Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПОЛУЧЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ МИЦЕЛЛЯРНЫХ ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ КЛИНДАМИЦИНА

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "ПОЛУЧЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ МИЦЕЛЛЯРНЫХ ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ КЛИНДАМИЦИНА"

На правах рукописи

ЧУМАКОВ ЕВГЕНИЙ МИХАЙЛОВИЧ

ПОЛУЧЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ МИЦЕЛЛЯРНЫХ ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ КЛИНДАМИЦИНА

03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 2006

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН и в ЗАО «НИТА-ФАРМ», г. Саратов

Научный руководитель:

доктор физико-математических наук, профессор Хлебцов Николай Григорьевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Щеголев Сергей Юрьевич кандидат биологических наук, Козулин Сергей Владимирович

Ведущая организация: Саратовский государственный аграрный университет им, Н.И. Вавилова

Защита диссертации состоится "27" декабря 2006 г. в 13м на заседании диссертационного совета Д002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, по адресу: 410049, г. Саратов, проспект Энтузиастов 13, актовый зал ИБФРМ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ИБФРМ РАН Автореферат диссертации размещен на сайте Ь«рг//\у\1«уЛЬррт. зашоу ги/оЬуауjiis.htm 1

Автореферат разослан " (30" ноября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы В последние годы стало очевидно, что химический синтез не в полной мере удовлетворяет потребностям общества в новых лекарственных препаратах <ЛП). Недостатками многих новых эффективных ЛП является плохая растворимость в воде, малое время циркуляции, низкая биодоступность н общая высокая токсичность. Одним из решений этих проблем является использование в качестве носителей ЛП корпускулярных структур микро- и манометрового размера. При этом к подобным структурам предъявляются жесткие требования, такие как низкая токсичность, хорошая емкость по отношению к ЛП, способность к направленному транспорту, контролируемое высвобождение ЛП в зоне мишени, химическая и физическая стабильность при хранении (как дня ЛП, так и для самого носителя), а также приемлемая цена, сопоставимая с аналогичными препаратами, не имеющими корпускулярного носителя. Выбор мицелл в качестве объекта исследования в нашем случае был обусловлен тем, что на первом месте по перспективности использования в качестве носителей ЛП стоят системы нанометрового размера. Было доказано, что они способны повышать растворимость, и биодоступность плохо растворимых ЛП [Amidon et al., 1995; Lôbenberg and Amidon, 2000; Dressman and Reppas, 2000]. В качестве исследуемой лекарственной субстанции был выбран клиндамицин, являющийся антибиотиком широкого спектра действия. В частности, клиндамицин активен в отношении грамположительных кокков. (стафилококков, стрептококков, за исключением энтерококков), некоторых грамположительных бактерий (кл остр иди и, сибиреязвенные микробы), нес порообразующих анаэробов (бактериоиды, фузобактерии) и микоплазм. Клиндамицин хлорид хорошо растворим в воде, так что после внутривенного или внутримышечного введения большее количество препарата остается во внеклеточном пространстве. Однако внутриклеточные инфекции часто не поддаются обычной антимикробной терапии, так как для их подавления требуется повышение концентрации антибиотика внутри клетки. Поэтому многие антибиотики, включая клиндамицин, показывая хорошую антибактериальную активность in vitro, имеют низкую активность против внутриклеточных бактерий in vivo из-за плохого проникновения в клетки или вследствие инактивации лизосомальными энзимами [Kumana and Yuen, 1994]. Разработка новых антибактериальных форм препарата, имеющего в своем составе носитель нанометрового размера и плохо растворимую в воде модификацию клиндамицина, могла бы расширить диапазон действия антибиотика и улучшить его терапевтическую активность.

Имеются данные по инкапсулированию клиндамицина в липосомы [Fierer et al., 1990; Swenson et al., 1990], Было доказано, что включение клиндамицина в состав липосомального носителя улучшает его фармакохинетические свойства. Однако к началу диссертационных исследований не было достоверных данных по мицеллярным формам данного

мицеллярной формы препарата очевидны, поскольку размер мицелл, как правило, существенно меньше, чем размер л штосом применяемых для инкапсуляции клиндамицина [Lutwyche et al., 1998; Schiffeíers et al.» 2001]. Можно предположить, что включение лекарственных препаратов в мицеллы способно повысить химическую и физическую стабильность композиций из нескольких плохо растворимых в воде антибиотиков при хранении. Кроме того, можно ожидать повышения терапевтической эффективности мицелпярного препарата, поскольку, с одной стороны, ЛП в мицелле будет защищен от действия неблагоприятных факторов, а с другой стороны мицеллярпая структура допускает более длительную циркуляцию в кровотоке для токсичного ЛП без превышения допустимой концентрации в организме. Наконец, мицеллы хорошо подходят как переносчики лекарственных препаратов и с точки зрения размера, поскольку мелкие сосуды имеют предел дня проходимости частиц в несколько сот нанометров.

Целью диссертационной работы являлось получение стабильных мииеллярных композиций на основе малорастворимой в воде соли клиндамицина бензоага, исследование роста бактериальных культур с различной родовой принадлежностью на средах содержащих мицеллярную и немицеллярную формы лекарственного препарата на основе клиндамицина в условиях in vitro, и сравнительное исследование мицеллярного и немицеллярного препаратов in viva.

Задачи исследования:

1. Синтезировать нерастворимую в воде соль клидашгщша бензоат (ClindBz),

2. Создать на базе синтезированной соли стабильные во времени мицеллярные композиции, в том числе содержащие комбинацию антибиотиков клиндамицина и гейтам ицина.

3. Провести оценку антибактериальной эффективности полученных композиций в сравнении с препаратом на основе растворимой в воде соли клиндамицина in vitro.

4. Провести оценку фармакокинетической эффективности полученных композиций в сравнении с препаратом на основе растворимой в воде соли клиндамицина при лечении заболеваний крупного рогатого скота.

Научная новизна работы;

1. Синтезирована модифицированная форма лекарственной субстанции (ClindBz), исследованы ее физико-химические свойства и оптимизирован процесс синтеза дня получения максимального выхода конечного продукта. Модифицированная субстанция вместе с гентамшшном использована для получения новой мицеллярной ветеринарной композиции «Гентамакс М» с широким спектром антимикробного действия.

2. Показано, что рост культуры Sarcrna (Micrococcus) luteus не зависит от размера мицелл (в диапазоне 6-20 нм) в препарате «Гентамакс М».

3. Доказано, что минеллярный препарат j." «Гентамакс М» на основе плохорастворнмой в воде соли ClindBz после внутримышечного введения удерживается в крови телят примерно в два раза дольше, чем препарат ка основе водорастворимого ClindHCl.

4. Показано, <по потенциальная повышенная терапевтическая эффективность препарата «Гентамакс М» может быть обусловлена только улучшенной фармакокинетикой и биодоступностью, а не прямым антимикробным действием.

Научно-практическая значимость работы;

Создана эффективная оригинальная мицеллярная лекарственная композиция «Гентамакс М», содержащая ClindBz и гентамицина сульфат с широким спектром антимикробного действия. Разработан лабораторный регламент получения модифицированной лекарственной субстанции ClindBz с целью последующей адаптации регламента к условиям производства. Препарат «Гентамакс М» планируется к производству на базе ЗАО «Нкта-Фарм».

Достоверность научных результатов подтверждается воспроизводимостью экспериментальных данных, а также клиническими испытаниями, проводимыми в ЗАО «Нита-Фарм».

На зашиту выносятся следующие результаты и положения:

• В диапазоне концентраций ПАВ Cremafor-EL и сорастворителя ДМА от 0 до 15% температура точки помутнения не зависит от состава смеси, а температура абсолютной нестабильности возрастает с увеличением концентрации ДМА. Средний размер мицелл зависит от типа применяемого ПАВ и состава композиции.

• Мииеллярные композиции, содержащие не более 5% ПАВ Cremafor-EL, 20% сорастворителя Solufor, 4% гентамицина сульфата и 11% ClindBz являются стабильными не менее 1 года. При использовании сорастворителя ДМА (10%), стабильные композиции могут содержать до 10-15% ПАВ Cremafor-EL и 11% ClindBz.

• Размеры зон задержки роста бактериальной культуры Sarcina luteus в присутствии мицеллярных композиций ка основе CtindBz не зависят от размера мицелл в диапазоне 6-20 нм.

• Мицелл яркая композиция на основе ClindBz действует на грамположительные бактериальные культуры Bacillus subtilis сходным образом с иемицеллярной композицией, содержащей растворимую в воде соль клиндамицина ClindHCl.

• Бактерицидные для Sarcina luteus концентрации препарата «Гентамакс М» на основе ClindBz регистрируются в плазме крови здоровых и больных телят дольше по сравнению с препаратом «Гентамакс» на основе ClindHCl.

Личный вклад диссертанта и результаты, полученные совместно с другими исследователями:

Личный вклад соискателя состоит в получении модифицированного лекарственного вещества ClindBz, оптимизации его синтеза, создании оригинальное композиции, исследовании ее физико-химических свойств, проведении экспериментов и интерпретации полученных данных. Турбидиметрический анализ антимикробного действия препаратов и опыты на установке динамического рассеяния света выполнены совместно с к,ф-.м,н. Хлебцовым Б.Н. Опыты по определению бактериостатнческнх концентраций «Гентамакс М» и анализу образцов крови выполнены совместно с лаб. Ивановой И.Б. Планирование экспериментов и обсуждение результатов проводились под руководством д.б.н. Чумакова М.И. и д.ф.-м.н Хлебцова Н.Г. Опыты по определению сравнительной эффективности «Гентамакс М» и «Гентамакс» на животных в условиях фермы проведены с участием Семенова C.B. и Улизко М. (ЗАО «Нита-Фарм»),

Гранты. Данное исследование поддерживалось грантом Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере «Регнон-наука-бизнес», проект 1972р/3794 2003-2004 гг. «Разработка опытных образцов и создание технологии получения новых форм ветеринарных лекарственных средств с повышенной активностью».

Работа выполнена в Лаборатории агробактериальной трансформации и биотехнологий и в Лаборатории биосенсоров на основе наноразмерных структур ИЕФРМ РАН в рамках плановых госбюджетных тем НИР. Часть исследований проведена в научно-исследовательском отделе ЗАО «НИТА-ФАРМ».

Апробация результатов: Результаты диссертации представлялись на следующих научных конференциях:

1) Международная конференция физико-хшшческого анализа жидкофазных систем Саратов, 30 июня - 4 июля 2003 г.

2) IV Всероссийская конференция молодых ученых Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии 23- 25 июня 2003 г. Саратов.

3) Saratov Fall Meettmg Optical Tecnologies in Biophysics and Medicine, Oct.7-10, 2003.

4) Structure and dynamics of Polymer and Colloidal Systems. Giens, France, 10-15 Sept 2004.

Публикации: По теме диссертации опубликованы 3 статьи, из них 2 в рецензируемых журналах и одна в зарубежном сборнике, и 4 тезисов.

Структура н объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 123 страницах машинописного текста, содержит 25 рисунков, 24 таблицы, состоит из введения, литературного обзора, 3-х глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы из 163 источников.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введении обоснована актуальность темы работы и научно-практическое значение мицеллярных форм лекарственных препаратов.

Глава I диссертации посвящена анализу литературных данных ло теме диссертации. Проведен анализ проблем повышения эффективности лекарственных препаратов (ЛП), а также рассмотрены различные носители манометрового диапазона и мишени, на которые может быть направлено воздействие наночастиц. На основе анализа литературы в конце главы сформулированы задачи исследования.

Глава 2 посвящена описанию материалов и методов, применяемых при проведении исследований, а также изучению модельных мииелпярных растворов с определением размера мицелл и различных физико-химических свойств системы в целом. Для изучения мицеллярных растворов нами был использован метод динамического рассеяния света (ДРС) [Berne and Pécora, 2002}.

Установка для реализации метода ДЛС была протестирована с использованием стандартных образцов латексных субмикронных единиц со средними паспортными электронно-микроскопическими размерами частиц 65, 100, 137, 230, 370, 840 нм (ВНИИ синтетического каучука, Россия) и золи золота со средним размером частиц 15, 20, 25, 30 и 35 нм, полученные в ИБФРМ РАН Богатыревым В.А. Описаны микробиологические и физико-химические методики, использованные в диссертации. Основное внимание уделено оценке антимикробного действия в зависимости от концентрации клиндамицина с помощью методов диффузии в агар и турбидиметр и и, а также оценке антибиогикоустойчивости бактерий по отношению к различным формам клиндамицина.

2.1. Получение ClindBz. Дня получения максимального выхода ClindBz варьировали условия приготовления сопи (pH, порядок смешивания, молярное соотношение реагентов) в ходе реакции замещения между ClindHCl и NaBz. Влияние различных факторов на полноту протекания реакций отражено в Таблице 1. Полученная в результате реакции субстанция ClindBz представляет собой мелкие кристаллы или порошок белого цвета, хорошо растворяющийся в

органических растворителях (ДМА, транскутол, 5о1иГог) и плохо растворяющийся в воде (6.1%),

Таблица I. Влияние соотношения реагентов на конечный выход С1ш(Ш2._

Ха С1ЫНС1 Моль NaBz моль рн воды рн ClindHCI рН NaBz РН р-ра Масса осадка, г Выход %

1 1 0.5 6.0 3.7 7.9 6.0 26.9 46.3

2 1 1 6.0 3.7 7.9 6.03 39.0 71.0

3 1 1.5 6.0 3.7 7.9 63 43.9 80.0

Для физико-химической характеристики многокомпонентных растворов (ПАВ+сорастворитель+вода) измеряли критические концентрации мицеллообразования (ККМ) ПАВ, а также точки помутнения (7^) и температуры абсолютной нестабильности Тг (ТАН) растворов методом светорассеяния. Измерения проводили на установке динамического рассеяния света для тройных систем ПАВ (Cremafor-EL^t-диметилацетамид (ДМА)+вода. Значения ККМ определяли по резкому изменению интенсивности рассеянного света, ТАН определяли методом экстраполяции обратной интенсивности к нулевому значению (Кленин, 1995). Полученные значения ККМ лежали в диапазоне концентраций ПАВ от 0.015% до 0.025 %. Наблюдалась слабая зависимость ККМ от метода приготовления исследуемого раствора.

Эксперименты по определению температур Тс и Tt были выполнены для тройной системы с процентным содержанием компонентов: Cremafor-EL — 5; 10; 15% , ДМА - 0; 7,5; 15% и вода - до 100%. При изменении концентрации ПАВ и сорастворителя в диапазоне 0-15% для сорастворителя и 5-15% для ПАВ не наблюдалось заметное изменение точки помутнения системы вода+ПАВ+сорастворнтель. Температура абсолютной нестабильности увеличивалась при увеличении концентрации в системе сорастворителя. Отсюда можно сделать вывод, что введение в раствор сорастворителя не только позволяет увеличить растворимость вещества, но и придает системе определенную температурную стабильность (Таблица 2).

Таблица 2. Точки помутнения и температуры абсолютной нестабильности (ТАН) для системы СгешаГог-ЕЬ+вода+ДМА, полученные оптическим методам

ДМА % Точки помутнения ТАН

Cremafor-EL, % Cremafor-EL, %

5 10 15 5 10 15

0 60 59 58 75 74 76

7.5 59 58 59 89 89 84

15 59 58 58 95 95 98

2.2. Получение стабильных мицеллярных композиций на основе СИпйВг

Одной то основных задач исследования являлось получение стабильных мицеллярных композиций, содержащих комбинацию антибиотиков против широкого круга микроорганизмов (клиндамнцнн (С1тсШг) и гентамицин сульфат (ОепЙ», Клиндамицина бензоат имеет очень низкую растворимость в воде, поэтому именно он оказывает решающее влияние на стабильность композиции. Испытывались композиции с минимальной растворяющей концентрацией 8о1иГог и варьированным содержанием Сгешайг-ЕЬ. Была определена минимальная стабилизирующая концентрация ПАВ при использовании минимальной растворяющей концентрации 5о1иРог (Таблица 3).

Таблица 3. Испытание мицеллярных композиций на временную стабильность.

№ ClindBz GentS Soiufor Cremafor-EL BzOH Вода Стабильность

(Н) (%) (%) (%) (%) (%) Композиции

1 8 4 20 20 I 47 -

2 8 4 20 15 1 52 -

3 S 4 20 10 1 57 -

4 И 4 20 20 1 44 -

5 11 4 20 15 1 49 -

6 11 4 20 10 I 54 -

7* 11 4 20 5 1 59 +

8* 11 4 20 0 1 64 +

9 15 4 20 20 1 45 -

10 15 4 20 15 1 50 1

Примечание; Независимую проверку стабильности образцов 7 и 8 проводили дважды. Образцы сохраняли стабильность за наблюдаемый период (I год).

Таким образом, оптимальная концентрация Soiufor для стабильных композиций равна 20 %, а количество ПАВ Cremafor-EL, необходимое для образования стабильного мкцеллярного раствора, не должно превышать 5%.

Для оценки зависимости размера мицелл от состава композиции были проведены опыты с использованием композиций, представленных в Таблице 4.

Таблица 4. Состав композиций с различным размером мицелл.

№ Клиндамнцнн, Gent Soiufor ПАВ, BzOH, Вода,

% % % % % %

1 ClindBz - 11 4 20 Cremafor-EL — 5 1 59

2 ClindHCl -10 4 0 Cremafor-EL — 5 0 81

3 CtindBz -11 4 20 Tween 20-5 0 60

4 ClindHCl -10 4 0 Tween 20 — 5 0 SI

5 ClindHCl -10 4 20 0 1 75

Гидродинамический диаметр, ни

Рнс. 1. Распределения мицелл по размерам для четырех композиций, представленных & таблице 4. Номера кривых соответствуют номерам композиция в таблице 4.

С! ¡тШС1+Сгета1ог-ЕЬ СМп<Шг+СгетаЛ)г-1

Целью данных исследований было определение зависимости размера мицелл от длины цепи мицеллообразующего ПАВ и от растворимости соли клиндам ицина, включенной в состав композиции. Распределения мицелл по размерам были измерены методом динамического светорассеяния.

Полученные распределения для четырех образцов (Таблица 4) представлены на рис. 1.

Согласно рис. 1, средний размер мицелл в исходных образцах препаратов 1-4 составлял: 20 (1), 15 (2), 9 3) и б нм (4), соответственно. При этом средний размер мицелл увеличивается от б до 20 нм в ряду: СНпёНа + Ту/ееп 20, С1ЫВг +Тугееп 20,

Значения б и 15 нм можно интерпретировать как средний размер мицелл, образованных ПАВ с различными длинами углеводородной цепи в гидрофобной части мицелл в отсутствии солюбилизации действующего вещества. Изменение размера мицелл для водорастворимой и плохо растворимой солей клиндамицина, использованных в композиции, наблюдалось при использовании в качестве ПАВ как Тл-ееп20 (от 6 до 10 нм), так и СгешаЛзг-ЕЬ (от 15 до 22 нм). Этот результат качественно свидетельствует о солюбилизации клиндамицина бензоата использованными в эксперименте ПАВ и включении его в гидрофобное ядро мицеллы. Следует иметь в виду, что приведенные цифры для средних размеров мицелл не являются абсолютными, поскольку получены без учета вязкости образцов. Однако отношения средних размеров в образцах можно считать довольно надежными, поскольку они близки к отношению непосредственно измеряемых средних коэффициентов трансляционной диффузии мицелл.

2.3. Сравнение бактерицидного действия композиций, содержащих мицеллы различного размера.

На рнс. 2 представлен пример определения зон задержки роста бактерий \uteus в зависимости от размера мицелл. Измерения выполнены методом диффузии в агар препаратов, описанных в Таблице 4. Цифры на рисунке соответствуют номерам композиций из Таблицы 4, Данные по зонам задержек роста бактерий после воздействия композиций представлены в Таблице 5.

Таблица 5. Размер зон полной задержки роста культуры & ¡шеиз для различных форм препаратов при концентрации солей клиндамицииа 10 м кг/мл и 1<ентамицина 4 мкг/мл в композициях

Форма препарата Средний измеренный размер мицелл (нм) Размер зоны полной задержки роста (мм)*

СНпйВг + Тлуееп 20 9 29

С1ЫНС1 + Т\уееп20 б 29

С1ш<Шг+ Сгета(Ьг-Е1* 20 26

С1ш(ШС1 + Сгетай>г-ЕЬ 15 28

Примечание: "Приведены средние арифметические значения (за вычетом диаметра лунки) по данным двух независимых экспериментов.

Как видно из таблицы 5 средний размер зоны задержки практически не изменялся и варьировал от 26 до 29 мм. Необходимо заметить, что при значительном разведении исходных композиций, содержащих 10-11% соли клиндамицииа и 4% соли гентамнцина в 1000-10000 раз до концентраций, которые являются бактерицидными и удобными при измерении зон, мы получаем концентрации ПАВ гораздо ниже ККМ. Поэтому, чтобы корректно судить о влиянии именно мицеллярных форм клиндамицииа, необходимо использовать концентрации

антибиотика в пределах 0.1-10 мкг/мл, при этом концентрации ПАВ должна быть выше ККМ.

Чтобы учесть указанные факторы, были приготовлены 4 препарата следующего состава:

1) С1т|ЩС1+Т\уееп20+5о1и Л>г; 2) С1шШ 1С1+СгетаРэг-ЕЬ+5о1ий>г; 3) С1тйВг+Т\уееп гО+БоЫог; 4) С1 ¡гкЗВг+Сгеша Рог-Е 1>5о1иГог. В первом и втором препаратах концентрация антибиотика равнялась 10 мкг/мл, а в третьем и четвертом - 1 мкг/мл. Концентрация ПАВ во всех опытах была равна 5%, а концентрация $о1и&>г - 20%.

Было установлено, что средние размеры зон задержки роста бактерий 1шеи$ для обеих концентраций антибиотика практически не зависят от состава композиции и равняются 24-26 мм для первой (10 мкг/мл) и 8-9 мм для второй (1 мкг/мл) концентраций, соответственно.

Рис. 2. Бактерицидное действие мицеллярных композиций на бактерии £ !и1еш.

1- СПпсШг+СгетаГог-ЕЬ;

2-С1т(ШС1+Тшссп20

3-С1ЫВг+Т\уееп 20,

4-СНп«ЗНС1+СгетаГог-ЕЬ.

Глава 4 посвящена исследованию бактерицидной и фармакокинетической эффективности полученной композиции, а также сравнению эффективности воздействия мицеллярного («Гентамакс М») и немицеллярного («Гентамакс») препаратов при лечении заболеваний телят.

Проблема эффективности мнцеллярных форм лекарственных субстанций имеет несколько аспектов. Кроме повышения эффективности прямого бактериостатического или бактерицидного действия, большое значеш!е имеет фармакокинетика препарата, его биодоступность, побочная токсичность, распределение в различных органах и тканях и т.д. Кроме того, имеются также потенциальные возможности повышения прямой антимикробной активности препаратов за счет изменения размера мицелл или типа ПАВ. Однако имеющиеся литературные данные по зависимости антимикробного действия от формы препарата (ми целляр ная-нем нцеллярная) крайне ограничены и противоречивы. Опубликованы тайные как по наличию синергетического действия лекарственной субстанции и ПАВ (Ved et a.l., 1990), так и по отсутствию эффектов такого типа (Сафарова и др. 2000).

Для анализа чувствительности Bacillus subtílis к действию различных форм клшшамицииа по методу диффузии в агар была проведена серия экспериментов, в которых сравнивалось действие двух солей ют гидам ицина (ClindBz и ClindHCl) в случае чисто водного раствора и при добавлении ПАВ (Cremafor-EL). В одном из опытов также нспытывалось действие композиции с добавлением сорастворитеяя (Solufor) в максимальной концентрации, которая могла бы реализоваться в опытах по диффузии в агар. Состав композиций, использованных в данном опыте, представлен в Таблице б, а результаты для зон задержки роста культур представлены в Таблице 7. Как и в Таблице 5, размеры зон задержки роста культуры приведены за вычетом диаметра лунки.

Таблица 6. Состав композиций в эксперименте по сравнению биологической активности солей клиндамицина на бактериальной культуре В. subtilus

Соль клиндамицина, Гектамшшна Solufor, Cremafor-EL,

мг/мл сульфат, % %

мг/мл

1 ClindHCl-U 0.4 0 0

2 ClindHCl- 1.1 0.4 0 0.1

3 ClindBz-1.1 0.4 0 1

4 ClindBz-1.1 0.4 0 0

5 ClindBz-1Л 0.4 2 0

6 ClindBz-1.1 0.4 0 0.1

Таблица 7. Размер зон задержки роста бактерий В. зиЬШиз при действии различных форм клиндамишша__

Номер преоарата (из таблицы 6} Диаметр зон задержки роста, мм

1 35

2 37

3 35

4 37

5 37

б 41

Из полученных данных следует, что действие различных форм клиндамицина в присутствии ПАВ иди сорастворнтеля мало сказывается на антибнотикочувствитсльности грамположительных бактерий В. зиЬШиз. Кроме того, эти эксперименты выявили существенную нелинейность зависимости размеров зон задержки роста бактериальной культуры от концентрации препарата, введенного в лунку. Эта нелинейность является характерной чертой диффузионного метода и может быть только уменьшена (но не устранена вовсе) за счет оптимизации условий эксперимента (диаметра лунки, толщины и плотности ашра, концентрации посевной дозы, диапазона концентраций препарата и т.п.).

Для получения более полных данных о бактерицидном действии полученного препарата исследовали бактерицидное действие препарата «Гонга макс М» методом определения аптибнотикочувсгвительности бактерий, поскольку метод диффузии в агар имеет свои ограничения по чувствительности примерно в диапазоне 0.3-0.5 мкг/мл для сарцин и I мкг/мл для бацилл. Пример результатов эксперимента представлен на рис. 3.

«Гентамакс М» Контроль

Рис. 3. Подавление роста бактериальной культуры £ 1шеиз на среде 01Рсо-5, содержащей «Гентамакс М». Для левой чашки Петри концентрация СИпйВг в агаре равна 0.05 мкг/мл. Справа показан контроль без антибиотика в срсдс.

Как видно из рис. 3, в контроле высеялось около 400 КОЕ (из седьмого десятикратного разведения исходной суспензии, посевная доза порядка 0.5х103 кл/мл), а на среде, содержащей 0.05 мкг/мл СНпсШг, рост отсутствовал полностью даже при увеличении концентрации бактерий в среде на два порядка (5-ое разведение, посевная доза порядка 0.5x10* кл/мл). На основе этого эксперимента можно заключить, что ингнбирующис (бактериостатические) для 5. 1и1еиз концентрации СГшсШг в препарате «Гентамакс М» по методу оценки антибиотикочувствительности бактерий находятся ниже 0.05 мкг/мл, при посевной дозе 5х( 103-101) кл/мл.

Для определения нижних пороговых значений бактериостатических концентраций, а также для сравнительной оценки действия препаратов «Гентамакс» и «Гентамакс М» на рост бактериальной культуры был проведен ряд опытов с использованием метода турбиднметрии. В Таблице К приведены данные одного из типичных экспериментов по влиянию препаратов «Гентамакс» и «Гентамакс-М» на рост бактериальной культуры Ж Шеш.

Таблица 8. Зависимость оптической плотности /f,w(f =*I80min) в 1,0 см кювете для суспензии S. luteus от концентрации препаратов «Гентамакс» и «Гентамакс М>>

Концентрация антибиотика (мкг/мл) ОД 0.1 0.05 0.025 0.012 0.006 0

«Гентамакс» 1 не встр* 0.12 0.14 0.17 0.17 0.24 0.27 0.34

| встрях. 0.19 0.21 0.22 0.21 0.29 0.31 0.38

«Гентамакс М» не встр. 0Л5 0.18 0.16 0.22 0.24 0.30 0.21

| встрях. 0.22 0.22 0.22 0.30 0.32 0.30 0.28

♦Примечание: приведены значения огггичееккх плотностей суспензий после интенсивного встряхивания пробирки и без встряхивания. Результаты отличаются нз-за агрегации клеток. Каждая строка усреднена по двум опытам. Посевная доза равна 5 х 10' кл/мл, время культивирования - 180 мин.

Из Таблицы 8 и рис. 4 следует, что турбидиметрический метод позволяет детектировать концентрации антибиотиков в системе в диапазоне 0.010.1 мкг/мл, которые не регистрируются методом диффузии в агар. Хотя турбшшметрические кривые роста качественно характеризуют эффективность подавления роста культуры данным препаратом, для количественной оценки oim мало пригодны. Для количественной сравнительной оценки действия препаратов на рост бактериальной культуры при существенно различных посевных дозах в опыте, что моделирует различную концентрацию патогена в организме, мы предлагаем использовать следующий параметр:

л™ _ л" лх лл

где: X - используемая длина волны, /-время культивирования (в наших опытах / = 120-180 мин), Ах - оптическая плотность суспензии с антибиотиком. А™ ~ максимальная оптическая плотность популяции при нулевой концентрации антибиотика (положительный контроль) А° - минимальная оптическая плотность негативного контроля, соответствующая посевной дозе в случае использовании формалина. Параметр Ек характеризует эффективность подавления роста бактерий данным препаратом в течение времени опыта. Чем больше параметр Ех, тем выше эффективность препарата как ингибитора роста бактерий.

На рис. 4 показано сравнение двух препаратов в терминах введенного нами параметра эффективности Е)Ю. Следует иметь в виду, что при одинаковых разведениях

препарат «Гентамакс» содержал большее количество

действующего вещества

примерно на 10%, по сравнению с «Гентамакс М». Возможно, именно этим объясняется несколько большая

эффективность «Гентамакс» на графиках рис. 4 и в Таблице 8. Различие в концентрациях двух сравниваемых препаратов можно учесть, умножив формулу (1) на отношение соответствующих молекулярных весов. С учетом такой коррекции можно считать, что рис. 4 демонстрирует примерно одинаковую антимикробную эффективность препаратов.

Дальнейшей целью работы было определение терапевтической эффективности мицеллярного («Гентамакс М») и немицеллярного («Гентамакс») препаратов при их введении больным и здоровым животным.

Для сравнения длительности циркуляции препаратов «(Гентамакс» н «Гентамакс М» в крови здоровых животных было сформировано две группы здоровых телят 4-х месячного возраста, по 3 животных примерно одинакового веса в каждой группе: группа 1*3 (вводился препарат «Гентамакс М») и группа

-0.2

0.001

1.000

0.010 0.100 Концентрация цг/мл

Рис. 4. Зависимость параметра эффективности от концентрации препаратов «Гентамакс» и «Гентамахс-М». Стрелками показана область бактсриостатических концентраций (0.02-0.05 м кг/мл), подавляющих рост культуры в течение опыта. Среднйквадрагические отклонения рассчитаны по б опытам.

3-6 (вводился препарат «Гентамакс»). Препараты вводились в расчете 1 мл водных и мицелл яр ных композиций на 10 кг массы тепа опытного животного. Отбор образцов крови осуществлялся из трех различных мест кровотока (3 повторносш на один тип препарата) через 2, 4, б. 8, 24 и 36 часов после введения.

Рис. 5. Зоны полной задержки роста 1шеиз после внесения в лупки образцов плазмы крови здоровых телят. Отбор проб через б часов после введения препаратов «Гентамакс М» (верхняя половина чашки) и «Гентамакс» (нижняя половина чашки). Обозначения: 0, 2, 4, 6 (на чашке) — время (часы) после введения препаратов «Гентамакс М» и «Гентамакс»; 1 и 4- номер животного.

На рис. 5 представлен типичный результат действия различных форм препарата «Гентамакс» (мнцеллярного и немицеллярного) из отобранных проб крови на рост 5. Как видно из рис. 5 максимальная концентрация

водного и мнцеллярного препаратов регистрируется в плазме крови у телят через два часа после введения. Концентрация препарата «Гентамакс М» в крови (в терминах зоны задержки роста бактерий) существенно выше по сравнению с препаратом, имеющим в составе водорастворимую форму клиндамишна. Кроме того, «Гентамакс М» держится в крови телят дольше, по сравнению с препаратом «Гентамакс» (Таблица 9).

Из Таблицы 9 видно, что бактерицидное действие мнцеллярного препарата, определенное методом диффузии в агар, регистрируется в крови здоровых телят через два часа в концентрациях в 1.5 раза более высоких, чем немицеллярного. К 4 часам после введения эта разница становится двукратной, а к б часам -трехкратной. Через 8 часов бактерицидные концентрации препарата «Гентамакс» не регистрируются методом диффузии в агар, в то время как концентрация мнцеллярного препарата «Гентамакс М» превышает бактерицидную (регистрируемую методом диффузии) на порядок и держится в плазме крови телят на 2 часа дольше. При этом необходимо отметить, что терапевтическая концентрация «Гентамакс М» в крови на протяжении всего

действия препарата наблюдается выше, чем при использовании немнцеллярного препарата «Гентамакс».

Таблица 9. Диаметр зон задержки роста £ \uteus после внесения в лунки образцов плазмы крови здоровых телят, отобранных после внутримышечного

№ группы Время отбора проб, час

0 2 4 б 8 24 36

1 группа («Гентамакс М») Средний диаметр зон задержки роста, мм 0 59.3 39.0 27.3 9.0 0 0

2 группа («Гентамакс») 0 42.6 24.3 8.6 0 0 0

Примечание: данные усреднены по 6 независимым измерениям методом диффузии в агар.

Для сравнения терапевтической эффективности препаратов «Гентамакс» и «Гентамакс М» на больных животных было сформировано три группы телят 4-х месячного возраста, по 4 животных в каждой группе, с диагнозом бронхопневмония. Диагноз ставили по результатам клинического обследования животных. При бронхопневмонии регистрировались следующие симптомы: умеренная лихорадка с повышением температуры тела до 40-41 °С (при норме 38.5-39.5 °С) кашель, слабая отдышка, мелкопузырчатые хрипы, угнетение общего состояния, слизистое истечение из носовых полостей, анерексия.

В целом терапевтическая эффективность препарата «Гентамакс М» (определяемая как процент выздоровевших животных) при бронхопневмонии телят составляла в среднем 93% с колебаниями от 86 до 100%. Клинические показатели организма животных (температура, пульс, дыхание) приходили в состояние физиологической нормы через 2-3 дня (в зависимости от вида заболевания и тяжести его течения), а симптомы заболевания исчезали через 35 дней после начала лечения. Причем эффективность препарата «Гентамакс М» оказалась на 6-8 % выше, чем у препарата сравнения «Гентамакс», при этом срок выздоровления уменьшается в среднем на 1 день. Это позволило снизить применяемую дозу и/или количество инъекций препарата.

Первой группе телят применяли «Гентамакс» в дозе 1 мл на 10 кг массы тела, два раза в день через 12 часов. Второй группе телят применяли «Гентамакс М» в той же дозе, один раз в день. Третьей группе телят применяли «Гентамакс М» в той же дозе два раза в день через 12 часов. Полученные в ходе исследований данные представлены в таблице 10.

Из данных, представленных в Таблице 10, следует, что мицелляркый препарат обладает лучшим терапевтическим эффектом, поскольку его

концентрации, обнаруживаемые метолом диффузии спустя 9 часов после введения, превышают бактериосгатические концентрации более чем на порядок в случае однократного применения (2-я группа) и более чем в 20 раз при двукратном применении (3-я группа). В то же время препарат «Гентамакс» присутствует в концентрациях, не обнаруживаемых методом диффузии в агар (0.5 -1.0 мкг/мл) уже через 9 часов (1-я группа).

Таблица 10. Анализ баюерностатического действия образцов плазмы крови, содержащих препараты «Гентамакс» и «Гентамакс М», отобранных у телят,

Группа животных Время отбора пробы крови, час

0 2 9 24

I группа Средний диаметр зон задержки роста, мм 0 56 0 0

2 группа 0 61 13 0

3 группа 0 62 20 0

Примечание; О часов (контроль) — отбор пробы до введения препаратов. Для каждой пробы крови проводилось два независимых измерения по определению зон задержки роста бактериальной культуры.

Таким образом, в результате исследований была установлена высокая терапевтическая эффективность лекарственного препарата «Гентамакс М» при лечении бактериальных инфекций у телят.

Результаты исследований, проведенных в диссертации, позволяют сделать следующие выводы:

1. Впервые создана модифицированная форма лекарственной субстанции (С1ш<Шг), исследованы ее физико-химические свойства, оптимизирован процесс синтеза для получения максимального выхода конечного продукта и получена стабильная мицеллярная композиция «Гентамакс М» на основе комбинации двух антибиотиков (С1т<Шг и гентамицин сульфата), ПАВ и сорастворителя.

2. Доказано, что размеры зон задержек роста бактериальной культуры $агс1па ¡Шеш в присутствии мицеллярных композиций на основе клиндамищша бензоата не зависят от размера мицелл в диапазоне 6-20 нм.

3. Показано, что рост бактерий Bacillus subtilis на средах, содержащих водорастворимую и мицеллярную формы солей клиндамицина, в условиях in vitro происходит сходным образом.

4. Доказано, что разработанный мицеллярный препарат «Гентамакс М» после внутримышечного введения регистрируется в крови телят в два раза дольше, по сравнению с немкцеллярным препаратом «Гентамакс», содержащим водорастворимую соль ClindHCI.

Список цитированной литературы

1. Amidon G.L. et al. // Pharm. Res. 1995. - V. 12. - P. 413-420.

2. Berne B. J,, Pecora R. Dynamic tight scattering with application to chemistry, biology, and physics. Mineola NY: Dover Publ., 2002.

3. Сафарова Э.Р., Бакшеева C.C., Бурлаков ВЛ, Егоров В.В. // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. 2000. - Т. 41, № 4. - С. 277-278.

4. Dressman J. В., Reppas С. // Eur. 1. Pharm. Sci. 2000. - V. 11. - P. S73-S80.

5. Fierer J. et at. // Antimicrob. Agents Chemother. 1990. - V. 34. - P. 343-348.

6. Кленин В.И. Термодинамика систем с гибко цепными полимерами. Саратов: Изд-во С ГУ, 1995.

7. Kumana C.R., Yuen K.Y. // Drugs. 1994. - V.47. - P. 902-913.

8. Lutwyche P. et al. // Antimicrob. Agents Chemother. 1998. - V.42 (10). - P. 2511-2520.

9. Lftbenberg R., Amidon G. L. // Eur. J. Biopharm. 2000. - V. 50. - P.3-12.

10. Schiffelens R. et al. // J. Antimicrobial Chemotherapy. 2001. - V. 48, - P. 333344.

11. Swenson С. E. et al. // Antimicrob, Agents Chemother. 1990. - V. 34. - P. 235240.

12. Ved H.S., Gustow E., PieringerR.A.//Lipids. 1990. - V, 25 (2).-P. 119-121.

Список публикаций по теме диссертации

1. Khlebtsov B.N., Chumakov EJVL, Semenov S.V„ Chumakov M.I. and Khlebtsov N.G. A study of complex miceltar system by static and dynamic light scattering It Coherent Optics of Ordered and Random Media IV, ed. by D. A. Zimnyakov, Proc. SPJE. 2004. V. 5475. P. 12-20.

2. Чумаков E. M„ Хлебцов Б. H., Хлебцов Н. Г., Чумаков М. И. Зависимость антимикробного действия мицелл яр ных лекарственных препаратов от размера мицелл.// Антибиотики и химиотерапия. 2006. Т.51. №1. С, 3-6.

3. Чумаков Е. М„ Хлебцов Б. Н., Иванова И. Б., Хлебцов Н. Г., Чумаков М. И. Сравнение эффективности мицеллярной и немицеллярной форм препарата Гентамакс при лечении инфекционных заболеваний у телят // Вестник Саратовского государственного аграрного университета. 2006, №4. С.29-32.

4. Чумаков Е.М., Хлебцов Б.Н., Семенов С.В. Оптические свойства системы вояа+ПАВ+диметилацеггамид: Зависимость от состава и температуры // Физико-химический анализ жидко-фазных систем, Тезисы докладов международной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Р. В. Мерцшша, Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2003. Ш-р.12, с. 134.

5. Хлебцов Б.Н., Чумаков Е.М., Семенов С.В. Экспериментальное исследование рассеяния света в системе вода+ПАВ +днметилацетамид // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии. Тезисы докладов 4-й Всероссийской конференции молодых ученых, Саратов: Изд-во ЮЛ, 2003, с. 216.

6. Khlebtsov В. N., Chumakov Е. М., Semenov S. V., Chumakov М. L, Khlebtsov N.G. A study of complex micellar system by static and dynamic light scattering// Saratov Fall Meeting Optical Technologies in Biophysics and Medicine, Saratov, Russia, 7-10 Oct 2003. URL: optics.sgu.ru/SFM/2003/biophysics /abstract.html7i=3 П

7. Chumakov E,M„ Khlebtsov B.N., Khlebtsov N.G., Chumakov MX, Semenov S.V. Micellar nanocompositions on the basis of clindamicine salts and their application as antibacterial preparations Interfaces and Colloidal Systems // Int Conf, Structure and Dynamics of Polymer and Colloidal Systems. Giens, France, 10-15 Sept. 2004.

Формат 60x84 1/16. Гарнитура Times New Roman 10,

_Объем I п. л. Тираж 100. Заказ 92._

Отпечатано вЙБФРМ РАН Саратов, пр. Энтузиастов 13