Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение моноклональных антител к возбудителям везикулярной экзантемы и везикулярной болезни свиней

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Получение моноклональных антител к возбудителям везикулярной экзантемы и везикулярной болезни свиней"

I Ь \ л" :.......'

На правах рукописи УДК 619:578.835.1:576.8.097

ФОМЕНКО Вадим Юрьевич

ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ВОЗБУДИТЕЛЯМ ВЕЗИКУЛЯРНОЙ ЭКЗАНТЕМЫ И ВЕЗИКУЛЯРНОЙ БОЛЕЗНИ СВИНЕЙ

03.00.06 "Вирусология"

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических паук-

Владимир - 1998

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты жипошых (ВНИИ'ЗЖ) Министерства сельскою хозяйства и продовольствия Российской Федерации.

Научный руководитель: ГЛОБЕ1 (КО Людмила Алексеевна, кандидат

биологических наук, старший научный сотрудник

Научный консультант: ШАЖКО Жорж Антонович, доктор

ветеринарных наук, профессор

Официальные оппоненты: ПОНОМАРЕВ Алексей Петрович.

доктор биологических наук, старший научный сотрудник (ВППИЗЖ, г. Владимир);

КУРИННОВ Виктор Васильевич,

кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник (ВНИИВВиМ, г. Покров).

Ведущая организация: Московская академия ветеринарной медицины и

биотехнологии им. К.И. Скрябина.

Зашита состоится " 30 " июня 1998 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 120.60.01. при Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных по адресу: 600900. г. Владимир, п. Юрьевец. ВНИИЗЖ.

С' диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института зашиты животных.

Автореферат разослан " 29 " мая 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета - Черняев Ю.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Известно, что из четырех болезней, протекающих с везикулярным синдромом, наибольшую угрозу представляет ящур. Однако, вероятность эпизоотического распространения остальных при современных интенсивных международных контактах сохраняется для любой страны, в том числе и для СНГ (Шажко Ж.А., 1989), поэтому программы научных и диагностических исследований в той или иной степени должны исходить из необходимости одновременной работы с возбудителями ящура, везикулярной болезни свиней (ВБС), везикулярной экзантемы свиней (ВЭС) и везикулярного стоматита, их идентификации и дифференциации друг от друга в случае изоляции от больных животных. Поскольку клинические признаки при перечисленных заболеваниях сходны (Вишняков И.Ф., 1983, Walker J.M., 1984) эти инфекции могут быть дифференцированы только при помощи лабораторных исследований, включающих вирусологические и серологические методы (Berger N. et. al., 1989).

В течение многих лет для диагностики вирусных болезней широко применялись многие методы, основанные на иммунохнмической реакции антиген-антитело. При этом был выяплен ряд недостатков этих методов, часть которых обусловлена не только методическими приемами их постановки, но и специфическими особенностями используемых иммунореагенгов. Особенно важное значение при использовании некоторых методов для диагностики имеют гипериммунные сыворотки, поликлональные антитела в которых не всегда обладают требуемой специфичностью, особенно при классификации и систематике штаммов возбудителей, обладающих плюралитетом В этом плане наиболее перспективным направлением является усовершенствование технологии получения моноклональных антител (МАт).

Уникальность их характеристик в настоящее время широко используется при решении проблем стандартизации диагностических методов, повышения их достоверности, чувствительности и специфичности (McCullough К.С., 1986). Они позволяют выявлять искомые антигены в препаратах, содержащих смесь контамшшрующих агентов разных таксономических групп, концентрация которых может в тысячи раз

превьшкиь концентрацию идентифицируемого возбудителя (Черных A.A. с соавь. 1992). Использование МАт в таких традиционных иммуиохимических реакциях, как РДГ1. РПГА. РИГА. РТГА, реакции лагекс-агглюгинации, ПФА. иммуноблоттипге позволяет значительно улучшить их характеристики и расширить сферу применения (Дельвиг A.A. с соавт., 1987, Yewdell J.W. et. al., 1981).

В области ветеринарной вирусологии наиболее важной и методологически сложной является проблема дифференциальной диагностики вышеназванных болезней с везикулярным синдромом. Для ее решения в последние годы получены моноклональпые антитела к возбудителям ящура различных типов (Глобенко Л.А., 1987, Butchainh G. и Rao B.U., 1989, Meloen R.H. и Barteling S.I., 1983, Robertson В Н. и Morgan D.O., 1984, Simone F. et. al., 1983 и др.) и везикулярному стоматиту (De Bishnu Р. ct. al. 1982, Ye Z. et. al., 1985, Ogden S.R. et. al., 1986 и др.). Благодаря им удалось получить новые данные об антигенной структуре возбудителей, усовершенствовать методы лабораторной диагностики вызываемых ими болезней, проводить более точную идентификацию их эпизоотических штаммов.

В то же время сведений о получении МАт к вирусам ВВС и ВЭС в доступной нам литературе мы не обнаружили. Между тем, исходя из необходимости унификации методов диагностики не только ящура, но и других болезней с везикулярным синдромом, а также более надежной идентификации эпизоотических штаммов их возбудителей, получение моноклональных антител к последним представляет как научный, так и научно-практический интерес.

Цели и задачи исследований. Целью настоящего исследования было получение гибридных клеток, секретирующих моноклональпые антитела к вирусам ВВС и ВЭС, а также изучение возможности их использования при дифференциальной диагностике болезней с везикулярным синдром.

Для достижения поставленной цели были определены следующие

задачи:

- получить высокоочищенные препараты возбудителей ВВС и ВЭС :тя иммунизации лабораторных животных и проведения иммуиохимических реакций;

- отработать технологию получения гибридом, секретирующих МАг к вирусам В'ЭС и ВБС;

оптимизировать методики изготовления специфических иммунореагентов на основе МАт для идентификации типовой принадлежности возбудителей ВЭС и ВБС;

- оценить в сравнительном аспекте полученные иммунореагегггы и традиционные поликлонадьные диагностикумы при дифференциальной диагностике болезней с везикулярным синдромом.

Научная новизна работы. Получены не имеющие аналог ов в стране и за рубежом штаммы гибридных клеток, продуцирующих МАг к вирусу везикулярной болезни свиней типов 0-72 и Т-75 и везикулярной экзантемы свиней типов С-72 и А-48.

Отобраны клоны, секретируюпше МАт к указанным возбудителям со строго определенной типовой специфичностью и выраженными вируснейтрализующими свойствами.

Изучены свойства этих антител в различных иммунохимических реакциях и отобраны клоны, пригодные для идентификации типовой принадлежности возбудителей ВЭС и ВБС.

Научная новизна проведенных исследований подтверждена положительным решением ВНИИГПЭ на выдачу патента РФ (приоритет № 97113822/13 (014570) от 1 1 августа 1997 г.).

Практическая значимость работы. Разработана "Методика получения высокоочишенных и концентрированных препаратов вируса везикулярной экзантемы свиней и вируса везикулярной болезни свиней", утвержденная директором ВНИИЗЖ 26.03.93.

Получена коллекция штаммов гибридом, секретирующих МАт к вирусам ВЭС типов С-72 и А-48 и ВБС типов 0-72 и Т-75. с высокой стабильностью и антителопродуцируюпгей активностью, часть которых депонирована во Всероссийской коллекции клеточных культур Института цитологии РАН, г. Санкт-Петербург (свидетельство о депонировании от 13.05.96 г. № ВСКК (п) 6478).

Отобраны МАт, пригодные для дифференциации ВЭС и ВБС ог ящура и для идентификации типовой принадлежности их возбудителей.

Основные положения, выносимые на чащиту. Экспериментальные исследования по разработке методики получения препаратов вирусов ВБС и ВЭС для иммунизации доноров I ипериммунных сывороток и иммунных спленоцитов и скрининга клонов гибридных клеток, секретирующих МАт.

Результаты изучения биологических свойств МАт к вирусам ВБС и ВЭС в различных иммунохимических реакциях с гомо- и гетерологичными антигенами возбудителей, вызывающих везикулярные заболевания.

Результаты использования препаратов МАт к вирусам ВБС и ВЭС для идентификации их типовой принадлежности и дифференциации от возбудителей других болезней с везикулярным синдромом.

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации были доложены на заседаниях Ученого совета ВНИИЗЖ в 1993-1997 гг., на Всероссийской научно-практической конференции "Вирусные болезни сельскохозяйственных животных" (ВНИИЗЖ, г. Владимир, 1995), международной научной конференции "Общая эпизоотология: иммунологические, экологические и методологические проблемы" (Харьков, 1995), Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию открытия вируса ящура (ВНИИЗЖ, г. Владимир, 1997). Полученные МАт успешно прошли межлабораторные комиссионные испытания, а также ведомственные комиссионные испытания на основании приказа по Департаменту ветеринарии в 1996-1998 гг.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных

работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 183 страницах, иллюстрирована 33 таблицами и 7 рисунками. Список используемой литературы включает 325 источников, из которых 214 иностранных.

СО БСТ В Е Н Н Ы Е 11СС Л ЕДО В А Н11Я МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Атигены. В работе использовали культуральные расплодки производственных штаммов вирусов ВБС типов 0-72 (шт. № 463/72) и Т-75 (шт. № 790/75) и ВЭС типов А-48 (шт. из 2-й американской коллекции) и С-72 (шт. № 585/72) из коллекции ВНИИ'ЗЖ, адаптированные к культуре клеток перевиваемых линий ПСГК-30 и 1В-Г15-2 и инактивированные производными этиленимнна и морфолина. Очистку препаратов вирусов осуществляли, в зависимости от целевого назначения, переосаждением ПЭГ 6000 и центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия-сахарозы, получая очищенные на 96-99% концентраты и фракции 1505 и 1605 антигенов соответственно. Степень чистоты и гомогенность препаратов оценивали под электронным микроскопом и электрофорезом в ПААГе. Содержание вирусного белка определяли на спектрофотометре при длине волны 260 им. Иммунобиологические свойства оценивали по титрам инфскционносги вирусов, активности в РСК и ПФА и по результатам иммунизации лабораторных животных.

При иммунизации мышей и скрининге гибридных клонов использовали только препараты 1605 антигена вируса ВЭС и 1505 антигена вируса ВБС. В опытах по исследованию специфичности МАт использовали как вышеназванные препараты, так и коммерческие серии диагностических антигенов вируса ящура подтипов А22 и Ок ВБС типов 0-72 и Т-75 и ВЭС типов А-48 и С-72. изготовленные производственной базой ВНШГЗЖ гго ТУ 46-20-429-79 и 46-20-566-80. афтозные материалы от свиней, экспериментально зараженных этими вирусами, а также расплодки последних в культурах перевиваемых линий клеток.

Клеточные культуры. Для репродукции вирусов, определения их инфекционной активности, а также контроля полноты инактивации вируссодержащих материалов использов&пи монослойные культуры клеток первично-трипсинизнрованной почки свиней (СП) и перевиваемых линий ВНК-21. Г1СГК-30 и 1В-Я5-2 в сосудах различной емкости.

Миеломные клетки. При получении гибридом использовали миеломные клетки линии РА1, полученной из Института химической и биологической физики АН Эстонии (Таллинн), и линии Х63/А§8.653, полученной из Института вирусных болезней с/х животных (Великобритания).

Животные. Донорами поликлональных сывороток служили нелинейные белые мыши массой 25-30 г и кролики массой 1,5-2,0 кг. Иммунные спленоциты и МАт в виде асцитической жидкости получали от инбредных мышей линии ВАЬЬ/с массой 20-28 г, полученных из питомников "Светлые горы" и "Столбовая" РАМН и Центрального питомника АН РФ и ВОПЦ РФ.

Получение гибридом. Слияние миеломных и селезеночных клеток проводили по методике Л.А. Глобенко с соавт. (1986) с некоторыми нашими модификациями.

Очистка моноклональных антител. МАт выделяли из культурального супернатанта и мышиной асцитической жидкости после обработки ПЭИ и хлороформом методом осаждения насыщенным раствором сульфата аммония по известной методике (авт. св. № 1119697) с последующим диализом против воды и фосфатно-буферного раствора (ФБР)

Определение классов моноклональных антител. Классовую и подклассовую принадлежность МАт определяли в непрямом ИФА, используя набор фирмы "Са1Ыос|1ет".

Методы оценки препаратов поли- и моноклональных антител. Активность и специфичность гипериммунных сывороток определяли с помощью ИФА, РЗПГА, РДП, РН. Конкуренцию МАт определяли в ИФА-аддитивном тесте согласно Friguet В. ег. а1. (1972). Диагностическую ценность препаратов МАт изучали с помощью сэндвич-варианта ИФА, который выполняли согласно "Временному наставлению по идентификации вируса ящура иммуноферменгным методом и дифференциации его от возбудителей других везикулярных болезней", утв. ГУВ ГАПК СССР 1.10.89.

Статистическая обработка результатов. Все опыты проводили не менее, чем в трех повторностях, с последующей обработкой по методу Стьюдента (Каминский Л.С., 1964). При оценке диагностической ценности

ИФА на основе МЛг использовали формулы, изложенные в монографии В.Г? Власова (1986).

В выполнении отдельных зтапов работы принимали участие сотрудники ВНИИЗЖ к. б. н. С.П. Аминева. к. б. н. И.П. Карпова, к. в. н. С.Р. Кременчуг ская, к. б. н. Г.М. Фалина.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Получение моноклональных антител к возбудителям ВБС

Исходя из того, что специфичность МАт зависит от качества антигенных препаратов, использованных для иммунизации доноров иммунных спленоцитов и последующего скрининга позитивных клонов, на первом этапе нашей работы было проведено сравнение методов получения гомогенных высокоочищенных препаратов вируса ВБС однократным осаждением ПЭГ 6000 с очисткой хлороформом и двукратным осаждением ПЭГ 6000 с последующим центрифугированием в градиенте плотности сахарозы и хлористого цезия.

Таблица I

Характеристика препаратов вируса ВБС,

полученных разными методами

Метод исследования Характеристика препаратов вируса

Исходный Очищенный

ПЭГ 6000 градиент СБСТ-сахарозы

Степень концентрации не кони. х 10 х 1000

Общий белок, мкг/мл 300-350 100-150 90-900

Процент очистки 0 50 96.7

Коэфф. специфичности 1.2 1.4 1.6

Активность в РСК 1:1 - 1:2 1:32 - 1:64 1:48 - 1:72

Ипфекц. титр, 1гТЦД5о/мл 6.5 - 7.5 8.0 - 8,4 8.0 - 8,4

Активность мышиных гипериммунпых сывороток в ИФА. 1р н/и 4,5 - 5.4 5,4 - 6.0

РН. ¡022 н/и 8.5- 10.0 9.5- 10.0

РЗПГА н/и 5,3 - 6,3 6.0 - 6,3

РДП н/и 5.0 - 6.0 5.0 - 6,0

Примечания: указаны максимальные и минимальные значения ти гров; н/и - не исследовали

Как свидетельствовали результаты определения коэффициентов специфичности EWEi-w, электронной микроскопии и электрофореза в ПААГ, первый способ позволял получать очищенные на 50% препараты, а второй -150S антигены со степенью очистки до 96,7 %. Анализ гюлипепгидного состава в ПААГ показал наличие в последних только гомогенных белков с молекулярными массами 32000, 30000 и 28000 Д, соответствующих структурным белкам VPi, VP: и VP3 (Hedger R.S., Mann J.A., 1989). Основные свойства полученных препаратов вируса представлены в таблице I, из которой видно, что, независимо от способа очистки, они оказались пригодными для получения гипериммунных сывороток с титром в РДП до 6,0 log2, РЗПГА - до 6,3 log2, ИФА до 6,0 lg, в РН - до 10,0 log2, а также для постановки различных иммунохимических реакций.

В то же время, как свидетельствовали исследования в ИФА, сыворотки, полученные на ПЭГ-концентраты, показали больший уровень взаимодействия с гетерологичными антигенами. Поэтому при изучении влияния условий иммунизации доноров спленоцитов на ее эффективность мы использовали антигены, полученные вторым способом. При этом было испытано две схемы иммунизации. Первая схема включала трехкратное внутримышечное введение антигенов в соотношении 1:1 с полным адъювантом Фрейнда. Интервал между первой и второй иммунизациями составлял 14 дней, между второй и третьей - 7 дней. Спустя 7 дней проводили отбор крови. Объем вводимого антигена составлял в каждом случае 0,13-0,15 мл с 30-40 мкг вирусного белка.

Вторая схема включала двухкратное интраперитонеальное введение антигена, первый раз в соотношении 1:1с ПАФ, а второй раз - без адъюванта. Интервал между иммунизациями составлял 21-25 дней. Обескровливание проводили через 3-4 дня. Объем АГ, вводимого при первой иммунизации, составлял 0,25-0,30 мл, при второй его доводили до 0,3-0,4 мл раствором ФБР. Одноразовая доза АГ составляла при каждой иммунизации 45-60 мкг.

В результате установлено, что титры полученных сывороток в РДП, РЗПГА, РН и ИФА, независимо от схемы иммунизации, были приблизительно одинаковы, однако, сыворотки трехкратно

У

иммунизированных живот пых обладали меньшей специфичностью, что подтвердили их исследования в ИФА с гетерологичными антигенами. Кроме того, при трехкратной схеме наблюдали значительные местные воспалительные и некротические очаги. Дополнительным преимуществом второй схемы являлась ее экономичность и меньшая продолжительность цикла гипериммунизации. При использовании этой схемы впоследствии удавалось получать до 20% позитивных гибридных клонов.

В качестве возможных партнеров для слияния, с учетом конкретных условий работы, мы провели сравнительную оценку миелом линий PAI и X63/Ag8.653 по ростовым свойствам и результатам независимых параллельных слияний с иммунными спленоцитами. Отмечено, что миелома X63/Ag8.653 характеризовалась более стабильным ростом в культуре и более высокой устойчивостью при длительном хранении в жидком азоте. Однако, линия PAI показала более высокую эффективность слияния со спленоцитами и обеспечивала максимальное количество жизнеспособных клонов, сохраняющих способность секретировать МАт в течение 10-15 пассажей, как в виде культуры клеток, так и асцитов (срок наблюдения). Поэтому для последующей работы нами была выбрана линия PAI. Слияние ее клеток с сенсибилизированными спленоцитами проводили согласно "Методике получения и поддержания гибридных клонов, секретирующих МАт к вирусу ящура", разработанной во ВНИЯИ, с нашими модификациями, внесенными в процессе работы.

В результате нами было получено 45 клонов к вирусу ВБС 0-72 и 34 - к вирусу ВБС Т-75. Их исследования показали, что около 67% первых и 50% вторых синтезировали МАт, обладавшие вируснейтрализуюшими свойствами в титрах от 2,0 log2 (супернатанты) до 6,6 log2 (асцитические жидкости). Титр в ИФА препаратов МАт составлял от 1,5 до 6,5 lg. Тог факт, что не все активные в ИФА препараты МАт обладали вируснейтрализующей способностью, позволяет предполагать наличие на поверхности вируса ВБС как нейтрализующихся, так и ненейтрализующихся эпитопов.

С целью дальнейшего изучения МАт наиболее перспективных клонов нарабатывали в необходимых количествах в виде первичных препаратов, которые представляли собой культуральные и асцитические жидкости.

Для получения препаратов, свободных от сывороточных белков ростовой среды, затрудняющих очистку секретируемых МАг, гибридомные клетки после формирования монослоя в течение суток инкубировали в поддерживающей среде ДМЕМ без сыворотки. Затем культуральную жидкость сливали, центрифугировали, замораживали и использовали по мере необходимости в качестве исходного препарата. Активность таких препаратов антител в ИФА составляла от 1:100 до 1:1000.

Более концентрированные препараты МАт получали из аснитической жидкости, для чего взрослым мышам ВАЬЬ/с, сенсибилизированным ангарским маслом, внутрибрюшинно вводили 5-10 млн гибридомных клеток соответствующего клона в 0,5 мл отмывочной среды. Асцитическую жидкость освобождали от гибридомных клеток центрифугированием, очищали ПЭП и хлороформом и использовали как исходный препарат моноклопальных антител. Концентрация МАт в аспитических жидкостях в 10-1000 раз превышала таковую в супернатантах.

Дальнейшее концентрирование и очистку препаратов проводили двукратным (в случае суперпатантов), либо трехкратным (в случае асцитов) осаждением сульфатом аммония. Как свидетельствовали проведенные опыты, очистка II концентрирование позволяли повысить титр препаратов, полученных в виде суперпатантов, на 1,5 - 1,8 1§, а аспитических препаратов -на 2,5 - 3,0 Кроме того, это сопровождалось снижением интенсивности песнецифических взаимодействий аспитических препаратов МАт с антигенами гетерологичных типов до 0,3-0,5 что было сопоставимо с уровнем взаимодействия нейтрального миеломпого асцита.

Получение мопокдоиальиых антител к ао юудителнм ВЭС

При сравнении методов очистки антигенов вируса ВЭС было установлено, что как однократное осаждение ПЭГ 6000 с последующей обработкой хлороформом, так и двукратное осаждение ПЭГ 6000 с последующим центрифугированием в градиенте хлористого цезия-сахарозы, обеспечивают выход практически чистого гомогенного материала с коэффициентами специфичности около 1,6 и седиментации - 1605. Активность

полученных препаратов в РОК и инфекционные гитры в обоих случаях зависели от кратности концентрирования.

Независимо от способа получения, препараты вируса оказались пригодны для получения гипериммунных сывороток с высокой активностью в различных иммунохимических реакциях. Однако, второй способ обеспечивал более высокую степень очистки, что подтвердили исследования полученных на его основе гипериммуных сывороток, обладавших меньшим уровнем взаимодействия с гетерологичными антигенами. Поэтому при отработке оптимального способа иммунизации мышей ВАЬЬ/с использовали СвО-антигены. При этом изучали схемы, аналогичные таковым при исследованиях с вирусом ВВС.

Как показали результаты исследований, сыворотки, полученные при обеих схемах, обладали практически одинаковой активностью в РДП, РЗПГА, РН и ИФА. Однако, как и в опытах с ВВБС, сыворотки после двукратной иммунизации проявляли более низкий уровень взаимодействия в реакциях с гетерологичными антигенами. Кроме этого, такая схема требовала меньших временных затрат и позволяла более экономно расходовать антигенные препараты, поэтому она была выбрана нами для дальнейшей работы.

На основании исследований, описанных в предыдущем разделе, в качестве партнера для слияния с иммунными спленоцитами нами была выбрана линия миеломных клеток РА1. Процедуру слияния проводили, как указано выше.

В результате проведенной работы было получено 45 клонов к вирусу ВЭС А-48 и 40 - к ВЭС С-72. Первичные культуральные и асиитическпе препараты секретируемых ими МАт обладали титрами в ИФА от 1,5 до 6,5 1«. Из них вируснейтрализующими свойствами обладали около 59% МАт к вирусу ВЭС типа С-72 и 56% МАт к вирусу типа А-48. Это, как и в случае с вирусом ВВС, свидетельствовало о наличии у вируса ВЭС как нейтрализующихся, так и ненейтрализующихся эпитопов.

С целью дальнейшего изучения полученные МАт нарабатывали в необходимых количествах в виде препаратов, представляющих собой культуральные и асцитические жидкости, как было описано в предыдущем разделе. По данным ИФА, титр антител в культуральных препаратах достигал

1.5-2.8 а в асшггических жидкостях - 3.0-6,5 Их освобождение ог неспецифических белковых фракций и дальнейшее концентрирование полученных препаратов проводили аналогично МАт к вирусу ВБС. Благодаря этому удавалось повысить активность препаратов МАт виде супернатантов на 1,5 - 2,0 а асцитических препаратов - на 2,0 - 3,0 ^ и значительно уменьшить неспецифическое связывание с гетерологичными антигенами.

Изучение свойств моноклональных антител

Так как основной целыо получения МАт была возможность использования их для дифференциации возбудителей, вызывающих заболевания со сходными клиническими признаками (ВЭС, ВБС, ящур), то необходимо было найти такие условия постановки ИФА, в которых одинаково хорошо выявлялись бы указанные возбудители, и при которых МАт сохраняли бы свою активность и специфичность.

Нами были исследованы три варианта постановки ИФА, используемые для выявления антител, в том числе твердофазный непрямой, твердофазный непрямой сэндвич и жидкофазный непрямой блокирующий сэндвич. Для исследований мы использовали высокоочищенные и концентрированные СзС1-препараты антигенов ВВБС и ВВЭС. МАт были представлены осветленными центрифугированием бессывороточными препаратами супернатантов.

Как показали результаты исследований, все разновидности ИФА обеспечивали эффективное выявление как МАт, так и ПАт, содержащихся в иммунной сыворотке. Однако, твердофазные варианты, в отличие от жидкофазного, допускали возможность работы с избытком антигена. Это позволяло выявлять антитела в гораздо больших разведениях, т. е. повышать чувствительность исследований. К тому же жидкофазный вариант был менее оперативен и включал использование дополнительных компонентов. Поэтому при скрининге МАт нами были выбраны твердофазные варианты. Последующее их сравнение в опытах с ВВБС показало, что непрямой вариант менее чувствителен по сравнению с непрямым сэндвич-вариантом. Использование при постановке второго варианта морской свинки в

качестве улавливающих вирус антител давало более воспроизводимые

удовлетворительные резульппы по сравнению с таковыми кролика и позволяло повысшь чувствительность ИФА при выявлении как МАк :ак и ПАт. В отличие от ВВБС, непрямой сэндвич-вариант ИФА в опытах с ВВ'ЗС продемонстрировал меньшую чувствительность выявления антител по сравнению с непрямым вариантом. В то же время, при выявлении антигенов, независимо от их характеристики, этот вариант значительно превосходил непрямой. Кроме того, он привлек наше внимание как более универсальный, поскольку оказался пригодным для выявления антигенов не только ВБС и ВЭС, но и яшура как в афгозпых, так и в культуральных материалах.

МАт 16АЗ к ВВБС 0-72

цельн. 4 16 64 256 1024 цельн. 4 16 64 256 1024

МАт 14А2 к ВВЭС А-43

непрямой вариант непрямой сэндвич-вариант

Рис. I. Взаимодействие МАт с культуральными и СБСЬантигенами в непрямом и непрямом сэндвич-вариантах ИФА.

Примечания: по вертикальной оси указаны значения оптической плотости. по горизонтальной - разведения антител.

С цслыо оптимизации условии постановки данного варианта ИФА при выявлении МАт нами были проведены опыты с неосветленными

куль i у ральными и высокоочищенпыми антигенами вирусов ВБС и ВОС. Для сравнения их исследовали и в непрямом варианте ИФА. Результаты исследований, представленные в виде графиков на рисунке 1, свидетельствуют, что для скрининга положительных клонов более надежным следовало признать непрямой твердофазный вариант ИФА с использованием CsCI-антигенов.

В то же время, для выявления с помощью МАт вирусов, содержащихся в культуральиых суспензиях, более пригодным оказался непрямой сэндвич-вариант, при котором эффективность их взаимодействия с неосветленными и высокоочишенными антигенами оказалась практически одинаковой. Кроме loio, использование улавливающих антител позволяло значительно повысить чувствительность выявления вируса, поскольку, судя по минимально выявляемой концентрации 150S и I60S антигенов, она достигала 1-10 нг/лунку. Поэтому в дальнейших экспериментах по изучению свойств МАт мы стали применять непрямой сэндвич-вариант ИФА с использованием для сенсибилизации планшетов типоспецифических иммуноглобулинов морской свинки.

Другие параметры постановки ИФА в наших условиях не оказывали существенного влияния па чувствительность указанных вариантов при условии строгой подтитровки рабочих разведений участвующих в реакции иммунореагентов, за исключением качества твердофазного сорбента. Как показали наши опыты, последнее может зависеть от состава буферных растворов, использованных при сенсибилизации полистнроловых планшетов.

Графики, представленные на рис. 2, показывают зависимость оптической плотности при взаимодействии МАт с гомологичными антигенными иммуносорбентами, приготовленными на разных буферных растворах. Они свидетельствуют, что в системе ВВБС состав раствора не оказывал заметного влияния на активность МАт. В то же время взаимодействие последних с иммуносорбентами на основе ВВЭС. разбавленного ФБР, характеризовалось несколько более высокой интенсивностью, а также более продолжительным горизонтальным участком кривой, соответствующей плато насыщения в реакции антиген-антитело. Исходя из эгого, в дальнейшей работе для разведения антигенов мы использовали фосфатный буферный раствор.

МАт С104 и Аг ВВЭС С-72 МАт 14А2 и Аг ВВЭС А-48

МАт 16А4 и Аг ВВБС 0-72 МАт 1 5В1 и Аг ВВБС Т-75

Рис. 2. Активность взаимодействия МАт с гомологичными антигенами вирусов ВЭС и ВВС в зависимости от используемого буферного раст вора. Примечания: см. рис I; буферные растворы: ФБР - фосфатный, ТБР - трис-буферный, КББ - карбонанто-бикарбонатный.

Результаты последующих испытаний МАт, секретируемых полученными клонами в ИФА. (твердофазный непрямой сэндвич-вариант) с гомо- и гетерологичными антигенами возбудителей ВЕС и ВЭС'. позволили разделить их на две большие группы. К первой группе, представленной подавляющим числом МАг, относились антитела, характеризовавшиеся строгой специфичностью по отношению к иммунизирующему антигену. Антитела второй группы могли в разной степени реагировать с аптшенами как гомо- , так и гетерологичных возбудителей.

Как показали дальнейшие исследования. МАт первой 1руппы различались по характеру взаимодействия с гомологичными антигенами. Об этом свидетельствовал!! разные по протяженности горизонтальные участки (плато) кривых (рис. 3), которые у МАт отдельных клонов вообще не регистрировались, а кривые были представлены пологими линиями с разными углами наклона. Причем большая протяженность плато не всегда

соо1 ветствовала копнет рации антител. Эго можно было расценивать, как свидетельство их неодинаковой аффинности.

МАт к ВВБС 0-72

МАт к ВВБС Т-75

МАткВВЭС С-72

МАт к В8ЭС А-43

150 100

цельн. 4 16 64 256 1024 цепьн, 4 16 64 256 1024

Рис. 3. Взаимодействие МАт к ВВБС и ВВЭС с антигенами гомологичного типа. Примечания: на вертикальной оси отложены значения оптической плотности, на горизонтальной - разведения антител.

о

Исследования МАт второй группы выявили различия в их способности взаимодействовать в ИФА с гетерологичными антигенами, проявлявшейся в том. что некоторые МАг реагировали с антигеном только одного г етерологичного возбудителя, другие же - с двумя или со всеми с разными уровнями активности. Характерно, что в РН ни одно из вируснейтрализуюших МАт не обладало способностью нейтрализовать гетерологичные вирусы.

Для выяснения причин выявленных различий в специфичности МАт разных клонов было проведено определение их классовой и подклассовой принадлежности.

Как видно из таблицы 2, клеточные культуры всех исследуемых линий гибридом секретировали иммуноглобулины классов и 1§М, и лишь один клон - класса 1еА. Наибольшим разнообразием изотипов отличались МАт к

вирусу ВБС 0-72, наименьшим - к ВВЭС А-48. Максимальное количество клопов секретировало, независимо от типа иммунизирующего антигена, антитела подкласса МАт, относящиеся к подклассу ^ОЗ, имели место только в

опытах с ВВБС. Изотип ^С2а чаще встречался среди антител, полученных на ВВБС, а ^С2в - среди МАт к ВВЭС. При анализе строю специфичных и перекрестно-реагирующих МАт в ИФА и РН мы не выявили их связи с принадлежностью к определенному классу или подклассу.

Таблица 2

Процентное содержание различных изотипов МАт к возбудителям ВБС и ВЭС

Иммунизирующий антиген Кол-во клонов Распределение МАт по изотипам, %

IgGl IgG2a IgG2b IgG3 IgM IgA

ВВБС 0-72 36 50,0 22,2 13,9 2,8 8,3 2.8

ВВБС 1-15 28 32,1 28,6 14,3 7,1 17,9 0

общее для ВВБС 64 41,05 25,4 14,1 4,95 13,1 1,4

ВВЭС С-72 28 60,7 10,7 21.4 0 7,2 0

ВВЭС А-48 36 86,1 0 2,8 0 И,) 0

общее для ВВЭС 64 73,4 5,35 12,1 0 9,15 0

Как известно из литературных данных, МАт широко применяются для эпитопного картирования возбудителей вирусных заболеваний (Barteling S.J., Boerke J. et. al.. 1986; Lefrancois L. и Lyles D.S., 1982. и др.). Нами была проведена работа по определению эпитопной направленности 6 ненейтрализуюших МАт подкласса IgGl, полученных к вирусу ВЭС А-48, со 160S антигеном этого возбудителя. Результаты показали, что исследованные МАт можно разбить на три группы. В первую и вторую входило по одному антителу, которые не конкурировали между собой, и, следовательно, были направлены к двум разным эпитопам. К третьей группе относились все остальные МАт, которые конкурировали только между собой и не конкурировали с двумя первыми МАт. Следовательно, они могли быть направлены к какому-либо третьему эпитопу.

Определение диагностической ценности препаратов МАт

Дальнейшая оценка специфичности и диагностической ценности полученных МАт с была проведена в опытах с 75 модельными антигенами, полученными в институте при проведении НИР или поступившими для диагностики болезней с везикулярным синдромом, а также культуральными расплодками выделенных из них агентов и искусственно составленными смесями, содержащими возбудителей разных таксономических групп. Для их идентификации использовали МАт. предварительно охарактеризованные в различных иммунохимических реакциях и обладавшие высокой активностью и специфичностью. Их активность с эталонными образцами гомологичных антигенов составляла в ИФА от 1 : 500 до 1 : 100000, а РМН от 1 : 16 до I : 256.

На первом этапе проводили идентификацию антигенов, содержащихся в исследуемых материалах, для чего последние исследовали в твердофазном сэндвич-варианте ИФА в цельном виде или разведении 1:2.

Результаты, полученные при использовании строгоспецифичных МАт разных клонов показали, что все исследованные испытуемые материалы были идентифицированы точно и не наблюдалось ни одного случая ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Заслуживает внимания то. что реакция характеризовалась полным отсутствием фоновых и неспецифических взаимодействий, несмотря на то, что пробы были представлены неочищенными материалами, а в качестве улавливающих служили поликлональные антитела. Благодаря этому в этих опытах удалось продемонстрировать возможность идентификации возбудителей разных таксономических групп при одновременном их наличии в исследуемой пробе.

На втором этапе провели титрование идентифицированных антигенов на наличие вируса и активность в РСК и ИФА в гомологичных системах, сформированных моно- и поликлональными антителами. Результаты этих опытов иллюстрируют данные, суммированные в таблице 3.

Как видно их данных этой таблицы, по чувствительности ИФА при выявлении вирусного материала превосходил на 1-1,5 порядка РСК. Это очень важно с диагностической точки зрения, поскольку полевые пробы, полученные oí больных свиней, как правило, имеют ограниченную массу, в значительном

числе случаев обладают очень низкими титрами в РСК и часто дают при исследовании сомнительные результаты, особенно при смешанных инфекциях. Анализ данных приведенных выше исследований с помощью критериев, описанных Власовым В.В. (1988), показал, что прогностичность истинно-положительных или истинно-отрицательных результатов ИФА при использовании МАт составляла 100 %, а ложно-положительных или ложно-отрицательных - 0 %.

Таблица 3

Результаты определения активности материалов, содержащих антигены

возбудителей везикулярш.гх болезней в РСК и ИФА с МА г

Антиген Возбудитель Кол-во Инф.титр Активность* в

проб 1е ТЦДзо/мл РСК ИФА

ВЭС С-72 5 7,0 2 32

А-48 3 5,4 2 32

ВБС 0-72 7 2.0 2 24

Т-75 2 6,0 1 16

Ящур т. О 2 4.0 2 24

афтозный т. А 2 4,0 2 24

Ящур т. А + 3 3,0 2 24

ВБС 0-72 1.0 2 32

ВБС 0-72+ 3 1,5 2 24

ВЭС А-48 4,8 2 24

ВБС 0-72+ 3 1,4 2 24

ВЭС С-72 6,4 2 24

ВЭС С-72+ 3 6,5 1 32

ВЭС А-48 5,0 2 24

ВЭС С-72 5 5,0 1 24

А-48 5 5,4 1 32

культу- ВБС 0-72 5 6.0 1 16

ральный Т-75 5 4,8 н/а 8

Ящур т. О 2 3.5 н/а 16

т. А 2 6,4 1 32

экспертиза Ящур т. О + 1 2,0 1 16

№ 1671 ВЭС С-72 1,4 2 32

экспертиза Ящур т. А + 1 н/а 1 24

№ 1019 ВЭС А-48 н/а н/а 32

Отрица- Культ. ПСГК 5 н/а н/а н/а

тельные клеток ВНК 5 н/а н/а н/а

пробы Эпи- языка 3 н/а н/а н/а

телий кожи 2 н/а н/а н/а

Примечания: " * " - активность показана числом, обратным предельному титру антигенног о материала в реакциях; "н/а" - антиген не выявлен.

На последнем этапе мы исследовали возможность повышения чувствительности выявления антигенов при использовании в ИФА смесей, составленных из препаратов МАт двух разных клонов. При этом использовали два типа смесей. Первый тип представлял собой объединение препаратов МАт. полученных к одному гомологичному возбудителю. Установлено, что в большинстве случаев такие смеси выявляли антиген в более низкой концентрации, позволяя повысить чувствительность ИФА на 20 - 50%.

Смеси второго типа представляли собой объединение препаратов МАт к антигенам разной типовой специфичности. Такие смеси позволяли идентифицировать возбудителей ВБС, ВЭС и ящура в пределах таксономических групп без определения типовой принадлежности. Благодаря этому значительно упрощалась схема лабораторной диагностики вызываемых ими болезней и сокращался расход необходимых иммунореагентов.

Таким образом, в результате проведенной проверки было установлено, что полученные моноклональные антитела являются высокоспецифичными препаратами, пригодными для выявления и идентификации типовой принадлежности вирусов ВБС и ВЭС и дифференциации их от вируса ящура и совершенствования схемы лабораторной диагностики вызываемых ими болезней.

ВЫВОДЫ

1. Разработана унифицированная методика получения высокоочишенных и концентрированных препаратов вирусов ВБС и ВЭС, пригодных для иммунизации доноров гипериммунных сывороток и иммунных спленоцитов, скрининга клонов гибридных клеток, секретирующих МАт, и изучения их свойств в различных иммунохимических реакциях.

2. Оптимизирована схема иммунизации доноров иммунных спленоцитов, включающая двукратное интраперитонеальное введение 45-60 мкг очищенных концентрированных антигенов вирусов ВБС и ВЭС. позволяющая получать высокоспецифичные гипериммунные сыворотки и

сплемоцнты, пригодные для получения гибридных клеток, до 20"о которых способны секрегировать специфичные МАг.

3. Отобрана линия миеломных клеток РА 1. обладающая высокой эффективностью слияния с иммунными спленоцитами и обеспечивающая получение максимального количества жизнеспособных клонов, продуцирующих МАт в течение 10-15 пассажей как in vivo, так и in vitro (срок наблюдения).

4. Определены оптимальные условия получения МАт, их очистки и концентрирования. Изучены основные биологические характеристики антител разных клонов в ПФА и РН и показано, что они могут различаться но уровням активности и специфичности в реакциях с гомо- и гетерологичными по типовой принадлежности антигенами.

5. Составлены коллекции штаммов гибридных клеток, секретируюших моноклоналытые антитела к вирусам ВБС и ВЭС, с титрами их препаратов в ИФА от 2 до 6,5 lg, в РН - от 2 до 7,2 log2. Клоп гибридных клеток, синтезирующий МАт к вирусу ВБС типа Т-75, значительно отличающемуся от всех известных отечественных и зарубежных штаммов вируса ВБС, депонирован во Всероссийской коллекции клеточных культур Института цитологии РАН и защищен патентом РФ (приоритет ВНИИГПЭ № 97113822/13 (014570) от 1 I августа 1997 г.).

6. Определена классовая и подклассовая принадлежность 54 МАт к вирусу ВБС и 54 МАт к вирусу ВЭС с оценкой общего распределения гибридомных клонов по изогипу продуцируемых антител и их специфичности.

7. На модели возбудителя ВЭС типа А-48 показана возможность применения полученных МАт для дифференциации эпитопов, расположенных на поверхности вирусных частиц.

8. Оптимизирован метод постановки непрямого твердофазного сэндвич-варианта ИФА. пригодный для скрининга МАт к вирусам ВБС и ВЭС, относящихся к разным семействам. Экспериментально обосновано его применение при лабораторной диагностике болезней, протекающих с везикулярным синдром, в том числе и при смешанных инфекциях.

9. Подтверждена возможность применения полученных моноклоналытых антител к вирусам ВБС и ВЭС для выявления последних в

лабораторных и полевых экспертизных материалах, идентификации их шповой принадлежности и дифференциации от вируса ящура, в том числе в слабоактивных в РСК пробах.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Разработанная на основании проведенных исследований "Методика получения высокоочишенных и концентрированных препаратов вируса везикулярной экзантемы свиней и вируса везикулярной болезни свиней", утвержденная директором ВНИИЗЖ 26.03.93, может быть использована в НИР при изучении биологических и физико-химических свойств возбудителей ВВС и ВЭС.

2. Созданная коллекция клопов гибридомных клеток, секретирующих МАт к возбудителям ВВС и ВЭС, может быть использована при организации серийного производства МАт заданной специфичности для совершенствования лабораторных методов иммунодиагностики везикулярных болезней.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННБ1Х ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Глобенко Л.А., Фоменко В.Ю., Шажко Ж.А., Дудников С.А., Жбанова Т.В. Получение гибридом и моноклональных антител к вирусу везикулярной болезни свиней // Пробл. инфекц. патол. с/х. животных: Тез. докл. конф., посвящ. 100-летию открытия вируса ящура. 27-31 окт. 1997. -Владимир. - 1997. - С. 115-116.

2. Фоменко В.Ю. Очистка и концентрирование вирусов везикулярной экзантемы свиней и везикулярной болезни свиней для гибридомной технологии // Вирусные болезни с/х. животных: Тез. докл. всеросс. научи.-практич. конф. 17-21 апр. 1995. - Владимир. - 1995. - С. 147.

3. Фоменко В.Ю. Получение гибридом-продуцентов моноклональных антител к вирусам везикулярной болезни свиней и везикулярной экзантемы