Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение инъекционных химер птиц

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение инъекционных химер птиц"

Г Б ОА

УКРАИНСКАЯ АКАДЕМИЯ АГРАРНЫХ НАУК ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА УААН

На правах рукописи

ТАГИР08 Махсуд Тагирович

УДК: 636.52/.58.575.222.75. '

ПОЛУЧЕНИЕ ИНЪЕКДИОННЫХ ХИМЕР ПТИЦ

ОЗ.00.23.- биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Харьков-1994

Работа выполнена в отделе генетики и селекции птиц Института птицеводства Украинской академии аграрных наук.

Научный руководитель: САХАЦКИЙ Николай Иванович, член кор. УААН, доктор биологических наук, профессор.

Официальные оппоненты: КЛИМЕНКО Вячаслав Викторович, доктор биологических наук.

ГОРДИЕНКО Ника Александровна, кандидат биологических наук. »

Ведущая организация: Институт агроэкологии и биотехнологии УА

Защита состоится " п'0<-И /__1994 года в /¿Лгсоъ на з,

дакии специализированного Совета Д.020.10.0?., при Институте жи! ноьодстьа УААН.

(312120, г. Харьков, п/о Кулиничи).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Г. ,

Автореферат разослан "/У " 1994 года.

Ученый секретарь специализированного Совета

кандидат биологических наук Соловьева Т.Л.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Дальнейший существенный прогресс в генетике и селекции домашних птиц возможен при использовании новейших достижений клеточной и генной инженерии. Особую роль в этой специальной области на современном этапе играют химерные организмы.

Известны две основные области применения химер в птицеводстве: для сохранения генофонда и создания трансгенной птицы. В связи с обеднением генофонда, даже исчезновением некоторых редких локальных пород и популяций, в мире, в том числе на Украине, созданы коллек-ционарии пород и низкотемпературные банки спермы. Однако создание генофондньк коллекций птицы и криобанков с запасом спермы решают данную проблему лишь частично. Эффективная технология низкотемпературной консервации эмбрионов еще не разработана. Между тем известно, что суспензия клеток эмбрионов и взрослых организмов птиц на различных стадиях развития успешно замораживается с высокой эффективностью ( Springer S.Т. et al., 1969, Stephens Е.A. et al., 1931)." С другой стороны, многочисленными исследованиями установлено, что клетки эмбрионов птиц на ранних, стадиях развития хотя и проявляют тотипотентные свойства, не способны к формированию сложных органов в условиях культуры. Поэтому замораживание эмбриональных клеток может найти применение лишь в случае разработки надежных методов реализации заложенной в них генетической информации, что зсзможно пр;; использовании' метода получения инъекционных химер птиц.

.При создании трансгеннсй птиш из существующих методов встраивания экзогенного генетического материала в геном наиболее приемлемым в отношении птицы является использование РНК-вирусов в качестве векторов для введения новых генов. Используя этот метод чужеродная ДНК уже введена в клетки зародышевой линии Солтером v. др.( Solter D.W. et а]., 1986) и Босселменом и др.( Boselman R.A. et al., 1965). Преимущество же метода получения химер для создания трансгенной птицу заключается в потенциальной возможности направления экзогенной ДНК в специфический логсус генома, характеристики его локализации и уровня встраивания гена в геном хозяина in vitro еак

до получения трансгенных цыплят.

Первое сообщение об удачном получении химерных цыплят появилось недавно, в 1990 году. Выводимость оперированных яиц и процент химеризма в этих экспериментах были крайне низкими, на уровне 8-102 ( Petitte J.N. et al., 1990). Причина этого заключается в специфике развития эмбрионов птиц на начальных этапах эмбриогенеза. В целом же, инъекционные химеры птиц получают на более поздних стадиях развития, чем у млекопитающих, что предполагает специфичность химериз-ма тканей и органов. Учитывая это, необходимо было провести исследования по разработке метода реабилитации оперированных яиц, совершенствованию техники получения химер птиц и изучению характера хи-меризма тканей на клеточном уровне.

Цель и задачу исследований. Целью настоящей работы явилось совершенствование метода получения и изучение инъекционных химер птиц. Для достижения данной цели на разрешение были поставлены следующие задачи:

1. Разработать метод реабилитации оперированных куриных яиц.

2.Усовершенствовать технику получения химер.

3. Изучить харатаер химеризма ткачей на клеточном уровне.

Научная новизна. Впервые изучены особенности химеризма тканей

птиц на клеточном уровне, исследовала зависимость химерообрззувдей способности клеток эмбрионов птиц от возраста донора, получены межвидовые (курица- перепел) химеры птиц.

Разработана оригинальная конструкция инъекционной микропипетки; определены объем суспензии и количество .клеток, обеспечивающие высокий результат, установлена возможность использования как эмбрионов-доноров,-так и реципиентов на Я1-Х111 стадиях развития по Зйал Жилади и Кочав при получении химер птиц.

Установлены причины низкой выводимости оперированных яиц, разработан эффективный метод их реабилитации.

Основные положения, вшюсиыые на зациху.

1.Метод реабилитации оперированных яиц кур, включающий вынужденное повреждение скорлупы и подскорлупных оболочек с последующим восстановлением их целостности, обеспечивающий выводимость таких яиц на уровне 507..

2. Метод создания инъекционных химер птиц, включапвдй применение оригинальной техники, обеспечивающий получение химерных организмов на уровне 35Z.

Практическая значимость работе. Разработанный метод реабилитации оперированных яиц кур может быть применен не только для получения инъекционных химер, но и для повышения выводимости яиц при проведении исследований в области экспериментальной эмбриологии, токсикологии, криобиологии.

Экспериментально обоснованный метод получения инъекционных химер в целом или отдельные этапы технологии можно испольвовать как один из подходов к клонированию птиц и получению монозиготных близнецов.

В результате гистологического анализа углублены известные ранее представления о процессах, происходящих на ранних этапах эмбриогенеза и взаимодействии различных типов тканей и клеток, что может быть использовано в учебниках по гистологии и экспериментальной эмбриологии.

Реализация результатов исследований. Предлагаемые технические

решения по получению инъекционных химер птиц используются в лаборатории клеточной инженерии отдела генетики и селекции птиц Института птицеводства Украинской академии аграрных наук при выполнении плановых исследований по разделу 02.02. "Разработать методы получения монсзиготкых Слизнеиог и клонирования птиц" государственной ' программы "Фундаментальные исследования" на 1991-1995г.г.

Апробация работ». Основные положения диссертации доложены на следующих научных конференциях:

Ежегодное рабочее совещание "Консервация генетических ресурсов", Пущино, 4-6 марта 1992 г.

Укра1нской конференц! i молодих учених, асп1рант1в з питань птахХвництва, В1рки, 6-7 жовтня. 1992 р.

l2international congress on animal reproduction, 23-27augtist 1992,-Hague, Ne therland :

Перша кдукова кокферентя по пт&чхвництву, Б1рки, 6-8 жовтня 1993 р.

Публикаций результатов исследований. По материалам диссертации

- б -

опубликовано 8 работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 143странта> машинописного текста, иллюстрирована 9 таблицами и 23 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы собственны» исследований, включающей материал и методы исследовании, результат* исследований с их обсуждением, выводов и списка цитированной литературы.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Б качестве экспериментального материала использовали яйца кур и японского перепела. Эмбрионы необходимой стадии развития получал* путем инкубации яиц при 37,-8 °С и относительной влажности 50-652 с их переворачиванием 6-7 раз в сутки.

Подготовку капилляров для ивготовления микроинструментов проводили по известным методикам ( Никитин В.А., 1986).

Техника изготовления микроинструментов к их конструкция значительно отличались от известных, так как были модифицированы нами.

Выделение эмбрионов производили по методу Lucas and Jamroz ( Lucas A.M., Jamrcz С., 1961). В качестве среды для выделения эмбрионов использовали фосфатно-солеЕэй буфер следующего состава: lOr.NaCl, 0,25г.KCl, 1,44r.NS0HPC4.12Н20, 0.25Г.КНР04 на 1 литр дистиллированной воды; рН7,2. Солевой раствор стерилизовали авток-лавироьакием.

Приготовление суспензии клеток эмбрионов на стадиях свекесне-секного яйца, а такке после 1С-, 20- часовой инкубации проводили следующим образом. Выделенные эмбрионы промывали в двух-трех сменах буферного раствора и переносили с помо;цью пастеровской пипетки в центрифуяяую пробирку с 4-5 мл. раствора трипсина с ЗДТА. Раствор готовили ка фосфатно-солевом буфере, концентрации трипсина и ЗДТА составляли 0,05 и 0,04%, соответственно. В этом растворе эмбрионь инкубировали в течение 5 мин. при 37°С. в водяной баче. После зтогс эмбрионы пикетировали пастеровской пипеткой с внутренним диаметров 0,5-0,6 мм. После пикетирования суспензию клеток центрифугировали е течение 15-20 сек при 1500 об/мин. Супернатант удаляли и к осадку добавляли 4-5 мл. питательной среды. В качестве питательной средь

^пользовались MEM или среда 199.с IOS фетальной сыворотки плодов сровы иди цыплят. Для предотвращения микробного заражения в среду ;обавляли антибиотики пенициллин (200 и. е./мл) и стрептомицин (200 ¡г/мл). После небольшого ресуслендкрованш клетки осаждали центри-угированием. Надосадочную жидкость удаляли, оставляя в пробирке 1,2-0,3 ил. среды, которую использовали для инъекции суспензии клеек.

Подсчет количества клеток проводили в камере Горяева.

Качество эмбриональных клеток оценивали по соотношению ие-ых/поврежденных клеток в суспензии. Поврежденные клетки определяли утей окрашивания люминесцентным красителем 2,7-диами-о-Ю-этил-Э-фенклфенактридиум бромид (этилиум бромид) фирмы Sibco". Раствор этидиум бромида концентрацией 5 мкЫ готовили на осфатна-солевом буфере и для окрашивания клеток смешивали с сус-ензмей в соотношении 1:1. После смешивания раствора этидиум броми-а с суспензией клеток каплв жидкости микроскспировали под покровам стеклом. Количество окрашенных клеток определят используя лю-* иаесцентный микроскоп МЛ-3. Препараты облучали ультрафиолетом с линой волны 365 нм. и регистрировали люминесценцию при длине волны 10 нм.

Определение размеров клеток проводили под инвертированным мик-оског.ом по встроенной шкале при увеличении £0x10x1,5.

для оценки химеризма тканей у птиц применяли метод, основанный а выявлении ДНК по Фелгену ( Волкова 0. В.,. Елецкий Ю.К., 1982).

Заключенные в бальзам препараты,' маркировали и хранили для зучения под. микроскопом. Готовые препарата исследовали под тк~ эскопсм МБИ-9.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Раз работа метода резбклентгцгэт ояерирежшша янц

Исследования в первую очередь были направлены на поиск ofio.no-ек, ответственных за резкое снижение выводимости оперированных кц. В табл.1. представлены экспериментальные данные по исследова-"Ю роли скорлупы в этом явлении. Они свидетельствуют о том, что ?агяция участка скорлупы площадью до 4 см2 привела к уменьшение

- б -

искрения воды иа 9Z, а удаление участка, скорлупы площадью 0.25см2 боа повреждения подскорлупных оболочек (3, 4 группы) ве привело к заметному снижению выводимости вскрытых яиц. При этом поврежденный участок скорлупы ькжет быть заменен гипсом или бактерицидным пластырем. Следовательно, основная причина резкого снижения выводимости оперировалных яиц связана не с нарушением целостности скорлупы, ' а, скорее всего, с повреждением подскорлупных оболочек.

При обследовании яиц с погибшими эмбрионами в большинстве случаев наблюдали тяж уплотненного белка, который прилипал к месту операции. Наличие этого тяжа препятствует нормальному' развитию хо~ риоадлангоисных клеток по внутренней поверхности подскорлупных обо-

Табл.1. Зависимость выводимости яиц от различных воздействий ка их скорлупу.

Группа Воздействие КоличествоВыводимостьУменьшение массы учета на скорлупу проинкубирован- яиц, %. проинкубированных яиц них я ад, ит. яиц, X.

1. КОНТРОЛЬ 29 9б.5±3,4 14,446,5

2. Наклеивание пластыря на

скорлупу. 24 87,516,7 13,416,9

3. Гипсовая повязка на отверстие

в скорлупе. 24 • • 93,8+4,9

4. Повязка ив пластыря на отвер.

в скорлупе. 12 93.7±7,0

лоч~к, и в большинстве случавЕ края аллантоиса не смыкаются именно вокруг этого участка. Возникновения этого тяжа, как нам представлялось, мокко было избегать, создав воздушную камеру между скорлупой и содержимым яйца- Воздушна1? камера расположена, как правило, в тупом конце яйца. Ее перемещение под операционное поле оказалось сильным повреждающим фактором, выводимость яиц составила ОХ (см.ркс.!.). При этом, гибель эмбрионов наступала в первой половине ,и.<{у6ации, когда они при нормальных условиях не нуждаются в наличии естественной воздушной камеры. Мы предполагаем, что вредным для эмбрионов оказалось не саио перемещение воздушной камеры, а образовавшееся после этого над зародышем воздушное пространство, которое

было так жестко зафиксировано, как в пуге. Поэтому наличие пла-васщего воздушного пространства над зародышем способствовало перемещению содержимого яйца при наклонах его в ту или иную сторону в процессе инкубации. Учитывая дачное обстоятельство, для уменьшения объема воздушной камеры под операционным отверстием был проведен эксперимент по доливанию жидкого белка в образовавшееся свободное пространство, который также оказался нерезультативным (рис.1.).

Рис.1. Влияние перемещения воздушной каыеры (опыт 1) к доливания белка (опыт 2) на выводимость с лзр про ванных яиц.

Таким образом, результаты этих экспериментов свидетельствуют о том, что ответственны;.; за резкое снижение выводимости оперированных яиц являются яодскорлу.-Нг:е оболочки. Поэтому следующая серия экспериментов была проведена с целью поиска материала для заклеивания оперированного участка, адекватного подсксрлупной оболочке. Результаты данной серии экспериментов представлены в таблице 2.

Расплавленный парафин оказался малопригоден, поскольку при температуре инкубации он размягчался и часто наблюдали вытекание беяка кз яиц.

В вариантах 5 ¡: б. главной причиной гибели эмбрионов являлось появление в яйцах с первых же дней • инкубации плавающих воздушных камер пли пугырзй воздуха. Следует отметить, что в группе 5, где

подсксрлупная оболочка присыхала к скорлупе в течении 5 минут, процент яиц с плавающей воздушной камерой был значительно меньше, чем в группе 6. (13 против 74%). В группах 1 и 4, где использовали бактерицидный пластырь, не наблюдали плаваздих воздушных камер или пузырьков воздуха.

Только в опытной группе 7, где как бы объединили условия опытов 4 и 5 получили результаты, которые в значительной степени превышали предыдущие. Выводимость оперированных яиц составила 33,52.

Табл.2. Зависимость выводимости оперированных яиц от материалов, использованных для устройства повязки на скорлупе.

Группа Использование мате-' Количество Выводимость

учета риалы для повязки яиц, шт. яиц, X.

1 Полизт.пл.+ пластырь 24 0

2 . Скорлупа+ парафин 25 8,0±5,4

3 Подскорлупн.обол.+

полизтилен+ парафин 24 0

4 Скорлупа+ пластырь 43 9,3±4,3

5 Подск.ОбОЛ:+ГИПС

(через 5 минут) 46 6,5±3,7*

6 Подск.ОбОЛ.+ГИПС

(сразу) 47 8,5+4,1*

7 2СЛ0Я подск. обол+ 33,5±8,6

8 пластырь+гипс 24

Полиэтилен+пласт+

гипс 19 31,б±3,6

9 Подск. обол.+пласт. 28 0

10 2слоя подск.ОбОЛ+

пластырь+гипс(отерилли- 22 50,0±10,1

зация всей скорлупы)

Примечание: " - Р < 0,05 в сравнении с группой 10

Яри стерилизации всей поверхности скорлупы оперированных ям 70%-спиртом их выводимость повышалась до 50% (группа 10).

Таким образом, в результате выполнения исследований по решени первой задачи выяснены основные причины, способствующие резком снижению выводимости оперированных яиц, подобраны условия дл; вскрытия яйца и материалы для закрытия операционного отверстия : скорлупе, обеслечиваащие их выводимость их на уровне 502 .

• 11 -

2. Получение якекционмнх хнмер птиц

При выполнении второй задачи мы испытывали трудности методического характера. Основная трудность заключалась в отсутствии четкого контроля за глубиной погружения микропипетки при инъекции. Между тем этот контроль очень важен. При "ее отсутствии инъекция может быть произведена над бластодермой .или глубоко в желток. Такая инъекция была бы заведомо Сезрезультативной. Задача заключалась в том, чтобы инъекцию произвести в подэародышевув полость как можно блине к бластодерме, на глубину не более 0,5мм; Эта задача была решена нами путем разработки микропипетки специальной" конструкции. Основная новизна в конструкции этой микропипетки заключается в наличии прокалываодего острия, охраненного в темный цвет и отверстия, расположенного сбоку от канала пипетки. Такая конструкция позволяет четко контролировать прохождение острия микропипетки через слои • белка, желточную оболочку и глубину погружения в желток.

В райках решения второй ездачи с использованием разработанных наш микроинструментов и других устройств проводили исследования по определению оптимального количества клеток, объема суспензии и диаметра канала микропипетки, которые обеспечивали, бы как можно больший процент химеризма.

Как видно из рис.2., только инъекция довольно большого количества клеток (1000-2000) способствует гас включению в мелакоциты эмбриона-рециаиента с высокой эффективностью. Наиболее оптимальное значение диаметра инъекционной микропипетки находится в пределах 95-120 мк. Наивысший процент химеризма в наших экспериментах получен при использовании объема суспензии ¡теток 1-Е мкл. Увеличение объема суспензии клеток от 1-2 мкл. до 10 жл. ведет к снижению этого показателя от 50Х до SZZ.

В рамках решения все той же второй задачи нами отработан еще один существенный методический подход. Согласно литературным данным, в качестве доноров и реципиентов следует испольвобатъ эмбрионы только на стадии X по Жилади и Кочав . Для получения экспериментального материала на этой стадии необходимо свежеснесенные яйца тут гее охладить до 10-12 °С для остановки дальнейшего развития. Это создав т. дополнительные трудности для экспериментатора. Наш иссле-

Вывод имость%. 60-

бо-

40-

30

20

10

•o-J

А

Г

Химеризьяб.

СИ -800-1000 GEO -1000-1500 -1500-2000 клеток

с

Выводимость Химеризмэь.

Е~1 -1-й CD - 4 m - I

Рис.2. Зависимость выводимости яиц и количества химер от:

А—количества инъец—ых клеток В—диаметра микропипетки С—объема суспензии клеток.

довакия представленные в табл.З. свидетельствуют о том, что при разработанной нами технике получения химер возможно использование эмбрионов как доноров, так и реципиентов, на более поздних стадиях развития (XI-XII1 по Яилади и Кочаз).

Табл.3. Получение фенотипических химер птиц. .

Группа Схема учета (опыта

Количество инъе-цир-ых яиц.шт.

Выводимость %

Количество фенотипических химер, 7..

1 Полосатый контр. Плимутрок-»

Белый 53

леггорн

2 Голсшейкне-»

• Белый 47

леггорн

3 Перепел Японский* -»Белый 29 леггорн

7,5 О

О

6 (11,3) 6 (12,8)

3 (10,4)

В этих же экспериментах установлена принципиальная возможность получения межвидовых химер птиц, в частности, перепел- курица.

3. Гистологическая оценка химернзка пхщ

Следугачий этап работы заключался в изучении распределения до-юрских клеток в реципкектном организме. Объясняется зто тем, что фимененная нами в предыдущих исследованиях оценка химеризма только ю пигментации оперения не дает полного представления о поведении инъецированных клеток. Лля выполнении этой задачи во всех экспери-«ктах использовали межвидовые химеры, перепел-курица. Результаты,' ¡редставленяые в таблице 4, показывают, что при применении разработанной нами техники уровень химеризма значительно выше, чем мы гредполагали ранее, определяя этот показатель по фенотипу. В 692 агучаев наблюдается включение донорских клеток в развивающийся организм. Выявились также некоторые особенности химеризма тканей, ^условленные спецификой развития куриных зародышей. В частности, иегки, инъецированные на стадии бластодермы преимущественно вкш-гаются з 'эктодерму, в то время как, в з мезодерме и эндодерме их тело крайне незначительно. Причем химерные ткани главным образом

наблюдаются в краниальной части эмбриона. По характеру вкдючени донорских клеток наблюдается ассиметричность их распределения в ре цшшенгном организме и формирование целых полей, состоящих- преиму щественно из донорского компонента. Это свидетельствует о том, чт инъецированные клетки не распределяются в подвародьшевой жидкост диффузно, а прилипают к нижней стороне зпибласта в виде агрегатов Поэтому в инъекционных химерах птиц химеризм, в основном огравиче определенными тканями, формирующимися из небольшого участка бласто дермы.

Табл.4. Распределение клеток перепела в организме куриного эмбриона.

Возраст [кол-во обслед-ых донора |э*<бриоков1т'. Ксд-во химер,шт Химеризм

эктодермы эндодермы мезодерм

Неинкубярован- 16 9 3 7

кые эмбрионы 11

9 часов инку-

бации 7 3 1 2 3

20 часов инку-

бахши 7 2 1 1 2

7 суток инку-

бации 12. 5 5 0 2

Клетки из вне-

зарод. оболочек

через 48ч.инкуб. 13 ■ О С* 2 1 1

В этих экспериментах.нами впервые была изучена зависимость хк-мерообразувдей способности клеток птиц от возраста донора. Установлено, что клетки эмбрионов- доноров до стадии дефинитивной первичной полоски нормально включаются в различные ткани эмбриона-хозяина, ко при этом, иногда наблюдается формирование эктопических цист, преимущественно состоящих из донорского компонента. Формировали* этих структур вероятно является результатом отторжения этих клетса тканью реципиента. При использовании в качестве источника донорски; : слеток эмбрионов белее поздних сроков инкубации (7 суток) ша ткань, ^ормярукицую внегародывевые оболочки, возникают .многочисленные уредекз в головной части зародыка.

- 15 -Вывода

.1. Основная причина снижения выводимости оперированных яиц является нарушение целостности подскорлупных оболочек.

2. Метод реабилитации оперированных яиц кур, включающий восстановление целостности скорлупы с помощью двух слоев подскор-лупной оболочки, бактерицидного пластыря и гипса, обеспечивает их выводимость на уровне 50%.

3. Для получения химер птиц в качестве реципиентов и доноров следует использовать эмбрионы Х-Х111 стадии развития по Эйал-Жилади и Кочав.

4. Разработанная нами микропипетка для инъекции суспензии эмбриональных клеток, позволяет контролировать глубину ее погружения в подзародышевую полость эмбриона-реципиента.

5. Для стабильного получения фенотипических химер кур на уровне 35% необходимо инъецировать не менее 1000-2000 клеток в один эмбрион-реципиент, при этом объем вводимой суспензии целесообразно выдерживать з пределах 2-4 мкл., используя микропипетку с диаметром канала от 90 до 120 мк.

6. Обнаружена с подтверждением гистологическими методами потенциальная возможность получения межвидовых бластодермальных химер птиц, перепел-курица, при уровне химеризма 59%.

7. Клетки, инъецированные на Х1-Х111 стадиях развития по Зйал-Жилади и Кочав включаются в производные всех трех зародышевых листков, экто-, мезо- и эндодерму, но преимущественно,-в эктодерму. Химеризм таких организмов ограничен тканями краниальной части тела.

8. Химерообразующая способность клйток птиц зависит от возраста эмбриона-донора. С увеличением разницы в возрасте между змб-рионом-реципиентом и донором от 1 до 4 стадии развития по Гамбургеру и Гамильтону количество химер уменьшается от 69 до 29%.

Практические рекомендации

1. Для проведения исследований с эмбрионами птиц в области экспериментальной эмбриологии, токсикологии, клеточной и генной инженерии, где требуется вскрытие оболочек яйца с последующим их восстановлением, следует использовать разработанный нами метод pea-

билитации оперированных яиц.

2. Для осуществления инъекции суспензии эмбриональных клеток, введения другого материала, препарата в яйцо или в эмбрион при проведении исследований по получению химер, монозиготных близнецов, клонированию птиц целесообразно использовать разработанную каш технику микроинъекций.

Материалы диссертации опубликованы в таких работах:

1. Терещенко A.B., Тагиров М.Т., Белецкая A.B., Артеменко A.B., Са-хацкий Н.И. Создание химер кур путем трансплантации бластодер-мазьных клеток //Тез. докл. Укр. конф. с международным участием "Актуальные проблемы современого птицеводства", 4-6 декабря 1991 г., - Харьков, 1991. -С. 34-35.

2. TaripoB М.Т., Терещенко О.В., Артеменко 0.Б., Биецька Г.В. Вдосксналення методу реабШтацП оперованих яець // Тез. доп. Укра1нской конференцП молодих учених та acnipaHTiB з питань птах1вницгва, Б1рки, 6-7 жовтня 1992 р., - Харьк1в, 1992. - С.4.

3. Sakhatsky N.I., Tereshchenko A.V., TagiroyM.T., Beletskaya A.v., Artemenko A.B. Production of chicken chimeras //' Proceeding's of the 12th international congress on- animal reproduction, 23-27 august 1992, - Hague, Netherland,i992.- V.l. P. 231.

4. Артеменко С.Б. , Б1лецька Г.В., Терещенко C.B., Tarlpos МЛ. Кр1оконсерзування юптинно! суспензП ранн!х ембр!он1в курей // Тег. доп. 1 науковой конф. по птах1вництву Украинского в1ддхлен-ня ВНАП. Борки, 6-8 грудня 1993 р., - XapbKiE, 1993. - С. 20.

5. Терещенко 0,-В., Артеменко O.E., ТаПров М.Т., Б1лецька Г.В., Са-хапький М. ]. Застосування заморшено-вхдталих Сластодермальних кл!тин для одержаккя химер птиц! // Тез. доп. 1 науковой конф. по птах1вництву Укра1нского в!дд!лення ВНАП, Борки, 6-8 грудня 1993 р., - Харьк1в, 1993. - С. 21.

6. TaripOB M.Т., Артеменко О.Б., Б1лецька Г.З., Терещенко О.В., Са-хацькийМ. I. Диференц1йн1 потенцИ Хк'зкозаних змЗрюналъних кл!тлн /В залекност1 в!д в1ку ембр1он1в-донор1в б химерних организмах птах iß // Тез. доп. 1 науковой конф. по ¡ттах1ьництву

Укра! некого в1дд1лення ВНАП, Борки, 6-8 грудня 1993 р., -XapbKlB, 1993. - С. 22-23.

Терещенко A.B., ТагировМ.Т., Белецкая A.B.. Артеменко А.Б.. Сахацкий Н.И. О возможности получения инъекционных химер кур // С.- X. биология. - 1993. - N 2. - С. 48-50. Терещенко A.B., Артеменко А. Б., Белецкая A.B., ТагировМ.Т., Сахацкий Н.И. Низкотемпературная консервация бластодермалъных клеток эмбрионов кур (методика) //С.- х. биология. - 1993. - N 6. - С. 53-58.