Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение генетическими методами новых штаммов дрожжей с амилолитической активностью для хлебопекарной промышленности

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение генетическими методами новых штаммов дрожжей с амилолитической активностью для хлебопекарной промышленности"

;: 7 ' 3 %

Все союз ный научно-жсследоват ель скый проект но-конструкторекий инотптут ГфИКЛ а,ЦНО Й бКОХИШИ

На правах рукописи

АЛЕКСЕЕВА МАРИЯ ГЕ0РП1ЕВНА

УДК 653.12: 663.153.21 (043.3)

ПОЛУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИМИ МЕТОДАМ! НОВЫХ ШТАММОВ ДРОЖЯЕй С А1.Ш0ЛПТИЧЕСК0Й АШВНОСТЬ» ХЛЕБОПЕКАРНОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

Специальность 03.00.23 - Биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1991.

Работа выполнена в лаборатории "Оптимизация экспрессии генов" ВНИИГенетикй и селекции промышленных микроорганизмов и в Московском технологическом институте пищевой промышленности.

Научные руководители: член кор. НА СССР, доктор технических наук, профессор Кантере В.М. кандидат биологических наук, доцент Тырсин ¿.А.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Даниленк'о В.Н.

. кандидат биологических наук, доцент Капгерева 1}.В,

Ведущая организация: научно-производственное объединение "Биотехнология".

Защита диссертации состоится "/У " /иип/?ггъс>~ 1992 г. на заседании специализированного совета Д 098.'09. 01 при Всесоюзном научно-исследовательском проектно-конструкторском институте прикладной биохимии' (125299, Москва, ул. Клары Цеткин, 4/6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного научно-исследовательского проектно-конструкторского института прикладной биохимик.

Автореферат разослан " 3 " С&ё&ЖЯ-ЛлЯ^ 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, /¡А кандидат биологических наук 1/1 И.И.Гусева'

.. ! ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

"^Актуальность темы. Одним'из основных продуктов питания во многих странах является хлеб. В процессе его приготовления ведущая роль в формировании качества принадлежит дрожжам -?асс/£алогаусе5 сеге-ае. Эти дрожжи не способны расщеплять крахмал муки до лег. ко сбрагкиваемого субстрата - глюкозы из-за отсутствия генетической системы синтеза амилолитических ферментов. В связи с этим, в хлебопекарной промышленности проводят этап предварительного осахаривания крахмала муки солодом или коммерчески..!!? препаратами амилолитических ферментов. Однако эти добавки не обеспечивают ЮО^-ноГо гидролиза крахмала, могут явиться факторами загрязнения конечного пищевого продукта из-за своей химической неоднородности и их применение приводит к удорожанию технологии.

В' начале XX века для производства хлебопекарных дрож.-.ей дорогое зерновое сырье было заменено отходом свеклосахарного производства - мелассой. Однако дрожжи, выращенные на мелассной среде, обладают «¿-фруктофуранозидазной активностью [ЕС 3.2.1.261 и имеют низкий уровень мальтазной [ЕС 3.2.1.20Д активности. Переключение на сбраживание мальтозы происходит крайне медленно, что иногда приводит к запаздыванию поднятия теста. Кроме того, не всякая меласса пригодна для производства дролжей'. В результате совершенствования процесса экстракции сахара из сахарной свеклы и под влиянием используемых, в сельском хозяйстве удобрений доброкачественность мелассы стала з последнее Бремя резко снижаться.

В связи с этим, важное значение имеет получение генетическим! методами штаммов пекарских дрокяей, обладающих способность*, к активному сбраживанию крахмала, что позволит, с одной стороны, избегать дополнительного процесса осахаривания и, с другой стороны, осуществлять производство этих дгс-хтей на крахмалсодер-жащей среде, исключив мелассу.

Цель и задачи исследования. Работа посзязена получению пропиленных стаимор пекарских дрся-АеГ, обладающих способностью к активному сбра.-й!ран;:л крахмала; разработке для полученных птпммор такого состава ерг.жзлсодер;>л:;5Е средгг, кзтсриТ бы обеспечил хорошие пекаггкис начестт др?.»е.':.

Для достижения поставленной цели работа проводилась в следующих направлениях:

- проверка полученных генетическими методами лабораторных штаммов глюкоамилазных дрожжей (синтезирующих ^(-глюкоамилазу [ЕС 3.2.1.3.3 ) и контрольных промышленных штаммов пекарских дрожжей с целью отбора наиболее активных;

- получение новых штаммов пекарских дрожжей, обладающих способностью к синтезу и секреции глюкоамилазы на основе промышленного штамма № 408 с высокими производственными показателями;

- оптимизация состава питательной среды для культивирования полученных штаммов;

- получение вариантов штаммов пекарских дрожжей с генами других амилолитических ферментов методами генной инженерии.

Научная новизна. Получены новые штаммы пекарских дрожжей, обладающие глюкоамилазной активностью. Штаммы получали методами гибридизации и тетрадного анализа. Для полученных штаммов появилась возможность замены традиционной среды для культивирования дрожжей - мелассного сусла - на крахмалеодержащую среду. Установлено, что концентрация крахмала в такой среде не должна превышать 2,С?6. Разработано 2 состава сред для культивирования глюкоамилазных дрожжей: среда, содержащая крахмал и добавку мелассы как активатора необходимых для хлебопечения ферментных систем; среда, содержащая крахмал и кукурузный экстракт в качестве источника азота и ростовых факторов. Биомасса, выращенная не обеих средах, обладала хорошими пекарскими качествами.

Экспериментально установлено, что путем введения дополнительных плазмидных генов в штаммы глюкоамилазных дрожжей можно повысить утилизацию крахмала и, соответственно, увеличить съем биомассы при увеличении концентрации крахмала. Получены варианты штаммов с измененным промотором гена глюкоамилазы и дополнительным геном и-амилазы [ЕС 3.2.1.1.] . Получение таких генно-инженерных штаммов позволит повысить концентрацию крахмала в разработанной среде.

Практическая ценность. Новые хлебопекарные дрожжи, обладающие способностью к синтезу и секреции амилолитических ферментов,

особенно эффективно применять при ускоренных технологиях хлебопечения, переработке муки с пониженными хлебопекарннми свойствами и при этом получать хлеб повышенного качества: увеличенного удельного объема, пористости, с улучшенными структурно-механическими свойствами мякина.

Для производства этих дрожжей можно использовать среды, содержащие отходы картофелеперерабатыващего производства в качестве источника углерода взамен традиционной мелассной.

Апробация работы. Основные результаты исследований были доложены на заседании кафедры "Биотехнология и экологическая безопасность производств" (ноябрь 1991 г.).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, содержит 47 таблиц и 4 рисунка. Работа состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, экспериментальной части, экономической части, выводов. Список литературы включает 136 публикаций, в том числе 53 зарубежных.

• I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

В обзоре научно-технической литературы рассмотрены биохимические процессы, протекающие в тесте и пути их интенсификации. Уделяется внимание вопросам.культивирования хлебопекарных дрожжей и состоянию сырьевой базы. Показано, что одним из основных путей улучшения качества хлеба является использование активных культур дрожжей. Рассмотрены перспективные методы получения новых продуктивных штаммов дрожжей.

2. ЗКСПЕРЛКЕИГАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Работа проводилась в лаборатории "Оптимизация экспрессии геноз" ВНИИГенетикк и селекции промышленных микроорганизмов и в лабораторных условиях кафедр "Бютехнологпя и экологическая безопасность производств", "Технология жиров и биоорганичсско-го синтеза" и "Технология хлебопекарного, кондитерского и макаронного производств" ШЖЛ.

2.1. Объекты и методы исследований.

В работе использовали штаммы дробей 5асс/аготусел селеу/Яае, представленные в таблице I.

Таблица I. Псаммы, используемые в работе.

НЬамм

Генотип

.Источник получения

Цели

использования

ЛВ-7

408 Вб

87 80 91 98 104 216

355

356 365 304

375

344

345

прототроф

2я> прототроф, 5ТА+

ЛО ВНИШ

ВгШГенетика

Промышленный

пекарский

штамм

и

Лабораторный штамм глюко-амилазных дрожжей

п, прототроф, 5ТА

(¿ьгц-А STAI 5-taIO —Лабораторный

ауксо.трофный • ' штамм с высо-

кой глюкоами-лазной активностью

STAI iTA2 5TA3"siaI0 KisAmet 5TAI j^alO --"— &deZ а/у 4 .STAI5TA2 ¿ТАЗ si&lO — We 5 —"— Тестер.типа

спаривания

ал$г4 a eeuZ a £eu2 oi Ы 7

a aj^4 a a<ie2 сJ, arfe2

ff

II

tl

194 а £еч2 ига3 Л&4 5ТА1

206 о/ ас£2 ¿Ы2 ^аЗ ^ТА2 339 а А5 4 млаЗ ¿ТА+ 571 Ы, Игп.2 -Ъгр I ¿е«2 5ТА+ ¿КУ4-2С а ¿шг игаЗ ¿ГА2 603 ¡¡с илаЗ -£тр1 £ГА"

ШГЕиа 4 Рм£+

603/А/л^ Аг^"

601 «л-а3/&3 4 601/Рк£ ¿ТА+ Р«£+

616 млаЗ е>ги2/€/<? 4 4^4 Лл+ 618/Ал^оС ¿еи2 А'зг 1 ¿у£4 'ГЛ+ Алу+

Для культивирования и отбора штаммов использовали следующие среды: полную среду с глюкозой, с крахмалом, с этанолом и глицерином; минимальную среду с глюкозой, с этанолом и глицерином; среду для спзруляции; келассное сусло.

Для получения новых штаммов пекарских дро&кей применяли генетические и генно-иньенерные методы: гибридизации; тетрадного анализа по методу Дконстона и Мортимера; случайной выборки спор; получения дь'хзтельно дефицитных вариантов;.отпечатков на селективные среды; определения типа спаривания и трансформации дрожжей..

Отбор птакков осуществлялся по следующим показателям: удельной скорости роста дрожжей; ферментативной активностч (эк-мазнэй и мальтазной); подъемной силе дрожжей (ускоренным методом); у штаммов, несущих структурные гены а.чилолитпческих ферментов, кроме перечисленных показателей определялись также способность к сбраживанию крахглгига в трубках Думбара •■! амплолитичеекал активность по методу с использованием ДЙС-реагента у глюкезооьл;-дазнэ-перокекдазнлму методу (с нслоль-зозанном орто-дкаж.'лндина).

О

Получение реципиентов для трансформации

Штаммы, содержащие "лазмид-ные гены

Для разработки оптимального состава крахмалсодержащей среды для полученных штаммов глюкоамилазных дрожжей использовали аддитивно-решетчатое описание по многоуровневому ортогональному плану.

Качество хлеба оценивали по удельному объему, влажности мякиша, кислотности и пористости.

Все полученные результаты обрабатывали статистически.

2.2. Результаты исследований и. цх анализ.

Проверка полученных ранее лабораторных штаммов

глюкоамилрзных дрожжей на хлебопекарные свойства.

В 1966 году во ВШИГенетики и селекции промышленных микроорганизмов были получены лабораторные линии-дрожжей ^асо^алолусе;? ce/njv/s/ae, несущие структурный ген глюкоамилазы - 5ТА+ из SaccAascynyces iüastaii eng . Некоторые из полученных штаммов проверялись на пекарские качества после культивирования на качалке на.двух средах: традиционной ыелассной и полной среде с 3,0^-ным крахмалом. В качестве контроля проверялась биомасса промышленных штаммов ^ 40В и ЛВ-7, выращенная на мелассном сусле • CSTA") .(таблица- 2).

Таблица 2.

Хлебопекарные показатели проверяемых лабораторных и промышленных штаммов.

Штамм Среда куль- Зимазная Мальтазная Подъемная

тивирования активность, активность, сила,

мин. мин. мин.

86 меласса 57 76 29

крахмал 50 73 26

87 меласса 49 80 . 36

крахмал , 58 70 39

88 меласса 54 76 30

крахмал 56' 78 37

. 91 меласса 82 97 34

крахмал 53 73 30

98 меласса 52 -84 29

крахмал 53 85 28

104 меласса 52 86 28

крахмал 53 82 26

ЛВ-7 меласса 45 60 18

408 меласса 40 46 12

Все проверенные штаммы обладали достаточно .¡нэкими па-

карскими качествами. Из промышленных .У ТА"- штаммов лучшие показатели имел штамм 408, поэтому он был выбран для дальнейшей работы.

Получение птаммов хлебопекарных дрожжей, обладающих способностью к синтезу и секреции глюкоамилазы на основе 408 штамма.

В связи с тем, что штамм 408 являлся диплоидом, для проЕеде-ния с ним генетических манипуляций необходимо было получить гаплоидные клетки. Из 12 гаплоидных сегрегантов 2 обладали лучтимп хлебопекарными показателями даже в сравнении с родительским 408 штаммом (таблица 3).

Таблица 3.

Хлебопекарные показатели сегрегантов 408 пта.чма.

Р сзгреганта Зимазная Г«альтазная Подъемная

активность, актиьность, сила,

мин. мин. i'.HH.

I 20 53 6

2 30 •13 15

3 27 32 13

4 з.> 41 13

5 20 9

6 ?:<: 35

7 2 С 12

3 сг. I?

3J Ь

10 21 35 ' 15

11 22 30 8 ..

12 24 35 II

408 40 46 . . 12

У отобранных штаммов был определен тип спаривания: 5-408 -• МА'Га, 11-408 - МА'Г^.

Далее на основе этих сегрегантов сначала были получены гаплоидные, а затем диплоидные штаммы дромкей, обладающие способностью к синтезу и секреции глюкоамилазы.

Для получения гаплоидных штаммов проводили поэтапное селективное скрещивание сегрегантов 5-408 и П-408 с лабораторными аук-сотрофными штаммами, несущими гени активно сбраживающими крахмал: 355, 356, 355 и 216. Полученные гибриды высевали на чашки с ацетатной средой и, применяя метод случайной выборки спор, отбирали гаплоидное потомство.

После I скрещивания отобрано 2 гаплоидных сегреганта, образующих глюкоамилазные зоны на чашках с крахмальной средой и активно сбраживающих крахмал в трубках Думбара. Однако они имели низкие производственные характеристики (таблица 4).

Таблица 4.

Характеристика сегрегантов, отобранных после I скрещивания.

№ сегре- Скрещивание Генотип Зимазная ' Ыальтазная Подъемная

ганта активность, , активность , . сила,

мин. мин. мин.

7 365 х 11-408 а £е«2 £ГА+ 50 120 36

15 356 х 11-408 Л. а+2 4 ¿ТА"1" 60 115 . 39

11-408 2«, прототроф 22 30 : 8

• Для улучшения селектируемых признаков необходимо было провести повторное скрещивание. Штамм № 7 скрещивали со штаммом П-408, а . штамм 15 - со штаммом 5-408. От двух гибридов отобрано 273 гап-

лоидов, большей частью прототрофных, образующих глюкоамклазные зоны просветления на чашках с крахмальной средой. Из них только 33 штамма успешно сбраживали крахмал в трубках Думбара, то есть зоны просветления крахмала не всегда определяли возможность успешного сбраживания среды при отсутствии аэрации. Далее у отобранных штаммов определялся основной показатель качества дрожжей - подъемная сила после наращивания биомассы на мелассном сусле на качалке. Проверкой выделено 9 вариантов с хорошей подъемной силой (таблица 5). Все эти штаммы оказались прототрофами.

Таблица 5.

Характеристика сегрегантсв, отобранных после II скрещивания.

сегреганта Скрещивание Сбраживание крахмала через Подъемная

сила,

24ч. 48ч. 72ч. 9бч. мин.

20 7 х 11-408 - - 1/2 I 18

40 15 х 5-408 - - 1/2 I 18

71 _ и - - 1/2 I 14

88 __и__ - - 1/2 9

91 м - - 1/2 I 12

104 1, - - 1/2 I 15

122 - 1/3 . 3/4 12

148 1/4 ■1/2 I I 15

153 — " — - 1/3 3/4 I 9

5-403 - - - - - 9

11-403 - - - - - 8

ЛЗ-7 - - - - - 18

7 365-х 11-408 - 1/2 I I 37

15' 356 х 11-400 - 1/4 3/4 I 39

выбранные штамлаг-не однородны пс подъемной, силе и имеют разную скорость сбрак;ван::я крахмала. В связи с этим целесообразно, для получения дпплсу.дов было применить метод зьтоселекцин, тяк кат:

в результате длительного культивирования на селективных средах с использованием серии последовательных пересевов могут возникнуть гибриды, обладающие пучшими показателями.

Была проведена серия последовательных пересевов суспензии из.9 гаплоидов на 10 колбах с крахмальной средой, затем суспензия высевалась на чашки для тестирования 5ТА-фенотипа и проверки диплоидности. Отобрано 126 диплоидов, из которых только 26 актгчно сбраживали крахмал. Из них 12 диплоидов по результатам теста подъемной силы имели производственные показатели на уровне 40В штамма (таблица 6).

Таблица 6. Характеристика диплоидов.

* диплоида Сбраживание крахмала через Подъемная

сила,

24ч. 48ч. 72ч. 96ч. мин.

19 1/8 1/2 I 12

22 1/6 1/2 I II

23 - 1/3 I 12

56 - 1/3 I 12

57 1/6 1/3 I II

67 - 1/4 •3/4 12

68 - 1/4 3/4 12

73 - 1/4 3/4 12

77 - 1/4 3/4 12

120 - 1/4 3/4 12

124 - 1/4 3/4 12

125 - — 1/4 3/4 12

408 - - - 12

365 1/2 3/4 , I -

, Скорость сбраживания крахмала диплоидами 19, 22 и 57 соот-, ветствовала 365 штамму. У них на полной среде с этанолом и гли-

церином в динамике была измерена глюкоамилазная активность (таблица 7).

Таблица 7.

Глюкоамилазная активность диплоидов.

Штамм Время культи- Титр, Глюкоамилазная

вирования, клеток/мл активность, мкмоль

час. глюкозы/мл мин.

19

14 17 21 24 38

0,68 2,03 5,33 1,07 6,2.5

7 10

108 10

10

0,09 0,26 , 0,49 0,25

22

57

14 17 21 24

38

~14~ 17 21 24 38

1,55 3,50 7,13 1,99 6,55

1,10 2,68 5,24 1,50 7,10

10 ю? 10 ю8

1С?

ж 10? 10 108

10'

,8

0,16 0,30 0,66 0,44

0,09 0,18 0,41 0,73 0,52

365

14 17 21 24

38

1,50 3,83 6,25 2,18 5,82

10' Ю7

108 ю8

ю8

0,13 0,39 0,51 .0,67 0,48

Из полученных штаммов был выбран штамм $ 57, который по сбраживающей способности и глюкоамилазной активности не уступал родительскому 365 штамму, а по подъемной силе - родительскому 408 птамму. При депонировании во Всесоюзной коллекции промьгзлен-

них микроорганизмов (ВКПМ) он получил коллекционный номер У-1534.

Разработка состава питательной среды для полученных штаммов глюкоамилазных дрожжей.

В связи с тем, что полученные штаммы способны усваивать крахмал в качестве единственного источника углерода, появилась возможность замены мелассной среды для культивирования дрожжей на крахмалеодержащую. С этой целью штамм У-1534 засевали на среды с 0,565 дрожжевого экстракта и концентрацией крахмала от I до 4!?. При этом оказалось, что- большие концентрации крахмала полностью не усваивались, остаточный крахмал оседал вместе с дрожжами и не поддавался отделению. После разработки методики определения остаточного крахмала в культуральной жидкости стало ясно, что концентрация крахмала в среде для культивирования глюкоамилазных дрожжей не должна превышать 2,0£.

Кроме того, биомасса, выращенная на крахмалсодержащей среде, отличалась пониженными пекарскими качествами. Поэтому вначале был разработан состав среды, содержащей крахмал и добавку мелассы как активатора необходимых для хлебопечения ферментных систем. Для оптимизации состава среды использовали аддитивно-решетчатое описание по многоуровневому ортогональному плану. План эксперимента был составлен для 4 фактопов, варьируемых на 4 уровнях и состоял из 16 вариантов. Критерием 'оптимизации служила подъемная сила дрожжей (таблица 8).

' Таблица 8.

Схема эксперимена для определения аддитивно-решетчатого описания по многоуровневому ортогональному плану.

№ вариан- Концентрация компонентов среды, % Подъемная

та _ сила,

дрожжевой экстракт меласса крахмал диаымоний фосфат мин,

I од 0,0 . 0,5 0,1 32

2 0,3 ' 0,0 1.5 0,2 26

3 0,4 0,0 2,0 0,4 25

4 0,2 0,0 1,0 • 0,3 28

5 0,1 2,0 1,5 0,4 28

6 0,3 . 2,0 0,5 0,3 18

7 0,4 2,0 1,0 • 0,1 15

8 0,2 2,0 2,0 • 0,2 II

9 0,1 4,0 2,0 0,3 17

10 0,3 4,0 1,0 0,4 16

II 0,4 4,0 0,5 0,2 14 <

12 0,2 4,0 1,5 0,1 15

13 0,1 6,0 1,0 0,2 15

14 0,3 6,0 2,0 0,1 15

15 0,4 6,0 1,5 0,3 15

16 0,2 6,0 0,5 0,4 14

К - 8,0 - 0,3 II

Оптимизированная среда имела следующий- состав: дрожжевой экстракт - 0,2?; меласса - 2,0?; крахмал - 2,0$; диаммоний фосфат - 0,2%. Этот состав среды соответствовал 8-му варианту.

Поскольку желательно было полностью исключить мелассу из состава питательной среды, сохранив при этом хорошие пекарские качества, 'необходимо было найти альтернативный компонент. В качестве такого компонента был выбран кукурузный экстракт, като-.рый уже сейчас используется в производстве пекарских дрожжей как дополнительный источник ростовых факторов. Оказалось, что при добавлении кукурузного экстракта в разработанную среду вместо мелассы значительно увеличивается удельна'я скорость роста дрожжей, а подъемная сила соответствует подъемной силе на среде, предусматривающей замену мелассы на эквивалентное количество сахарозы.

Для разработки состава безмелассной среды использовали аддитивно-решетчатое описание по многоуровневому ортогональному плану (таблица 9).

Таблица 9.

Схема эксперимента для определения аддитивно-решетчатого описания по многоуровневому ортогональному плану.

# варианта Концентрация компонентов среды, % Подъемная

__ сила,

дрожжевой крахмал кукурузный диаммо- мин.

экстракт экстракт ний фосфат

I 0,0 1,0 0,6 0,0 17

2 0,2 1,0 1,0 0,1 23

3 0,3. 1,0 1,2 0,3 19

4 0,1 1,0 0,8 0,2 19

5 0,0 1,5 1,0 0,3 17

6 0,2 1,5 0,6 0,2 16

7 0,3 1,5 о,е 0,0 1В

8 0,1 1,5 1,2 од 16

9 0,0 2,0 1,2 0,2 16

10 0,2. 2,0 0,8 0,3 22

II 0,3 2,0 0,6 0,1 19

12 0,1 2,0 1,0 0,0 18

13 0,0- 2,5 0,8 0,1 20

14 0,2 2,5 .1,2 . 0,0 18

15 0,3 2,5 1,0 0,2 19

16 0,1 2,5 0,6 0,3 17

К 0,2 2,0 1,0 0,2 17

Среда, расчитаннная по аддитивно-решетчатому описанию, имела следующий состав: крахмал - 1,5£; кукурузный экстракт -0,6 и 1,2^; диаммоний фосфат - 0,2%. Дрожжевой экстракт может быть исключен из состава среды.

Получено два варианта сред, составы которых отличались концентрациями кукурузного экстракта. С целью изучения влияния дополнительных 0,6% на выход биомассы и ее пекарские качества был поставлен эксперимент с подпиткой. При подборе ферментационных сред приходится решать две основные задачи: обеспечение сте-хиометрических соотношений компонентов сред, достаточных для активного роста, и в то же время предотвращение ингибирования по-вь"оеннь»:и концентрациями компонентов среды. Более радикальным средством является использование облегченной срсды к-добавление

субстратов в среду в ходе процесса по мере их исчерпания. Дрожжи являются факультативными анаэробами и способны потреблять сахар с большой скоростью и, если в процессе выращивания подача его превышает потребность биосинтеза, процесс идет с преобладанием брожения, часть спирта улетучивается' в виде спирта и СС^.

В данном случае осуществлялось дозирование кукурузного экстракта. Для подбора режима подпитки было проведено определение спирта в культуральной жидкости на средах различного состава через 14 часов культивирования штамма У-1534. На Б^-ном мелас-сном сусле концентрация спирта была очень высокой и составляла 24,9 мг/мл; на разработанных средах с 0,6 и 1,255 кукурузного экстракта спирт присутствовал в виде следов <0,1 мг/мл, то есть брожения не наблюдалось. Следовательно, на крахмалеодержащих средах можно осуществлять' режим культивирования без подпиток, • либо вносить разовые добавки крупных доз субстрата.

Был поставлен следующий эксперимент: начальная концентрация кукурузного экстракта в среде составляла"0,6^, в середине процесса культивирования в колбы добавлялось еще 0,6%.

Дозирование, кукурузного экстракта оказало существенное влияние на показатель подъемной силы дрожжей (таблица 10).

Таблица 10.

Влияние дозирования кукурузного экстракта на накопление биомассы и ее пекарские качества.

Начальная концен- Подпитка Съем биомас- Подъемная трация кукурузного через 24 сы со 100 мл сила, экстракта, %■ часа, % среды, г мин.

Все описанные эксперименты проводились на средах с обычным картофельным крахмалом. С целью получения более дешевого сырья для производства дрожжей была проверена возможность использования в составе сред различных отходов картофелеперера-батывающих производств - сточных вод и некондиционного крахма-

0,6 0,61,2

0,6

2,62 2,18 2,52

13 15 15

*

ла. Все показатели качества дрожжей на средах, содержащих отходы, соответствовали показателям на среде с обычным картофельным крахмалом.

Чтобы приблизиться к производственным условиям, осуществлялось культивирование штамма У-1534 в ферментере на средах с обычным и некондиционным крахмалом. Отделенная при сепарирова- • нии биомасса проверялась в лаборатории на кафедре "Технология хлебопекарного, кондитерского и макаронного производств", где были подтверждены ее хорошие пекарские качества (таблица II).

Таблица II.

Показатели качества хлеба.

Показатели Безопарный Большая Густая Жидкая

способ густая опара опара опара

Штамм У-1534 на крахмальной среде.

I. Удельный объем,

см3/100 г хлеба 320 331 337 291

2. Влажность, % 43,1 43,8 43,3 42,5

3. Кислотность, град. 2,9 2,3 2,9 3,1

4. Пористость, % 83 83 83 79

Штамм У-1534 на среде с некондиционным крахмалом

I. Удельный объем,

см3/100 г хлеба 312 354 323 314

2. Влажность, % 43,5 43,5 43,5 43,5

3. Кислотность, град. 2,7 2,5 2,6 2,8

4. Пористость, % 81 82 81 60

Штамм ЛВ-7 на мелассном сусле.

I. Удельный объем,

см3/100 г хлеба 328 ' 316- 318 • 311

2. Влажность, 1! 44,1 43,6 43,4 43,5

3. Кислотность, град. 3,1 2,6 3,0 2,7

4. Пористость, %' 83 83 81 80

Получение вариантов генно-инженерных штаммов -пекарских дрожжей, обладающих комплексом амилолитических ферментов. Разработанная крахмалеодержащая среда содержит меньше сухих веществ, чем мелассное сусло, поэтому съем биомассы с единицы объема ферментера получается нигз. Полученные штаммы глю-коамилазных дрожжей большую концентрацию крахмала усвоить не могут. Повысить усвояемость крахмала можно только путем введения дополнительных ферментных систем. С этой целью изучалось влияние на утилизацию крахмала добавления амилолитических ферментов ( Глюкаваморин Г10Х - активность 800 ед/г и Амилосубти-лин Г10Х - активность 550 ед/г ) непосредственно в среду (пол-. ная среда + 4,0? крахмала) перед засевом штамма У-1534. Кроме того, проверялись, полученные во ВНИИГенетики, лабораторные штаммы дрожжей ^ассА-агошусе^ сег-е/^'ае, несущие дополнительные гены ¿¿-амилазы [_ЕС 3.2.1.1.3 и пуллуланазы [ЕС 3.2.1.417] на плазмидах. Через 18 часов роста на качалке в культуральной жидкости определяли остаточный крахмал. Добавление ферментов в среду и введение плазмидных генов в штамм повышало его амилолити-ческую активность и, соответственно, увеличивало выход биомассы (таблица 12).

.Таблица 12.

Влияние введения дополнительных ферментов и плазмидных генов амилолитических ферментов на накопление биомассы и утилизацию крахмала.

№ колбы Штамм Дополнительные Титр, Остаточный ферменты или гены клеток/мл крахмал,$

I У-1534 без добавок 2,00-10* 1,248

2 п 0,5 мл ГлА 6,40-108 0,24

3 0,75 мл ГлА 7,40-103 0,072

4 Т1 0,5 мл (¿'А 5,15-Ю5 0,6

5 __ 1,0 мл«СА 5,75- 1С7 0,408

6 _ Т1 0,5 мл ГлА + 0,5млс1А 7,40- 1Сг 0,168

7 __ »1 0,5 ГлА + 1,0 ¿А 6,00-10* 0,288

8 м 0,75 ГлА + 0,5 «¿А 9,55 -Ю8 -

9 У-1534 - 20 -0,75 ГлА + 1,0¿к 7,45-Ю0 ' -

10 603 - 2,56-10° 3,88

II 603/Ри£ пуллуланаза 7,35.Ю6 2,832

12 603/Ату ^¿-амилаза 8,15-10° 2,653

13 601 - 2,48-107 1,608

14 601/Ркг. пуллуланаза 4,88-Ю7 0,816

15 618 . - 2,85-10 1,484

16 618/А/лу ■ oí— амилаза 5,08-Ю7 0,888

В связи с этим, была поставлена задача введения дополнительных генов в штаммы пекарских дрожжей методами генной инженерии. В работе использовали интегративные плазмиды, сконструированные м.н.с. ВНИИГенетики Д.Г.Козловым. В качестве селективного маркера для трансформации служил ген цгаЗ, следовательно, необходимо было получить реципиентные гатаммы с к-л-аЗ - мутацией. Такие штаммы получали путем стандартных генетических скрещиваний.

Реципиентные штаммы получали в двух вариантах: 5ТА+ - на основе гаплоида 153(15) и STA" - на основе гаплоида 5-408. У полученных штаммов тестировалась ауксотрофность, определялся тип спаривания, подъемняя сила (у STA+ - штаммов на оптимизированной крахмалсодержащей среде, у STA" - штаммов на мелассном сусле).

Экспрессия генов амилолитических ферментов может осуществляться под контролем 5ТА промотора или гликолитического (ТДН) промотора. В связи с этим, первоначально необходимо было выбрать такой промотор, под которым экспрессия гена на крахмалсо-держащей среде будет выше. С этой целью осуществлялась трансформация 5ТА" - штаммов плазмидами, несущими ген глюкоамилазы . под полным STA промотором (¿TA Jut) v под гликолитическим ТДН промотором (5ТА Ь ). Трансформанты отбирали на среде, не содержащей урацпла, после чего у них: проверялся уровень.экспрессии: под SТА промотором на полной среде с этанолом и глицерином, под ТДН промотором на'полной среде с глюкозой. Затем отобранные транс£огманты засевал;: на эптпупзкрованнус крахмалсодержащую «еду. Результаты проверенного эксперимента показали прекмуще-ст.-.а ТДН промотора, ¡¡-.2ЭТо::у в дальне;';'-м испельоОеаяп пягяп'УЕЫ

с гликолитическими промоторами.

Сконструированные штаммы пекарских дрожжей не должны быть токсичными и патогенными для человека. Поэтому при использовании генно-инженерных методов для конструирования новых штаммов нельзя трансформировать плазмиды, несущие другие бактериальные гены кроме генов амилолитических ферментов. В настоящее время во ВНИИГенетики ведется работа по конструированию плазмид, не содержащих посторонних бактериальных генов. Уже получены варианты двух плазмид: I) плазмида, меняющая -STA промотор хромосомной глюкоамилазы на ТДН; 2) плазмида, меняющая £ТА промотор на ТДН и несущая дополнительно ген «¿-амилазы под АДН промотором.

Зтими плазмицами трансформировали STA+ - штаммы: 7 и 64. Экспрессия генов амилолитических ферментов определялась на полной среде с глюкозой, на оптимизированной крахмалсодержащей среде, после чего путем селективного скрещивания отобранных штаммов получали диплоиды. Установлено, что при введении плазмид значительно повышаются все показатели качества дрожжей, особенно показатель съема биомассы (таблица 13). Для таких штаммов уже можно изменять технологию: либо разрабатывать новую среду с повышением концентрации крахмала, либо сокращать время культивирования на разработанной среде.'

Таблица 13.

Показатели культивирования гаплоидных и диплоидных штаммов, отобранных после трансформации плазмидами I и 2, на крахмалсодержащей среде.

Штамм Амилолитическая Оьем биомас- Подъемная

активность, сы со 100 мл сила,

мкмоль/мЛ-мин среды, -г мин.

7 0,24 2,032 17

' 7 +' пл.1 (2) 0,35 2,382 14

7 + пл.1 (4) 0,31 2,279 15

7 + йл.2 (12) 0,38 3,774 16

7 + пл.2 (16) 0,45 2,656 15

64 0,27 2,220 16

64 + пл.1 (3) ' 0,33 2,411 14

64 + пл.1 (И) 0,38 2,446 12

64 + пл.2 (16) 0,39 3,488 16

64 + пл.2 (18) С,38 2,625 14

V (2Т) х 64 (ИТ) 0,48 2,592 12

7 (4Т) х 64 (ИТ) 0,42 2,760 12

7 (12ЛТ) х 64 (16Л1) 0,65 3,475 12

• 7 (16«сТ) х 64 (16Л') 0,32 2,795 15

У-1534 0,39 2,545 12

Биомасса диплоидных траисформантов проверялась в лаборатории на кафедре "Технология хлебопекарного, кондитерского и макаронного производств", где были подтверадены ее хорошие пекарские качества (таблица 14).

Таблица 14.

Показатели качества, хлеба (безопарный способ.).

Штамм Удельный Влажность, Кислотность, Пористо-

объем, см3/ % • град. сть, %

100 г хлеба

7(4Т) х 64(ИТ) 335 43,5 2,7 83

7(12Л) х 64(16Л) 345 43,5 2,7 81

ЛВ-7 328 44,1 ' 3,1 83

Получение новых штаммов с использованием генно-инженерных методов является перспективным направлением в области совершенствования производства пекарских дрожжей. При условии получения необходимых плазмид можно будет получить трансформантные штаммы, содержащие гены амилолитических ферментов в разных сочетаниях.

Общие выводы.

В работе получены промышленные итаумы лекарских дрожжей, ос лплаот'е сгюсоСностыо к синтезу и секреции глюкоамплазы. Для П5лу«е!!Н1ч втакков : азраСотан состав к.рахмалс'о-тертале'Р средь:, хорз'лл; пекарг кия качества прояви. Показана

- 2Ъ -

возможность повышения скорости сбраживания крахмала штаммами пекарских дрожжей, что позволит проводить их культивирование на более концентрированных средах.

На основании проведенных исследований сделаны нижеследующие выводы.

1. Показана возможность применения для конструирования штаммов пекарских дрожжей с амилолитической активностью гибридизацион-ных и генно-инженерных методов.

2. Показано, что для получения диплоидных штаммов целесообразно применять метод автоселекции на крахмалеодержащей среде.

3. Установлено, что хорошая удельная скорость роста не определяет хорошие пекарские качества дрожжей. О них можно судить по основному показателю качества дрожжей - подъемной силе, которая определяется не только штаммом, но и составом среды и условиями культивирования.

4. Разработан состав новой среды, предусматривающий замену мелассы как источника углерода на крахмал. Для этого могут быть использованы крахмалсодержащие отходы картофелеперерабатываю-щего производства.

5. Показано, что в процессе культивирования дрожжей на разработанной среде'практически не образуется спирта..Можно осуществлять режим культивирования без подпиток или вносить разовые добавки крупных-доз субстрата,

6. Установлено, что можно значительно повысить утилизацию крахмала в культуральной среде и увеличить съем биомассы дрожжей либо путем добавления амилолитических ферментов непосредственно в среду, либо за счет введения дополнительных генов в штамм путем трансформации.

7. Показано, что промотор экспрессируемого гена оказывает существенное влияние не только на показатели амилолитической активности, но и на пекарские качества дрожжевой биомассы.

8. Доказано, что полученные штаммы пекарских дрожжей, обладающие способностью к синтезу и секреции амилолитических ферментов, могут быть рекомендованы, с одной стороны, как эффективное средство регулирования технологического процесса производства хлеба и его интенсификации и, с другой стороны, как возможность утилизации отходов картофелеперерабатыващих производств.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Беневоленский C.B., Кантере В.М., Тырсин Ю.А., Талантов В.Н., Алексеева М.Г., Сарсенова С.К., Незнанова H.A., Соловьёв Г.В. Штамм дрожжей Sacc^a/nwyces cez-evis/ae ВКПМ У-1320, используемый в хлебопечении. - Заявка № 4852331/13 (079И73) от 19.07,1990 г. Решение о ввдаче авторского свидетельства от

5.03.1991 г.

2. Беневоленский C.B., Кантере В.М., Тырсин D.A., Талантов В.Н., Алексеева М.Г., Сарсенова С.Ш., Незнанова H.A., Соловьёв Г.В. Штамм дрожжей SaccßaAciyces ceAewsiae ВКПМ У-1534 - продуцент биомассы на крахмале используемый в хлебопечении. -

Заявка № 4852333/13 (079867) от 19.07.1990 г. Решение о выдаче авторского свидетельства от 5.03.1991 г. •

3. Алексеева М.Г., Беневоленский C.B., Кантере В.М., Сарсенова С.Ж:, Тырсин Ю.А.•Получение нового штамма хлебопекарных дрожжей, обладающего способностью к синтезу и секреции глю-коамилазы.//Биотехнология. - 1992. - PI (в.печати).

4. Алексеева М.Г., Кантере В.М., Талантов В.Н., Соловьёва T.D., Тырсин Ю.А. Крахмалсодержащая среда для нового штамма пекарских дрожжей со встроенным геном глюкоамилазы.//Прикладная биохимия и микробиология. - 1992. - №4 (в печати).

5. Алексеева М.Г., Тырсин Ю.А., Кантере В.М. Новые штаммы пекарских дрожжей, утилизирующие отходы картофелеперерабатывающих . производств. Тезисы конференции, посвященной 60-летию образо-, вания МГИПП. M., 1991 г. (в печати).

6. Алексеева М.Г. Получение штаммов дрожжей Jacc/la^o/nyce,? eerevisiae, обладающих амилолитической активностью, для хлебопекарной промышленности. Тезисы У1П конференции молодых . ученых и специалистов, посвященной 60-летию образования МГИПП, M., 1991. - с. 83.