и крови по своей форме были достаточно близки к прямым линиям. При этом кинетика уменьшения содержания ДНКЖ в зоне риска имела характерный излом. Вероятно, что распад ДНКЖ в зоне риска частично компенсировался во время ишемии вследствие синтеза новых комплексов, и заметно ускорялся далее в ходе реперфузии в результате перехвата их молекулами супероксидных анион-радикалов.

г 16-

г 12

X д 8-

□ СЕРДЦА ЗР

□ СЕРД£,ИЗ I I ГВВЬ

I I КРОВЬ

2 иш.

40' иш. 4СГ ии+бО'реп.

3,5 3,0 2,5 | 20 Л 1,5 ^1,0 05 ОД

-■- СВДД.ЗР СЕРД^ИЗ -А- ГЕЧЕНи -*- КРОВЬ

О 20

100

40 60 80 Время, гли

Рис. 17 /левая панель/. Усреднённые значения концентрации ДНКЖ, связанных с белковыми лигандами, в зоне риска (ЗР) и интактной зоне (ИЗ) миокарда, ткани печени, а также в цельной крови, полученные на 2-й и 40-й минутах ишемии, а также 60-й минуте реперфузии.

Рис. 18 /правая панель/. Кинетики уменьшения содержания ДНКЖ, связанных с белковыми лигандами, в зоне риска (ЗР) и интактной зоне (ИЗ) миокарда, ткани печени, а также в цельной крови /в полулогарифмических координатах/. 0-40 мин -период окклюзии ПНА, 40-100 мин - постишемическая реперфузия.

Таким образом, полученные нами данные говорят о том, что в результате введения "дестабилизированного" препарата ДНКЖ-Глт в ишемизированной зоне миокарда инициируется дополнительный синтез связанных с белками ДНКЖ, вследствие чего в этой области происходит подавление гиперпродуцирования свободного N0, сопряжённое с накоплением большего количества ДНКЖ, по сравнению с интактной зоной. В условиях реперфузии эти комплексы оказывают антиоксидантное действие, перехватывая короткоживущие супероксидные радикалы, в результате чего происходит их необратимый и быстрый распад.

Глава 6. Исследование сократительной активности и парамагнитных центров изолированного сердца крысы, перфузируемого раствором, содержащим динитрозильные комплексы железа

В данной главе представлены результаты исследования действия ДНКЖ-Глт на изолированное перфузируемое сердце крысы. Нами сделана попытка изучения накопления полученных комплексов в ткани миокарда в условиях аэробной перфузии, тотальной ишемии и реперфузии, их возможного вазодилататорного и кардиопротекторного действия, а также их влияния на свободнорадикальные центры в ткани сердечной мышцы. Установлено, что в результате 5 % увеличения коронарного потока в ходе аэробной перфузии регистрировалось увеличение аортального давления (АД), а при одновременном введении в среду перфузии ДНКЖ-Глт ("дестабилизированный" препарат, 0,1 мкМ) никаких достоверных изменений АД не наблюдалось, что отражало его вазодилататорное действие.

Для регистрации переноса Ре+(>Ю+)2 групп в ткань миокарда и формирования пула парамагнитных ДНКЖ с белковыми лигандами после инфузии ДНКЖ-Глт в условиях аэробной перфузии, а также последующей тотальной ишемии проводилось быстрое замораживание сердец и дальнейший анализ замороженных образцов методом ЭПР. На рис. 19 представлены характерные спектры ткани сердечной мышцы, полученные при уровне СВЧ-мощности Р=10 мВт. Из этого рисунка видно, что в центральной части спектра во всех случаях регистрировался симметричный синглетный свободнорадикальный сигнал. В области g = 2,03 в условиях перфузии в контрольной группе (без инфузии ДНКЖ) сигнал ЭПР отсутствовал (спектр 1). В результате введения препарата ДНКЖ-Глт в

перфузируемом сердце регистрировался лишь очень слабый сигнал ДНКЖ при £ = 2,03 (спектр 2). В условиях ишемии в контрольной группе (без предварительной инфузии ДНКЖ-Глт) также наблюдался слабый сигнал, соответствующий, вероятно, эндогенным ДНКЖ, образующимся в условиях повышения уровня N0 в ишемизированной ткани (спектр 3). В то же время, в результате инфузии препарата и последующей тотальной ишемии в ткани происходило накопление большего количества ДНКЖ, обладающих характерным сигналом ЭПР при g = 2,03 (Рис. 19, спектр 4). Таким образом, образование и/или накопление значительного количества связанных с белками ДНКЖ достигалось в результате двух последовательных процессов - перфузии сердца раствором, содержащим ДНКЖ-Глт и последующей тотальной ишемии.

На рисунке 20 представлены спектры ЭПР аналогичных образцов ткани миокарда, полученные при более низком уровне СВЧ мощности - Р = 0,2 мВт в области g=2,00. Из этого рисунка видно, что в результате перехода от аэробной перфузии к тотальной ишемии свободнорадикальный сигнал становился более широким и несколько асимметричным, причём как в контроле, так и после инфузии препарата ДНКЖ-Глт.

9=2,03 1 / 13=2,0044

ау^А^ч«. з

У^»*** 4

дн 1

-1-1-1---1-*-1-'-1-■-

315 320 325 330 335 Магнитное пале, мТл

340 320 322 324 326 328 330 332 Магнитное поле, мТл

Рис. 19 /левая панель/. Спектры ЭПР ткани сердца при температуре -40°С и Р=10 мВт. 1- перфузия (контроль); 2- перфузия с введением ДНКЖ-Глт; 3- ишемия (контроль); 4- ишемия с предварительным введением ДНКЖ-Глт. Рис. 20 /правая панель/. Спектры ЭПР ткани сердца при температуре -40°С и Р= 0,2 мВт. 1- перфузия (контроль); 2- перфузия с введением ДНКЖ-Глт; 3- ишемия (контроль); 4- ишемия с предварительным введением ДНКЖ-Глт.

Известно, что такая форма свободнорадикального спектра представляет собой суперпозицию двух синглетных сигналов, принадлежащих полувосстановленным формам убихинона (симметричный синглет гауссовой формы с шириной 0,8 -г 1,0 мТл) и флавиновых коферментов (слегка асимметричные линии с шириной 1,2 -г 1,6 мТл). Характерно, что такая форма сигналов сохранялась при росте СВЧ-мощности приблизительно до уровня Р=1 мВт, а в ходе дальнейшего его увеличения этот сигнал становился более узким и симметричным. Исходя из формы свободнорадикальных сигналов можно полагать, что при аэробной перфузии основная доля таких парамагнитных центров принадлежит убихинону. При ишемии происходило существенное повышение вклада флавосемихинонов, вследствие чего наблюдалось увеличение ширины суммарного свободнорадикального сигнала ЭПР и изменение его формы (Рис. 20).

Соотношение вкладов этих двух сигналов представлялось возможным оценивать исходя из величины ДН при Р=1 мВт. Значения АН, соответствующие четырём экспериментальным группам, представлены на рис. 21. Нами показано, что в условиях перфузии введение ДНКЖ-Глт в изолированное сердце не приводило к изменениям ДН, что означало, что достоверных изменений вкладов убисемихинона и флавосемихинонов при этом не наблюдалось. На рис. 22 представлены значения содержания свободнорадикальных центров в образцах (М).

Из этого рисунка видно, что для образцов, полученных в условиях перфузии, введение ДНКЖ-Глт не приводило к изменениям величины N. Кроме того, нами было показано, что инфузия ДНКЖ-Глт во условиях перфузии не влияла на насыщение свободнорадикальных сигналов ЭПР. Следовательно, в условиях аэробной перфузии сердец никакого влияния инфузии ДНКЖ-Глт на состояние полувосстановленых форм убихинона и флавинов также не наблюдалось.

Из рис. 21 и 22 также видно, что в результате ишемии увеличивалась ширина сигнала на уровне Р = 1,0 мВт (ДН), а также происходило существенное увеличение общего числа свободнорадикальных центров (И). Эти данные свидетельствовали о том, что переход от перфузии по Лангендорфу к тотальной ишемии приводил к увеличению как вклада флавосемихинонов в суммарный свободнорадикальный сигнал, так и их концентрации в ткани миокарда.

1,2

0,8-

1 КОНТРОГЬ т

1 Т Т ш

1 ж 1

ГШРУЗИЯ

шв/ия

ГЕРФУЗИЯ ]Л1Шия

Рис. 21 /левая панель/. Усреднённые значения ширины интегрального свободнорадикального сигнала ткани миокарда при Р=1,0 мВт (ДН), соответствующие разным экспериментальным группам.

Рис. 22 /правая панель/. Усреднённые значения содержания свободнорадикальных центров в образцах ткани сердца (N0, соответствующие разным экспериментальным группам.

Из этих рисунков также видно, что образцы, полученные во время тотальной ишемии после предварительной инфузии ДНКЖ-Глт, характеризовались более высокими значениями ДН и N. по сравнению с образцами, соответствующими ишемизированным сердцам из контрольной группы, т.е. без введения ДНКЖ. Это означало, что в условиях ишемии в результате предварительной инфузии ДНКЖ-Глт в свободнорадикальном сигнале наблюдается ещё большее доминирование более широких компонентов сигналов флавосемихинонов, а также увеличение содержания полувосстановленных форм флавинов. Как уже отмечалось ранее, такие изменения состояния компонентов дыхательной цепи сопровождались более эффективным накоплением и/или образованием связанных с белками ДНКЖ в ткани ишемизированного миокарда (Рис. 19, спектры 3 и 4).

Механизм накопления и/или образования связанных с белками ДНКЖ в результате введения этого комплекса и последующей тотальной ишемии, наиболее вероятно, является следующим. В результате инфузии "дестабилизированного" препарата ДНКЖ-Глт в изолированном сердце крысы происходил быстрый распад большей части этих комплексов. В результате в ткань в качестве продуктов распада происходило высвобождение N0. ионов железа и 5-нитрозотиолов, которые

связывались с белковыми лигаидами. На этом этапе эксперимента стационарная концентрация ДНКЖ в ткани была сравнительно низкой и не могла влиять на состояние дыхательной цепи митохондрий.

Далее, в ходе тотальной ишемии в ткани инициировалось ферментативное и неферментативное восстановление нитрита до N0, часть из которых связывалась с 8-нитрозотиолами и ионами железа с образованием новых ДНКЖ с белковыми лигандами. Вследствие этого в условиях ишемии в ткани регистрировалось существенно большее количество связанных с белками парамагнитных ДНКЖ (по сравнению с перфузией после введения ДНКЖ-Глт), приводящих к появлению характерного сигнала при g=2,03. В ходе образования и накопления этих комплексов, способных эффективно перехватывать короткоживущие кислородные радикалы, происходило также связывание избытка N0 в миокарде, что во многом определяло кардиопротекторный эффект ДНКЖ.

В ходе работы нами проводились также специальные серии контрольных экспериментов, в которых исследовались свободнорадикальные сигналы ткани изолированного сердца, перфузируемого как по методу Лангендорфа, так и по Нили ("работающее сердце"), а также в условиях тотальной ишемии и реперфузии. Установлено, что в результате перехода от аэробной перфузии к тотальной ишемии, соответствующей более восстановленному состоянию компонентов дыхательной цепи митохондрий, регистрируется увеличение содержания полувосстановленных форм флавинов. В других опытах нами было показано, что переход компонентов дыхательной цепи в окисленное состояние, достигаемый в результате "бессубстратного оксигенирования" миокарда, приводил к уменьшению выхода полувосстановленных форм флавинов. На основании этих результатов полученные нами данные об увеличении содержания флавосемихинонов в условиях ишемии после инфузии ДНКЖ-Глт заставляют думать о том, что в этих физиологических условиях в результате введения данного препарата дыхательная цепь становилась ещё более восстановленной, по сравнению с тотальной ишемией без предварительного введения препарата.

Механизмы действия ДНКЖ на полувосстановленные формы убихинона и флавинов остаются во многом неизвестными. Тем не менее, можно предположить, что образующийся в условиях ишемии ДНКЖ эффективно перехватывает

супероксидные радикалы, образующиеся в результате взаимодействия остаточного кислорода в ткани и компонентов дыхательной цепи митохондрий. Таким образом, ДНКЖ могут препятствовать окислению цепи образующимися АФК и смещать тем самым редокс-состояние компонентов в сторону восстановления, что будет сопровождаться изменением соотношения между содержанием убисемихинона и флавосемихинонов в сторону увеличения выхода полувосстановленных форм флавинов. Кроме того, возможно также, что в условиях синтеза ДНКЖ при гиперпродуцировании N0 происходит образование нитроксильных анионов, способных восстанавливать компоненты дыхательной цепи во время ишемии. Необходимо отметить, что данные предположения нельзя рассматривать, как единственные, поскольку невозможно исключить также существования каких-то других механизмов взаимодействия парамагнитных ДНКЖ и полувосстановленных форм убихинона и флавинов в сердечной мышце.

Для регистрации кардиопротекторного действия ДНКЖ-Глт в других опытах инфузия препарата проводилась в течение первых пяти минут реперфузии после длительной тотальной ишемии. Установлено, что это существенно стимулировало восстановление сократительной функции сердца.

Для регистрации формирования и накопления связанных с белками ДНКЖ во время реперфузии проводилось замораживание сердец сразу по окончании инфузии препарата с дальнейшим их анализом методом ЭПР. На рис. 23 представлены характерные спектры ЭПР ткани миокарда, замороженного в условиях перфузии средой без ДНКЖ, а также после 5-минутной перфузии и реперфузии средой, содержащей ДНКЖ-Глт (1 мкМ).

Из этого рисунка видно, что после перфузии сердца раствором, содержащим ДНКЖ-Глт (сигнал 2), в спектре ЭПР ткани регистрировался лишь слабый сигнал связанных с белками ДНКЖ при g=2,03. Однако, в том случае, если замораживание проводилось после 5-мин реперфузии раствором, содержащим ДНКЖ-Глт, то сигнал ДНКЖ при g=2,03 был существенно больше (спектр 3). Это означало, что перенос ДНКЖ из среды перфузии в ткани миокарда и накопление этих комплексов с белковыми лигандами более эффективно происходит в ходе реперфузии, по сравнению с аэробной перфузией.

9=2,03 |

Рис. 23. Спектры замороженной

ткани

ЭПР

изолированного сердца крысы: 1-перфузия раствором Кребса-Хензелейта (К.-Х.); 2- 5-мин перфузия раствором К.-Х. + ДНКЖ-Глт (1 мкМ); 3 - 35-мин ишемия и последующая 5-мин реперфузия раствором К.-Х. + ДНКЖ-Глт (1 мкМ). Температура - жидкий азот.

320 325 330 335 340 Магнитное поле, мТл

Полученный эффект увеличения содержания связанных с белками ДНКЖ в миокарде в результате реперфузии может быть следствием их вторичного синтеза, поскольку на данной стадии опыта уровень N0 в ткани сердечной мышцы остаётся ещё повышенным. Кроме того, в условиях длительной тотальной ишемии может происходить увеличение содержания восстановленных тиольных групп в ткани миокарда, что может сохраняться также и в первые минуты реперфузии. Учитывая то, что скорость переноса Ре+(МО+)2 групп на белковые лиганды во многом определяется количеством акцепторов этих групп, содержащих тиолы, то это будет также стимулировать перенос и накопление парамагнитных ДНКЖ в ткани миокарда в начале реперфузии.

Таким образом, в результате перфузии изолированного сердца раствором, содержащим ДНКЖ-Глт, происходит перенос депонированных форм N0 в ткань и накопление его преимущественно в форме стабильных диамагнитных комплексов (вероятно, 8-нитрозотиолов), которые в результате ишемии эффективно трансформируются в связанные с белками моноядерные ДНКЖ. При введении ДНКЖ-Глт в начале реперфузии инициируется эффективное накопление связанных с белками ДНКЖ, оказывающих на сердце защитное действие, причём таким действием обладают также N0, высвобождающиеся в результате их распада.

Глава 7. Исследование динитрозильных комплексов железа, как источника N0 вне организма

В данной главе представлены результаты исследования ДНКЖ, как источника газообразного N0 при продувании воздуха через раствор этого комплекса в целях дальнейшего использования полученной воздушной среды для ингаляции крыс \Vistar. В ходе таких опытов проводились как оценка содержания N0 в воздухе после прохождения через ингалятор, так и анализ физиологического действия такой ингаляции. Мониторинг уровня N0 в воздушной среде, как и ранее, проводился путём пропускания исследуемого воздушного потока через кювету с раствором спиновой ловушки Ге3+-МС02 и последующей регистрации спиновых аддуктов N0 методом ЭПР. Установлено, что в результате прокачки воздуха через раствор ДНКЖ с тиосульфатом уровень N0 в такой воздушной среде возрастал в 45 раз.

Для избирательной оценки уровня N0 в ткани важнейших органов в контроле и его изменений в результате 30-минутной ингаляции воздухом с повышенным содержанием N0 был использован метод ЭПР с применением в качестве спиновой ловушки N0 комплексов Рс'1+-ОРТС2, способных формироваться и накапливаться в гидрофобных компартментах клеток органов. Опыты ставились на крысах \Vistar, как контрольных, так и получающих ингаляцию воздухом с повышенным содержанием N0. В результате для всех исследуемых органов животных (сердце, лёгкое, печень, почка, скелетная мышца), принадлежащих к обеим группам, по стандартной методике рассчитывали значения параметра N. характеризующие содержание в ткани спиновых аддуктов ЫО-Ре2+-ОЕТС2, образующиеся в результате взаимодействия N0 со спиновой ловушкой.

На рис. 24 представлены отношения Мишал/МКШ1|р., характеризующие для разных органов эффект ингаляции на уровень N0, включая его связанные формы. Из этого рисунка видно, что в результате ингаляции наибольшее увеличение содержания N0 регистрировалось в органах, принадлежащих малому кругу кровообращения (сердце, лёгкое), а также в печени животного, тогда как в ткани почки и скелетной мышцы данный эффект практически отсутствовал.

Кроме того, нами исследовались парамагнитные свойства цельной крови крыс, как контрольных, так и после ингаляции N0. Спектры ЭПР образцов цельной

крови, соответствующих обеим группам животных, представлены на рис. 25. Из этого рисунка видно, что в результате ингаляции в спектре ЭПР крови проявлялись слабые компоненты сигнала МО-Ре2+-ОЕТС2 (линии е, j), что свидетельствует о том, что в результате такого воздействия уровень N0 в крови также повышался, вследствие чего инициировалось их взаимодействие со спиновой ловушкой с образованием этого парамагнитного аддукта N0.

Из рис. 25 также видно, что в результате ингаляции N0 в области g=2,00 регистрировался более интенсивный свободнорадикальный сигнал (компонента БЯ), частично перекрывающийся с третьей компонентой сверхтонкой структуры сигнала Си2+-ОЕТС2 (линия с). Его возрастание в крови в результате ингаляции свидетельствовало об интенсификации свободнорадикальных процессов в крови под действием N0. Можно предположить, что в результате ингаляции происходило изменение редокс-состояния ферментов крови, что приводило к образованию и/или

накоплению интермедиатов, обладающих свободнорадикальными свойствами.

454,0 3,5

| 2,0 ■£ 1,5

1,0 (-О™ ^

0,5

о,о' шн ч| Инн и шиш шиши ш ш I

свад ШТ«ЗЕ ГЕЧЭ-Ь ПОКА П/Ы1Ц*

Рис. 24 /левая панель/. Отношения Мингал/Мконтр. для всех органов животных. Рис. 25 /правая панель/. Спектры ЭПР образцов цельной крови, полученных в конце опыта. 1 - контроль, 2 - ингаляция воздухом с повышенным содержанием N0. а, Ь, с, с1 — компоненты сигнала Си2+-ОЕТС2: е, 1', ] - компоненты сигнала ЫО-Ре2+-ОЕТС2. Температура - жидкий азот.

Таким образом, установлено, что в результате длительной ингаляции воздухом с повышенным содержанием оксида азота, полученным путём его пропускания через концентрированный раствор ДНКЖ, происходит существенное увеличение содержания N0 в гидрофобных областях клеток органов малого круга

320 325 330 335 340 Магнитное поле, мТл

кровообращения (сердце, лёгкое) и в печени, а в цельной крови в результате такого воздействия инициируется формирование стабильных интермедиатов, обладающих свободнорадикальными свойствами.

Заключение

Полученные результаты дают новые представления о физико-механических механизмах, лежащих в основе эффектов ДНКЖ с тиол-содержащими лигандами на сердечно-сосудистую систему, а также данные о физико-химических свойствах этих комплексов, определяющих эти механизмы. На рис. 26 приведена схема действия вводимых в организм ДНКЖ, представленнная автором на основании литературных данных и результатов, полученных в данной работе.

ДНКЖ с низкомолекулярным лигандом

внутривенное введение»

Моноядерные и биядерные ДНКЖ с белковыми лигандами в доови

перенос кровотс

Э-нитрозотиолы (ЯЭ-МО) с белковыми лигандами в крови

На сха/е: Х - перехват радиального ингерме д№та

-►Ре2;

ДНКЖ и Р&МОс белковыми лиганцами в хим. равновесии в ткании крови

ДНКЖ с белковыми лигандами

[^-N0 с белковыми лигандами

Белок

Ре2*(Ре3*) ♦

Пул свободного N0

N03

Пул негемово го железа и его компл.

Ферригин

интактная зона

в ткании крови втканиикрови

Белок

Пул негемовопз железа

Ферритин

Дых. цепь митохондрий (1 и III компл.)

Нитрит

^"" ИнгибироЕажеПОЛт^

02"> Х^ОЫОО" > ОН'> Х^НГ> ЬОО'(ЬО> X

ишемизируемая зона

Рис. 26. Схема регуляторного и сигнального действия ДНКЖ в организме при различных условиях кровоснабжения.

Так, известно, что физиологическое действие ДНКЖ во многом определяется способностью этих комплексов выступать в качестве доноров нейтральных молекул N0 и ионов нитрозония (ЫО+), обусловленной характерным

химическим равновесием между этими комплексами и составляющими их компонентами [(К5")2Ре+(МО+)2]+ Ре2+ + N0 + Ив" + N0+ + РОГ. При этом появляющиеся ионы нитрозония связываются с восстановлеными тиолами с образованием 8-нитрозотиолов (Г^-МО), которые по механизму Б-транс-нитрозирования осуществляют 8-нитрозирование различных тиолов.

В данной работе впервые показано, что при введении стандартного препарата ДНКЖ-Глт в условиях естественного кровоснабжения содержание связанных с белками ДНКЖ и 8-нитрозотиолов в миокарде весьма близки друг к другу. Установлено, что ДНКЖ, как источник связанных форм N0, обладает избирательным действием по отношению к миокарду, по сравнению с другими органами. При этом связанные с белками ИЗ-ЬЮ и ДНКЖ выступают в качестве депо N0, тогда как в низкомолекулярной форме эти соединения оказывают непосредственное действие на физиологические процессы, как доноры N0 и N0*. Сравнительно высокая стабильность ДНКЖ достаточна для внутри- и межклеточного переноса N0, что обеспечивает как аутокринное, так и паракринное действие этого агента. Важно отметить, что молекулы N0 не высвобождаются из этих комплексов самопроизвольно, а переходят на мишени их действия, характеризующиеся большим сродством к этим молекулам, по сравнению с ДНКЖ. В качестве таких мишеней выступают, например, гемсодержащие белки, в частности, такой фермент, как гуанилатциклаза.

Кроме того, в работе получены новые данные о том, что кардиопротекторное действие ДНКЖ достигается в результате, по крайней мере, трёх механизмов, инициирующихся после введения этого препарата в кровь. Во-первых, в организме постоянно происходит спонтанный распад ДНКЖ и других форм депонирования N0 с высвобождением свободного N0, что приводит к гипотензивному и кардиопротекторному действию. Во-вторых, в результате перехвата молекулами моноядерных ДНКЖ супероксидных радикалов достигается антиоксидантное действие этих комплексов. В-третьих, при взаимодействии ЯБ-ЫО внутри клеток со свободным железом (с ионами Ре2+) и низкомолекулярными тиолами возможен синтез новых ДНКЖ с их последующим физиологическим действием. Поэтому в результате взаимных превращений разных форм депонирования N0 возможны как высвобождение N0, так и связывание его избытка (в условиях региональной или

тотальной ишемии), что позволяет избежать как недостатка, так и гиперпродуцирования N0 в разных частях организма.

Таким образом, проведённые исследования позволяют рассматривать ДНЮК с одной стороны, как природную форму депонирования N0, а с другой, как соединение, обладающее полифункциональной активностью, и способное регулировать уровень N0 в органах, оказывать длительное и эффективное вазодилататорное, а также избирательное антиоксидантное действия при его экзогенном введении в организм.

ОБЩЕЕ РЕЗЮМЕ

Введение животным динитрозильных комплексов железа (ДНЮК) с низкомолекулярными тиольными лигандами приводит к образованию в крови и ткани органов связанных с белками Б-нитрозотиолов и ДНКЖ, находящихся в равновесии со своими низкомолекулярными аналогами. Они являются депо и переносчиками N0 и N0+ к мишеням действия. В результате этого инициируется длительный гипотензивный эффект ДНКЖ. Кардиопротекторные свойства ДНКЖ связаны с их способностью влиять на уровень N0 и активных форм кислорода, а также накапливаться в зоне ишемического повреждения.

ВЫВОДЫ РАБОТЫ

1. Установлено, что после внутривенного введения ДНКЖ с низкомолекулярными лигандами в крови в результате переноса Ре+(1\'0+)2 групп на белковые лиганды происходит образование ДНКЖ, связанных с белками. При этом в плазме ДНКЖ связываются с альбумином, а в эритроцитарной массе - с гемоглобином, причём содержание парамагнитных ДНКЖ в плазме существенно выше, чем в эритроцитах.

2. Показано, что после внутривенного введения низкомолекулярных ДНКЖ, содержание белковых ДНКЖ в цельной крови, сердце, лёгких, печени и почках сразу достигает максимального уровня и далее постепенно снижается, причём в почках этот уровень сохраняется в течение длительного времени практически неизменным. Установлено также, что в ткани сердца, лёгких и печени в результате введения ДНКЖ происходит накопление 8-нитрозотиолов, являющихся

физиологической формой депонирования N0*. Распад ДНКЖ сопровождается высвобождением N0, что вызывает длительное гипотензивное действие. Экскреция ДНКЖ не наблюдается.

3. Установлено, что в интактных условиях уровни свободного N0 в интерстиции сердца, печени и почки между собой достоверно не различаются. В результате введения препарата ДНКЖ регистрируется увеличение содержания N0 в интерстиции ткани этих органов, а также в выдыхаемом воздухе, причём степень этого увеличения приблизительно одинакова для всех исследуемых органов.

4. Установлено, что при введении низкомолекулярных ДНКЖ суммарный пул N0 (ДНКЖ, Б-нитрозотиолы, свободный оксид азота) в наибольшей степени увеличивается в сердце крысы, причём этот эффект существенно превышает рост уровня свободного N0. Напротив, при введении животным Изокета (водорастворимого аналога нитроглицерина) увеличение уровня свободного N0 в сердце существенно превышает возрастание суммарного пула оксида азота.

5. Показано, что в условиях региональной ишемии миокарда после введения связанных с глутатионом ДНКЖ образующиеся белковые ДНКЖ в ишемизируемой зоне накапливаются более эффективно, по сравнению с интактной зоной, что свидетельствует о регенерации этих комплексов в области окклюзии.

6. Установлено, что при восстановлении кровоснабжения участка сердечной мышцы ДНКЖ снижают уровень активных форм кислорода. Кардиопротекторное действие глутатионовых ДНКЖ может быть также связано с образованием новых белковых ДНКЖ в ишемизированной зоне и снижением продукции пероксинитрита в реакции свободного N0 с супероксидным анион-радикалом.

7. Показано, что в результате перфузии изолированного сердца раствором связанных с глутатионом ДНКЖ, происходит депонирование N0 в тканях преимущественно в виде 5-нитрозотиолов, причём в ходе ишемии последние трансформируются в белковые ДНКЖ, которые обладают кардиопротекторным действием.

8. Установлено, что ДНКЖ с низкомолекулярными лигандами могут являться источником газообразного N0 при продувании воздуха через водный раствор этого соединения. В результате ингаляции животных воздухом, пропущенным через данный раствор, происходит существенное увеличение содержания N0 в

гидрофобных областях клеток органов малого круга кровообращения (сердце, лёгкое), а также в печени животного.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи.

1. Тимошин А.А., Лакомкин В.Л., Рууге Э.К. Свободнорадикальные центры в ткани изолированного сердца крысы в норме, при ишемии и реперфузии. // Биофизика. 1993.-Т.38,№ 1.-С. 179-186.

2. Тимошин А.А., Цкитишвили О.В., Серебрякова Л.И., Кузьмин А.И., Медведев О.С., Рууге Э.К. Образование гидроксильных радикалов при локальной ишемии сердца собаки. // Биофизика. 1994. - Т.39, № 3. - С. 502-506.

3. Timoshin А.А., Tskitishvili O.V., Serebryakova L.I., Kuzmin A.I., Medvedev O.S., Ruuge E.K. Microdialysis study of ischemia-induced hydroxyl radicals in the canine heart. // Experientia. 1994. - V.50, № 7. - P. 677-679.

4. Тимошин A.A., Лакомкин В.Л., Рууге Э.К. Свободнорадикальные центры в ткани изолированного миокарда крысы в условиях перфузии бессубстратным раствором с нормальной оксигенацией. // Биофизика. 1996. - Т.41, № 6. - С. 1305-1308.

5. Тимошин А.А., Цкитишвили О.В., Серебрякова Л.И., Рууге Э.К. Регистрация остаточного кислорода в области региональной ишемии миокарда методом ЭПР. // Биофизика. 1999. - Т.44, № 6. - С. 914-915.

6. Timoshin А.А., Pisarenko O.I., Lakomkin V.L., Studneva I.M., Ruuge E.K. Free radical intermediates in isolated rat heart during perfusion, ischemia, and reperfusion: effect of ischemic preconditioning. // Experimental and Clinical Cardiology. 2000. - V.5, № 2. - P. 59-64.

7. Тимошин A.A., Цкитишвили O.B., Серебрякова Л.И., Рууге Э.К. Свободнорадикальные центры в ткани миокарда собаки в условиях региональной ишемии. // Биофизика. 2001. - Т.46, № 4. - С. 731-737.

8. Тимошин А.А., Орлова Ц.Р., Рууге Э.К., Ванин А.Ф. Регистрация уровня радикалов оксида азота в организме млекопитающих с использованием водорастворимых комплексов трёхвалентного железа с дитиокарбаматом. // Биофизика. 2005. - Т.50, № 3. - С. 537-543.

9. Лакомкин В.Л., Тимошин А.А., Ванин А.Ф., Капелько В.И., Чазов Е.И. Длительный гипотензивный эффект стабильных динитрозильных комплексов железа у бодрствующих нормотензивных и гипертензивных крыс. // Кардиологический вестник. 2006. - T.I(XIII), № 1. - С. 42-47.

10. Шумаев К.Б., Губкин А.А., Губкина С.А., Гудков Л.Л., Свиряева И.В., Тимошин А.А., Топунов А.Ф., Ванин А.Ф., Рууге Э.К. Взаимодействие динитрозильгых комплексов железа с интермедиатами окислительного стресса. // Биофизика. 2006. Т.51, № 3. - С. 472-477.

11. Тимошин А.А., Орлова Ц.Р., Ванин А.Ф., Санина Н.А., Рууге Э.К., Алдошин С.М., Чазов Е.И. Динитрозильные комплексы железа - новый тип гипотензивных препаратов. // Российский Химический журнал. 2007. - T.LI, № 1. - С. 88-92.

12. Timoshin А.А., Vanin A.F., Orlova Ts.R., Sanina N.A., Ruuge E.K., Aldoshin S.M., Chazov E.I. Protein-bound dinitrosyl-iron complexes appearing in blood of rabbit added with a low-molecular dinitrosyl-iron complex: EPR studies. // Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 2007. - V.16, № 2. - P. 286-293.

13. Lakomkin V.L., Vanin A.F., Timoshin A. A., Kapelko V.I., Chazov E.I. Long-lasting hypotensive action of stable preparations of dinitrosyl-iron complexes with thiol-containing ligands in conscious normotensive and hypertensive rats. // Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 2007. - V.16, № 4. - P. 413-418.

14. Шумаев К.Б., Ванин А.Ф., Лакомкин В.Л., Мох В.П., Серебрякова Л.И., Цкитишвили О.В., Тимошин А.А., Максименко А.В., Писаренко О.И., Рууге Э.К., Капелько В.И., Чазов Е.И. Участие активных форм кислорода в модуляции гипотензивного эффекта динитрозильных комплексов железа. // Кардиологический вестник. 2007. - T.II(XIV), № 2. - С. 31-37.

15. Shumaev К.В., Kosmachevskaya O.V., Timoshin А.А., Vanin A.F., Topunov A.F. Dinitrosyl iron complexes bound with haemoglobin as markers of oxidative stress. II Methods in Enzymology. 2008. - V.436, Part A. - P. 445-461.

16. Serezhenkov V.A., Timoshin A.A., Orlova Ts.R., Mikoyan V.D., Kubrina L.N., Poltorakov A.P., Ruuge E.K., Sanina N.A., Vanin A.F. Decomposition of water-soluble mononitrosyl iron complexes with dithiocarbamates and of dinitrosyl iron complexes with thiol ligands in animal organism. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 2008. -V.18. - P. 195-203.

17. Тимошин A.A., Цкитишвили O.B., Дроботова Д.Ю., Студнева И.М., Серебрякова Л.И., Рууге Э.К., Писаренко О.И. Взаимосвязь образования оксида азота с повреждениями кардиомиоцитов при региональной ишемии и реперфузии сердца крысы. // Биофизика. 2008. - Т.53, № 4. - С. 679-683.

18. Timoshin А.А., Drobotova D.Yu., Lakomkin V.L., Ruuge E.K., Vanin A.F. Estimation of nitric oxide level in vivo by microdialysis with water-soluble iron-N-methyl-D-dithiocarbamate complexes as NO traps: A novel approach to nitric oxide spin trapping in animal tissues. II Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 2008. - V.19, № 4. -P. 338-344.

19. Лакомкин В.Л., Тимошин A.A., Орлова Ц.Р., Губкина С.А., Старожилова А.Н., Гвоздик Т.Е., Добровольский А.Б., Рууге Э.К., Ванин А.Ф., Капелько В.И., Лапин Б.А., Чазов Е.И. Действие динитрозильного комплекса железа с глутатионом -донора оксида азота - на систему кровообращения крыс и обезьян. // Кардиология. 2009. - Т.49, № 5. - С. 53-60.

20. Тимошин А.А., Губкина С.А., Орлова Ц.Р., Рууге Э.К., Ванин А.Ф., Чазов Е.И. Исследование уровня оксида азота в ткани органов крыс и его изменений в результате длительной ингаляции воздухом с повышенным содержанием NO. // Доклады Академии Наук (Раздел - "Биофизика"). 2009. - Т.425, № 5. - С. 696-700.

21. Писаренко О.И., Шульженко B.C., Студнева И.М., Пелогейкина Ю.А., Тимошин А.А., Ванин А.Ф. Влияние препарата динитрозильного комплекса железа с глутатионом и его компонентов на ишемизированное сердце крысы при реперфузии. // Биофизика. 2009. - Т.54, № 6. - С. 1081-1087.

22. Тимошин А.А., Дроботова Д.Ю., Цкитишвили О.В., Серебрякова Л.И., Писаренко О.И., Рууге Э.К., Ванин А.Ф. Защитное действие динитрозильных комплексов железа с глутатионом в условиях региональной ишемии миокарда крыс: исследование методом микродиализа. // Доклады Академии Наук (Раздел "Биофизика"). 2010. - Т.432, № 3. - С. 416-419.

23. Тимошин А.А., Дроботова Д.Ю., Лакомкин В.Л., Рууге Э.К., Ванин А.Ф. Влияние экзогенных доноров на уровень оксида азота в органах животных in vivo: исследование методом микродиализа с использованием спиновых ловушек. //

Сборник статей "Проблемы биологической физики" (Под ред. В.А.Твердислова). Издательство "УРСС". Москва. 2010. - С. 107-124.

24. Тимошин А.А., Писаренко О.И., Цкитишвили О.В., Серебрякова Л.И., Студнева И.М., Дроботова Д.Ю., Рууге Э.К., Ванин А.Ф. Динитрозильные комплексы железа с глутатионом в ткани миокарда крысы в условиях регионального нарушения и восстановления кровоснабжения сердечной мышцы. // Биофизика. 2010. - Т.55, № 6. - С. 1099-1107.

25. Vanin A.F., Timoshin А.А. Determination of in vivo nitric oxide levels in animal tissues using a novel spin trapping technology. // Methods in Molecular Biology. Humana Press. New York. 2011. - V.704. - P. 135-149.

26. Remizova M.I., Kochetygov N.I., Gerbout K.A., Lakomkin V.L., Timoshin A.A., Burgova E.N., Vanin A.F. Effect of dinitrosyl iron complexes with glutathione on hemorrhagic shock followed by saline treatment. // European Journal of Pharmacology. 2011. -V.662,№ 1-3.-P. 40-46.

27. Чазов Е.И., Родненков O.B., Зорин А.В., Лакомкин В.Л., Грамович В.В., Выборов О.Н., Драгнев А.Г., Тимошин А.А., Бурячковская Л.И., Абрамов А.А., Добровольский А.Б., Максимов Г.В., Масенко В.П., Арзамасцев Е.В., Капелько В.И., Ванин А.Ф. Испытание гипотензивного действия препарата "Оксаком", содержащего динитрозильный комплекс железа с глутатионом, на здоровых добровольцах. // Кардиология. 2011. - Т.51, № 11. - С. 39-48.

28. Тимошин А.А., Лакомкин В.Л., Рууге Э.К., Ванин А.Ф. Фармакокинетика и распределение динитрозильных комплексов железа в тканях органов крыс. // Биофизика. 2012. - Т.57, № 2. - С. 331-337.

29. Chazov E.I., Rodnenkov O.V., Zorin A.V., Lakomkin V.L., Gramovich V.V., Vyborov O.N., Dragnev A.G., Timoshin A.A., Buryachkovskaya L.I., Abramov A.A., Massenko V.P., Arzamastsev E.V., Kapelko V.I., Vanin A.F. Hypotensive effect of Oxacom® containing a dinitrosyl iron complex with glutathione: Animal studies and clinical trials on healthy volunteers. // Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 2012. -V.26,. № 3. - P. 148-156.

Тезисы докладов.

Основные результаты работы представлены также в тезисах докладов российских (7 тезисов) и международных симпозиумов (25 тезисов), опубликованных в трудах конференций или в специальных выпусках журналов.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АД - артериальное давление; АФК - активные формы кислорода; ДНКЖ-динитрозильные комплексы железа; ДНКЖ-Глт - динитрозильные комплексы железа с лигандом глутатионом; ЗР - зона риска; ИЗ - интактная зона; ИМ -инфаркт миокарда; ЛЖ - левый желудочек; ПНА - передняя нисходящая коронарная артерия; ПОЛ - перекисное окисление липидов; СТС - сверхтонкая структура; ЧСС - частота сердечных сокращений; BSA - бычий сывороточный альбумин; DETC - диэтилдитиокарбамат; DMPO - 5,5 - диметил-1-пирролин^-оксид; MGD - N-метил- D, L -глюкамин дитиокарбамат; NOS - NO синтаза.

Подписано в печать. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 150 экз. Заказ №0842 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-т, д.28 Тел. 8(495)782-88-39

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Тимошин, Александр Анатольевич, Москва

ФГБУ "Российский кардиологический научно-производственный комплекс" Министерства здравоохранения и социального развития Российской федерации

На правах рукописи

ТИМОШИН Александр Анатольевич

ПРЕВРАЩЕНИЯ ДИНИТРОЗИЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЖЕЛЕЗА В ОРГАНИЗМЕ И ИХ ДЕЙСТВИЕ НА СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТУЮ

СИСТЕМУ

03.01.02 - биофизика ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени доктора биологических наук

Научный консультант доктор биологических наук, профессор

Ванин Анатолий Фёдорович

Москва-2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...........................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................7

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................................9

1.1. Оксид азота, его образование, физико-химические свойства и роль в организме......................................................................................................................9

1.2. Дихотомическое действие N0 в условиях естественного кровоснабжения и при его нарушениях...................................................................................................20

1.3. Методы регистрации содержания N0 в организме.........................................35

1.4. Динитрозильные комплексы железа и S-нитрозотиолы как физиологические формы депонирования N0........................................................................................42

1.5. Постановка задачи...............................................................................................61

Глава 2. МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА...............................................................65

2.1. Реагенты...............................................................................................................65

2.2. Экспериментальные животные..........................................................................69

2.3. Влияние ДНКЖ на сократительную активность и парамагнитные центры изолированных перфузируемых сердец крыс.........................................................69

2.4. Изучение динитрозильных комплексов железа в крови, а также уровня N0 в условиях in vivo и его изменений в результате введения доноров N0.................75

2.5. Исследование действия ДНКЖ в условиях естественного кровообращения.........................................................................................................78

2.6. Исследование кардиопротекторного действия ДНКЖ в условиях нарушения и восстановления кровоснабжения in situ................................................................84

2.7. Исследование ДНКЖ, как источника N0 вне организма................................90

2.8. Статистический анализ.......................................................................................91

Глава 3. ИЗУЧЕНИЕ ЭКЗОГЕННЫХ ДИНИТРОЗИЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЖЕЛЕЗА В КРОВИ ЖИВОТНЫХ В УСЛОВИЯХ IN VIVO.................................................................................................................................92

3.1. Цель и задачи раздела.........................................................................................92

3.2. Сигналы ЭПР ДНКЖ в модельных системах, а также в венозной крови.....93

3.3. Влияние комплексов ионов железа и ]Ч-метил-0,Ь-глю камин дитиокарбамата (Fe3+-MGD2) на ДНКЖ в крови кролика....................................105

3.4. Исследование уровня NO в организме с помощью вводимых внутривенно комплексов Fe3+-MGD2............................................................................................109

3.5. Образование биядерных ДНКЖ в цельной крови in vivo.............................119

3.6. Обсуждение результатов..................................................................................122

3.7. Выводы раздела.................................................................................................124

Глава 4. ДИНИТРОЗИЛЬНЫЕ КОМПЛЕКСЫ ЖЕЛЕЗА, КАК ДОНОРЫ NO В УСЛОВИЯХ ЕСТЕСТВЕННОГО КРОВОСНАБЖЕНИЯ ОРГАНИЗМА...125

4.1. Цель и задачи раздела.......................................................................................125

4.2. Регистрация гипотензивного эффекта у нормотензивных и гипертензивных крыс...........................................................................................................................126

4.3. Влияние ДНКЖ на уровень NO в интерстиции ткани органов in situ.........129

4.4. Фармако кинетика и тканевое распределение ДНКЖ в условиях естественного кровоснабжения..............................................................................146

4.5. Влияние введения ДНКЖ с глутатионом на уровень N0 в липофильных областях ткани органов............................................................................................158

4.6. Обсуждение результатов..................................................................................163

4.7. Выводы раздела.................................................................................................167

Глава 5. ЗАЩИТНОЕ ДЕЙСТВИЕ ДИНИТРОЗИЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЖЕЛЕЗА В УСЛОВИЯХ РЕГИОНАЛЬНОЙ ИШЕМИИ И РЕПЕРФУЗИИ МИОКАРДА..................................................................................................................169

5.1. Цель и задачи раздела.......................................................................................169

5.2. Регистрация ишемии и ишемических повреждений ткани в зоне окклюзии...................................................................................................................172

5.3. Регистрация защитного действия ДНКЖ-Глт в условиях региональной ишемии......................................................................................................................174

5.4. Влияние ДНКЖ-Глт на уровни N0 и активных форм кислорода в сердечной мышце в условиях региональной ишемии и реперфузии миокарда...................178

5.5. Содержание ДНКЖ в крови и ткани органов в условиях окислительного стресса.......................................................................................................................187

5.6. Обсуждение результатов..................................................................................193

5.7. Выводы раздела.................................................................................................199

Глава 6. ИССЛЕДОВАНИЕ СОКРАТИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ И ПАРАМАГНИТНЫХ ЦЕНТРОВ ИЗОЛИРОВАННОГО СЕРДЦА КРЫСЫ, ПЕРФУЗИРУЕМОГО РАСТВОРОМ, СОДЕРЖАЩИМ ДИНИТРОЗИЛЬНЫЕ КОМПЛЕКСЫ ЖЕЛЕЗА...........................................................................................201

6.1. Цель и задачи раздела.......................................................................................201

6.2. Исследование физиологической активности и парамагнитных центров изолированных сердец, перфузируемых раствором, содержащим ДНКЖ........204

6.3. Исследование физиологической активности и свободнорадикальных центров изолированных сердец, перфузируемых раствором, не содержащим ДНКЖ........................................................................................................................217

6.4. Защитное действие ДНКЖ с глутатионом в ходе постишемической реперфузии................................................................................................................226

6.5. Обсуждение результатов..................................................................................231

6.6. Выводы раздела.................................................................................................235

Глава 7. ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНИТРОЗИЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ ЖЕЛЕЗА, КАК ИСТОЧНИКА N0 ВНЕ ОРГАНИЗМА.........................................................237

7.1. Цель и задачи раздела.......................................................................................237

7.2. Оценка уровня N0 в среде ингаляции............................................................238

7.3. Влияние длительной ингаляции воздухом с высоким содержанием оксида азота на уровень N0 в ткани разных органов животного....................................238

7.4. Влияние длительной ингаляции воздухом с высоким содержанием N0 на парамагнитные центры в крови животного...........................................................241

7.5. Выводы раздела.................................................................................................243

ЗАКЛЮЧЕНИЕ........................................................................................................245

ВЫВОДЫ......................................................................................................................252

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................................254

ПУБЛИКАЦИИ АВТОРА /по теме диссертации/................................................288

Статьи........................................................................................................................288

Тезисы докладов.......................................................................................................292

БЛАГОДАРНОСТИ....................................................................................................298

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АВ - аортальный выброс;

АВЛ - аппарат для вентиляции лёгких;

АД - аортальное давление;

АДср. - среднее аортальное давление;

АТФ - аденозин 3-фосфорная кислота;

АФК - активные формы кислорода;

ДНКЖ - динитрозильные комплексы железа;

ДНКЖ-Глт - динитрозильные комплексы железа с лигандом глутатионом;

ДНКЖ-Тс - динитрозильные комплексы железа с лигандом тиосульфатом;

ДНКЖ-Цис - динитрозильные комплексы железа с лигандом цистеином;

ЗР - зона риска;

ИЗ - интактная зона;

ИМ - инфаркт миокарда;

ИРС - индекс работы сердца;

ИСФ - интенсивность сократительной функции;

КДД - конечно-диастолическое давление;

Кр - креатин;

£Кр - содержание общего креатина (фосфокреатина + креатина);

ЛДГ - лактатдегидрогеназа;

ЛЖ - левый желудочек;

ЛНП - липопротеиды низкой плотности;

ЛПС - липополисахариды;

МВ-КК - МВ-фракция креатинкиназы;

МО - минутный объём;

ПНА - передняя нисходящая коронарная артерия;

ПОЛ - перекисное окисление липидов;

раствор К.-Х. - раствор Кребса-Хензелейта;

РД - развиваемое давление;

СД - систолическое давление;

СОД - супероксиддисмутаза;

СТС - сверхтонкая структура;

ФАД - флавинадениннуклеотид; ФКр - фосфокреатин;

цГМФ - циклический гуанозин - 3', 5' - монофосфат;

ЧСС - частота сердечных сокращений;

ЭПР - электронный парамагнитный резонанс;

BSA - бычий сывороточный альбумин;

DETC - диэтилдитиокарбамат;

DMPO - 5,5-диметил-1-пирролин-Ы-оксид;

+dp/dt - скорость сокращения сердца;

-dp/dt - скорость расслабления сердца;

eNOS - эндотелиальная N0 синтаза;

Hb - гемоглобин;

iNOS - индуцибельная N0 синтаза;

L-NAME - метиловый эфир Мщ-нитро-Ь-аргинина;

L-NMMA - №-метил-Ь-аргинина;

MGD - N-метил-О, L-глюкаминдитиокарбамат;

mNOS - митохондриальная N0 синтаза;

nNOS - нейрональная N0 синтаза;

NOS - N0 синтаза;

РТЮ - 2-фенил-4, 4, 5, 5-тетраметил-имидазолин-1-оксил-3-оксид.

ВВЕДЕНИЕ. Актуальность проблемы.

Как показано многими авторами, одним из основных факторов, приводящих к существенным и необратимым повреждениям ткани, в таких условиях является окислительный стресс, вызванный генерацией большого количества короткоживущих высокотоксичных кислородных радикалов. Поэтому в клинической практике широко применяются препараты, оказывающие вазодилататорное действие, способное восстанавливать нарушенное кровоснабжение ткани органов. Кроме того, для уменьшения уровня кислородных радикалов, возникающих в ходе восстановления кровоснабжения ишемизированной области, а также снижения их повреждающего действия, широко применяются также препараты, способные подавлять образование кислородных радикалов, осуществлять перехват этих высокотоксичных соединений, а также нейтрализовывать их токсичные вторичные продукты, терминируя процессы перекисного окисления липидов.

К настоящему времени хорошо известно, что такое соединение, как оксид азота (N0), в организме является эндогенным вазодилататором, регулирующим тонус сосудов, способным также оказывать антиоксидантное действие, перехватывая кислородные радикалы и нейтрализуя радикальные формы липидов, образующихся в ходе перекисного окисления липидов. Поэтому в клинической практике для профилактики и лечения последствий ишемических повреждений ткани органов широко применяются препараты, являющиеся источником оксида азота (N0) в организме.

Тем не менее, N0, как высокоактивное соединение, обладает хорошо выраженным дихотомическим действием, и гиперпродуцирование N0 может вызывать отрицательный и даже токсичный эффект. Однако, в организме основная часть пула N0 присутствует в связанной форме, формируя квазистабильные нетоксичные комплексы, что способно существенно уменьшать неблагоприятное действие избытка N0.

Исследование таких комплексов, содержащих N0 в депонированной форме, представляет собой актуальную научную проблему, причём сразу по нескольким причинам. Во-первых, это связано с тем, что накопление и перенос N0 к мишеням действия осуществляют именно стабилизированные комплексы N0, поэтому их свойствами во многом определяются содержание N0 в разных органах и/или их участках. Во-вторых, такие формы депонирования N0 обладают собственной метаболической активностью, а также способны мигрировать и накапливаться в разных областях организма, что является одним из факторов избирательности их действия на разные органы и/или их участки. В-третьих, в связи с тем, что эти комплексы являются природными формами связывания N0, возможно их применение в качестве эффективных и безопасных лекарственных препаратов -доноров N0, обладающих гипотензивным и антиоксидантным действием.

Поэтому исследование различных физиологических комплексов, содержащих депонированный N0, а также их взаимных превращений, является актуальной проблемой и неотъемлемой частью изучения роли и механизмов действия N0 в организме млекопитающих при различных условиях кровоснабжения органов и/или их участков.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ.

1.1. Оксид азота, его образование, физико-химические свойства и роль в организме

Данная диссертационная работа посвящена исследованию оксида азота (N0), а также его физиологических форм и метаболитов в организме животных, причём в условиях как нормального кровоснабжения, так и при его нарушениях.

Хорошо известно, что оксид азота - парамагнитный низкомолекулярный газ, молекулы которого имеют неспаренный электрон на внешней разрыхляющей я-орбитали. Он играет важную роль во многих метаболических и физиологических процессах в организме [Ignarro, 2000]. В 1998 году трое американских учёных -Р.Фурчготт (R.Ffurchgott), Л.Игнарро (L.Ignarro), и Ф.Мурад (F.Murad) были удостоены Нобелевской премии в области физиологии и медицины за выяснение роли N0 как сигнальной молекулы в регуляции сердечно-сосудистой системы [Марков, 2011].

Физико-химические свойства NO во многом определяются способностью атомов азота окисляться и восстанавливаться в разных соединениях, при этом степень их окисленности может изменяться от -3 до +5. В результате наличия неспаренного электрона молекулы N0 обладают высокой реакционной способностью в отношении как других радикалов, так и нерадикалов. Так, при взаимодействии NO с молекулярным кислородом константа скорости реакции составляет 6><106 M'V1 [Inoue et al., 2003], a с супероксидом уже 6,7* Ю9 M'V1 [Осипов и др., 2007]. Известно, что NO является относительно стабильным соединением, его среднее время жизни в физиологическом растворе составляет 530 с [Голиков, 2004], в биологических тканях - 5,6 с [Kikuchi et al., 1993]. Характерно, что в печени и миокарде оно существенно короче, и составляет всего 0,1 с [Thomas et al., 2001], что свидетельствует о наиболее интенсивном метаболизме NO в этих органах. Необходимо отметить, что среднее время жизни этих молекул обычно существенно зависит от их концентрации [Wink and Mitchell, 1998].

Хорошо известно, что ферментативное образование N0 в организме животных и человека происходит в цикле мочевины путём превращения Ь-аргинина в Ь-цитруллин, с участием двух атомов кислорода. Схема ферментативного образования N0 представлена на рис. 1.1.

HpN

H-N

>=NH

L-arginine

H2N

н2о

H-N

>=NOH

H2N—< NADPH NAD+

H2N

L-N -hydroxyarginine

0.5 NADPH

.0=0

н2о

N=0

Рис. 1.1. Схема ферментативного образования NO.

Такая реакция проходит при участии трёх изоформ фермента NO-синтазы (NOS) - индуцибельной, эндотелиальной и нейрональной NOS. По своим физико-химическим свойствам и характеру действия эти ферменты разделяются на два класса:

1) кальций- и кальмодулин-зависимые, конститутивно экспрессируемые NO-синтазы, разделяемые на нейрональную (тип I) и эндотелиальную (тип III)

изоформы. Нейрональная (nNOS) экспрессируется в астроцитах, нейронах, и мышечных клетках скелетной мускулатуры. Эндотелиальная NO-синтаза (eNOS) экспрессируется в эндотелиальных и гладкомышечных клетках. Эти ферменты стимулируются физиологическими факторами или через рецепторы; 2) кальций-независимые, к которым относится индуцибельно экспрессируемая NO-синтаза (тип II). Этот фермент присутствует в макрофагах, гепатоцитах, фибробластах, миоцитах, его активность также выявляется в различных тканях, при активации транскрипции фермента цитокинами синтез N0 возрастает в десятки раз и максимальных значений достигает через часы [Moneada et al., 1991].

Нейрональная и эндотелиальная NO-синтазы обладают низким выходом N0 (пикомолярный диапазон), а индуцибельная NO-синаза является Са-независимой формой с относительно большим выходом N0 (наномолярный диапазон) [Rakhit and Marber, 2001]. В процессе ферментативного синтеза N0 с участием NO-синтаз скорость образования продукта во многом определяется содержанием субстратов, какими являются L-аргинин и кислород [Alvarez, et al., 2003].

Известно, что некоторые домены эндотелиальной N0 синтазы могут быть ассоциированы с плазматическими мембранами, при этом индуцибельные изоформы чаще всего растворимые, а нейрональные являются связанными с Са2+ -регулируемыми белками сарколеммы или саркоплазматического ретикулума [Massion et al., 2003]. По данным других авторов, основное место локализации NO-синтаз - микросомы, однако ферменты выделяются также в митохондриях клеток млекопитающих. Анализ распределения специфических антител бычьей эндотелиальной NO-синтазы показал, что более 80% этих ферментов локализовано в мембранной фракции, содержащей митохондрии и микросомы [Guilivi et al., 1998]. Анализ продукции NO в гомогенатах и субмитохондриальных частицах позволил утверждать, что NO-синтаза локализована преимущественно во внутре�

Информация о работе

Тимошин, Александр Анатольевич
доктора биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.02

Диссертация

Превращения динитрозильных комплексов железа в организме и их действие на сердечно-сосудистую систему - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы