Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и анализ межвидовых соматическихцибридов картофеля

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Получение и анализ межвидовых соматическихцибридов картофеля"

НАЦЮНАЛЬНА АКАДЕМ1Я НАУК УКРА1НИ Р Г 6 О Д"СТИТУТ клттно! 6icuoriï та генетичнси шженерл

1 з m

На правах рукопису УДК 575.222.7+582.951.4

евтушЕНКо

Дмитро Павлович

ОТРИМАННЯ ТА AHAJ1Í3 М1ЖВИДОВИХ СОМАТИЧНИХ ЦИБРИД1В KAPTOrUIÍ

03.00.25 — клгпшна бioлoгiя

АВТОРЕФЕРАТ дисертацн на здобуття вченого ступеня кандидата бюлопчних наук

Кшв 1995

Роботу виконано у в!ддШ кл1тинно! селекцП 1нституту кл1тинно! б!олог1! та генетично! 1нженер1! HAH Укра1ни

Науковий кер1вник - член-кореспондент HAH Укра1ни та

УААН, доктор б1олог!чних наук В. А. Сидоров

OOiuiüHi опоненти - доктор бЮлопчних наук

Пров1дна орган1зац1я - Нац1ональний ун1верситет

1м.Т.Г.Шевченка М1н1стерства осв1ти Укра!ни

Захист в!дбудеться "¿У" 1995 р. о JA. год.

на зас!данн1 спец1ал!зовано! вчено! ради Д.01.19.01 ^статуту кл1тинно1 б1олог11 та генетично! 1нженер1! HAH Укра!ни за адресою: 252143, КИ1В-143. вул. Заболотного, 148.

3 дасертац1ею можна ознайомитися в б1бл1отец1 ¡нституту кл1тинно! б1олог11 та генетично! 1нженер11 HAH Укра!ни.

Автореферат розЮлано листомс/д 1995 р.

Вчений секретар сиец1ал1зовано! ради.

Б. 0. Левенко

кандидат б1олог1чних наук М. В. Кучу к

Л.В.Малишева

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуалыисть теми. Розробка ефективних метод!в генетич-Hoi реконструкцН культурних рослин з метою пол!пшення 1х еих1дних характеристик належить до актуальних завдань сучас-Hoi б1отехнологп. Одним 13 таких напрямк1в е соматична riб-ридизац1я, яка дозволяе подолати бар'ери статево! HecyMic-HocTi при м1жвидових схрещуваннях та залучити до селекц1йно-го процесу ф!логенетично в1ддален1 види. Однак отримання м1жвидоБих ядерних ПбридХв картошп поряд 1з набуттям кових властивостей супроЕоджуеться втратою сортоспециф1чних ознак генотипу i потребуе додаткових рекурентних схрещувань. На в!дм1ну в1д г1брид1з. отримання цибрид!в - рослин, що Mic-тять ядро одного з партнер1в та цитоплазму (або II частину) 1ншого, дозволяе не т1льки зберегти гетерозиготн!сть вих!д-ного сорту, але й перенести в культурну картоплю господарсь-ко-ц1нн1 ознаки, що кодуються плазмагенами 1нших вид1в Solanum.

Цибриди становлять зкачний 1нтерес як для фундаменталь-них, так i прикладних досл!джень: с зручною модельного системою для вивчення взаемов!дносин ядра i органел кл!тини, доз-воляють 1дентиф1кувати ознаки, що контролюються цитоплазмо-ном, надають 1нформац1ю про ф!логенш вид!в тощо.

Б1льш1сть генотип!в культурно! картоши м1стить пластом, характерний для Solanum tuberosum L. Це обумовлено од-нобатьк1вським, материнським успадкуванням пластид у рослин ц1с! культури. Разом з тим 1снуе величезна р!зноман1тн1сть диких вид1в Solanum, що мають видоспециф!чний цитоплазмон. В1домо, що хлоропластна та м!тохондр!альна ДНК можуть конт-

ролювати ряд ц1нних в практичному в1дношенн! ознак, а саме 1нтбнсивнicTb фотосинтезу, ст1йк!сть до патотоксин!в, repöi-цид!в, толерантн1сть до низьких та високих температур, ци-топлазматична чолов!ча стерильнЮть та 1н. (Medgyesy. 1990).

Однак до цього часу потенц!ал плазмофонду диких вид!в картопл1" практично не використовуеться. На сьогодн1 BiflOMi лише Д9к1лька роб!т по отриманню цибридгв картопл1 (Sidorov et al., 1Э89; Perl et al.. 1990). Досл1дження стримуються в1дсутн1стю генетично маркерованих л1н1й, необх!дних для се-лекцП цибрид1в, та значними труднощами використання метод1в кл!тинно! 1нженерП стосовно ц1е1 культури. Отже. розробка та використання нових технологий у створенн1 соматичних циб-рид1в дозволить розширити плазмофонд культурно! картопл! та виявити найб1льш ц1нн1 джерела цитоплазми серед диких вид1в So lanum.

Мета та завдання роботи. Мета - вивчення можливост! от-римання м1жвидових соматичних цибрид1в картопл1 з викорис-танням нових п1дход1в у створенн! алоплазматичних форм рос-лин.

До конкретних завдань роботи входило:

1. Розробити кл!тинну технологию отримання цибрид!в, яка не потребуе присутност1 селективних генетичних маркер1в у вих1дному рослинному матер1ал1.

2. За допомогою ново! технологи створити цибридн! рос-лини, що м1стять ядерний генетичний матер1ал культурно! картопл! 1 пластиди диких вид!в Solanum.

3. Створити соматичн1 цибриди на основ! хлороф!лдефект-них пластомних мутант!в S. tuberosum L. 1 р!зних представни-к!в роду Solanum.

4. Провести анал1з вШбраних рослин-регенерант!в для доказу ix цибридно! природи.

Наукова новизна досл1дхень.

1. Запропоновано принципово новий п1дх1д у ств&ренн! цибридгв. який дозволяе спрямовано отримувати рослини з чу-жинними органелами без присутност! у вих!дному Матер1ал1 се-лективних генетичких маркер1в.

2. За новою технологией вперше отримано цибридн1 рослини S.tuberosum L., що м!стять хлоропласта дикого виду кар-топл! S.bulbocastcnum Dun., S.pinnatisectm Dun., S.acaule Bitt.

3. Вперше показано, що протопласта, оброблен! надле-тальними дозами мутагену, можуть бути використан1 як донори мутантних пластид.

4. Запропоновано модифшовану методику злиття протоп-ласт1в i3 мезоф1льно! тканини листка.

5. Продемонстровано доц1льн1сть використання надлеталь-них доз ¥_опром1нення протопласт!в донора для отримання циб-рид1в картопль

6. На OCHOB1 хлороф1лдефектних пластомних мутант!в S. tuberosum L. вперше створено цибридн! рослини, що м1стять пластиди дикого бульбоутворюючого виду S. microdontum Dun., S. stoloniferwn Schlecht., S.gibberulosm Juz., S. cardiophyl-lum Lindl., S.kurtzianum Bitt. (S.macolae Buk.).

7. Показано сум1сн1сть ядерного генома S. tuberosum L. 1 пластома диких вид!в картопл1. що використовувалися в робот1.

8. Розроблено кл1тинно-1нженерн1 засоби, що дозволяють використовувати широку р1зноман!тн1сть плазмофонду р1зних вид!в Solanum в селекцП культурно! картопл!.

- 4 -

Практична ц!нн1сть роботи.

1. Розроблена нова кл1тинна технология отримання цибри-д1в дозволяе зберегти гетерозиготн1сть вих!дних сорт1в кар-

топл1.

2. CTBopsHi цибриди картошй можуть бути безпосередньо використан! в рослинництв1 без додаткових рекурентних схре-щувань.

3. 0триман1 цибридн! рослини дакть можлив!сть Шнтиф!-кувати господарсько-ц!нн! ознаки, що кодуються цитоплазмоном диких вид1в Solanum, та розширити плазмофонд культурно! кар-тошп.

4. Створен: форми рослин можуть бути вих1дним селекц1й-ним матер1алом для отримання нових copTiB картошп.

Отриман! рослини передан! до БЮтехнолог1чно! лаборато-pl! кафедри б!олог!1, селекц1! та захисту рослин Льв1вського державного с!льськогосподарського 1нституту для подальшого Ix вивчення в польових умовах.

На захист виносяться положения.

1. Соматична г!бридизац1я дае можлив1сть спрямовано от-римувати цибридн! рослини без присутност! у вих1дному мате-р!ал1 селективних генетичних маркер!в.

2. Метод злиття протопласт!в дозволяе використовувати в селекцП картопл! плазмофонд диких бульбоутворюючих вид!в Solanum: S.bulbocastanum Dun., S. pinnatisectm Dun., S.acau-leBitt., S.microdontum Dun.. S. stoloniferwn Schlecht.. S. gibberulosum Juz., S.cardiophyllum Lindl., S.kurtzianum Bltt. (S.macolae Buk.).

3. При соматичнШ г1бридизац11 протопласта, оброблеШ надлетальними дозами мутагену, можуть бути використан1 як донори мутантних пластид.

4. Можливе отримання цибрид1в картопл1 як з реконстру-йованою мтДНК, так 1 з мтДНК одного 1з партнер1в.

Апробац1я роботи. Результате досл1джень було представлено на 4-ому бвропейському конгрес1 з шИтинно! б1ологп (Прага. 4exiH, 1994), М1:кнародк1й конференцН "Молекулярко-генетичнг маркери та селекц!я рослин" (Ки1в, 1994). М1жна-родному симпоз1ум1 "Б1отехнолог1я та генетична Шженер1я рослин" (Ки1в, 1994), И1жнародн1й конференцН "Актуальн1 проблеми генетики. б!отехнологп та селекцИ" (Кишшпв. Молдова. 1994), Кейстоунському симпоз1ум1 з 61олог11 рослинно! кл1тини (Таос, США. 1995), Кейстоунському симпоз1ум1 з мор- -фогенезу рослин (Х1лтон Хед Айленд, США, 1995). а також на наукових сем1нарах в!дд1лу кл!тинно1 селекцП 1нституту кл1-тинно! б1олог11 та генетично! 1нженерП HAH Украгни.

Публ1кацП. За матер1алами дисертацП опубл1ковано 8 роб1т, список яких наведено в к1нц! автореферату.

Структура та обсяг роботи. Дисертац1я складаеться 1з вступу. огляду л1тератури, матер1ал1в та метод1в. результата досл1джень та Ix обговорення, заключения, висновк1в та списку цитовано! л1тератури, який м1стить 208 б1бл1ограф1ч-них посилань. Робота викладена на 162 стор!нках машинопису. включае одну таблицю, 29 рисунк1в.

- 6 -

МАТЕРIАЛИ ТА МЕТОДИ

У досл1дах використовували р1зн! види та форми картошп:

1. Дик1 бульбоутворкжш види роду Solanum L., секцП Tuberarlum (Dun.) Buk., ягл з1др1зняються р1внем пло!дност1 та належать до р!зних сер!й дзох географ1чних груп. Швден-ноамериканськ! види: S.acanle Bitt.. S.mtcrodontum Bitt.. S.gibberulosum Juz., S.kurtzianum Bitt. (S.macolae Buk.). Швн1чноамериканськ1 види: 5. bulbocastanum Dun.. S.pinnatl-sectum Dan., S.stoloniferm Schlecht., S.cardiophyllum Lyndl.

2. Культуркий тетрашшдний (2n=4x=48) вид Solanum tuberosum L. , cepifl Tuberosa (F.ydb.) Buk.. Сорти: Свхтанок ки-1вський, Зарево.

3. Хлороф1лдефектний пластомний мутант S. tuberosum L. сорту Зарево - лШя Z-3 (Sicorov et al., 1990).

Рослини вирощували в асептичних умовах на модиф1ковано-му безгормональному середовисц MS (Murashige, Skoog, 1962) або на кивильному середовищ! ST-3 (Сидоров и др., 1985), при 16-годинному св1тловому фотопер!од1, осв1тленн1 3-4 клк та температур! 23-25°С. Розмножували живцюванням.

Мезоф1льн1 протопласта вид1ляли за вдосконаленою методикою (Сидоров и др.. 1985).

Для мутагенезу протопласт1в виду-донора органел використовували 3-5 мМ розчин К-н1трозо-М-метилсечовини (1-2 го-дини) та/або ^-опром1нення дозою 1000-2000 Гр (9 Гр -хв"1,

60со).

Злиття мезоф1льних протопласт1в проводили за методикою Менделя (Menczel et al., 1981), модиф1кованою стосовно умов експерименту.

Культивування протопласПв та продуктов ïx злиття здшснювали в р!дкому живильному середовищ! SW (Sidorov et al., 1987) з використанням методу 1моб1л1зацН кл1тин в альПнат кальц1ю.

Селекцш цибридних протоклон1в проводили на твердому середовищ! ST-1 (Сидоров и др., 1985), яке mîctiuio низький р1вень джерел вуглеводного живлення та було доповнене 0,5-1 г/л стрептомщинсульфату. В експериментах з використанням хлороф1лдефектких мутант1в селективне середовище було 5ез стрептомЩину.

Для регенерацП рослин використовували мод;;ф!коване середовище ST-2 (Сидоров и др., 1985). Регенеранти вкор1нюЕали на безгормональному середовипц KS, висаднували в грунт.

Сумарну рослинну ДНК вид!ляли з листя за стандартною методикою (Murray, Thompson, 1980).

ДНК 1з хлоролласт1в та м1тохондр1й вид1ляли, використо-вуючи в1дом1 методики (Wilson, Chourey. 1984; Bookjans et al.. 1984).

Рестрикц1ю проводили зг1дно з рекомендаЩями виробник1в фермент1в (Boehringer Mannheim, FRG).

Саузерн-блот-г1бридиза1дю проводили на нейлонових ф1ль-трах за методикою, запропонованою Чач та Плбертом (1984). Як рад1оактивний зонд використовували Ват HI-фрагмент мтДНК Oenothera довжиною 5.2 т.п.н., що м1стить посл1довн1сть 18S-. 5БрДНК, 5'ND5 та вид1лений з плазм1ди В6/2 (Brennicke et al.. 1985).

Цитогенетичний анал1з та анал!з множинних молекулярних форм естераз проводили за описаними методами (Сидоров и др., 1985; Mouras et al.. 1987).

- 8 -

РЕЗУЛЬТАТИ ТА IX ОБГОВОРЕННЯ

1. Вивчення видоспециф1чност1 пластома вих1дних форм та вид1в картопл!.

Отримання цибрид1в картопл1 грунтувалося на перенесены! пластид 1з диких вид1в пасльонових в культурний S. tuberosum L. Тому на першому eTani досл1джень було проведено рестрикт-ний анал1з хлоропластно! ДНК диких вид!в Solanum, що станов-лять певний !нтерес для селекц!онер1в, та перспектизних сор-TiB картопл!.

Результата анал1зу пластома з викэристанням ендонуклеаз Ват HI та Hind III показали, що дик1 види мають видоспеци-ф!чн1 рестриктн! фрагменти хлДНК, як1 в1др1зняються в1д ана-лог1чних фрагмент!в пластома як 1нших диких вид1в ц1е! роди-ни, так i культурно! картопл!. За допомогою цього ж методу було встановлено, що б1льш!сть сорт1в картопл! мають спектри хлДНК, характеры1 для S. tuberosum ssp. tuberosum - так званий Т-тип пластома (Hosaka. 1986). Отриман! результата ' п1д-тверджують теор1ю походження культурно! картопл! в1д одного сильного предка, запропоновану Хосакою 1з сп1вавт. (Hosaka, Hanneman, 1988). В1дпов!дно, дик1 види Solanum мають р!зне з культурною картоплею походження i, як насл1док, в!дм1нну цитоплазму. Б1льш того, ступ1нь в!дм1нност! цитоплазмона м1ж видами надае 1нформац1ю про ф1логенетичну в1ддален1сть !х один в!д одного.

0ск1льки хлоропластна ДНК може контролювати ряд ц1нних для с1льського господарства ознак (Medgyesy. 1990), то отримання цибрид1в картопл! дасть можлив1сть залучити до селек-

ц1йкого процесу корисн1 ознаки, що кодуються пластомом диких вид!в Solanum. Для створення цибридних форм картопл! в робо-т1 використовували метод злиття протопласт!в за схемою "ре-цип!ент + донор". Рецип1ентом чужинно! цитоплазми були сорти Свiтанок кигвський, Зарево. За донора органел використовували дик! види S.bulbocastanum Dun., S. pinnatisectum Dun., S. acaule Bitt., S. stoloriiferum Schlecht., S.microdontia Dun., S.gibberulosum Juz.. S. cardiophyllum Lindl., S.kurtzianum Bitt. (S.macolae Buk.). Вказан! види HecyMicHi з S. tuberosum L. при статев1й г!бридизац!1.

2. Отримання цибрид1в картопл! без використання цитоплазматичних мутант1в.

Як правило. необх!дною умовою для отримання цибрид1в е використання рослинного матер!алу з селективними цитоплазма-тичними маркерами: хлороф!лдефектн!стю, ст!йк!стю до антиб!-отик1в, герб1цид1в тощо. Однак застосування тагах мутант1в потребуе Ix попереднього отримання, а це, в сзою чергу, пов'язано з! значними витратами часу (piK 1 бгльше) i не завжди зак!нчуетья усп1шно. Кр1м того. хлороф!лдефектн1 пластомн1 мутанта можуть мати небажан! зм!ни ядерного генома (делец!I та 1н.), як1 виникають при мутагенн!й обробц!. Використання таких рослин за рецип!ента чужинних органел приз-водить до отримання цибрид!в 1з втраченими сортоспециф!чними ознаками генома 1, в!дпов1дно, непридатних для безпосеред-нього застосування в рослинництв!.

Нами запропоновано ! розроблено принципово нову кл!тин-ну технолог!ю отримання цибрид!в, при як!й нема потреби у

присутност! будь-яких селективних генетичних маркер1в у ви-х1дному рослинному матер1ал1. В основ! п!дходу лежить оброб-ка (безпосередньо перед злиттям) протопласт1в виду-донора органел надлеталышми дозами ф!зичного 1 xiMiHHoro мутаге-н1в. та переважне розмноження мутантних пластид в продуктах злиття протопласт1в. При цьому ф1зичний мутагенез 0(-опром!-нення дозою 1000-2000 Гр) використовували для 1нактивацП ядра донора, щоб звести до мШмуму моклив1сть перенесения чукинного ядерного матер1алу в геном рецип1ента. А обробку Х1м1чним мутагеном (3-5 мМ розчином М-н1трозо-Ы-метилсечови-ни, яка е ефективним 1ндуктором цитоплазматичних мутацШ) застосовували з метою 1ндукц11 пластомних мутац1й ст1йкост1 до стрептом1цину. Для 1дентиф1кацП мутантних пластид' донора в продуктах злиття протопласт1в проводили селекцш клхтинних колон1й на середовищх з1 стрептом1цкном. В1дб1р цибрид!в на селективному середовищ1 грунтувався на здатност! ймов1рних цибридних клон!в роста i зелен1ти в присутност! антиб!отика (0,5-1 г/л стрептом!цинсульфату), в той час як !нш! (чутли-в!) колон 1í в цих же умовах формували знебарвлений калус.

При розробц! технолог!í мезофгльн! протопласта виду-донора (S. bulbocastaniun Dun., S. ptnnatisectum Dun.. S. acaule Bltt.) обробляли двома мутагенами (К-опром!нення + НМС) 1 зливали з мезоф!льними протопластами рецип1ента (сорту Зарево, Св1танок шйвський) у сп1вв1дношенн1 1:1. Злиття протоп-ласт!в проводили за модиф!кованою методикою, що дало змогу зб1льшити в 10-12 раз1в к1льк1сть протопласт1в та продукт1в Ix злиття, як! вижили п1сля обробки розчинами "ПЕГ-високий pH/Ca2 4. Частота злиття протопласт!в складала 20-25%. У робот! показано ефективн1сть використання ступ!нчастого селек-

тивного тиску для збереження 1ндукованих цитоплазматичних мутац1й i в!дбору ймов1рних цибридних клон1в. Скрин1нг про-топласт!в на ст!йк1сть до стрептом1цину починали проводити п1сля перших 2-3 клхтинних подШв. Початкова концентрац1я антиб1отика в середовищ1 для культнвування протопласт1в складала 50-100 мг/л. Р1вень вм!сту срептом!цинсульфату в середовицц зб1льшували щотижня, доводячи протягом 1-1,5 MicflqiB до 500-1000 мг/л. Таке поступове зб1льшення кон-центрацИ селективного агента в середовищ створювало сприятлив! умови для переважно! регшкацп копш хлДНК, що Miстили 1ндукован1 мутацП стрептом1цинстшкост1. та ефек-тивного сортування мутантних i немутантних пластид в продуктах злиття протопласт1в. Використання стуШнчастого селективного тиску дало змогу в1дбирати на селективному середовищ! в 6-8 раз1в б!льше ймов1рних цибридних клон1в, н1ж при традиц!йн1й cxeMi селекци мутант1в.

У результат! селекцП було виявлено 23 ст1йк1 до ан-тиб!отика колонИ 1з комб1нацп "S. tuberosum L. с. Зарево + S.bulbocastanum Dun.". 18 - 1з комбшацП "S. tuberosum b.c. Зарево + S. pinnatisectum Dun.". 32 - "S.tuberosum Ь.с.Св1та-нок ки1вський + S.pinnatisectum Dun.", i 48 - "S. tuberosum L. с.Св1танок ки!вський + S.acaule Bitt.". Формування naroHiB 1з в1д1браних клон!в в!дбувалося протягом 2-5 м1сяц1в культивування на середовищ! для 1ндукцП органогенезу. Частота регенерацП в комб!нац1ях злиття протопласт!в. де за рецип1ента використовували сорт Зарево, складала 87,3+3,5%; в комб!нац!ях "S. tuberosum L.с.Св1танок кигвський + дикий вид картопл!" - 66.5+5,3%. В досл!дженнях ми не пом1тили за-лежност! регенерац1йно! здатност! кл1тинних колон1й в1д ви-

дово! належност! чужинних пластид, хоча 1ндукц1я пагоноут-ворення 1з цибридних клон1в в1дбувалася на 1-2 м!сяц1 п!зн1ше, н1ж у контрольних досл1дах 1з протопластами рецип1снта. В кожн1й комб1нац11 партнер1в вШбрали по дек1лька л1н!й регенерант1в з нормальною морфолоПею. роз-множлли in vitro 1 використовували для подальшого анал1зу.

Б1ох1м1чний анал1з регенерованих рослин було зосередже-но головним чином на характеристик генетичного матер1алу органел. Рестриктний анал1з хлоропласто! ДНК з використанням ендонуклеаз Ват HI 1 Hind III показав присутн1сть чукпнного пластома в регенерактах 1з кожно! комб1нацП партнер1в. Серед регенерованих рослин 8 лШй мали хлоропласта S.bulbo-castanum Dun. (комб1нац1я "S. tuberosum L. с. Зарево + S.bulbo-castanum Dun."), 8 л1н1й м1стили хлоропласта S. pinnatisectum Dun. (4 л1н11 1з комб1нац11 "S. tuberosum L.с.Зарево + S. pinnatisectum Dun." 1 4 л1нп 1з комб1нацП "S. tuberosum

b.с.Св1танок ки!вський + S. pinnatisectum Dun.") та 3 л!н11 мали хлоропласта S.acaule Bltt. (комб1нац1я "S.tuberosum L.

c.Св!танок ки!вський + S.acaule Bitt."). Частота утворення цибридних клон!в в середньому складала 5,4 '1СГ5. Результата анал1зу хлДНК деяких л1н1й зображен! на рис.1; 2. А. Н1яких в1дм1нностей м1ж рестриктними спектрами хлДНК отриманих цибрид1в та в1дпов1дними фрагментами пластома виду-донора хлоропласт!в не виявлено. Це свхдчить про в1дсутн1сть пом1тних зм1н у хлДНК донора при обробц1 протопласт1в надле-тальними дозами 1он1зуючого випром1нювання, та вказуе на ви-соку рад1ост1йк1сть пластома в пор1внянн1 з хроматином кл!тини. Водночас, при цитолог1чному та морфолог1чному анал1з1 ми не знайшли будь-яких ознак негативного впливу

„вгй-l

»•ч м

— ■ ■ ш

- — м м

м'Ы М :. и

: ■:} ■ vi

»• - М " к

«•• м ~ м

: ь

•• it

s:те -fl

i г ъ ч 5 б

Рис.1. Результата рестриктного анал1зу хлДКК вих1дних вид1в та цибрид1в картопл! з використанням ендонуклеаз Ват HI(A). Hind III(Б): 1-ДНК фага X (Hind III-фрагменти); 2-S. tuberosum L. с. Зарево; 3-S. pinnatisectm Dun.; 4.-S.bulbocas-tanum Dun.; 5-цибридн1 л1н11 Spl(A). Sp2(B); 6-цибридна л1-н1я Sp3; 7-цибридна л!н1я Sb5.

Hini Ш

Ват til

HiM I

ßamHl

i234 5 6 7 8 3

14 5 6 18 3

Рис.2. Результата рестриктного анал1зу хлДНК (А), мтДНК (Б) вих1дних вид1в та цибрид1в картопл1 з використанням ендонуклеаз Hinü III. Ват HI: 1-ДНК фага X; 2,6-S. tuberosum L. с. Св1танок ки!вський; 3.7-S.ptnnattsectum Dun.; 4,8-цибридна л1н1я 116.5; 5.9-цибридна л1н1я 116.8.

пластомних мутац1й стШкост! до стрептом1цину на структуру 1 функцП хлоропласт!в у пор1внянн1 з 1нтактними пластидами.

При рестриктному анал1з1 органельних ДНК стрептомх-цинст!йких клон1в поряд 1з цибридними рослинами були вияв-лен1 рослини рецип1ектно! форми. Частота виникнення таких ст1йких до антиб1отика форм рецип1ента в середньому складала 3,2 •10~6 1 за значениям була близькою до спонтанно! частоти утворення стрептом!цинст1йких мутант1в - 2,7 -Ю"6, в1дзна-чено! в роботах 1нших автор1в (Maliga et al., 1982). Певно, виникнення стрелтомЩинрезистентних л1н1й рецип1ента буг.о обумовлено не т!льки спонтанними мутац!ями ст!йкост1 до ан-т11б!отика. але й тим, що стрептом1цин може мати мутагекниП ефект стосовно пластома кл1тини (Сидоров и др., 1990).

Успадкування м1тохондр1й в отриманих цибрид1в визначали шляхом рестриктного анал1зу мтДНК (ендонуклеази Ват HI. Hind III) та Саузерн-блот-г3.бридизац11 Pst I- та Sma 1-фрагмент1в сумарно! ДНК з використанням рад1оактивно м1ченого мгтохонд-р!ального зонду. Для б1льшост! цибридних форм рослин показано присутн1сть мтДНК рецип1ентного типу, властивого S. tuberosum L. (рис. 3). Однак у л1н1й Sp2. 116.5, 116.8 (кок-б1нац11 "культурна картопля + S.pinnatisectum Dun.") виявили перебудови мтДНК. причому л1н11 116.5 1 116.8 характ.еризува-лись присутн1стю в рекомб1нован1й мтДНК значно! частини хондр1ома донорного типу (рис.2.Б). Ц1 результата св!дчать про незалежне перенесения м1тохондр1й при дан1й cxeMi селек-ц11 та можлив1сть отримання цибридних рослин картопл1 з мтДНК як вих1дних вид1в, так 1 з мтДНК реконструйованого типу.

Ядерну конституц1ю рослин-регенерант1в вивчали за допо-

Д

wm **

« S3

§:::=У ^ " В

i 2 3 4 5 6

äea с= J^J =

Ф» —'**

9 - -

М — —

» > >

i 2 3 М б 6 7

Рис.3. Результати рестриктного анал!зу (А) та Саузерн-блот-г!бридизац1! (Б. В) мтДНК вих1дних вид!в та цибрщцв картопл!. A (Hind III-фрагменти): 1-S.tuberosum L.с.Зарево; 2-S. pinnatisectum Dun.; 3-S.bulbocastanum Dun.; 4,5.6-циб-ридШ Л1н11 Spl, Sp5. Sb7 в!дпов1дно. Б, В: 1-S. tuberosum L. с.Зарево; 2-S.bulbocastanum Dun.; 3-S.pinnatisectum Dun.; 4. 5. 6,7-цибридн1 Л1Н11 Sp3, Sp5, Sb5, Sbl в1дпов!дно. Pst I (Б), Sma I (В) фрагмента сумарно! рослинно! ДНК г1бридизували з 5.2 т.п.н. Ват HI-фрагментом мтДНК Oenothera, що м1стить посл1довн!сть 18S-.бБрДНК. 5'ND5.

Рис.4. Спектри множинних молекулярних форм естераз ви-х1дних вид1в та цибрид!в картопл!: 1-S. tuberosum L. с. Зарево; 2-S.bulbocastanum Dun.; 3.4-цибридн1 л1нП Sb5.Sb9 в1дпов1д-но; 5-S.tuberosum L.с.Св1танок кихвський; 6-S.pinnatisectum Dun.; 7.8-цибридн1 л!нп 116.5, 116.7 в!дпов1дно.

могою цитогенетичного анал!зу та анал1зу нножинних молеку-лярних форм естераз. Показано, що у вс1х цибрид1в з нормальною морфолог!ею к!льк!сть хромосом в меристематичних кл1ти-нах к1нчик1в кор1нц1в складала 48, що в!дпов1дае тетрапло!д-ному набору хромосом реципиента - S.tuberosum L. При nopiB-нянн! 1зоферментних спектр1з рослин-регенерант1в i вих!дних батьк1вських вид!в було встановлено, що BCi отриман! форми рослин мають видоспециф1чн! спектри естераз, характеры! для генотипу культурно! картошц в1дпов1дного сорту (рис.4).

В наших досл!дах протопласта рослини-рецип1ента не об-робляли з метою 1дентиф!ка1;П п?одукт1в злиття. Цим обумов-лено в1дм1нн1сть розробленс! технологи в1д способу отриман-ня цибрид1в з використанняк йодацетата, родам1на та !нших речовин, як1 е незворотнШ: 1нг1б1торами метабол1зму кл1тини i можуть призЕоднти до мут&ц1йних 3MiH ядерного матер1алу рецип!ента. Застосування для деструкцп ядерно! ДНК донора надлетальних доз К-опромшення, в1дсутн1сть обробки протопласт^ рецип1ента перед злнттям та використання протопласт1в !змезоф1льно! тканини листка були головними причинами того, що при досл!дженн1 ядерно! конституцИ отриманих цибрид1в BCi регенеранти характеризовались стаб1льним кар!отипом i збер!гали видоспецифичн!сть генома культурно! картопл!.

При морфолог1чному анал!з1 регенерант1в у деяких циб-ридних л1н!й в умовах in vitro в!дзначали зм1ни в довжин! м1жвузля, товщин! стебла, розм!рах листово! пластинки. Однак ц! в1дм1нност! мали еп!генетичний характер, 1 п1сля адапта-ц11 рослин у rpyHTi в ycix цибрщЦв 1дентиф1кували фенотип вих!днс)ГО сорту. Цибридн! рослини 1з комбШацП "S. tuberosum L.с.Св1танок ки!вський + S.pinnatisectvm Dan." мали 1нтен-

сквне темно-зелене забарвлення листя в пор1внянн1 з рослина-ми рецип1ента. що. на наш погляд, зумовлено присутн1стю в кл1тинах регенерант1в чужинних пластид. В1дсутн1сть ознак хлороф1лдефектност! та нормальний фенотип отриманих цибрид1в св1дчать про сум1сн!сть ядра S. tuberosum L. з хлоропластаки S.bulbocastanum Dun.. S. pinnatisectum Dun., S.acaule Bitt.

Таким чином, результата експеримент!в показують можлн-в1сть створення цибридних рослин картопл1 за допомогою зап-ропонованого п1дходу "подв1йно1 шактиЕацП-злиття протоп-ласт1в". Головна особлив1сть шдходу та перевала над 1ншш.:и засобами отримання цибрид1в полягае у в1дсутност1 селектиЕ-них генетичних маркер1в у вих!дному рослинному матер!ал1: необх1дн1 для селекцН цибрид1в пластомн! мутацП 1ндукують-ся надлетальними дозами мутагена безпосередньо перед злиттям протопласт1в. Завдяки цьому значно скорочусться час, необ-х1дний для отримання цибридних рослин, збер1гаетья видоспе-циф1чн1сть ядерного генома рецип1ента, а також в1дкриваеться можлив!сть створення цибрид1в для тих вид1в рослин, у яких надзвичайно складно 1золювати цитоплазматичн1 мутанти.

Потенц1йна ц!нн1сть розроблено! кл1тинно! технологи отримання цибрид1в випливас з експеримент!в по соматичн1й г1бридизац11 картошп. Так, на сьогодн! шляхом злиття протопласт^ отримано р1зн! м1жвидов! ядерн1 Пбриди картопл1 (Barsby et al., 1984; Helgenson et al., 1986: Pulte et al., 1986; Fish et al., 1987; Sldorov et al.. 1987; Seraff et al.. 1991). Однак Ix використання у рослинництв! обменено тим. що звичайно 1з дикого в культурний вид потр!бно перенести лише дек1лька ознак. як! становлять iHTepec для с!льського господарства. Тому потр!бн! численн! зворотн!

схрещування таких г!брид!в з культурною картоплею. Наш1 екс-перименти св!дчать. що негайне лрактичне застосування ре-конструйованих форм рослин може бути досягнуто отриманням не г1брид!в, а цибрид1в, оск1льки цибридизац1я призводить до реконструкцП т1льки цитоплазмону, в той час як ядерний геном. а значить 1 гоповн! сортоспециф1чн1 ознаки культурно! картопл! залишаються без зм1н.

3. Отримання цибрид!в картопл! з використанням цитоплазматичних мутант1в.

За рецип1ента чужинних органел використовували хлоро-ф!лдефектний мутант S. tuberosum L. с. Зарево, лШя Z-3. Пластомну природу п!гментдефектност1 цього мутанта встанови-ли шляхом комплементац1йного анал1зу за допомогою злиття протопласт!в. Донорами пластид були дик! бульбоутворюкш ви-ди картопл! S.microdontum Dun., S. stoloniferum Schlecht., S.gibberulosum Juz., S.cardiophyllum Lindl., S.kurtzianum Bitt. (S.macotae Buk.).

Мезоф!льн1 протопласта вид1в-донор1в Т(-опром!нювали дозою 1000-2000 Гр 1 зливали з протопластами рецип!ента у сп1вв!дношенн1 1:1, к!лькост1 106 кл1тин/мл. Показано значну перевагу заплавки кл1тин в альг!нат кальц!ю для усШшного культивування продукт!в злиття: ефективн1сть вис!ву 1мобШ-зованих кл!тин складала 67.6+8.2% ! була приблизно в три рази вищою, н!ж при загальновживаному способ! культивування в р1дкому середовищ1.

Селекц1я цибридних клон!в грунтувалася на в1дновленн! фотосинтетично! активност! кл!тинних клон!в та Ix здатност!

зелен1ти на твердому середовищ! з низьким bmIctom джерел вуглеводного живлення. В кожн1й комб1нацп злиття протоплас-т1в хлороф!лдефектно! картопл! 1 р1зних вид1в Solanum було отримано в1д 200 до 700 фотосинтезуючих колон!й.

Регенерац1я рослин 1з в1д1браних яскраво-зелених колок 1 й в1дбувалася протягом 1-6 мЮяЩв культивування на середовищ! для 1ндукц!1 органогенезу. К1льк!сть регенерованих клон1в п1сля першого м1сяця культивування складала 2,1+0,3%, 2-го м!сяця - 5,3+0,8%. 3-го - 13,7+1,9%. 4-го - 35,9+5,1%, 5-го - 78, 2+8, 37:, 6-го та наступних м1сяц1в досягала 90% i б1льше. В ц!лому частота регенерат! рослин 1з цибрлдних ко-лон1й складала 81,5+10,5% i в!дпов1дала частот! регенерацП рослин 1з мезоф1льних протопласт!в немутантно! лШ! рецип!ента (с.Зарево) в контрольних досл!дах - 83,7+8,6%.

В кожн!й комб1нац1! партнер!в досл!джували ви 10 до 30 рослин-регенерант!в. Рестриктний анал!з хлДНК з використан-ням ендонуклеази Ват HI дав змогу виявити в ycix видових комб1нац1ях регенеранти, що м1стили пластом р1зних вид1в Solanum. Частота утворення цибридних клон1в в середньому складала 2.4 "Ю"4. Серед регенерант!в поряд 1з цибридними формами були виявлен1 фотосинтезуюч! рослини, як1 кали пластом ревдп1ента. Вивчення рецип1ентно! форми картопл! показало, що поява таких рослин-ревертант!в не пов'язака з химерною л!н1! Z-3, а обумовлена. швидше, зворотньою му-тац1ею в хлДНК в!д мутантного (п!гментдефектного) до дикого типу пластид. Зв!дси виходить, що пластомна мутац!я хлороф1лдефектност1 в рецип!ентн!й л1н11 Z-3 пов'язана, в усякому раз!, не з делец!ею.

При вивченн! ядерно! конституцП отриманих цибрид!в

к!льк!сть хромосом у рослин з нормальною морфолог!ею склада-ла 48, що в!дпов!дае тетрашшдному набору хромосом рецип!ента (2п=4х=48). У той же час серед регенерант1в були знайден! форми з анеупло!дною к1льк!стю хромосом. Ц! рослини характеризувались р1зними аномал!ями морфолог!i: нетипова форма i розм1ри листово! пластинки, порушення аткального дом1нування, низька життездатн!сть тощо. Появу таких рослин в!дзначали в кожн!й комб1нац11 злиття протопласт!в, однак Ix к1льк!сть не перевищувала 20% в!д загального числа регенеро-ваних рослин. Певно, виникнення регенерант1в 1з зм1неною к!льк!стю хромосом 1. як насл!док, аномал!ями у розвитку рослин обумовлено сомаклональною м1нлив!стю, що спостер!га-еться в культур! in vitro (Shepard et al.. 1980; Сидоров, Сидорова. 1987).

У морфолог1чно нормальних рослин. що мали тетрапло1дний наб!р хромосом 1 мЮтили чужинн! пластиди, досл1джували мно-жинн1 молекулярн! форми естераз. При пор!внянн! !зофермент-них спектр1в рослин-регенерант1в 1 вих!дних батьк1вських ви-д!в показано, що отриман! в результат! злиття протопласт1в рослини мають видоспециф1чн1 форми 1зофермент1в, характерн! для сорту Зарево культурно! картогш.

Таким чином, шляхом злиття протопласт1в показано можли-в!сть реконструкцП цитоплазми культурно! картопл1 та ство-рення рослин, що м!стять ядро S.tuberosum L. i пластиди дикого бульбоутворюючого виду S.microdontia Dun., S. stolonife-rum Schlecht., S.gibberuiosum Juz., S.cardiophyllum Lindl., S.kurtzianum Bitt. (S.mcolae Buk.). Так! форми рослин не-можливо отримати при статев1й г!бридизац!!, а в1дсутн1сть у них пом!тних ознак ядерно-пластомно! несум1сност1 в!дкривае

перспективи залучення до селекцП картопл! багатства плазмо-фонду диких вид1в Solarium, яке до цього часу практично не використовувалося.

висновки

1. Розроблено принципово нову шптинну технологхю отри-мання цибрид1Б, яка дозволяв спрямовано отримувати рослини г чужинними органелами без присутност1 у вих1дному матер1ал! селективних генетичних маркер!в; запропонований п!дх!д базу-еться на подв!йн1й !нактивэцп протопласт!в донора надле-тальними дозами ф1зичного та х1м1чного мутагенгв cy-onpoMi-ненням - для шактивацп ядра донора, М-н!трозо-Ы-метилсечо-виною - для ефективно! 1ндукцП пластомних мутац1й), та пе-ренесенн1 мутантних пластид донора в рецип!ент шляхом злиття протопласт1в.

2. За допомогою запропоновано! технологи вперше створено цибридн1 рослини. як1 м1стять ядерний генетичний матерел культурно! картопл! та пластиди дикого бульбоутворюючо-го виду S. bulbocastanum Dun., S.pinnatisectum Dun., S. acaule Bltt. В отриманих цибрщцв в!дсутн! ознаки ядерно-пластомно! HecyMicHocTi, що дае змогу подальшого !х використання в се-лекц!йно-генетичних дослШеннях.

3. Встановлено, що ступ1нчастий селективний тиск е ефективним засобом при в1дбор1 !ндукованих цитоплазматичних мутац1й в продуктах злиття протопласт1в.

4. Запропоновано схему в1дбору цибридних клон!в, як! м!стять мутантн1 пластиди донора, що грунтуеться на викорис-танн! стрептом!цину як селективного агента.

- 22 -

5. Вперше створено цибридн! рослини картошп, що м1с-тять ядро S. tuberosum L. та пластиди дикого виду S.microdon-tum Dun., S. stoloniferum Schlecht., S. gibberulosum Juz.. S. cardiophyllum Lindl.. S.kurtztanum Bitt. (S.macolae Buk.). Показано можлив1сть замши пластома у культурно! картоши з метою гтол1Пшення вих1дних характеристик генотипу.

6. Встановлено можлив!сть отримання цибрид1в картошц 1з мтДНК як вих1дного виду, так i з реконструйованою мтДНК.

Список роб!т, опубл1кованих по Teni дисертацЦ.

1. Евтушенко Д.П., Сидоров В. А. Цибриды культурного картофеля с пластомом Solarium cardiophyllum Lindl.. полученные путем слияния протопластов// Междун. конф. по молекуляр-но-генетическим маркерам и селекции растений: Тез. докл. (Киев. 10-13 мая 1994 г.).-Киев, 1994.-С.66.

2." Евтушенко Д. П. , Буцко Е. В., Сидоров В. А. Регенерация растений из мезофильных протопластов Solarium acaule Bitt.// ДоповШ Нац1онально! академП наук Укра1ни. -1995.-N9.-С.136-139.

3. Yevtushenko D.Р., Sidorov V.A. Interspecific somatic cybrids obtained by protoplast fusion between Solarium tuberosum L. and y-irradlated wild Sotanum species// Cell Biology International.-1994.-18.-N5.-P.542.

4. Sidorov V.A., Yevtushenko D.P.. Shakhovsky A.M.. Gleba Yu. Yu. Cybrid production based on mutagenic innactiva-tion of protoplasts and rescuing of mutant plastlds in fusion products: potato with a plastome from S.bulbocastanum and S.pinnatisectwn// Theor. and Appl. Genet.-1994.-88.-N5.-

P. 525-529.

5. Yevtushenko D. P., Sidorov V.A. Potato cybrid plants obtained by protoplast fusion between Solanum tuberosum L. and ^-Irradiated S.microdontum Bitt.// Abstr. Int. Symp. on Plant Biotechnology and Genetic Engineering (Kyiv, Oct.3-6. 1994).-Kylv, 1994.-P.74.

6. Yevtushenko D.P.. Sidorov V.A. Fusion-derived potato cybrids with plastome from Solarium gibberulosum Juz.// Abstr. Int. Conf. on Actual Problems in Genetics, Biotechnology and Agriculture (Kishenev, Moldova, Nov.9-10, 1994). -Kishenev, 1994.-P.130-131.

7. Yevtushenko D.P., Shakhovsky A.M., Sidorov V.A. Interspecific somatic cybrids in Solanum as a model for studying nuclear-organelle interaction // Journal of Cellular Biochemistry, Abstract Supplement 19A.-1995.-P.142.

8. Yevtushenko D.?.. Sidorov V.A. Effect of calcium-al-ginate immobilization on potato protoplast divisions and colony formation // Journal of Cellular Biochemistry, Abstract Supplement 21A.-1995.-P.461.

Yevtushenko D.P. Production and analysis of interspecific somatic cybrids of potato.

Thesis for a scientific degree of Candidate of Biological Sciences on speciality 03.00.25 - Cell Biology, Institute of Cell Biology and Genetic Engineering, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 1995.

The results of 8 scientific papers are defended.

An approach for cybrid production without any genetic selectable markers In the parental material, based on double

lnactlyatlon of donor protoplasts (by Y-rays for inactlvatl-on of the nucleus and by chemical mutagenesis for the induction of a high frequency of cytoplasmic mutations) and the rescuing of mutant plastids after fusion with untreated recipient protoplasts, has been proposed. Interspecific cybrid plants containing potato nuclei with a plastome from wild tuber-bearing species S.bulbocastanum Dun., S.pinnatisectum Dun., S.acaule Bitt. were obtained using the described system. Cybrid potato plants with a plastome from wild S.micro-dontum Dun., S.stoloniferum Schlecht.. S. gibberulosum Juz., S. cardiophyllum Lindl.. S.kurtzianum Bitt. (S. rrncolae Buk. ) were obtained using the chlorophyll deficient plastome mutant of S.tuberosum L. as recipient. The cybrid nature of the plants was confirmed by chromosome counting, analysis of esterase Isoenzymes, restriction analysis of organelle DNA. and blot hybridization.

Евтушенко Д.П. Получение и анализ межвидовых соматических цибридов картофеля.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.25 - клеточная биология, Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, 1995.

Защищается 8 научных работ по теме диссертации.

Разработана клеточная технология получения цибридов. при которой не требуется присутствие селективных генетических маркеров в исходном растительном материале. Предложенный подход основан на двойной инактивации протопластов донора (^-облучением - для инактивации ядра, химическим мутагеном -

для эффективной индукции цитоплазматических мутаций), и переносе мутантных пластид донора в реципиент путем слияния протопластов. С использованием предложенной технологии получены межвидовые цибридные растения, содержащие ядро культурного картофеля и пластиды дикого клубненосного вида S.bulbo-castanum Dun.. S.pinriatisectum Dun., S.acaule Bitt. На основе хлорофиллдефектного пластомного мутанта S.tuberosum L. созданы цибридные растения картофеля, содержащие пластиды дикого вида S. microdontum Dun.. S. stoloniferum Schlecht., S.gibberulosum Juz.. S.cardiophyllum Lindl., S.kurtzianum Bitt. (S.macolae Buk.). Цибридная природа полученных растений доказана с помощью цитогенетического анализа, анализа множественных молекулярных форм эстераз. рестрикционного анализа органельных ДНК и Саузерн-блот-гибридизации.

fonoMOBi слова: цибриди, м1жвидова цибридизац!я, пласти-ди. Solarium, донор, рецип!ент. злиття протопласт!в.