Получение трансгенных растений томата, продуцирующих химерный белок TBI-HBsAg, и изучение иммуногенных свойств плодов этих томатов

Поздняков, Сергей Геннадьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение трансгенных растений томата, продуцирующих химерный белок TBI-HBsAg, и изучение иммуногенных свойств плодов этих томатов
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Получение трансгенных растений томата, продуцирующих химерный белок TBI-HBsAg, и изучение иммуногенных свойств плодов этих томатов"

На правах рукописи

□□3451384

Поздняков Сергей Геннадьевич

ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ТОМАТА, ПРОДУЦИРУЮЩИХ ХИМЕРНЫЙ БЕЛОК ТВЬНВвА^ И ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОГЕННЫХ СВОЙСТВ ПЛОДОВ ЭТИХ ТОМАТОВ

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

з о е:;т2::з

Кольцово - 2008

003451384

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Щелкунов С.Н. Официальные оппоненты:

доктор химических наук Бунёва В.Н.

кандидат биологических наук Рыжиков А.Б.

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт цитологии и генетики Сибирского Отделения РАН (ИЦиГ СО РАН) г. Новосибирск.

Защита состоится 28 ноября 2008 года в 9 часов утра на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при Федеральном государственном учреждении науки Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор", Кольцово Новосибирской области, 630559.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Федерального государственного учреждения науки Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Автореферат разослан « {Ь » октября 2008 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

Карпенко Л.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вирусы ВИЧ и ВГВ являются возбудителями социально значимых, опасных заболеваний.

Два миллиарда человек из числа живущих сейчас в мире в течение жизни были заражены вирусом гепатита В. Около 350 миллионов из них остаются хронически носителями вируса, а это около 5% населения планеты. Носитель в течение многих лет может заражать гепатитом В здоровых людей, у него высок риск развития цирроза или рака печени. Ежегодно регистрируется 4 миллиона случаев острого гепатита В и около одного миллиона смертельных исходов. Около 300000 новых случаев заболевания происходят ежегодно несмотря на наличие вакцины. Ситуация обстоит особенно остро в странах, эндемичных по этому заболеванию. Как правило, это развивающиеся страны. Такие государства не могут позволить себе массовую закупку лицензированных парентеральных вакцин из-за их значительной стоимости. Инъекционные вакцины имеют ограниченную пригодность, а в условиях жаркого климата многих стран дорого и трудно поддерживать необходимый режим хранения. Вирус гепатита В по-прежнему ответственен за существенную заболеваемость и смертность на планете.

По данным ВОЗ, от синдрома приобретенного иммунодефицита ежегодно умирает 2-3 млн. человек. К настоящему времени ВИЧ инфицировано около 40 млн. человек; 22 млн. людей уже умерло. Хотя активная пропаганда способов профилактики снизила темпы распространения ВИЧ в развитых странах, ежедневно на Земле заражаются примерно 15 тысяч человек.

Известно, что вакцинация - наиболее эффективный путь защиты от вирусных заболеваний. В настоящее время международные эксперты и правительства большинства стран рассматривают вакци-нопрофилактику как наиболее доступный и экономически эффективный способ снижения смертности, увеличения ожидаемой продолжительности жизни и достижения активного долголетия во всех социальных группах развитых и развивающихся стран. Вакцины ежегодно предотвращают до трех миллионов смертей. За XX столетие средняя продолжительность жизни людей увеличилась примерно на 30 лет, что в немалой степени обусловлено массовой вакцинацией.

В этой связи, разработка новых вакцин против ВИЧ и ВГВ является необходимой мерой для предотвращения дальнейшего развития этих грозных заболеваний. При этом немаловажное значение должны иметь такие преимущества новых вакцин как низкая себестоимость, безопасность, эффективность, простота хранения и использования, а также доступность. Всем этим требованиям отвечают новейшие разработки в области съедобных вакцин на основе трансгенных растений.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы было получение трансгенных растений томата, продуцирующих химерный белок TBI-HBsAg, содержащий антигенные детерминанты вирусов гепатита В (ВГВ) и иммунодефицита человека (ВИЧ), изучение плодов этих томатов в качестве кандидаткой съедобной вакцины против ВГВ и ВИЧ.

Для этого потребовалось решение следующих задач:

1. Создание в системе Е. coli рекомбинантной плазмиды на основе бинарного агробактериального вектора, которая несет последовательность гена TBI-HBS и способна интегрировать часть своей ДНК в геном растения. Трансформация полученной плазмидой агробакте-рии и отбор клонов агробактерии, содержащих плазмидную ДНК.

2. Получение трансгенных растений томата и подтверждение встройки гена TBI-HBS в геном отобранных растений.

3. Анализ продукции целевого белка TBI-HBsAg в полученных трансгенных растениях.

4. Анализ иммуногенности против ВГВ и ВИЧ плодов трансгенных томатов в эксперименте кормления ими мышей.

5. Получение гибридной плазмиды pcDNA-TBI-HBsAg, кодирующей целевой химерный белок TBI-HBsAg и обладающей свойствами ДНК-вакцины. Изучение влияния дополнительной ДНК-вакцинации на мышей, энтерально иммунизируемых плодами трансгенных томатов.

Научная новизна и практическая значимость работы. ВОЗ

и различные другие социальные организации указывают на потребность в новых технологиях получения дополнительных вакцин против инфекционных болезней, что позволило бы увеличить глобальную иммунизированность населения и понизить стоимость вакцин.

Огромное значение придается безыгольной доставке вакцин и их термостабильности, как ключевым элементам в достижении этой цели.

В настоящей работе впервые выбрана стратегия создания съедобной вакцины на основе трансгенных растений томата.

Впервые при разработке съедобных вакцин использована химерная конструкция антигена, одновременно сочетающая свойства антигенных белков двух различных вирусов. Используя гибридный ген TBI-HBS, кодирующий синтез поверхностного антигена ВГВ и искусственного иммуногена ВИЧ, получили генетическую конструкцию, в которой целевой белок TBI-HBsAg находится под контролем промотора 35S вируса мозаики цветной капусты в составе бинарного агробакгериального вектора. Созданная плазмида pBIN_TBI-HBS была использована для получения трансгенных растений томата.

Иммунизацию лабораторных животных проводили энтераль-ным введением водной взвеси порошка сушеных плодов трансгенного томата. Результаты экспериментов на лабораторных животных, впервые доказали возможность получения специфического антительного иммунного ответа при кормлении животных плодами трансгенных томатов.

Основные положения, выносимые на защиту:

Генетические конструкции, кодирующие химерный иммуно-генный против вирусов ВГВ и ВИЧ белок TBI-HBsAg - плазмиды pBINTBI-HBS и pcDNA-TBI-HBsAg.

Кормление мышей плодами трансгенного томата, экспресси-рующего белок TBI-HBsAg, приводит к развитию мукозального и системного антительных ответов против ВГВ.

Публикация и апробация работы. По материалам диссертации опубликованы 4 статьи в реферируемых изданиях. Результаты работы представлены на международных конференциях: 9-я Международная Конференция "СПИД, РАК И РОДСТВЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ" (Санкт-Петербург, 2001), International Symposium on Plant-Derived Vaccines and Antibodies: Potential and Limitations, (Annecy, France 2004), 15th International AIDS Conference (Bangkok, Thailand 2004), 13-я Международная Конференция "СПИД, РАК И РОДСТВЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ" (Санкт-Петербург, 2005), Международный междисциплинарный симпозиум (Судак, Крым,

Украина 2005), 14th International Symposium on HIV and Emerging Infectious Diseases. (Toulon, France 2006), Третья международная конференция "Геномика, протеомика, биоинформатика и нанотехноло-гии для медицины" (Новосибирск, 2006).

Структура и объем диссертацию. Диссертационная работа состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждения», «Заключение» и «Выводы». Работа изложена на 151 страницах, содержит 25 рисунков, 4 таблицы. Библиография включает 238 литературных источников.

Вклад автора. Получение плазмидных конструкций осуществлено автором совместно с Рыжовой Т.С. и Гавриленко E.H., секвени-рование генетических конструкций осуществлено лично автором.

Получение трансгенных растений томата поколения То и Ti выполнено сотрудниками Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН (СИФИБР СО РАН, г. Иркутск).

Разработка эксперимента по иммунизации мышей выполнена автором совместно с А.Е. Нестеровым. Энтеральная иммунизация мышей и сбор материала для анализа выполнены А.Е. Нестеровым.

Анализ экспрессии целевого белка в тканях трансгенных томатов и анализ гуморального системного и мукозального иммунного ответов у мышей осуществлено лично автором.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Конструирование плазмиды растительной трансформации

Для получения генетической конструкции с целевым геном, кодирующим антигенный белок одновременно против ВГВ и ВИЧ-1, нами был использован химерный ген TBI-HBS. Участок TBI является синтетическим ген-эквивалентом, искусственного полипептида, составленного из иммуногенных эпитопов вирионных белков Env и Gag вируса иммунодефицита человека (Т- and B-cellular Immuno-genes) (Рис. 1).

Нами предполагалась относительно высокая иммуногенность химерного белка TBI-HBsAg в связи с тем, что HBsAg может собираться в вирусоподобные частицы, а полипептид TBI при этом мог располагаться на поверхности этих частиц. Для получения регуляторных последовательностей экспрессии в клетках растения использовали донорную плазмиду pRT104 (Рис. 2), содержащую сильный

конститутивный промотор вируса мозаики цветной капусты р358, и сигнал полиаденилирования мРНК вируса мозаики цветной капусты (ро1у-А сигнал).

епу(255-26б)

еш<102-118)

*nv(309-317) env(421-437)

____40.........50.........60

lgtHGIRP VVSYQLq;

pqtORGPGRAFq

env(730-742) env(827-841) gag(351-361) gag(291-305) ...70.........80.........90........100........110........120

83202-109)

130........140. ..146

Рис. 1. Последовательность искусственного белка TBI. Над последовательностью аминокислот указано положение Т- и В- клеточных эпитопов TBI в белках ВИЧ. Аминокислотные последовательности эпитопов написаны заглавными буквами, Т-клеточные эпитопы выделены темно-серым цветом, а В-клеточные - светло-серым цветом

Из плазмиды pRT104 предварительно с помощью ферментов был удален ген Р-глюкуронидазы (Рис. 2, этап I). Полученный вектор, назвали pRT104_dG. Целевой ген TBI-HBS получали из плазмиды pTBIk2 путем ПЦР. Подготовленный фрагмент последовательности TBI-HBS лигировали с вектором pRT104_dG. После трансформации клеток E.coli XLl-Blue лигазной смесью было получены колонии, часть которых содержала искомую плазмиду. Таким образом, была создана гибридная плазмида pRT 104TBI-HBS (Рис. 2, этап II), в которой целевой ген TBI-HBS находится под контролем промотора p35S и ограничен poly-A сигналом на 3'-конце.

Эта конструкция послужила промежуточным звеном к созданию модифицированного варианта целевого гена, несущего последовательность Козак, которая повышает уровень трансляции мРНК в эукариотических клетках (Рис. 2, этап Ш).

Плазмидную конструкцию с добавочной последовательностью Козак назвали pRTTBI-HBS-б (Рис. 2, этап IV) и уже ее использовали для переноса целевого гена и всех его регуляторных последовательностей в бинарный вектор трансформации растений.

. ЯамМ Л1а1

p-tfuc

Вю!КI

pol1-A tlgntl

i^fte

■SAr ■Hirdm

промотор-TGGAGAGGACCrCGACrrCX; l'CACCATKCi VTCTGCAGACT

(Сотак

toxi»

№at am («mMSt(

—.V«»l£453)

'»wtB«

TBI-HBl

Рис. 2. Схема получения плазмиды рЯПЫ-ИВБ-б, содержащей вставку кодирующей последовательности ТВЬНВБ и последовательности Козак (Этапы 1-1У)

Получение плазмиды растительной трансформации рВШ_ТВ1-НВ8

В качестве бинарного вектора использовали плазмиду рВШ-РШв/АЯЗ (Рис. 3), Т-ДНК участок которой имеет функционирующий в растениях ген неомицинфосфотрансферазы (ЫРТН), позволяющий отбирать регенеранты растений на селективной среде с канами-цином. В качестве источника, содержащего целевые последовательности нуклеотидов:

Рис. 3. Структура бинарного вектора агробактериальной трансформации растений pBinplus/ARS. RB, LB — концевые повторы Т-ДНК плазмиды Ti; oriV, trfA (relaxosome protein RP)—генетические элементы плазмиды с широким кру-гом хозяев, обеспечивающие ее репликацию; nptIII — ген устойчивости к канамицину (белок аминогликозид 3' фосфотрансфераза), функционирую-щий в бактериях; Pubi3-UQ-nptII-Tubi— гибридный ген ubiquitin-NPTII, экспрессирующийся в растениях и обеспечивающий устойчивость к канамицину; Promotor Р1 (ubi), Т ubi— промотор и термина-тор гена ubi, кодирующего убиквитин

промотор p35S, последовательность Козак, ген TBI-HBS и poly-A сигнал, использовали плазмиду pRTTBI-HBS-б. Вектор pBINPLUS/ ARS имеет в составе своей полилинкерной последовательности (внутри Т-области) сайт рестрикции HindUI, а целевой фрагмент <фЗ5S-TBI-HBS-polyA» в плазмиде pRTTBI-HBS-б фланкирован сайтами НМШ с обеих сторон. Это позволило перенести необходимый участок ДНК из плазмиды pRTTBI-HBS-б в pBINPLUS/ARS (Рис. 4) лигированием по HindUI. Таким образом, была получена новая генетическая конструкция и обозначена pBIN_TBI-HBS (Рис. 4 Д). Структуру плазмиды подтверждали с помощью ПЦР и рест-рикционного анализа. Входящий в плазмиду фрагмент p35S-TBI-НВ S-polyA был секвенирован и показано, что последовательность нуклеотидов соответствовала ожидаемой. Как и планировалось, в созданной плазмиде pBIN_TBI-HBS целевой ген TBI-HBS находится в составе Т-ДНК под контролем сильного конститутивного промотора вируса мозаики цветной капусты p35S, соединен с последовательностью Козак и ограничен сигналом полиаденилирования на 3'-конце.

Перенос плазмиды pBIN_TBI-HBS в клетки агробактерии

Перенос готовой конструкции pBIN TBI-HBS в клетки Agro-bacterium tumefaciens агробактерий штамма LBA4404 проводили совместно с СИФИБР СО РАН. Селекцию трансформированных колоний осуществляли на агаризованной среде YEP с добавлением рифампицина (селекция на присутствие хелперной плазмиды) и канамицина (селекция на наличие бинарного вектора pBINPLUS/ Ars). Проверку трансформированных клонов агробактерий осуществляли с помощью ПЦР-скрининга и рестрикционного анализа. Таким образом, для последующего переноса целевого фрагмента ДНК в растения была отобрана кпональная культура агробактерии штамма LBA4404 трансформированная плазмидой pBIN_TBI-HBS.

Создание трансгенных растений

Сотрудники СИФИБР из семян томата сорта Вентура получали эксплантаты для агробактериальной трансформации. Трансформацию растений осуществляли уколом иглы в раневую поверхность (от удаления верхушечной почки (метод «фламинго»)),

oriKl'4

ori Colli I

ям HI

XfT/ll

Д«П1'Ллт111_ polj A

/Mil

TBl-HBS

Л'сЫ

Amp'

/МШ

tfmdIII

RB ori Colli i ,\'P Till

rl-■-«-—

I'-ubB xrm T-uhiJ

p35S

TBl-HBS

НШМ

ori RP4

pBIXPLl/S/ARS

—§■<-ХГЭО-j iCZCiC

LB HimJill /««dill

ДНК-лигаза

|4>ivA

Hmdill

ori RW

f»!vA

TB1-I1BS

ori СЫЕ1

T-ubi3 "* LB

XPTII P-ubB

M'Tlll

Рис. 4. Схема создания конструкции pBIN_TBI-HBS

инфицированной агробактериями Agrobacterium tumefaciens LBA4404(pBIN_TBI-HBS). Всего было трансформировано более 2000 эксплантов томата. Проростки без инфицирования агробактериями - служили контролем. Инфицированные и неинфицированные агробактериями проростки культивировали in vitro в течение 15-20 суток на среде, с добавлением канамицина и цефотаксима. Через 3-4 недели получили 900 регенерантов томата, сформировавшихся в раневом наплыве апекса и давших корни на селективной среде с кана-мицином. Регенераты отделяли от основного растения, переносили на среду того же состава и помещали для культивирования в термо-статируемую световую комнату.

Селекция на канамицине показала, что контрольные проростки не образовывали корней, останавливали рост и погибали. Выжившие регенераты после доращивания высаживали в гидропонные условия на фитотроне до получения плодов (поколение То).

Для исключения мозаичности растения по целевому гену, которое присутствует в поколении То, были получены полностью трансгенные растения поколения Ть Для этого из зрелых плодов томатов поколения Т0 брали семена, из них выращивали проростки, которые "проводили" через селективную среду с канамицином. В результате получили 7 растений поколения Tj. Данные растения обозначили: 111, 11-2,13-1,13-2,13-3,134 4.

Анализ интеграции целевого гена в геном растений

Для того чтобы проанализировать растения томата на транс-генность по NPTII и TBI-HBS мы выделяли геномную ДНК из листьев и с ней и соответствующими праймерами проводили ПЦР. Результаты ПЦР-анализа подтвердили наличие этих двух генов в тканях растений, выживших на селективной среде.

Наличие генов NPTII и TBI-HBS в листьях трансгенных растений поколения Ti также выявляли с помощью ПЦР. В качестве отрицательного контроля использовали листья нетрансформированного растения томата сорта Вентура, в качестве положительного контроля - плазмиду pBIN TBI-HBS. По данным ПЦР-анализа, встройка гена NPTII и целевого TBI-HBS была надежно выявлена у растений 11-2, 13-1,13-2,13-3,13-4 и 4.

Анализ продукции белка TBI-HBsAg в трансгенных растениях

Листья и плоды томатов по мере подрастания и созревания неоднократно исследовали на наличие в них целевого белка TBI-HBsAg с помощью ИФА на белок HBsAg. Наиболее типичные результаты ИФА по определению HBsAg, представленные на Рис. 5, демонстрируют, что в листьях и плодах большинства трансгенных растений томата присутствуют антигенные детерминанты белка HBsAg.

При анализе препаратов плодов томатов была выявлена группа плодов бурой стадии созревания, в которой ИФА обнаруживал высокие значения ОП (Рис. 6). Данные плоды использовались для иммунизации мышей.

Наличие последовательности полиэпитопного искусственного полипептида TBI в данных трансгенных растениях показано при анализе экстрактов листьев и плодов с использованием тест-системы ИФА на белок р24 HIV, один из эпитопов которого входит в состав TBI (данные анализов СИФИБР, не приведены). При этом также наблюдали разнообразие клонов по уровню экспрессии целевого белка, что характерно для трансгенных растений.

Конструирование плазмиды для ДНК-вакцинации

В качестве вектора для ДНК-вакцины использовали плазмиду pcDNA3.1(+). В состав вектора входят промотор цитомегаловируса, узнаваемый эукариотической РНК-полимеразой, и сигнал полиаде-нилирования, позволяющие эффективно экспрессировать целевой ген в клетках эукариот; полилинкер для клонирования генов; бактериальный участок начала репликации для получения плазмидной ДНК в клетках E.coli; ген устойчивости к неомицину и ген устойчивости к ампициллину для селекции колоний E.coli, содержащих данную плазмиду. Кроме того, ген устойчивости к ампициллину несет в своем составе иммуностимулирующие (ISS) последовательности. Ген TBI-HBsAg был перенесен из плазмиды pl8-TBI-HBsAg в вектор pcDNA3.1(+) с помощью ПЦР и лигирования. Для дальнейшей работы брали плазмиду с прямой ориентацией целевого фрагмента, названную pcDNA-TBI-HBsAg (Рис. 7), где ген TBI-HBsAg находится под контролем промотора цитомегаловируса и на 3'-конце имеет

(А)

160 140 120 100 80

£ 60

(Б)

250

200

| 150

т 100 X

№13(1) N813(2) №13(3) №13(4) Образцы

№13(1) №13(2) №13(3) Образцы.

№13(4)

Рис. 5. Определение НВэА§ в тканях томатов, трансформированных геном ТВЬНВБ. Поколение Т1. А - в листьях, Б - в плодах. К - нетрансген-ное растение; 13(1) - 4 - трансгенные растения. Приведены средние значения и доверительный интервал концентрации ТВ1-НВзА§ (нг/мл) в свежей ткани растения (уровень значимости а = 0,05 или Р=95%)

200

| 150

Ш 100 I

ГЛ

Кнаб+

К наб- К томат-

13-1 Образцы.

13-2

13-3

13-4

Рис. 6. Определение НВзА§ в сушеных образцах плодов томатов, трансформированных геном ТИ-НВБ. Плоды на стадии созревания («бурая окраска»). Поколение Т1. Столбцы К наб+, К наб- - положительный и отрицательный контроля набора ИФА, столбец К томат- - нетрансгенное растение; 13-1, 13-2, 13-3, 13-4 - трансгенные растения. Приведены средние значения и доверительный интервал концентрации ТВ1-НВзА§ (нг/мл) в пересчете на ткань свежего плода (уровень значимости а = 0,05 или Р = 95%)

сайт полиаденилирования. Первичная структура целевого гена полученной плазмиды pcDNA-TBI-HBsAg подтверждена секвенировани-ем. Предварительно в эксперименте на мышах, в нашей лаборатории было показано, что такая генетическая конструкция обеспечивает экспрессию иммуногена в эукариотической клетке и работает как ДНК-вакцина при инъекции лабораторным животным.

Анализ иммуногенности плодов трансгенных томатов

С целью изучения иммуногенности плодов трансгенных томатов было проведено два эксперимента по энтеральной иммунизации мышей. Первый из них - ориентировочный послужил базой для второго основного эксперимента. В первом эксперименте плоды томата поедались мышами добровольно. При таком кормлении, оказалось трудно иммунизировать всех мышей рассчитанным стандартным

pUCori

SV40

/ \ ñxRI (2099) BGHpA

BamHL /Bglü

Neor

SV40ori

Рис. 7. Схема гибридной плазмиды pcDNA-TBI-HBsAg. Целевой ген TBI-HBsAg показан дугой (участок HBsAg окрашен черным). Черным цветом выделены гены: ampr (ген устойчивости к ампициллину) и neor (ген устойчивости к неомицину). Серым цветом выделены регуляторные элементы: Pcmv (ранний промотор-энхансер цитомегаловируса человека), BGHpA (сигнал полиаденилирования ростового гормона быка), SV40 рА (ранний сигнал полиаденилирования SV40), SV40 ori (ранний промотор и начало репликации SV40), pUC ori (начало репликации pUC)

количеством целевого антигена. Разные мыши поедали плоды томата в разных количествах. Но все-таки, на 14 сутки в фекалиях опытной группы животных удалось обнаружить антитела к белкам ВИЧ и высокое содержание антител к HBsAg. Это указывало на формирование антительного ответа слизистой кишечника на целевой белок TBI-HBsAg.

Первый эксперимент на животных показал принципиальную возможность получения специфического иммунного ответа у мышей после поедании плодов трансгенных томатов. Для дальнейшего изучения иммуногенности кандидатной съедобной вакцины на основе плодов трансгенного томата был проведен второй эксперимент по оральной иммунизации мышей (Рис. 8). На этот раз были взяты плоды с высокими содержанием HBsAg, не менее 200 нг HBsAg на 1 г сырого веса (Рис. 6), эти плоды были лиофильно высушены, перемолоты и объединены в единую гомогенную смесь.

Это позволило многократно использовать в эксперименте по иммунизации стандартный гомогенный порошок-образец.

Изучали 3 группы мышей линии BALB/c. Две экспериментальные группы животных трижды получали препараты плодов трансгенного или нетрансгенного томата, по запланированной схеме иммунизации, а контрольная группа получала только стандартный рацион без томатов (Таблица 1, дни иммунизации томатом выделены жирным шрифтом). Препараты смесей сушеных плодов томатов разводили дистиллированной водой до концентрации 100 мг сухого томата в 1 мл и вводили животным экспериментальных групп по 1 мл принудительно в пищевод через катетер. Такой способ приготовления плодов и кормления был выбран с целью максимальной стандартизации эксперимента. По результатам ИФА, во вводимой нами смеси количество HBsAg составляло не менее 200 нг/мл. Такая доза была, например, в 2 раза выше эффективной оральной дозы, установленной для иммуно-генного белка самосборки L1 вируса папилломы человека и приблизительно в 10 раз меньше, чем при оральной иммунизации чистым L1 белком.

Кроме того, в этом эксперименте было решено изучить влияние эффекта дополнительной инъекционной иммунизации животных ДНК -вакциной.

Гомогенаты сушеных томатов в форме суспензии вводили животным на сроках 0,14 и 28 суток эксперимента. Антитела к HBsAg и TBI в сыворотке крови и фекалиях животных тестировали еженедельно по 56-ые сутки эксперимента, всего 8 раз. Тест-системы для анализа HBsAg и TBI в сыворотке и фекалиях мышей использовали те же, что и в первом эксперименте - производства ЗАО "Векгор-Бест" D-0562 (суммарные антитела к HBsAg) и D-0172 (суммарные антитела к ВИЧ -1, ВИЧ-2). Для анализа забирали по 5 особей из каждой группы. Сыворотки от 5 животных смешивали и анализировали как единую смесь. Таким же образом смешивали и анализировали экстракты фекалий. Показатели ОП оказались близкими в двух повторах ИФА.

Результаты выполненных анализов с использованием тест-системы D-0562 показали (Рис. 9А), что уровень суммарных антител против HBsAg в сыворотке крови мышей начинает фиксироваться в первой же пробе после второго кормления (через 7 суток) и держится высоким до конца эксперимента (выше 200 мМЕ/мл), во всех остав-

шихся шести еженедельных пробах. Мукозальный иммунный ответ против ВГВ (суммарные антитела), детектируемый в фекальных массах, начинался раньше, в первой же пробе после первого кормления (Рис. 9Б), и выявлялся на высоком уровне (выше 200 мМЕ/мл) до конца эксперимента, во всех оставшихся восьми еженедельных пробах. Надо заметить, что для человека принятый минимальный протектив-ный уровень антител против ВГВ в сыворотке крови составляет 10 мМЕ/мл.

Тот же образец томата вызывал системный антительный иммунный ответ у мышей против ВИЧ. Это обнаруживалось в сыворотке крови, после второго кормления (Рис. 10А). При анализе фекалий на антитела к ВИЧ (TBI), как и в случае с антителами к ВГВ (HBsAg), антительный ответ начинал продуцироваться заметно раньше по сравнению с ответом, выявляемым в сыворотке крови (Рис. 10Б). Уровни ОП в ИФА на антитела к ВИЧ превосходили показатели ОП контрольной группы мышей с обычной диетой (без трансгенных томатов) в двух повторах ИФА (Рис. 10А), однако значения ОП находились на уровне ОПкрит=0,237 набора для антител сыворотки и ниже ОПкрит для антител фекалий. Количественно сопоставить гуморальный ответ на ВГВ и ВИЧ в нашем исследовании было не возможно из-за особенностей используемых тест-систем на антитела к ВГВ и ВИЧ. Набор к ВГВ предназначен для определения антител непосредственно на белок HBsAg, а набор к ВИЧ детектирует антитела к gp41, а не прямо к TBI. Только некоторая часть антител к TBI реагирует с рекомбинангным белком gp41 ВИЧ, что существенно снижает чувствительность тест-системы при анализе антител к TBI. Кроме того, возможности тест-системы на ВИЧ-антитела, в отличие от возможностей тест-системы на HBsAg-антитела, не позволяют определить уровень гуморального ответа в стандартных единицах (МЕ/л).

Для проверки того, будет ли происходить усиление иммунного ответа против целевого белка TBI-HBsAg при комбинированном использовании съедобной вакцины и ДНК-вакцины, на 42 сутки эксперимента 10 животным группы, получавшей препарат трансгенных плодов, вводили внутрибрюшинно по 50 мкг плазмиды pcDNA-TBI-HBsAg, экспрессирующей в клетках млекопитающих полипептид TBI-HBsAg. Оказалось, что введение pcDNA-TBI-HBsAg не сказывалось на уровне высокого антительного ответа против HBsAg, наблюдаемого

<о

Ияъехдяя

ПЛДЗМИДЫ

сутки 49 суткя 56 сутки

Получение сыворовси крови н осветленного экстракта фекалий от каждых пяти мышей и их заморозка до конца сбора материала

1. ИФА на АТ к ВГВ смеси швороткн от каждых пяти мышей

2. ИФА на АТ к ВИЧ смеси сыворотки от каждых пяти мышей

3. ИФА на АТ к ВГВ смеси осветленного экстракта фекал нй от каждых пяти мышей

4. ИФА на АТ к ВИЧ смеси осветленного экстракта фекалий от каждых пяти мышей

Рис. 8. Графическая схема иммунизации мышей первой (опытной) группы препаратами сушеных плодов томата и забора биоматериала

Таблица 1. Полная схема иммунизации мышей препаратами сушеных плодов томата и забора

биоматериала

Группы мышей Действия с мышами, их количество в процедуре * , Сутки . >..„,- |

0 7 14 21 28 35 42 49 56

1 Кормление трансгенным томатом Наличие мышей в группе после изъятия на анализ, но до иммунизации (шт.) 50 45 40 35 30 25 20 10 0

Кормление томатной пастой (г/мышь)

Количество мышей, без инъекции плазмцды, изымаемых для И ФА (шт.) 5 5 5 5 5 5 5 5 5

Мыши с инъекцией рсОЫА-ТВЖВз (шт.) 10

Количество мышей для ИФА после инъекции плазмиды (шт.) 5 5

V .... - ::•> ■ Т А.»- и — ■ г

2 Кормление нетрансгенным томатом Наличие мышей в группе после изъятия на анализ, до иммунизации (шт.) 40 35 30 25 20 15 10 5 0

Кормление томатной пастой О/мышь)

Количество мышей на анализ (шт.) 5 5 5 5 5 5 5 5 5

нр ...........» "

3 Кормление без томатов Наличие мышей в группе после изъятия на анализ, но до иммунизации (шт.) 50 45 50 35 30 25 20 10 0

Количество мышей, без инъекции плазмиды, изымаемых для ИФА (шт.) 5 5 5 5 5 5 5 5 5

Мыши с инъекцией рсОЫА-ТВЖВз (шт.) 10

Количеством мышей на анализ после инъекции плазмиды (шт.) 5 5

Сутки

Рис. 9(А), Динамика уровня суммарных антител против НВзА£ в сыворотке крови мышей после кормления трансгенными (..........Д......■) и нетрансгенными (■—♦ — ) томатами и инъекции ДНК-вакцины (—Ж -).

В каждом анализе объединен материал от 5 мышей. Тонкими вертикальными стрелками указаны дни скармливания томатов. Толстой короткой стрелкой указан день парентеральной иммунизации ДНК-вакциной

о ю

С О

1— I— ~--"7

т-

Рис. 9(Б). Динамика уровня суммарных антител против НВзА§ в фекалиях мышей после кормления трансгенными ) и нетрансгенными (»........♦ — ) томатами и инъекции ДНК-вакцины (-"Ж -). В ка-

ждом анализе объединен материал от 5 мышей. Тонкими вертикальными стрелками указаны дни скармливания томатов. Толстой короткой стрелкой указан день парентеральной иммунизации ДНК-вакциной

Сутки

Рис. Ю(А). Динамика уровня суммарных антител против ВИЧ в сыворотке крови мышей после кормления трансгенными (......И.........) и нетрансгенными ( «ф ■») томатами и инъекции ДНК-вакцины (—Ж -).

0,20 л

0,16-

0,12

0,08-

0,04-

0,00

28 Сутки

Рис. 10(Б). Динамика уровня суммарных антител против ВИЧ в фекалиях мышей после кормления трансгенными (......'И1.....) и нетрансгенными (—♦ — ) томатами и инъекции ДНК-вакцины (—Ж -). В каждом анализе объединен материал от 5 мышей. Тонкими вертикальными стрелками указаны дни скармливания томатов. Толстой короткой стрелкой указан день парентеральной иммунизации ДНК-вакциной.

после кормления трансгенными томатами (Рис. 9 А, Б). Только системный гуморальный иммунный ответ против ВИЧ после ДНК-вакцинации значимо, хотя и некритически возрастал, превышая С)Пкрит=0,237 набора на антитела к ВИЧ. (Рис. 10А). Как и ожидалось, инъекция плазмиды рсВМА-ТВ1-НВзА§ не сказывалась на продукции антител против ВИЧ, секретируемых слизистыми кишечника (Рис. 10Б), поскольку плазмиду вводили парэнггерально, т.е. минуя слизистые оболочки.

Выводы

1. Сконструирована гибридная плазмида рВШ_ТВ1-НВ8 на основе бинарного агробактериального вектора, кодирующая целевой химерный белок ТВЬНВбА^. Получен штамм агробактерии ЦВА__ТВ1-НВБ, несущей данную плазмиду.

2. Получены трансгенные растения томата, экспрессирующие белок TBI-HBsAg. ПЦР-амплификацией доказана встройка в геном этих растений целевого трансгена.

3. Продукция целевого белка в трансгенных растениях томата подтверждена с помощью ИФА и показано что отдельные растения существенно различаются по продукции TBI-HBsAg.

4. Впервые показано, что иммунизация мышей кормлением плодами трансгенного томата индуцирует высокий антительный иммунный ответ против HBsAg как в сыворотке крови, так и в слизистой кишечника. При этом в слизистой кишечника антитела против HBsAg начинают регистрироваться во всех пробах после первого кормления, а в сыворотке крови - только после второго кормления препаратом кандидатной съедобной вакцины.

5. Сконструирована гибридная плазмида pcDNA-TBI-HBsAg, кодирующая целевой химерный белок ТВГ-НВэА^ Показано, что дополнительная парентеральная иммунизация мышей кандидатной ДНК-вакциной, кодирующей химерный белок TBI-HBsAg, не влияет на специфичный иммунный ответ против ВГВ.

Результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Щелкунов С.Н., Саляев Р.К., Рекославская Н.И., Рыжова Т.С., Поздняков С.Г., Сумцова В.М., Пакова Н.В., Мишутина У.О., Копы-тина Т.В., Хэммонд Р.В. Получение трансгенных растений томата,

продуцирующих химерный белок TBI-HbsAg. // Докл РАН. - 2004. -V. 396. -№ 1.-Р. 121-125.

2. Щелкунов С.Н., Саляев Р.К., Рыжова Т.О., Поздняков С.Г., Нестеров А.Е., Рекославская Н.И., Сумцова В.М., Пакова Н.В., Мишу-тина У.О., Копытина Т.В., Хэммонд Р.В. Создание кандидатной съедобной вакцины против вирусов гепатита В и иммунодефицита человека на основе трансгенного томата. // Вест РАМН. - 2004. - № 11.-Р. 50-55.

3. Щелкунов С.Н., Саляев Р.К., Рекославская Н.И., Поздняков С.Г., Нестеров А.Е., Сумцова В.М., Пакова Н.В., Мишутина У.О., Копытина Т.В., Хэммонд Р.В. Изучение иммуногенных свойств кандидатной съедобной вакцины против вирусов гепатита В и иммунодефицита человека на основе плодов трансгенных растений томата. // Докл РАН. - 2005. - V. 401. - № 5. - Р, 709-711.

4. Shchelkunov S.N., Salyaev R.K., Pozdnyakov S.G., Rekoslavskaya N.I., Nesterov A.E., Ryzhova T.S., Sumtsova V.M., Pakova N.V., Mishutina U.O., Kopytina T.V., Hammond R.W. Immunogenicity of a novel, bivalent, plant-based oral vaccine against hepatitis В and human immunodeficiency viruses. // Biotechnol Lett. - 2006. - V. 28. - № 13. - P. 959-967.

Изд. лиц. ИД № 04060 от 20.02.2001

Подписано к печати и в свет 10.10.2008 Формат 60x84/16. Бумага № 1. Гарнитура "Times New Roman".

Печать оперативная. Печ. л. 1,5. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100. Заказ № 160 Институт неорганической химии им. Николаева СО РАН. Просп. Акад. Лаврентьева, 3, Новосибирск, 630090

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Поздняков, Сергей Геннадьевич

Список сокращений.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Противовирусные вакцины.

1.1.1. Цельновирионные вакцины.

1.1.1.1. Живые аттенуироваиные вакцины.

1.1.1.2. Инактивированные вакцины.

1.1.2. Вакцины на основе вирусных антигенов.

1.1.2.1. Живые генно-инженерные поливалентные вакцины.

1.1.2.2. ДНК-вакцины.

1.2. Мукозальные вакцины.

1.2.1. Иммунитет слизистых оболочек.

1.2.2. Съедобные вакцины на основе трансгенных растений.

1.2.2.1. Перенос генов из бактерий рода Agrobacterium в растения.

1.2.2.2. Экспрессия чужеродных генов в растениях.

1.2.2.3. Противовирусные вакцины на основе трансгенных растений.

2. Материалы и методы.

2.1. Материалы.

2.1.1. Реактивы, наборы реактивов, ферменты.

2.1.1.1. Наборы реактивов.

2.1.1.2. Реактивы.

2.1.1.3. Ферменты и маркеры молекулярных весов.

2.1.2. Оборудование и материалы.

2.1.3. Бактериальные штаммы, плазмиды.

2.1.4. Буферы, растворы, среды.

2.1.4.1. Буферы.

2.1.4.2. Растворы для трансформации клеток Е. coli.

2.1.4.3. Растворы для выделения плазмидной ДНК.

2.1.4.4. Питательные среды.

2.1.5. Список праймеров.

2.1.6. Наборы для проведения ИФА.

2.1.7. Растения.

2.2. Методы.

2.2.1. Гидролиз плазмидной ДНК эндонуклеазой рестрикции.

2.2.2. Лигирование.

2.2.3. Приготовление компетентных клеток Е. coli.

2.2.4. Трансформация клеток Е. coli.

2.2.5. Выделение плазмидной ДНК в аналитических количествах.

2.2.6. Анализ нуклеотндных последовательностей ДНК.

2.2.7. Полимеразная цепная реакция.

2.2.8. Введение в З'-ОН конец фрагмента ДНК ct-32P-dNTP и a-33P-dNTP

2.2.9. Гибридизация.

2.2.10. Определение нуклеотндных последовательностей ДНК.

2.2.11. Очистка реакционной смеси для секвенирования.

2.2.12. Анализ продукции TBI-HBsAg в тканях трансгенных растений.

2.2.13. Иммунизация мышей.

2.2.14. Анализ продукции антител у иммунизированных мышей.

2.2.15. Статистическая обработка данных ИФА.

3. Результаты и обсуждение.

3.1. Конструирование плазмиды растительной трансформации.

3.2. Получение плазмиды pBINTBI-HBS.

3.3. Перенос плазмиды pBINTBI-HBS в клетки агробактерии.

3.4. Создание трансгенных растений.

3.5. Анализ интеграции целевого гена в геном растений.

3.6. Анализ продукции белка TBI-HBsAg в трансгенных растениях.

3.7. Конструирование плазмиды для ДНК-вакцинации.

3.8. Анализ иммуногенности плодов трансгенных томатов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение трансгенных растений томата, продуцирующих химерный белок TBI-HBsAg, и изучение иммуногенных свойств плодов этих томатов"

Актуальность проблемы. Вирусы гепатита В (ВГВ) и иммунодефицита человека (ВИЧ) являются возбудителями социально j значимых заболеваний.

Два миллиарда человек из числа живущих сейчас в мире в течение жизни были заражены вирусом гепатита В. Около 350 миллионов из них остаются хроническими носителями вируса, а это около 5% населения планеты (Kumar et al., 2007). Носитель в течение многих лет может заражать гепатитом В здоровых людей, у него высок риск развития цирроза или рака печени. Ежегодно регистрируется 4 миллиона случаев острого гепатита В и около одного миллиона смертельных исходов. Первичный рак печени, вызванный вирусом гепатита В, является сейчас одной из ведущих причин смерти от рака в Африке, Азии и Тихоокеанском регионе. Исследования проведенные в 1996 г. в США показали, что приблизительно 115 миллионов человек были заражены ВГВ за те 10 лет, в течении которых субъединичная вакцина, полученная из дрожжей, была вполне доступна. Около 300000 новых случаев заболевания происходят ежегодно несмотря на наличие вакцины (Thanavala et al., 2005; Дэйви, 1996). В настоящее время иммунизированность населения даже в США остается ниже необходимых норм. Ситуация обстоит еще хуже в странах, эндемичных по этому заболеванию. Как правило это развивающиеся страны. Такие государства не могут позволить себе массовую закупку лицензированных парентеральных вакцин из-за их значительной стоимости, в то время как заболеваемость и смертность там высоки. Инъекционные вакцины имеют жесткие ограничения по условиям хранения и транспортировки, а в условиях жаркого климата многих стран дорого и трудно поддерживать такой режим. Вирус гепатита В по-прежнему ответственен за существенную заболеваемость и смертность на планете.

По данным ВОЗ, от синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИДа) ежегодно умирает 2-3 млн. человек. К настоящему времени ВИЧ инфицировано около 40 млн. человек, из них 5,1 млн. детей; 22 млн. людей уже умерло. У инфицированных детей СПИД развивается очень быстро, и они умирают в первые пять лет жизни. Хотя активная пропаганда способов профилактики снизила темпы распространения ВИЧ в развитых странах, ежедневно на Земле заражаются примерно 15 тысяч человек.

По сообщению главного государственного санитарного врача РФ Г.Г. Онищенко от 14 января 2008 для РИА Новости, с 1987 по 2007 год включительно, в России зарегистрировано 408535 ВИЧ-инфицированных, из них - 2719 детей, среди которых 1297 рождены ВИЧ-инфицированными матерями. С момента регистрации эпидемии ВИЧ стадия СПИД диагностирована у 3652 россиян, в том числе у 235 детей.

Известно, что вакцинация - наиболее эффективный путь защиты от вирусных заболеваний. В настоящее время международные эксперты и правительства большинства стран рассматривают вакцинопрофилактику как наиболее доступный и экономически эффективный способ снижения смертности, увеличения ожидаемой продолжительности жизни и достижения активного долголетия во всех социальных группах развитых и развивающихся стран. В настоящее время вакцины ежегодно предотвращают до трех миллионов смертей. За XX столетие средняя продолжительности жизни людей увеличилась примерно на 30 лет, что в немалой степени обусловлено массовой вакцинацией (Ulmer et al., 2006). Одно из опаснейших инфекционных заболеваний — оспа — полностью ликвидировано с помощью вакцинации.

В этой связи, разработка новых вакцин против ВГВ и ВИЧ является необходимой мерой для предотвращения дальнейшего развития этих грозных заболеваний. При этом немаловажное значение должны иметь такие преимущества новых вакцин как низкая себестоимость, безопасность, эффективность, простота хранения и использования, а также доступность. Современным вариантом такой вакцины могут явиться трансгенные растения, продуцирующие целевой протективный антиген.

Для получения съедобной вакцины выбран томат, поскольку его плоды могут использоваться в пищу без термообработки; культивирование растения широко распространено; плоды легко поддаются высушиванию и не имеют жестких семян; растение относится к двудольным и доступно для стабильной трансформации бинарными векторными системами; плоды содержат природные адъюванты - томатин, а семена — сапонин.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы было получение трансгенных растений томата, продуцирующих химерный белок TBI-HBsAg, содержащий антигенные детерминанты вирусов гепатита В (ВГВ) и иммунодефицита человека (ВИЧ), изучение плодов этих томатов в качестве кандидатной съедобной вакцины против ВГВ и ВИЧ.

Для этого потребовалось решение следующих задач:

1. Создание в системе Е. coli рекомбинантной плазмиды на основе бинарного агробактериального вектора, которая несет последовательность гена TBI-HBS и способна интегрировать часть своей ДНК в геном растения. Трансформация полученной плазмидой агробактерии и отбор клонов агробактерии, содержащих плазмидную ДНК.

2. Получение трансгенных растений томата и подтверждение встройки гена TBI-HBS в геном отобранных растений.

3. Анализ продукции целевого белка TBI-HBsAg в полученных трансгенных растениях.

4. Анализ иммуногенности против ВГВ и ВИЧ плодов трансгенных томатов в эксперименте кормления ими мышей.

5. Получение гибридной плазмиды pcDNA-TBI-HBsAg, кодирующей целевой химерный белок TBI-HBsAg и обладающей свойствами ДНКвакцины. Изучение влияния дополнительной ДНК-вакцинации на мышей, энтерально иммунизируемых плодами трансгенных томатов.

Научная новизна и практическая значимость работы.

ВОЗ и различные другие социальные организации указывают на потребность в новых технологиях получения дополнительных вакцин против инфекционных болезней, что позволило бы увеличить глобальную иммунизированность населения и понизить стоимость вакцин. Огромное значение придается безыгольной доставке вакцин и их термостабильности, как ключевым элементам в достижении этой цели.

Впервые при разработке съедобных вакцин использована химерная конструкция антигена, одновременно сочетающая свойства антигенных белков двух различных вирусов. Используя гибридный ген TBI-HBS, кодирующий синтез поверхностного антигена ВГВ и искусственного иммуногена ВИЧ, получили генетическую конструкцию, в которой целевой белок TBI-HBsAg находится под контролем промотора 35S вируса мозаики цветной капусты в составе бинарного агробактериального вектора. Созданная плазмида pBINTBI-HBS была использована для получения трансгенных растений томата.

Иммунизацию лабораторных животных проводили энтеральным введением водной взвеси порошка сушеных плодов трансгенного томата. Результаты экспериментов на лабораторных животных, впервые доказали возможность получения специфического антительного иммунного ответа при кормлении животных плодами трансгенных томатов.

Публикация и апробация работы. По материалам диссертации опубликованы 4 статьи в реферируемых изданиях.

Результаты работы также представлены на международных конференциях: 9-я Международная Конференция "СПИД, РАК И

РОДСТВЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ" (Санкт-Петербург, 2001), International Symposium on Plant-Derived Vaccines and Antibodies: Potential and Limitations, (Annecy, France 2004), 15th International AIDS Conference (Bangkok, Thailand 2004), 13-я Международная Конференция "СПИД, РАК И РОДСТВЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ" (Санкт-Петербург, 2005), Международный междисциплинарный симпозиум (Судак, Крым, Украина 2005), 14th International Symposium on HIV and Emerging Infectious Diseases. (Toulon, France 2006), Третья международная конференция "Геномика, протеомика, биоинформатика и нанотехнологии для медицины" (Новосибирск, 2006).

Основные положения, выносимые на защиту:

• Генетические конструкции, кодирующие химерный иммуногенный против вирусов ВГВ и ВИЧ белок TBI-HBsAg - плазмиды pBINTBI-HBS иpcDNA-TBI-HBsAg.

• Кормление мышей плодами трансгенного томата, экспрессирующего белок TBI-HBsAg, приводит к развитию мукозального и системного антительных ответов против ВГВ.

1. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Поздняков, Сергей Геннадьевич

5. Выводы

1. Сконструирована гибридная плазмида pBINTBI-HBS на основе бинарного агробактериального вектора, кодирующая целевой химерный белок TBI-HBsAg. Получен штамм агробактерии LBATBI-HBS, несущей данную плазмиду.

5. Сконструирована гибридная плазмида pcDNA-TBI-HBsAg, кодирующая целевой химерный белок TBI-HBsAg. Показано, что дополнительная парентеральная иммунизация мышей кандидатной ДНК-вакциной, кодирующей химерный белок TBI-HBsAg, не влияет на специфичный иммунный ответ против ВГВ.

6. Благодарности

Автор выражает искреннюю признательность своему научному руководителю, Щелкунову Сергею Николаевичу, за организацию работы, консультации и помощь в оформлении диссертации, а также Нестерову Андрею Егоровичу, Рыжовой Татьяне Сергеевне и Гавриленко Екатерине Владимировне за помощь в работе.

Глубокую благодарность хочется выразить всем сотрудникам рабочей группы СИФИБР (г. Иркутск) проекта МНТЦ 2176, а особенно Саляеву ; Рюрику Константиновичу и Рекославской Наталье Игоревне.

Огромное спасибо Белавину Павлу Александровичу, Серёгину Сергею Викторовичу и Сосновцеву Станиславу Владимировичу за обучение практическим навыкам и неоценимые советы.

Самую теплую благодарность за поддержку хочется выразить своим родителям Позднякову Геннадию Германовичу и Павленко Надежде Павловне, а за терпение - жене Поздняковой Ларисе Дмитриевне.

Настоящая работа выполнена при финансовой поддержке : Международного научно-технического центра, грант № 2176р "Разработка съедобных вакцин с использованием трансгенных растений".

4. Заключение

Целью данной работы было создание и изучение иммуногенных свойств кандидатной съедобной вакцины одновременно против вирусов -гепатита В и иммунодефицита человека, созданной на основе трансгенных растений томата.

Впервые нами использована химерная конструкция антигена, одновременно сочетающая свойства антигенных белков двух различных вирусов. Используя гибридный ген TBI-HBS, кодирующий синтез искусственного иммуногена против ВИЧ и ВГВ, мы на основе бинарного агробактериального вектора pBINplus/Ars (Рис. 5) создали плазмиду pBINTBI-HBS (Рис. 12). Эту плазмиду использовали для получения трансгенных растений томата, продуцирующих химерный белок.

Участок TBI химерного белка TBI-HBsAg является антигеном ВИЧ, а участок HBsAg - антигеном ВГВ. TBI — это искусственный белок, состоящий из антигенных детерминант природных белков Env и Gag ВИЧ-1, ответственных за стимуляцию Т- pi В-лимфоцитов (Т- and В- cellular immunogen). Участок HBsAg - поверхностный антиген вируса гепатита В, обладающий способностью к самосборке в высокоиммуногенные надмолекулярные структуры, которые являются не только антигеном, но и природным адъювантом и ПАМС одновременно.

Химерный белок TBI-HBsAg проверен на иммуногенность в нашей лаборатории ранее при продукции его в составе гибридного вируса осповакцины (Нестеров и др., 2004) и плазмиды для эукариотической экспрессии (Поздняков и др., 2003).

Оба участка единого антигена TBI-HBsAg представляют собой не просто линейные антигенные белки, слитые в один, а структурированный белковый комплекс. В гене TBI-HBS, участок TBI занимает место природного участка preS2, который кодирует в М-белке ВГВ небольшой белковый фрагмент, расположенный на поверхности вирусных частиц ВГВ, где он многократно повторен и выполняет функцию связывания вируса с полимеризованным альбуминовым рецептором гепатоцита. В настоящей работе мы исходили из того, что фрагмент TBI, белка TBI-HBsAg, также будет многократно представлен на поверхности неинфекционных частиц, состоящих из HBsAg-белка и, следовательно, доступен мукозальной иммунной системе.

В качестве съедобной вакцины нами был выбран томат, поскольку его плоды используются в пищу, как правило, без термообработки. Культивирование растения широко распространено, включая районы с теплым и холодным климатом. Растение несложно выращивать и получать большие урожаи; плоды легко поддаются высушиванию и не имеют жестких семян (косточек). Растение относится к двудольным и доступно для стабильной трансформации бинарными векторными системами; плоды содержат природный энтеральный адъювант - гликоалкалоид томатин (Morrow et al., 2004; Rajananthanan et al., 1999).

В результате работы были созданы две генетические конструкции, в которых целевой белок TBI-HBsAg находится под контролем разных ; эукариотических регуляторных элементов. Исследование первичной структуры ДНК подтвердило правильность и точность сборки плазмид, отсутствие сбоев рамки считывания, терминирующих кодонов и мутаций аминокислотной последовательности. Обе плазмиды служили одной цели -иммунизации животных белком TBI-HBsAg, но разными путями. Если ДНК-вакцина сама экспрессирует целевой белок в клетках животных после инъекции, то бинарный вектор служит, лишь донором Т-ДНК для растения, которое экспрессирует целевой белок, закодированный в Т-ДНК. Растительные клетки съеденного томата доставляют этот белок до слизистой i кишечника в защищенном, биоинкапсулированном виде, где и происходит иммунизация. Съедобная кандидатная вакцина являлась основным объектом исследования, ДНК-вакцина - дополнительным.

С помощью плазмиды pBINTBI-HBS и других компонентов бинарной векторной системы получены трансгенные растения томата поколения Т0 и Ть экспрессирующие различные уровни целевого белка TBI-HBsAg. Уровни ОП в ИФА целевого белка достоверно и стабильно превышают значения ОП контрольных томатов и в листьях, и в плодах. Наличие целевого трансгена подтверждено ПЦР-анализом растений.

Получены растения томата поколения Tj с высоким уровнем экспрессии целевого белка, свыше 200 нг на грамм ткани свежего плода. Сушеные плоды этих растений (гомогенный порошок из них) и послужили средством иммунизации лабораторных мышей.

В основном эксперименте иммунизацию проводили принудительным энтеральным введением водной взвеси порошка томата по запланированной схеме (табл. 4) и (Рис. 24), троекратно, через две недели. Сбор материала для анализа иммунного ответа проводили каждую неделю.

Для того чтобы оценить уровень антител, циркулирующих в крови и секретируемых в кишечник, анализ антител к HBsAg и ВИЧ проводили одновременно в сыворотке крови и фекалиях после полного сбора материала. Эксперименты на животных доказали возможность получения специфического иммунного ответа при поедании плодов трансгенных томатов (Рис. 25, Рис. 26). Выявленный уровень гуморального ответа на два антигенных компонента белка TBI-HBsAg оказался различным - сильным на HBsAg и слабым на TBI. Возможно, этот результат обусловлен особенностями использованных тест-систем. Следует подчеркнуть, что мукозальный ответ развивался уже после первого кормления, в то время как в сыворотке крови специфичные антитела появлялись лишь после второго кормления животных трансгенным томатом. Таким образом, при энтеральном способе иммунизации слизистые как "входные ворота" оказались готовы к защите раньше, чем системный иммунитет. Выявленный эффективный гуморальный ответ против ВГВ (HBsAg), возможно, был обусловлен наличием в данной группе плодов томата (бурая стадия созревания) растительного орального адъюванта - томатина.

Причины, по которым антительный ответ на TBI оказался слабее ответа на HBsAg нами дополнительно не исследовались. Возможно, это связано плохой экспонированностью и доступностью участка TBI для иммунной системы, но более вероятно - особенностями выбранной тест-системы анализа антител. Антигены использованной тест-системы реагируют только с малой группой антител к TBI, только с антителами на В-клеточный эпитоп Env gp41. Природный белок HBsAg ВГВ прошел долгий эволюционный путь в составе вируса. Его надмолекулярные структуры значительно больше белка TBI по размеру и надежнее проявляют свои антигенные свойства, даже в составе химерного белка. Возможно, это и обусловило сильный антигенный эффект HBsAg (Thanavala et al., 2005). Необходимо отметить, что в ■ проведенных нами энтеральных иммунизациях мышей белок TBI-HBsAg использовался без каких-либо традиционных оральных адъювантов (СТ-В, LT-B (Arakawa et al., 2001; Kim et al., 2004b; Matoba et al., 2004; Oszvald et al., 2007; Yu and Langridge, 2001)) и при этом проявил антигенные свойства.

В любом случае, проведенное исследование указывает на перспективность использования растений томата для создания на их основе и других съедобных вакцин.

Изучение энтеральной вакцинации трансгенным томатом на антигенность было дополнено исследованием влияния однократного бустирования ДНК-вакциной с тем же геном TBI-HBsAg. Внутрибрюшинная инъекция ДНК вакцины, привела к увеличению уровня гуморального ответа против ВИЧ в сыворотке крови, но не в слизистой. Бустирование не влияло на высокий уровень антител против ВГВ ни в сыворотке, ни на слизистой кишечника (Рис. 25, Рис. 26).

Таким образом, в результате выполненных экспериментов можно заключить, что впервые на основе трансгенного томата получена кандидатная съедобная вакцина против вируса гепатита В и, возможно, против вируса иммунодефицита человека.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Поздняков, Сергей Геннадьевич, Кольцово

1. Дрейпер Д., Скотт Р., Армитидж Ф., Дьюри Г., Джекоб Л., Кумар А., Джефферсон Р., Дж. X. Генетическая инженерия растений. Лабораторное руководство. М.: Мир, 1991. - 408 с.

2. Дэйви Ш. Вакцины и иммунизация: современное положение в мире. -1996. http://www.who. int/vaccines-docimients/DoxTra/h4Russian.htm (январь-февраль 2008).

3. Лутова Л.А. Генетическая инженерия растений: свершения и надежды. // j Соросовский образовательный журнал. 2000. - V. 6. - № 10.

4. Медуницын Н.В. Вакцинология. М.: Триада-Х, 2004. - 445 с.

5. Поздняков С.Г., Гавриленко Е.В., Курманова Е.Н., Нестеров А.Е., Позднякова Л.Д., Щелкунов С.Н. Создание кандидатных ДНК-вакцин против вируса иммунодефицита человека. // Биотехнология. 2003. - № 5.-Р. 37-43.

6. Ройт А., Бростофф Д., Мейл Д. Иммунология. М.: Мир, 2000. - 581 с.

7. Семенов Б.Ф., Зверев В.В. Концепция создания быстрой иммунологической защиты от патогенов. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2007. - № 4. - Р. 93-100.

8. Щелкунов С.Н., Рязанкина О.И., Рязанкин И.А. Ортопоксвирусы как объект генно-инженерных исследований. Изучение генома и генетическая трансформация растений. Новосибирск: Наука, 2001. -211 с.

9. Ярилин А.А. Основы иммунологии. М.: Медицина, 1999. - 606 с.

10. Andonov P., Dundarov S., Bakalov B. Design of inactivated polyvalent antiherpes vaccines. // Vopr Virusol. 1979. - № 6. - P. 665-671.

11. Angenon G., Dillen W., Montagu M.V. Plant Molecular Biology Manual. -Dordrecht: Kluwer Academic Publishers Group, 1994

12. Arakawa Т., Chong D.K., Langridge W.H. Efficacy of a food plant-based oral cholera toxin В subunit vaccine. // Nat Biotechnol. 1998a. - V. 16. - № 3. -P. 292-297.

13. Arakawa Т., Langridge J., Yu W. Synthesis of a cholera toxin В subunitrotavirus NSP4 fusion protein in potato. // Plant Cell Reports. 2001. -V. 20. - № 4. - P. 343-348.

14. Arakawa Т., Yu J., Chong D.K., Hough J., Engen P.C., Langridge W.H. A plant-based cholera toxin В subunit-insulin fusion protein protects against the development of autoimmune diabetes. //Nat Biotechnol. 1998b. - V. 16. - № 10.-P. 934-938.

15. Arntzen С., Plotkin S., Dodet B. Plant-derived vaccines and antibodies: potential and limitations. //Vaccine. 2005. - V. 23. - № 15. - P. 1753-1756.

16. Ashraf S., Singh P.K., Yadav D.K., Shahnawaz M., Mishra S., Sawant S.V., Tuli R. High level expression of surface glycoprotein of rabies virus in tobacco leaves and its immunoprotective activity in mice. // J Biotechnol. -2005.-V. 119. -№1. -P. 1-14.

17. Axelsson P. The history of polio in Sweden from infantile paralysis to polio vaccine. // Sven Med Tidskr. - 2004. - V. 8. - № 1. - P. 57-66.

18. Bae J.L., Lee J.G., Kang T.J., Jang H.S., Jang Y.S., Yang M.S. Induction of antigen-specific systemic and mucosal immune responses by feeding animals transgenic plants expressing the antigen. // Vaccine. 2003. - V. 21. - № 2526. - P. 4052-4058.

19. Baez M., Palese P., Kilbourne E.D. Gene composition of high yielding influenza vaccine strains obtained by recombination. // J Infect Dis. 1980. -V. 141.-P. 362-369.

20. Baralcat A., Gallois P., Raynal M., Mestre-Ortega D., Sallaud C., Guiderdoni E., Delseny M., Bernardi G. The distribution of T-DNA in the genomes of transgenic Arabidopsis and rice. // FEBS Lett. 2000. - V. 471. - № 2-3. - P. 161-164.

21. Barry D.W., Staton E., Mayner R.E. Inactivated influenza vaccine efficacy: diminished antigenicity of split-product vaccines in mice. // Infect Immun. -1974. V. 10. - № 6. - P. 1329-1336.

22. Becker D., Kemper E., Schell J., Masterson R. New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left T-DNA border. // Plant Mol Biol. 1992.-V. 20.-№6.-P. 1195-1197.

23. Benfey P.N., Chua N.H. The Cauliflower Mosaic Virus 35S Promoter: Combinatorial Regulation of Transcription in Plants. // Science. 1990. - V. 250. - № 4983. - P. 959-966.

24. Bevan M. Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. // Nucleic Acids Res. 1984. - V. 12. - № 22. - P. 8711 -8721.

25. Biemelt S., Sonnewald U., Galmbacher P., Willmitzer L., Muller M. Production of human papillomavirus type 16 virus-like particles in transgenic plants. // J Virol. 2003. - V. 77. - № 17. - P. 9211-9220.

26. Bouche F.B., Steinmetz A., Yanagi Y., Muller C.P. Induction of broadly neutralizing antibodies against measles virus mutants using a polyepitope vaccine strategy. // Vaccine. 2005. - V. 23. - № 17-18. - P. 2074-2077.

27. Boyaka P.N., McGhee J.R. Cytokines as adjuvants for the induction of mucosal immunity. // Adv Drug Deliv Rev. 2001. - V. 51. - № 1-3. - P. 7179.

28. Brandtzaeg P., Johansen F.E. Mucosal В cells: phenotypic characteristics, transcriptional regulation, and homing properties. // Immunol Rev. 2005. -V. 206. - P. 32-63.

29. Collins F.M. Tuberculosis: the return of an old enemy. // Crit Rev Microbiol. -1993.-V. 19.-№1.-P. 1-16.

30. Crowe J.E., Jr., Firestone C.Y., Murphy B.R. Passively acquired antibodies suppress humoral but not cell-mediated immunity in mice immunized with live attenuated respiratory syncytial virus vaccines. // J Immunol. 2001. - V. 167.-№ 7.-P. 3910-3918.

31. Daniell H., Streatfield S.J., Wycoff K. Medical molecular farming: production of antibodies, biopharmaceuticals and edible vaccines in plants. // Trends Plant Sci. 2001. - V. 6. - № 5. - P. 219-226.

32. Daiji A., Guzman C.A., Gerstel В., Wachholz P., Timmis K.N., Wehland J., Chakraborty Т., Weiss S. Oral somatic transgene vaccination using attenuated S. typhimurium. // Cell. 1997. - V. 91. - № 6. - P. 765-775.

33. Deikman J., Fischer R.L. Interaction of a DNA binding factor with the 5'-flanking region of an ethylene-responsive fruit ripening gene from tomato. // Embo J. 1988.-V. 7. -№ 11.-P. 3315-3320.

34. Djavani M., Yin C., Xia L., Lukashevich I.S., Pauza C.D., Salvato M.S. Murine immune responses to mucosally delivered Salmonella expressing Lassa fever virus nucleoprotein. // Vaccine. 2000. - V. 18. - № 15. - P. 15431554.

35. Dong J.L., Liang B.G., Jin Y.S., Zhang W.J., Wang T. Oral immunization with pBsVP6~transgenic alfalfa protects mice against rotavirus infection. // Virology. 2005. - V. 339. - № 2. - P. 153-163.

36. Dus Santos M.J., Wigdorovitz A. Special Feature: Transgenic plants for the production of veterinary vaccines. // Immunology and Cell Biology. 2005. -V. 83. - P. 229-238.

37. Ehsani P., Khabiri A., Domansky N.N. Polypeptides of hepatitis В surface antigen produced in transgenic potato. // Gene. 1997. - V. 190. - № l.-P. 107-111.

38. Eroshkin A.M., Karginova E.A., Gileva I.P., Lomakin A.S., Lebedev L.R., Kamyinina T.P., Pereboev A.V., Ignat'ev G.M. Design of four-helix bundleprotein as a candidate for HIV vaccine. I I Protein Eng. 1995. - V. 8. - № 2. -P. 167-173.

39. Eroshkin A.M., Zhilkin P.A., Shamin V.V., Korolev S., Fedorov B.B. Artificial protein vaccines with predetermined tertiary structure: application to anti-HIV-1 vaccine design. // Protein Eng. 1993. - V. 6. - № 8. - P. 9971001.

40. Fennelly G.J., Khan S.A., Abadi M.A., Wild T.F., Bloom B.R. Mucosal DNA vaccine immunization against measles with a highly attenuated Shigella flexneri vector. // J Immunol. 1999. - V. 162. - № 3. - P. 1603-1610.

41. Furuta S., Nagata A., Kiyosawa K., Takahashi Т., Akahane Y. HBs-Ag, HBc-Ag and virus-like particles in liver tissue. // Gastroenterol Jpn. 1975. - V. 10. - № 3. - P. 208-214.

42. Fynan E.F., Webster R.G., Fuller D.H., Haynes J.R., Santoro J.C., Robinson H.L. DNA vaccines: protective immunizations by parenteral, mucosal, and gene-gun inoculations. // Proc Natl Acad Sci U S A. 1993. - V. 90. - № 24. -P. 11478-11482.

43. Gao Y., Ma Y., Li M., Cheng Т., Li S.W., Zhang J., Xia N.S. Oral immunization of animals with transgenic cherry tomatillo expressing HBsAg. // World J Gastroenterol. 2003. - V. 9. - № 5. - P. 996-1002.

44. Giddings G., Allison G., Brooks D., Carter A. Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals. // Nat Biotechnol. 2000. - V. 18. - № 11. - P. 11511155.

45. Gil F., Brun A., Wigdorovitz A., Catala R., Martinez-Torrecuadrada J.L., Casal I., Salinas J., Borca M.V., Escribano J.M. High-yield expression of a viral peptide vaccine in transgenic plants. // FEBS Lett. 2001. - V. 488. - № 1-2.-P. 13-17.

46. Glenn G.M., Scharton-Kersten Т., Vassell R., Matyas G.R., Alving C.R. Transcutaneous immunization with bacterial ADP-ribosylating exotoxins as antigens and adjuvants. // Infect Imrnun. 1999. - V. 67. - № 3. - P. 11001106.

47. Gomez N., Carrillo C., Salinas J., Parra F., Borca M.V., Escribano J.M. Expression of immunogenic glycoprotein S polypeptides from transmissible gastroenteritis coronavirus in transgenic plants. // Virology. 1998. - V. 249. -№ 2. - P. 352-358.

48. Gomez N., Wigdorovitz A., Castanon S., Gil F., Ordas R., Borca M.V., Escribano J.M. Oral immunogenicity of the plant derived spike protein from swine-transmissible gastroenteritis coronavirus. // Arch Virol. 2000. - V. 145.-№8.-P. 1725-1732.

49. Hajdukiewicz P., Svab Z., Maliga P. The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. // Plant Mol Biol. -1994. V. 25. - № 6. - P. 989-994.

50. Hamilton C.M., Frary A., Lewis C., Tanksley S.D. Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes. // Proc Natl Acad Sci U S A. 1996. - V. 93. - № 18. - P. 9975-9979.

51. Hansen G., Chilton M.D. Lessons in gene transfer to plants by a gifted microbe. // Curr Top Microbiol Immunol. 1999. - V. 240. - P. 21-57.

52. Haq T.A., Mason H.S., Clements J.D., Arntzen C.J. Oral immunization with a recombinant bacterial antigen produced in transgenic plants. // Science. -1995. V. 268. - № 5211. - P. 714-716.

53. Hathaway L.J., Kraehenbuhl J.P. The role of M cells in mucosal immunity. // Cell Mol Life Sci. 2000. - V. 57. - № 2. - P. 323-332.

54. Hayford M.B., Medford J.I., Hoffman N.L., Rogers S.G., Klee H.J. Development of a Plant Transformation Selection System Based on Expression of Genes Encoding Gentamicin Acetyltransferases. // Plant Physiol. 1988. - V. 86. - № 4. - P. 1216-1222.

55. He Z.M., Jiang X.L., Qi Y., Luo D.Q. Assessment of the utility of the tomato fruit-specific E8 promoter for driving vaccine antigen expression. // Genetica. 2007.

56. Hellens R.P., Edwards E.A., Leyland N.R., Bean S., Mullineaux P.M. pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. // Plant Mol Biol. 2000. - V. 42. - № 6. - P. 819-832.

57. Herrera-Estrella L., Block M.D., Messens E., Hernalsteens J.P., Montagu M.V., Schell J. Chimeric genes as dominant selectable markers in plant cells. // Embo J. 1983. - V. 2. - № 6. - P. 987-995.

58. Hille J., Verheggen F., Roelvink P., Franssen H., Vankammen A., Zabel P. Bleomycin Resistance a New Dominant Selectable Marker for Plant-Cell Transformation. // Plant Molecular Biology. - 1986. - V. 7. - № 3. - P. 171176.

59. Hiroi Т., Goto H., Someya К., Yanagita M., Honda M., Yamanaka N., Kiyono

60. H. HIV mucosal vaccine: nasal immunization with rBCG-V3Jl induces a long term V3J1 peptide-specific neutralizing immunity in Thl- and Th2-deficient conditions. // J Immunol. 2001. - V. 167. - № 10. - P. 5862-5867.

61. Hoekema A., Hirsch* P.R., Hooykaas P.J.J., Schilperoort R.A. A binary plant vector strategy based on separation of vir- and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid. // Nature. 1983. - V. 303. - P. 179 - 180.

62. Holmgren J., Czerkinsky C. Mucosal immunity and vaccines. // Nat Med. -2005. V. 11. - № 4 Suppl. - P. S45-53.

63. Horstmann D.M. Viral vaccines and their ways. // Rev Infect Dis. 1979. - V.1.-P. 502-516.

64. Huang Z., Dry I., Webster D., Stmgnell R., Wesselingh S. Plant-derived measles virus hemagglutinin protein induces neutralizing antibodies in mice. //Vaccine. 2001. - V. 19. - № 15-16. - P. 2163-2171.

65. Irdani Т., Bogani P., Mengoni A., Mastromei G., Buiatti M. Construction of a new vector conferring methotrexate resistance in Nicotiana tabacum plants. // Plant Mol Biol. 1998. - V. 37. - № 6. - P. 1079-1084.

66. Jen G.C., Chilton M.D. The right border region of pTiT37 T-DNA is intrinsically more active than the left border region in promoting T-DNA transformation. // Proc Natl Acad Sci USA.- 1986. V. 83. - № 11. - P. 3895-3899.

67. Joshi C.P. An inspection of the domain between putative TATA box and translation start site in 79 plant genes. // Nucleic Acids Res. 1987. - V. 15. -№ 16. - P. 6643-6653.

68. Joung Y.H., Youm J.W., Jeon J.H., Lee B.C., Ryu C.J., Hong H.J., Kim H.C., Joung H., Kim H.S. Expression of the hepatitis В surface S and preS2 antigens in tubers of Solanum tuberosum. // Plant Cell Rep. 2004. - V. 22. -№ 12.-P. 925-930.

69. Kang T.J., Kim Y.S., Jang Y.S., Yang M.S. Expression of the synthetic neutralizing epitope gene of porcine epidemic diarrhea virus in tobacco plants without nicotine. // Vaccine. 2005a. - V. 23. - № 17-18. - P. 2294-2297.

70. Kao J.H., Chen D.S. Global control of hepatitis В virus infection. // Lancet Infect Dis. 2002. - V. 2. - № 7. - P. 395-403.

71. Kapusta J., Modelska A., Figlerowicz M., Pniewski Т., Letellier M., Lisowa O., Yusibov V., Koprowski H., Plucienniczak A., Legocki A.B. A plant-derived edible vaccine against hepatitis В virus. // Faseb J. 1999. - V. 13. -№ 13.-P. 1796-1799.

72. Kew O.M., Sutter R.W., de Gourville E.M., Dowdle W.R., Pallansch M.A. Vaccine-derived polioviruses and the endgame strategy for global polio eradication. //Annu Rev Microbiol. 2005. - V. 59. - P. 587-635.

73. Kim T.G., Langridge W.H. Synthesis of an HIV-1 Tat transduction domain-rotavirus enterotoxin fusion protein in transgenic potato. // Plant Cell Rep. -2004. V. 22. - № 6. - P. 382-387.

74. Kim T.G., Ruprecht R., Langridge W.H. SIVmac Gag p27 capsid protein gene expression in potato. // Protein Expr Purif. 2004a. - V. 36. - № 2. - P. 312317.

75. Kim T.G., Ruprecht R., Langridge W.H. Synthesis and assembly of a cholera toxin В subunit SHIV 89.6p Tat fusion protein in transgenic potato. // Protein Expr Purif. 2004b. - V. 35. - № 2. - P. 313-319.

76. Kim Y.-S., Kang T.-J., Jang Y.-S., Yang M.-S. Expression of neutralizing epitope of porcine epidemic diarrhea virus in potato plants. // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2005. - V. 82. - P. 125-130.

77. Kong Q., Richter L., Yang Y.F., Arntzen C.J., Mason H.S., Thanavala Y. Oral immunization with hepatitis В surface antigen expressed in transgenic plants. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2001. - V. 98. - № 20. - P. 11539-11544.

78. Kozak M. Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes. // Cell. 1986. - V. 44. - № 2. - P. 283-292.

79. Kraehenbuhl J.P. Mucosa-targeted DNA vaccination. // Trends Immunol. -2001. V. 22. - № 12. - P. 646-648.

80. Krieg A.M., Yi A.K., Matson S., Waldschmidt T.J., Bishop G.A., Teasdale R., Koretzky G.A., Klinman D.M. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation. //Nature. 1995. - V. 374. - № 6522. - P. 546-549.

81. Krieg A.M., Yi A.K., Schorr J., Davis H.L. The role of CpG dinucleotides in DNA vaccines. // Trends Microbiol. 1998. - V. 6. - № 1. - P. 23-27.

82. Krugman S. The newly licensed hepatitis В vaccine. Characteristics and indications for use. // Jama. 1982. - V. 247. - № 14. - P. 2012-2015.

83. Kumar G.B., Ganapathi T.R., Bapat V.A. Production of hepatitis В surface antigen in recombinant plant systems: an update. // Biotechnol Prog. 2007. -V. 23. - № 3. - P. 532-539.

84. Kumar G.B., Ganapathi T.R., Revathi C.J., Srinivas L., Bapat V.A. Expression of hepatitis В surface antigen in transgenic banana plants. // Planta. 2005. - V. 222. - № 3. - P. 484-493.

85. Lacorte С., Lohuis H., Goldbach R., Prins M. Assessing the expression of chicken anemia virus proteins in plants. // Virus Res. 2007. - V. 129. - № 2. -P. 80-86.

86. Lai P., Ramachandran V.G., Goyal R., Sharma R. Edible vaccines: Current status and future. // Indian J Med Microbiol. 2007. - V. 25. - № 2. - P. 93102.

87. Lassner M., Peterson P., Yoder J. Simultaneous amplification of multiple DNA fragments by polymerase chain reaction in the analysis of transgenic plants and their progeny. // Plant Molecular Biology Reporter. 1989. - V. 7. -№2.-P. 116-128.

88. Leong K.H., Ramsay A.J., Boyle D.B., Ramshaw I.A. Selective induction of immune responses by cytokines coexpressed in recombinant fowlpox virus. // J Virol. 1994.-V. 68.-№ 12. - P. 8125-8130.

89. Li J.T., Fei L., Мои Z.R., Wei J., Tang Y., He H.Y., Wang L., Wu Y.Z. Immunogenicity of a plant-derived edible rotavirus subunit vaccine transformed over fifty generations. // Virology. 2006. - V. 356. - № 1-2. - P. 171-178.

90. Liashenko V.A., Krasnova V.P., Youminova N.V. Measles IgA in the nasal washings of adult volunteers and children immunized intranasally with measles vaccine L-16. // Hum Antibodies. 1999. - V. 9. - № 3. - P. 143-148.

91. Lutcke H.A., Chow K.C., Mickel F.S., Moss K.A., Kern H.F., Scheele G.A. Selection of AUG initiation codons differs in plants and animals. // EMBO J. -1987.-V. 6.-№ l.-P. 43-48.

92. Ma Y., Lin S.Q., Gao Y., Li M., Luo W.X., Zhang J., Xia N.S. Expression of ORF2 partial gene of hepatitis E vims in tomatoes and immunoactivity of expression products. // World J Gastroenterol. 2003. - V. 9. - № 10. - P. 2211-2215.

93. Mackett M., Smith G.L., Moss B. Vaccinia vims: a selectable eukaryotic cloning and expression vector. // Proc Natl Acad Sci USA.- 1982. V. 79. -№23. - P. 7415-7419.

94. Maloney B.J., Takeda N., Suzaki Y., Ami Y., Li T.C., Miyamura Т., Arntzen C.J., Mason H.S. Challenges in creating a vaccine to prevent hepatitis E. // Vaccine. 2005. - V. 23. - № 15. - P. 1870-1874.

95. Manganaro M., Ogra P.L., Ernst P.B. Oral immunization: turning fantasy into reality. // Int Arch Allergy Immunol. 1994. - V. 103. - № 3. - P. 223-233.

96. Marquet-Blouin E., Bouche F.B., Steinmetz A., Muller C.P. Neutralizing immunogenicity of transgenic carrot (Daucus carota L.)-derived measles vims hemagglutinin. // Plant Mol Biol. 2003. - V. 51. - № 4. - P. 459-469.

97. Mason H.S., Ball J.M., Shi J.J., Jiang X., Estes M.K., Arntzen C.J. Expression of Norwalk virus capsid protein in transgenic tobacco and potato and its oralimmunogenicity in mice. // Proc Natl Acad Sci USA.- 1996. V. 93. - № 11. -P. 5335-5340.

98. Mason H.S., Haq T.A., Clements J.D., Arntzen C.J. Edible vaccine protects mice against Escherichia coli heat-labile enterotoxin (LT): potatoes expressing a synthetic gene. // Vaccine. 1998. - V. 16. - № 13. - P. 13361343.

99. Mason H.S., Lam D.M., Arntzen C.J. Expression of hepatitis В surface antigen in transgenic plants. // Proc Natl Acad Sci USA.- 1992. V. 89. - № 24.-P. 11745-11749.

100. Matsumura Т., Itchoda N., Tsunemitsu H. Production of immunogenic VP6 protein of bovine group A rotavirus in transgenic potato plants. // Arch Virol. 2002. - V. 147. - № 6. - P. 1263-1270.

101. Matzke A.J., Neuhuber F., Park Y.D., Ambros P.F., Matzke M.A. Homology-dependent gene silencing in transgenic plants: epistatic silencing loci contain multiple copies of methylated transgenes. // Mol Gen Genet. 1994. - V. 244. -№3.-P. 219-229.

102. McBride K.E., Summerfelt K.R. Improved binary vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. // Plant Mol Biol. 1990. - V. 14. - № 2. - P. 269-276.

103. McGarvey P.B., Hammond J., Dienelt M.M., Hooper D.C., Fu Z.F., Dietzschold В., Koprowski H., Michaels F.H. Expression of the rabies virusglycoprotein in transgenic tomatoes. // Biotechnology (N Y). 1995. - V. 13. -№ 13.-P. 1484-1487.

104. Meyer H.M., Jr., Hopps H.E., Parkman P.D., Ennis F.A. Review of existing vaccines for influenza. // Am J Clin Pathol. 1978. - V. 70. - № 1 Suppl. - P. 146-152.

105. Milton J. Genetic roulette: the hazards of altering nature. // Nation. 1977. -V. 225. -№12. -P. 361-365.

106. Miranda A., Janssen G., Hodges L., Peralta E.G., Ream W. Agrobacterium tumefaciens transfers extremely long T-DNAs by a unidirectional mechanism. // J Bacteriol. 1992. - V. 174. - № 7. - P. 2288-2297.

107. Modelska A., Dietzschold В., Sleysh N., Fu Z.F., Steplewski K., Hooper D.C., Koprowski H., Yusibov V. Immunization against rabies with plant-derived antigen. // Proc Natl Acad Sci USA.- 1998. V. 95. - № 5. - P. 2481-2485.

108. Morel J.B., Mourrain P., Beclin C., Vaucheret H. DNA methylation and chromatin structure affect transcriptional and post-transcriptional transgene silencing in Arabidopsis. // Curr Biol. 2000. - V. 10. - № 24. - P. 1591-1594.

109. Morrow W.J., Yang Y.W., Sheikh N.A. Immunobiology of the Tomatine adjuvant. //Vaccine. 2004. - V. 22. - № 19. - P. 2380-2384.

110. Moss В., Mackett M., Smith G.L. Vaccinia virus: a selectable eukaryotic cloning and expression vector. 1982. // Biotechnology. 1992. - V. 24. - P. 495-499.

111. Murashige Т., Skoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. // Physiologia Plantarum. 1962. - V. 15. - № 3. - P. 473-497.

112. Nester E.W., Merlo D.J., Drummond M.H., Sciaky D., Montoya A.L., Chilton M.D. The incorporation and expression of Agrobacterium plasmid genes in crown gall tumors. // Basic Life Sci. 1977. - V. 9. - P. 181-196.

113. Neutra M.R. Current concepts in mucosal immunity. V Role of M cells in transepithelial transport of antigens and pathogens to the mucosal immune system. // Am J Physiol. 1998. - V. 274. - № 5 Pt 1. - P. G785-791.

114. Ning-Sun Yang P.C. Cell type specific expression of a CaMV 35S-GUS gene in transgenic soybean plants. // Developmental Genetics. 1990. - V. 11. - № 4. - P. 289-293.

115. Odell J.T., Nagy F., Chua N.H. Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. // Nature. 1985. - V. 313.-№6005. -P. 810-812.

116. Parkman P.D., Hopps H.E., Rastogi S.C., Meyer H.M., Jr. Summary of clinical trials of influenza virus vaccines in adults. // J Infect Dis. 1977. - V. 136 Suppl. - P. S722-730.

117. Potter C.W. Inactivated influenza virus vaccine. Boca Raton, Florida: CRC Press Inc 1982.- 119-204

118. Pozueta-Romero J., Houlne G., Canas L., Schantz R., Chamarro J. Enhanced regeneration of tomato and pepper seedling explants for Agrobacterium-mediated transformation. // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2001. - V. 67.-№ 2.-P. 173-180.

119. Purcell R.H., Gerin J.L. Hepatitis В subunit vaccine: a preliminary report of safety and efficacy tests in chimpanzees. // Am J Med Sci. 1975. - V. 270. -№2.-P. 395-399.

120. Quiding-Jarbrink M., Ahlstedt I., Lindholm C., Johansson E.L., Lonroth H. Homing commitment of lymphocytes activated in the human gastric and intestinal mucosa. // Gut. 2001. - V. 49. - № 4. - P. 519-525.

121. Rajananthanan P., Attard G.S., Sheikh N.A., Morrow W.J. Evaluation of novel aggregate structures as adjuvants: composition, toxicity studies and humoral responses. // Vaccine. 1999. - V. 17. - № 7-8. - P. 715-730.

122. Ramshaw I.A., Ramsay A.J. The prime-boost strategy: exciting prospects for improved vaccination. // Immunol Today. 2000. - V. 21. - № 4. - P. 163-165.

123. Remy J.S., Sirlin C., Vierling P., Behr J.P. Gene transfer with a series of lipophilic DNA-binding molecules. // Bioconjug Chem. 1994. - V. 5. - № 6. - P. 647-654.

124. Richter L.J., Thanavala Y., Arntzen C.J., Mason H.S. Production of hepatitis В surface antigen in transgenic plants for oral immunization. // Nat Biotechnol.-2000.-V. 18.-№ 11.-P. 1167-1171.

125. Russell C.S., Clarke L.A. Recombinant proteins for genetic disease. // Clin Genet. 1999. - V. 55. - № 6. - P. 389-394.

126. Sabin A.B. Properties and behavior of orally administered attenuated poliovirus vaccine. // J Am Med Assoc. 1957. - V. 164. - № 11. - P. 12161223.

127. Sabin A.B., Flores Arechiga A., Fernandez de Castro J., Sever J.L., Madden

128. Sabin A.B., Boulger L.R. History of Sabin attenuated poliovirus oral live vaccine strains. // J Biol Stand. 1973. - V. 1. - P. 115-118.

129. Satyavathi V.V., Prasad V., Khandelwal A., Shaila M.S., Sita G.L. Expression of hemagglutinin protein of Rinderpest virus in transgenic pigeon pea Cajanus cajan (L.) Millsp. plants. // Plant Cell Rep. 2003. - V. 21. - № 7. -P. 651-658.

130. Schlesinger S. Alphaviruses—vectors for the expression of heterologous genes. // Trends Biotechnol. 1993. - V. 11. - № 1. - P. 18-22.

131. Scolnick E.M., McLean A.A., West D.J., McAleer W.J., Miller W.J., Buynak

132. E.B. Clinical evaluation in healthy adults of a hepatitis В vaccine made by recombinant DNA. // Jama. 1984. - V. 251. - № 21. - P. 2812-2815.

133. Shih M.F., Arsenakis M., Tiollais P., Roizman B. Expression of hepatitis В virus S gene by herpes simplex vims type 1 vectors carrying alpha- and betaregulated gene chimeras. // Proc Natl Acad Sci USA.- 1984. V. 81. - № 18. - P. 5867-5870.

134. Shulga N.Y., Rukavtsova E.B., Krymsky M.A., Borisova V.N., Melnikov V.A., Bylcov V.A., Buryanov Y.I. Expression and characterization of hepatitis В surface antigen in transgenic potato plants. // Biochemistry (Mosc). 2004. -V. 69.-№ 10.-P. 1158-1164.

135. Sissons J.G., Oldstone M.B. Killing of virus-infected cells: the role of antiviral antibody and complement in limiting vims infection. // J Infect Dis. -1980. V. 142. - № 3. - P. 442-448.

136. Sizemore D.R., Branstrom A.A., Sadoff J.C. Attenuated Shigella as a DNA delivery vehicle for DNA-mediated immunization. // Science. 1995. - V. 270. - № 5234. - P. 299-302.

137. Smith G.L., Mackett M., Moss B. Infectious vaccinia vims recombinants that express hepatitis В vims surface antigen. // Nature. 1983a. - V. 302. - № 5908.-P. 490-495.

138. Smith M.L., Keegan M.E., Mason H.S., Shuler M.L. Factors important in the extraction, stability and in vitro assembly of the hepatitis В surface antigen derived from recombinant plant systems. // Biotechnol Prog. 2002. - V. 18. -№ 3. - P. 538-550.

139. Sojikul P., Buehner N., Mason H.S. A plant signal peptide-hepatitis В surface antigen fusion protein with enhanced stability and immunogenicity expressed in plant cells. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2003. V. 100. - № 5. - P. 22092214.

140. Streatfield S.J., Jilka J.M., Hood E.E., Turner D.D., Bailey M.R., Mayor J.M., Woodard S.L., Beifuss K.K., Нот M.E., Delaney D.E., Tizard I.R., Howard J.A. Plant-based vaccines: unique advantages. // Vaccine. 2001. - V. 19. - № 17-19.-P. 2742-2748.

141. Strobel S., Mowat A.M. Immune responses to dietary antigens: oral tolerance. //Immunol Today. 1998. - V. 19. -№4. - P. 173-181.

142. Strobel S., Mowat A.M. Oral tolerance and allergic responses to food proteins. // Cuit Opin Allergy Clin Immunol. 2006. - V. 6. - № 3. - P. 207213.

143. Sullivan N.J., Sanchez A., Rollin P.E., Yang Z.Y., Nabel G.J. Development of a preventive vaccine for Ebola virus infection in primates. // Nature. 2000. -V. 408. - № 6812. - P. 605-609.

144. Svab Z., Harper E.C., Jones J.D., Maliga P. Aminoglycoside-3"-adenyltransferase confers resistance to spectinomycin and streptomycin in Nicotiana tabacum. // Plant Mol Biol. 1990. - V. 14. - № 2. - P. 197-205.

145. Tacket C.O., Mason H.S., Losonsky G., Estes M.K., Levine M.M., Arntzen C.J. Human immune responses to a novel norwalk virus vaccine delivered in transgenic potatoes. // J Infect Dis. 2000. - V. 182. - № 1. - P. 302-305.

146. Tacket C.O., Roy M.J., Widera G., Swain W.F., Broome S., Edelman R. Phase 1 safety and immune response studies of a DNA vaccine encoding hepatitis В surface antigen delivered by a gene delivery device. // Vaccine. -1999. V. 17. - № 22. - P. 2826-2829.

147. Tang D.C., DeVit M., Johnston S.A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. // Nature. 1992. - V. 356. - № 6365.-P. 152-154.

148. Terada R., Shimamoto K. Expression of CaMV 35S-Gus gene in transgenic rice plants. // Mol Gen Genet. 1990. - V. 220. - P. 389-392.

149. Thanavala Y., Mahoney M., Pal S., Scott A., Richter L., Natarajan N., Goodwin P., Arntzen C.J., Mason H.S. Immunogenicity in humans of an edible vaccine for hepatitis B. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2005. V. 102. -№ 9. - P. 3378-3382.

150. Thanavala Y., Yang Y.F., Lyons P., Mason H.S., Arntzen C. Immunogenicity of transgenic plant-derived hepatitis В surface antigen. // Proc Natl Acad Sci USA.- 1995. V. 92. - № 8. - P. 3358-3361.

151. Theiler M., Smith H.H. The effect of prolonged cultivation in vitro upon the pathogenicity of yellow fever virus. // J Exp Med. 1939. - V. 65. - P. 767787.

152. Theiler M., Smith H.H. The use of yellow fever virus modified by in vitro cultivation for human immunization. J. Exp. Med. 65, 787-800 (1937). // Rev Med Virol. 2000. - V. 10. - № 1. - P. 6-16; discussion 13-15.

153. Topfer R., Matzeit V., Gronenborn В., Schell J., Steinbiss H.H. A set of plant expression vectors for transcriptional and translational fusions. // Nucleic Acids Res. 1987. - V. 15. - № 14. - P. 5890.

154. Tsuji N.M., Mizumachi К., Kurisaki J. Interleukin-10-secreting Peyer's patch cells are responsible for active suppression in low-dose oral tolerance. // Immunology. 2001. - V. 103. - № 4. - P. 458-464.

155. Tuboly Т., Yu W., Bailey A., Degrandis S., Du S., Erickson L., Nagy E. Immunogenicity of porcine transmissible gastroenteritis virus spike protein expressed in plants. // Vaccine. 2000. - V. 18. - № 19. - P. 2023-2028.

156. Ulmer J.B., Valley U., Rappuoli R. Vaccine manufacturing: challenges and solutions. // Nat Biotechnol. 2006. - V. 24. - № 11. - P. 1377-1383.

157. Valenzuela P., Medina A., Rutter W.J., Ammerer G., Hall B.D. Synthesis and assembly of hepatitis В vims surface antigen particles in yeast. // Nature. -1982. V. 298. - № 5872. - P. 347-350.

158. Van denElzen P., Townsend J., Lee K., Bedbrook J. A chimaeric hygromycin resistance gene as a selectable marker in plant cells. // Plant Molec Biol. -1985.-V. 5.-P. 299-302.

159. Varsani A., Williamson A.L., Rose R.C., Jaffer M., Rybicki E.P. Expression of Human papillomavirus type 16 major capsid protein in transgenic Nicotiana tabacum cv. Xanthi. // Arch Virol. 2003. - V. 148. - № 9. - P. 1771-1786.

160. Walmsley A.M., Arntzen C.J. Plants for delivery of edible vaccines. // Curr Opin Biotechnol. 2000. - V. 11. - № 2. - P. 126-129.

161. Warzecha H., Mason H.S., Lane C., Tryggvesson A., Rybicki E., Williamson A.L., Clements J.D., Rose R.C. Oral immunogenicity of human papillomavirus-like particles expressed in potato. // J Virol. 2003. - V. 77. -№ 16.-P. 8702-8711.

162. Webster D.E., Thomas M.C., Huang Z., Wesselingh S.L. The development of a plant-based vaccine for measles. // Vaccine. 2005. - V. 23. - № 15. - P. 1859-1865.

163. Webster D.E., Thomas M.C., Strugnell R.A., Dry I.B., Wesselingh S.L. Appetising solutions: an edible vaccine for measles. // Med J Aust. 2002b. -V. 176.-№9.-p. 434-437.

164. Webster R.G., Campbell C.H., Granoff A. The "in vivo" production of "new" influenza A viruses. I. Genetic recombination between avian and mammalian influenza viruses. // Virology. 1971. - V. 44. - № 2. - P. 317-328.

165. Wu H., Singh N.K., Locy R.D., Scissum-Gunn K., Giambrone J.J. Expression of immunogenic VP2 protein of infectious bursal disease virus in Arabidopsis thaliana. // Biotechnol Lett. 2004. - V. 26. - № 10. - P. 787-792.

166. Wu Y.Z., Li J.T., Мои Z.R., Fei L., Ni В., Geng M., Jia Z.C., Zhou W., Zou L.Y., Tang Y. Oral immunization with rotavirus VP7 expressed in transgenic potatoes induced high titers of mucosal neutralizing IgA. II Virology. 2003. -V. 313.-№2.-P. 337-342.

167. Yang Z.Q., Liu Q.Q., Pan Z.M., Yu H.X., Jiao X.A. Expression of the fusion glycoprotein of newcasstle disease virus in transgenic rice and its immunogenicity in mice. // Vaccine. 2007. - V. 25. - № 4. - P. 591-598.

168. Youm J.W., Won Y.S., Jeon J.H., Ryu С .J., Choi Y.K., Kim H.C., Kim B.D., Joung H., Kim H.S. Oral immunogenicity of potato-derived HBsAg middle protein in BALB/c mice. // Vaccine. 2007. - V. 25. - № 3. - P. 577-584.

169. Yu J., Langridge W. Expression of rotavirus capsid protein VP6 in transgenic potato and its oral immunogenicity in mice. // Transgenic Res. 2003. - V. 12. - № 2. - P. 163-169.

170. Yu J., Langridge W.H. A plant-based multicomponent vaccine protects mice from enteric diseases. // Nat Biotechnol. 2001. - V. 19. - № 6. - P. 548-552.

171. Zhang X., Buehner N.A., Hutson A.M., Estes M.K., Mason H.S. Tomato is a highly effective vehicle for expression and oral immunization with Norwalk virus capsid protein. 11 Plant Biotechnol J. 2006. - V. 4. - № 4. - P. 419-432.

172. Zhou J.Y., Cheng L.Q., Zheng X.J., Wu J.X., Shang S.B., Wang J.Y., Chen J.G. Generation of the transgenic potato expressing full-length spike protein of infectious bronchitis virus. // J Biotechnol. 2004. - V. 111. - № 2. - P. 121-130.

173. Zhou J.Y., Wu J.X., Cheng L.Q., Zheng X.J., Gong H., Shang S.B., Zhou E.M. Expression of immunogenic SI glycoprotein of infectious bronchitis virus in transgenic potatoes. // J Virol. 2003. - V. 77. - № 16. - P. 9090-9093.

Информация о работе

Поздняков, Сергей Геннадьевич
кандидата биологических наук
Кольцово, 2008
ВАК 03.00.03

Диссертация

Получение трансгенных растений томата, продуцирующих химерный белок TBI-HBsAg, и изучение иммуногенных свойств плодов этих томатов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Получение трансгенных растений томата, продуцирующих химерный белок TBI-HBsAg, и изучение иммуногенных свойств плодов этих томатов - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы