Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поведенческий анализ серотонин истощающего эффекта хлорпромазина

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Поведенческий анализ серотонин истощающего эффекта хлорпромазина"

ч

5?

&?

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

, ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н.К. КОЛЬЦОВА

Со

На правах рукописи УДК 615.214: [577.175.823: 594.381.5]

ХАБАРОВА Марина Юрьевна

Поведенческий анализ серотонин-истощаюшего эффекта хлорпромазнна

03.00.13. - физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1998.

Работа выполнена в лаборатории сравнительной физиологии

Института биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук.

Научные руководители:

академик РАЕН, доктор биологических наук Д.А. Сахаров; кандидат биологических наук Е.Е. Воронежская

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Б.Н. Манухин доктор биологических наук Б.А. Шишов

Ведущее учреждение:

Защита диссертации состоится 15 апреля 1998 года в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.85.01. при Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: г. Москва, ул. Вавилова 26

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

НИИ физико-химической биологии им. А.М. Белозерского

Автореферат разослан_марта 1998 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Е.В. Волина

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Настоящее диссертационное исследование посвящено одной из актуальных проблем, стоящих перед психофармакологией, - механизму действия лекарственных средств, которые в англоязычной литературе обычно обозначаются термином антипсихотики, а в русскоязычной - нейролептики. Прошло более 40 лет с тех пор, как НЛ (список сокращений С. 4) начали с успехом применяться в психиатрической клинике, но природа их эффективности до сих пор остается нераскрытой. Этим, несомненно, затрудняется поиск новых, еще более эффективных препаратов.

Наиболее популярная, т.н. дофаминовая, гипотеза связывает терапевтический эффект НЛ с тем, что они блокируют дофаминовые рецепторы, снижая тем самым патологически повышенный тонус ДА-ергической системы мозга (Seeman et al., 1975, 1976; Grace, 1991, 1992; Leysen et al., 1993). Однако на пути дофаминовой гипотезы и ее позднейших модификаций стояла и стоит непреодолимая трудность: для блокирования рецепторов требуются минуты, а для изменения поведения больных - недели.

В ходе исследований коллектива Лаборатории сравнительной физиологии ИБР РАН был обнаружен ранее не известный способ действия НЛ - способность существенно снижать содержание ДА и/или 5-НТ в нервной ткани (Baker et al., 1995; Sakharov et al., 1996). Основные эксперименты проводились на далеких от человека модельных объектах (моллюски, аннелиды), но результаты экспериментов позволили сформулировать рабочую гипотезу, приложимую к клинической психофармакологии.

Непреходящая ценность сравнительно-физиологического подхода подтверждается всем прошлым опытом физиологии и фармакологии нервной системы, ведь именно использование беспозвоночных модельных объектов позволило обнаружить и доказать нейротрансмиттерную функцию таких важнейших сигнальных молекул, как 5-НТ, ДА, глутамат и ГАМ К. Также и при постановке задач данного диссертационного исследования имелось в виду, что результаты, полученные на модельном

беспозвоночном объекте, станут важным аргументом в пользу нового представления о механизме терапевтического действия НЛ.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью диссертационного исследования было ответить на два вопроса:

(1) какие компоненты поведения и как меняются при хроническом действии срг и

(2) соответствуют ли наблюдающиеся изменения поведения предположению, что их причиной является снижение активности 5-НТ-ергической системы.

При проведении поведенческих экспериментов в качестве простого модельного объекта исследования использовали пресноводного легочного моллюска - большого прудовика.

Конкретными задачами экспериментов было проанализировать изменения поведения прудовика при действии следующих веществ: СР2, 5-НТ и его биохимических предшественников: 5-НТР и Т.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. В работе разработана тест-система анализа поведения пресноводных легочных моллюсков. Использование метода поведенческого анализа впервые позволило четко показать нейротрансмиттер-ную направленность действия СРг на поведение, динамику развития этих поведенческих эффектов. Проведенный поведенческий анализ показал, что хроническое воздействие СРг направлено преимущественно или исключительно на 5-НТ-зависимые формы поведения, которые меняются так, как если бы имело место снижение активности 5-НТ-ергических нейронов. Впервые показано, что изменения поведения, вызванные влиянием хронического СРг, частично или полностью компенсируются введением животному 5-НТ и/или его метаболических предшественников. Вызванные длительным воздействием С?Х изменения в поведении обратимы и, по-видимому, не являются следствием прекращения функционирования механизмов, ответственных за утилизацию метаболических предшественников, синтез и высвобождение нейронального 5-НТ,

Согласно ранее выдвинутой гипотезе, в основе терапевтического действия НЛ на поведение больных лежит способность этих лекарственных препаратов существенно снижать уровень нейрональных МА в патологически измененных участках ЦНС. Результаты проведенных экспериментов впервые показали, что именно такую основу имеет влияние СР2 на поведение модельного животного. Таким образом, примененные впервые методы фармакологии поведения позволили получить важные аргументы в пользу новой гипотезы о способе действия НЛ.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Практическое значение работы состоит, прежде всего, в перспективе клинического применения новых представлений, достоверность которых подтверждена проведенным исследованием. Кроме того, открывается возможность использования разработанной тест-системы оценки поведенческого состояния модельных моллюсков в экспериментах по тестированию различных фармакологических препаратов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные материалы диссертации докладывались на молодежных конференциях ИБР им. Н.К. Кольцова (1995, 1997), на 4-ой и 5-ой конференциях Международного общества нейро-биологии беспозвоночных (ШМ) "Простые нервные системы" (Пущино, 1994; Москва, 1997).

Работа выполнена при поддержке Российского Фонда Фундаментальных исследований (проект №96-04-49181) и гранта 1ЫТАЭ-93-3504.

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и тезисы 2 докладов.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы с изложением материала и методов исследования, главы результатов и их обсуждения (5 разделов), заключения, выводов и списка литературы. Изложена страницах машинописного текста, иллюстрирована 28 рисунками. Список литературы содержит/^источника.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

Галоперидол - HAL.

Гамма-аминомасляная кислота-ГАМК.

5-Гидрокситриптофан - 5-НТР.

Дезоксифенилаланин-ДОФА.

Дофамин - ДА.

Моноамины - МА.

Нейролептики - HJI.

Серотонин - 5-НТ.

Триптофан - Т.

Хлорпромазин (аминазин) - CPZ. Центральная нервная система - ЦНС.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Объект исследования. В качестве объекта исследования использовали половозрелых и развивающихся особей пресноводного легочного моллюска - большого прудовика, Lymnaea stagnalis (Mollusca, Pulmonata, Basomma-tophora). Использовали однородных по весу и размеру особей. Моллюсков содержали в аквариумах с отстоенной водопроводной водой, из расчета не менее 100 мл воды на одну особь, при комнатной температуре. Смена воды и кормление проводили ежедневно. Световой режим не контролировался, искусственная аэрация отсутствовала. Кладки с зародышами получали от половозрелых животных аквариальной линии. Каждая кладка помещалась в отдельную емкость с отстоенной водой. Для работы с эмбрионами разных стадий развития оболочку кладки вскрывали и отдельные яйца (по 10 штук) помещали в чашки Петри с отстоенной водой (5 мл). Смена воды, световой, температурный и аэрационный режимы были такие же, как и для взрослых животных.

Методика поведенческих экспериментов на половозрелых Lymnaea stagnalis. В стандартном эксперименте по изучению действия CPZ для регистрации изменений в поведении моллюсков по 5-6 особей помещали в

стеклянный плоскодонный кристаллизатор, заполненный двумя литрами воды, полностью покрывающей животных. После адаптации улиток к новым условиям, когда моллюск выдвигал тело из раковины и начинал свободно перемещаться по дну кристаллизатора, изменения в поведении регистрировали визуально и/или с помощью видеокамеры (JVC GR-IX66).

Локомоторная активность. Регистрировали скорость локомоции моллюсков (см/мин). При визуальном определении скорости под дно кристаллизатора, где перемещались моллюски, помещался лист масштабно-координатной бумаги, и фиксировались только прямолинейные отрезки движения в течение 3-х минут.

При видеорегистрации локомоторная активность моллюсков в течение 10 минут записывалась видеокамерой и транслировалась на экран монитора. С экрана индивидуальные пути движения животных, "треки", переносились на прозрачные пленки, а затем на бумагу, и обрабатывались.

Дыхательное поведение. Регистрировались два параметра респираторного поведения: число открытий дыхательного отверстия (пневмостома) в минуту и продолжительность открытия пневмостома в секундах. Частота открытия пневмостома регистрировалась при помощи видеокамеры, а продолжительность таких эпизодов - при визуальном наблюдении.

Защитное поведение. Регистрировались формы ответных реакций моллюсков на тактильное раздражение. Для определения тактильных реакций касались препаровальной иглой кончика щупальца, нанося 10 раздражений с интервалом 15 секунд. Такое раздражение вызывает у животного различные формы ответных реакций, которые по силе проявления защитного поведения можно расположить следующим образом: втягивание тела в раковину, ретракция раздражаемого щупальца, отсутствие реакции. Определялось среднее значения (в %) каждой формы ответной реакции. При видеорегистрации также учитывали проявление защитного поведения животных - количеством реакций втягивания тела в раковину в минуту. Данная реакция может проявляться моллюсками как спонтанно,

без видимых раздражений, так и быть вызванной столкновениями животных при движении.

Количество съеденной моллюсками пиши в ходе экспериментов определяли по разнице между весом предложенной пищи до и после 6 часов кормления животных.

Фармакологические воздействия. По результатам проведенных ранее экспериментов было установлено, что хронический CPZ одинаково снижает содержание 5-НТ как в условиях инкубации прудовиков в водном растворе, так и при инъецировании (Sakharov et al., 1996). Это позволило нам использовать более простой и нетравмирующий животных метод инкубации. В поведенческих опытах и при изучении влияния CPZ на процесс откладки яиц взрослых природных и аквариальных улиток содержали в водных растворах CPZ (то есть в условиях иммерсии), при смене растворов каждые 24 часа. В поведенческих экспериментах концентрация CPZ была 1 мкмоль/л, а при изучении процесса откладки яиц и эмбриогенеза - 0,5, 1 и 2 мкмоль/л.

Остальные вещества растворяли в физиологическом растворе и инъецировали в гемоцель в объеме 50 мкл. Физиологический раствор для большого прудовика имел следующий состав: NaCl - 50мМ, КС1 - 1,6мМ, СаС12 - 4мМ, MgCl2 - 8мМ, и фосфатный буфер - ЮмМ.

В работе использованы следующие вещества (все фирмы "Sigma"): CPZ (chloipromazine hydrochloride), 5-HT (5-Hydroxytryptamine hydrochloride,), метаболические предшественники 5-HT: 5-HTP (5-Hydroxy-L-tryptophan) и T (L-tryptophan). Все конечные дозы выражались в мкг/г веса улитки.

Параметры поведения животных до инъекции считались исходными (начальными). После инъекции животных помещали во влажную камеру на 10 минут, затем перемещали в кристаллизатор для последующей видеорегистрации поведения. Определяли: (1) скорость локомоции (см/мин); (2) частоту открытия пневмостома в мин. и (3) число реакций втягивания тела в раковину в мин.

Наблюдения за формированием и развитием яиц. Кладки, отложенные моллюсками, собирались и рассматривались под бинокуляром. При этом учитывали: (1) число отложенных яйцевых капсул; (2) число отложенных кладок; (3) отношение числа яйцевых капсул к числу кладок, т.е. средний размер кладки. Учитывались и нарушения в процессе инкапсуляции яиц, а именно: наличие и число зародышей вне яйцевых капсул, число пустых капсул, полиэмбриония (наличие более одного зародыша в яйце).

Исследовали влияние разных концентраций CPZ на развитие зародышей. С этой целью инкубировали яйцевые капсулы, освобожденные от оболочки кладки, начиная со следующих стадий эмбриогенеза: Е18 (гаструла), ЕЗО (ранний велигер), Е50 (начало метаморфоза) и Е100 (непосредственно перед вылуплением) (стадии развития указаны по Raven, 1966). Наблюдение за развитием проводилось визуально под бинокуляром. Определяли для каждой из этих стадий концентрацию CPZ, дающую 50%-ную смертность эмбрионов в первые сутки инкубации.

Объем экспериментального материала. С учетом предварительных экспериментов общее число животных (интактные и при воздействовии CPZ), у которых регистрировались параметры поведения, составило 328. Для определения действующей концентрации CPZ было исследовано по 100 яйцевых капсул каждой стадии развития. Влияние 5-НТ и его биохимических предшественников было исследовано на 135 интактных и 85 опытных животных. Общее число животных, на которых исследовалось действие 5-НТ и его предшественников, с учетом предварительных экспериментов, составило 445 особей.

Обработка результатов. Эксперименты с видеорегистрацией поведения проводили двойным слепым методом. Результаты обрабатывали на IBM РС586 с использованием программы STATISTICA. Все оцениваемые параметры были пронормированы и выражены как средние значения на одну особь в сутки. Сравнение полученных данных проводилось по t-критерию Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1.1. Анализ поведения взрослых моллюсков в течение первых суток воздействия CPZ (1мкМ).

Влияние на скорость локомоции. Уже через 30 минут и до конца воздействия CPZ (24 часа) скорость локомоции значительно и достоверно (в 3,1-2,5 раза) ниже, чем до воздействия НЛ. При перемещении животных в чистую воду, 36 часов отмывки, скорость возвращалась к первоначальному уровню. После 6-ти часов и до конца инкубации (24 часа) у большинства животных при движении визуально отмечались моторные нарушения: а) раскоординированные, несогласованные с направлением движения развороты раковины на 180°; б) деформация ноги; в) плохое, неполное прикрепление к субстрату. К концу срока отмывки (72 часа) все перечисленные моторные нарушения полностью исчезали.

Влияние на частоту открытия пневмостома. Суточное воздействие CPZ не вызывало изменений частоты открытия пневмостома. Уменьшение этого параметра поведения в 2,2 раза к концу инкубации являлось недостоверным.

Влияние на частоту втягивания тела в раковину. Не происходило изменений этого параметра поведения.

1.2. Анализ поведения взрослых моллюсков при многодневном воздействии CPZ (1мкМ).

Влияние на скорость локомоции. Во всех сериях экспериментов, начиная с первых суток и на протяжении всего срока инкубации, скорость локомоции постоянно и значительно снижалась. Отмечалось резкое падение скорости в 2,5-4,4 раза к концу первых суток воздействия CPZ. Весь период воздействия сопровождался постоянным, но уже постепенным падением скорости. При самом длительном сроке воздействия НЛ (70 дней) скорость локомоции опытных животных была в 8,0-8,5 раз ниже, чем до воздействия CPZ. Кроме того, уже в первые сутки действия CPZ и на протяжении всего срока инкубации наблюдались моторные нарушения, по всем признакам схожие с теми, которые возникали при суточном

воздействии этого НЛ. При многодневном воздействии НЛ локомоторная активность животных также длительно восстанавливалась при отмывке. Так при действии СРХ в течение 33-х дней, двухнедельная отмывка приводила лишь к частичному восстановлению скорости локомоции, до конца отмывки сохранялись и проявления моторных нарушений.

Влияние на частоту открытия пневмостома. Во всех сериях экспериментов при хроническом воздействии СР2 происходило прогрессивное и значительное уменьшение частоты открытия пневмостома. Этот эффект начинал развиваться после З-х-6-ти дней инкубации моллюсков. Можно отметить значительную устойчивость к влиянию СР2, так как только после 20-40 дней воздействия НЛ показатели этого параметра значительно и достоверно ниже относительно и исходного значения в опытной группе, и контрольного на данный момент времени.

При максимальном сроке воздействия С?Т (70 дней) частота открытия пневмостома у опытных животных уменьшилась в 4,0 раза по сравнению с начальным значением этого параметра. После действия НЛ в течение 33-х дней проводилась двухнедельная отмывка. К ее концу частота открытия пневмостома достоверно не отличалась от контрольной.

Влияние на продолжительность открытия пневмостома. Влияние СРЪ на продолжительность открытия пневмостома выражалось в увеличении времени состояния открытого пневмостома. При максимальном сроке воздействия СРЪ (70 дней) время открытого пневмостома достоверно увеличилось в 6,3 раза по сравнению с начальным значением в опытной группе. Однако этот параметр дыхания постоянно и значительно начинал возрастать только после 4-х недель воздействия CPZ.

Таким образом, параметры дыхательного поведения достаточно устойчивы к влиянию СР2. Только после длительного интервала времени (десятки дней) наблюдались их значительные изменения.

При длительном сроке воздействия СРХ (>60-ти дней) отмечалось достоверное увеличение (в 3,5 раза) общего времени состояния открытого

пневмостома (произведение частоты открытия пневмостома в течение часа на продолжительность таких эпизодов).

Влияние на формы ответных реакций при раздражении щупальца. В контроле соотношение форм ответных реакций мало изменялось: преобладающей реакцией на раздражение примерно в 60-ти% случаев являлась ретракция щупальца, затем полное и частичное втягивание тела в раковину (20% и1б% соответственно), и лишь в 3-х% случаев при раздражении щупальца животного реакция отсутствовала. При длительном воздействии CPZ (> 40 дней) полностью исчезали такие формы ответных реакций, как полное и частичное втягивание тела в раковину. Также значительно реже (в 6 раз) на раздражитель опытные животные отвечали ретракцией щупальца. После 30-ти дней воздействия СР2 у опытных животных появилась новая форма ответной реакции - поворот к раздражителю (10-15%). Но все же преобладала невосприимчивость к раздражителю (60-70%).

Влияние на количество съеденной пищи. При максимальном сроке воздействия С?Ъ (70 дней) этот параметр длительно существенно не менялся. Только после 50-го дня количество съедаемой пищи опытными животными прогрессивно и достоверно снижалось. К концу инкубации количество съеденной пищи опытной группой в 2,4 раза меньше, чем исходное значение этого параметра поведения.

Обсуждение. В результате проведенного поведенческого анализа изменений поведения взрослых моллюсков под действием C?Z (1мкМ) можно сделать несколько интересных заключений:

во-первых, данный НЛ действовал преимущественно подавляюще практически на все регистрируемые параметры поведения (скорость локомоции, общую дыхательную активность, количество потребляемой пищи, реакции защитного поведения);

во-вторых, эффекты СР2 можно разделить на кратковременные, быстро обратимые и долговременные, длительно сохраняющиеся. Скорее всего, и способы действия С?Ъ при кратко- и долговременном воздействии различны. Быстрые эффекты (падение скорости, например) могут

быть связаны с известным блокирующим действием CPZ на 5-НТ рецепторы (Leysen et al., 1993). Хронические эффекты, которые заключались в прогрессивном и постепенном изменении параметров многих поведенческих программ, скорее всего, вызваны снижением уровня 5-НТ в мозге животных, то есть, вызваны истощающим действием CPZ (Baker et al., 1995). По времени возникновения изменений при воздействии CPZ можно расположить поведенческие программы по чувствительности к HJ1: наиболее чувствительной, как отмечалось, являлась скорость локо-моции, затем респираторное поведение, защитное и наиболее устойчив к воздействию CPZ - параметр пищевого поведения;

в-третьих, наблюдавшиеся у моллюсков снижение двигательной активности и моторные нарушения при длительном воздействии CPZ коррелируют с направленностью терапевтического (снятие психомоторного возбуждения) и побочного эффектов (дискинезии) этого HJI (Baldessarini, 1985; Snyder, 1987).

Таким образом, мы с достаточной степенью уверенности предполагаем, что наблюдаемые нами изменения в поведении моллюсков при длительном воздействии CPZ можно рассматривать как отражение терапевтического профиля данного препарата. Поэтому, поведенческий анализ может использоваться в качестве достаточно удобной тест-системы для изучения терапевтических эффектов других HJI.

2. Влияние 5-НТ и его биохимических предшественников на поведение взрослых интактных моллюсков.

Действие 5-НТ. Интактным моллюскам инъецировали следующие дозы 5-НТ: 2 мкг/г (п=5), 4 мкг/г (п=30), 8 мкг/г (п=15), 16 мкг/г (п=15), 20 мкг/г (n= 15) и 40 мкг/г (п=5).

(1) Только инъекция 4 мкг/г достоверно увеличивала скорость в 1,5 раза по сравнению с начальным уровнем, до инъекции. Эффект проявлялся в интервале от 10 до 20 мин, после чего скорость снижалась, и к концу часа возвращалась к исходному уровню. (2) Отмечалось незначительное и недостоверное увеличение частоты открытия пневмостома на

30-45% после инъекций 8, 16 и 20 мкг/г. (3) Наблюдалось достоверное и значительное увеличение в 3,5-11 раз числа реакций втягивания в раковину после инъекций 4, 8, и 16 мкг/г. Максимальное увеличение частоты втягивания в раковину в 11 раз наблюдалось через 10 минут после инъекции 8 мкг/г.

Действие 5-НТР. Моллюскам инъецировали 5-НТР в следующих дозах: 25 мкг/г, 40 мкг/г и 80 мкг/г (везде п=Ю).

(1) Инъекции всех доз достоверно увеличивали скорость локомоции в 2-2,5 раза через 10 минут после инъекции. Такое увеличение сохранялось до конца первого часа наблюдений для доз 40 и 50 мкг/г. Через 2 часа скорость возвращалась к исходному уровню во всех группах. После инъекций всех доз наблюдались ритмические движения раковины, которые отмечаются при наземной локомоции апс! Наус1оп, 1986). Они всегда начинались через 18-20 минут после инъекции и сохранялись в течение 15-20 минут для доз 25 и 40 мкг/г, и в течение 40 минут для 50 мкг/г. Наиболее оптимальной дозой из всех была выбрана 40 мкг/г, так как при ней повышенная скорость локомоции стабильно держалась в интервале от 10 до 70-ти минут после инъекции. И, кроме того, происходящие ритмические качания раковины не мешали движению моллюсков, как в случае инъекции 50 мкг/г. (2) Ни одна из использованных доз не оказывала существенного влияния на частоту открытия пневмостома, незначительное повышение на 60-65% этого параметра в течение часа после инъекции всех доз было недостоверным. (3) Также, после инъекции всех доз не наблюдалось изменений частоты защитных реакций втягивания в раковину.

Действие Т. Моллюскам инъецировали Т в дозе 80 мкг/г (п=20).

Уже через 10 минут после инъекции скорость локомоции достоверно возрастала в 1,4 раза. Повышение скорости локомоции в 1,4-1,6 раза сохранялось до конца первого часа. Через два часа скорость возвращалась к исходному значению, до инъекции. Ритмические движения раковины не наблюдались.

(2) Инъекция Т не оказывала влияния на частоту дыхания. Максимальное увеличение этого параметра дыхательного поведения на 80% от исходного уровня наблюдалось через 30 минут после инъекции, но оно было недостоверным. (3) Также после инъекции Т не наблюдалось существенных изменений частоты защитных реакций втягивания в раковину.

Обсуждение. Прежде всего, данные эксперименты позволили определить 5-НТ-зависимые параметры тех программ поведения моллюсков, которые мы регистрировали - это скорость локомоции и частота открытия пневмостома. Именно эти параметры поведения возрастали после инъекции и 5-НТ, и его биохимических предшественников.

Кроме того, была установлена довольно значительная разница между действием на поведение моллюсков 5-НТ и его непосредственного предшественника в цепи синтеза - 5-НТР. Использование 5-НТР для запуска 5-НТ зависимых программ поведения оказалось более приемлемым, так как при его инъекции, как мы считаем, происходило "адресное" (по времени и по месту) и оптимальное повышение уровня 5-НТ в ЦНС животных (БаИгагоу, 1991). В целом, воздействие 5-НТР более эффективно и адекватно, чем самого медиатора: во-первых, более значительное и продолжительное увеличение скорости локомоции, чем при использовании 5-НТ; во-вторых, примерно одинаковое по величине повышение скорости локомоции наблюдалось при использовании целого ряда доз 5-НТР. Учитывая большую эффективность и адекватность действия предшественника синтеза 5-НТ по сравнению с самим медиатором, ритмические движения раковины также можно отнести к 5-НТ зависимой реакции.

И, наконец, интересный факт, что для 5-НТ и всех его метаболических предшественников латентный период при увеличении скорости локомоции был одинаков - 10 минут, указывает на то, что кинетика процесса синтеза 5-НТ требует дальнейших исследований.

3. Влияние 5-НТ и его биохимических предшественников на поведение моллюсков со сниженным под действием СРХ уровнем 5-НТ.

Действие 5-НТ. Опытным моллюскам инъецировали 5-НТ в дозах: 4 (п=15), 8 (п= 10) и 16 мкг/г (п=15).

(1) Только инъекция 16 мкг/г достоверно увеличивала скорость локо-моции моллюсков в 1,5 раза по сравнению со скоростью до инъекции. Эффект проявлялся в интервале от 10 до 20 мин после инъекции, после чего скорость снижалась, и к концу часа возвращалась к исходному уровню. (2) После инъекции 4 мкг/г происходило значительное (в 3,0-3,3 раза), достоверное и длительное (в течение часа) повышение частоты открытия пневмостома. Максимальное достоверное увеличение (в 5 раз) этого параметра наблюдалось через 40 минут после инъекции 4 мкг/г. (3) После инъекции 4 и 16 мкг/г у моллюсков отмечалось увеличение числа реакций втягивания в раковину (в 4 раза), но оно было недостоверным.

Действие 5-НТР. Опытным моллюскам инъецировали 5-НТР в дозах 40 и 80 мкг/г (п=15 для каждой дозы).

(1) Уже через 10 минут после инъекции обеих доз скорость локомоции достоверно возрастала в 2,0-2,5 раза по сравнению с начальной, до инъекции. Такое достоверное увеличение скорости сохранялось до конца первого часа наблюдений для дозы 40 мкг/г, а после инъекции 80 мкг/г -в течение 4-х часов. После инъекций всех доз наблюдались ритмические движения раковины. Они начинались, также как и у интактных животных, через 18-20 минут после инъекции. После инъекции 40 мкг/г ритмические движения раковины продолжались в течение 20-30 минут, а для дозы 80 мкг/г их продолжительность была больше, в течение часа. (2) Достоверное и максимальное повышение частоты открытия пневмостома (в 6,6 раза) наблюдалось в интервале от 30 до 60 минут после инъекции 40 мкг/г. Незначительное увеличение этого параметра дыхания после инъекции 80 мкг/г было недостоверным. (3) Защитные реакции

втягивания тела в раковину у всех опытных животных отсутствовали и до, и после инъекции обеих доз.

Действие Т. Опытным моллюскам, как и интакгным, инъецировали Т в дозе 80 мкг/г (п=15).

(1) Достоверное повышение скорости локомоции в 1,5-1,6 раза наблюдалось в интервалах 10-20 и 120-130 минут после инъекции.

(2) Инъекция не. оказывала значительного влияния на частоту дыхания. Максимальное увеличение частоты открытия пневмостома на 90% от исходного уровня через 30 минут после инъекции было недостоверным.

(3) У опытных животных до и после инъекции защитная реакция втягивания тела в раковину отсутствовала.

Обсуждение. На основании проведенных экспериментов методом видеорегистрации мы показали, что скорость локомоции, ритмические движения раковины и частота открытия пневмостома являются 5-НТ-зависимыми параметрами поведения. Именно эти параметры поведения изменялись при длительном воздействии СРг. То есть, теперь уже четко показана нейротрансмитгерная направленность CPZ - это истощение запасов 5-НТ в ЦНС моллюсков (БакЪагоу й а1., 1996).

Инъецируя 5-НТ и его биохимические предшественники опытным животным, то есть со сниженным при длительном воздействии CPZ уровнем 5-НТ, мы прежде всего проверяли: не происходит ли необратимых изменений в 5-НТ зависимых программах поведения, является ли хроническое влияние СР2 обратимым или нет?

И у контрольных, и у опытных животных инъекция 5-НТ и его предшественников вызывала одинаковые изменения в поведении: повышение скорости локомоции и частоты открытия пневмостома, ритмические движения раковины. Все это говорит о том, что длительное воздействие C?Z обратимо и существенно не затронуло 5-НТ-ергическую систему регуляции поведения.

На основании анализа действия 5-НТ и его биохимических предшественников на скорость локомоции и другие регистрируемые параметры по-

ведения опытных и контрольных животных можно сделать несколько важных заключений, касающихся возможных причин 5-НТ-истощающего эффекта CPZ:

во-первых, относительно процессов обратного захвата 5-НТ и захвата его предшественников. Время латентного периода в случае увеличения скорости локомоции для действующих доз всех инъецируемых веществ как в опытной, так и контрольной группе составляло 10 минут. Эти факты указывают на то, что процессы захвата и транспортировки этих веществ, особенно к клеткам-мишеням, участвующим в организации локомоции, при длительном влиянии CPZ не нарушались;

во-вторых, можно сделать очень важный вывод, который заключается в том, что при длительном воздействии CPZ не происходило нарушений в цепи синтеза 5-НТ из его биохимических предшественников. Доказательством этого вывода являются факты, показывающие, что после инъекции одинаковых для опыта и контроля доз предшественников синтеза 5-НТ наблюдалось аналогичное (по величине и продолжительности) повышение скорости локомоции у обеих групп животных;

в-третьих, данные о том, что после инъекции 5-НТ наблюдалось одинаковое повышение (по величине и продолжительности) скорости локомоции у опытных и контрольных животных указывают на то, что реактивность нервных клеток к 5-НТ у опытных моллюсков близка к контрольной.

Конечно, эти заключения можно делать только в ограниченной и осторожной форме, но все же мы пришли к выводу, что 5-НТ-истоща-ющий эффект СРг скорее всего не является следствием глобальных нарушений в процессах высвобождения и захвата 5-НТ, реактивности возбудимых систем к нему, утилизации экзогенных метаболических предшественников и, в конечном итоге, в процессе синтеза 5-НТ.

4. Влияние длительного воздействия CPZ на процесс откладки яиц. При длительной инкубации (4 недели) половозрелых моллюсков в 2мкМ водном растворе СР2 общее число отложенных яйцевых капсул достовер-

но уменьшилось на 80% по сравнению со средним контрольным значением продукции яиц. За время инкубации животных в 0,5 и 1 мкМ растворах СР2 продукция яиц уменьшилась незначительно (на 13 и 9% соответственно).

Высокие концентрации СР2 (1 и 2 мкМ) приводили к незначительному (на 25-30%) и недостоверному увеличению числа откладываемых кладок, тогда как низкая концентрация НЛ (0,5 мкМ) вызывала достоверное увеличение в 2,2 раза числа откладываемых кладок по сравнению с контрольным значением.

В результате хронического действия СР2 всех концентраций средний размер кладки (отношение числа откладываемых яйцевых капсул к числу кладок) достоверно уменьшился: на 55, 31 и 83% для 0,5, 1 и 2 мкМ СРг соответственно.

При длительной иммерсии половозрелых моллюсков в мкМ растворах СР2 наблюдались нарушения в процессе инкапсуляции яиц: наличие зародышей без яйцевой капсулы, пустых капсул, уменьшение размеров яйцевых капсул и полиэмбриония (больше одного зародыша в яйце).

В контрольной группе первые два нарушения отсутствовали, а число капсул с полиэмбрионией составляло 0,14% по отношению к общему числу отложенных яйцевых капсул. Максимально полиэмбриония в контроле наблюдалась как наличие 2-х зародышей в одной капсуле.

Первые нарушения в упаковке кладок опытных животных отмечались после 6-8 дней воздействия всех концентраций СР2. За время инкубации число яйцевых капсул с нарушениями в упаковке у опытных животных по сравнению с контрольными значительно и концентрационно зависимо выросло: в 18, 22 и 38,5 раз при иммерсии в 0,5, 1 и 2 мкмоль/л растворах С¥Х соответственно. Наблюдалось увеличение и в выраженности полиэм-брионии: в одной капсуле было больше 2-х зародышей, а максимальное значение - наличие в одной капсуле более 300 зародышей (1 мкМ СРг). Однако за время воздействия CPZ во всех опытных группах встречались кладки без перечисленных нарушений процесса инкапсуляции.

Обсуждение. Сравнивая влияние разных концентраций СР2 на процесс откладки яйцевых капсул, можно заметить, что все концентрации СР2 оказывали влияние на репродуктивный процесс, подавляя его. Об этом говорит общий для всех опытных групп факт достоверного уменьшения среднего размера кладки. А высокая концентрация (2мкМ) приводила уже к достоверному уменьшению как среднего размера кладки, так и общего числа откладываемых капсул.

Кроме этого, СР2 во всех концентрациях через 6-8 дней воздействия вызывал нарушения в процессе инкапсуляции. Но все же эти нарушения не были необратимыми, скорее всего можно говорить о периодических дисфункциональных нарушениях, так как на протяжении всего срока воздействия CPZ, даже при действии высокой концентрации НЛ (2мкМ), встречаются кладки с нормальной морфологией капсул.

На это указывают и литературные источники, в которых рассматриваются причины тех нарушений инкапсуляции, которые мы наблюдали при длительном воздействии CPZ на половозрелых моллюсков.

Расположение зародышей за пределами яйцевых капсул может быть вызвано дисгармонией в функционировании гермафродитной железы и придаточных желез яйцевода, в первую очередь - белковой (Березкина, 1988, С.226).

Уменьшение размеров яйцевых капсул можно объяснить гипофункцией белковой железы в начале или конце прохождения потока овулиро-вавших яйцеклеток через квадривий, а также ускоренным выведением яйцеьой капсулы из квадривия (зона репродуктивной системы, где вокруг овулировавшей яйцеклетки формируется яйцевая капсула) (Березкина, 1988, С. 42). Очень часто оно сопровождается отсутствием яйцеклеток в капсулах (Березкина, 1988, С. 227).

Одной из причин появления полиэмбрионии является несогласованность в функционировании гонады и желез женского полового тракта. В некоторой мере возникновению полиэмбрионии может способствовать интенсивная овуляция яйцеклеток, вызванная активным спариванием

моллюсков: овулировавшие в небольшом интервале времени яйцеклетки попадают в квадривий почти одновременно и соответственно оказываются в одной яйцевой капсуле. У Lymnaeiformes полиэмбриония может рассматриваться как нежелательное явление. Она приводит к развитию нежизнеспособного потомства и сопровождается бессмысленными энергетическими и пластическими тратами на размножение (Березкина, 1988, С. 228-230).

Таким образом, наши результаты в соответствии с литературными данными указывают на то, что при длительном воздействии CPZ на взрослых моллюсков происходили значительные, хотя и неглобальные дисфункции репродуктивной системы животных. Зная истощающий профиль CPZ, как препарата, значительно снижающего уровень 5-НТ в мозге моллюсков, можно предположить, что дисфункции репродуктивной системы отчасти связаны с этим центральным падением уровня 5-НТ.

Можно также предположить, что происходило снижение уровня медиатора в системе иннервации репродуктивных органов (периферическое снижение уровня 5-НТ). К сожалению, гистохимически пока не удалось обнаружить элементы, иннервирующие репродуктивную систему, в которых при длительном воздействии CPZ отмечалось бы снижение уровня 5-НТ. Может быть из-за того, что вообще в репродуктивной системе L. stagnalis мало участков, где гистохимически выявляются МА (Иванова-Казас, 1977, С. 28).

5. Влияние CPZ на процесс эмбриогенеза. Наиболее чувствительной к воздействию CPZ оказалась ранняя стадия развития зародышей - Е18. При инкубации с этой стадии развития действующая (смертность 50%) концентрация раствора CPZ была 1,5мкМ. Для других стадий развития действующие концентрации НЛ были: стадия Е30 - 2,2мкМ; стадия Е50 -1,8мкМ; стадия Е100 - 2,8мкМ. При инкубации с ранних стадий эмбриогенеза, Е18 и Е30,"у непогибших зародышей при развитии отмечалось морфологическое нарушение - недоразвитие белкового мешка ("зародышевой печени") (Иванова-Казас, 1977, С. 136).

Чем с более ранней стадии начиналось влияние CPZ, тем больше была продолжительность эмбриогенеза у непогибших зародышей. Продолжительность эмбриогенеза при инкубации в действующих концентрациях CPZ со стадии Е18 увеличилась на 65-90%, ЕЗО - на 4050%, а со стадии Е50 - на 15-30%.

Обсуждение. Наши результаты о влиянии CPZ на процесс эмбриогенеза коррелируют с результатами исследований по изучению влияния на процесс эмбриогенеза HJI другого химического ряда (бутирофеноны)-HAL. На зародышах большого прудовика гистохимически было установлено, что при их инкубации в водном растворе HAL (1мкмоль/л) происходит значительное снижение уровня MA (5-НТ и ДА) во многих нейронах ЦНС моллюсков (Воронежская и др., 1993). Было показано, что ранние стадии развития (такие как, Е18 и ЕЗО) крайне чувствительны к воздействию HAL, что выражалось в увеличении продолжительности эмбриогенеза, наличии нарушений морфологии эмбрионов, высокой смертности зародышей. Если же воздействие HAL начиналось со стадии Е60 (после метаморфоза) или перед вылуплением - Е80, то влияние НЛ на течение эмбриогенеза было незначительно (Воронежская и др., 1993).

Действительно, даже притом, что CPZ, в отличие от HAL, преимущественно воздействует на 5-НТ-ергическую систему мозга (Baker et al., 1995), по общей направленности на процесс эмбриогенеза моллюсков у этих веществ много сходного.

HAL (1мкМ) оказывал значительное истощающее воздействие не только на нейроны ЦНС развивающихся моллюсков, но и на так называемые транзиторные нейроны (Воронежская, 1992). Это пара МА нейронов вне области закладки будующей ЦНС взрослых моллюсков впервые гистохимически выявляется со стадии ЕЗО эмбрионального развития и, как считают авторы, играет большую роль в нормальном осуществлении процесса метаморфоза (Воронежская и др., 1992; Воронежская и др., 1993). Так как, если воздействие HAL начиналось со стадии Е18, то есть когда эти транзиторные клетки еще не выявляются

гистохимически, развитее зародышей останавливалось в состоянии метаморфоза и эмбрионы погибали (Воронежская и др., 1993).

И по результатам наших экспериментов наибольшей чувствительностью к CPZ (высокая смертность, значительная задержка в развитии, нарушения морфологии зародышей) обладала ранняя стадия эмбриогенеза - Е18, когда истощающее воздействие CPZ скорее всего направлено на развивающиеся транзиторные нейроны. Момент вступления эмбрионов в метаморфоз являлся также крайне чувствительной к воздействию CPZ стадией развития. Влияние HJI на развитие зародышей, прошедших метаморфоз и готовых к вылуплению не столь значительно.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Интерес к вопросу о способе действия НЛ возник в Лаборатории сравнительной физиологии ИБР РАН в связи со случайным наблюдением значительного снижения уровня МА в определенных популяциях нейронов у зародышей моллюска - большого прудовика, которых содержали в 1 мкМ растворе НЛ бутирофенонового ряда, HAL (Воронежская и др., 1993). Этот интерес перерос в системное исследование, и уже в одной из первых работ на взрослых животных (пиявки) было показано, что поведенческий эффект HAL легче объяснить истощением ДА, чем блокированием рецепторов ДА (Sakharov et al., 1994). К тому моменту, когда мы приступили к выполнению настоящего диссертационного исследования, все знания о поведенческих коррелятах МА-истощающих эффектов НЛ в основном ограничивались упомянутыми результатами опытов на пиявках (Sakharov et al., 1994) и предварительными экспериментами по изучению влияния HAL на некоторые параметры дыхательного поведения больших прудовиков.

Проведенное нами диссертационное исследование было впервые специально посвящено поведенческим эффектам НЛ, причем иной химической природы, чем испытанный ранее HAL. Существенно, что поведенческие эффекты исследовались на том же объекте и при тех же уело-

виях, при которых ранее был получен МА-истощающий эффект. Особое внимание мы уделили экспериментам, отвечающим на вопрос: являются ли наблюдающиеся изменения моторного поведения прямым следствием истощения нейрональных МА. Результаты проведенных нами экспериментов позволяют положительно ответить на этот вопрос.

Уже ранние поведенческие наблюдения на HAL-инкубированных пиявках оказались достаточными для того, чтобы впервые выдвинуть новую гипотезу, касающуюся терапевтического действия HJI. Согласно этой гипотезе, "a similar mechanism of transmitter deficiency (т.е. истощение ДА) in selected subsets of brain neurones might play a role in clinical effects of chronically administered classical neuroleptics" (Sakharov et al., 1994, p. 670).

В последовавших затем совместных исследованиях методами HPLC и гистофлюоресценции было установлено, что фармакологические профили разных HJI различаются по направленности истощающего действия на ДА и 5-НТ (Baker et al., 1995; Sakharov et al., 1996). Так, если длительное воздействие HAL приводило у модельных моллюсков к значительному снижению уровня и ДА, и (временно) 5-НТ, то воздействие CPZ было направленно преимущественно на 5-НТ. Для серии клинически применяемых НЛ была установлена корреляция между ДА-истощающим эффектом на мозге прудовика и аффинностью к D2 рецептору мозга млекопитающих, а также между 5-НТ-истощающим эффектом на мозге прудовика и аффинностью к 5-НТ2 рецептору мозга млекопитающих (неопубликовано; см. Baker et al., 1995).

Новые результаты, составной частью которых явились материалы настоящей диссертации, позволили уточнить выдвинутую ранее рабочую гипотезу. Теперь способ терапевтического действия НЛ стали связывать с истощением не только нейронального ДА, но и 5-НТ (Baker et al., 1995; Croll et al., 1997). По-видимому, таким истощением - при длительном действии НЛ - достигается коррекция баланса ДА/5-НТ в пострадавшей области мозга. Важная роль баланса ДА/5-НТ в определении поведенческих состояний была убедительно показана в опытах на модельных

беспозвоночных (Kabotyanski and Sakharov, 1988, 1990; Дьяконова и Сахаров, 19946).

В этой связи привлекают внимание наши результаты, указывающие на то, что способ действия CPZ может быть разным при кратковременном (сутки) и долговременном (свыше суток) влиянии. Определенные параметры поведения менялись только при многодневном воздействии CPZ. Мы установили, что все такие изменения касаются исключительно тех форм поведения, которые можно отнести к разряду 5-НТ-зависимых, и что, скорее всего, они были вызваны снижением уровня 5-НТ в мозге животных. На это же определенно указывает тот факт, что 5-НТ или его предшественники вызывали коррекцию поведения. Все это хорошо соответствует гипотезе, по которой причиной поведенческих эффектов является недостаточность 5-НТ, то есть снижение 5-НТ-го тонуса.

Исключением являются результаты опытов с измерением скорости ресничной локомоции. Последняя значимо снижалась уже в течение первых 30 минут, оставаясь на новом, сниженном уровне и в последующие дни. Мы предполагаем, что быстрое снижение скорости 5-НТ-за-висимой ресничной локомоции может быть связано с известным блокирующим действием CPZ на рецепторы 5-НТ. В пользу этого говорит и тот факт, что быстрые эффекты CPZ так же быстро (часы) снимаются при отмывке. Напротив, многодневные воздействия этого НЛ, которые вызывали значительные изменения во многих поведенческих программах животных и которые длительно (недели) сохранялись после прекращения действия CPZ, скорее всего связаны с истощением запасов 5-НТ в определенных структурах мозга моллюсков и вряд ли могут рассматриваться как результат блокады 5-НТ рецепторов.

Проведенные нами поведенческие эксперименты не позволяют с необходимой основательностью судить о механизме, лежащем в основе истощающего эффекта CPZ. Тем не менее, мы считаем возможным обсуждать этот вопрос в ограниченной и осторожной форме, что позволит уточнить план дальнейших исследований.

Во-первых, вызванные длительным действием СР2 изменения в 5-НТ-зависимых формах поведения (то есть изменения в самой 5-НТ-ергической системе) носят только количественный характер и являются обратимыми.

Во-вторых, при длительным воздействии CPZ продолжают функционировать нейрохимические механизмы, ответственные за утилизацию экзогенных метаболических предшественников и, в конечном итоге, за синтез 5-НТ.

В-третьих, при этом продолжают также функционировать механизмы, ответственные за высвобождение нейронального 5-НТ в нормальных местах секреции.

В-четвертых, при длительном воздействии CPZ сохраняются реактивность возбудимых систем к 5-НТ и координированный характер моторного поведения.

Эти заключения делают менее вероятными некоторые из возможных объяснений истощающего эффекта CPZ, а именно те возможные гипотезы, которые связывали бы истощение нейронального 5-НТ с нарушением механизмов утилизации его метаболических предшественников, а также с нарушением синтеза и секреции 5-НТ. Вместе с тем, принимая во внимание наличие в организме многочисленных компенсирующих механизмов, было бы неправильным считать такие рабочие гипотезы совершенно невероятными. Вопрос о механизме МА-истощающего действия НЛ вообще, и CPZ в частности, остается таким образом открытым.

Будущие исследования должны ответить и на другие важные вопросы, остающиеся пока без ответа, в частности на вопрос, почему при различном МА-истощающем профиле разных НЛ достигается близкий терапевтический эффект. Представляется, что при решении этих и других нерешенных вопросов, касающихся способа действия НЛ, беспозвоночные животные, в частности моллюски, сохранят свое значение как удобные модельные объекты нейро- и психофармакологии.

ВЫВОДЫ

1. Исследовали поведение половозрелых пресноводных улиток Ьутпаеа stagnalis (большой прудовик), которых длительно (до 70-ти дней) содержали в 1 мкМ растворе СРХ, что, согласно ранее полученным результатам, приводит к существенному снижению содержания 5-НТ в мозге этого моллюска.

2. Длительное воздействие С?Ъ приводит к значительному изменению количественных параметров следующих проявлений моторного поведения: ресничная локомоция, мышечная (наземная) локомоция и частота открытия дыхательного отверстия. Кроме того, нарушается координированный характер упаковки яйцеклеток в яйцевые оболочки.

3. Названные формы моторного поведения меняются под влиянием хронического С?2 в направлении, противоположном тому, в котором они меняются под влиянием 5-НТ и/или его метаболических предшественников.

4. Изменения поведения, вызванные влиянием хронического СРг, частично или полностью компенсируются введением животному 5-НТ и/или его метаболических предшественников.

5. Результаты экспериментов позволяют заключить, что хронический CPZ влияет исключительно (или, по крайней мере, преимущественно) на 5-НТ-зависимые формы поведения, которые при этом меняются так, как если бы имело место снижение активности 5-НТ-ергической системы.

6. Вызванные длительным действием СР2 изменения моторного поведения обратимы и, по-видимому, не являются следствием прекращения функционирования механизмов, ответственных за утилизацию метаболических предшественников, синтез и высвобождение нейронального 5-НТ.

7. В целом результаты настоящего исследования, проведенного на простой нейробиологической модели, хорошо согласуются с рабочей гипотезой, согласно которой в основе действия хронических НЛ на ЦНС лежит снижение содержания нейрональных МА.

Список статей, опубликованных по теме диссертации:

Baker M.W., Croll R.P., Dyakonova V.E., Khabarova М. Yu., Sakharov D.A., Voronezhskaya E.E. 1995. Mode of action of antipsychotic drugs: lessons from simpler models. Acta Biologica Hungarica V. 46 (2-4) pp. 221-227. (Статья повторно опубликована в книге Neurobiology of Invertebrates. 1996. Eds. By Salanki et al. Budapest, Akademiai Kiado, pp. 221-227.)

Croll R.P., Baker M.W., Khabarova M.Yu., Voronezhskaya E.E and Sakharov D.A. 1997. Serotinin depletion after prolonged chlorpromazine treatment in a simpler model system. Gen. Pharmacol. V. 29 N. 1 pp. 91 -96.

Тезисы докладов:

Khabarova M., Kozhuchov M., Voronezhskaya E. 1994. Effect of chronic chlorpromazine on neurons and behavior of Lymnaea stagnalis. In: Simpler Nervous Systems. Abstracts from the regional meeting of ISIN. Pushino, Russia, p. 19.

Khabarova M., Voronezhskaya E. 1997. Behavioral analysis of serotonin-depleting action of chronic chlorpromazine (CPZ) on the pond snail Lymnaea stagnalis. In: Simpler Nervous Systems. Abstracts of the 5th East European conference of the ISIN. Moscow. Russia, p. 31.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хабарова, Марина Юрьевна, Москва



РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н.К. Кольцова

На правах рукописи УДК 615.214: [577.175.823: 594.381.5]

Марина Юрьевна ХАБАРОВА

ПОВЕДЕНЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СЕРОТОНИН-ИСТОЩАЮЩЕГО ЭФФЕКТА ХЛОРПРОМАЗИНА.

03.00.13. - физиология человека и животных Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Научный руководитель:

академик РАЕН, доктор биологических наук

Дмитрий Антонович Сахаров.

Москва, 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ ............................... 3-4

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................5-27

1.1. Классификация и характеристика психотропных препаратов............5

1.2. Общая характеристика нейролептиков (НЛ).......................................6

1.2.1. Классификация НЛ...........................................................................7

1.2.2. Клиническое применение.................................................................8

1.2.3. Побочные эффекты...........................................................................9.

1.3. Механизм действия НЛ.................................................................10-21

1.3.1. Множественность мишеней............................................................10

1.3.2. Блокирование рецепторов дофамина (ДА).....................................11

1.3.3. Шизофрения....................................................................................13

1.3.4. Теория деполяризационного блока.................................................15

1.3.5. Структуры мозга, вовлеченные в деполяризационный блок.........17

1.3.6. Деполяризационный блок как основной терапевтический эффект НЛ..............................................................................................................18

1.3.7. Противоречия и сравнения гипотез о способе действия НЛ.........19

1.4. Эффекты НЛ, полученные на модельных беспозвоночных 21 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.......................................................27-36

2.1. Объект исследования..........................................................................27

2.2. Определение возраста и обозначение стадий развития.....................28

2.3. Поведенческие эксперименты...........................................................29

2.4. Наблюдения за формированием и развитием яиц............................34

2.5. Фармакологические воздействия 35 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.........................................................................36-85

3.1. Анализ поведения взрослых моллюсков в течение первых суток воздействия хлорпромазина (СР2)...........................................................36

3.2. Анализ поведения взрослых моллюсков при многодневном воздействии СРг..................................................................................38-53

3.2.1. Влияние на скорость локомоции...................................................38

3.2.2. Влияние на частоту открытия пневмостома...................................41

3.2.3. Влияние на продолжительность открытия пневмостома..............44

3.2.4. Влияние на формы ответных реакций при раздражении щупальца...................................................................................................46

3.2.5. Влияние на количество съеденной пищи.......................................47

3.2.6. Обсуждение......................................................................................48

3.3. Влияние серотонина (5-НТ) и его биохимических предшественников на поведение взрослых интактных моллюсков........................54-66

3.3.1. Действие 5-НТ................................................................................54

3.3.2. Действие 5-гидрокси-Ь-триптофана (5-НТР).................................57

3.3.3. Действие триптофана.......................................................................62

3.3.4. Обсуждение......................................................................................63

3.4. Влияние 5-НТ и его биохимических предшественников на поведение моллюсков со сниженным под действием СР2 уровнем 5-НТ .66-76

3.4.1. Действие 5-НТ................................................................................66

3.4.2. Действие 5-НТР...............................................................................69

3.4.3. Действие триптофана.......................................................................72

3.4.4. Обсуждение......................................................................................73

3.5. Влияние длительного воздействия С?Ъ на процесс откладки яиц..76 3.5.1. Обсуждение......................................................................................80

3.6. Влияние СР2 на процесс эмбриогенеза моллюсков.........................84

3.6.1. Обсуждение .....................................................85

ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................................................................85-89

ВЫВОДЫ .........................................................................................90

СПИСОК ЖТЁРАТУРЫ..................................................................91-104

ВВЕДЕНИЕ.

Настоящее диссертационное исследование посвящено одной из актуальных проблем, стоящих перед психофармакологией, - механизму действия лекарственных средств, которые в англоязычной литературе обычно обозначаются термином антипсихотики, а в русскоязычной -нейролептики. Прошло более 40 лет с тех пор, как НЛ (список сокращений С. 5) начали с успехом применяться в психиатрической клинике, но природа их эффективности до сих пор остается нераскрытой. Этим, несомненно, затрудняется поиск новых, еще более эффективных препаратов.

Наиболее популярная, т.н. дофаминовая, гипотеза связывает терапевтический эффект НЛ с тем, что они блокируют ДА-рецепторы, снижая тем самым патологически повышенный тонус ДА-ергической системы мозга (Seeman et al, 1975, 1976; Grace, 1991, 1992; Leysen et al, 1993). Однако на пути дофаминовой гипотезы и ее позднейших модификаций стояла и стоит непреодолимая трудность: для блокирования рецепторов требуются минуты, а для изменения поведения больных — недели.

В ходе исследований коллектива Лаборатории сравнительной физиологии ИБР РАН, к которому вскоре присоединилась группа канадских коллег, был обнаружен ранее не известный способ действия НЛ — способность существенно снижать содержание ДА и/или 5-НТ в нервной ткани (Baker et al., 1995; Sakharov et al., 1996). Основные эксперименты проводились на далеких от человека модельных объектах (моллюски, ан-нелиды), но результаты экспериментов позволили сформулировать рабочую гипотезу, приложимую к клинической психофармакологии, согласно которой именно истощающий МА-ергический эффект может лежать в основе терапевтического действия НЛ.

Непреходящая ценность сравнительно-физиологического подхода подтверждается всем прошлым опытом физиологии и фармакологии нервной системы, ведь именно использование беспозвоночных модельных объектов позволило обнаружить и доказать нейротрансмиттерную функцию таких важнейших сигнальных молекул, как 5-НТ, ДА, глутамат и

ГАМК. Также и при постановке задач данного диссертационного исследования имелось в виду, что результаты, полученные на модельном беспозвоночном объекте, станут важным аргументом в пользу нового представления о механизме терапевтического действия НЛ.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью диссертационного исследования было ответить на два вопроса:

(1) какие компоненты поведения и как меняются при хроническом

действии и

(2) соответствуют ли наблюдающиеся изменения поведения предположению, что их причиной является снижение активности 5-НТ-ергической системы.

При проведении поведенческих экспериментов в качестве простого модельного объекта исследования использовали пресноводного легочного моллюска - большого прудовика (Ьутпаеа stagnalis).

Конкретными задачами экспериментов было проанализировать изменения поведения прудовика при действии следующих веществ: С?Х, 5-НТ и его биохимических предшественников: 5-НТР и Т.

Работа выполнена в 1994-1997гг. в лаборатории сравнительной физиологии Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. Основная часть экспериментов проводилась на Кропотовской биологической станции института (Каширский р-н Московской области).

Основные материалы диссертации докладывались на молодежных конференциях ИБР им. Н.К. Кольцова (1995, 1997), на 4-ой и 5-ой конференциях Международного общества нейробиологии беспозвоночных (ШТЧ) "Простые нервные системы" (Путцино, 1994; Москва, 1997).

Работа выполнена при поддержке Российского Фонда Фундаментальных исследований (проект №96-04-49181) и гранта ШТА8-93-3504.

Глубокую благодарность и признательность автор выражает Е.Е. Воронежской за помощь в работе над диссертацией, Л.П. Незлину за методические советы в проведении поведенческих экспериментов и подготовке диссертации к печати, В.В. Цыганову за моральную поддержку в работе и

директору биостанции ИБР РАН В.В. Аркатову за предоставленную возможность работать в комфортных условиях.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

Галоперидол - HAL.

Гамма-аминомасляная кислота-ГАМК.

5-Гидрокситриптофан - 5-НТР.

Дезоксифенилаланин-ДОФА.

Дофамин - ДА.

Моноамины - МА.

Нейролептики - HJI.

Серотонин - 5-НТ.

Триптофан - Т.

Хлорпромазин (аминазин) - CPZ. Центральная нервная система - ЦНС.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Классификация и краткая характеристика психотропных препаратов.

Психофармакология как особая область фармакологической науки ведет свое начало с 50-х годов этого века, когда были найдены препараты, способные снимать (купировать) острые психозы, приступы бреда, галлюцинации, маниакально-депрессивные состояния.

Современная классификация психотропных средств включает 7 групп препаратов:

(1) нейролептики, или антипсихотические средства (эффективны при психозах и различных типах психомоторного возбуждения);

(2) анксиолитические седативные (успокаивающие) средства, или транквилизаторы (снимают тревогу, напряжение, страхи);

(3) нормотимики (соли лития) (купируют маниакальные состояния и являются средством профилактики аффективных приступов и фаз);

(4) антидепрессанты, или тимолептики (эффективны при лечении депрессий);

(5) психостимуляторы (увеличивают продолжительность периодов бодрствования, стимулируют интеллектуальную деятельность, устраняют астенические симптомы: усталость, слабость, повышенную истоща-емость);

(6) ноотропы и ГАМК-ергические вещества (стимулируют метаболизм нервных клеток, обладают активирующим действием, применяются при астении, нарушениях памяти, расстройствах сознания);

(7) психодислептики (психотомиметики), или галлюциногены (широкого применения в качестве лекарственных средств не имеют, пригодны для экспериментальных целей, поскольку продуцируют психические расстройства: иллюзии, красочные зрительные и слуховые галлюцинации) (Видаль, 1997, С. Ell; Машковский, 1987 С. 36-38; Снежневсий, 1985, С. 83-84).

Данная классификация была принята практически во всех странах и за три десятилетия координально не менялась, но значительно пополнилась огромным количеством новых препаратов. В настоящее время число психотропных лекарственных препаратов превысило 500 (Видаль, 1997, С. Ell; Машковский, 1987, С. 40-41).

1.2. Общая характеристика нейролептиков (HJI).

1.2.1. Классификация HJI.

Создание и развитие психофармакологии началось с открытия HJT. Первым среди них (1952 г.) в психиатрии стал применяться хлорпромазин (CPZ) (основное отечественное название данного препарата "аминазин") (Delay et al., 1952).

HJI - вещества различной химической структуры, их разделяют на химические группы (классы), где все препараты являются производными от основного представителя данного ряда:

(1) фенотиазина (наиболее широко применяемые препараты этой группы: хлорпромазин, тиоридазин и трифлуоперазин).

(2) тиоксантена (хлорпротиксен);

(3) бутирофенона (галоперидол);

(4) дифенилбутилпиперидина (пимозид);

(5) фенилпиперазина (оксипертин);

(6) дибензодиазипина (клозапин);

(7) алкалоиды растения раувульфии (Rauwolfia■), производные индола (резерпин). (El-Sobky, 1984).

По химической структуре близки НЛ 1-го и 2-го класса, а также 3-го и 4-го, остальные классы HJT химически более самостоятельны.

1.2.2. Клиническое применение.

Хотя HJI - вещества различной химической природы, но обладают общим клиническим воздействием при различных психических расстройствах, имеют общее, так называемое, нейролептическое или антипсихотическое действие. HJ1 прекращают течение как экзогенных (например, алкогольного), так и эндогенных острых и хронических психозов (например, при шизофрении), приступы бреда, галлюцинации. HJI также эффективны в снятии маниакально-депрессивных психозов, параноидального синдрома. Эти препараты, кроме того, применяются для лечения различных нервных расстройств (в неврологии), оказывая седативное действие. Правда, они не оказывают селективного успокаивающего эффекта, как анксиолитики (например, представитель группы бенздиазипинов - диа-зепам). Как основное терапевтическое средство, а особенно в сочетании с другими психотропными препаратами, HJI применяют при лечении большого числа расстройств ЦНС (Видаль, 1997, С. В180).

Наиболее широко HJI используются при лечении шизофрении. В настоящее время в среднем 80% больных шизофренией, прошедших курс лечения НЛ, могут быть выписаны из больниц для амбулаторного наблюдения (Stevens, 1991). Совместные исследования врачей различных стран показали, что более чем у 70% больных, прошедших курс лечения НЛ,

психосоматическое состояние значительно улучшалось, и только у 10% не наблюдалось никакого заметного улучшения. В отличие от этих данных, у больных шизофренией, не прошедших такого лечения, только в 25% случаев происходит спонтанное улучшение состояния (ремиссии) в определенные периоды болезни. Однако при этом не происходит заметного стойкого психосоматического улучшения, а после ремиссий, как правило, психические расстройства усиливаются. Тогда как HJI оказывают стойкое лечебное действие, которое резко снижает частоту повторения рецидивов. Лечение НЛ имеет хороший долговременный прогноз, это способствует снижению уровня и прогрессирования данного заболевания. Наибольшую эффективность имеет длительное лечение НЛ, именно длительный и постоянный прием этих препаратов (поддерживающая терапия) приводит к устойчивым ремиссиям у больных шизофренией (May et al., 1976; Wyatt, 1991).

Терапевтические дозы различных НЛ значительно отличаются друг от друга. Но в среднем при поддерживающей терапии суточная доза большинства НЛ при приеме внутрь и внутримышечно составляет 3-4 мг/кг, при внутривенном введении она в 2 раза меньше (Видаль, 1997, С. В180; Машковский, 1987, С. 43).

1.2.3. Побочные эффекты.

Но, несмотря на высокую терапевтическую эффективность НЛ, большинство из них вызывают побочные эффекты, приводящие к серьезным расстройствам ЦНС, некоторые из которых необратимы. Поэтому в клинической психиатрии НЛ используются строго направленно (к примеру, при лечении шизофрении), когда другие препараты не дают лечебного эффекта. Так как побочные эффекты развиваются одновременно с терапевтическим действием НЛ, считают, что эти процессы неразрывно связаны друг с другом. Все это ограничивает клиническое использование этих препаратов и вносит дополнительные трудности при их применении. В каждом конкретном случае применение того или иного агента опреде-

ляется индивидуальной чувствительностью больного к побочным эффектам (Deniker, 1960; Snyder, 1987).

Побочные эффекты, возникающие при длительном лечении HJI можно разделить на две группы: неврологические (моторные нарушения экстрапирамидной системы мозга) и седативно-гипотензивные (успокаивающие и снижающие давление). Первыми из побочных неврологических эффектов HJ1 были описаны моторные нарушения, схожие с симптомами болезни Паркинсона (Delay et al., 1952; Deniker, I960; Bernheimer et al., 1973). Паркинсоноподобные моторные нарушения выражаются в основном в ригидности мышц, мышечном треморе, затрудненности движений, хотя могут варьировать от легкой гипокинезии до общей обездвиженности с маскообразностью лица, редким миганием и повышением тонуса мускулатуры конечностей (Manos et al., 1981). При длительном применении HJI кроме паркинсоноподобных наблюдаются и другие моторные нарушения - это разнообразные дискинезии: (1) в оральной области с напряжением глотательной и жевательной мускулатуры и мышц языка; (2) напряжение шейных мышц, приводящее к раскоординирован-ным и частым поворотам шеи; (3) нарушения при вращении глаз, аккомодации (Снежневский, 1985, С. 266-267). Картину нарушений экстрапирамидной системы мозга под действием HJI дополняют симптомы ака-тизии. Акатизивные симптомы проявляются в трудностях поддержания статичного положения (позы). Больные субъективно отмечают зуд в мышцах, поэтому вынуждены постоянно двигаться, стараясь избавиться от этих неприятных мышечных ощущений. Увеличение терапевтической дозы HJI усиливает симптомы акатизии (Marsden et al., 1975). Гипо - и гиперкинезивные моторные нарушения могут сочетаться в виде очень стойких двигательных расстройств у пожилых больных и сохраняться не только после снижения доз, но и долгое время после отмены лекарств. Перечисленные моторные нарушения экстрапирамидной системы мозга чаще возникают при длительном лечении производными бутирофенона и фенотиазина (Baldessarini, 1985).

Как отмечалось выше, хроническое применение HJ1 может сопровождаться мощным седативно-гипотензивным побочным эффектом. Такое действие больше характерно для HJ1 фенотиазинового ряда: CPZ и тиори-дазина. Предполагается, что в основе и седативного эффекта, и гипотен-зии лежат схожие механизмы действия (Klein and Davis, 1969; Johnstone et al., 1978).

Изучение терапевтических и побочных эффектов HJI привело к возникновению другой, нехимической классификации НЛ, согласно которой препараты делятся на две группы: классические (типичные) и атипичные (нетипичные).

Типичные HJI обладают мощным антипсихотическим действием, но и вызывают многочисленные экстрапирамидные моторные нарушения. Атипичные HJI не имеют столь же сильного т�