Получение и исследование комплексов хитозана и его производных с белками и меланинами

Бакулин, Александр Валерьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение и исследование комплексов хитозана и его производных с белками и меланинами
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Получение и исследование комплексов хитозана и его производных с белками и меланинами"

На правах рукописи

Бакулин Александр Валерьевич

ПОЛУЧЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ КОМПЛЕКСОВ ХИТОЗАНА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ С БЕЛКАМИ И МЕЛАНИНАМИ

03.01.06 - Биотехнология (в том числе и бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

-ЗНОЯ 2011

Москва 2011

4858616

Работа выполнена в лаборатории инженерии ферментов Учреждения Российской академии наук Центр «Биоинженерия» РАН, г. Москва

Научные руководители доктор химических наук, профессор

Варламов Валерий Петрович

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Штильман Михаил Исаакович, Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева

доктор технических наук, профессор Кривова Анна Юрьевна Заведующий лабораторией микробиологии Научного Центра ОАО «Свобода»

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский Институт пищевой биотехнологии РАСХН

Защита состоится 22 ноября 2011 года в 12 час. 30 мин. на заседании объединенного диссертационного совета ДМ 212.204.13 при РХТУ им. Д. И. Менделеева (125047 г. Москва, Миусская пл., д. 9) в 443 аудитории (конференц-зал).

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ им. Д.И. Менделеева.

Автореферат диссертации разослано^/октября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

ДМ 212.204.13 //. ¡{НЖ-А^ ШакирИ.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Биополимеры - высокомолекулярные природные соединения - являются структурной основой всех живых организмов и выполняют ключевые функции в процессах их жизнедеятельности. В настоящее время исследование и применение биополимеров, в том числе полисахаридов является одним из наиболее актуальных направлений фундаментальной и прикладной науки.

Особое место среди природных полимеров занимают хитин и его дезацетилированное производное - хитозан благодаря наличию уникальных физико-химических характеристик и биологических свойств, а также способности к биоразложению и низкой токсичности. Полисахаридная природа хитозана и присутствие реакционноспособных функциональных групп обеспечивает возможность разнообразных химических модификаций, позволяющих усиливать присущие им свойства или придавать новые в соответствии с предъявляемыми требованиями. Получение комплексов хитозана с другими биополимерами (белками, нуклеиновыми кислотами, полисахаридами и др.) также расширяет спектр его применения.

Известно, что в организмах членистоногих и базидальных грибов хитин находится в комплексе с другими биополимерами, такими как белки, гликаны, меланины. Это придает биоматериалу определенные структурно-функциональные свойства, необходимые организму для адаптации к условиям окружающей среды. Одним из малоизученных биополимеров является меланин. Характерной особенностью меланина является наличие высокостабильных парамагнитных центров, разнообразных функциональных групп, а также системы сопряженных связей в их молекулах. Эти особенности структуры определяют их фото-, радиопротекторные, антиоксидантные и другие свойства. В этой связи представляется интересным конструирование комплексов на основе хитозана и меланина, которые будут обладать свойствами, отличными от исходных биополимеров, что позволит использовать их в биотехнологии, медицине, для защиты окружающей среды и других областях.

Способность хитозана взаимодействовать с другими биополимерами с образованием комплексов может быть использована в различных областях науки и производства, например, для фракционирования белковых смесей.

В частности, в сфере производства молочных продуктов существует проблема переработки и утилизации молочной сыворотки (СМ), в виду большого содержания белка и других соединений. Несмотря на высокую пищевую ценность, белки сыворотки молока способны вызывать аллергические реакции, что особенно опасно для детей первых лет жизни. При этом наибольшими сенсибилизирующими свойствами обладает Р-лактоглобулин (Р-ЛГ).

В этой связи удаление Р-ЛГ из состава молочной сыворотки путем комплексообразования с хитозаном позволит осуществлять процесс производства профилактических и лечебно-профилактических смесей для детского питания в более мягких условиях, обеспечивающих сохранность пищевой ценности компонентов молочной сыворотки.

Цели и задачи исследования. Целью работы являлось получение и исследование свойств комплексов хитозана и его производных с меланинами, а также разработка подхода, позволяющего избирательно удалять Р-лактоглобулин из состава молочной сыворотки с помощью хитозана.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Исследовать особенности взаимодействия хитозана и его производных с меланинами;

2. Изучить физико-химические характеристики полученных хитозан-меланиновых комплексов;

3. Исследовать свойства хитозан-меланиновых комплексов;

4. Установить особенности взаимодействия хитозана и р-лактоглобулина и выбрать условия, обеспечивающие селективное извлечение Р-ЛГ из смеси белков молочной сыворотки;

5. Разработать технологическую схему процесса переработки молочной сыворотки с использованием хитозана.

Научная новизна. В настоящей работе впервые рассмотрено получение комплексов хитозана и его производных с меланиновыми пигментами различного

происхождения. Определено влияние различных факторов на процесс комплексообразования. Исследованы физико-химические характеристики полученных комплексов с применением термогравиметрического, элементного анализа, а также с помощью метода электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). Впервые описано явление самопроизвольного увеличения концентрации парамагнитных центров в структуре хитозан-меланинового комплекса с течением времени.

Изучена способность нерастворимых хитозан-меланиновых комплексов связывать из раствора радионуклиды (уран и стронций). Определены значения коэффициентов распределения, степени извлечения, а также емкость хитин/хитозан-меланиновых комплексов в виде порошка и гранулированного сорбента.

Исследованы антиокисидантные свойства водорастворимых комплексов производных хитозана и меланина. Изучена возможность комплексов ингибировать процесс разрушения ДНК фага к продуктами пероксидазного окисления бензидина. Антигипоксические свойства комплексов были исследованы в условиях острой нормобарической гипоксии и гиперкапнии, острой гипоксической гипоксии, а также изучено влияние хитозан-меланиновых комплексов на физическую работоспособность.

В процессе работы исследованы особенности процесса комплексообразования хитозана и р-лактоглобулина, а также установлено влияние различных факторов на эффективность формирования нерастворимого хитозан-белкового комплекса. С помощью изотермической калориметрии установлены термодинамические параметры процесса комплексообразования.

На основании полученных исследований разработана технологическая схема переработки молочной сыворотки с использованием хитозана.

Праюпческая значимость работы. Получены сорбенты на основе хитин/хитозан-меланиновых комплексов в виде гранул и порошка, способные эффективно связывать радионуклиды из водных растворов. В связи с этим, хитин/хитозан-меланиновые комплексы могут быть рекомендованы для использования в процессах концентрирования радионуклидов из растворов при

реабилитации природных и техногенных сред, а также для мониторинга загрязнений водных объектов.

Эксперименты в условиях in vivo, выявили способность комплекса сульфосукциноил хитозан-меланин увеличивать выживаемость мышей в условиях недостатка кислорода, избытка углекислого газа, а также при нарушении потребления кислорода тканями. Поэтому данный комплекс может послужить основой для создания препаратов антигипоксического действия.

На основании проведенных исследований разработана и апробирована технологическая схема переработки молочной сыворотки с использованием хитозана пищевого ТУ 9289-067-00472124-03. Разработана технологическая инструкция на производство белкового продукта со сниженными аллергенными свойствами из смеси белков молочной сыворотки с помощью хитозана. Предлагаемый подход позволяет получить два функционально важных продукта: сыворотку молока со сниженными аллергенными свойствами (CM-ГА) и ß-лактоглобулин в индивидуальном виде.

Апробация работы. Основные результаты и отдельные положения работы представлены на следующих конференциях: 9th International Conference of the European Chitin Society (Italy, Venice, 2009), 15th Workshop "New aspects on chemistry and application of chitin and its derivaties" (Poland, Torun, 2009), Десятой Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Нижний Новгород, 2010), XI Международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии», (Казань, 2010), Седьмых Шорыгинских чтениях (Московская обл. 2010), Научно-практической конференции «Инновационные технологии и оборудование в молочной промышленности (Воронеж 2010), 10th International Conference of the European Chitin Society EUCHIS'll (St-Peterburg, 2011), IV Международной молодежной научной конференции «Экология-2011» (Архангельск, 2011), V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011).

Работа получила премию им. П.П. Шорыгина в 2011 г. за лучшие разработки в области хитинологии, стала победителем программы «Участник Молодежного Научно-Инновационного Конкурса» («У.М.Н.И.К.») в 2010 г.

Личный вклад соискателя. Личный вклад автора заключается в проведении теоретических и экспериментальных исследований. Основные результаты работы получены лично автором при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах, входящих в перечень ВАК.

Структура н объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 132 страницах машинописного текста и включают 32 рисунка и 10 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, раздела с обсуждением экспериментальных результатов, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 161 научного источника и приложения.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Основные результаты и их обсуждение

1. Исследование процесса комплексообразования хитозана и меланина

Меланины представляют собой высокомолекулярные полимеры нерегулярной структуры, относящиеся к классу конденсированных фенольных соединений. В зависимости от источника и способа получения состав пигментов является разнообразным, непостоянным, как и их молекулярная масса. В этой связи достаточно трудно дать характеристику полученных комплексов и установить механизм комплексообразования.

При добавлении 1% раствора меланина к 0,5% раствору хитозана наблюдалось образование плотного осадка. Полученный комплекс, в отличие от исходных биополимеров, не растворялся не только в водных растворах кислот и щелочей, но и в органических растворителях. Для понимания фундаментальных аспектов взаимодействия двух биополимеров было исследовано влияние на процесс комплексообразования рН среды, ионной силы раствора, молекулярной массы хитозана, и различных детергентов.

В процессе работы установлено, что в результате взаимодействия хитозана (М„ 18-500 кДа, СД 86%) и меланинов из разных источников происходит образование нерастворимого комплекса. При значении рН среды 4,5 агрегация частиц комплекса

наблюдалась быстрее и при меньших концентрациях полисахарида, чем при рН 6,2. Показано, что с ростом концентрации соли ЫаС1 в растворе при рН 6,0 происходило увеличение количества образовавшегося комплекса, что свидетельствует о вкладе гидрофобного взаимодействия в процесс формирования комплекса.

Результаты исследований влияния различных детергентов на процесс взаимодействия хитозана и меланина показали, что присутствие в смеси как ионных (додецилсульфат натрия), так и неионных (Твин 20) детергентов сильно ингибировало образование нерастворимого комплекса.

Известно, что в структуре молекулы меланина присутствуют карбоксильные группы, аминогруппы, большое число о-хинонных, о-гидрохинонных и семихинонных групп. В этой связи возможно образование как ионных, гидрофобных, водородных так и ковалентных типов связей между хитозаном и меланином.

Следует отметить, что в случае использования частично замещенных производных хитозана с меланином образование нерастворимых комплексов не наблюдалось. Это может объясняться как уменьшением количества свободных аминогрупп в структуре молекул хитозана, так и снижением гидрофобного взаимодействия между двумя биополимерами.

В процессе работы установлено, что с ростом молекулярной массы хитозана количество связанного меланина из раствора снижается. Полученные результаты можно объяснить уменьшением количества участков связывания в молекуле хитозана из-за возникновения стерических затруднений в случае использования высокомолекулярного полисахарида.

1.2. Физико-химические характеристики хитозан-меланиновых комплексов

Полученные комплексы были охарактеризованы с использованием термогравиметрического анализа, а также метода электронного парамагнитного резонанса.

Подтверждением структурных изменений в молекулах хитозана и меланина при их комплексообразовании служат проведенные термогравиметрические исследования. Основные характеристики термического разложения образцов

хитозана (М„ 21 кДа, СД 86%), сукциноил-хитозана, меланина из трутовика плоского (Сапос1егта арр!апашт) и их комплексов приведены в таблице 1.

Таблица 1

Основные этапы термического разложения биополимеров и их комплексов

Вещество Температурный интервал разложения, °С Потеря веса, % Еа кДж/мОЛЬ

Хитозан 200-270 34,5 109

Сукциноил хитозан 25-100 200-400 10,6 35,8 91 55

Меланин 200-350 350-480 42,2 33,4 79 44

Нерастворимый комплекс

Хитозан-Меланин 200-270 350-480 34.7 21.8 119

Водорастворимый комплекс

Сукциноил хитозан-Меланин 200-300 300-360 20,8 17,9 53 26

При сравнении термограмм разложения хитозан-меланиновых комплексов с механическими смесями биополимеров, взятых в том же соотношении, обнаружен ряд существенных отличий, связанный с появлением дополнительных этапов деструкции и изменением энергетики процессов разрушения вещества.

Применение метода ЭПР позволило установить, что все исследованные хитозан-меланиновые комплексы и использованные для их получения меланины характеризуются интенсивным парамагнитным поглощением с g-фaктopoмs равным 2,0035±0,003 (близким к §-фактору свободного электрона), что позволяет предположить единую природу парамагнитных центров. Форма спектров была средней между лоуренцевой и гауссовой, что характерно для меланиновых пигментов. Ширина сигнала при этом составляла ДН=б,0-7,0 Гс. Содержание парамагнитных центров в исследованных образцах комплексов и меланинов варьировало в пределах от 1017 до 1018 спин/г (рис. 1 А). Следует отметить, что количество стабильных свободных радикалов в комплексах было существенно выше, чем в механических смесях хитозана и меланина.

В процессе исследований был обнаружен факт увеличения концентрации парамагнитных центров во времени для хитозан-меланиновых комплексов в твердом

состоянии без какого-либо воздействия, в отличие от исходных биополимеров (рис. Б).

1- сульфосукциноил хитозан;

2- сукциноил хитозан;

3- карбоксиметил хитозан;

4- меланин (/. obliquus);

5- сульфосукциноил хитозан-меланин;

6- сукциноил хитозан-меланин;

7- карбоксиметил хитозан-меланин.

1- комплекс хитозан-меланин (F. fomentarius)',

2- комплекс хитозан-меланин (G. applanatum)-,

3- комплекс хитозан-меланин (/. obliquus)',

4- комплекс хитозан-меланин (Ph. robustus);

5- меланин (G. applanatum).

Рис. 1. (А) концентрация парамагнитных центров (ПЦ) водорастворимых комплексов и исходных биополимеров, (Б) зависимость интенсивности ЭПР-сигнала нерастворимых комплексов хитозан-меланин от времени.

Таким образом, взаимодействие хитозана и его модифицированных производных с меланинами приводит к формированию новой макроструктуры с отличительными физико-химическими характеристиками.

Ранее в литературе описана взаимосвязь биологических свойств меланина с наличием в его структуре парамагнитных центров (Britgton G. 1983, Аверьянов A.A. 1987, Щерба В.В. 2000). В этой связи увеличение концентрации ПМЦ в структуре полученных комплексов, по сравнению с исходным меланином, а также их нерастворимость открывает новые перспективы использования хитозан-меланиновых комплексов, например, для создания полупроводниковых материалов, экранов различного вида излучения, биосенсоров и т.д.

1.3. Свойства хитозан-меланиновых комплексов

1.3.1. Сорбционные свойства

Сорбционные свойства полученных нерастворимых хитозан-меланиновых комплексов и исходных биополимеров были изучены на примере связывания радионуклидов 233и и ад8г из водных растворов. Для этого хитозан-меланиновые комплексы были сформированы в виде гранулированного сорбента (рис. 2).

Рис. 2. А- хитозан (Мг 200 кДа, СД 86%), Б- хитозан-меланиновый комплекс в виде гранулированного сорбента

Известно, что важными показателями, характеризующими эффективность сорбции, являются коэффициенты распределения (Ка) и кинетика процесса. Определение К^ позволяет оценить потенциальную сорбционную способность вещества по отношению к тому или иному элементу, а данные по кинетике сорбции дают информацию о скорости протекания процесса. В ходе работы установлено, что сорбция 233и и 908г протекает довольно быстро, кинетическое равновесие устанавливается за 10 минут для всех исследованных образцов. В условиях равновесия определены коэффициенты распределения и степень извлечения радионуклидов из раствора для хитозана, хитозан-меланинового комплекса в виде гранулированного сорбента и порошка, а также для меланина (табл. 2). Порошкообразные хитозан-меланиновые комплексы обладали меньшей сорбционной емкостью, по сравнению с гранулированным сорбентом, что, вероятно, обусловлено меньшей удельной поверхностью частиц порошка.

Сорбционные свойства биополимеров и их комплексов по отношению к 23311 и ^г

Сорбент Степень извлечения, а % Коэффициент распределения, Кс1 мл/г РСОЕ , а мг(2331)) /г

2Ии и

Хитозан (М„ 200 кДа, СД 86%) 79,6 14 390 17 _»

Меланин (/. оЬИдиш) 86.3 86,2 - - 21,5

Гранулы хитозана 63.8 19 176 24 15,9

Гранулы хитозан-меланииового комплекса 96,6 70,2 1580,9 930 50

Хитозан-меланиновый комплекс 97,5 63 3841,8 350 7,5

Хитин-меланиновый комплекс (А. теШ/ега) 98,1 86,5 5100 640 5

прим. РСОЕ- равновесная статическая обменная емкость, (-*) - не определялось

В работе также были исследованы сорбционные свойства природного хитин-меланинового комплекса, выделенного из кутикулы насекомых (пчела медоносная). Показано, что в условиях жесткой обработки сырья при выделении и очистке комплекса происходило разрушение меланина и, как следствие, снижение способности связывать радионуклиды из раствора, что говорит о превалирующем вкладе меланинового компонента в сорбционные свойства комплекса.

Важным преимуществом полученных сорбентов является их низкая зольность. Применение таких сорбентов позволит решать вопросы не только очистки от загрязнений водных объектов, но и компактирования отходов. Кроме того, возможность уменьшения объема может найти применение в аналитической практике при их использовании в разработке высокочувствительных методов аналитического определения радионуклидов в радиоэкологическом мониторинге.

1.3.2. Антиоксидантные свойства Антиоксидантные свойства меланина, К-замещенных производных хитозана и их водорастворимых комплексов были исследованы с использованием амперометрического метода измерений массовой концентрации антиоксидантов в исследуемом образце, эквивалентное стандарту (галловой кислоте). Метод основан на измерении силы электрического тока, возникающего при окислении молекул антиоксиданта на поверхности рабочего электрода при потенциале 1,3 В. Результаты измерений антиоксидантной активности (АА) образцов представлены в таблице 3.

Антиоксидантая активность производных хитозана, меланина и их комплексов

№ Образец Стандарт РН АА мг/г СКО

1 Меланин (/. оЫ'щии$) Галловая кислота 5.8 4,6 <3%

2 Сульфосукщшоил хнтозан-меланин Галловая кислота 5,8 4,7 <3%

3 Сукцииоил хитозан-меланин Галловая кислота 5.8 4,9 <3%

4 Карбоксиметил хитозан-меланин Галловая кислота 5.8 6,7 <3%

5 Сукцииоил хитозан Не обнаружена

6 Сульфосукщшоил хитозан Не обнаружена

7 М-карбоксиметил хитозан Не обнаружена

прим.: АА - общее количество антиоксидантов в одном грамме исследуемого вещества, эквивалентное количеству стандарта.

Таким образом, все полученные комплексы обладали более высокой АА, чем меланин, который является известным антиоксидантом (В.В. Щерба, 2000). Также установлено, что водорастворимые образцы хитозана не проявляли антиоксидантной активности. Полученные данные кореллируют с содержанием парамагнитных центров в комплексах (рис. 1 А). Можно предположить, что наличие в структуре комплекса стабильных радикалов определенным образом влияет на его антиоксидантные свойства.

1.3.3. Генопротектроные свойства

Большинство аминобифенилов при их метаболической активации способны активно взаимодействовать с ДНК, вызывая в ней различные повреждения. В результате происходит образование межнитевых и перекрестных сшивок ДНК-ДНК.

В этой связи были изучены способность меланина, производных хитозана и их комплексов ингибировать процесс разрушения ДНК фага-), продуктами пероксидазного окисления бензидина (БД). Установлено, что ДНК в результате действия продуктов БД (6*10"6М) перекрестно сшивается и накапливается в геле на старте (рис. 3, дорожка 3). Постепенное увеличение концентрации меланина (/. оЬИциив) (от 4,5 до 6 мкг/мл) и его комплексов с производными хитозана (от 5 до 100 мкг/мл) в реакционной среде приводило к уменьшению количества поврежденной ДНК продуктами окисления БД и восстановлению ее электрофоретической подвижности (рис.3).

ЯНИЙЯ

Концентрация ингибитора, мкг/мл 0 0 0 0,5 1 2 5 10 40 100

1, 23456 789 10

(В», тшф «■» <шт ттт Шя* «и* ««■>»

Концентрация ингибитора, мкг/мл 0 0 0 0,5 1 2 5 10 40 100

Рис. 3. Влияние (А) меланина, (Б) комплекса сульфосукциноил хитозан-меланина, (В) сульфосукциноил хитозана на процесс образования сшивок ДНК продуктами пероксидазного окисления БД в зависимости от концентрации ингибитора; рН 7,4, 0,1 М Трис-НС1, инкубация 1 час, I 37°С

Возможный механизм ингибирования процесса повреждения ДНК меланином и его комплексами с хитозаном заключается во взаимодействии ингибитора с радикальными продуктами окисления бензидина.

В результате исследований установлено, что наиболее выраженными генопротектроными свойствами обладал образец комплекса сульфосукциноил хитозан-меланин (рис.3 Б), наряду с самим меланином (рис.3 А) в концентрации от 5 мкг/мл. Остальные водорастворимые комплексы хитозана и меланина ингибировали повреждение ДНК в более высоких концентрациях (>40 мкг/мл). Следует отметить, что производные хитозана не только не препятствовали процессу повреждения ДНК. а наоборот, усиливали его (рис.3 В). Вероятно, это связано с образованием межмолекулярных комплексов производных хитозана с ДНК.

1.3.4. Антигипоксические свойства

Антигипоксическую активность меланина (/. оМ^мм^), сульфосукциноил хитозана и их комплекса изучали на белых беспородных мышах самцах при введении исследуемых соединений за 1 час до проведения эксперимента.

1- Буфер, ДНК,

2- Буфер, ДНК, Н202, пероксидаза хрена (ПХ),

3- Буфер, ДНК, Н202, ПХ, БД 6* 10"6М,

4-10 Буфер, ДНК, Н202, ПХ, БД 6*10"6М, ингибитор, мкг/мл

Рис. 4. Влияние введения меланина, сульфосукциноил хитозана и их комплекса на выживаемость мышей (А) в условиях недостатка кислорода и избытка С02 и (Б) при нарушении потребления кислорода тканями, вызванное подкожным введением раствора натрия нитропруссида в дозе 20 мг/кг (ЛДюо) по сравнению с контролем (р<0,05).

В результате эксперимента показано, что комплекс биополимеров проявлял наиболее выраженные антигипоксические свойства в выбранных условиях, в то время как сульфосукциноил хитозан снижал выживаемость мышей в условиях недостатка кислорода и избытка углекислого газа (рис.4). Следует, однако, отметить, что введение комплекса не приводило к выраженному повышению физической работоспособности в нормальных условиях. Вероятно, это обусловлено тем, что антигипоксическая активность соединений и их влияние на физическую работоспособность взаимно противоположны.

2. Использование хитозана для избирательного удаления Р-лактоглобулина из состава молочной сыворотки.

В настоящее время, наряду с методами ультрафильтрации, хроматографического разделения, термообработки, высаливания, а также их сочетания, для выделения и фракционирования белков молочной сыворотки используют методы селективного соосаждения с использованием полисахаридов и их производных, а также синтетических полимеров. Главными недостатками ранее использованных полимеров являются низкая степень извлечения молочных белков и

недостаточная селективность процесса, кроме того, применение синтетических полимеров нежелательно для производства пищевых продуктов.

В этой связи представляется перспективным использование хитозана (ХТЗ) для выделения |3-ЛГ из состава молочной сыворотки для получения продукта со сниженными сенсибилизирующими свойствами.

2.1. Исследование взаимодействия хитозана с р-лактоглобулином.

На связывание (3-ЛГ хитозаном могут оказывать влияние ряд факторов. Их изучение представляет интерес не только для понимания фундаментальных аспектов, лежащих в основе взаимодействия макромолекул, но и с практической точки зрения - выбора оптимальных условий для получения очищенных белковых препаратов. Такими факторами являются: концентрация и молекулярная масса полисахарида, рН и ионная сила раствора, время проведения процесса и др.

В результате добавления 0.5% раствора хитозана М„ 200 кДа к раствору |3-ЛГ происходило образование опалесценции, связанное с формированием нерастворимого комплекса полисахарида с белком, достигающей максимума через 30 минут.

(3-ЛГ р-лг+хтз 18 кДа

[5-ЛГ+ХТЗ 200 кДа

О 50 100

С(ХТ'!), мкг/ш

Рис. 5. Зависимость количества связанного белка (320 мкг/мл) от концентрации хитозана (К, 200 кДа, СД 86%), рН 6,0 в 0,05М МЕЭ-ЫаОН буфере.

340 Збо

>., Н VI

Рис. 6. Флуоресценция (3-ЛГ и (3-ЛГ с хитозаном. рН 6.2 в 0,05М MES-NaOH буфере. С (ХТЗ) 150 мкг/мл, С(белка) 320 мкг/мл.

Было показано, что образование нерастворимого хитозан-белкового комплекса происходило лишь при добавлении определенной концентрации полисахарида

(рис.5). В этой связи возникает вопрос, в каком виде происходит сосуществование хитозана и белка в растворе в области III (рис. 5).

Было установлено, что максимум флуоресценции белка наблюдался при длине волны 336 нм при I 24°С, рН 6,2 в 0,05М МЕ8-ЫаОН буфере. При добавлении к раствору белка заданного количества хитозана (область III, рис. 5) происходило тушение флуоресценции белка (рис. 6). Это явление может объясняться межмолекулярным взаимодействием хитозана и Р-ЛГ, приводящее к изменению пространственной конфигурации белка.

Методом изотермической калориметрии показано, что в области 1 (рис. 5) изменение энтальпии в процессе комплексообразования составило ДН= -2,1 ккал/моль в расчете на одно звено хитозана, тогда как последующее добавление хитозана в раствор белка (обл. // рис. 5) не приводило к изменению термодинамических параметров системы. Это может говорить о том, что диссоциации комплекса и образования новых типов взаимодействия не происходит.

На основании полученных данных можно предположить, что добавление хитозана к раствору Р-ЛГ в концентрации выше оптимальной (1 : 10 в/в, хитозан : белок соответственно) происходит перераспределение молекул белка между цепями хитозана. При этом из-за избытка полисахарида не все функциональные группы хитозана принимают участие в образовании комплекса с белком, из-за чего способность к седиментации комплекса снижается и хитозан-белковый комплекс остается в растворе.

Другим фактором, оказывающим существенное влияние на процесс взаимодействия хитозан - р-ЛГ является молекулярная масса полисахарида. В ходе исследований было показано, что количество связанного белка из раствора увеличивалась с ростом молекулярной массы хитозана (рис. 7). Вероятно, такой эффект объясняется тем, что в случае использования хитозана с большей молекулярной массой способность к седиментации образующегося комплекса становится выше, чем при использовании низкомолекулярного полисахарида.

Размер и морфология частиц, сформированных из комплексов хитозан - Р-ЛГ, были определены методом атомно-силовой микроскопии. Показано, что при взаимодействии хитозана М„ 200 кДа с Р-ЛГ происходит образование

нерастворимых частиц размером 170±50 нм с последующим формированием более крупных агрегатов (рис.8 А), тогда как размер частиц, полученных с использованием хитозана М„21 кДа, не превышает 100 нм (рис. 8 Б).

Моле^лярнвя масса хитозана, кДа

Рис.7. Эффективность связывания р-ЛГ в зависимости от молекулярной массы используемого хитозана; концентрация полисахарида 20 мкг/мл; р-лактоглобулина 200 мкг/мл; рН 6,2, буфер МЕБ-№ОН 0,1М.

Рис. В. Изображение частиц нерастворимого комплекса Р-ЛГ с хитозаном М„200 кДа (А) и хитозаном М„ 21 кДа (Б), полученных с помощью атомно-силовой микроскопии

Также было установлено, что энтальпия процесса взаимодействия в пересчете на единичное звено полисахарида практически не изменяется в зависимости от молекулярной массы хитозана, что говорит об одинаковом типе связывания.

Фактор рН имеет большое значение для реализации многих межмолекулярных взаимодействий, поскольку влияет на ионизацию функциональных групп полимерных соединений. Исследование взаимодействия хитозана и р-ЛГ проводили в диапазоне рН от 5,2 до 6,2. В результате было установлено, что при рН среды 5,2 не происходило образование осадка, указывающего на формирование нерастворимого комплекса между белком и хитозаном. С ростом рН количество связанного белка хитозаном увеличивалась и достигала максимума при рН 6.2. при этом изменение энтальпии процесса наблюдалось от ДН= -0,38 ккал/моль при рН 5.5 до ДН= -2.12 ккал/моль при рН 6,2. Следует отметить, что в выбранном диапазоне хитозан находился в протежированной форме, а р-ЛГ, напротив, был заряжен отрицательно (р/=5,2). Полученные данные свидетельствуют о роли ионогенных

групп во взаимодействии биополимеров, однако, нельзя исключать существование и других типов связей.

Участие ионогенных групп в формировании нерастворимого комплекса хитозан - Р-ЛГ удалось также подтвердить варьированием ионной силы раствора. Для этого процесс взаимодействие биополимеров был осуществлен в 0,1 М МЕБ-ЫаОН буфере, рН 6,2 и концентрации ШС1 от 0,01 М до 0,2 М. Показано, что наиболее эффективно хитозан связывается с белком при наименьшей ионной силе, в то время как в 0,2 М буфере образование нерастворимого комплекса не наблюдалось.

Полученные данные свидетельствуют о необходимости проведения предварительной стадии деминерализации молочной сыворотки для выделения (3-ЛГ с помощью хитозана на производстве.

Таким образом установлено, что наиболее полное извлечение Р-ЛГ из раствора (>90%) происходит при использовании высокомолекулярного хитозана (М„ 200 кДа, СД 86%) через 30 минут, в соотношении хитозан/белок 1/10 (в/в) соответственно, при рН среды 6,0-6,2 и минимальной ионной силе раствора. В этих условиях каждая субъединица белка связывается с 6 звеньями хитозана, при этом каждое звено имеет константу связывания с белком около 7,6 х 104 М"1, ДН= -2,1 ккал/моль.

2.2 Влияние ранее выбранных параметров на селективность связывания |5-ЛГ из раствора сывороточных белков.

Добавление хитозана (М„ 200 кДа, СД 86%) к 1% раствору концентрата сывороточных белков (КСБ) при рН 6,2 в 0,05 М карбонатном буфере приводило к образованию опалесценции, что связано с образованием нерастворимых хитозан-белковых комплексов. Максимальное связывание Р-ЛГ (-90% от общего количества) с хитозаном наблюдалось при концентрации полисахарида в растворе, равной 0,5 мг/мл (рис.9). Однако помимо Р-ЛГ происходило связывание с хитозаном и а-лактальбумина (а-ЛА) и БСА, но в значительно меньших количествах. После промывки осадка 0,05 М карбонатным буфером рН 6,0 а-ЛА и БСА удалялись из состава хитозан-белкового комплекса. Показано, что основным белком, связанным с хитозаном, является Р-ЛГ (рис. 10).

БСА->

1 2

0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

Концентрация хитозана, мг/мл

3 4 5

Рис. 9. Зависимость относительного содержания сывороточных белков в супернатанте от содержания хитозана в реакционной смеси: I- (3-ЛГ; 2- БСА; 3- а-ЛА

Рис. 10. Электрофореграмма раствора

КСБ до и после обработки хитозаном: 1-КСБ (контроль); 2- КСБ после обработки хитозаном; 3-белок после разрушения

нерастворимого комплекса; 4- стандарт р-ЛГБ (Sigma); 5-стандарт БСА (Sigma).

Также было установлено, что, несмотря на различную эффективность образования нерастворимого хитозан-белкового комплекса, селективность связывания с |3-ЛГ сохраняется при различных значениях молекулярной массы хитозана.

Таким образом, ранее выбранные условия позволяют обеспечить селективное выделение до 95% Р-лактоглобулина из смеси белков сыворотки молока с помощью хитозана.

2.3 Использование хитозана для выделения р-лактоглобулина из молочной сыворотки.

Основными компонентами сухого вещества молочной сыворотки являются: лактоза, белки, жир, а также минеральная составляющая. Известно, что в определенных пределах соотношение компонентов, рН и другие характеристики молочной сыворотки могут варьировать. Также не исключено наличие белок-белковых агрегатов и других межмолекулярных взаимодействий. Все это может непосредственно влиять на эффективность селективного извлечения главного аллергена из состава молочной сыворотки.

Добавление полисахарида в частично деминерализованную молочную сыворотку приводило к образованию нерастворимых агрегатов. Однако полного

извлечения (3-ЛГ из состава молочной сыворотки добиться не удалось во всем диапазоне выбранных концентраций (рис. 11 А)

А Б

1 2 Г 4 5" 6 7......8 9 10 •

1 | - - - Ч • ^. ! - ' .>■' " : " '•■ "О'-:-'';"-;'1'- ..,.; ., БСА —* " * "*■ * • '

■ :.'' ■■■■ .ч- ** «* аышг— р-лг_ -

а-ЛА _- . ____

о 0.76 0.9 1.0 1.1 1.2 1.35 1.5 1.6 1.7

Концентрация хитозана, мг/мл

Рис. 11. Электрофореграмма (А) сыворотки молока после обработки хитозаном в разной концентрации и (Б) белков, связанных хитозаном соответственно.

В данном случае максимальное извлечение (3-лактоглобулина из состава молочной сыворотки наблюдалось при концентрации хитозана 1,2 мг/мл (5:8 хитозан/белок, в/в), что существенно превышает значения, определенные для выделения (3-ЛГ из раствора КСБ (1:8, в/в). Селективность процесса при этом также нарушалась (рис.11 Б). Эти затруднения могут быть обусловлены высоким содержанием солей в составе исходной сыворотки (содержание золы 7,3% против 2,1% в составе КСБ), что выдвигает дополнительные требования к процессу деминерализации сырья.

На основании проведенных исследований разработана технологическая схема переработки КСБ и молочной сыворотки с использованием хитозана (рис. 12). Данная схема была апробирована на предприятии ЗАО «Биопрогресс» и разработана технологическая инструкция на производство белкового продукта со сниженными аллергенными свойствами из смеси белков молочной сыворотки с помощью хитозана пищевого ТУ 9289-067-00472124-03. Использование данной схемы позволит селективно выделять главный аллерген из состава молочной сыворотки (либо КСБ, СДС) и в результате получать два функционально важных продукта: молочную сыворотку со сниженным аллергенным потенциалом (СМ-ГА) и |3-лактоглобулин в индивидуальном виде, который может в дальнейшем

использоваться в пищевой промышленности (пенообразователь, эмульгатор). Также данная схема переработки предусматривает многократное использование хитозана после регенерации.

Предлагаемый подход может быть реализован на предприятиях пищевой промышленности без использования специализированного оборудования, больших временных и энергетических затрат.

Сыворотка молока

Сепарирование

Нерастворимые частицы Подсырные сливки

Пастеризация +

КСБ

сдс

Растворение

Деминерализация +

Регулирование рН

Хитозан

Фильтрат

Смешение

Фильтрование

Осадок

Приготовление раствора хитозана рН 6.0 | Буфер

Хитган

Пастеризация

Промывные воды

Промывка

Буфер

Сгущение

Сушка

Фильтрат

Фасовка

Элюция белка

Элюент

Фильтрование

Осадок

Упаковка

Деминерализация

Маркировка

Сушка

Фасовка

Хранение

Ресуспенливование

Центрифугирование

Упаковка

СМ-ГА

Хранение

Н20 ^Ситозан

Сбор сточных вод

Р-лактоглобулин

Сброс

Рис. 12. Технологическая схема переработки молочной сыворотки с использованием хитозана, где СДС- сухая деминерализованная сыворотка, КСБ-концентрат сывороточных белков

выводы

1. Исследован процесс взаимодействия хитозана с меланинами, приводящий к образованию стабильных комплексов.

2. Обнаружено увеличение концентрации парамагнитных центров на 90% в структуре хитозан-меланиновых комплексов в течение трех месяцев.

3. Показано, что хитозан-меланиновые комплексы способны связывать 233U на 98% и 90Sr на 70% из водных растворов.

4. Изучены антиоксидантные, генопротекторные и антигипоксические свойства водорастворимых хитозан-меланиновых комплексов.

5. Показана селективность извлечения ß-лактоглобулина на 90% из раствора сывороточных белков с помощью хитозана.

6. Разработана и апробирована технологическая схема переработки молочной сыворотки (КСБ) с использованием хитозана.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Бакулин A.B., Гавриленко Н.В., Червяковский Е.М., Курченко В.П., Варламов В.П. Использование хитозана для выделения ß-лактоглобулина из смеси белков молочной сыворотки // Биотехнология. 2011. №1. С. 34-41.

2. Бакулин A.B., Гавриленко Н.В., Червяковский Е.М., Курченко В.П., Варламов В.П. Использование хитозана ракообразных в технологии переработки молочной сыворотки // Рыбпром. 2010. № 4. С. 64-67.

3. Бакулин A.B., Велешко И.Е., Румянцева Е.В., Левов А.Н., Бурмистрова Л.А., Хисматуллин Р.Г., Курченко В.П., Варламов В.П., Кривцов Н.И. Получение хитин-меланиновых комплексов из Apis mellifera и изучение возможности их использования в качестве сорбентов радионуклидов // Доклады РАСХН. 2011. №5. С. 48-51.

Публикации в других изданиях и материалах конференций:

1. Bakulin A., Kurchenko V., Gavrilenko N., Halavach Т., Cherviakovsky E. Interaction of chitosan with whey proteins // New aspects on chemistry and application of chitin and its derivaties: Proc. 15th Workshop. Torun, Poland, 2009. P.l.

2. Бакулин А. В., Гавриленко Н.В., Червяковский Е. М., Курченко В.П. Эффективность связывания белков молочной сыворотки с хитозаном // Труды Белорусского государственного университета. 2009. Т. 4, Ч. 2. С. 283-289.

3. Бакулин А. В., Курченко В.П., Сушинская Н.В., Азарко И.И., Варламов В.П. Физико-химические характеристики хитозан-меланиновых комплексов // Труды Белорусского государственного университета. 2009. Т. 4, Ч. 2. С. 290-297.

4. Azarko I.I., Bakulin A.V., Kozlova E.I., Kurchenko V.P., Ajayeva L.V. Paramagnetic properties of melanin pigments and their compounds with chitozan // Proc. 6 Int. conf. NEET. Zakopane, Poland, 2009. P. 101.

5. Гавриленко H.B., Бакулин A.B., Хамашкеева M.T., Курченко В.П., Варламов В.П. Некоторые особенности получения хитозан-меланиновых комплексов // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана: Мат. X Международной конф. Нижний Новгород, 2010. С. 90-94.

6. Бакулин А.В., Гавриленко Н.В., Курченко В.П., Варламов В.П. Взаимодействие хитозана с белками сыворотки молока // Пищевые технологии и биотехнологии: Мат. XI Международной конф. молодых ученых. Казань, 2010. С.155

7. Azarko 1.1., Bakulin A.V., Kozlova E.I., Kurchenko V.P., Ajayeva L.V. Melanin complexes as a radiation bioprotector // Proc. YIII Int. conf. ION. Kazimierz Dolny, Poland, 2010. P.118.

8. Велешко И.Е., Румянцева E.B., Велешко A.H., Гальбрайх JI.C., Бакулин А.В. Роль меланина в процессах взаимодействия с радионуклеидами в растворах // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана: Мат. X Международной конф. Нижний Новгород, 2010. С. 86-90.

9. Алиева Л.Р., Бакулин А.В., Варламов В.П., Гавриленко Н.В., Червяковский Е.М., Курченко В.П. Особенности взаимодействия хитозанов с белками молочной сыворотки II Инновационные технологии и оборудование в молочной промышленности: Мат. научно-практической конф. Воронеж, 2010. С. 145.

10. Bakulin А. V., Kurchenko V.P., Veleshko I.E., Rumyantseva E.V., Varlamov V.P. Construction of chitosan-melanin complexes and investigation of their properties// Proc. 10th Int. Conf. of the European Chitin Society EUCHIS41. St-Peterburg, 2011. P. 19.

11.Khismatoullin R. G., Bakulin А. V., Levov A.N., Veleshko I.E., Rumyantseva E.V., Krivtsov N. I., Varlamov V.P. Apis mellifera as a perspective source of chitin and chitin-melanin complexe // Proc. 10,h Int. Conf. of the European Chitin Society EUCHIS' 11. St-Peterburg, 2011. P. 86.

12.Бакулин A.B., Велешко И.Е., Румянцева E.B., Курченко В.П., Варламов В.П. Изучение взаимодействия хитин-меланиновых комплексов с радионуклидами в растворе // Экология-2011: Мат. IV Международной молодежной научной конф. Архангельск, 2011. С. 84.

13.Бакулин A.B., Гавриленко Н.В., Червяковский Е.М., Курченко В.П., Варламов В.П. Использование хитозана для выделения ß-лактоглобулина из смеси белков сыворотки молока // Белки и пептиды: Мат. V Российского симпозиума. Петрозаводск, 2011. С. 267.

Заказ №65-А/10/2011 Подписано в печать 19.10.2011 Тираж 130 экз. Усл. пл. 1,2

¿^-■Ад ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

), www.cfr.ru; e-maihinfo@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Бакулин, Александр Валерьевич

Оглавление.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1 Природные полисахариды хитин и хитозан.

1.1.1 Хитин.

1.1.2 Хитозан.

• 1.1.3 Области применения хитозана.

1.2 Взаимодействие хитозана с другими биополимерами.

1.2.1 Взаимодействие хитозана с белками.

1.2.1.1 Взаимодействие хитозана с белками сыворотки молока.

1.2.1.1 а Совместное использование хитозана и белков молочной сыворотки для стабилизации эмульсий.

1.2.2 Взаимодействие хитозана с нуклеиновыми кислотами.

1.2.3 Взаимодействие хитозана с полисахаридами.

1.2.3.1. Взаимодействие хитозана с альгинатами.

1.2.3.2. Взаимодействие хитозана с каррагинаном.

1.2.3.3 Взаимодействие хитозана с пектином.

1.2.3.4 Взаимодействие хитозана с целлюлозой.

1.2.3.5 Взаимодействие хитозана с гликозаминогликанами.

1.2.4 Взаимодействие хитозана с лигнином.

1.2.5 Биоинкапсулирование и нанобиокомпозиты на основе хитозана.

1.3 Меланин.

1.3.1 Структура меланина.

1.3.2 Свойства меланина.

1.3.3 Биологическая роль меланина.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение и исследование комплексов хитозана и его производных с белками и меланинами"

Биополимеры - высокомолекулярные природные соединения - являются структурной основой всех живых организмов и выполняют ключевые функции в процессах их жизнедеятельности. В настоящее время исследование и применение биополимеров, в том числе полисахаридов является одним из наиболее актуальных направлений фундаментальной и прикладной науки.

Особое место среди, природных полимеров занимают хитин и его дезацетилированное производное - хитозан благодаря наличию уникальных физико-химических характеристик и биологических свойств. Полисахаридная природа хитозана и присутствие реакционноспособных функциональных групп обеспечивает возможность разнообразных- химических модификаций, позволяющих усиливать присущие им свойства или придавать новые- в соответствии с предъявляемыми требованиями. Получение комплексов хитозана1 с другими биополимерами (белками, нуклеиновыми кислотами, полисахаридами и др:) также расширяет спектр его применения.

Известно, что5 в организмах членистоногих и базидальных грибов хитин, находится в комплексе с другими биополимерами, такими как белки, гликаны, меланины. Это придает биоматериалу определенные структурно-функциональные свойства, необходимые организму для адаптации к условиям окружающей среды. Одним из малоизученных биополимеров является меланин. Характерной особенностью меланина является наличие высокостабильных парамагнитных центров, разнообразных функциональных групп, а также системы сопряженных связей в их молекулах. Эти особенности структуры определяют их фото-, радиопротекторные, антиоксидантные и другие свойства. В этой-связи представляется интересным конструирование комплексов, на- основе хитозана- и меланина, которые будут обладать свойствами, отличными от исходных биополимеров, что позволит использовать их в биотехнологии, медицине, для защиты окружающей среды и других областях.

Способность хитозана взаимодействовать с другими биополимерами с образованием комплексов может быть' использована в различных областях науки и производства, например, для фракционирования белковых смесей.

В частности, в сфере производства молочных существует проблема переработки и утилизации молочной сыворотки, в виду большого содержания белка (20 % от всех белков молока) и других ценных соединений. Сывороточные белки по содержанию незаменимых аминокислот являются наиболее ценной частью белков молока, поэтому их использование для пищевых целей имеет большое практическое значение, в том числе в качестве белкового компонента детских питательных смесей. Однако белки сыворотки молока способны вызывать аллергические реакции, что особенно опасно для детей первых лет жизни. При этом наибольшими сенсибилизирующими свойствами обладает [3-лактоглобулин. Особенностью данного белка является его высокая протеолитическая устойчивость и способность попадать в кровеносное русло в практически неизменном виде. Кроме того, при создании смесей для детского питания необходимо максимально приблизить состав продукта к составу женского молока, в котором р-лактоглобулин практически отсутствует.

Таким образом, выделение |3-лактоглобулина из молочной сыворотки представляется важной и актуальной задачей. Удаление р-лактоглобулина из состава молочной сыворотки позволит осуществлять процесс производства профилктических и лечебно-профилактических смесей для детского питания в более мягких условиях, обеспечивающих сохранность пищевой ценности компонентов молочной сыворотки.

В настоящее время с целью выделения и очистки белков используют разнообразные хроматографические методы и методы1 ультрафильтрации, что позволяет получить белковые препараты с высокой степенью чистоты. Однако такие методы, как правило, требуют больших временных затрат и наличия дорогостоящего специального оборудования. Альтернативным методом является селективное осаждение индивидуальных белков с использованием специфических реагентов, одним из которых может являться малотоксичный и способный к биоразложению хитозан.

Целью работы являлось получение и исследование свойств комплексов хитозана и его производных с меланинами, а также разработка подхода, I позволяющего избирательно удалять р-лактоглобулин из состава молочной сыворотки с помощью хитозана.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Исследовать особенности взаимодействия хитозана и его производных с меланинами;

2. Изучить физико-химические характеристики полученных хитозан-меланиновых комплексов;

3. Исследовать свойства хитозан-меланиновых комплексов;

5. Разработать технологическую схему процесса переработки молочной сыворотки с использованием хитозана.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Бакулин, Александр Валерьевич

выводы

1. Исследован процесс взаимодействия хитозана с меланинами, приводящий к образованию стабильных комплексов.

3. Показано, что хитозан-меланиновые комплексы способны связывать 233и на 98% и 908г на 70% из водных растворов.

5. Показана селективность извлечения (З-лактоглобулина на 90% из раствора сывороточных белков с помощью хитозана.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК:

Публикации в других изданиях и материалах конференций:

1. Bakulin A., Kurchenko V., Gavrilenko N., Halavach Т.,

Cherviakovsky E. Interaction of chitosan with whey proteins // New aspects on th chemistry and application of chitin and its derivaties: Proc. 15 Workshop. Torun, Poland, 2009. P.l.

2. Бакулин А. В., Гавриленко H.B., Червяковский E. M., Курченко В.П. Эффективность связывания белков молочной сыворотки с хитозаном // Труды Белорусского государственного университета. 2009. Т. 4, Ч. 2. С. 283-289.

6. Бакулин А.В;, Гавриленко Н.В:, Курченко В.П., Варламов В.П. Взаимодействие хитозана с белками сыворотки молока. // Пищевые технологии и биотехнологии: Мат. XI Международной конф. молодых ученых. Казань, 2010. С.155

7. Azarko-LI., Bakulin A.V., Kozlova-E.I., Kurchenko Y.P., Ajayeva L.Y. Melanin complexes as a radiation bioprotector // Proc. YIII Int. conf. ION. Kazimierz Dolny, Poland, 2010. P. 118.

8. Велешко И.Е., Румянцева E.B., Велешко A.H., Гальбрайх Л.С., Бакулин А.В. Роль меланина в процессах взаимодействия с радионуклеидами в растворах // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана: Мат. X Международной конф. Нижний Новгород, 2010: С. 86-90.

9. Алиева Л.Р., Бакулин А.В., Варламов В.П., Гавриленко Н.В:, Червяковский Е.М., Курченко В.П. Особенности взаимодействия хитозанов с белками молочной сыворотки // Инновационные технологии и оборудование в молочной промышленности: Мат. научно-практической конф. Воронеж, 2010. С. 145.

11. Khismatoullin R. G. , Bakulin А. V., Levov A.N. , Veleshko I.E., Rumyantseva E.V., Krivtsov N. I., Varlamov V.P. Apis mellifera as a perspective source of chitin and chitin-melanin complexe // Proc. 10л Int. Conf. of the European Chitin Society EUCHIS' 11. St-Peterburg, 2011. P. 86.

12. Бакулин A.B., Велешко И.Е., Румянцева E.B., Курченко В.П., Варламов В.П. Изучение взаимодействия хитин-меланиновых комплексов с радионуклидами в растворе // Экология-2011: Мат. IV Международной молодежной научной конф. Архангельск, 2011. С. 84.

13. Бакулин A.B., Гавриленко Н.В., Червяковский Е.М., Курченко В.П., Варламов В.П. Использование хитозана для выделения ß-лактоглобулина из смеси белков сыворотки молока // Белки и пептиды: Мат. V Российского симпозиума. Петрозаводск, 2011. С. 267.

Благодарности

Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю д.х.н., профессору Варламову Валерию Петровичу.

Особую благодарность автор выражает за помощь в проведении исследований и ценные советы заведующему лабораторией прикладных проблем биохимии БГУ к.б.н. Курченко Владимиру Петровичу.

Автор выражает искреннюю признательность за поддержку и оказанное внимание сотрудникам лаборатории инженерии ферментов Центра «Биоинженерия» РАН к.х.н. Ильиной A.B., к.х.н. Лопатину С.А, к.х.н. Левову А.Н., к.х.н. Курек Д.В., к.т.н. Львовой A.A., Зубаревой A.A.

Благодарности сотрудникам других институтов:

Автор благодарит сотрудников ФГУ «Курчатовский институт» к.х.н. Ирину Евгеньевну Велешко и к.х.н. Екатерину Александровну Румянцеву за помощь в проведении совместных исследований.

Автор выражает благодарность сотруднику ИМБ РАН к.б.н. В. А. Миткевичу за неоценимую помощь в проведении совместных работ.

Авотор благодарит к.б.н. Иванову Татьяну Геннадьевну за помощь и содействие в проведении совместных исследований.

Также автор выражает искреннюю признательность к.ф-м.н. И.И. Азарко, Н.В. Гавриленко и всем сотрудникам Белорусского государственного университета, способствовавших выполнению данной работы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Бакулин, Александр Валерьевич, Москва

1. Muzarelli R.A.A. Chitin. Oxford: Pergamon Press, 1977. P. 309.

2. Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение / под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. М.: Наука, 2002. 368 с.

3. Cauchie Н.М. Chitin production by arthropodsin in the hydrosphere // Hidrobiologia. 2002. V.470. №1/3. P.63-95.

4. Majeti N.V., Kumar R. A review of chitin and chitosan applications // Reactive & Functional Polymers. 2000. V. 46. №1. P. 1-27.

5. Tolaimate A., Desbrieres J., Rhazi M., Alagui A., Vincendon M., Votteron P. On the influence of deacetilation process on the physicochemical characteristics of chitosan from squid chitin // Polymers. 2001. Y.41. №7. P. 2463-2469.

6. Zhang M., Haga A., Seriguchi H., Hirano S. Structure of insect chitin isolated from beetle larva cuticle and silkworm (Bomyx mori) pupa exuvia // Biological Macromolecules. 2000. V.27. №1. P.99-105.

7. Boot R.G., Renkema G.H., Strijland A., Zonneveld A.J. , Aerts J.M.F.G. Purification and characterization of human chitotriosidase, a novel member of the chitinase family of proteins // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 26252-26256.

8. Zhu Z., Zheng T., Homer R.J., Kim Y.K., Chen N.Y., Cohn L., Hamid Q., Elias J.A. Acidic mammalian chitinase in asthmatic Th2 inflammation and IL-13 pathway activation // Science. 2004. V. 304. P. 1678-1682.

9. Muzzarelli R. A.A. The discovery of chitin a>570 Megayear old polimer // Chitosan in pharmacy and chemistry / Ed. R. A.A. Muzzarelli, C. Muzzarelli. Italy: Atec, 2002. P. 1-8.

10. Ильина A.B., Зуева О.Ю., Лопатин C.A., Варламов В.П. Ферментный гидролиз а-хитина // Прикладная биохимия и микробиология. 2004. №1". С.42-45.

11. No Н.К., Meyers S.P., Muzzarelly R.A.A., Peter M.M.G. Preparation of chitin and chitosan // Chitin handbook. Italy: Atec, 1997. P.475 489.

12. Ежова E.A. Модификация «холодного способа» дезацетилирования хитина // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана: Мат. VTI междунар. конференции. Москва, 2003. С 17-19.

13. Chang К. L.B., Tsai G., Lee J., Fu W.R. Heterogeneous N deacetylation of chitin in alkaline solution // Carbohydrate Research. V. 303. №3. P. 327 - 332.

14. Rege P.R., Blok L. H. Chitosan processing: influense of process parameters durig acidic and alkaline hydrolysis and effect of the processing sequence on the resultant chitosans properties // Carbohydrate-Research. 1999. Vol. 321. №3-4. P.235-245.

15. Tolaimate A., Desbrieres J., Rhazi M., Alagui A. Contribution to the preparation of chitins and chitosans with controlled physic-chemical properties // Polimer. 2003. V.44. №26. P.7939-7952.

16. Tsigos I., Martinou A., Varum K. Enzymatic deacetylation of chitinos substrates employing chitin deacetylases //Advan. Chitin. 1995. V.100. P.59-69.

17. Tsai G.J., Su W.H., Chen H.C. Antimicrobal activity of shrimp chitin and chitosan from different treatment and applications of fish preservation // Fisheries science. 2002. V. 68. №1. P170-177.

18. Гальбрайх JI.С. Хитин и хитозан: строение, свойства, применение // Соросовский образовательный журнал. 2001. №1. С. 51-56.

19. Хитин и хитозан: природа, получение и применение / Пер. с испанского; под ред. В.П.Варламова, С.В. Немцева, В.Е. Тихонова. М.:РХО. 2010. 292 с.

20. Немцев С.В., Ильина А.В., Шинкарев С.М., Албулов А.И., Варламов

21. B.П. Получение низкомолекулярного водорастворимого хитозана // Биотехнология. 2001. №6. С37-42.

22. Черкасова Е. И., Алексеева М. Ф., Пастухов М.О. Деструкция хитозана ферментным комплексом из Carica papaya // Биотехнология. 2005. №2. С.73-81.

23. Ильина А.В., Ткачева Ю. В., Варламов В.П. Деполимеризация высокомолекулярного хитозана ферментным препаратом Целловеридин Г20х // Прикладная биохимия и микробиология. 2002. Т.38. №2. С132-135.

24. Pettersen Н., Sannes A., Holme Н. К., Kristensen А.Н., Dornish М. Thermal depolimerization of chitosan salts // Advantage Chitin Science/ Ed M.G. Peter, A.Domard, R.A.A. Muzzarelli. Postdam: Germany, 1999. V.4. P.422-428.

25. Hai L., Deip Т., Nagasawa N., Yoshii F., Kume T. Radiation depolimerization of chitosan to prepare oligomers // Nuclear instruments and methods in physics research B. 2003. V.208. P.466-470.

26. Chen R.H., Chang J.R., Shyur J.S. Effect of ultrasonic conditions and storage in solutions on changes in molecular weight polydispersity of treated chitosan // Carbohydrate Research. 1997. V.299. №4. P.287-294.

27. Kasaai M.R., Chin S.L., Arul J. Kinetic aspects of chitosan fragmentation by femtosecond laser // Journal of photochemistry and photobiology A: Chemistry. 2003. V. 159. ЖЗ.Р.207-211.

28. Роговина C.3., Акопова T.A. Модификация полисахаридов в условиях сдвиговых деформаций // Высокомолекулярные соединения. 1994. Т.36. №4.1. C.593-600.

29. Kurita К. Chitin and Chitosan: Functional Biopolymers from Marine Crustaceans // Mar. Biotechnol. 2006. V. 8. P. 203-226.

30. Rhoades J., Roller S. Antymicrobal actions of degraded and native chitosan against spoilage organisms in laboratory media and foods // Applied and environmental microbiology. 2000. V.66. №1. P.80-86.

31. Mukhopadhyay R., Talukdar D., Chatterjee B. P., Guha A. K. Whey processing with chitosan and isolation of lactose // Process Biochemistry. 2003. V.39. P.381-385.

32. Speiciene V., Guilmineau F., Kulozik U., Leskauskaite D. The effect of chitosan on the properties of emulsions stabilized by whey proteins // Food Chemistry. 2007. V.102. P. 1048-1054.

33. Ильин Л.А., Андреева И.Е., Глушков B.A. Изучение зависимости радиационной активности хитозана от его молекулярной массы // Радиационная биология. Радиоэкология. 2004. Т. 44. №2. С. 176-178.

34. Muzzarelli R. A.A. Chitins and chitosans for the repair of wounded skin, nerve, cartilage and bone // Carbohydrate Polymers. 2009. V.76. P. 167-182.

35. Варламов В.П. Зарождение и развитие российской хитинологии // Рыбпром. 2010. №2. С.4-8.

36. Kato A. Industrial application of Maillard-Type conjugates // Food Science Technology Resech. 2002. V.8. P. 193-199.

37. Travel M.N., Domard A. Relation between the physic-chemical characteristics of collagen-and its interaction with chitosan. Part I // Biomaterials. 1993. V.14. №12. P.930-938.

38. Travel M.N., Domard A. Collagen and its interaction with chitosan. II. Influence of the physicochemical characteristics of collagen // Biomaterials. 1995. V.16. №11. P.865-871.

39. Yakovlev G.I., Mitkevich V.A., Struminskaya N.K., Varlamov V.P., Makarov A.A. Low molecular wheat chitosan is an efficient inhibitor of ribonucleases // Biochemical and biophysical research communications. 2007. V.357. P.584-588.

40. Chen L., Tianqing L. Interaction behaviors between chitosan and hemoglobin // International Journal of Biological Macromolecules. 2008. V.42. P.441-446.

41. Богатова O.B., Догарева Н.Г. Химия и физика молока: учебное пособие. Оренбург: ГОУ ОГУ, 2004. 137 с.

42. Madureira A. R., Pereira С. I., Gomes А.М.Р., Pintado М. Е., Malcata F.X. Bovine whey proteins Overview on their main biological properties // Food Res. Int. 2007. V.40. P. 1197-1211.

43. Ha E., Zemel M. B. Functional properties of whey, whey components, and essential amino acids: Mechanisms underlying health benefits for active people (review) // J. Nut. Biochem. 2003. Vol. 14. P. 251-258.

44. Mounsey J.S., O'Kennedy В. Т., Fenelon M. A., Brodkorb A. The effect of heating on P-lactoglobulin-chitosan mixtures as influenced by pH and ionic strength // Food Hydrocolloids. 2008. V.22. P.65-73.

45. Souza H. K.S., Bai G., Alves M. P.G., Bastos M. Whey protein isolate-chitosan interactions: A calorimetric and spectroscopy study // Thermochimica Acta. 2009. V.495. P.108-114.

46. Claesson P. M., Ninham B. W. pH-Dependent interactions between adsorbed chitosan layers // Langmuir. 1992. V. 8. P. 1406-1412.

47. Sawyer L., Kontopidis G. The core lipocalin, bovine P-lactoglobulin // Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1482. P. 136-148.

48. Permyakova E. A., Berliner L. J. a-Laetalbumin: structure and function // FEBS Lett. 2000. V. 473. P. 269-274.

49. Wallevik K. Isoelectric focusing of bovine serum albumin: Influence of binding of carrier ampholytes // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Protein Structure. 1973. V. 322.1.1. P.75-87.

50. Farrell H. M., Bede M. J., Enyeart J. A. Binding of p-nitrophenyl phosphate and other aromatic compounds by b-LG // J. Dairy Sci. 1987. V.70. P.252-258.

51. Selo I. Clément G., Bernard H., Chatel J., Créminon C., Peltre G., Wal J. Allergy to bovine beta-lactoglobulin: specificity of human IgE to tryptic peptides // Clin. Exp. Allergy. 1999. V.29. N.8. P.1055-1063.

52. Laursen I., Briand P., Lykkesfeldt A. E. Serum albumin as a modulator of the human breast cancer cell line MCF-7 // Anticanc. Res. 1990. V.10. P.343-352.

53. Tong L. M., Sasaki S., Mc Clements D.J., Decker E.A. Mechanisms of the antioxidant activity of a high» molecular weight fraction of whey // J. Agric. Food Chem. 2000. V. 48. P. 1473-1478.

54. Lee A.C., Hong Y.H. Coacervate formation of a-lactalbumin-chitosan and b-lactoglobulin-chitosan complexes // Food Research International. 2009. V.42. P.733-738.

55. Aoki T., Iskandar S., Yoshida T., Takahashi K., Hattori M. Reduced immunogenicity of P-lactoglobulin by conjugating with chitosan // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2006. V.70(10). P.2349-2356.

56. Guzey D., Mc Clements D. J. Characterization of b-Lactoglobulin-chitosan interactions in aqueous solutions: A calorimetry, light scattering, electrophoretic mobility and solubility study // Food Hydrocolloids. 2006. V.20. P. 124-131.

57. Левицкий Д.И. Применение метода дифференциальной сканирующей калориметрии для структурно-функциональных исследований мышечных белков // Успехи биологической химии. 2004. Т.44. С.133-170.

58. Montilla A., Casal Е., Moreno F. J., Belloque J., Olano A., Corso N. Isolation of P-lactoglobulin from complex with chitosan // International Dairy Journal. 2007. V.17P. 459-464.

59. Miralles В., Marti'nez-Rodri'guez A., Santiago A., Lagemaat J., I-Ieras A. The occurrence of a Maillard-type protein-polysaccharide reaction between b-lactoglobulin and chitosan // Food Chemistry. 2007. Y.100. P.1071-1075.

60. Dalgeish D. G. Conformations and structures of milk proteins adsorbed to oil-water interfaces // Food Research International. 1996. V.29. P.541-547.

61. Dickinson E. Emulsion stabilization by polysaccharide and polysaccharide-protein complexes / In Food Polysaccharides and Their Applications Ed. A. M. Stephen. New York: Marcel Dekker, 1995. P.501-515.

62. Dickinson E. Hydrocolloids at interfaces and the influence on the properties of dispersed systems // Food Hydrocolloids. 2003. V.17. P.25-39.

63. Laplante S., Turgeon S. L., Paquin P. Emulsion-stabilizing properties of chitosan in the presence of whey protein isolate: Effect of the mixture ratio, ionic strength and pH // Carbohydrate Polymers. 2006. V.65. P.479-487.

64. Laplante S., Turgeon S. L., Paquin P. Effect of pH, ionic strength, and composition on emulsion stabilising properties of chitosan in a model system containing whey protein isolate // Food Hydrocolloids. 2005. V.19. P.721-729.

65. Генная терапия медицине будущего / Под ред. А.В. Зеленина. М.: ВИНИТИ, 2000. 135с.

66. Morille M., Passirani С., Vonarbourg A., Clavreul A., Benoit J.P. Progress in developing cationic vectors for non-viral systemic gene therapy against cancer // Biomaterials. 2008. V.29. P.3477-96.

67. Kim Т.Н., Jiang H.L., Jere D., Park I.K., Cho M.H., Nah J.W., et al Chemical modification of chitosan as a gene carrier in vitro and in vivo // Prog. Polym. Sci. 2007. V.32. P.726-53.

68. Lee M.K., Chun S.K., Choi W.J., Kim J.K., Choi S.H., Kim A., et al. The use of chitosan as a condensing agent to enhance emulsion-mediated gene transfer // Biomaterials. 2005. V.26. P.2147-56.

69. Masotti A., Bordi F., Ortaggi G., Marino F., Palocci C. A novel method to obtain chitosan/DNA nanospheres and a study of their release properties // Nanotechnology. 2008. V.19. 55302. P. 1-6.

70. Mao H. Q., Roy K., Troung-Le V. L., Janes K. A., Lin K. Y., Wang Y., et al. Chitosan-DNA nanoparticles as gene carriers: Synthesis, characterization and transfection efficacy // Journal of Controlled Release. 2001. V.70. P.399-421.

71. Ishii Т., Okahata Y., Sato T. Mechanism of cell transfection with plasmid/chitosan complexes // Biochimica et Biophysica Acta. 2001. V.15. P.51-64.

72. Саянов В.И., Ильина A.B., Варламов В.П., Евдокимов Ю.М. Влияние интеркаляторов на свойства жидкокристаллических дисперсий комплекса НК-' хитозан // Молекулярная биология. 2002. Т.36. №4. С.699-705.

73. Евдокимов М.Ю., Саянов В.И., Скуридин С.Г., Дембо А.Т. Некоторые рентгенографические параметры жидкокристаллических дисперсий комплексов НК-хитозан // Молекулярная биология. 2002. Т.36. №4. С.706-714.

74. Evdokimov Y., Salyanov V.I. Liquid-crystalline dispersions of complex formed of chitosan with double-stranded nucleic acids // Liq. Crystals. 2003. V.30. P.1057-1074.

75. Евдокимов Ю.М., Салянов В.И., Скурдин С.Г. Наноструктуры и наноконструкции на основе ДНК / Под ред. Ю.М. Евдокимова. М.: САЙНС-ПРЕСС, 2010. 256 с.

76. Hayatsu H., Kubo T., Tanaka Y., et al. Polinueleotide-chitosan complex, an insoluble but reactive from of polinucleotides // Chem. Pharm. Bull. 1997. V.45. P.1363-1368.

77. Кочетков H.K., Бочков А.Ф., Дмитриев В.A. и др. Химия углеводов. М.: Химия, 1967. 671 с.

78. Saether H.V., Holme H. К., Maurstad G., Smidsrod О., Stokke В. T. Polyelectrolyte complex formation using alginate and chitosan // Carbohydrate Polymers. 2008. V.74. P.813-821.

79. Li X., Xie H., Lin J., Xie W., Ma X. Characterization and biodégradation of chitosan-alginate polyelectrolyte Complexes // Polymer Degradation and Stability. 2009. V.94. P. 1-6.

80. Huguet M.L., Neufeld R.J., Dellacherie E. Calcium-alginate beads coated with polycationic polymers: comparison of chitosan and DEAE-dextran // Process Biochem. 1996. V.31. P.347-353.

81. George M., Abraham T. E. Polyionic hydrocolloids for the intestinal delivery of protein drugs:Alginate and chitosan — a review // Journal of Controlled Release. 2006. V.114. P.1—14.

82. Yan X. Khor E., Lim L.Y. Chitosan -alginate films prepared with chitosans of different molecular weights // Journal Biomedicine Material Research (Appl. Biomater.). 2001. V.58. №4. P.358-365.

83. Давыдова В.Н., Володько А.В., Ермак И.М. Изучение процесса формирования комплексов хитозан-каррагенан в разбавленных растворах // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана: Мат. X Междунар. Конф. Н.Новгород, 2010. С.95-97.

84. Hugerth A., Caramletham N., Sundelof L.O. The effect of charge density and conformation on the polyelectrolyte complex formation between carrageenan and chitosan // Carbohydrate Polymer. 1997. V.34. №3. P. 149-156.

85. Mitsumata Т., Suemitsu Y, Fujii K., Fujii T.,Taniguchi Т., Koyam K. pH-Response of chitosan, k-karragenan, carboxymethil cellulose sodium salt complex hydrogels // Polimer. 2003. V.44. №23. P.7103-7111.

86. Шумилова E.B., Щипунов Ю.А. Гели хитозана с каррагинанами // Коллойдный журнал. 2002. Т.64. №3. С.413-420.

87. Братская С.Ю., Маринин Д.В., Simon F. и др. Антиадгезивные биомедицинские покрытия, содержащие хитозан и его производные // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана: Мат. X Межд. Конф. Н.Новгород, 2010. С. 169-173.

88. Офицеров E.H., Лисин C.A., Завахина Ю.А. Пектин-хитозановые комплексы и некоторые их свойства// Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана: Мат. VII. Межд. Конф. Санкт-Петербург-Репино, 2003. С.428-430.

89. Рашидова С.Ш., Милушева Р.Ю., Семенова Л.Н. и др. К изучению взаимодействия двух природных полисахаридов // Современные перспективыв исследовании хитина и хитозана: Мат. VII. Межд. Конф. Санкт-Петербург-Репино, 2003. С.347-350.

90. Hiorth М., Kjoniksen A.L., Knudsen К. D., Sande S. A., Nystrom В. Structural and dynamical properties of aqueous mixtures of pectin and chitosan // European Polymer Journal. 2005. V.41.1.8. P.1718-1728.

91. Chen P.H., Kuo T. Y., Kuo J. Y., Tseng Y. P., Wang D. M., Lai J. Y., Hsieh H. J. Novel chitosan-pectin composite membranes with enhanced strength, hydrophilicity and controllable disintegration // Carbohydrate Polymers. 2010. V.82. P. 1236-1242.

92. Yao K.D., Liu J., Cheg G.X., Lu X.D., Tu H.L., Silvia J.A.L. Swelling behavior of pectin/chitosan complex films // Journal of Applay Polimer Science. 1996. V.60.№2. P.279-283.

93. Fernandez-Hervas M.J., Fell J.T. Pectin/chitosan mixtures as coatings for colon-specific drug delivery: an in vitro evaluation // Int. J. Pharm. 1998. V.169. P.115-119.

94. Рашидова С.Ш., Милушева Р.Ю., Воропаева H.JI., Никонович Г.В и др. Формирование наночастиц в системах на основе хитозана // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана: Мат. XIII Межд. Конф. 2006. С.124-126.

95. Rosea С., Рора М. I., Lisa G., Chitanu G. С. Interaction of chitosan with natural or synthetic anionic polyelectrolytes.l. The chitosan-carboxymethylcellulose complex// Carbohydrate Polymers. 2005. V.62. P.35-41.

96. Arguelles-Monal W., Garciga M., Peniche-Covas C. Study of the stechiometric polyelectrolyte complex between chitosan and carboxymethil cellulose // Polimer Bull. 1990. V.23. №3. P.307-313.

97. Chitin, Chitosan, Oligosacharides and their Derivatives: Biological Activities and Applications / Ed. S.K. Kim. London, N.Y.: CRC Press. 633 p.

98. Ильина A.B., Варламов В.П. Полиэлектролитные комплексы на основе хитозана (обзор) //Прикладная биохимия и микробиология. 2005. Т.41. №1. С. 9-16.

99. Denuziere A., Ferrier D., Domard A. Interaction between chitosan and glycosaminoglycans (chondroitin sulfate and hyaluronic acid): physicochemical and biological studies // Ann Pharm Fr. 2000. V.58. №1. P.47-53.

100. Shinoda K., Nakajiama A. Complex formation of the hyaluronic acid' or chondroitin sulfate with glycol chitosan // Bull: Chem. Res. 1975. V.53. P.400-408.

101. Shinoda K., Nakajiama A. Complex formation of the heparin or sulfate cellulose with glycol chitosan // Bull. Chem. Res. 1975. V.53. P.392-399.

102. Kweon DK, Song SB, Park YY; Preparation of water-soluble chitosan/heparin complex and its application as wound healing accelerator // Biomaterials. 2003. V. 24(9). P. 1595-601.

103. Способ обнаружения комплексов между гепаринами и поликатионами: пат. 2370271 Рос. Федерация. №2006141290/15; заявка 22.11.2006; опубл. 20.10.2009.

104. Lin: W.C., Liu Т.С., Yang М.С. Hemocompatibility of polyacrylonitrile dialysis membrane immobilized with chitosan and heparin conjugate // Biomaterials.2004. V.25; №10. P.1947-1957.

105. Агафонов В.Е., Ильинцева Н.Е., Гервазиева В.Б. Особенности секреторного иммунитета желудочно-кишечного тракта // Российский аллергологический журнал. 2011. №1. С.14-24.

106. Qaqish В., Amiji М.М. Synthesis of a fluorescent chitosan derivative and its application for the study of chitosan-mucin interactions // Carbohydrate Polymers. 1999. V.38.1.2. P.99-107.

107. Лигнины (структура, свойства и реакции) / Под ред. К.В. Сарканена, К.Х. Людвига. М.: Лесная промышленность, 1975. 629 с.

108. Закис Г.Ф. Функциональный анализ лигнинов и их производных. Рига: Знание, 1987. 228 с.

109. Паламарчук И.А., Макаревич Н.А., Бровко О.С., Бойцова Т.А., Афанасьев Н.И. Кооперативные взаимодействия в системе лигносульфонат-хитозан//растительного сырья. 2008. №4. С.29-34.

110. Макаревич Н.А., Паламарчук И.А. Полиэлектролитные комплексы на основе лигносульфанатов и хитозана в системе очистки сточных вод целлюлозно-бумажных предприятий //Вода:химия и экология. 2009. №7. С.23-29.

111. Макаревич Н.А., Бойцова Т.А. Динамика изменения сорбционных свойств лигносульфонатов, хитозана, полиэтиленполиамина, и поликомплексов на их основе в зависимости от степени их набухания в парах воды // Вода: химия и экология. 2010. №6. С.22-28.

112. Ganjidoust Н., Tatsumi К., Yamagishi Т., Gholian R.N. Effect of synthetic and natural coagulant on lignin removal from pulp and paper wastewater // Water Science and Technology. 1997. V.35.1. 2-3. P.291-296.

113. Марквичева E.A. Биомедицинское применение хитозана для биоинкапсулирования белков, пептидов и животных клеток // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана: Мат. VII Межд. Конф. Санкт-Петербург-Репино, 2003. С. 405-408.

114. Jayakumar R., Menon D., Manzoor K., Nair S.V., Tamura H. Biomedical applications of chitin and chitosan based nanomaterials-—A short review // Carbohydrate Polymers. 2010. V.82. P.227-232.

115. Hoagland P.D., Parris N. Chitosan/Pectin Laminated Films // Journal Agriculture Food Chemistry. 1996. V.44. №7. P.1915-1919.

116. Нудьга JI.A., Петрова B.A., Бочек A.M. и др. Пленочные матрицы для культивирования клеток кожи человека на основе природных полисахаридов // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана: Мат. XII Межд. конф. Казань, 2006. С. 230-233.

117. Ильина А.В., Габайдуллина А.А., Мелентьев А.И., Варламов В.П. Получение микроастиц на основе хитозана и исследование их взаимодействия с интерфероном // Прикладная биохимия и микробиология. 2008. Т.44. №2. С.1-5.

118. Ильина А.В. Формирование наночастиц один из способов модификации хитозана//Рыбпром. 2010. №2. С.70-75.

119. Agnihotri S. A., Mallikarjuna N. N., Aminabhavi T. M. Recent advances on chitosan-based micro- and nanoparticles in drug delivery // Journal of Controlled Release. 2004. V.100. P.5 -28.

120. Балабушевич Н.Г., Печенкин M.A., Вихорева Г.А., Ларионова Н.И. Хитозан-содержащие наноструктурированные микрочастицы с инсулином // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана: Мат. X Межд. Конф. Н.Новгород, 2010. С. 162-165.

121. Britgton G. The biochemistry of natural pigments. Cambridge: Cambridge Univ. Press, 1983. 366p.

122. Riley P.A. Melanin.-Molecules in focus // J. Biochem.Cell Biol. 1997. V.29. №11. P.1235-1239.

123. Лопатина B.A., Донцов A.E., Островский M.A. Генерация супероксида при взаимодействии меланина с кислородом // Биохимия. 1984. Т.49. №10. С.1712-1718.

124. Ligonzo Т., Ambrico М., Augelli V. et. al Electrical and optical properties of natural and synthetic melanin biopolymer // Journal of Non-crystalline Solids. 2009. V.355. P.1221-1226.

125. Барабой В.А. Структура, биосинтез меланинов, их биологическая роль и перспективы применения // Успехи современной биологии. 2001. Т. 121. №1. С.36-46.

126. Аверьянов А.А. Гужова Н.В., Мочалов В.В. Влияние меланина на цитотоксичность кислородных радикалов //Биохимия. 1987. Т.52. №9. С. 15391546.

127. Fogarty R. V., Tobin J.M. Fungal melanins and their interactions with metals //Enzyme and Microbial Technology. 1996. V.19. P.311-317.

128. Howell R.C., Schweitzer A.D., Casadevall A., Dadachova E. Chemosorption of radiometals of interest to nuclear medicine by synthetic melanins // Nuclear Medicine and Biology. 2008. V.35. P.353-357.

129. Carsberg C.J., Warenius H.M., Friedmann P.S. Ultraviolet radiation-induced melanogenesismin human melanocytes. Effects ofmodulating protein kinase С // J. Cell. Sci. 1994. V.107. №9. P.2591-2597.

130. Gilchrest B.A., Park H.Y., Eller M.S., Yaar M. Mechanisms of ultraviolet light-induced pigmentation //Photochem. Photobiol. 1996. V.63. №1. P.1-10.

131. Борщевская М.И., Васильева C.M. Развитие представлений о биохимии и фармокологии меланиновых пигментов (обзор) // Вопросы мед. химии. 1999. Т.45. №1. С.13-23.

132. Johanson M.W., Soderhall К. Relevance of drug-melanin interactions to ocular pharmacology and toxicology // Parasitology Today. 1989. Vol.5. P.171.

133. Щерба B.B., Бабицкая В.Г., Курченко В.П. и др. Антиоксидантные свойства меланиновых пигментов грибного происхождения // Прикладная биохимия и микробиология. 2000. Т.36. №5. С. 596-597.

134. Хрулева И.М., Берлин А.А. Противоопухолевая активность синтетических, биосинтетических и природных меланинов // Изв. АНСССР. Серия биол. науки. 1973. №3. С.438-442.

135. Жеребин Ю.А., Сава М.К., Колесник А.А., Богодский А.В. Исследование окислительных свойств эномеланина // Доклады АН СССР. 1982. Т.263. №1. С.112-115.

136. Dadachova Е., Brayan R., Huang X. et. al Ionizing radiation changes the electronic properties of melanin and enhances the growth of melanized fungi // Plos one. 2007.1.5. P.l-13.

137. Твердохлебова И.И. Конформация макромолекул (вискозиметрический метод оценки). М.: Химия, 1981. 284 с.

138. Бабицкая В.Г., Щерба В.В., Иконникова Н.В. Меланиновый комплекс гриба Inonotus obliquus // Прикладная биохимия и микробиология. 2000. Т. 36. №4. С. 439-444.

139. Керрингтон А., Маклечлан Э. Магнитный резонанс и его применение в химии. М.: Мир, 1970. 448 с.

140. Павлоцкая Ф.И. Основные принципы радиохимического анализа объектов природной среды и методы определения радионуклидов стронция и трансурановых элементов. Обзор // Жур. аналитической химии. 1997. Т.52. № 2. С. 126-143.

141. Щекатихина А.С., Курченко В.П. Генопротекторные свойства флаволигнанов из семян расторопши пятнистой (Si I bum marianum I) // Труды БГУ. 2009. Т.4. 4.1. С.141-148.

142. Лукьянова Л. Д., Романова В.Е., Чернобаева Г.Н. и др. Особенности антигипоксического действия мексидола, связанные с его специфическим влиянием на энергетический обмен // Химико-фармацевтический журнал. 1990. №8. С. 9-11.

143. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. 1970. Vol.227. №7. P.680-685.

144. ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ ИНСТРУКЦИЯ на производство белкового продукта со сниженными аллергенными свойствами из смеси белков молочной сыворотки с помощью хитозана1. Разработано

145. Центр «Бионнженерня» РАН м.н.с. Лаборатории инже^е^ииг-ферментов1. Бакулин A.B.1. ТУ1. Согласовано

146. Центр «Биоипженерия» РАН Заведующий лабораторией ^ии фермедош,/) проф. Д.Х.Н. Варламов В.П.

147. ЗАО «Био1 рогресс» Главигд^т^х н о логк.б.н. Фролова М.А.на фасовку

148. Обозначение 9.19 Нутч-фильтр1.5,6 Емкость 10,18 Резербуар премныи

149. Насос центробежный 11 Насос вакуумный

150. IТасщшщионно-охткпепьнт усптВка % Вакуум-выпарная установка

151. Сепаратор 15 Сушилка распылительная

152. Злектродиализная установка 16 Циклоншш Смеситель 20 Центрифуга

153. Аппаратурная схема переработкимолочной сы&оротки с использованием хитозона1. Лист Листай 1

Информация о работе