Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение in vitro форм картофеля, устойчивых к гербициду класса имидазолинона Pursuit

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Получение in vitro форм картофеля, устойчивых к гербициду класса имидазолинона Pursuit"

па

Ой

- М1Н1СТЕРСТВО ОСВ1ТИ УКРАЙИ КЙКВСЬКИЙ УШВЕРСИТСТ ¡м. ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

На правах рукотищ

Крапеиь Ольга Оле{{Сапдр1впа

ОТРММАННЯ т УГЛЮ ФОРМ КАРТОПЛ1, СТ1ШШХ ДО ГЕРБЩИДУ КЛАСУ Ш1ДАЗОЛШОШ1 РШ8ШТ

03.00.12 - Ф13ЮЛОГ1Я РОСЛИН

АВТОРЕФЕРАТ

дисератцИ яа здобуггя вченого етупеяю канцидата бЬлопчних, наук

Ки1а - 1993

ДисзртаЩею е рукопис

Робота виконанз на кафедр! фШологИ та еколсгП рослин б1ощ-Пчного факультету Киэвського ун!верситету 1м. Тараса ДОевченка

доктор бюлоПчних наук, професор Капля Д. Б.

кандидат б!слог1чних наук, науковий сп1вроб1тник Погребняк Н.Я.

доктор ИолоПчних наук, пров1дний науковий сп}вроб1т1(Ш£ Сарнацька В. Б. кандидат б!олог1чних наук, доценг

Желтоножська Л.В,

1нститут картоплярства УДАН. смт Нем1шаево

Захист 'дисертацП в1дбудеться "Я? " 1993 р.

О Л_ год на эас1данн! спец1ал1зовано1 вчено! ради Д. 01.01.07. кри Ки1вському ун1верситет1 1м. Тараса Шевченка за адресор; 252127, КМв, проспект Глушкова, 2, корпус 12 (бЮфак)

3 дисерт'ад'1ею моща ознайомитись у б1бл1отец! университету Автореферат рсзю ланий " &егг(М>кА~ 1993 р.

Вчоний оекретар дпе'ц18л1зовано1 ради

вдндидагб1олог1чних наук, ( ,

профзсор ?;• -) о. Б. ЬоаПон

Vх -

Пауков! керШики:

,0(Ь1ц1й«1 опоцеита:

Пров1дна оргаШзац!я:

ВСТУП

Акг.уальн1сть проблем». Одним 1з резерв1в Швивдения урожчйност! :1льськогоияодарських культур с боротгба з бур'янэми.' Зараз п!домо юнад 1800 вид1в бур'ян1о. для боротьби з ними, щ»1н агрогехпИких заход1в. широко тчсористорупъ 61 ля 6000 х1и1чних нреларат!в. кфск-гявн1сть цього методу досягав 95-984. Проте ел1д в1дм1ти, то зао-госування х!м1чних засоб1в захисгу рослин кр!,м батаного ефеклу слазить перед рирсбиичникаии ряд проблем, одна з них - па иоявя стойких Цори шкШшвих орган1зн1в. На сьоголШгаШ день в1домо десятки )ур'ян!в. що иабули стШкост! до гербпэдЦв. А тому для ycnJwH«.'Оо-гатьби з ними noTplfmo зб!лывувати норми внкористання гер!Иыяд1в, им юбезпечно не лише для зсвШшнього ^ередории-э, а ¡1 для культурних юслин.

Тепер у практац! о[льськогосподзрсьгаго виробниитва для Оороть-ш з йк1дливиии оргян1змэми успшгэ застосовують бЮирепартш, як] ;онкурувть з хШчнимн засобами залкпту рослин. Поряд з ним йле по-|ук влях!в вдоскоиалшшя хМчиою методу Роротьбя з mtti длиг-ичи ор-•аи1змачи. Один 1з них - створения методами найновiiiioi б!отехнодоп 1 орт! в культурных рослин, ст1йких пг> герб!щш!р.

Мега 1 завдшшя досл!джень. Нотою дано! робота було отршшшя з мкористзчням метод!в кл1тлнно1 б1олог11 та геиетичио! Инженер!I орм карч on,п1, стМкшс до Pursuit - гербШиду клзгу 1й1д=>гол1!юна. е новай клас герб1ичд1в. вдо претенд'/о но щроке викориетання у 1льоькому госледарств!.

Зг!дно поставлено} мети ззЕдашш ешгераментяльноГ работа вклв-

али;

1. Внвчити в укорах In vitro пилив герб1циду Purmi t на poo яни i кэлуе картопл!.

2. П1д1брати умови селе.кцП in viv.ro стШких яо гррбп'нду >И"1 артопл!.

3. П1д1брати умови трансФориаиН та регенерат f роелпн кар-опл!.

4. зд1йонити перенесения та ексяреШю мутантиаго гену аиего.грг-ггсинтази араб!допопсу в рослини картонл!.

5. Довести трансгенну природу «Шбрашшх {»опии за допсчоюв ТК-ДНК та ГНК-ДНК пбридизацП.

6. Вивчити стриман] от1йк! Ферми то 1рзнсФорманти картонл!.

i-'j/jmob/nvhih г !'5

Наукова новизна 1 практична ц1ни1сгь робота. Вперше встановле-но, що коренева система асептичних рослин картогш найб]лъш чутлива до дП гер01циду Pursuit.

■ Виявлено. що недиференц1йована тканина картопл! менш чутлива до дП "геропиду. н1ж д!ла рослина.

Вперше огрнмано калусШ клони картопл1 сорту Зарево б1льш н!ж у 50 раз1в ст1йк1ш1 до дИ герыцнду Pursuit в!д контролю.

- 3 допомогою мутагенезу 1 подальшо1 селекцП вперше вШбран! рослшм картопл1 сорт!в Jlopx, Приекульський ранн1й 1 Зарево, ст1йк1 до герб'Ншду Pursuit.

Вперше отримано трансфорыанти. картопл1 сорив Лугоьський та Цез1рее з иутантним геном ацетолактатсинтази араб1допс.ису. 1нтег-рац1я чужор1дних ген1в у геном рослин картопл! Шдтвердасена методом ôAOT-riôридизацП за Саузерном. Показано, що цанг траногенш ростни зоер1гають характер«1 фенотнпнЗ ознаки вих1дних сорг1в.

EiiUôpaiil CTliiKl калусш клони, па нашу думку, можна використо-вувати для створення ст1йких до 1м1дазол1нон1в форм картсчш та 1нших рослин методом злиття 1зольованпх протоплаопв.

Створен! траиогенн! рселини картогШ, на наш поглид, мокугь бути викэриотан! селещЦонерами для створення ноьих сортш картопл1, етШких до 1нших герб!цид1в класу 1м1дазол1нони.

Анробаи1я робота. Нагер1али дисергаЩ! донов1дались на Шдсум-кових наукових конферешЦях 01олог1чного факультету ШЦвського ушверсптету (1991, 1992.1993), зас1дан1 кафедри Ф1з1олог11 та еко-логП рослин 61олог1чного факультету Ки1вського ун1верситету. а та-к.иж ha науково-теоретичному ceMiirapL КиГвського в1дд1лення товарист-ва ф1з1олог!в рослин.

Автор висловлве щиру подяку от.н:сп. Лопато C.B. та м.н.сп. Стсрожешсу C.B. за велику допомогу. надану при вш;онани1 роботи, а також yeiM сп1ероб!тникам в1дд1лу цитиф1зЮлогп та кл1тит«л 1шке-нс-pii 1КБП АН Украш! за порадн. моральну Шдтримку 1 чуйне с гав-лення.

Публ1кацП. .Основнi результата дисертаШ викладен! у чстирьох друкованих роботах, список якнх представлено у к1нц! автореферату.

Структура та об'бц роботи, Дисертац1и окладаеться а вступу, ог-ляду л1тератури, експерименталиш частили, результата досл1джень, «бговорешш , BUCHOBKlB 1 списку л1тератури, який включав 221 найме-

нуьання. Робота викладена на 131 сторШШ машинописного тексту i м1стить 20 малюик1в'1 3 таблиц1.

Полоиення. як!_внносгься_ца захнст. На основ! проведших

досл1джень, узагальнкюча впасШ 1 л!тературн! дан1. на захнст внно-сятьоя сл!дувч! положения:

1. Коренева система асептичннх рослнн картопл1 найб!льш чутлива до дП гербЩиду Pursuit.

2. Калусна тканина картогШ менш чутлива до дП гербЩиду Pursuit, н1к щла рослина.

3. П1д1брано умови мутагенезу 1 селекцП форм картопл!, ст1йких до д!1 Pursuit. ВШбрано рослини i калусн! клони, резистентн1 до герб1циду.

4. ПШбрано уиоьн перенесения чужор!дних ген!в у рослини картопл! шляхом агробактер1ально1 1нфэкцН. Отримано рослини-трансфор-манти, як! моауть бути використан! у селекцШгому npoueci.

НАТЕРШИ I МЕТОДИ.

Характеристика росликкого натер!алу та герб1циду.

У робот! використовували нас1ння. нестерильн! бульби, асептичн! зослини, м1кробульби та калус культурного тетраплоздного виду >olunum tuberosum. Рослини S. tuberosum copTis Луговський, Прие-гульеький раший, Лорх, Св1танок ийвський взято 1з колекцН Ук-laiHCbKoro иауково-досл!дного !нституту картопляного господарства, а ■орт 1в Зарево, Темп, Остара 1 Дез1рее - 1з колекцИ 1нституту л1тинно1 бЮлогН та генетично! 1н;кенерИ АН Украши.

Pursuit (1мазетап1р) - новий, широкого спектру д11 герб1цид ласу 1м1дазол1нони, створений ф1рмою American Cyanamld Company США). ГербЩиди цього класу шгибують активШсть ацетолактатсннтази ключового ферменту б1осннтезу валШу, лейцину та гзолейцину.

Нан1пуляци з катер1ало![.

Bei ёксперименти по культивуванню рослии, калуоних лИпй 1 про-зпласт1в проводили в асептичних умовах. Середоешце стерил!зували зтоклавуванням.

HaclHHfj картопл! стерил1зували 70Я-шш етанолом на протяз! 1 д!оцидом - 20 хв з подальшим триразовнм промиваннян у стерилыий [СтильованШй водь Нас!ння пророщували на агаризованому середовищ!

-замийпени.. 549

- 4 -

Мурасиге i Скуга - НС (Murashige, Skoog, 1962).

Бульби картопл! стерил!зували за методикою, описаною Аветисовим В.А. з1 сп1вроб1тниками (-Аветисов и др., 1991).

Асептичн1 рослини картопл1 росли на середовшц! МС при стандар-тних умовах: температура +24°С + 1°С. осв1тленн!сть 4000 лк, св1тло-вий день - 16 годин, в1дносна волоПсть пов!тря 75-85%.

Для 1ндукцП калусоутворення листя • 1 сегмента стебла рослин картопл! надр1зали у декЗлькох м1сцях i помЩали на агаризоване се-редовищз SC 10 - серэдовище МС з додаванням 3 мг/л 2,4-Д 1 0.3 мг/л к1нетину.

ЬИкробулъби отримували 1 культивували за методикою, описаною Буркве Дж. 1з сп1вроб!тникаш (Bourque et al.. 1987),

Вшчення in vitro вгшиву р!зних концентрац!й герб!циду Pursuit на р1ст i розвиток калусу i рослин картопл! р!зинх сорт!а. Для виз-начення концентрац!й герб!циду, що пригн1чують р1ст калусу шматочки калусно! тканини вагою 0,21-0,23 г пом1щали на середовище SC10 з р1зними концеитрац1ями гербЩиду (8х10~в M, 2х!0"7 M. 4х10"7 К, 10"6 М, 2x10"6 M 1 4x10"6 М). Контролем був калус, що pic на середовищ! SC10 без герб!циду. Калус звакували через 5 тшкн1в. ВШосний прир!ст маси калусу визначали за формулою:

W =

- w„

_t_el

'Я

де - в1дносний прирост иаси калусу, N - вага калусу через 5 тижн1в, И0 - початкова вага калусу.

ДЛя вивчення впливу герб1циду на рослини картопл1 живц!' цих рослин розсаджували на середовище МС з р1зною к1льк1стго герб1циду ( 10"8 М, 2x10"8 М, 5x10"8 м, 10"7 И). Контролем були аналог1чн1 рослини картопл!, посаджен1 на середовище МС без гербЩиду. Спостере-ження проводили через 5 тижн1в п1сля посадки рослин.

Мутагенез, i селгкц!я ферм картопл! criйкпк до д!х гера!циду.

У досл1дах по мутагенезу використовували ф1зичн1 (У! - -=254 нм) та х1м!чн1 (н1трозонетклсечоэ'ша - НМС, етилнетаисулъ^онат - ЕМС) му-тагени. Мутаген, його К01;центрац1я 1 час впливу пЦбиралися в залеж-hoctI в1д типу експлантагу.

Нао1ння обробляли 25 мМ ЕМС, сегмента стебла, м1кро6ульби та пазушн1 бруньки - в1дпов1дно 5 мН, 2 мИ 1 3 ыИ НМС, а кэлуопу тканину - 0.5 мМ НМС або опром1нювали У1>.

Також проводили поступову селеыЦю калусу без мутагенезу.

Ст1йк1 до герб1ииду форми в1дбирали на середовшц1 *з иШмаль-но-критичною концентрат ею антиметабсл1ту, яку визначали для кожного сорту окрено.

Р1вень ст1йкост1 в!д1браних п1сля досл!д1в по мутагенезу та се-лекцИ лШй рослин та калусних клон1в визначали розсадкуючи ix та контроль на середовшце з р1аною к1льк1стю гербЩиду.

Характеристика плазм!дш1:с вак.тор!и.

Для трансформацП картопл! використовували плазм1ди рАС 350 та рАС 351, що нвляються поу.1дитш плазм1ди pBln 19 (Bevan, 1984) l ч1стять ген неомщинфосфотрансферази II (HPT II) та мутантний ген адетолактатештази яраб1допсису.

Плазм!дн! конструкц!i методом прямо! трансформацП переносили в )беззброений штамм ¿grobacterlum tumefaclens C58ClRlfR(рМРЭО), який шкаристовували в подалыШй робот!. Бактер1ю вирощували на середовшЩ 1В з додаванням 50 нг/л канаШцинсульфату.

Плазм1дн1 конструкпП були лоб'язно надан! доктором Чалеффом Р. American Cyanamld Company, США).

Електрогзорац1я протопласт!в.

.Протопласта is ,мезоФ1лу листа картопл! вши ляли 1 культивували а методикою запропонованою Сидоровнм Е. А. (Сидоров и др.. 1985).

Електропорац1га протоплаот1в проводили за методикой розробленою 1нститут1 кд1тинн<п бЮлогИ та генетично! 1нженорП АН Укра1ни Помет и др., 1988).

7рансфсрмац1я картопл!. опосередкована A.tunmfacisns.

Трансформад1ю картопл! проводили методом кокультивування лист-звих диск1в, certoeiiTiB стебла, зр1з!в м1кробульб 1 бульб з . turnefaciens.

Використовували методики ряду ав-гор!в (Аветиоов и др., 1991;

Дмитриева, Негрук, 1990; De Block, 1988; VJenzler et al., 1989). Ба-зовою була методика Де Блок И. з нашими модиф1кац1ями.

СелекЩю трансфориант1в проводили на сервдовищ! з 50 мг/л ка-,нам1цинсульфагу.

Тести на канаи1цинст1йк1сть.

0триман1 п1оля досл1д!в по трансформац11 рослини перев1ряли на здатн1сть до коренеутворення при наявност! у середовищ! канамЩину. Для цього ix розсаджувалн на середовище МС з 50 1 100 мг/л канамЩину.

Рослинну тканину тесгували на злати1сть до калусоутворення на середовищ1 з канамЩином: сегмент стебла рослин-регенера::т1в 1 нет-рансформрваного контролю пом1щали на середовище SC10 з1 100 мг/л канамЩину.

Аиал1з ядерно! ДНК трансформованних рослин.

Вид1лену 1 очищену ДНК рослин-регенерант1в (Murray, Thompson, 1980) анал1зували на наявШсть чужерШого гену методом блот-Пбри-дизацП за Саузерном (Маниатис и др.. 1984).

Анал1з РНК трапсгенних рослин.

Для дослШшння експресН на р1вн1 РНК використовували метод РНК-ДНК-блот-г1бридизап11 (Маниатис и др.. 1984).

Статистична обробка результатов.

При обробц! експериментальних даних використовували стандарта! методи обробки результата (Урбах, 1964).

РЕЗУЛЬТАТ» ДОСЛГДЖЕНЬ

1. Визначення м1н1мально-крнтичних концентрац1й герб!циду для рослин 1 калу су картопл)..

В результат! проведених досл1д1в встановлено, що у асептичних рослин картопл! коренева система найбтльш чутлива до д11 гербЩиду. На осное1 цього процес коренеутворення ' обралн основним показником при визначенШ чутливост1 рослин картопл1 до гербЩиду, а концент-раи1ю антиметабол1ту. яка лригн1чуе утворення корен1в, ваажали м1Шмально-критичною.

1з граф1ка, представлено го на малюнку 1 , видно, що гербЩвд по р1зному впливае на пронес коренеутворення у рослин картопл!

.. m

\

^ Й so

i Ï-J

w

Oí

В ■'■■O

'pn

Vх

í\

U4

\

X

O fí] 5'ÜT* ÍIV

тщЕширашл1 sepötmuly ¡rM)

Мал. I. Dилиз конпеитрзиi т рзрАпщру ¡¡л процея ¡tops--нсуг воре пня у аеепгичнях роолии кр.ргоч« piaiiHX oopris:

о - горшп групв cop-Tin /flpHotyaievwW j^nniO/,

v - /р.угп групя с:орг1а /liopx, Лугопський, T*¡"i

i f о з i р о о/.

>;- ipnrî ¡pyiin о орт i в /?лр*эго i Оотпрп/,

- В -

¿0йл1дх>ваких сорт!в.

Blлпов1дно до встановленсго значения иИИналыю-критично! кон-нентранЛ вс1 'доол1джуван1 сорти розд1лнли на три групп:

перша - найб1льи чутлиьЛ до д1К гербЩиду сорти Шриекульсыжй раннШ, коренеутворення у яких пригн1чуеться при 2x10"® М гербЩиду;

друга - сорти з проминки» чутливЮтв (Лорх. Луговський, Темп 1 Двзц/вё}'- значения >;1н1мал1-но-критично1 кондентрацИ - 5x10"' М;

трет* - найб1льш толерантн! до гербЩиду сорти (Зарево 1 Оота-ра), у яких ксшюнтрац!* антаметабол1ту 10"7 М повн1с,ту inrafeyo ут-виропня корен!t.

Нзя&йсть гербЩигу ь свредоышц впАиьала 1 на морфолопв рос-хин. Для вс1х досл1дкуианих сортХв картопл! встановлена слшоча г>.~ леыПсть: при конценграцП герОДнду, t|0 пригв1чуг коренеутьорьиня, прнблизно,' у bü'i рослин ккчшють з'налятися ь1дхилеяш> у морфологи. У л!тератур! не иле noelдомлекь про д!в Iii vitro герОИишь класу мдг.зол1ноки на морфологiso ршлии. На нашу думку, з'яоуваник причин полей корфолог1чшшшзльних росли:? ¡пд д!ев fursuit иожо стати темою окремого дослШешя

У !]опр.родн1>: досл1дах оуло всгановлзно, ¡до серед yclx доел1джу-ьаких сорт1в проще калуооутворешш найкраще в1д&уваеться на сегментах стебла рослин сорту Зарево. Тому кал ус саме цюго сорту виксрис-тсьували у подальш1й ро5от1.

Як видно 1з данях предстаьлених у таблиц! 1, вихШш концентрат я гербЩиду - 8x10"8 К 1нгибувала р1ст калусу майже у 2 рази у noplBHHHHi з конгрелам. При зб1льшенн! кондентрацИ гербЩиду в се-редсвииЦ до 8x1,0"1 М, що в 10 раз б!льые початково], р!ст калуоу пригн1чував:л побн!стю.

Таким чином ми визначили к'1н1малыю-критичи1 концентрат 1 гербЩиду для родлин i калусу картоял!. 2 яках ол!д починати в!дб!р CTliiKiix форм.

2, Мутагенез 1 салекц1я,

Мутагенез нае!мю кар-уопл!. У ход! досл1д:;;ень оуло встановлено, що огпииалыг.ш час д11 25 иМ ЕНС на насшш картопл! - 16 годин. При такому ре;:ш! обробки схож1сть нас!ния становила 65%. Проростки,

Таблиня 1.

Валив концентраци гербЩиду на р1ст калусу карт'опл! (сорт Зарево)

Концентрация Початкова вага Вага калусу

герб1циду калусу (г) через 5 тижн1в (г)

у середовщ! (М)

О 0,21 + 0.026 3,9 + 0, 162.

8x10"8 0.21 + 0,034 - 2, 1 + 0. 1J1

2X10"7 Q.22 + 0,056 0,51 + 0, 036

4X10"7 0,21 0,045 0,32 А- 0. 032

8X10"7 0,22 + 0,030 0,22 + 0, 02.0

2x10"6 0,21 + 0,027 0.21 )■ 0, 03 i

4x10"5 0,22 4 0. 035 0,22 0.032

2XÍCT5 0.22 Ч- 0. 027 0.22 + 0, 027

отриман1 1з обробленого мутагеном нас1ння, нядс1кали у г:1лькпх м1сцях I пом!цали на ссредовшце SC10 для кэлусогенезу. Через 2-3 тижн! на поБс-рхн1 рани починав угворюватися первинниЯ калус. Яого в1дд1ляли 1 переносили на регенерацШне серрдовище R3C8 (I'c ГаЪе et al., 1989), що м1стило 10"7 М гербЩиду.

Через 5-6 тижн 1 в 1з первишюго калусу отркмано 68 паростк1в, 1х в1дчленовували i переносили на середоивде ЙС. Ко;ший паросток пав початок окрем1й д!н1! регенерант1в, як1 ро-зоаджували на сереловище МС з 10"7 М гербЩиду. Регенеранти вс1х л5н1й нормально росли 1 ут-ворювали корен1. При п1двишснн1 концентрат! антиметабол1ту в 5 раз1в - 5х10~7 М у 43 л1н1й регенерант1в спостер1гали появу анональ-них роолин, тод1 як 23 jilHil росли нормально, але не утворшади ко-рен!в 1 лише 2 л!н11 регенерант1в формува.та корен1, що дозволило зробити Попередн! висновки про ст!йк!сть них рослин до гербЩиду.

¡■lyTapeijee Mi кробул;,б, У ход! доел1джень було остановлено. цо (iOiiJIIlHH сорт/ Лорх утэорюоть М1К(>Обуль0<( 31ШЧН0 ШБИЛШв eltc рослини сорт)в Лугоьський, ариекульсьюШ раш1й, Темп 1 Остара. Тому в по-далыШй робот! викириотовувал! м!кробульби цього сорту.

, UiKpo6y,it6M обробляж 2 мН ШС iipoTfli ом 2 годиь, трич1 пропивали стерильною дно'гильоваиоь ' водою, н1дсушували • на ФЪътруьальному напер! i iioMiiiidJiii на середоэгаце R3C8 з 5x10'3 И герб1циду. Були оО-роблено 100 зр1з1ь мПфобульб. Через 4. тнжн1 на селективному еередо-шгд1 з'явилися перш! паростки. Отрнмали 25 паросткТв, як1 переносили'!« cepe£aBV.t!& НС з fix 10"8 М гер61цзду. В ьих умошх липе рослини одн!в1 лШ1! утьорили коран!. При и1деищрнн1 концентрат! герЫциду в б раз1в (2 5x10"7 И) у росли inel niuli в1доувалися нзрыадип процеся морфогенезу.

ЫуглгцКй? сегмент!в стебла 1 пазтаюх бръньок. У .досл1дах вико-р.чстовували сегмент» стеола з пазушков брупькот ! без тп, як! с1дпов1дно називали'назушн! бруньки i сегмента стебла.

Мучагешон (ft кМ ШО) ооробляли по 150 сегновт1в стебла 1 ни 100 пазушпх Сруньок сорг)в Приекульський ранн1й, Лорх, Дез1рео та Зарево иротягим г j•одна. Шелл цього сегвенти стебла поиНцали на ое. лекгцше р(мчгиера«1йцб середовшце. а жяв«1 з иоолшгоыши нарушит: брунм;аш! - на серкдовище ИС з Гср&1шдом.

Воганийлено. то ефективн1сгь утворення паросте1в з иэзушнчх бруньок нл сфедоввд! з нИЦмально-критичною концентрат ею гербпшду становила 40Х для сорту Приекульсь-киЯ ранн!й, 37Я для сорту Зарево 1 '25% для соргу Лорх.

У доелгдах по мутагенезу сегмент!в стебла з^стосоьували дв1 сии гоми регенерацП:

перша - шотупове- перенесения сегмент!в стебла з калусиого ое-редивнща S3 на рогенирлЩйне St">. a iiotiм S7 iDe Block. 1S88);

друга - сегмента стебла зразу пом1щали на регенерацИЬге середо-В1.!1Э КйС8 з гербиидои.

У досипдах з поотуповим перенесениям експлантат1ь на середови-WX S3 -55-37 значно зо!льшувалась ефективШсть 1 скорочувалась три-валюто регенерат!. При ьикористаин1 ще! сигтеми регенерацП на протнз! В tiuhib оуло отримано 15 реген,ерапт1в у сорту Приекульський ранЫй порЛышно з 3 на середовищ! R3CU. а також 2 регенерантн у

- и -

сорту Лору., тод1 як на середошЦ НЗС8 регвлцздП у пього сорту ¡if гЦдбуьалоея.

Па осчов! отршанюс результат1в шхка ариОшм ц miyiw-mo) про кращ! регенорацш-il i росю»! можливост! сорту ЦлыкуяьськиР ранШП пор1внянно з пшши сортами - Лсрх, Зарсы) 1 ЛеЫрее. У сорту Прие-кульськнй ранни! отрпмалп !8 регенерапПг при винсрксгатЦ еогменпв стебла 1 40 napocTKlB при використанн! пазушпич Сругьок, тод1 як у сорту Лорх. - в!дпов1 дно. 2 регснсраита 1 25 плроспив, у соргу Зарево - 37 uapocwiB is пазуш;йх cpyuuiv, а V сорт/ Дез\рее не ьХх&у -ралися Ш регечерац1я, н1 утворення пароогк1в.

Сл*даэчпн етапом робота було вив»ення стгикосп |.оо.шн-ре1члш-раит1в до гербщпду. Вэтановпеио, цс при чутагшПЛ обрс-глЦ сст-мент1в стебле у сорту ГфлекульськиП pamiiii 1з 13 рыччигрзн'ПБ лише ь Суда CTli'tcl. 31д1брэи1 .nlHil шли рлзшп! piuc-иь от :йко>;т1, 4 а них в умовах In vitro булн у 2 рази oTlflKlmi до г«ро1ниду пир1ьн.шг. а контролем, а 2 - у 5 paaiB. 1з 40 наростклв отришшч пр» oqmtitU мутагеном пазушшк бруиьок сорту Пряькульсышй ршш1и ЫдЮрали лшге одну л1н1ю рослпн у 2 рази стШашу до геротциду я!а контротах рос-лини. У сорту Лсрх на сс-редсввд1 з м начально-критичною концентрацию герб1циду росли 2 JiiHli рослин. регенерованих 1з cei;»stvrib стебла 1 1 лШя з 25 отрпмишх п1сля мутагенезу пэзушнич бруиьск. Результата досл!дкень дозволлвть яробити висновок. «о сфективид изь мутагенезу айда при використашЦ сегмвнт1в стебла.

Мутагенез 1 постунова селекп1я калусу картопл:.

При вувчен1 впливу 0,5 мМ ИМ С на р!ст калусу ,лртопп1. питано вили, цо при 2 гоцишай д11 мутагену знггтездаттшми залшиаетьол 50-602 кл!тшг, чот'о ц1лком досташьо для проведении селекмдйиого лругеоу.

3 метою виявлешы ст1йких лШй обросши! мутагеном калусн! к.'Итинц псм1щали на середоввде SC10 з концентрате» ¡ербИрп.у, що у 2,5 раза иеревищуе м1н1иально-критичну - 2xlo"6 м.

Через 6-8 тияПв пЮля обробки на цьому середовиип ia -100-500 калусних колон1й в1д1брали 5 калусних Jilniii. Протлгом 3 naoaatlB в1д1бран1 клони культивували на середовищ! з такию ж концентрацию гербЩщу. Кл1тнни yclx 5 клин 1 в дсбре д1 лились 1 через 5 тимн1н ма-са калусу з61 лыаувалась у 10-12 раз!в. Bin мав 6Ш; забарвггення 1 рихлу структуру, ТГ.И1 як клРппш контролю б^ d 1 л.; i гинули при ц1й

концентрацИ герЗЩиду.

В 1Н1ШХ дос.'Идах калусну тканину опромиповали УФ-променями про-тягом 10, 15 1 20 хв. Оптимальним був час опром1нення 15 хв. При такому решим! виживало 60-70% кл1тин. У раз1 зб!льшення тривалост1 дП УФ до 20 хв життездагними заливались приблизно 50% кл1тин, що нерос-татньо дж. наших дослШв.

СелекЩю ст1йких клон1в вели на середовищ! ЭСЮ з 2х10"6 М герб!циду. 1з 300 калусних колон1й через '5 тижн!в в1д1брали 1 клон, який р!с при дан1й концентрацИ герб1циду.

Кр1м мутагенезу з посл!дуючою селекц!вю проводили поступову се-лекЩю калугу/, що базуеться на сомаклональн1й м1нливост1 рослинних

КЛ1Т1Ш.

На першому етап! селекцП калус картопл! пом1щали на середовшце 5С10 з 2х10"7 И герб!циду. Через 10 дн!в калусн1 зони, як1 росли, переносили на св1же, сеШвище з т!ев ж конценграШею герб1циду. П1сля 5 насаж1в на середовищ! з 2x10"7 М гербЩиду концентрац1к> зб1лыиува~ ли у 4 разн - 8x10"7 М. Це м1н1мально-критична концентрац1я гербщи-ду для калусу картопл1. ГИсля сьомого пасажу в1д!брали 2 калусч1 клони сг.1йк1 до ц1е! концентрацИ гербЩиду.

В результат! досл1д!в по мутагенезу 1 поотупов!й селекцП калу-су вШбрали 8 клон1в, як1 росли на середовищ! з 8x10"1 М герИциду. Для визначсння р1вня сПйкост! до герб1циду ц1 клони розоаджували на середовище БСЮ з р1зною к!льк!ств герб1циду - 2х10"6 М, 4x10"° м 1 БхЮ"6 М. З'ясувалось, що вс1 клони ростуть при концентрацИ герб1циду 2x10"6 М, .При зб1льиенн1 концентрацИ герб!циду у 2 рази -4x10"6 М - росли 4 калусних клони, два з них (клон N1 1 N2) - росли на середовищ! з 8х10"6 м герб1циду. що в 10 раз1в перевищуе и1н1мально-критичну концентрац!» герб!циду для калусу каргопл1.

Подальше вивчешш ст1йкост1 калусних клон!в N1 ! N2 до гербщи-. ду показало, що калусна тканина цих клон1в продовжувала роста нав1ть но середовищ! з 4x10"5 М гербЩиду, що у 50 раз!в перевищуе м1н1мально-критичну концентраЩю . Це св1дчить про високий р1вень СТ1ЙКОСТ1.

На иалюнку 2 показано в!дносний прир!ст маси калусно! тканини

1 ? h--- 1

■îr

.1 \

1 \ !

g X

§

0 S'fí

\

\

\J

fû-s

fámex/vpauLz ¿eû5ùu:Sç //У/

Мал. с. Вплйв piskkx концентраций repoiuw ¡¡а прлщз? кмусу

катзтогиг! сорту Зг.рево: ' о - контроль. V- кто a ir I. х- гж« >' 2.

!"/¡oíiïг К! 1 Г," пср!£'нлнс> з контролен на середошидах о р!зно$ хонцен-•фачЬ1' ! 0рб1дису. Вер го вШначити. едо при чочатковюс концентратях гер-Чгнду <öx 10"7 - ?;,10 0 I-P калуон! клони !;! 1 N2 ростуть 51льш ~ JnrciK'nv'io, Mis на сесиячвизЦ f>?s «ч-рМцялу.

Топ'м чином, у резулыат! досл1д1в по мутагенезу т« поетупов1й сэл&кп' ! F'j.yoy каргопл! вШСрали G клон!в, J з якпх у 2, 5 розн crJRulnt до д!1 герб!гиду у порШинш о кснтроче.м, 2 - у 5 раз!в, а г - г пони HI 1 ¡12 - V ьо раз1г.

3. Генотична т|)аяс-|оргац]я каргопл1.

L/i^'L^^r^l^'-bf'PiJJîîi—Il^LtK^,,^ îlJUOQTC!n.n.aç.jJ '.к.

uчл гпл1;.зннй jjpoicimcn« вгкорлогочували лиот.я УО-Лб дешшх Оссяйн каркя,;,'. Лрсгкр парЮали снуъкачк товщпною до ! мм 1 Ш;у-буеалн у «ириектШй сук1ш!. Чк осиотвк гикогистсзували 0. б И сахарозу з. 5 мН CaCÎ . У результат! проведения доол!Лв нШбраяи фермечт-ну 'ум1ы, при Бгкорхетанн'. яко1 отряиана максимальна К1лыс1сть житт-езлатвих протопласт^ coprlu Зарево, CBlianoK ки!вський 1 При? KjjibobKHñ paucjfi. Для цкх coprlc'оптимально") була сум Im: Cellulysin 0,8,?, ürHelas1? 0,2л 1 "lacerase 0,455.

Велите значения для культивування протопласт^ мае, к1льк1сть кч!тан у мл еередорпс;а. Е наших уновах онпташшн було 10s-to* кгНгин 'мл.

В егеперннешах по елеюгрогюрацН в. серёдньсиу виксристовувалм 10s Moaoih'LJib'.mx гротснласт1ь на один досл1д. Протеплаетн елегтропо-гузали в пол: р!зь-"1 папруги. так. да 50-0'Я в 1л Ix загадько! к1ль-KocTj. Згалийал'ися гатт&здатнгми. Прогспласти гультивуват.; на середо-Btwl W-S-S (Сидоров » íp. • 1&Ö5; ? 50 иг/л кч!пи11шчу. Через 3-й •Цедя елоктропорэцИ ьри лроведенШ в1зуальга!х егк сгсрежепь гогано-т'.пч, що К!,);ь!с1сть тггезцаяних протопласт!в не змешягчапь. aie ксд'л1в 1 педальшл'о уявороння колон 1й не 'епостерпалп.

КоисгрукцП рАС 350 1 рАС 35!, що HlCTurb мутаитт-е ген ацето-лакттпшт'зм араб].допе.ису порснопплп г A. tua«îecJem> штан CMRli" 'рмг ГО) ms годом прян-)! тронофорчааП. Для пЬтж.ерд+^ннл факту перенесения копетрукЩй У пезвакнгР и*аи агробактерй. з нього

ввд1ляли плазШдну ДНК, якою трансфпрмували Е. coll. за допойогою рестрикц1йного анал1зу 1 електрофорезу ДНК, вид1лено! 1з Е.coll, доведено наявнють консгрукц1й рАС 350 I рАС 351 в A. tumefaclens 1 ix 1дентичк1сть вих1дним.

Нами опробувано дек1лька методик трансформации клртопл1 за до-помогою A. tumefaclens.

При використанн1 методики Вензлер X. та 1шшх (Wenzler et. al., 1989) експлантати (сегмента стебла 1 листков1 диски проб1рочних рос-лин картопл1 сорт1в Луговський, Приекульський parmi й, Темп. Остара 1 Дез1рев) протягом 4 д1б витримували на оередовищ! WZA. пот1м на 10 хв занурювали у Шчну культуру (night culture) A. tume fac lens, п1сля чого переносили на те ж середовище. Через 3 доби навколо рослинних тканин утворввався легкий бектер1альний нал)т. Експлантати переносили на середовище того ж складу з додаванням 50 мг/л канам1цину 1 500 мг/л карбен1цил1ну. При культивуванн1 сегмент1в стебла 1 листкових диск1в досл!джуваних сорт1в калусогенезу не.спосТер1гали. Кр1н того, на експлантатах утворввалнся некрози. Через 4-5 тага! в п1сля 1ноку-лювання рослинн! ткашнш гинули. .

В li-ших досл1дах трансформац1ю проводили за методикою прискоре-hoï 1ндукц11 морфогенезу (Дмитриева. Негрук, 1990). Використовували сегменти стебла 1 jiuctkobI диски асептичних рослин картонл!. Експлантати помечали на середовище MC, що Шстить 2% сахарози. На повергаю зр1зу наносили каплю р1дко! культури A. tumefaclens. Експлантати 1нкубували у термостат1 протягом 24 годин. П1сля чого в!дмивали в1д ЗактерП у стерильней дистильованнШ вод! 1 пом1щалн на середовище зля калусогенезу (К) з 500 мг/л карбен1цил!ну. Через 3 доби весь ма-гер!ал переносили на середовище для регенерацП (И) з 50 мг/л ка-!ан1цину 1 500 мг/л карбен1цил1ну.

Через тиждень п1сля 1нф1кування у вс1х досл!джуваних сорт1в, :р1м Остара, спостер1гали початок, калусоутворення на раневих поверх-ях сегмент1в стебла. Найвища частота калусогенезу в1дзначек1 у орт1в Лез1рее 1 Темп - 67X сегмент1в стебел утворювали калус. Для орт1в Луговський 1 Приекульський ранн1й ця величина стэновила, -1дпов1дно, 50 1 32%. Варто в1дзначити, що ми не спостер1га.ли калу-оутворення' на листкових дисках.

При подальиому культивуванн!.сегмент1в стебла з калусами на се-эдови'щ! M з антибЮтиками лише 4% експ.лантат1в сорту Дез1рее 1 5%

сорту Луговський утворили зелен! регенерац1йн1 аони. Калуси з щшн д1лянками в!дд1ляли в1д експлантат1в 1. пом1щали на середовище того ж складу, але без канаШцину. Однак подальших регенераЩйних процес1в ми-не сностер!гали.

У серИ досл!д1в для трансформацП використовували зр!зи бульб copriB Св1танок ки!вський, Адретга ! Ласунок, а також отриманих in vitro MiKpo-бульО сорту Приекульський ранн1й. Трансформац!» проводили за методиков Аветисова В.А. (Аветисов и др.. 1991) шляхом !ноку-лвванкя зр!з1в н1чнои культурою A. tumefaclens. 1нф1кованн1 експлан-тати протагом 24 годин культпвували на середовиаЦ USD без ан-тиб1отик1в, a noTlM переносили на середовище того ж складу з 50 мг/л канам!цину 1 500 _мг/л карбен!цил1ну. Через 2 гиин1 на поверхШ зр!з1в вс1х сорт1в спостер!гали появу калусних колон!й. Ьарто в!дзначити, • що к1льк1сть. зр1з1в м1кро-бульб. як! утворили калус, б!лыи н!з; у 2 рази перевищувала к!льк!сть зр1з!в бульб 1з зонами ка-лусогенезу. Так. у сорту Приекульський раннШ 39,4% зр!з1в MiKpo-бульб утворили колонИ, а у сорт1в Адретта, Св!танок ки!вський 1 Ласунок цей показник в1дпов!дно становив 18,6%, 16% ! 14,8%. 0ск1льки умовн трансформацП були однаков1 для зр1з1в м!кро-бульб 1 .•бульб, то р1знкця у к1лькост1 зр!з!в, що утворили калусн! колонП, може бути пов'язана з ти.м, що бульби зазнали стерил1зацП, а де зменшило ïx здатн1сть до калусогенезу.

» Зр1зи з калусними колон1ями переносили на середовище для регенерат 1 MSZ, що м1стало 50 мг/л канам1цкну ! 500 мг/л карбен1цил!ну. Через 2 THKHl-y сорту Приекульський ранк!й отримали 17 регенерт1ь, як!'пересадили на середовище МС з канам1цином. У 1нших сорт1в регенерат ï не сгюстер1гали.

• Найб!лы11 ефективно трансформаЩя проходила при ьикористанн1 методики Де Блок M. (De Block, 1988) з нашими модиФ1 каЩями. Для транс-формацП використовували. листков! диски, сегменти стебла ! зр1зи м!кро-бульб сорт!в Луговський, Приекульський рашШТ Темп. Остара ! Дез1рее. Зг1дно з методикою п!сля дводобового кокультивуваннл з A. tumefaclens у р!дкому середовлщ S2, еухилантати в Шишам середо-вищем того ж складу з 1 мг/л карбенлпил1ну 1 помещали на середовище S3 з 50 мг/л канам!цину ! 500 мг/л карбен!цил!ну.. Однак при даних умовах кокультивування через 5-7 дав ночинався сильний бактер1аль-ний зар!ст. який було досить складно !нгибуьати. Зб!лыаоння вм!сту

карбен1цил!ну в середошщ1 до 1,5 иг/л хоча й припИчувало р!ст аг-робактерП, ало негативно впливало на експлангати - зростала к!льк!сть некроз1в. У зв'язку з ним, ни окоротили час кокультивуван-ня до 24 годин. Варто в1дзначити. то в данях досл1дах , концентрац1я : карбен1цил1ну в середовииЦ S3 500 мг/л повн1стю пригШчувала р1ст ■ A. tumefaciens. Протс, н! один експлантат не утворив зеленого ка- . наи1цинст1йкого калусу. Ни припили до висновку, що кокультивування протпгом доби недостатньо для трансФормацЯ картопл1. Тому в подаль-шому 1нокулювання проводили сл1дуючим чином: експлантати на 10 хв за-нурювали у н!чну культуру A. tumefaciens, a iiotIm 1х пом1щали на ага-ризоване середовище S2 i кульгивували протягом 2 д1б до появи Сак-тер1ального росту, л1сля чого експлантати без в1дяивання переносили на середовище S3 з кэнаШшнои 1 карбен1цил1ном. Через 3-6 тижн1в у bcíx coptíb на окрешх експлэнтатах спостер1гали утворення компакт-них калусЛв, що росли на середовиц1 з 50 мг/л канамШину. Н^обхШо в1дзначити. що при даних умовах кокультивування 1 селекцИ найвища частота калусоутворення в1дбувалася при використянн1 сегмент1в стебла. У вс1х сорт1в, кр1м Остара, на раневдх поверхнях експлантат1в цього типу формувавсл первинний калус, а у coprlB Темп 1 Луговський утворення калусу спостер!гали 1 на зр1зах лисгкових диск1в. Експлантати з калусон переносили на регенерац1йне середовище 35 з 50 мг/л канампмну 1 500 мг/л кэрбен1нил1ну. Через 3-4 тижн1 на окреиих ка-лусах вс 1х сорт1в спостер1гали утворення зелених регенерацШних д1лянок. TaKi калуси в1дд1ляли в1д експлантат1в 1 переносили на середовище S7 з 250 мг/л карбен1пил1ну, але без селективного Фактору -канам!цину. На середовищ! S7 отримали регенеранти сор'Пв Лугсвський, Остара 1 Дез1рее, як1 для подальшого вивчення розсадили на середовище МС з 50 мг/л канам1цину.

Таким чином, п1сля досл1д1в по трансформац11 картопл1 на 'середовищ! з 50 иг/л канам1цину отримали 13 регенеранПв сорту Луговсь-чий 1 15 - сорту Дез1рев при використанн1 сегменИв стебла, 4 реге-геранти сорту Луговський при використанШ лисгкових диск1в, 17 реге-1ерант1Б сорту Приекульський ранч!й 1 13 - сорту Остара при викорис-ганн1 зр1з1в м.1кро-бульб.

Доведения грансгенно! природя рослин-регенерант!в.

ОтримаШ регенеранти розсалжували на середовище МС з 50 иг/л :анам1цину - ня концентраШя антиб1отику повн1стю 1игибуе р1ст ! ко-

ренеутворення у контролышх рослин. У результат! проведених дослШв встановили, що огрнмаШ п1сля трансформацН м1кро-бульб регенеранти сорт1в Приекульський ранн1й 1 Остара не росли 1 не утворввали корен! на середовнщ! з канам1цином. тод1 як 7 л1н1й рослин (клони 3, 4, 5. 12, 13, 14 1 15) сорту Дез!рее 1 7 лШй (клони 2, 5, 6, 7, 15, 16 1 18) сорту Луговський, отриман! при використанн! сегмент1в стебла, а таком 4 л1нИ рослин (клони 46, 47, 52 1 53) сорту Луговський, реге-нерован1 л!сля трансформанii листкових диск!в, росли 1 формували ко-рен1 при концентрацП канам!цину 50 1 100 мг/л.

111сля перев1рки здатност1 вШбраних лШй до коренеутворення на середовш!((.зканам1цином провели тест на калусоутворення при кок-центрацП канамЩину 100 мг/л: надс!чен1 сегменти стебел ycix реге-нерант1в 1 контролю пом1щали на середовице SC10 для калусогенезу 1з 100 мг/л /канамЩину. Через 3-4 гижн! експлантати регенерант1в 7 л!н1й сорту Дез1рее 1 11 л1н!й сорту Луговський утворили калус, а експлантати регенерант1в сорт1в Приекульський ранн1й, Остара 1 кон-трольних рослин вибШлися, що св1дчить про чутлив!сть до антиб!оти-ку. .

0триман1 результата дозволяють зробити полередн1й висновок. що •в!дбулась 1нтеграц!я чужер!дних ген1в у геном рослин картопл! сорт1в Дез1рее 1 Луговський.

Анал1з ДНК рослин-регенерант1в ст1йких до канамШину п1дтвердив факт перенесения генетичних конструкций рАС 350 1 рАС 351, що несуть мутантний гея ацетолактатсинтази араб1допсису в геном цих рослин, а методом нозерн-г1бридизацП показана експрес1я ьведеного гену на р1вн1 транскрипц!

висновки

1. Найб1льш чугливою-до дП гербщиду pursuit у асептичних рослин картопл! яв'ляеться коренева система. По реакнП коренево! систе-мИ на препарат встановлена р!зна чуглив1сть доел!джуваниХ' сорт!в до гер61циду: найеицою толерантн!стю характеризуются сорти Зарево 1 Остара, найменшою - Приекульський ранн1й, а сорти Лорх, Луговський. Темп 1 Дез1рее займають пром!жне положения.

2. КонцентрацН гербЩиду класу 1м1дазол1нон1в, як1 нригн1чують р1ст корен!в, викликають в умовах In vitro дезорган!зац]ы морфогене-

" 10 ■

ay 1 появу морфолог!чно-аномальних рослин картопл!. •

3. Диференц1йован1 тканини картопл1 б1льш чутлнв1 до гербЩиду Pursuit н1ж недиферешийовс'н!. Шюмально-кришчна концеитраЩя гербЩиду для калусу картопл! у 8 раз1в вища тако! для Щло1 рослшш.

4. 3 допомогою мутагенезу 1 подалыио! селекцП в1д!брано рос-лини картопл!, ст1йк1 до д11 гербЩиду Pursuit. При вегетативному розмноженн! них рослин In vitro (черенкуванням 1 м!кро-оульбами) ст1йк!сть до гербЩиду збер1гаетьоя.

5. Отримано калусн! клони кар-гопл1 у 50 раз!в ст1йк1ш1 до гербЩиду Pursuit. н1ж контроль. Ц1 клони иояуть бути викориетан1 для створення стгйких до 1м1дазол1нсн1в Ферм рослин методом злнпя 1зольованих протоиластЩ.

6. П1д1брано умови перенесения чужор1дних геШв / рослшш картопл! шляхом агробактер1ально1 1нфекц11 рослишюг тканини. Иаишща ефективн!сть трансфорнацИ слостер1гавться при оикористаин! сегментов стебла асентичних рослин картопл!.

7. Результата блоттинг-ПбридизацП за Оаузером свЩчать про ¡нтегращю генетичних конструкц1й рдс 350 1 рАС .351 у геном рослин картопл! coprlB Дез1рее 1 Луговсышй. Методом И1К-Д11К-г1бршшзацП показана експрес!я введеного гену на р1вн! транскрпнцИ.

8. Рослини. отрнман! в результат! трансформацп машъ характеры! фенотипн! ознаки вихЩних сорт!в. СтнШсть зберЩаетьс^ при вегетативному розмножыш1 In vi его.

9. Отриман1 рослини-трансформантн можуть бути ьикористан! в се -лекц1йному процесi як донори ст!йкост1 до гербЩид1в класу 1н1да-золЩони.

По матер 1алах дисертацП онубл1кован1 олЩуюч! роботи:

Л. Кравець 0.0., Капля A.B.. Погребняк Н.я. Вивчення in vitro ст1йкоот1 р1зних сорт1в картопл! до гербЩиду // В1сник КиЩоького уШверситету. - 1992. - Нб. - Стер 30-33.

2. Погребняк Н. Я.. Кравец O.A., Шиша E.H., Глеба Ю.Ю. Получение клеточных линий и растений картофеля, устойчивых к действию гербицида // Цитология и генетика. - 1992. - Т. 26, М?.. - Стр. 50 55.

3. Кравец O.A., Погребняк Н. Я., Шиша Е. II., Лона то C.B.. Г неба

<Е

В. Ю. Трансформация картофеля с лакмщя конструкций, содержащих иу-тантанй ген ацото.пактзтсинтазч ерабидопсиса.// Биополимеры и клетка.

- 199?. - Т. 8, N6. - Стр. 47-52. " '

4. Сторол'онко C.B., Кравеп O.A., Погребияк Н.Я., Глеба D.D. Получение трансгенных растении картофеля, экспрессирующих мутантный ген ацетплактатсинтази AraUldopsls tliallaiia // Биополимеры и клетка.

- 1994. - Т. 10, N1. - приГшяго по друку.

7i;iîHT3,I9.!3, ком.543, тир, [20