Получение низкомолекулярного хитозана и его производных, обладающих защитными и репарационными свойствами

Львова, Анна Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение низкомолекулярного хитозана и его производных, обладающих защитными и репарационными свойствами
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Получение низкомолекулярного хитозана и его производных, обладающих защитными и репарационными свойствами"

На правах рукописи

ЛЬВОВА АННА АЛЕКСАНДРОВНА

ПОЛУЧЕНИЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ХИТОЗАНА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ, ОБЛАДАЮЩИХ ЗАЩИТНЫМИ И РЕПАРАЦИОННЫМИ СВОЙСТВАМИ

03.01.06. - биотехнология (в том числе нанобиотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Щелково-2010

2 3 ЛЕН 2010

004618786

Работа выполнена в лаборатории инженерии ферментов Центра «Биоинженерия» РАН и в лаборатории биохимии фитоиммунитета Института биохимии им. А.Н.Баха РАН.

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

Варламов Валерий Петрович

доктор биологических наук Васюкова Наталия Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор технических наук, профессор член-корреспондент РАСХН Римарева Любовь Вячеславовна

кандидат биологических наук Куликов Сергей Николаевич

Ведущая организация: Московский государственный университет

пищевых производств (МГУПП)

заседании диссертационного совета Д 006.069.01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН по адресу: 141142, Московская область, Щёлковский район, пос. Биокомбината д. 17, ВНИТИБП

С диссертацией можно ознакомиться в научно-технической библиотеке Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности (ВНИТИБП) РАСХН

Автореферат разослан «¡¿2 » ноября 2010 г.

Защита диссертации состоится

декабря 2010 г. в

часов на

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Ю.Д. Фролов

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одиим из важнейших достижений мирового биотехнологического прогресса в области изыскания новых перспективных веществ за последние годы стало получение, изучение и внедрение в практику биополимеров хитина, хитозана и их производных. Принимая во внимание уникальные свойства хитина и хитозана, в последние годы значительно возрос интерес к изучению и практическому применению этих природных полимеров в таких областях как медицина, косметология, пищевая промышленность, ветеринария, а также в сельском хозяйстве для защиты растений от болезней.

Сельскохозяйственные растения постоянно находятся в условиях экологического стресса. Они страдают от болезней и вредителей, бесконтрольного применения пестицидов и избытка удобрений, а также других неблагоприятных факторов. В этих условиях защита растений от болезней и стрессов является особенно актуальной. Одиим из наиболее перспективных способов повышения защитных ответов растений является метод индуцирования их устойчивости с помощью экологически безопасных биогенных элиситоров (Метлицкий JI.B., Озерецковская O.JL, 1985; Durrant, Dong, 2004), к числу которых относится хитозан (Hadwigcr L.A., 1984).

Элиситоры - соединения, вызывающие или индуцирующие защитные механизмы в растительных тканях и тем самым предохраняющие растения от болезней и стрессов (Тарчевский И.А., 2002) Препятствием в использовании хитозана в качестве элиситора является его плохая растворимость в воде при нейтральном pH, с чем, по-видимому, частично может быть связана его невысокая биологическая активность. Для решения этой проблемы предпринимаются попытки снижения молекулярной массы хитозана, создания композиционных препаратов на его основе, а также синтеза новых производных, водорастворимых при нейтральном значении pH.

Одной из возможностей интенсификации защитных свойств хитозана является его комбинация с салициловой кислотой (CK) (Панина Я.С., 2005). Известно, что CK принимает участие в процессе формирования устойчивости растений (Васюкова Н.И., 1999; McDowell, Dung], 2000; Тарчевский И.А., 2002; Durrant, Dong, 2004), и является сигнальной мобильной молекулой, способной транспортироваться по тканям растений,

вызывая их системную устойчивость. Создание и использование на практике композиционных препаратов хитозана с сигнальными молекулами, обладающих высокой скоростью и интенсивностью индуцирования в растениях системных защитных реакций, являются достаточно перспективными.

Цель и задачи исследования. Цель исследования заключалась в получении низкомолекулярного хитозана и его производных с салициловой кислотой для поиска среди них новых высокоэффективных защитных препаратов, индуцирующих фитофтороустойчивость и стимулирующих процесс залечивания механических поранений у клубней картофеля.

Для достижения поставленной цели были определены основные задачи:

1. Оптимизировать метод ферментативного гидролиза высокомолекулярного хитозана (ВМХ 700 кДа) с помощью ферментного препарата (ФП) Фитопаии и определить условия получения низкомолекулярных образцов хитозана (НМХ) с заданной молекулярной массой 5-50 кДа.

2. Разработать технологическую схему производства НМХ из ВМХ с помощью ФП Фитопаин.

3. Исследовать влияние степени дезацетилирования (СД), молекулярной массы (ММ) и концентрации полученных образцов хитозана, на элиситорную и репарационную способность тканей клубней картофеля. Из полученных НМХ выбрать образец, обладающий наибольшей биологической активностью.

4. На основе выбранного образца хитозана, синтезировать его производные с салициловой кислотой (СК), изучить их биологическую активность. Определить препарат, проявляющий наибольшую способность индуцировать локальную и системную устойчивость клубней картофеля. Разработать технологическую схему его получения.

85%, индуцирующий фитофтороустойчивость и стимулирующий процесс залечивания механических поранений клубней картофеля. Показано, что элиситорная и репарационная активность хитозана имеет не только локальный, но и системный характер.

С целью интенсификации защитных свойств хитозана (ММ 5 кДа и СД 85%) были синтезированы его производные с системной мобильной сигнальной молекулой СК. Впервые проведенный скрининг производных хитозана позволил установить, что наибольшим защитным эффектом обладает М-2-гидрокси-3-метоксибензил-М-пиридоксхитозан, который в диапазоне испытанных концентраций превосходит свойства исходного хитозана. Установлено, что М-2-гидрокси-3-метоксибензил-М-пиридоксхитозан обладает:

• элиситорпой активностью, защищая картофель от возбудителя фитофтороза;

• репарационными свойствами, активно залечивая участки механических поранений клубней картофеля и тем самым предохраняя их от проникновения инфекции;

• защитными и репарационными свойствами в низких концентрациях (0,1-1 мкг/мл), в которых исходный хитозан активностью не обладает.

Теоретическая и практическая значимость работы. На основе НМХ (5 кДа), полученного, по разработанной методике, ферментативным гидролизом с помощью ФП Фитопаин, был синтезирован новый высоко активный препарат - элиситор, способный в малых концентрациях повышать фитофтороустойчивость и репарационную активность клубней картофеля.

пиридоксхитозан) даже в малых концентрациях интенсифицировал защитные ответы картофеля и увеличивал скорость их распространения, что является весьма существенным для сохранения урожая.

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на 4-ом Международном научно-практическом симпозиуме «Микробные биокатализаторы и их роль в нано- и биотехнологии», (г. Москва, 2008); Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Технологии и оборудование химической, биологической и пищевой промышленности» (г. Бийск, 2008); 9-ой международной конференции «Современные перспективы исследования хитина и хитозана» (г. Ставрополь, 2008); 5-ом съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (г. Москва, 2008); 9th International Conference of the European Chitin Society (Venice, Italy, 2009); Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (г. Щелково, 2009); 10-ой международной конференции "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана" (г. Нижний Новгород, 2010).

Личный вклад соискателя. Экспериментальные исследования в лаборатории инженерии ферментов (Центр «Биоинженерия» РАН) и в лаборатории биохимии фитоиммунитета (Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН), а также обобщение результатов по теме диссертационной работы выполнены автором самостоятельно.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 406 страницах машинописного текста, содержит таблиц »J4 рисунков, библиографию из -*/ ¿^^наименований, из них на иностранном языке.

Благодарности. Автор благодарит за поддержку и внимание сотрудников лаборатории инженерии ферментов Центра «Биоинженерия» РАН: к.х.н. A.B. Ильину, к.х.н. С.А. Лопатина, к.х.н. А.Н. Левова, Д.В. Курек, A.B. Бакулина, а также сотрудников лаборатории биохимии фитоиммунитета, Института Биохимии А.Н. Баха РАН: проф., д.б.н. О.Л. Озерецковскую, к.б.н. Г.И. Чаленко, к.б.н. Н.Г. Герасимову.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

Для получения НМХ (5-50 кДа) использовали крабовый ВМХ (700 кДа, СД 85%) производства фирмы «Нерре» Германия. Ферментативный гидролиз ВМХ осуществляли с помощью ферментного препарата (ФП) Фитопаин производство ЗАО «Биопрогресс», г. Щелково.

Измерение вязкости растворов хитозана проводили в капиллярном вискозиметре Уббелоде. Рассчитывали величину характеристической вязкости (г|), а также средневязкотиую молекулярную массу хитозана (Мг|) - по уравнению Марка-Хаувинка.

Степень дезацетилирования хитозана (СД) определяли методом кондуктометрического титрования.

Содержание белка в ферментном препарате исследовали но методу Bradford М.М.

Хроматографический анализ хитозана осуществляли методом высокоэффективной гельпроникающей хроматографии на приборе «Sykam» (Германия)

Хитиназную активность ФП Фитопаин определяли по количеству восстанавливающих Сахаров используя 3,5-динитросалициловую кислоту, в качестве реагента и коллоидный хитин, в качестве субстрата.

Протеиназную активность ФП Фитопаин определяли при длине волны 1=440, по количеству кислоторастворимых продуктов гидролиза, используя в качестве субстрата азоказеин.

Липолитическую активность ФП Фитопаин определяли при длине волны Х=410, используя в качестве субстрата паранитрофенил пальмитат.

Определения протеиназной и липолитической активности проводили на спектрофотометре Spekol 11 (Carl Zeiss Jena, ГДР).

Для определения защитной и репарационной активности хитозана и его производных использовали клубни картофеля сорта «Юбилей Жукова». Клубни картофеля инфицировали суспензией зооспор оомицета Phytophthora infestans (Mont.)de Вагу.

Испытание защитных и репарационных свойств хитозана и его производных проводили с помощью метода биотестирования (Чаленко Г.И. и др. 1990 год), в лаборатории биохимии фитоиммунитста Института биохимии им. А.Н.Баха РАН. Моделями служили клубни картофеля (рис.1).

Рисунок 1. Модели биотестов

ч о

« .й.

^ \

3 О 5 ш

2 в

а «

Обработка препаратом или водой (контроль) 0,05 мл

Время инкубации

Инфицирован ие дисков суспензией

зооспор Р. ш^ё^аш (104 спор/мл)

2 часа

а о

ГО

8 &

а к и

и #

ей И И

со к

2 о к

5! И о

Я «

1) в-к ч к ч о и о о,

с «

к я

а м о (х я и к

к к к я

ЕГ >>

Поверхность вырезанных из клубня картофеля дисков или клубней с удаленной глазковой частью, обрабатывали различными концентрациями испытуемых препаратов, а затем через определенные интервалы времени инфицировали суспензией зооспор патогена. Использование этих моделей позволяет оцепить способность веществ вызывать у клубней картофеля как локальную так и системную фитофтороустойчивость, а также интенсивность процесса залечивания.

Степень поражения клубней картофеля Р. тГез1апз оценивали по глубине проникновения в ткани дисков возбудителя фитофтороза, считая от поверхности инфицирования, микроскопически подсчитывая слои клеток, в которые проникли гифы патогена.

Процесс раневого залечивания на поверхности дисков, обработанных препаратами (без инфицирования патогеном), учитывали по скорости образования вторичной меристемы (пробкового камбия) - феллогена (на 3 сутки после поранения), тогда как интенсивность образования раневой перидермы оценивали по числу ее клеточных рядов (на 7 сутки после поранения).

Статистическая обработка данных. Статистическую обработку аналитических данных проводили с помощью компьютерного программного обеспечения SPSS' 10. При анализе данных микроскопических исследований использовали среднюю арифметическую (М) и абсолютную максимальную погрешность (Л) (Плохинский, 1980). Исследования проводились с вероятностью безошибочного прогноза, равной 0,95. Опыты осуществлялись в четырехкратной биологической и трехкратной аналитической повторпостях.

2.2. Результаты и их обсуждение.

2.2.1. Определение характеристик ферментного препарата.

В ходе исследований Фитопаина было установлено, что содержание белка в препарате составляло 45% от общей массы. Протеолитическая активность Фитопаина по азоказеину составляла 212,68 Е/мг белка. Липолитическая активность обнаружена не была. Хитипазная активность в данном ферментном препарате присутствовала лишь в следовых количествах и составляла 0,012 мкмоль ацетилглюкозамина/мин*мг белка.

2.2.2. Оптимизация условий ферментативного гидролиза.

Изменяя параметры процесса: рН среды, температуру, фермент-субстратное (Ф/С) соотношение, ММ и СД исходного хитозапа, можно получать хитозан с различными заданными характеристиками.

Выбор оптимального значения рН. Подбор оптимума рН осуществляли в диапазоне рН от 4 до 6. Это обусловлено тем, что при более высоких значениях рН высокомолекулярный хитозан не растворялся. Гомогенность системы нарушалась и гидролиз протекал в меньшей степени, смещение рН в кислую область (ниже рН 4) выходило за рамки диапазона рН - стабильности фермента. Наибольшее снижение вязкости раствора полимера наблюдалось при рН среды 5,5. Динамическая вязкость растворов полимера является характеристикой процесса гидролиза, так как позволяет наблюдать изменение вязкости растворов во времени.

Выбор оптимальной температуры Подбор оптимального

значения температуры осуществляли в диапазоне от 25 до 65°С. Наибольшее снижение вязкости растворов происходило при температуре

45-55°С. При дальнейшем увеличении температуры вязкость образцов существенно возрастала, что можно объяснить инактивацией фермента при данной температуре. Оптимальной оказалась температура 45°С, которая позволяла использовать меньшие энергозатраты в условиях производственного процесса.

Выбор оптимальной продолжительности процесса Тшш. Процесс ферментативного гидролиза хитозана проводили от 1 до 24 часов. Наибольшее падение вязкости растворов полимера наблюдалось в течение первого часа ферментативной реакции и составляло 67% относительно исходной. Это свидетельствует о высокой эффективности выбранного ФП. Оптимальная продолжительность процесса ферментативной деструкции хитозана составляла 4 часа.

Выбор опшималыюго фермент-субстратного соотношения. При определении средневязкостной ММ полученных образцов было установлено, что с увеличением количества Фитопаина молекулярная масса хитозана снижается, (рис. 2).

При изменении параметра Ф/С были получены НМХ с различной ММ: при Ф/С 1/100 - средпевязкостная ММ хитозана была равна 50 кДа, при Ф/С - 1/20 ММ хитозана составляла 15 кДа, наименьшая ММ хитозана - 5 кДа была получена при Ф/С соотношении 1/10.

Рисунок 2. Молекулярная масса полученных образцов хитозана при различном фермент-субстратном соотношении.

^ 800 1б00 I 400

и 200

2 „

}

исходный 1/800 1/400 1/100 1/20. 1/10.

фсрмент-субстратнос соотношение

Разработана методика и определены оптимальные условия ферментативного гидролиза ВМХ (700кДа) ферментным препаратом Фитопаин для получения НМХ хитозана с ММ 5-50 кДа при параметрах процесса рН 5,5; 145°С; время 4 часа.

2.2.3. Технологическая схема процесса получения низкомолскулярного хитозана из высокомолекулярного хитозана с помощью ферментного препарата Фнтопаин.

На основании проведенных исследований разработана технологическая инструкция по производству НМХ из ВМХ с помощью ФП Фитопаин.

Технологическая схема получения НМХ с помощью Фитопаина представляет собой многостадийный процесс (рис.3).

В реактор (1), снабженный рубашкой и мешалкой из емкости (2) загружали Юл 1М раствора уксусной кислоты, вручную загружали 300 г. высокомолекулярного хитозана 700 кДа, раствор выдерживали при постоянном перемешивании при 40°С в течение 1,5 часов, до полного растворения хитозана, затем раствор доводили раствором щелочи №011 из емкости (3) до рН = 5,5.

Рисунок 3. Технологическая схема получения низкомолекулярного хитозана из высокомолекулярного с помощью ферментного препарата Фитопаин.

, .¿ктбалюры ................

.«---(У1----•----, ..........М ..I •

' >......II Ь. |Х

фррмрнтый ' — —;

^-.-м......д

К бакуум | ^ '

Ч9ЙР

1 - реактор, 2 - емкость для кислоты, 3 - емкость для щелочи, 4 - емкость для растворения ФП, 5 - емкость для воды, 6 - насос центробежный, 7 -осадительная ванна, 8 - транспортер, 9 - центрифуга, 10 - морозильная камера, 11 - сублиматор, 12-теплообменник.

В емкости (4) растворяли 35 г. ферментного препарата Фитопаин в 1 л. воды и добавляли вручную активаторы, далее с помощью центробежного насоса (6) растворенный ферментный препарат подавали в реактор (1).

Процесс ферментативного гидролиза хитозана проводили при постоянном перемешивании, 1=45°С, рН 5,5 в течение 4 часов. По истечении времени гидролиза реакционная смесь при помощи насоса (6) поступала в осадительные ванны (7), где реакцию останавливали, инактивируя фермент добавлением щелочи из емкости (3) до рН среды 10.

Далее надосадочную жидкость сливали, в то время как осажденный хитозан оставляли на фильтре. Осадок промывали водой с целью отделения от солей, после чего с помощью транспортера (8) осадок направляли в центрифугу (9), где под действием центробежных сил происходит уплотнение осадка и отделение надосадочной жидкости. Затем хитозан вновь подавали в осадительные ванны (7), где происходит его суспензирование в воде для отделения от солей, а рН среды доводили щелочью до 10 во избежание потерь водорастворимых фракций. Далее осадок снова направляли в центрифугу(9).

После трехкратной рециркуляции полученного хитозана продукт направляли на лиофильную сушку, до достижения остаточной влажности в образце не более 10%.

Выбранные параметры процесса и оборудование для его проведения позволяют получить низкомолекулярный хитозан с заданными характеристиками из высокомолекулярного с помощью Фитопаина.

2.2.4. Влияние молекулярной массы, степени дсзацстшшрования и концентрации на элиситорную активность хитозана.

Молекулярная масса хитозана. Для изучения зависимости элиситорной активности хитозана от его ММ были взяты образцы хитозана со средневязкостной ММ 5, 15 и 50 кДа, полученные ферментативным гидролизом высокомолекулярного хитозана (ВМХ) - 700 кДа с помощью ФП Фитопаин. Наибольший защитный эффект (15-20%) проявлял образец хитозана со средневязкостной ММ 5кДа, активно защищая клубни картофеля от возбудителя фитофтороза.

Степень дезацетилировапия хитозаиа. Исследована элиситорная активность образцов хитозана с ММ 5 кДа и СД от 70% до 98%. Наибольшая элиситорная активность была обнаружена у образца хитозана со СД 85%.

С помощью метода высокоэффективной гельпроникающей хроматографии образец хитозана со средпевязкостной ММ 5кДа и СД 85% был охарактеризован (рис. 4).

Рисунок 4. Хроматорграмма образца хитозана с молекулярной массой 5 кДа, степенью дезацетилировапия 85%

ММ=5.54 срсднсчисловая мол. масса М1Г=8.40 -средневесовая мол масса 1р=Ш/МЫ= 1.52-индекс

полидесперсности МР= 4.98 - мол. масса для наибольшего пика

Данная хроматорграмма (рис. 4) свидетельствует об узкой степени полидиснерсности (1р=1,52) исследуемого образца хитозана. Молекулярная масса для наибольшего пика (МР) составляет 4,98 кДа, что хорошо коррелирует со значением средпевязкостной молекулярной массой.

Концентрация хитозана. Как следует из данных (табл. 1 А), максимальную элиситорную (защитную) активность хитозан проявлял в концентрации 100 мкг/мл, при которой обнаружена наибольшая защита тканей картофеля от фитофтороза (23%).

Процесс залечивания раневой поверхности дисков клубней картофеля наблюдали на 3 и 7 сутки (табл. 1Б). Наибольшую защиту хитозан проявлял при концентрации 100 мкг/мл.

Таблица 1. Влияние концентрации хитозана на _его защитные и репарационные свойства

(А) Влияние концентрации (Б) Влияние концентрации

>нцентрация, мкг/мл хитозана на развитие фитофтороза хитозана на процесс раневой репарации

глубина проникновения раневая репарация, сутки

Вариант РлпГеяШпз в ткани клубия з Н 7

число слоев, М ± А %от копт роля * % фелло- число рядов % от

И защ иты ген, % от контр перидермы, М± А конт роля

Вода (контроль) 26,7 ± 1,1 100 0 100 4,09 ± 0.02 100

200 24.3 ±1.3 91 0 108 4.70 ± 0.06 115

150 21.4 ±0.8 80 9 107 4.54 ± 0.04 111

Исходный 100 20.5 ±0.9 77 20 112 4.74 ± 0.03 116

хитозан 10 22.4 ± 0.7 84 23 105 4.38 ± 0.05 107

1 24.0 ± 1.7 90 16 106 4.25 ± 0.01 104

0.1 25.9 ±0.7 97 10 101 3.80 ± 0.03 93

Таким образом, хитозан с ММ 5 кДа и СД 85%, оптимально индуцировал защитные свойства клубня картофеля против возбудителя фитофтороза и стимулировал процесс раневой репарации при концентрации 100 мкг/мл.

2.2.5. Индукция хитозаном системной фитофторустойчивости и репарационной способности клубней картофеля, (см. рис.1, модель 2)

Известно, что устойчивость (защитные ответы) растений бывают двух типов: локальная (ЛУ) и системная индуцированная устойчивость (СИУ). ЛУ возникает непосредственно в инфицированных или обработанных элиситорами тканях растения. СИУ распространяется по всем тканям растения, начиная от места инфицирования или обработки элиситором.

Индукцию СИУ с помощью хитозана изучали на 2-ые, 4-ые и 7-ые сутки после обработки препаратом с последующим инфицированием возбудителем фитофтороза.

Анализировали глубину проникновения гиф патогена по тканям клубня картофеля (табл. 2).

Согласно полученным данным, системная защита хитозаном на 2-ые сутки достигала только 1 -ого диска от поверхности нанесения препарата.

На 4-ые сутки индуцируемая хитозаном системная устойчивость достигла 3-его диска (6% защиты), а к 7-ым суткам защита картофеля от фитофтороза возрастала и распространялась по всем тканям дисков на 1620%.

Таблица 2. Системная индукция фитофтороустойчивости, развивающаяся у клубней картофеля __после обработки хитозаном (100мкг/мл)

2 сутки 4сутки 7сутки

№ диска 1 2 3 1 2 3 1 2 3

глубина проникновения P. infestons, слои клеток, % от контроля 91 98 100 83 90 94 80 83 84

% защиты 9 2 0 17 10 6 20 17 16

Развитие системных свойств процесса раневой репарации изучали на 2-ые, 4-ые и 7-ые сутки после обработки хитозаном. Анализировали скорость образования феллогена и число рядов образовавшейся раневой перидермы.

Оказалось, что процесс раневой репарации после обработки хитозаном (табл.3) с течением времени постепенно распространяется от 1 -го диска к 3-му. В итоге на 7-ые сутки на поверхности всех дисков образовалась более плотная раневая перидерма, чем в контроле, что является показателем системности процесса раневой репарации.

Таблица 3. Системная репарация, развивающаяся в клубнях _ картофеля после обработки хитозаном (100мкг/мл)

2 сутки 4 сутки 7 сутки

№ диска 1 2 3 1 2 3 1 2 3

Число рядов раневой перидермы, % от контроля 106 103 98 115 106 106 122 125 115

Феллоген, % от контроля 108 102 100 116 112 105 * * *

* - На 7-ые сутки определение феллогена не представляется возможным, так как к этому сроку раневая перидерма уже сформировалась.

Хитозан (ММ 5 кДа, СД 85%) обладал способностью индуцировать защитные свойства клубней картофеля против возбудителя фитофтороза и стимулировать процессы раневой репарации не только локально, в местах соприкосновения с инфекцией или элиситором, но и системно, в местах, удаленных от контакта с патогеном.

Вместе с тем следует подчеркнуть, что элиситорная активность, присущая исследуемому хитозану, не превышала 16-20%, считая от контрольного варианта. В связи с этим задачей следующего раздела работы служила попытка увеличить элиситорный эффект хитозана. Одним из способов такой интенсификации является использование системной сигнальной молекулы салициловой кислоты (СК) в комбинации с элиситором.

Ранее было показано (Панина Я.Н. и др., 2005), что смешивание хитозана с СК усиливало и, что не менее важно, ускоряло возникновение защитного эффекта в клубнях картофеля против возбудителя фитофтороза.

Представляло интерес определить, стимулирует ли композиционный препарат (хитозан + СК) не только фитофтороустойчивость клубней картофеля, но и процесс раневой репарации (табл.4).

Результаты показали, что композиционный препарат не только не интенсифицировал процесс залечивания поранений клубней картофеля, но, напротив, его значительно подавлял. Таким образом, композиционный препарат (хитозан + СК) повышал сопротивляемость клубня картофеля к P. infestons, но одновременно подавлял процесс раневой репарации.

Таблица 4. Влияние композиции хитозан + СК на процесс раневого залечивания клубней картофеля

Вариант Раневая репарация, сутки после обработки

3 7

Феллоген, %от контр. Число рядов перидермы, М±Д % от контроля

Вода (контроль) 100 3.95 ± 0,02 100

Салициловая кислота (7*10"8М) 79 2,92 ± 0,03 74

Хитозан (100 мкг/мл) НО 4.42 ± 0.07 112

Хитозан (100 мкг/мл)+ СК(7*10~8М) 86 3.36 ±0.01 85

Полученные результаты диктовали необходимость поиска новых элиситоров среди производных хитозана с СК, способных повышать не только защиту картофеля от фитофтороза, но и стимулировать процессы раневой репарации.

2.2.6. Производные хитозана с салициловой кислотой.

В лаборатории инженерии ферментов Центра «Биоинженерия» РАН были синтезированы производные хитозана, (полученного с помощью ФП Фитопаина) с салициловой кислотой. Для этого полимерную цепь хитозана модифицировали по аминогруппам. В результате получены следующие производные:

Исходный хитозан Салицилат хитозана

М-2-гидроксибепзоилхитозан

М-2-гидроксибензилхитозан

]^-пиридоксхитозан

Ы-2-гидроксибснзил-Ы-пиридоксхитозан Ы-2-1идрокси-3-метоксибензилхитозан М-2-гидрокси-3-метоксибензил-Ы-пиридоксхитозан

п=85, ш=15, р=0, к=0 ММ 5 кДа

1С 1С -7П 1 п Х = ЬШз С6Н5

п=15, ш=15, р=70, к=0 ОСОО"

п=70, ш=15, р=15, к=0 X = А

п=70, ш=15, р=15, к=0 Х = В

п=70, ш=15, р=15, к=0 Х = С

п=45, ш=15, р=20, к=20 X = С, У = В

п=65, т=15, р=20, к=0 Х = Э

п=45, ш=15, р =20, к=20 X = С, У = Э

2.2.6.1. Влияние производных хитозана на развитие фитофтороустойчивости клубней картофеля.

Согласно полученным данным (табл.5 А) салицилат хитозана (образец № 2) подавлял инфекцию на 41-46% в диапазоне концентраций (1-100мкг/мл).

Таблица 5. Влияние производных хитозана на защитные и репарационные свойства клубней картофеля.

(Л) Влияние производных (Б) Влияние производных

я с; хитозана на развитие фитофтороза хитозана на процесс раневой репарации

Вариант глубина проникновения раневая репарация,сутки

сЗ I Си ю о г ц РлпГе\ч&п$ в ткани клубня 3 7

Я 2 в: & число слоев, М±Д % от конт роля % защ иты фелло-ген, % от контр число рядов перидермы, М±Л %от конт роля

* Вода (контроль) 26,7± 1,1 100 0 100 3,95 ± 0,02 100

100 18,7 ±0,9 70 30 104 4,28 ± 0,07 108

Исходный 10 21,9 ±0,7 82 18 102 4,70 ±0,03 119

хитозан 1 23,5 ±1,7 88 12 101 4,37 ± 0,05 110

0,1 23,8 ± 0,7 89 11 102 3,90 ± 0,03 99

100 16,4 ± 1,9 61 39 76 3,52 ±0,01 89

2. Салицилат 10 14,4 ±0,5 54 46 70 2,57 ± 0,07 65

хитозана 1 15,7 ±0,8 59 41 62 2,61 ±0,02 66

0,1 26,4 ±1,9 99 1 77 3,47 ±0,04 69

100 15,2 ± 1,2 57 43

3. М-2-гидрокси-беизоилхитозан 10 1 19,5 ± 1,1 32,8 ± 0,7 73 89 27 11 105 3,62 ± 0,05 92

0,1 25,6 ±0,8 96 4 102 3,96 ± 0,07 100

100 14,4 ±0,5 54 46 96 3,33 ± 0,03 84

4. М-2-гидрокси-бепзилхитозан 10 1 15,7 ±0,8 16,0± 1,0 59 60 41 40 92 93 3,90 ±0,10 3,63 ± 0,09 99 92

0,1 18,4 ±0,8 57 43 96 3,73 ± 0,01 95

100 18,2 ±0,4 68 32 105 4,35 ±0,10 110

5. Ы-пиридокс 10 17,1 ±1,2 64 36 103 3,71 ± 0,03 94

хитозан 1 20,3 ± 0,8 76 24 100 3,73 ± 0,05 95

0,1 23,0 ± 1,4 86 14 102 4,07 ± 0,02 103

6. ]М-2-гидрокси бензил-М-пиридокс хитозан 100 10 1 0,1 28,3 ± 1,7 28,0 ± 1,5 27,2 ± 2,0 27,5 ± 1,7 подавление устойчивости 73 79 40 40 4,38 ± 0,03 4,02 ±0,07 3,44 ±0,01 3,61 ± 0,05 110 102 87 91

7. !Ч-2-гидрокси- 3-метокси бензилхитозаи 100 10 1 0,1 25,1 ±0,9 25,4 ± 1,0 25,1 ± 1,1 23,8 ± 0,8 94 95 94 89 6 5 6 11 82 71 57 96 3,93 ± 0,04 3,89 ±0,01 3,41 ±0,03 3,97 ± 0,03 99 98 86 100

>)-2-гидрокси-3- 100 19,8 ±0,9 74 26 190 5,42 ± 0,05 138

метоксибснзил- 10 16,0 ±1,1 60 40 185 5,19 ±0,01 132

К-пиридокс-хитозан 1 0,1 19,2 ± 1,2 19,0 ± 1,8 72 71 28 29 130 155 4,87 ±0,01 4,40 ± 0,04 121 112

Глубина проникновения патогена составляла примерно 54 - 59%, и только в минимальной дозировке (0.1 мкг/мл) эффект защиты от патогена практически отсутствовал. При сопоставлении защитных свойств всех исследованных препаратов по сравнению с хитозаном оказалось, что образцы №4, №5 и №8 примерно в равной степени подавляли развитие фитофтороза в клубнях картофеля во всём исследуемом диапазоне концентраций. Ингибирование инфекции этими производными обнаружено даже при низких дозах - 1,0 и 0,1 мкг/мл, в то время как хитозан в этих концентрациях оказался почти неэффективным. Остальные производные по степени защиты уступали образцам №4, №5 и №8, а у препаратов №6 и №7 эффект защиты почти отсутствовал.

2.2.6.2. Влияние производных хитозана на процесс раневой репарации клубней картофеля.

Испытания показали (табл.5 Б), что исходный хитозан (образец № 1), стимулировал процесс раневой репарации. Все испытанные производные хитозана по их способности влиять на интенсивность раневой репарации представляли собой широкий спектр воздействия: от сильного ингибирования раневой репарации (образец №2) до значительной активации процесса залечивания (образец №8).

Процесс репарации в наибольшей степени стимулировал N-2-гидрокси-З-метоксибснзил-Ы-пиридоксхитозан (образец №8), который даже в минимальной концентрации (0.1 мкг/мл) проявлял положительный эффект. Это производное особенно сильно стимулировало образование феллогена, что характеризует скорость процесса раневой репарации. Быстрый процесс залечивания поранений при обработке стимулирующими препаратами во многом определяет защиту растения, поскольку позволяет срочно закрыть пораненные участки для возможного проникновения инфекции.

На рис.5 представлены данные, характеризующие элиситорную и репарационную активность трех производных хитозана. Обнаружено, что образец № 2 активно защищал картофель от возбудителя фитофтороза, но резко подавлял репарацию. Образец №4 обладал хорошими защитными свойствами, но практически не влиял на процесс раневого залечивания.

Исключительными свойствами обладал образец №8, который стимулировал как защиту от фитофтороза, так и раневую репарацию

тканей картофеля. Характерным отличием действия образца №8 была высокая скорость образования феллогена на раневой поверхности.

Рисунок 5. Влияние производных хитозана (10 мкг/мл) на защитные и репарационные реакции в клубнях картофеля

образец № 2 салицилат хитозана, образец №4 Ы-2-гидроксибензил-

80 60 °40 20 0

№2 №4 №8

□ защита клубней картофеля от Р.тГеэ1апз, % П образование феллогена, %

хитозан, образец №8 N-2-гидрокси-З-метоксибензил-N-пиридоксхитозан

В целом можно отметить, что синтез хитозана с СК позволяет усилить защитные свойства этих производных против возбудителя фитофтороза и в то же время уменьшить отрицательное воздействие СК на процесс раневой репарации. Оптимальные элиситорные и репарационные свойства оказались присущи образцу №8. Это производное значительно лучше, чем исходный хитозан, защищало картофель от возбудителя фитофтороза и стимулировало процесс раневой репарации, причем в более низких, чем хитозан, концентрациях (табл. 6).

Таблица 6. Сравнительная элиситорная и

Вещество Конце» трация, мкг/мл Глубина проникновения Р.тГс^апя, слои Раневая репарация, % от контроля

М ±Д % от контр феллоген Число рядов перидермы

Вода - 24.3 ±2.1 100 100 100

Салициловая кислота 7*10"8М 19.7± 1.7 81 83 91

Хитозан 100 20.4 ±2.0 84 112 119

10 18.0 ± 1.8 74 105 108

1 21.4 ± 1.6 88 106 110

0.1 21.6 ± 1.9 89 101 99

Образец №8 М-2-гидрокси-З-метоксибснзил-М-пиридоксхитозан 100 14.6 ±1.1 60 190 138

10 17.0± 1.4 70 185 132

1 17.5 ± 1.0 72 130 121

0.1 21.6 ± 1.9 71 155 112

Таким образом, целенаправленный поиск новых высокоэффективных элиситоров среди производных хитозана с системной мобильной сигнальной молекулой СК оказался достаточно перспективным.

2.2.7. Технологическая схема получения 1^-2-гидрокси-3-метоксибензил-Г^-пирндоксхитозана.

Схема получения ^2-гидрокси-3-метоксибензил-Ы-пиридоксхитозаня была реализована в лаборатории инженерии ферментов Центра «Биоинженерия» РАН (рис. 6).

Для получения Ы-2-гидрокси-3-метоксибензил-Ы-пиридоксхитозана использовали низкомолекулярный хитозан (5 кДа, СД=98%).

Для этого 10 г хитозана 5 кДа (0,062 моль N112 групп) растворяли (технологический процесс! - ТП1) в 300 мл 1% водного раствора уксусной кислоты, затем добавляли 12,6 г. (0,062 моль) пиридоксаль-гидрохлорида, перемешивали (ТПг) в течение 2 ч при 1°=50°С, затем охлаждали до I ком„ (ТП3), и добавляли 100мл 3%-го водного раствора боргидрида натрия (0,08 моль), при постоянном перемешивании выдерживали в течение 1 часа (ТП4). После чего проводили деминерализацию (ТП5). Полученный раствор М-пиридоксхитозана концентрировали (ТП6), а затем растворяли в уксусной кислоте (ТП7). К полученному раствору добавляли 6,08 г. (0,04 моль) 2-гидрокси-З-метоксибензальдегида, и перемешивали в течение 2 ч при I = 50°С (ТП8), затем охлаждали до I комДТПд) Добавляли 100мл 2%-го водного раствора боргидрида натрия ЫаВН4 (0,08 моль), перемешивали при I комн в течение 1 часа (ТП10), после чего 5%-ым раствором уксусной кислоты доводили рН до 5,5 (ТПц) и деминерализовали (ТП12).

Образец высышивали (ТП]3), после чего выделяли 9,7 г. (85%) бледно-желтого порошка К-2-гидрокси-3-метоксибеизил-М-пиридоксхитозапа со степенью замещения 55%.

На основании данного методического подхода может быть разработана технология производства Ы-2-гидрокси-3-метоксибензил-Ы-пиридокс-хитозана.

Рисунок 6. Блок-схема технологического процесса получения 1Ч-2-гидрокси-3-метоксибензил-М-пиридоксхитозана

Хитозан

тп, растворение

тпг синтез 1

'-коми

ТП3 охлаждение

тп4 синтез 2

тп. деминерализация

тп,, концентрирование

тп, растворение

тп» синтез 3

'^КПМН

тп, охлаждение

тп„ синтез 4

тп, 1 закисление рН =5,5

тп ,г деминерализация

тп„ сушка

Т11|4 фасовка

2ч, 50°С

1 % укс.к-та

Пиридоксаль гидрохлорид

^комн.^

3% №1Ш4

2ч, 50°С

2% укс.к-та

2-гидрокси-

3-метокси-безальдегид

^оми. 2ч

2% ЫаВН4

5% укс.к-та

выводы

1. Изучен процесс гидролиза ВМХ ферментным препаратом Фитопаин, и подобраны условия для получения НМХ с заданной ММ 5-50 кДа.

2. Разработана, опробована и оптимизирована технологическая схема процесса ферментативного гидролиза ВМХ с помощью ферментного препарата Фитопаин.

3. Из полученных образцов НМХ наибольшую защитную (элиситорную) и репарационную активность проявил образец хитозана с МР 5 кДа и СД 85%, максимально индуцирующий фитофтороустойчивость и стимулирующий процесс залечивания механических поранений клубней картофеля в концентрации 100 мкг/мл. Установлено, что элиситориая и репарационная активность хитозана имеет как локальный, так и системный характер.

4. Впервые для интенсификации защитных свойств хитозана были синтезированы и испытаны на биологическую активность его производные с системной сигнальной молекулой (салициловой кислотой).

5. Проведенный скрининг производных хитозана позволил установить, что наибольшим защитный эффект проявлял 1Ч-2-гидрокси-3-метоксибензил-М-пиридоксхитозан, обладая:

❖ элиситорной активностью, защищая картофель от возбудителя фитофтороза;

❖ высокими репарационными свойствами, активно залечивая участки поранений клубней картофеля, предохраняя их от проникновения инфекции;

♦> защитной и репарационной активностью в более низких концентрациях (0,1-1 мкг/мл) по сравнению с хитозаном.

6. Оптимизированы условия для получения 1\Г-2-гидрокси-3-метоксибснзил-Ы-пиридоксхитозана и разработана технологическая схема процесса.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На производстве ЗАО «Биопрогресс» была апробирована ранее разработанная в лаборатории инженерии ферментов Центра «Биоинженерия» РАН методика ферментативного гидролиза высокомолекулярного хитозана с помощью протеолитического ферментного препарата Фитопаин с целью получения низкомолекулярного водорастворимого хитозана. По разработанной технологии были изготовлены 3 опытно-промышленные серии низкомолекулярного хитозана и определены физико-химические показатели полученных препаратов. Полученные образцы хитозана могут быть рекомендованы для использования как в синтезе новых производных, так и в сельском хозяйстве для защиты растений.

Разработана технологическая инструкция по производству НМХ из ВМХ с помощью ферментного препарата Фитопаин.

На основе полученного НМХ (5 кДа) и СК была разработана методика получения высокоэффективного препарата М-2-гидрокси-3-мстоксибспзил-М-пиридоксхитозан, обладающего защитными (элиситорными) и репарационными свойствами. N - 2 - гидрокси - 3 - метоксибензил - N -пиридоксхитозан может быть рекомендован к испытаниям в сельском хозяйстве, как средство защиты картофеля от патогенных инфекций, а так же для быстрого залечивания механических поранений тканей растения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Васюкова Н. И., Озерецковская О. JI., Чаленко Г. И., Герасимова Н. Г., Львова А. А., Ильина А. В., Левов А. Н., Варламов В. П. «Индуцирование устойчивости картофеля производными хитозана», Доклады РАН. 2009. Т. 427. № 3. с.423-425.

2. Васюкова Н. И., Озерецковская О. Л., Чаленко Г. И., Герасимова Н. Г., Львова А. А., Ильина А. В., Левов А. Н., Варламов В. П., Тарчевский И. А. «Иммуномодулирутощая активность производных хитозана с салициловой кислотой и ее фрагментами», Прикладная биохимия и микробиология, 2010, т. 46. №3. с. 379-384.

3. Львова A.A., Бакулин A.B., Ильина A.B., Албулов А.И., Варламов В.П. «Деполимеризация высокомолекулярного хитозана протеолитическими ферментными препаратами», Сборник научных трудов 4-го Междунородного научно-практического симпозиума «Микробные биокатализаторы и их роль в нано- и биотехнологии», ГНУ ВНИИ пищевой биотехнологии, г. Москва, 2008. с. 149-151

4. Львова A.A., Бакулин А. В., Ильина A.B., Албулов А.И., Варламов В.П. «Ферментативный гидролиз высокомолекулярного хитозана папаином», Материалы всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Технологии и оборудование химической, биологической и пищевой промышленности», Алтайский гос. тех. университет им. И. И. Ползунова, Бийск, 2008. с. 108-110

5. Бакулин А. В., Львова A.A., Албулов А.И., Tran Dinh Toai, «Деполимеризация высокомолекулярного хитозана ферментным препаратом фитопапаином», Материалы 9-ой международной конференции «Современные перспективы исследования хитина и хитозана», г. Ставрополь, Россия, 2008, с. 241-243.

6. Озерецковская О.Л., Васюкова Н.И., Львова A.A., Герасимова Н.Г., Чаленко Г.И., Ильина A.B., Левов А.Н. «Модифицирование элиситорных свойств хитозана», Материалы 9-ой международной конференции «Современные перспективы исследования хитина и хитозана», г. Ставрополь, Россия, 2008, с. 249-252

7. Львова A.A. «Модифицирование элиситорных свойств хитозана», Материалы 5-го съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, г. Москва, 2008. с. 342-343.

8. Lvova A.A., Levov A.N., Chalenko G.I., Gerasimova N.G. «Elicilor activity of chitosan and it's derivatives» 9lh International Conference of the European Chitin Society, 2009. Venice, Italy. P. 93

9. Львова A.A., Левов A.H., Озерецковская О.Л., Васюкова Н.И., Чаленко Г.И., В.П. Варламов «Индуцирование устойчивости картофеля производными хитозана», Материалы международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», Россия, г. Щелково с. 575-580.

Ю.Львова A.A., Чаленко Г.И., Герасимова Н.Г., Васюкова Н.И., Озерецковская О.Л. «Защитные, репарационные и токсические свойства производных хитозана», Материалы 10-ой международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана», Россия, г. Нижний Новгород, 2010, с. 295-298.

Подписано в печать 15.11.2010 г. Печать лазерная цифровая Тираж 100 экз.

Типография Aegis-Print 115230, Москва, Варшавское шоссе, д. 42 Тел.: 543-50-32 www.autoref.ae-print.ru

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Львова, Анна Александровна

Содержание.

Список используемых сокращений.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Хитин.Ю

2.2. Хитозан.

2.3. Получение низкомолекулярного хитозана.

2.3.1 Химические способы гидролиза.

2.3.2. Физические способы гидролиза.

2.3.3. Ферментативный гидролиз.

2.3.3.1. Гидролиз хитозана протеолитическими ферментами.

2.4. Области применения хитозана.

2.5. Индукция устойчивости растений.

2.5.1 Локальная индуцированная устойчивость.

2.5.2. Системная индуцированная устойчивость.

2.5.3. Раневая репарация.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Объекты исследования.

3.2. Физико-химические методы исследования.

3.3. Биологические методы исследования.

3.3.1. Элиситорная активность.

3.3.2. Раневая репарация.

3.4. Статистическая обработка данных.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Определение качественных и количественных характеристик ферментного препарата Фитопаин.

4.2. Оптимизация процесса ферментативного гидролиза высокомолекулярного хитозана с помощью ферментного препарата Фитопаин.

4.2.1. Выбор оптимального значения рН.

4.2.2. Выбор оптимальной температуры.

4.2.3. Выбор оптимальной продолжительности процесса.

4.2.4. Выбор оптимального фермент-субстратного соотношения.

4.2.5. Влияние активаторов на процесс ферментативного гидролиза.

4.2.6. Методика ферментативного гидролиза высокомолекулярного хитозана Фитопаином.

4.2.7. Технологическая схема процесса получения низкомолекулярного хитозана из высокомолекулярного хитозана с помощью ферментного препарата Фитопаин.

4.3. Влияние параметров хитозана на его элиситорную активность.

4.3.1. Молекулярная масса хитозана.

4.3.2. Степень дезацетилирования хитозана.

4.3.3. Концентрации хитозана.

4.3.3.1. Влияние концентрации хитозана на его способность индуцировать локальную устойчивость.

4.3.3.2. Влияние концентрации хитозана на раневую репарацию тканей клубней картофеля.

4.3.4. Индукция хитозаном системной устойчивости клубней картофеля.

4.4. Интенсификация элиситорной активности хитозана с помощью салициловой кислоты.

4.4.1. Композиция хитозана с салициловой кислотой.

4.4.2. Производные хитозана с салициловой кислотой.

4.4.3 .Влияние производных хитозана на развитие фитофтороустойчивости клубней картофеля.

4.4.4. Влияние производных хитозана на процесс раневой репарации клубней картофеля.

4.4.5. Технологическая схема получения >Т-2-гидрокси-3-метоксибензш1-1Я-пиридоксхитозана.

5. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение низкомолекулярного хитозана и его производных, обладающих защитными и репарационными свойствами"

Актуальность темы. Одним из важнейших достижений мирового биотехнологического прогресса в области изыскания новых перспективных веществ за последние годы стало получение, изучение и внедрение в практику биополимеров хитина, хитозана и их производных. Принимая во внимание уникальные свойства хитина и хитозана, в последние годы значительно возрос интерес к изучению и практическому применению этих природных полимеров в таких областях как медицина, косметология, пищевая промышленность, ветеринария, а также в сельском хозяйстве для защиты растений от болезней.

Сельскохозяйственные растения постоянно находятся в условиях экологического стресса. Они страдают от болезней и вредителей, бесконтрольного применения пестицидов и избытка удобрений, а также других неблагоприятных факторов. В этих условиях защита растений от болезней и стрессов является особенно актуальной. Одним из наиболее перспективных способов повышения защитных ответов растений является метод индуцирования их устойчивости с помощью экологически безопасных биогенных элиситоров [87,10], к числу которых относится хитозан [19].

Элиситоры - соединения, вызывающие или индуцирующие защитные механизмы в растительных тканях и тем самым предохраняющие растения от болезней и стрессов [96].

Препятствием в использовании хитозана в качестве элиситора является его плохая растворимость в воде при нейтральном рН, с чем, по-видимому, частично может быть связана его невысокая биологическая активность. Для решения этой проблемы предпринимаются попытки снижения молекулярной массы хитозана, создания композиционных препаратов на его основе, а также синтеза новых производных, водорастворимых при нейтральном значении рН.

Одной из возможностей интенсификации защитных свойств хитозана является его комбинация с салициловой кислотой (СК) [92].

Известно, что СК принимает участие в процессе формирования устойчивости растений [72; 41; 96; 10], и является сигнальной мобильной молекулой, способной транспортироваться по тканям растений, вызывая их системную устойчивость. Создание и использование на практике композиционных препаратов хитозана с сигнальными молекулами, обладающих высокой скоростью и интенсивностью индуцирования в растениях системных защитных реакций, являются достаточно перспективными.

Для достижения поставленной цели были определены основные задачи:

1. Оптимизировать метод ферментативного гидролиза высокомолекулярного хитозана (ВМХ 700 кДа) с помощью ферментного препарата (ФП) Фитопаин и определить условия получения низкомолекулярных образцов хитозана (НМХ) с заданной молекулярной массой 5-50 кДа.

2. Разработать технологическую схему производства НМХ из ВМХ с помощью ФП Фитопаин.

Научная новизна работы. Установлена возможность гидролиза ВМХ (700 кДа) ферментным препаратом Фитопаин. Оптимизирован метод и подобраны условия для получения образцов НМХ с заданной характеристикой молекулярной массы от 5 до 50 кДа. Разработана технологическая схема и подобраны условия проведения ферментативного гидролиза хитозана с помощью Фитопаина. Наибольшей элиситорной и репарационной активностью обладает образец хитозана с ММ 5 кДа и СД 85%, индуцирующий фитофтороустойчивость и стимулирующий процесс залечивания механических поранений клубней картофеля. Показано, что элиситорная и репарационная активность хитозана имеет не только локальный, но и системный характер.

С целью интенсификации защитных свойств хитозана (ММ 5 кДа и СД 85%) были синтезированы его производные с системной мобильной сигнальной молекулой СК. Впервые проведенный скрининг производных хитозана позволил установить, что наибольшим защитным эффектом обладает >1-2-гидрокси-3-метоксибензил-1М-пиридоксхитозан, который в диапазоне испытанных концентраций превосходит свойства исходного хитозана. Установлено, что N-2-гидрокси-З-метоксибензил-КГ-пиридоксхитозан обладает:

• элиситорной активностью, защищая картофель от возбудителя фитофтороза;

Теоретическая и практическая значимость работы. На основе НМХ (5 кДа), полученного, по разработанной методике, ферментативным гидролизом с помощью ФП Фитопаин, был синтезирован новый высоко активный препарат -элиситор, способный в малых концентрациях повышать фитофтороустойчивость и репарационную активность клубней картофеля.

Фитофтороз является одной из наиболее вредоносных болезней картофеля, уносящей в годы эпифитотий до 50% его урожая. Репарационная способность картофеля также представляет немалую важность для сельскохозяйственного производства, поскольку пораненная поверхность клубней, неизбежная при уборке и транспортировке, открывает возможность беспрепятственного проникновения инфекции. Полученный препарат (N-2-гидрокси-З-метоксибензил-N-пиридоксхитозан) даже в малых концентрациях интенсифицировал защитные ответы картофеля и увеличивал скорость их распространения, что является весьма существенным для сохранения урожая.

2008); 5-ом съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (г. tb

Москва, 2008); 9 International Conference of the European Chitin Society (Venice, Italy, 2009); Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (г. Щелково,

2009); 10-ой международной конференции "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана" (г. Нижний Новгород, 2010).

Личный вклад соискателя. Экспериментальные исследования в лаборатории инженерии ферментов (Центр «Биоинженерия» РАН) й в лаборатории биохимии фитоиммунитета (Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН), а также обобщение результатов по теме диссертационной работы выполнены автором самостоятельно.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 106 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц и 24 рисунков, библиографию из 105 наименований, из них 68 на иностранном языке.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Львова, Анна Александровна

-875. ВЫВОДЫ

1. Изучен процесс'7 гидролиза высокомолекулярного хитозана ферментным препаратом Фитопаин, и подобраны условия для получения низкомолекулярного хитозана с заданной ММ 5-50 кДа.

2. Разработана, опробована и оптимизирована технологическая схема процесса ферментативного гидролиза высокомолекулярного хитозана с помощью ферментного препарата Фитопаин.

3. Из полученных образцов низкомолекулярного хитозана наибольшую защитную (элиситорную) и репарационную активность проявил образец хитозана с ММ 5 кДа и СД 85%, максимально индуцирующий фитофтороустойчивость и стимулирующий процесс залечивания механических поранений клубней картофеля в концентрации 100 мкг/мл. Установлено, что элиситорная и репарационная активность хитозана имеет как локальный, так и системный характер.

5. Проведенный скрининг производных хитозана позволил установить, что наибольшим защитный эффект проявлял >Т-2-гидрокси-3-метоксибензил-1Ч-пиридоксхитозан, обладая: элиситорной активностью, защищая картофель от возбудителя фитофтороза; высокими репарационными свойствами, активно залечивая участки поранений клубней картофеля, предохраняя их от проникновения инфекции; защитной и репарационной активностью в более низких концентрациях

0,1-1 мкг/мл) по сравнению с хитозаном.

6. Оптимизированы условия для получения Н-2-гидрокси-3-метоксибензил-!М-пиридоксхитозана и разработана технологическая схема процесса.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Львова, Анна Александровна, Щелково

1. Allan G.G., Peyron M. Molecular weight manipulation of chitosan II: prediction and control of extent of depolymerization by nitrous acid // Carbohydrate research. -1995.-V.277.-N.2.- P.273-282.

2. Bolwell G.P. Role of active oxygen species and NO in plant defence responses Cur. Opin. Plant Biol. -1999. -V. 2. 4. -P. 287-294.

3. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976.-V. 72.-P. 248-254.

4. Cauchie H-M. Chitin production by arthropods in the hydrosphere // Hydrobiologia. 2002. -V. 470. - N. 1/3.- P. 63-95.

5. Chen Z., Klessig D.F. Identification of a soluble salicylic acid-binding protein that may function in signal transduction in the plant disease-resistance response Proc.// Nath. Acad. Sci.USA. -1991. -V. 88. -P. 8179-8183

6. Cruickshank I.A., Perrin D.R. The isolation and partial characterization of Monilicolin A, a polypeptid with phaseollin-inducing activity from Monilinia fructicola// Life Sci. -1968.-V. 7. -P. 449-458.

7. Dempsey D.M.A., Shah J., Klessig D.F. Salicylic acid and disease resistance in plants // Critical Review of Plant Science. -1999. -V.18. P.547-575

8. Dong X. Finding the missing pieces in the puzzle of plant disease resistance // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. -V. 92. - P. 7137-7139.

9. Dumer J., Wendehemme D., Klessig D.F. Defense gene induction in tobacco by nitric oxide, cyclic GMP and cyclic ADP-ribose // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. -V. 95.-P. 10328-10333.

10. Durrant W.E., Dong X. Systemic acquired resistance // Annu. Rev. Phytopathol. -2004. -V. 42. -P. 185-209.

11. Feussner I., Wasternack C., The Lipoxygenase way// Annu. Rev. Plant Biol. -2002. -V. 53. -P.275-280

12. Gaffney T., Friedrich L., Vernooij E., Negrotto D., Nye G., Uknes S., Ward E., Kessmann H., and Ryals J. Requirementof salicylic acid for the induction of systemic acquired resistance // Science, -1993. -261. -P. 754-756.

13. Gallie D.R. Posttranscriptional regulation of gene expression in plants // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. -1993. -44. -P. 77-105.

14. Grazebrook J. Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens//Annu. Rev. Phytopathol. 2005. V. 43. P. 205-227

15. Green T.R., Ryan C.A. Wound-Induced Proteinase Inhibitor in Plant Leaves -Possible Defense Mechanism against Insects// Science. -1972. -V. 175. -P. 776-777

16. Haberlandt G. Uber zellteilungshomone und ihre Bezichungen zur wundheilung//Biol. Zentrelblstt. -1922. -V. 42. -P. 145

17. Hadwiger, L.A., Kendra, D.F., Fristensky, B.W., Wagoner, W. Chitosan both activates genes in plants and inhibits RNA synthesis in fungi// Chitin in Nature and Technology. Plenum Press, NewYork. -1986. -P. 209-214.

18. Halitschke R., Baldwin I.T. Jasmonates and Related Compounds in Plant-Insect Interactions//.!. Plant Growth Regul. -2004. -V. 23. -P. 238-245

19. Hammond-Kosack K.E., Jones J.D. Inducible plant defense mechanisms and resistance gene function//Plant Cell. -1996. -V.8.-P. 1773-1791

20. Heath M.C. Hypersensitive response-related death // Plant Mol. Biol. -2000. -V.44. -№3. -P.321-334-9024. Howe GA. Jasmonates as signals in the wound response// Plant J. -2005. -V. 23. -P. 223-237

21. Hung T.H., Giridhaz R., Chiou S.H., Wen-Teng W. Binary immobilization of Candida ragosa lipase on chitosan // J. Mol. Cat. B: Enzymatic. -2003. -V. 26. № 1. -P. 69-78.

22. Il'ina A.V., Tatarinova N. Yu., Varlamov V.P. The preparation of low-molecular-weight chitosan using chitinolytic complex from Streptomyces kursanovii // Process Biochemistry. 1999. - Vol.34. - №9. -P.875-878

23. Kittur F.S., Kumar A.B.V., Tharanathan R.N. Low molecular weight chitosans -preparation by depolymerization with Aspergillus niger pectinase, and characterization //CarbohydrateResearch.-2003.-V.338.-№ 12.-P.1283 -1290.

24. Klessig D.F., Durner J., Noad R. et al. Nitric oxide and salicylic acid signaling in plant defense //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. -2000. -V. 97. -P. 8849-8855;

25. Kumar A.B.V. Low moleculer weight chitosans: preparation with the aid of papain and characterization / A.B.V. Kumar, M.C Varadaraj, R.G. Lalitha //Biochimia et Biophysica Acta. 2004. V.1670. №2. P137-146

26. Kumar A.B.V., Varadaraj M.C., Lalitha R.G., Tharanathan R.N. Low molecular weight chitosans: preparation with the aid of papain and characterization // Biochim. Biophys. Acta. -2004. -V. 1670.-P. 137-146.

27. Kumar A.B.V., Gowda L.R., Tharanathan R.N. Non-specific depolymerization of chitosan by pronase and characterization of the resultant products //Eur. J. Biochem. -2004.-V.271.-N.4.-P.713-723

28. Kunkel B.N., Brooks D.M. Cross-talk between signaling pathways in pathogen defense// Curr.Opin.Plant Biol. -2002. -V.5. -P.325-331

29. Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. — 1970. — Vol. 227. — P. 680—685.

30. Levine A., Tenhaken R., Dixon R., Lamb C. H202 from the oxidative burst orchestrates the plant hypersensitive disease resistance response// Cell. 1994. -Y.79. -№5. -P.573-593

31. Li C., Schilmiller A.L., Liu G.I., Jayanty S., Sagaman C., Vrebalov J., Glovannoni J.J., Yagi K., Korabyashi Y. Role of p-Oxidation in Jasmonate Biosynthesis and Systemic Wound Signaling in Tomato // Plant Cell. 2005. -V. 17. -P. 971-986

32. Lorenzo O., Solano R. Molecular Players Regulating the Jasmonate Signaling Network//Curr.Opin. Plant Biol. -2005 -V.8. -P.532-540

33. Majeti, N.V., Kumar, R. A review of chitin and chitosan applications //Reactive and Functional Polymers. -London. 2000. - № 46. - P. 1 - 27

34. Malamy J., Carr J.P., Klessig D.F., Raskin I. Salicylic acid: a likely endogenous signal in the resistance response of tobacco to viral infection Science // Science. -1990. -V. 250. -№ 4983. -P.1002-1004

35. McDowell GJ.f, DungU.L. Signal transduction in the plant immune response// Trends Bichem. Sci. 2000. V. 25. P. 79-82.

36. Mehdy M.C. Active oxygen species in plant defense against pathogens // Plant Physiol. 1994. - V.105. - № 2. - P.467-472

37. Muzzarelli, R. A. A. The discovery of chitin, a > 570 Megayear old polymer / R. A. A. Muzzarelli // Chitosan in Pharmacy and Chemistry / Ed. by R. A. A. Muzzarelli and C Muzzarelli. Grottammare, Italy: Atec Edizioni. -2002. -P. 1-8.

38. Muzzarelli R.A.A. Chitin./ R. A. A. Muzzarelli. Oxford: Pergamon Press, 1977. -309 p.

39. Niebel, A.; Heungens, K.; Barthels, N.; Inze, D.; Van Montagu, ' M.; Gheysen, G. Characterization of a pathogen-induced potato catalase and its expression upon nematode and bacterial infection // The Amer. Phytopathol. Soc. -2002. -V. 8. -P. 371378.

40. Nimchuk Z, Eulgem T, Holt B.F. Ill, Dangl J.L. Recognition and response in the plant immune system// Annu. Rev. Genet. -2003. -V.37. P.579-609.

41. Pearce G., Strydom D., Johnson S., Ryan C. A. A Polypeptide from Tomato Leaves Induces Wound-Inducible Proteinase Inhibitor Proteins// Science. -1991. -V. 1991. P. 995-998

42. Raskin I. Role of salicylic acid in plants//Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. -1992. -P.439-463

43. Rhoades J., Roller S. Antimicrobial actions of degraded and native chitosan against spoilage organisms in laboratory media and foods // Applied and environmental microbiology.-2000.- V.66.- N.l.-P. 80-86.

44. Roos A.F. Systemic acquired resistance induced by localized virus infection in plants // Virology. -1961. -V. 14. -№3. -P. 340-358

45. Rozahl S., Feussner I. Oxylipins // Plant Lipids: Biology, Utilization and Manipulation / Ed. Murphy D.J. Oxford: Blackwell, -2004. -V. 53. -P.329-454

46. Ryals J.A., Neuenschwander U.H., Willits M.G. Systemic acquired resistance// Plant Cell. -1996. -V.8. -P.1809-1819

47. Ryan C.A. The Search for the proteinase-Inhibitor Inducing Factor. PIIF// Plant. Mol. Biol. -1992. -V.19 -P.123-133

48. Schilmiller A.L., Howe G.A. Systemic signaling in the wound response // Curr. Opin. Plant Biol. -2005. -V.8. -P.369-377

49. Shah J., Klessig D.F. // Biochemistry and Molecular Biology of Plant Hormone / Eds. K. Libbenga, M.Hall., P.G.J.Hooykaas. London Elsevier. -1999. -V.33. -P.513-554

50. Shah, J., Klessig, D.F. Kachroo, P., Yoshioka, K. Resistance to turnip crinkle virus in Arabidopsis requires two host genes and is salicylic acid dependent but NPR1, ethylene and Jasmonate independent// Plant Cell -2000. -V.12. -P.677-690

51. Shirasu K., Nakajima H., Rajasekher V.K., Dixon R.A., Lamb C. // Plant Cell. -1997. -V.9. -N2. -P.261-270

52. Tolaimate A., Desbrie'res J., Rhazi M., Alagui A., Vincendon M., Vottero P. On the influence of deacetylation process on the physicochemical characteristics of chitosan from squid chitin // Polymer.- 2001.-V.41.- N.7.- P. 2463-2469

53. Van Loon L.C. Pathogenesis-related proteins // Plant Mol. Biol. -1985. -V.4. -P. 111-116.

54. Van Loon L.C., Van Strien E.A. The families of pathogenesis-related proteins, their activities, and comparative analysis of PR-1 type proteins// Physiol. Mol/Plant Pathol. -1999. -V.55. -P.85-97

55. Wang W., Bo S., Li S., Qin W. Determination of the Mark-Houwink equation for chitosans with different degree of deacetylation // Int. J. Biol. Macromol. -1991. -V.13. -№5. -P.281-285.

56. Wasternack C., Stenzel I., Hause B., Hause G., Kutter C., Maucher H., Neumerkel J., feussner i., Miersch O. The wound response in tomato Role of jasmonic acid//J. Plant Physiol. -2006. -V.163. -P.297-306

57. Wasternack C., Stenzel I., Hause B., Hause G., Kutter C., Maucher H., Neumerkel J., feussner i., Miersch O. The wound response in tomato Role of jasmonic acid// J. Plant Physiol. -2006. -V. -163. -P.297-306

58. Абдуллин В.Ф., Шиповская А.Б., Фомина В.И., Артеменко С.Е., Овчинникова Г.П., Пчелинцева Е.В. Физико-химические свойства хитозана из разных сырьевых источников // Хим. волокна. -2008. -№1. -С.33-36.

59. Аверьянов A.A. Активные формы кислорода и иммунитет растений // Успехи современной биологии. -1991. -Т.111. -N5. -С.722-737.

60. Васюкова Н.И., Герасимова Н.Г., Озерецковская О.Л. Роль салициловой кислоты в болезнеустойчивости растений // Прикладная биохимия и микробиология. -1999. -Т. 35. -С. 557-563.

61. Васюкова Н.И., Озерецковская О.Л. Индуцированная устойчивость растений и салициловая кислота (обзор) // Прикл. биохимия и микробиология. -2007. -Т. -43. -№ 4. -С.405-411

62. Васюкова П.И., Давыдова М. А., Щербакова Л.А., Озерецковская О. Л., Фитостерины как фактор, предохраняющий возбудитель фитофтороза картофеля от действия фитоалексинов // ДАП. -1977. -Т. 235, -№1. -С.216-219.

63. Гальбрайх Л.С. Хитин и хитозан: строение, свойства, применение Соросовский образовательный журнал. -2001. -Т.7.1. -С.51-56.

64. Гречкин А.Н., Тарчевский И.А, Липоксигеназная сигнальная система// Физиология растений. -1999. -Т. 46. -С. 132-142

65. Дьяков Ю.Г., Озерецковская О.Л., Джавахия В.Г., Багирова С.Ф. Общая и молекулярная фитопатология. -М. Общество фитопатологов, -2002. -301 с.

66. Ильина A.B. Деполимеризация высокомолекулярного хитозана ферментным препаратом Целловеридин Г20х/ A.B. Ильина, Ю. В. Ткачева, В.П. Варламов // Прикладная биохимия и микробиология. 2002. -Т. 38. -№2. -С. 132135

67. Ильина A.B., Варламов В.П., Мелентьев А.И., Актуганов Г.Е. Деполимеризация хитозана хитинолитическим комплексом бактерии рода Bacillus sp. 739 //Прикладная биохимия и микробиология.-2001.-Т. 37.-№2.-С. 160-163

68. Лиу Ю., Пан Ц.Х., Ян Х.Р., Лиу Ю.Ю., Хуан В.Д. Взаимосвязь между Н202 и жасмоновой кислотой в ответной реакции листьев гороха на поранение // Физиология растений. 2008. - Т. 56, № 6. - С. 851-862.

69. Метлицкий Л.В., Озерецковская О.Л. Как растения защищаются от болезней //М. Наука.-1985.-188 с.

70. C.B. Немцев, A.B. Ильина, С.М. Шинкарев, А.И. Албулов, В.П. Варламов Получение низкомолекулярного водорастворимого хитозана// Биотехнология. -2001. -№6. -С.37-42

71. В.Ю. Новиков, В.А. Мухин Деполимеризация хитозана под действием ферментов гепатопакреаса камчатского краба Paralithodes camtschaticus II Прикладная биохимия и микробиология. -2003. -Т. 39. -№5.- С. 530-535

72. Озерецковская О. Л, Чалова Л. И. Индуцирование устойчивости растений к болезням// Молекулярные и генетические механизмы взаимодействия микроорганизмов с растениями, Пущино, -1989. -С.178-184

73. Озерецковская О.Л., Давыдова М.А., Васюкова Н.И., Метлицкий Л.В. Гликоалкалоиды в здоровом и поврежденном клубне картофеля// ДАН СССР. 1971. Т. 196 С. 1470-1473

74. Озерецковская О.Л., Ильинская Л.И., Васюкова Н.И. Механизмы индуцирования элиситорами системной устойчивости растений к болезням// Физиология растений. -1994. -Т. 41. -№. 4. -С.626-633.

75. Озерецковская О.Л., Чаленко Г.И. Сравнительное изучение раневой и естественной перидермы клубня картофеля// Биохимия иммунитета и покоя растений. -1969. -М. ВИНИТИ -С.70-82

76. Панина Я.С, Герасимова Н.Г., Чаленко Г.И., Васюкова Н.И., Озерецковская О.Л. Салициловая кислота и фенилаланинаммиаклиаза в картофеле, инфицированном возбудителем фитофтороза // Физиология растений. -2005. -Т. 52. -№4. -С. 573-577

77. Плохинский Н.А. Алгоритмы биометрии. М.: МГУ. 1980. 150с.

78. Скрябин К.Г. Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение/ К.Г. Скрябин, Г. А. Вихорева, В. П. Варламов. М.: Наука, 2002. -368 с.

79. Тарчевский И.А. Сигнальные системы клеток растений // -М. Наука. -2002. -С.163

80. Тарчевский И.А. Элиситор-индуцируемые сигнальные системы и их взаимодействие// Физиология растений. -2000. -Т. 47. -С. 321-331

81. Чаленко Г.И. Интенсификация раневых реакций в иммунизированных биогенными индукторами клубнях картофеля // Биохимия хранения картофеля, овощей и плодов. -М.: Наука, -1990. -С.45-49

82. Черкасова Е.И., Алексеева М.Ф., Пастухов М.О., Фролов В.Г., Смирнова Л.А., Смирнов В.Ф. Деструкция хитозана ферментным комплексом из Carica papayalI Биотехнология. -2005. -№2. -С.73-81

83. Черкасова Е.И., Душкова З.Г., Фролов В.Г. Исследование хитозанолитической активности папаина // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана: Материалы VIII конференции/ВНИРО. -Москва, 2006. С.315-318

Информация о работе

Львова, Анна Александровна
кандидата технических наук
Щелково, 2010
ВАК 03.01.06

Диссертация

Получение низкомолекулярного хитозана и его производных, обладающих защитными и репарационными свойствами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы