Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полиморфизм генов метаболизма этанола в населении Евразии

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Полиморфизм генов метаболизма этанола в населении Евразии"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ ИМ.Н.И.ВАВИЛОВА

КАЛЬИНА Нина Ромуальдовна

•Полиморфизм генов метаболизма этанола в населении Евразии

Специальность 03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

ИИ4604938

Москва 2010 г.

004604938

Работа выполнена в лаборатории анализа генома

Учреждения Российской академии наук Института общей генетики им.Н.И.Вавилова РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Светлана Александровна Боринская

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Александр Николаевич Петрин Московский Государственный медико-стоматологический университет

Доктор биологических наук Ольга Владимировна Жукова

Институт общей генетики им.Н.И.Вавилова РАН

Ведущая организация: ГУ Медико-генетический научный центр РАМН

Защита состоится « Д> о 6 2010 г. в -72 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.214.01 при Учреждении Российской академии наук Институте общей генетики им.Н.И.Вавилова РАН по адресу:

119991, Россия, г. Москва, ул.Губкина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института общей генетики им.Н.И.Вавилова РАН по адресу:

119991, Россия, г. Москва, ул.Губкина, 3. факс: (499) 135-12-89, e-mail: aspirantura@vigg.rii

Автореферат разослан «¿-U» (AX^APIaJ 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат биологических наук /. ) Q Т. А. Синелыцикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы.

С потреблением алкоголя в России связана повышенная смертность мужчин

трудоспособного возраста: от трети до более половины смертей составляют прямые (из-за отравления алкоголем) или непрямые (дорожно-транспортные происшествия в состоянии опьянения, бытовые убийства, самоубийства, травмы, цирроз печени и другие связанные с алкоголем заболевания) алкогольные потери (Немцов, 2001; Андреев и др„ 2008; Leon et al„ 2009; Zaridze et al., 2009). Исследование причин сверхвысокого потребления алкоголя и факторов риска формирования алкогольной зависимости имеет высокую социальную и научную значимость. Гены, контролирующие метаболизм алкоголя, влияют на количество потребляемого алкоголя и риск развития алкогольной зависимости. К ним относятся ген алкогольдегидрогеназы ADH1B (прежнее название ADH2) и ген ALDH2, кодирующий митохондриальную альдегиддегидрогеназу.

Два разных аллеля гена ADHlB*Arg47His определяют синтез разных изоформ соответствующего фермента, отличающихся на порядок по скорости катализируемой реакции превращения алкоголя в токсичный ацетальдегид. У носителей аллеля гена ALDH2*504Lys более чем на 90% снижена активность фермента по сравнению с носителями аллеля ALDH2*504Glu, вследствие чего замедляется окисление ацетальдегида [Kim et al., 2008; Peng, Yin 2009]. Аллель ALDH2*504Lys реже (по сравнению с ALDH2*504Glu) встречается у больных алкоголизмом, а его носители (как алкоголики, так и здоровые индивиды) потребляют меньшие количества алкоголя [Wall et al., 1997]. Для аллеля ADHlB*47His получены данные, указывающие, что его носители потребляют меньшие количества спиртного, чем соответствующие по возрасту индивиды, у которых данный аллель не представлен, хотя влияние носительства этого аллеля на количество потребляемого алкоголя существенно слабее, чем ALDH2*504Lys [Osier et al. 1999; Muramatsu et al. 1995; Neumark et al. 1998]. Таким образом, указанные аллели могут рассматриваться как протективные в отношении алкоголизма. Знание популяционных частот этих аллелей необходимо в медико-генетических исследованиях алкоголизма и ассоциированных с ним заболеваний.

Частота аллеля ADHlB*47His варьирует в популяциях Евразии от менее 1% до более 70%, a ALDH2*504Lys - от 0 до 40%. Предполагается, что частоты аллелей ADHIB*47His и ALDH2*504Lys, по крайне мере в некоторых популяциях, возросли под действием отбора, факторы которого не известны [Ikuta et al., 1986; Long J., 2001; Osier et al., 2002]. Для исследования фундаментальной проблемы адаптивности аллелей в популяциях человека и выявления факторов отбора принципиально важным является знание географического распределения частот аллелей.

К началу данного исследования лишь для нескольких популяций, представляющих население России, были известны частоты аллелей обоих генов, а для русских были получены противоречивые данные: разные авторы указывали частоту аллеля ADHIB*47His от 6% до 41% [Ogurtsov et al., 2001; Belkovets et al., 2001; Osier et al., 2002]. Противоречивые данные о частотах этого аллеля были получены также и для популяций Ближнего Востока [Osier et al., 2002; Sepehr et al., 2004]. Для популяций Центральной Азии данные отсутствовали. Характер географического распределения частот аллелей ADHlB*Arg47His и ALDH2*Glu504Lys в ареале между двумя хорошо изученными регионами -Европой и Юго-Восточной Азией - оставался неизвестным. Это определило актуальность исследования частот аллелей указанных генов в популяциях Евразии.

Цели исследования

Целью диссертационной работы явились экспериментальное установление частот аллелей генов алкогольдегидрогеназы ADHlB*Arg47His и альдегиддегидрогеназы ALDH2*Glu504Lys в российских популяциях и анализ географического распределения частот этих аллелей в популяциях Евразии.

Задачи исследования

1. Подобрать оптимальные методы генотипирования полиморфизмов ADH1B*Arg47His и ALDH2*Glu504Lys.

2. Определить генотипы индивидов по изучаемым полиморфизмам в выборках, представляющих популяции Евразии;

3. Установить частоты соответствующих аллелей в изученных популяциях;

4. Провести анализ опубликованных данных о частотах аллелей АОН1В*47Шз и АЬВН2*504Ьу$ и охарактеризовать географическое распределение частот этих аллелей в Евразии.

5. В отдельных выборках провести анализ пятисайтовых гаплотипов (ЕсоШ, На?III, &р1 (АОН]С*Пе349УаГ), АЛЛ (АОП1В*Л^47т<;), 1Ш) для выяснения картины формирования географического распределения частот аллеля АОШВ*47Вм в Евразии и определения возможных источниковых популяций.

6. Провести анализ внутрипопуляционной дифференциации носителей аллеля АОН]В*47Шз по нейтральным БТЯ-маркерам.

Научная новизна

Впервые установлены частоты протективного в отношении алкоголизма аллеля АЬВН2*504Ьу$ для 12 этнических групп России, Ближнего и Дальнего Востока и Центральной Азии, всего проанализировано по данному локусу 16 популяций из 14 этнических групп. Установлена северная граница распространения аллеля в Евразии.

Впервые установлены частоты протективного в отношении алкоголизма аллеля АОН1В*47№з для 14 из 20 изученных этнических групп (27 популяционных выборок России, Ближнего Востока и Центральной Азии). Для 3 этнических групп уточнены ранее опубликованные ошибочные данные.

Определено географическое распределение частот аллелей АВШВ*47Шв и АЮН2*504Ьу$ в популяциях Евразии.

В локусе Л£>#(гены 1В и 1С), кроме функционального полиморфизма АОН1В*А^47Шз, дополнительно определены генотипы по четырем полиморфным сайтам в популяциях иранцев, русских, коми, казахов и бурят и рассчитаны вероятности пятисайтовых гаплотипов: ЕсоШ, НаеIII, (АОН1С*1!е349Уа!), М.ч1\ (АйН 1В*А^47Ш$), 1Ьа\ в этих популяциях. На основе распределения частот пятисайтовых гаплотипов выдвинута гипотеза о возможной роли миграций в евразийском степном поясе в формировании современной картины распределения частот аллеля АОН\В*47Пи в Евразии.

Практическая значимость

Установленные частоты аллелей ADHlB*47His и ALDH2*504Lys важны для исследования роли генетических факторов риска развития алкоголизма и ассоциированных с ним заболеваний в российских популяциях. Знание географического распределения частот аллелей является принципиально важным для исследования фундаментальной проблемы адаптивности аллелей в популяциях человека и выявления факторов отбора.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на следующих российских и международных семинарах, конференциях и съездах: 8th Iranian Congrss of Biochemistry and First International Congress of Biochemistry and Molecular Biology, September 11-15, 2005, Tehran, Iran. Selected Abstracts. Clinical Biochemistry, 2005; Human Genome Meeting 2006, May 30-June 3 2006, Helsinki, Finland; Пятый съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГиС), Москва, 21-27 июня 2009.

Публикации

Основные результаты данной работы опубликованы в 3 статьях в журналах списка ВАК (1 в российском и 2 в зарубежных), а также в 3 тезисах конференций (1 всероссийская и 2 международные).

Структура и объем работы

Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, выводы, список цитируемой литературы (более 120 источников), приложения. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста, содержит 13 рисунков и 12 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕРАБОТЫ

Материалы и методы

Материалом для работы послужили полуляционные коллекция биологических образцов (венозная кровь либо соскобы с внутренней поверхности щеки), полученных от 1658 индивидов из 27 популяций, представляющих 20 этнических групп России и других стран. Коллекции представлены образцами, собранными у неродственных индивидов с соблюдением принятой в мире процедуры "информированного согласия" и сбором данных о месте рождения и национальной принадлежности предков двух поколений. В исследуемые выборки включались только лица, имеющие предков соответствующей национальной принадлежности на основе данных опроса. В исследование были включены образцы следующих групп из коллекции лаборатории анализа генома ИОГен РАН: русские различных регионов (Костромская, Курская, Ростовская области и Чукотка), украинцы, белорусы, кольские саамы, коми-зыряне, марийцы, удмурты (Игринский район), калмыки, иранцы, горцы Памира, казахи, уйгуры, буряты(Улан-Удэ), чукчи, а также популяционные коллекции ДНК, предоставленные другими лабораториями: удмурты (Пургинскнй район) и казанские татары (предоставлены Э.К.Хуснутдиновой), русские Москвы, таджики, туркмены (предоставлены Е.И.Рогаевым), буряты Курумканского и Агинского районов, нивхи, удэгейцы, нанайцы (предоставлены В.А.Степановым).

Выделение ДНК из образцов крови объемом более 1 мл проводили с помощью стандартного фенол-хлороформного метода. При объеме образца до 500 мкл и выделении ДНК из соскобов применяли сорбентный метод (использовали готовый набор DIA/om™ DNA РгерЮО в соответствии с инструкцией производителя («Изоген», Москва), который позволяет выделить ДНК из малых объемов с низкой потерей ДНК).

Генотипирование образцов по однонуклеотидным полиморфизмам в локусе ADH (гены ADHIB и ADH1Q проводилось с помощью метода ПЦР-ПДРФ [Osier et al., 1999, 2002]. Продукты амплификации подвергали обработке соответствующей рестриктазой в условиях, рекомендованных производителем (ООО «Сибэнзим», Россия). В части выборок одновременно проводили генотипирование полиморфизмов ALDH2*Glu504Lys и ADHlB*Arg47His с помощью дуплексной четырехпраймерной ПЦР (модификация метода [Tamakoshi et al., 2003] с применением высокоспецифичной SNP-detect-полимеразы фирмы «Евроген», Москва. Результаты генотипирования ADHlB*Arg47His обоими методами (ПЦР-ПДРФ и четырехпраймерная ПЦР) полностью совпали. Условия ПЦР и нуклеотидные последовательности праймеров приведены в табл. 1.

Таблица 1. Условия и праймеры для ПЦР.

Ген, SNP и метод генотипирования Праймеры Условия ПЦР Размер фрагментов ДНК, п.н. Соответствующие аллели

ADH1C, rsl 789920 ПЦР-ПДРФ EcoRI For: 5-TTG С АС СТС СТА AGG СТС-3', Rev: 5-ТСТ ААТ GCA ААТ TGA TTG TGA АС-3' 95°C (15 s), 51°C (15 s), 72°C (75 s) 323 242 + 81 Т G

ADH1C, rsl 693425 ПЦР-ПДРФ Нае III For: 5'-TGA GTT TGC АСА TTA GTT ATG G-3', Rev: 5-TGC TCT С AG TTC TTT CTG GG-3' 95°C (30 s), 56°C (30 s), 72°C (60 s) 435 193 + 242 G А

ADHlC*lle349Val rs698 ПЦР-ПДРФ Ssp\ For: 5'-TTG TTT АТС TGT GAT TTT TTT TGT-3', Rev: 5'-CGT TAC TGT AGA ATA CAA AGC-3' 95°C (15 s), 51°C (15 s), 72°C (75 s) 378 274 +104 G А

ADHIB*Arg4 7His, rsl 229984 ПЦР-ПДРФ Ms/I For: 5'-ATT СТА ААТ TGT TTA ATT CAA GAA G-3' Rev: 5'-ACT AAC АСА GAA TTA CTG GAC-3' 95°C (30 s), 56°C (30 s), 72°C (60 s) 685 443 +242 G (Arg) A (His)

ADH1B, rs2066701 ПЦР-ПДРФ Rsal For: 5'-TAA СТА GGA CAT TGC CAT ACC-3' Rev: 5'-GAG СТА AAA CAT ACT TTG GATAG-3' 95°C (40s), 60°C(30 s), 72°C (45s) 236 176 +60 Т С

ADH1B* Arg47His rsl 229984 четырех-праймерная ПЦР adhFl: 5' -GCTTTA GAC TGA ATA ACC TTG G-3' adhRl: 5'-AAC CAC GTG GTC АТС TGT GC-3' adhF2: 5' GGT GGC TGT AGG AAT CTG TCA-3' adhR2: 5'-AGG GAA AGA GGA AAC TCC TGA A-3' 95°C (30 s), 64°C (15 s), 72°C (30 s) 459 280 219 G (Arg) A (His)

ALDH2 *Glu504Lys, rs671 четырех-праймерная ПЦР aldtFl: 5'-TGC TAT GAT GTG TTT GGA GCC-3' aldtRl: 5'-CCC АСА СТС АСА GTT TTC ACT ТС -3' aldtF2: 5'- GGG CTG CAG GCA TAC ACT A-3' aldtR2: 5'-GGC TCC GAG CCA CCA -3' 95°C (30 s), 64°C (15 s), 72°C (30 s) 176 119 98 G (Glu) A (Lys)

Полученные в результате ПЦР или ПЦР-ПДРФ фрагменты ДНК разделяли с помощью электрофореза в 7.5% ПААГ и визуализировали в УФ-свсте после окрашивания бромистым этидием.

Статистическая обработка данных. Значение стандартной ошибки рассчитывали по формуле вр =Ур(1-р)/2М, где р - частота аллеля, N - число индивидов в выборке.

Соответствие распределения частот генотипов в исследованных выборках равновесному распределению Харди-Вайнберга оценивали с помощью критериях2 и точного теста Фишера с использованием программных пакетов "Статистика" и "SPSS".

Для расчета наиболее вероятных частот гаплотипов в локусе ADH на основе частот пятилокусных генотипов использовали ЕМ-алгоритм (Expectation-Maximization (ЕМ) algorithm [Dempster et al. 1977; Excoffier and Slatkin, 1995; Lange, 1997; Weir, 1996]). Процедура является итеративным процессом, позволяющим получить максимально правдоподобные оценки частот гаплотипов из мультилокусных генотипических данных при неизвестной гаметической фазе. Расчеты проводили независимо с помощью программы EH program [Jurg Ott, Rockefeller University, New York] и программного пакета Arlequin ver. 3.0 [ Excoffier et al., 2005].

Анализ внутрипопуляционной дифференциации по нейтральным STR-маркерам проводили с использованием точного теста Фишера в программе «Статистика» 6.0.

Результаты и обсуждение Определение частот аллелей и генотипов по полиморфизму ALDH2*G!u504Lys гена альдегиддегидрогеназы в исследуемых популяциях

К началу исследования было опубликовано большое количество данных о частотах протективного в отношении алкоголизма аллеля ALDH2*504Lys в популяциях Европы и Юго-Восточной Азии, и показано, что в Европе аллель практически отсутствует, а в Юго-Восточной Азии его частота достигает 30%. Для населения России были исследовано несколько популяций (русские Вологды, коми, чуваши, ханты, буряты, алтайцы, якуты, чукчи, сибирские эскимосы) в выборках небольшого размера. Среди них лишь один индивид (в выборке бурят) оказался гетерозиготным носителем аллеля ALDH2*504Lys [Thomasson et al. 1992; Oota et al. 2004]. В связи с этим границы распространения аллеля ALDH2*504Lys оставались неясными. Поэтому были выбраны доступные для исследования популяции Ближнего Востока, Центральной Азии и России, которые позволили бы заполнить белые пятна на геногеографической карте.

Методом четырехпраймерной ПЦР нами установлены генотипы по данному локусу для 699 человек из 14 популяций, представляющих 11 этнических групп,. Примеры результатов электрофоретического разделения продуктов ПЦР представлены на рис. 1. Частоты аллелей и генотипов представлены в табл. 2.

(а)

■ 119 Ьр

ххххххххххххххххххххххСххххххх:

хххххххххх к.

ахххххххххххххх сххххххАхххххххххххххххххх

. 176 Ьр •

(б)

176

(0)119 (А) 98

37 38 39 Иран

40 41

16 17 18 19 20 М50 21 Таджики ^

22 23 24 25 26 2"

500

;450

400

-- 350

- 300 -250 -- 200

150

- 100

■50

Рис. 1. Определение генотипов по полиморфизму А1йН2*С1и504Ьуя с помощью четырехпраймерной ПЦР. (а). Положение праймеров и размер продуктов ПЦР. (б). Электрофореграмма продуктов ПЦР-амплификации. Вверху указаны номера образцов и названия популяционных коллекций. Слева указаны размеры фрагментов (п.н.), полученных в результате ПЦР-амплификации. Справа указаны размеры маркерных фрагментов ДНК М50 («Изоген»).

Десять из 16 исследованных выборок оказались мономорфны - в них выявлены только генотипы СЮ (&и/С1и) по полиморфизму АЮН2*С1и504Ьу$.

В популяциях европейской части России (русские, марийцы, удмурты) аллель не выявлен. Его частота, согласно расчетам для размера исследованных выборок, не превышает 2%, что соответствует опубликованным данным для европейских популяций, обобщенным в нашей статье в соавторстве с группой проф. К. Кидда [1Л е1 а1., 2009]. Общая численность рассмотренных в данной статье выборок, представляющих европейские популяции (ирландцы, англичане, датчане, финны, шведы, немцы, саамы Норвегии и Швеции, венгры, испанцы), составила более 1700 человек, из них только у венгров аллель представлен с частотой 1%, тогда как в других популяциях аллель не выявлен. Опубликованные данные для популяций европейской части России (русские Архангельской обл. и Вологды, коми-зыряне и чуваши) показывают, что аллель

8

отсутствует в этих популяциях, за исключением 1 индивида в выборке русских Архангельской обл.

В небольшой выборке иранцев аллель АЮН2*504Ьу5 также не выявлен.

Для 5 популяций, в которых выявлены гетерозиготные носители аллеля АЬОН2*504Ьуз, наблюдаемое распределение генотипов не отклоняется от ожидаемого при равновесии Харди-Вайнберга. Аллель АЮН2*5041у$ выявлен с невысокой частотой (1.4% - 3.7%) в выборках Центральной Азии (казахи, уйгуры, таджики), Южной Сибири (буряты) и Дальнего Востока (удэгейцы). Частоты, установленные для популяций Центральной Азии и Южной Сибири, соответствуют ранее опубликованным данным о частоте аллеля АЮН2*504Ьуз у узбеков (1.6%) [АЬп е( а1., 2009] и бурят (1.7%) и [ТЬотаввоп е1 а1. 1992]. В небольшой выборке нанайцев (12 человек) аллель не выявлен. Согласно опубликованным данным, в группе нанайцев была выявлена флаш-реакция на алкоголь. Флаш-реакция обусловлена присутствием в крови ацетальдегида; поэтому можно предполагать, что при исследовании выборок большего объема у нанайцев может быть все же выявлен аллель АЬОН2*504Ьуз, либо обнаружены другие особенности метаболизма, приводящие к накоплению этого токсичного продукта.

Анализ географического распределения частот аллеля АЬОН2*504Ьу5 в

популяциях мира

Для анализа распределения частот аллеля АЬОН2*504Ьу$ в популяциях мира были использованы собственные и собраны литературные данные для 80691 индивида из 366 популяций. Так как в коренном населении Европы, Африки и Америки аллель редок или отсутствует, для построения карты (рис. 2) использовали лишь часть этих данных преимущественно для азиатских популяций, всего для 49501 индивида из 190 популяций.

Как видно из полученного распределения, частота аллеля АШН2*5041у5 достигает максимума в населении южных провинций Китая (китайцы хакка - 40.9%) и в центральной Японии. В популяциях северных и западных провинций Китая частота аллеля составляет 9-15%, в Корее - 15-26%, во Вьетнаме, Лаосе и Камбодже не превышает 14-17%. В направлениях на север и на запад от зоны максимума частота аллеля плавно снижается до 1-3% в изученных нами популяциях Центральной Азии, Южной Сибири и Дальнего Востока. На Ближнем Востоке аллель практически отсутствует. Полученные данные позволяют установить северную и западную границы ареала распространения АШН2*504Ьуз.

Высокая частота аллеля в отдельном регионе может объясняться эффектом основателя, однако для популяций Юго-Восточной Азии это объяснение маловероятно,

так как этот район во все периоды истории человечества был одним из самых плотно заселенных.

Табл. 2 Частоты аллелей и генотипов по полиморфизму АШН2*С1и504Ьу5 (в/А).

Популяция N Генотипы, число индивидов (%) Частоты аллелей Р

О/С Ии/Ии О/А ОМЬуБ А/А Ьуз/Ьув в (01и) А (1*5)

Русские(Ростовская обл.) 48 48 (100) 0 0 1,000 (0,980-1,000) 0 (0-0,020) 0,941

Марийцы 62 62 (100) 0 0 1,000 (0,984-1,000) 0 (0-0,016) 0,951

Удмурты(Иг-ринский р-н) 84 84 (100) 0 0 1,000 (0,988-1,000) 0 (0-0,012) 0,956

Казахи 34 33 (97,1) 1 (2,9) 0 0,986 (0,972-1,000) 0,014 (0-0,028) 0,930

Уйгуры 30 29 (96,7) 1 (3,3) 0 0,983 (0,966-1,000) 0,017 (0-0,034) 0,926

Буряты (Улан-Удэ) 70 70 (100) 0 0 1,000 (0,986-1,000) 0 (0-0,014) 0,952

Буряты (Курумкан) 67 67 (100) 0 0 1,000 (0,985-1,000) 0 (0-0,015) 0,951

Буряты (Агинские) 69 67 (97,1) 2 (2,9) 0 0,986 (0,976-0,996) 0,014 (0,04-0,024) 0,903

Удэгейцы 67 62 (92,5) 5 (7,5) 0 0,963 (0,947-0,979) 0,037 (0,021-0,053) 0,749

Нанайцы 12 12 (100) 0 0 1,000 (0,917-1,000) 0 (0-0,083) 0,881

Горцы Памира 34 34 (100) 0 0 1,000 (0,971-1,000) 0 (0-0,029) 0,931

Таджики 16 15 (93,8) 1 (6,2) 0 0,969 (0,938-1,000) 0,031 (0-0,062) 0,897

Туркмены 65 65 (100) 0 0 1,000 (0,985-1,000) 0 (0-0,015) 0,950

Иранцы 41 41 (100) 0 0 1,000 (0,976-1,000) 0 (0-0,024) 0,937

ВСЕГО: 699

Выявленная картина географического распределения аллеля АЮН2*504Ьуз может объясняться действием отбора в сочетании с миграциями. Так как опубликованы данные, указывающие на возможное повышение частот аллеля АЬОН2*5041у$ в популяциях Юго-Восточной Азии под действием отбора [СМа е1 а1., 2004], установленная картина географического распределения частот аллеля АЬОН2*5()4Ьу5 может послужить основой исследования факторов отбора, действовавших в прошлом или действующих в настоящее время.

Рис. 2. Географическое распределение частот аллеля ALDH2*504Lys в Евразии. Карта построена на основе данных для 190 популяций с помощью программы Surfer 8.00 (Golden 8ойшаге).Отмечены границы областей с частотой аллеля 12% и 24%.

Определение частот аллелей и генотипов по полиморфизму ADHlB*Arg47His гена алкогольдегидрогеназы в исследуемых популяциях

К началу представляемой работы данные о частотах аллелей ADH1B были опубликованы для 150 популяций мира. При этом большинство данных было получено для популяций Европы (где частота аллеля ADHlB*47His не более 8%) и Юго-Восточной Азии (до 70%). Для популяций Ближнего Востока частоты аллеля ADHIB*47His варьировали в значительном диапазоне - от 12,5% до 68%.

Для населения России были установлены частоты аллелей в популяциях алтайцев, бурят, якутов, чукчей, сибирских эскимосов. Для нескольких русских популяций были получены противоречивые данные о частоте аллеля ADHlB*47His\ 41% для русских Москвы [Ogurtsov et al., 2001], 19,7% для русских Новосибирска [Belkovetz et al., 2001], 6% для русских Вологды [Osier et al., 2002] и 3,6%-7,5% в трех выборках русских Сибири [Марусин и др., 2004]. Повышенная частота аллелей у русских [Ogurtsov et al., 2001] многократно цитировлась как в научных публикациях, так и в СМИ. В ряде публикаций

это интерпретировалось как генетическая особенность русских, связанная с их предрасположенностью к потреблению больших доз алкоголя [МашуШе, 2004].

Для уточнения частот аллеля АОН1В*47Н1 у у русских и в популяциях Ближнего Востока, а также для уточнения распределения частот аллеля на геногеографической карте Евразии, было проведено генотипирование по данному локусу индивидов из 27 выборок общей численностью 1658 человек, представляющих 20 этнических групп Ближнего Востока, России и сопредельных стран. Пример результатов генотипирования с помощью метода ПЦР-ПДРФ приведен на рис. 3. Частоты аллелей и генотипов представлены в табл. 3. Частоты генотипов во всех изученных выборках соответствуют равновесному распределению Харди-Вайнберга, за исключением маленькой (13 человек) выборки нанайцев.

Рис. 3. Электрофореграмма продуктов ПЦР-ПРДФ анализа по полиморфизму АОН1В*Аг§47Н'и. Слева указаны размеры фрагментов Фрагмент 685 п.н. соответствует аплелю в (Аг£), наличие фрагментов 443 п.н. и 242 п.н. свидетельствует о присутствии аллеля А (Я«). Справа указаны размеры маркерных фрагментов ДНК М100 («Изоген»),

В пяти исследованных популяциях русских с разной географической локализацией (Кострома, Москва, Курск, Ростовская обл., Чукотка) общей численностью 433 человека частота аллеля АОН1В*47Н'и составила в среднем 4,2% (от 1,9% до 7,6%). У украинцев и белорусов частота этого аллеля составила 8,3% и 2,8% , соответственно. Следует отметить, что близкие частоты установлены для русских Башкортостана (2,5% [Воппзкауа е1 а1., 2009]), русских Архангельской обл. (5,0% [Нап е! а1., 2007]), и большой выборки русских москвичей (5,9% [НаэЫЬе е1 а1., 2008]). Можно предположить, что завышенные частоты аллеля АОН1В*47Н'18 в публикациях [С^ш180У е! а!., 2001; Ве1коуе1з е! а1., 2001] являются следствием технической ошибки, на что указывает и отмеченное во второй работе авторами значительное отклонение распределения генотипов от равновесного по Харди-Вайнбергу (р<0,001). Проведенный анализ собственных и опубликованных данных

показывает, что частота аллеля ADHlB*47His во всех исследованных группах русских составляет от 1,9% до 7,6% (в среднем 4,9%), что не отличается от частот этого аллеля в европейских популяциях (0-8%).

Для популяций Центральной Азии (туркмен, казахов, уйгуров, таджиков, горцев Памира) частота аллеля ADH¡B*47His составила 19,0%-34,4%.

Частота аллеля ADHlB*47His, определенная нами у иранцев (24,4%) согласуется с опубликованными частотами для групп восточно-средиземноморского происхождения [Li, Kidd, 2009]. Опубликованные данные о частотах этого аллеля [Sepelir et al., 2004] для иранских популяций (68% для персов-зороастрнйцев, 51% для туркмен Ирана) существенно отличаются от вышеприведенных. Однако при биоинформационном анализе праймеров, использованных для генотипирования в работе [Sepehr et al., 2004], было обнаружено, что оба олигонуклеотида оказались почти идентичными не только последовательности гена ADH1B (OMIM ID 103720), но и последовательности соседних генов ADH этого класса , что могло явиться причиной неспецифической амплификации и завышения частоты аллеля ADHlB*47His при генотипировашш. Косвенным подтверждением возможной технической ошибки в этой работе может служить и отмеченное самими авторами значимое отклонение от равновесия Харди-Вайнберга в исследованных ими выборках.

Анализ географического распределения частот аллеля ADHlB*47His в

популяциях мира

Для детального исследования географического распределения частот аллеля ADHlB*47His мы проанализировали опубликованные данные для 172 популяций Евразии и Африки. Распределение частот аллеля ADHlB*47His в евразийских популяциях представлено на рис. 4. Кроме максимума частот аллеля ADHlB*47His (70%) в Юго-Восточной Азии, отмечен второй локальный максимум в ближневосточных популяциях (около 30%). Эти максимумы соединены между собой через популяции степного пояса, где частота аллеля составляет в среднем 20-30%. Севернее и западнее, в популяциях Кавказа и Волго-Уральского региона, частота аллеля снижается до 10-16%, за исключением калмыков, которые происходят от монголов-ойратов и переселились на занимаемую ныне территорию около 300 лет назад. Частота аллеля у калмыков составляет 26,3%, что может отражать относительно высокую частоту в их предковой группе.

Следует отметить, что в популяциях южной Сибири и юга Дальнего Востока (бурят, алтайцев, тувинцев, удэгейцев, нивхов, нанайцев) частоты аллеля ADHIB*47His составили 20-27%, а в более северных популяциях (сибирские татары, якуты) - от 9 до 19%. В популяциях субарктической зоны (саамы, ханты, кеты, чукчи) частота аллеля

13

составляет 0,7-4%. Полученные результаты подтверждают значительные отличия частот аллеля АОН1В*47Н'и у северных и южных монголоидов (2% у чукчей и до 70% у китайцев и японцев). Это противоречит распространненным представлениям о том, что обусловленная наличием «атипичных» ферментов непереносимость алкоголя характерна для всех монголоидов.

Табл. 3. Частоты аллелей и генотипов по полиморфизму АОН1В*А^47Ня (в/А).

Популяция N Генотипы, число индивидов(%) Частота аллелей х2

Arg/Arg (G/G) Arg/His (G/A) His/His (А/А) Arg (G) His (А)

Русские (Кострома) 118 111 (94,1) 1 (5,9) 0 0,970+0,011 0,030±0,011 0,114

Русские (Курск) 86 73 (84,9) 13(15,1) 0 0,924+0,020 0,076+0,020 0,575

Русские(Ростовская обл.) 96 88(91,7) 8 (8,3) 0 0,958+0,014 0,042+0,014 0,184

Русские (Москва) 104 100(96,2) 4 (3,8) 0 0,981+0,009 0,019+0,009 0,044

Русские (Чукотка) 29 25 (86,2) 4(13,8) 0 0,931+0,033 0,069+0,033 0,881

Украинцы 109 91 (83,5) 18(16,5) 0 0,917+0,019 0,083+0,019 0,107

Белорусы 126 119(94,4) 7 (5,6) 0 0,972+0,010 0,028+0,010 0,112

Саамы Кольские 62 57(91,9) 5(8,1) 0 0,960+0,018 0,040+0,018 0,143

Коми-зыряне 49 44 (89,8) 5(10,2) 0 0,949+0,022 0,051+0,022 0,061

Марийцы 98 77(78,6) 20 (20,4) 1 (1,0) 0,888+0,023 0,112+0,023 0,881

Удмурты (Малопург. р-н) 68 51 (75,0) 17 (25,0) 0 0,875+0,028 0,125+0,028 1,382

Удмурты (Игринский р-н) 94 75 (79,8) 16(17,0) з (3,2) 0,883+0,023 0,117+0,023 2,908

Татары казанские 21 16(76,2) 5 (13,8) 0 0,881+0,050 0,119+0,050 0,382

Калмыки (Элиста) 59 30 (50,8) 27 (45,8) 2 (3,4) 0,737+0,041 0,263+0,041 1,930

Иранцы 41 24 (58,5) 14(34,1) 3 (7,3) 0,756+0,047 0,244+0,047 0,226

Туркмены 54 35 (64,8) 16 (29,6) 3 (5,6) 0,796+0,039 0,204+0,039 0,405

Таджики 16 7 (43,8) 7 (43,8) 2(12,4) 0,656+0,084 0,344+0,084 1,770

Горцы Памира 30 18(60,0) И (36,7) 1 (3,3) 0,783+0,053 0,217+0,053 0,193

Казахи 35 22 (62,9) 12 (34,2) 1 (2,9) 0,800+0,048 0,200+0,048 0,179

Уйгуры 29 19(65,5) 9(71,1) I (3,4) 0,810+0,052 0,190+0,052 0,004

Буряты (Улан Удэ) 61 39 (63,9) 18 (39,5) 4(6,6) 0,787+0,037 0,213+0,037 0,561

Буряты (Курумкан~ 61 38 (62,3) 22 (36,1) 1 (1,6) 0,803+0,036 0,197+0,036 1,211

Буряты (Агинские) 65 34 (52,3) 29 (44,6) 2(3,1) 0,746+0,038 0,254+0,038 2,044

Чукчи 45 43 (95,6) 2 (4,4) 0 0,978+0,015 0,022+0,015 0,034

Нивхи 31 20 (64,5) 11 (35,5) 0 0,823+0,048 0,177+0,048 1,435

Удэгейцы 58 31 (53,4) 23 (39,8) 4 (6,8) 0,733+0,041 0,267+0,041 0,011

Нанайцы 13 8(61,5) 3(23,0) 2(154) 0,731+0,087 0,269+0,087 2,210

Всего: 1658

Однако и литературные, и полученные в нашем исследовании данные, указывают, что популяции северных монголоидов (чукчи, эскимосы) не отличаются по частотам аллелей АЭН 1В*47Щ$ и АЬйН2*С1и504Ьу5 от европейских популяций. Учитывая это, следует отказаться от распространившейся идеи о связи предрасположенности коренных северян к употреблению алкоголя с особенностями метаболизма алкоголя, обусловленными носительством аллелей АОН1В*47НЬ и АЬОН2*5П4Ьу5.

Рис. 3. Географическое распределение частот аллеля ADHIB*47His.

Карта построена на основе данных для 172 популяций с помощью программы Surfer

8.00 (Golden Software).

Определение частот пятсайтовых гаплотиов локуса ADH

Согласно опубликованным данным, в ближневосточных популяциях и в популяциях Юго-Восточной Азии аллель ADHlB*47His входит в состав разных гаплотипов [Osier et al., 2002] (рис 4). Для определения происхождения аллеля ADHIB*47His в исследованных популяциях для шести из них (иранцев, русских Костромы и Ростовской области коми-зырян, казахов и бурят) общей численностью 318 индивидов были дополнительно определены генотипы по 4 полиморфным сайтам в локусе ADH.

30.4 kb

1-1

AliHlC ADH1B

4q22-1-1 Г-—

/1 \ ,............Л

Urn-П1 J!e349V;,i , Arg.HHis ЛЧл!

2 2 1 2 1 lui нжннн Восток

2 2 1 2 2 Юго-Восточная Азия

Рестршшионный по;шморф!нм: I - cnma нсг, 2 ■ сайт ость fcoRl Han III Nsp\ ШI fool

Рис. 4. Расположение полиморфных сайтов, использованных для определения гаплотипов, в локусе ADH(по [Osier et al., 2002]). Указано сочетание аллелей (наличия/отсутствия рестрикционных сайтов) для двух наиболее распространенных гаплотипов, содержащих аллель ADHlB*47His.

Распределение генотипов во всех случаях соответствует равновесному (оценено с помощью точного критерия Фишера), за исключением распределения генотипов по полиморфизму £coRI (rsl789920) в выборке коми-зырян.

Для расчета наиболее вероятных частот гаплотипов полученные данные обрабатывали с помощью двух разных программ, как описано в «Методах». Обе программы дали сходные результаты. Рассчитанные частоты гаплотипов представлены в табл. 4. Для двух основных гаплотипов, содержащих аллель ADHlB*47His, -«ближневосточного» и «юго-восточного» - соотношения частот в исследованных популяциях показаны на рис. 6.

Как показано Osier et al., [2002], в популяциях Ближнего Востока основным гаплотипом, содержащим аллель ADHlB*47His, является гаплотип 2-2-1-2-1. В Юго-Восточной Азии этот гаплотип практически не встречается, там преобладает гаплотип 2-21-2-2 и встречаются некоторые другие редкие гаплотипы [Oota et al., 2007]. В исследованной нами группе иранцев аллель ADHlB*47His встречается преимущественно в составе «ближневосточного» гаплотипа. При общей частоте аллеля ADHlB*47His 24,4% (14 гетерозиготных индивида и 3 гомозиготных в выборке 41 человек) соотношение частот «ближневосточного» и «юго-восточного» гаплотипов составляет у иранцев 21:2.

По мере продвижения от Ближнего Востока к Южной Сибири соотношение гаплотипов меняется. У казахов расчетное соотношение частот «ближневосточного» и «юго-восточного» гаплотипов составляет 6:10 (при частоте аллеля ADIilB*47His около 20%), а у бурят (частота 21%) - только 1:30. И, как уже упоминалось выше, в Юго-Восточной Азии «ближневосточный» гаплотип не встречается.

ADH1A

1-1

-ISkb

Гаплотипы Русские

EcoRl Hnelll Sspl Msll Rsal Arg47His M и a 4 Иран Во логда Ростов, обл. Кострома Коми Казахи Буряты Японцы

11111 0,00 0,00 0,00

112 11 0,18 0,06 0,30 0,25 0,27 0,21 0,07 0,13 0,02

1 1 2 1 2 0,02 0,00 0,07 0,03 0,02 0,03 0,01 0,00

12 111 0,00 0,00 0,01 0,00

2 1 1 1 1 0,00 0,04 0,00 0,01 0,02 0,01 0,00

2 1 1 1 2 0,03 0,03

2 1 2 1 1 0,07 0,07 0,15 0,09 0,14 0,13 0,09 0,15 0,03

2 1 2 1 2 0,00 0,00 0,01 0,00

2 1 2 2 1 0,00 0.004 0,00

2 2 111 0,19 0,21 0,25 0,24 0,22 0,34 0,47 0,32 0,10

2 2 1 1 2 0,23 0,26 0,24 0,22 0,27 0,14 0,08 0,01 0,08

2 2 1 2 1* 0,23 0,21 0,04 0,04 0,00 0,02 0,06 0,01 0,00

2 2 1 2 2** 0,00 0,02 0,02 0,00 0,04 0,04 0,10 0,30 0,75

2 2 2 1 1 0,02 0,01 0,00 0,01 0,01 0,02 0,03 0,00

2 2 2 1 2 0,05 0,03

2 2 2 2 1 0,03 0,02 0,00 0,00

* «Ближневосточный» гаплотип, содержащий аллель ADH!B*47His ** - «Юго-восточный» гаплотип, содержащий аллель ADHlB*47His Для сравнения даны частоты гаплотипов из [Osier et al., 2002] (выделены жирным шрифтом). Гаплотипы обозначены также, как на рис. 4.

ГАПЛОТИПЫ друзы иран русск коми казах бурят япон

Юго-восточный □ 0 2 6 2 10 30 75

Ближневосточный □ 23 21 8 4 6 1 0

Рис. 5. Соотношение частот гаплотипов, содержащих аллель ADHlB*47His, в исследованных популяциях. Для русских даны объединенные данные по трем выборкам. Для сравнения приведены друзы (Ближний Восток) и японцы (Юго-Восточная Азия) из статьи [Osier et al., 2002].

Выявленное плавное изменение соотношения частот двух вариантов гаплотипов позволяет выдвинуть гипотезу о формировании установленной нами картины распределения гаплотипов, в состав которых входит аллель ADHlB*47His, в результате миграций вдоль степного пояса. Интересно отметить, что у русских и коми представлены оба гаплотипа. Это указывает на то, что аллель ADHlB*47His попал к ним из двух источниковых популяций, либо из популяции, в которой уже были представлены оба гаплотипа.

Внутрипопуляционная дифференциация по нейтральным STR-маркерам

Так как предполагается, что аллель ADHlB*Arg47His был привнесен в российские популяции с миграциями из ближневосточных или юго-восточных популяций, была проведена оценка возможной внутрипопуляционной дифференциации между подгруппами носителей аллеля 47His и индивидов с генотипом 47.Arg/47 Arg. Для этого использовали доступные данные о генотипах по нейтральным STR-маркерам для тех индивидов, для которых были установлены генотипы по ADHlB*Arg47His. Такие данные для 15 STR-маркеров (D3SI358, ТН01, D21S11, DI8S51, PentaE, D5S818, DI3S317, D7S820, DI6S539, CSFPO, PentaD, vWA, D8S1179, ТРОХ, FGA) коммерческого набора PowerPlexl6 (Promega), используемого для ДНК-идентификации человека в криминалистической экспертизе, были доступны для популяций русских Костромы, украинцев, белорусов и коми [Stepanov et al., 2010; Степанов и др., 2010]. Так как в указанных работах показано, что между русскими, украинцами, белорусами и коми межпопуляционные различия по STR-локусам незначимы (а в ряде случаев внутрипопуляционные различия и превышали межпопуляционные), с учетом невысокой, частоты аллеля ADHlB*47His исследуемые выборки были объединены.

Для анализа данные были разделены на две подвыборки: носители аллеля His (генотипы Arg/His и His/His) и носители генотипа Arg/Arg. В каждой полученной подвыборке были подсчитаны частоты каждого аллеля каждого STR-локуса. Из сравнения были исключены аллели, не представленные в одной из двух сравниваемых подвыборок (редкие аллели). Было выявлено 6 случаев из 108 сравнений с вероятностью случайности различий р<0,05 (табл. 5). Однако с учетом поправки Бонферрони (уровень р<0,0005) эти различия незначимы. Таким образом, внутрипопуляционная дифференциация носителей аллеля ADHlB*47Hls не выявлена.

Табл. 5.

Оценка уровня внутрипопуляционной дифференциации по STR-аллелям

Локус Аллель Р

PentaE 11 0,0025

FGA 24 0,01

D5S8I8 11 0,02

CSFPO 12 0,04

D7S820 12 0,05

Выводы

1. На основе собственных экспериментальных данных о частоте протективного в отношении алкоголизма аллеля А№Н2*504Ьу$ (в 16 популяциях, представляющих 14 этнических групп Евразии), дополненных анализом имеющихся литературных данных определено географическое распределение частот этого аллеля в Евразии для 190 популяций. Во всех исследованных популяцях РФ частота этого аллеля не превышает 5%. Таким образом, вклад носительства аллеля А№Н2*5041.у$ в генетически обусловленное снижение риска развития алкоголизма на популяционном уровне не может быть значительным для населения РФ.

2. На основе собственных и литературных данных определено географическое распределение частот аллеля АОН1В*47Н1$ для 172 популяций Евразии. Частота встречаемости этого аллеля, обладающего слабым протективным действием в отношении алкоголизма, экспериментально установлена в 27 популяциях, представляющих 20 этнических групп Евразии. Для исследованных популяций РФ частота носителей этого аллеля варьирует от 3-8% для населения европейской части страны до более 35% для коренного населения Южной Сибири и Дальнего Востока. В популяциях с повышенной частотой данного аллеля он может быть эпидемиологически значимым фактором, влияющим на риск развития алкоголизма и ассоциированных с ним заболеваний.

3. В популяциях иранцев, русских, коми-зырян, казахов и бурят на основе экспериментально установленных частот генотипов рассчитаны частоты 5-сайтовых гаплотипов, содержащих аллель АОН1В*47Н'а, один из которых (гаплотип 22121), характерен для жителей Ближнего Востока, а другой (гаплотип 22122) характерен для Юго-Восточной Азии. Доля носителей аллеля АОН1В*47№5 в составе гаплотипа 22121 уменьшается от более западных популяций к более восточным, а доля носителей этого аллеля в составе гаплотипа 22122 возрастает. В популяциях русских и коми аллель АОШВ*47Ш$ представлен в составе обоих гаплотипов примерно в равных долях. На основе соотношения частот гаплотипов в изученных группах выдвинута гипотеза о вкладе миграций вдоль степного пояса Евразии в формирование географического распределения частот аллеля АОН1В*47Н1$.

4. По частотам аллелей АОШВ*47Ни и А1^ВН2 *504Ьу$ генов алкогольдегидрогеназы и альдегиддегирогеназы, а следовательно и по особенностям метаболизма этанола, определяемым ферментами, кодируемыми этими генами, русские не отличаются от других народов Европы.

Часть работы выполнена в рамках плановых работ ИОГен РАН по теме «Факторы формирования генофондов популяций: сравнительный анализ финно-угорских и восточно-славянских групп» Подпрограммы «Генофонды и генетическое разнообразие» Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Биологическое разнообразие и ГК № 02.512.11.2231 от «10» июля 2008 «Разработка отечественного набора ДНК-маркеров для ДНК-идентификации человека»

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Боринская С.А., Гасемиаиродсари Ф., Кальина Н.Р.. Соколова М.В., Янковский Н.К. Полиморфизм гена алкогольдегидрогеназы ADH1B в восточнославянских и ираноязычных популяциях И Генетика, 2005, Т. 41, № 11, С. 1563-1566.

2. Borinskaya S., Marusin A., Kal'ina N.. Faskhutdinova G, Koshechkin V., Khusnutdinova E., Stepanov V., Puzyrev V., Yankovsky N., Rogaev E. Distribution of alcoholism protecting alcohol dehydrogenase ADHlB*47His allele in Eurasia. // Am J Hum Genet. 2009. V. 84, № 1, P. 89-92.

3. Li H., Borinskaya S., Yoshimura K., Kal'ina N.. Marusin A., Stepanov V., Qin Zh., Khaliq Sh., Lee M.-Y., Yang Y., Mohyuddin A., Gurwitz D., Qasim Mehdi S., Rogaev E., Jin L., Yankovsky N., Kidd J., Kidd K. Refined geographic distribution of the Oriental ALDH2*504Lys (nee 487Lys) Variant // Ann. Hum. Genet. 2009. V. 73. № 3, P. 335-345.

Тезисы и сообщения:

4.. Ghasemian Rodsari F., Sokolova M., Kalyina N.. Borinskaya S., Yankovsky N. Iranian and Pamir populations in Eurasian context: allele frequencies of eight loci associated with common diseases. 8th Iranian Congrss of Biochemistry and First International Congress of Biochem. and Molecular Biol., September 11-15,2005, Tehran, Iran. Selected Abstracts // Clinical Biochemistry. 2005. V. 38. p.857

5 . Borinskaya S., Kal'ina N.. Marusin A, Stepanov V., Yuriev E., Khusnutdinova E., Puzyrev V., Yankovsky N. ADHIB*47His allele frequency distribution in populations of Russia and neighboring countries // Human Genome Meeting 2006, May 30- June 3 2006, Helsinki, Finland, p. 273.

6. Кальина H.P.. Санина E.B., Янковский Н.К. Полиморфизм генов метаболизма алкоголя в населении Евразии // Сборник сообщений V съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГиС), Москва, 21-27 июня 2009 года. С. 428.

Заказ № 119-1/04/10 Подписано в печать 27.04.2010 Тираж 80 экз. Усл. п.л. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 С^)) www.cfr.rii; е-таИ:т/о@с/г.т

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кальина, Нина Ромуальдовна

Список использованных сокращений.

Введение.

1. Обзор литературы

1.1. Метаболизм этанола в организме человека

1.2. Полиморфизм генов метаболизма этанола и номенклатура аллелей.

1.3. Выявление атипичных ферментов метаболизма этанола и кодирующих 13 генов

1.4. Популяционные исследования частот аллелей генов АОНШ и АЫЖ

1.5. Структура гаплотипов локусов АХ)Н и АЬОН

2. Материалы и методы.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

2.2.1. Хранение образцов.

2.2.2. Выделение и хранение препаратов геномной ДНК.

2.2.3. Оценка количества ДНК.

2.2.4. ПЦР-Амплификация.

2. 2.5. Электрофоретический анализ ДНК в ПААГ

2.2.6. Статистический анализ данных.

3. Результаты и обсуждение.

3.3.1. Определение частот аллелей и генотипов гена альдегиддегидрогеназы 37 АЬОН2 *&и487Ьуя (гэ671) в исследуемых популяциях

3.2. Анализ географического распределения частот аллеля АЬБН2*487Ьуз в 42 популяциях мира

3.3. Определение частот аллелей и генотипов гена альдегиддегидрогеназы 44 АВН1В*А^47Шз (гэ 1229984 ) в исследуемых популяциях

3.4. Анализ географического распределения частот аллеля АОН1В*47Ш$ в популяциях мира

3.5. Определение частот аллелей и генотипов по однонуклеотидным 56 полиморфизмам локуса АИН в шести популяциях

3.6. Определение частот пятсайтовых гаплотиов локуса АОН

3.7. Внутрипопуляционная дифференциация по нейтральным 8ТЯ-маркерам

3.8. Сопоставление географического распределения частот аллелей 66 АОН1В*47тя и АЮН2 *504Ьуз и возможные факторы отбора.

Выводы.

Благодарности.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Полиморфизм генов метаболизма этанола в населении Евразии"

Актуальность работы

Потребление алкоголя в России составляет по оценкам экспертов более 14 литров на человека в год. С потреблением алкоголя в России связана повышенная смертность мужчин трудоспособного возраста: от трети до более половины смертей составляют прямые (из-за отравления алкоголем) или непрямые (дорожно-транспортные происшествия в состоянии опьянения, бытовые убийства, самоубийства, травмы, цирроз печени и другие связанные с алкоголем заболевания) алкогольные потери (Немцов, 2001; Андреев и др„ 2008; Leon et al., 2009; Zaridze et al., 2009). Исследование причин сверхвысокого потребления алкоголя и факторов риска формирования алкогольной зависимости имеет высокую социальную и научную значимость. Гены, контролирующие метаболизм алкоголя, влияют на количество потребляемого алкоголя и риск развития алкогольной зависимости. К ним относятся ген алкогольдегидрогеназы ADH1B (прежнее название ADH2) и ген ALDH2, кодирующий митохондриальную альдегиддегидрогеназу.

Протективными в отношении алкоголизма являются аллели этих генов ADHlB*Arg47His и ALDH2*504Lys. К началу данного исследования лишь для нескольких популяций, представляющих население России, были известны частоты аллелей обоих генов, а для русских в отношении частоты протективного аллеля ADHlB*47His были получены противоречивые данные. Противоречивые данные о частотах этого аллеля были получены также и для популяций Ближнего Востока. Для популяций Центральной Азии данные отсутствовали. Характер географического распределения частот аллелей ADHlB*Arg47His и ALDH2*Glu504Lys в ареале между двумя хорошо изученными регионами - Европой и Юго-Восточной Азией -оставался неизвестным. Это определило актуальность исследования частот аллелей указанных генов в популяциях Евразии.

Цели исследования

Целью диссертационной работы явились экспериментальное установление частот аллелей генов алкогольдегидрогеназы АОН1В*А^47№з и альдегиддегидрогеназы АЬБН2 *01и504Ьуз в российских популяциях и анализ географического распределения частот этих аллелей в популяциях Евразии.

Задачи исследования

1. Подобрать оптимальные методы генотипирования полиморфизмов АИНШ 7Шз и АШН2*в1и504Ьуя.

2. Определить генотипы индивидов по изучаемым полиморфизмам в выборках, представляющих популяции Евразии;

3. Установить частоты соответствующих аллелей в изученных популяциях;

4. Провести анализ опубликованных данных о частотах аллелей АОН1В *Аг^4 7IIи АЬОН2 *С1и504Ьу$ и охарактеризовать географическое распределение частот этих аллелей в Евразии.

5. В отдельных выборках провести анализ пятисайтовых гаплотипов (£соМ, НаеIII, (АВН1С*Пе349¥а1), М?/I {АОН1В*Агё47тз), Яза!) для выяснения картины формирования географического распределения частот аллеля АОН1В*А^47Шз в Евразии и определения возможных источниковых популяций.

6. Провести анализ внутрипопуляционной дифференциации носителей аллелей АОН1В*А^47Шз по нейтральным БТЯ-маркерам.

Научная новизна

Впервые установлены частоты протективного в отношении алкоголизма аллеля АЮН2*504Ьуз для 12 этнических групп России, Ближнего и Дальнего Востока и Центральной Азии, всего проанализировано по этому локусу 16 популяций из 14 этнических групп. Установлена северная граница распространения аллеля в Евразии.

Впервые установлены частоты протективного в отношении алкоголизма аллеля ЛИН!В*47Нгз для 14 из 20 изученных этнических групп (27 популяционных выборок России, Ближнего Востока и Центральной Азии). Для 3 этнических групп уточнены ранее опубликованные ошибочные данные.

Определено географическое распределения частот аллелей АОН1В*47Нгз и АЬИН2 *504Ьуя в популяциях Евразии.

В локусе А ОН, кроме функционального полиморфизма АПН1В*47Шя, дополнительно определены генотипы по четырем полиморфным сайтам в популяциях иранцев, русских, коми, казахов и бурят и рассчитаны вероятности пятисайтовых гаплотипов: ЕсоШ, Нае III, (АОН1С*Пе349Уа1), МуЛ

А1)Н1В*А^47Шз), Яяа1 в этих популяциях. На основе распределения частот пятисайтовых гаплотипов выдвинута гипотеза о возможной роли миграций в евразийском степном поясе в формировании современной картины распределения частота аллеля АИШВ *4 7Ш$ в Евразии.

Практическая значимость

Установленные частоты аллелей АВН1В*47Н1я и АЬОН2*5()4Ьу5 важны для исследования роли генетических факторов риска развития алкоголизма и ассоциированных с ним заболеваний в российских популяциях. Знание географического распределения частот аллелей является принципиально важным для исследования фундаментальной проблемы адаптивности аллелей в популяциях человека и выявления факторов отбора.

1. Обзор литературы.

Полиморфизм генов ADH и ALDH и их популяционно-генетические исследования

Потребление алкоголя в России составляет по оценкам экспертов более 14 литров на человека в год. С потребление алкоголя в России связана сверхсмертность мужчин трудоспособного возраста - от трети до более половины смертей составляют прямые (из-за отравления алкоголем) или непрямые (дорожно-транспортные происшествия в состоянии опьянения, бытовые убийства, самоубийства, производственные травмы, цирроз печени и другие связанные с алкоголем заболевания) алкогольные потери [Немцов, 2001; Андреев и др., 2008; Leon et al., 2009; Zaridze et al., 2009]. Исследование причин сверхвысокого потребления алкоголя и факторов риска формирования алкогольной зависимости имеет высокую социальную и научную значимость. Помимо анализа социально-экономических и психологических факторов большое значение имеет исследование генетики алкоголизма, позволяющее понять молекулярные механизмы действия алкоголя и формирования зависимости от него. Как показали близнецовые исследования, исследования приемных детей, исследования детей одной матери от разных отцов, существует значительный вклад наследственной предрасположенности в развитие алкоголизма. Конкордантность близнецов по данному признаку составляет 30-50% (Plomin et al., 1994), и для мужчин выше, чем для женщин. Гены, влияющие на риск развитие алкогольной зависимости, можно разделить на две группы: связанные с метаболизмом алкоголя и связанные с функциями мозга. Для генов первой группы показана четкая ассоциация с алкоголизмом, тогда как для генов второй группы данные довольно противоречивы [Gelernter, Kranzler 2009; Dick et al., 2006; Kuhnke, 2008; Tolstrup et al., 2008; Macgregor et al., 2009].

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Кальина, Нина Ромуальдовна

Выводы

1. На основе собственных экспериментальных данных о частоте протективного в отношении алкоголизма аллеля АЬОН2 *504Ьуь- (в 16 популяциях, представляющих 14 этнических групп Евразии), дополненных анализом имеющихся литературных данных определено географическое распределение частот этого аллеля в Евразии для 190 популяций. Во всех исследованных популяциях РФ частота этого аллеля не превышает 5%. Таким образом, вклад носительства аллеля АЬБН2*504Ьуз в генетически обусловленное снижение риска развития алкоголизма на популяционном уровне не может быть значительным для населения РФ.

2. На основе собственных и литературных данных определено географическое распределение частот аллеля АПН1В*47Шз для 172 популяций Евразии. Частота встречаемости этого аллеля, обладающего слабым протективным действием в отношении алкоголизма, экспериментально установлена в 27 популяциях, представляющих 20 этнических групп Евразии. Для исследованных популяций РФ частота носителей этого аллеля варьирует от 3-8% для населения европейской части страны до более 35% для коренного населения Южной Сибири и Дальнего Востока. В популяциях с повышенной частотой данного аллеля он может быть эпидемиологически значимым фактором, влияющим на риск развития алкоголизма и ассоциированных с ним заболеваний.

3. В популяциях иранцев, русских, коми-зырян, казахов и бурят на основе экспериментально установленных частот генотипов рассчитаны частоты 5-сайтовых гаплотипов, содержащих аллель АОН1В*47Шз, один из которых (гаплотип 22121), характерен для жителей Ближнего Востока, а другой (гаплотип 22122) характерен для Юго-Восточной Азии. Доля носителей аллеля АОН1В*47Шз в составе гаплотипа 22121 уменьшается от более западных популяций к более восточным, а доля носителей этого аллеля в составе гаплотипа 22122 возрастает. В популяциях русских и коми аллель АВН]В*47Шя представлен в составе обоих гаплотипов примерно в равных долях. На основе соотношения частот гаплотипов в изученных группах выдвинута гипотеза о вкладе миграций вдоль степного пояса Евразии в формирование географического распределения частот аллеля АОН1В *4 7Шя.

4. По частотам аллелей АОН]В*47Ш? и АЬОН2*504Ьуз генов алкогольдегидрогеназы и альдегидцегирогеназы, а следовательно и по особенностям метаболизма этанола, определяемым ферментами, кодируемыми этими генами, русские не отличаются от других народов Европы.

Благодарности

Выражаю благодарность всем добровольцам, согласившимся предоставить биоматериал для исследований, а также коллегам, предоставившим некоторые коллекции ДНК: Харьковскоиу Центру клинической генетики и пренатальной диагностики (дир, - проф Е. Я. Гречанина), д.м.н. С.П.Фещенко (НИИ наследственных и врожденных заболеваний, Минск, Беларусь), проф. М.М.Гараеву (НИИ ЭиМ РАМН), проф. Э.К.Хуснутдиновой (ИБХГ УНЦ РАН), проф. В.А.Степавнову (ИМГ СО РАМН), проф. Е.И.Рогаеву (НЦПЗ РАМН и ИОГен РАН).

Искренне благодарю Олега Владимировича Балановского за ценные советы и помощь в анализе внутрипопуляционной дифференциации по нейтральным ЭТИ.-маркерам, коллектив отдела эволюционной геномики за поддержку и заинтересованное обсуждение экспериментов, Ирину Юрьевну Морозову за помощь в составлении карт географического распределения аллелей, Алексей Васильевича Залесова за помощь в расчетах частот гаплотипов с применением компьютерной программы Аг1ецшпе.

Я искренне благодарна Елене Марковне Меерсон, Нине Борисовне Варшавер, Ирине Вячеславовне Бобрышевой, Андрею Артуровичу Недоспасову, Анастасии Петровне Григоренко, Елене Львовне Арсеньевой, Ирине Георгиевне Ефименко, Андрею Николаевичу Лебедеву, Елене Васильевне Гончаровой, Дмитрию Андреевичу Климову, Михаилу Юрьевичу Скоблову, а также очень многим другим людям, кто в разные годы и при разных обстоятельствах помогал мне сохранять интерес к науке и веру в собственные силы

Хочу поблагодарить руководителя лаборатории анализа генома директора ИОГен РАН чл.-корр. РАН Николая Казимировича Янковского и особенно непосредственного научного руководителя работы Светлану Александровну Боринскую, создавшим условия для выполнения данной работы.

Благодарю за понимание и поддержку моих дочерей Ирину и Александру.

Часть работы выполнена в рамках плановых работ ИОГен РАН по теме «Факторы формирования генофондов популяций: сравнительный анализ финно-угорских и восточно-славянских групп» Подпрограммы «Генофонды и генетическое разнообразие» Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Биологическое разнообразие и ГК № 02.512.11.2231 от «10» июля 2008 «Разработка отечественного набора ДНК-маркеров для ДНК-идентификации человека»

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кальина, Нина Ромуальдовна, Москва

1. Вейр, Б. Анализ генетических данных. Пер.с англ. Москва.: Мир,- 1995. 400с.

2. Зольник В.Г., Кершенгольц Б.М.Проблемы современнйо наркологии. — с.115 -120.

3. Козлов А.И. Потребление алкоголя и связанные с алкоголем проблемы у коренного населения Севера России // Наркология.- 2006. Т. 10. - С.22 - 29.

4. Кушнерова Н.Ф. Растительные полифенолы как регуляторы метаболизма этанола и липидов у людей двух этнических групп // Сб. Науч.трудов «Естествознание и гуманизм» под редакцией проф., д.б.н. H.H. Ильинских . Томск, 2006, Т. 3, вып. 1.

5. Курилович С.А., Авксентюк A.B., Сегал Б., Галактионов O.K., Якушенко И.А., Даффи Л. Особенности потребления алкоголя и генотип митохондриальной альдегиддегидрогеназы у коренных мужчин Чукотки. // Вестн. РАМН.- 1994. -V.2. Р.28 - 30.

6. Лужников Е.А. Клиническая токсикология. М.: Медицина, 1994. - 255 с.

7. Маниатис Т., Фрич Э. С. Дж. Молекулярное клонирование. Пер. с англ. Москва.: Мир.- 1988. 538р.

8. Марусин A.B., Степанов В.А., Спиридонова М.Г., Пузырев В.П. Полиморфизмгенов алкогольдегидрогеназ в русских популяциях Сибирского региона // Мол.биология. 2004. Т. 38. № 4. С. 625-631.

9. Немцов A.B. Алкогольная смертность в России, 1980-90-е годы. -М., 2001. 60с.

10. Островский Ю.МСадовник М.Н. Пути метаболизма этанола и их роль в развитии алкоголизма. Теоретические основы поиска средств для лечения алкоголизма Москва.- 1984.- 150с.

11. Панин Л.Е. Рациональное питание на Севере основа первичной профилактики // Проблемы современного социального развития народностей Севера. Новосибирск, 1987.

12. Agarwal, D. P.,.Goedde, H. W. Pharmacogenetics of alcohol metabolism and alcoholism // Pharmacogenetics.- 1992. V.2. - P.48 - 62.

13. Ahn, K. S., Abdiev, S., Rahimov, B., Malikov, Y., Bahramov, S., Okada, R., Naito, M., Hamajima, N. Alcohol dehydrogenase IB and Aldehyde dehydrogenase 2 Polymorphisms in Uzbekistan // Asian Pac.J.Cancer Prev.- 2009. V.10. - P.17 - 20.

14. Assanangkornchai, S., Noi-pha, K., Saunders, J. B., Ratanachaiyavong, S. Aldehyde dehydrogenase 2 genotypes, alcohol flushing symptoms and drinking patterns in Thai men //Psychiatry Res.- 1-5-2003. V.l 18. - P.9 - 17.

15. Athari, A., Gohar-Dehi, S., Rostami-Jalilian, M. Determination of definitive and intermediate hosts of cercarial dermatitis-producing agents in northern Iran // Arch.Iran Med.- 2006. V.9. - P.l 1 - 15.

16. Belkovets A, Kurilovich S, Avkenstyuk A, Agarwal DP Alcohol Drinking Habits and Genetic Polymorphism of Alcohol Metabolism Genes in West Siberia // International Journal of Human Genetics.- 2001 P. 165 - 170.

17. Bhaskar, L. V., Thangaraj, K., Osier, M., Reddy, A. G., Rao, A. P., Singh, L., Rao, V. R. Single nucleotide polymorphisms of the ALDH2 gene in six Indian populations // Ann.Hum.Biol.- 2007. V.34. - P.607 - 619.

18. Bonne, B. The Samaritans: a demographic study // Hum.Biol.- 1963. V.35. - P.61 -89.

19. Boom, R., Sol, C. J., Salimans, M. M., Jansen, C. L., Wertheim-van Dillen, P. M., van der Noordaa, J. Rapid and simple method for purification of nucleic acids // J.Clin.Microbiol.- 1990. V.28. - P.495 - 503.

20. Boonyaphiphat, P., Thongsuksai, P., Sriplung, H., Puttawibul, P. Lifestyle habits and genetic susceptibility and the risk of esophageal cancer in the Thai population // Cancer Lett.- 5-12-2002. V. 186. - P. 193 - 199.

21. Cao, X.,.Wu, D. Compare of distributions of gene polymorphisms about alcohol metabolizing-related enzymes in five Chinese nationalities. // Wei Sheng Yan.Jiu.-2002.- V.31.-P.156- 159.

22. Chan, A. W. Racial differences in alcohol sensitivity // Alcohol Alcohol.- 1986. -V.21.-P.93 104.

23. Chen, C. C., Lu, R. B., Chen, Y. C., Wang, M. F„ Chang, Y. C., Li, T. K., Yin, S. J. Interaction between the functional polymorphisms of the alcohol-metabolism genes in protection against alcoholism // Am.J.Hum.Genet.- 1999. V.65. - P.795 - 807.

24. Chen, S. H., Zhang, M., Scott, C. R. Gene frequencies of alcohol dehydrogenase2 and aldehyde dehydrogenase2 in Northwest Coast Amerindians // Hum.Genet.- 1992. -V.89. -P.351 -352.

25. Chen, S. H., Zhang, M., Wang, N. S., Scott, C. R. Gene frequencies of alcohol dehydrogenase2 (ADH2) and aldehyde dehydrogenase2 (ALDH2) in five Chinese minorities // Hum.Genet.- 1994. Y.94. - P.571 - 572.

26. Chen, W. J., Loh, E. W., Hsu, Y. P., Cheng, A. T. Alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase genotypes and alcoholism among Taiwanese aborigines // Biol.Psychiatry.- 15-3-1997. V.41. - P.703 - 709.

27. Crabb, D. W., Edenberg, H. J., Bosron, W. F., Li, T. K. Genotypes for aldehyde dehydrogenase deficiency and alcohol sensitivity. The inactive ALDH2(2) allele is dominant//J.Clin.Invest.- 1989. V.83. - P.314 - 316.

28. Edenberg, H. J. Regulation of the mammalian alcohol dehydrogenase genes // Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.- 2000. V.64. - P.295 - 341.

29. Edenberg, H. J. The genetics of alcohol metabolism: role of alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase variants // Alcohol Res.Health.- 2007. V.30. - P.5 -13.

30. Excoffier, L.,.Slatkin, M. Maximum-likelihood estimation of molecular haplotype frequencies in a diploid population // Molecular Biology and Evolution.- 1-9-1995. -V.12.-P.921 -927.

31. Excoffier, L., Laval, G., Schneider, S. Arlequin (version 3.0): An integrated software package for population genetics data analysis // Evol.Bioinform.Online.- 2005. V.l. - P.47 - 50.

32. Fong, W: P., Ho, Y. W., Lee, C. Y., Keung, W. M. Liver alcohol and aldehyde dehydrogenase isozymes in a Chinese population in Hong Kong // Hum.Hered.- 1989. -V.39.-P.185 191.

33. Gelernter, J.,.Kranzler, H. R. Genetics of alcohol dependence // Hum.Genet.- 2009. -V.126.-P.91 -99.

34. Goedde, H. W.,.Agarwal, D. P. Aldehyde dehydrogenase polymorphism: molecular basis and phenotypic relationship to alcohol sensitivity // Alcohol Alcohol Suppl.-1987.-V.l.-P.47-54.

35. Goedde, H. W.,.AgarwaI, D. P. Polymorphism of aldehyde dehydrogenase and alcohol sensitivity // Enzyme.- 1987. V.37. - P.29 - 44.

36. Goedde, H. W., Agarwal, D. P., Fritze, G., Meier-Tackmann, D., Singh, S., Beckmann, G., Bhatia, K., Chen, L. Z., Fang, B., Lisker, R.,. Distribution of ADH2and ALDH2 genotypes in different populations // Hum.Genet.- 1992. V.88. - P.344 -346.

37. Gong, Z., Harada, S., Myo, Thaik Oo, Okubo, T. Investigation for polymorphism of ALDH2 exonl2 in several Asian areas. // Nihon Arukoru Yakubutsu Igakkai Zasshi.-1998.-V.33.-P. 144- 150.

38. Halej TJ.Berndt W.O. Handbook of Toxicology USA.- 1987.

39. Han, Y., Gu, S., Oota, H., Osier, M. V., Pakstis, A. J., Speed, W. C., Kidd, J. R., Kidd, K. K. Evidence of positive selection on a class IADH locus // Am.J.Hum.Genet.- 2007. V.80. - P.441 - 456.

40. Harada, S., Agarwal, D. P., Goedde, H. W. Isozyme variations in acetaldehyde dehydrogenase (e.c.1.2.1.3) in human tissues // Hum.Genet.- 31-10-1978. V.44. -P.181 - 185.

41. Harada, S., Misawa, S., Agarwal, D. P., Goedde, H. W. Liver alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase in the Japanese: isozyme variation and its possible role in alcohol intoxication // Am.J.Hum.Genet.- 1980. V.32. - P.8 - 15.

42. Hasegawa, Y., Higuchi, S., Matsushita, S., Miyaoka, H. Association of a polymorphism of the serotonin IB receptor gene and alcohol dependence with inactive aldehyde dehydrogenase-2 // J.Neural Transm.- 2002. V.109. - P.513 - 521.

43. Hashimoto, T., Uchida, K., Okayama, N., Imate, Y., Suehiro, Y,, Ueyama, Y., Yamashita, H., Hinoda, Y. ALDH2 1510 G/A (Glu487Lys) polymorphism interactionwith age in head and neck squamous cell carcinoma // Tumour.Biol.- 2006. V.27. -. P.334 - 338.

44. Hasin, D., Aharonovich, E., Liu, X., Mamman, Z., Matseoane, K., Carr, L., Li, T. K. Alcohol and ADH2 in Israel: Ashkenazis, Sephardics, and recent Russian immigrants // Am.J.Psychiatry.- 2002. V.159. - P.1432 - 1434.

45. Hsu, L. C., Bendel, R. E., Yoshida, A. Genomic structure of the human mitochondrial aldehyde dehydrogenase gene // Genomics.- 1988. V.2. - P.57 - 65.

46. Ikuta, T., Szeto, S., Yoshida, A. Three human alcohol dehydrogenase subunits: cDNA structure and molecular and evolutionary divergence // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A .-1986,-V.83.-P.634-638.

47. Impraim, C., Wang, G., Yoshida, A. Structural mutation in a major human aldehyde dehydrogenase gene results in loss of enzyme activity // Am.J.Hum.Genet.- 1982. -V.34. P.837 - 841.

48. Isashiki, Y., Tabata, Y., Kamimura, K., Ohba, N. Genotypes of aldehyde dehydrogenase and alcohol dehydrogenase polymorphisms in patients with Leber's hereditary optic neuropathy // Jpn.J.Hum.Genet.- 1997. V.42. - P. 187 - 191.

49. Iwahashi, K., Matsuo, Y., Suwaki, H., Nakamura, K., Ichikawa, Y. CYP2E1 and ALDH2 genotypes and alcohol dependence in Japanese // Alcohol Clin.Exp.Res.-1995.-V.19.-P.564 566.

50. Iwai, N., Tago, N., Yasui, N., Kokubo, Y., Inamoto, N., Tomoike, H., Shioji, K. Genetic analysis of 22 candidate genes for hypertension in the Japanese population // J.Hypertens.- 2004. V.22. - P.l 119 - 1126.

51. Kermekchiev, M. B., Kirilova, L. I., Vail, E. E., Barnes, W. M. Mutants of Taq DNA polymerase resistant to PCR inhibitors allow DNA amplification from whole blood and crude soil samples // Nucleic Acids Res.- 2009. V.37. - P.e40

52. Kim, D. J., Choi, I. G., Park, B. L., Lee, B. C., Ham, B. J., Yoon, S., Bae, J. S., Cheong, H. S., Shin, H. D. Major genetic components underlying alcoholism in Korean population // Hum.Mol.Genet.- 15-3-2008. V.17. - P.854 - 858.

53. Komiya, Y., Nakao, H., Kuroda, Y., Arizono, K., Nakahara, A., Katoh, T. Application of aldehyde dehydrogenase 2 (ALDH2) genetic diagnosis in support of decreasing alcohol intake // J.Occup.Health.- 2006. V.48. - P. 161 - 165.

54. Kurilovich, S. A., Jakuschenko, I. A., Egorova, N. G., Avksentyuk, A. V., Trusov, V. B. Flushing response and its role in alcohol disease in Siberian populations // Int.J.Circumpolar.Health.- 1998. V.57 Suppl 1. - P.454 - 458.

55. Lee, K. H., Kwak, B. Y., Kim, J. H., Yoo, S. K., Yum, S. K., Jeong, H. S. Genetic polymorphism of cytochrome P-4502E1 and mitochondrial aldehyde dehydrogenase in a Korean population // Alcohol Clin.Exp.Res.- 1997. V.21. - P.953 - 956.

56. Leon, D. A., Shkolnikov, V. M., McKee, M. Alcohol and Russian mortality: a continuing crisis // Addiction.- 4-8-2009

57. Li, H., Gu, S., Cai, X., Speed, W. C., Pakstis, A. J., Golub, E. I., Kidd, J. R., Kidd, K. K. Ethnic related selection for an ADH Class I variant within East Asia // PLoS.One.2008.-V.3.-P.el881

58. Li, Z. X.,.Xie, G. L. Detection of the twelfth extron(G/A) polymorphism of ALDH2 in Beijin Han people // Chin.J.Modern Med.- 2005457 458 .

59. Long, J. in Liberies D. A. SNPing variation from genomes Meeting report // Genom biol- 12-12-2001. V.3. - P.4001.1 - 4001.4.

60. Luo, H. R., Tu, G. C., Zhang, Y. P. Detection of usual and atypical aldehyde dehydrogenase alleles by mismatch amplification mutation assay // Clin.Chem.Lab Med.- 2001. -V.39. P. 1195 - 1197.

61. Luo, H. R.,.Zhang, Y. P. Aldehyde dehydrogenase (ALDH2) polymorphism and drinking behavior. // Yi.Chuan.- 2004. V.26. - P.263 - 266.

62. Luo, H. R., Israel, Y., Tu, G. C., Eriksson, C. J., Zhang, Y. P. Genetic polymorphism of aldehyde dehydrogenase 2 (ALDH2) in a Chinese population: gender, age, culture, and genotypes of ALDH2 // Biochem.Genet.- 2005. V.43. - P.223 - 227.

63. Luo, H. R., Wu, G. S., Pakstis, A. J., Tong, L., Oota, II., Kidd, K. K., Zhang, Y. P. Origin and dispersal of atypical aldehyde dehydrogenase ALDH2487Lys // Gene.-15-4-2009. V.435. - P.96 - 103.

64. Mainville M. Vodka runs through bloodlines. Toronto, Ont.: Toronto Star .- 2004.

65. Mi, S. L., Sun, A. J., Zou, Y. Z., Wang, K. Q., Zhang, Q., Yu, J. Y., Ge, J. B. Association study between ALDH2 polymorphism and long life. // Shanghai Medicine.- 2007. -V. 189 . P.

66. Morata, P., Queipo-Ortuno, M. I., de Dios, Colmenero J. Strategy for optimizing DNA amplification in a peripheral blood PCR assay used for diagnosis of human brucellosis // J.Clin.Microbiol.- 1998. V.36. - P.2443 - 2446.

67. Muramatsu, T., Wang, Z. C., Fang, Y. R., Hu, K. B., Yan, H., Yamada, K., Higuchi, S., Harada, S., Kono, H. Alcohol and aldehyde dehydrogenase genotypes and drinking behavior of Chinese living in Shanghai. // Hum.Genet.- 1995. V.96. -P.151 - 154.

68. Neumark, Y. D., Friedlander, Y., Thomasson, H. R., Li, T. K. Association of the ADH2*2 allele with reduced ethanol consumption in Jewish men in Israel: a pilot study // J.Stud.Alcohol.- 1998. V.59. - P. 133 - 139.

69. Ning, Y. G., Xie, Y, Sun, M., Yang, T. L., Zhou, H. Y. Relationship between genie polymorphism of ALDH2 and alcoholic cardiomyopathy // China J.Mod.Med.- 2005. -V.15.-P.2776-2779.

70. Ohmae, H., Iwanaga, Y., Nara, T., Matsuda, H., Yasuraoka, K. Biological characteristics and control of intermediate snail host of Schistosoma japonicum // Parasitol.Int.- 2003. V.52. - P.409 - 417.

71. Ohsawa, I., Kamino, K., Nagasaka, K., Ando, F., Niino, N., Shimokata, H., Ohta, S. Genetic deficiency of a mitochondrial aldehyde dehydrogenase increases serum lipidperoxides in community-dwelling females // J.Hum.Genet.- 2003. V.48. - P.404 -409.

72. Okamoto, K., Murawaki, Y., Yuasa, And, I, Kawasaki, H. Effect of ALDH2 and CYP2E1 gene polymorphisms on drinking behavior and alcoholic liver disease in Japanese male workers // Alcohol Clin.Exp.Res.- 2001. V.25. - P.19S - 23S.

73. Oota, H., Dunn, C. W., Speed, W. C., Pakstis, A. J., Palmatier, M. A., Kidd, J. R., Kidd, K. K. Conservative evolution in duplicated genes of the primate Class IADH cluster // Gene.- 1-5-2007. V.392. - P.64 - 76.

74. Osier, M., Pakstis, A. J., Kidd, J. R., Lee, J. F., Yin, S. J., Ko, H. C., Edenberg, H. J., Lu, R. B., Kidd, K. K. Linkage disequilibrium at the ADH2 and ADH3 loci and risk of alcoholism // Am. J.Hum.Genet.- 1999. V.64. - P.l 147 - 1157.

75. Ostrer, H. A genetic profile of contemporary Jewish populations // Nat.Rev.Genet.-2001.-V.2.-P.891 898.

76. Ott, J. EH programm.- http://linkage.rockefeller.edu/ott/eh.htm

77. Peng, G. S.,.Yin, S. J. Effect of the allelic variants of aldehyde dehydrogenase ALDH2*2 and alcohol dehydrogenase ADH1B*2 on blood acetaldehyde concentrations // Hum.Genomics.- 2009. V.3. - P.121 - 127.

78. Peng, Y., Shi, H., Qi, X. B., Xiao, C. J., Zhong, H., Ma, R. L., Su, B. The ADH1B Arg47His polymorphism in east Asian populations and expansion of rice domestication in history // BMC.Evol.Biol.- 2010. V.10. - P. 15

79. Peterson, R. J., Goldman, D., Long, J. C. Effects of worldwide population subdivision on ALDH2 linkage disequilibrium // Genome Res.- 1999. V.9. - P.844 - 852.

80. Promin,.et al. I I Science.- 1994. V.264. - P. 1733 - 1739.

81. Rao, V. R., Bhaskar, L. V., Annapurna, C., Reddy, A. G., Thangaraj, K., Rao, A. P., Singh, L. Single nucleotide polymorphisms in alcohol dehydrogenase genes among some Indian populations // Am.J.Hum.Biol.- 2007. V.19. - P.338 - 344.

82. Roychoudhury, A. K.Nei, M. Human Polymorphic Genes: World Distribution. New York.: Oxford Univ. Press.- 1988.

83. Sambrook J, Russell D Molecular cloning: A laboratory manual.-. V.3. - P.l - 2222.

84. Segal, B. ADH and ALDH polymorphisms among Alaska Natives entering treatment for alcoholism // Alaska Med.- 1999. V.41. - P.9 - 12, 23.

85. Shenoi, S. D., Davis, S. V., Rao, S., Rao, G., Nair, S. Dermatoses among paddy field workers—a descriptive, cross-sectional pilot study // Indian

86. J.Dermatol.Venereol.Leprol.- 2005. V.71. - P.254 - 258.

87. Smith, M., Hopkinson, D. A., Harris, H. Alcohol dehydrogenase isozymes in adult human stomach and liver: evidence for activity of the ADH 3 locus // Ann.Hum.Genet.- 1972. V.35. - P.243 - 253.

88. Smith, M., Hopkinson, D. A., Harris, H. Studies on the properties of the human alcohol dehydrogenase isozymes determined by the different loci ADH1, ADH2, ADH3 // Ann.Hum.Genet.- 1973. V.37. - P.49 - 67.

89. Smith, M., Hopkinson, D. A., Harris, H. Studies on the subunit structure and molecular size of the human alcohol dehydrogenase isozymes determined by the different loci, ADH1, ADH2, and ADH3 // Ann.Hum.Genet.- 1973. V.36. - P.401 -414.

90. Stamatoyannopoulos, G., Chen, S. H., Fukui, M. Liver alcohol dehydrogenase in Japanese: high population frequency of atypical form and its possible role in alcohol sensitivity //Am.J.Hum.Genet.- 1975. V.27. - P.789 -796.

91. Stepanov V.A., Melnikov A.V., Lash-Zavada A.Yu., Kharkov V.N, Tyazhelova T.V., Zhukova O.V., Schneider Y, Shil'nikova I., Rybakova A., Yankovsky N Genetic variability of 15 autosomal STR loci in Russian populations // Legal Medicine.- (In press)

92. Takeshita, Т., Morimoto, К., Мао, X., Hashimoto, Т., Furuyama, J. Characterization of the three genotypes of low Km aldehyde dehydrogenase in a Japanese population // Hum.Genet.- 1994. V.94. - P.217 - 223.

93. Tanabe, H., Ohhira, M., Ohtsubo, Т., Watari, J., Yokota, K., Kohgo, Y. Genetic polymorphism of aldehyde dehydrogenase 2 in patients with upper aerodigestive tract cancer//Alcohol Clin.Exp.Res.- 1999. V.23. - P.17S - 20S.

94. Tanaka, F., Shiratori, Y., Yokosuka, O., Imazeki, F., Tsukada, Y., Omata, M. High incidence of ADH2*1/ALDH2*1 genes among Japanese alcohol dependents and patients with alcoholic liver disease // Hepatology.- 1996. V.23. - P.234 - 239.

95. Thomas M.G., Skorecki K., Ben-Amid H., Parfitt Т., Bradman N., Goldstein D.B. Origins of Old Testament priests //Nature.- 1998138 140.

96. Thomas, M. G., Weale, M. E., Jones, A. L., Richards, M., Smith, A., Redhead, N., Torroni, A., Scozzari, R., Gratrix, F., Tarekegn, A., Wilson, J. F., Capelli, C.,

97. Bradman, N., Goldstein, D. B. Founding mothers of Jewish communities: geographically separated Jewish groups were independently founded by very few female ancestors // Am.J.Hum.Genet.- 2002. V.70. - P. 1411 - 1420.

98. Thomasson, H. R., Khartonik, A. M., Avksentyuk, A., Duffy, L. K., Segal, B., Li, T. K. Alcohol and aldehyde dehydrogenase frequencies in Eskimo, Native American and Siberian peoples. // Alcohol.Clin.Exp.Res.- 1992. V.16. - P.506 - 605.

99. Thomasson, H. R., Zeng, D., Mai, K., McGarvey, S., Deka, R., Li, T. K. Population distribution of ADH and ALDH2 alleles // Alcohol.Clin.Exp.Res.- 1994. V. 18. - P.

100. Tolstrup, J. S., Nordestgaard, B. G., Rasmussen, S., Tybjaerg-Hansen, A., Gronbaek, M. Alcoholism and alcohol drinking habits predicted from alcohol dehydrogenase genes // Pharmacogenomics.J.- 2008. V.8. - P.220 - 227.

101. Wall, T. L., Peterson, C. M., Peterson, K. P., Johnson, M. L., Thomasson, H. R., Cole, M., Ehlers, C. L. Alcohol metabolism in Asian-American men with genetic polymorphisms of aldehyde dehydrogenase // Ann.Intern.Med.- 1-9-1997. V.127. -P.376 - 379.

102. Wall, T. L., Horn, S. M., Johnson, M. L., Smith, T. L., Carr, L. G. Hangover symptoms in Asian Americans with variations in the aldehyde dehydrogenase (ALDH2) gene // J.Stud.Alcohol.- 2000. V.61. - P. 13 - 17.

103. Wolff, P. H. Ethnic differences in alcohol sensitivity // Science.- 28-1-1972. V.175. p. 449 450.

104. Wolff, P. H. Vasomotor sensitivity to alcohol in diverse Mongoloid populations // Am.J.Hum.Genet.- 1973. V.25. - P.193 - 199.

105. Wu, G. S., Luo, H. R., Zhang, Y. P. Genetic Polymorphism of Aldehyde Dehydrogenase (ALDH2) in Chinese Populations. // The American Society of Human Genetics 57th Annual Meeting.San Diego, California, October 23-27,2007.No.20594/1299.- 2007

106. Xu, K., Liu, X. H., Nagarajan, S., Gu, X. Y., Goldman, D. Relationship of the delta-opioid receptor gene to heroin abuse in a large Chinese case/control sample //

107. Am.J.Med.Genet.- 1-6-2002. V.l 10. - P.45 - 50.

108. Yamada, Y., Sun, F., Tsuritani, I., Honda, R. Genetic differences in ethanol metabolizing enzymes and blood pressure in Japanese alcohol consumers // J.Hum.Hypertens.- 2002. V.16. - P.479 - 486.

109. Yamaguchi, J., Hasegawa, Y., Kawasaki, M., Masui, T., Kanoh, T., Ishiguro, N., Hamajima, N. ALDH2 polymorphisms and bone mineral density in an elderly Japanese population // Osteoporos.Int.- 2006. V.17. - P.908 - 913.

110. Yan, M., Zhu, K. X., Meng, F. L., Wang, H. J., Wu, M. L. Relationship between ALDH gene polymorphism and alcoholic liver diseases. // Zhonghua Gan Zang.Bing.Za Zhi.- 2003. V.l 1. - P.654 - 656.

111. Yasuoka, J.,.Levins, R. Ecology of vector mosquitoes in Sri Lanka—suggestions for future mosquito control in rice ecosystems // Southeast Asian J.Trop.Med.Public Health.- 2007. V.38. - P.646 - 657.

112. Yoshida, A. Differences in the isozymes involved in alcohol metabolism between Caucasians and orientals // Isozymes.Curr.Top.Biol.Med.Res.- 1983. V.8. - P.245 -261.

113. Yu, C., Li, Y., Chen, W., Yue, M. Genotype of ethanol metabolizing enzyme genes by oligonucleotide microarray in alcoholic liver disease in Chinese people // Chin Med.J.(Engl.).- 2002. V.l 15. - P. 1085 - 1087.

114. Zhang, Z. M., Liu, C. Z., Bian, J. C., Tang, B. M., Jiang, F., Wang, Q. J., Wang, Q. M., Zhu, X., Shen, F. M. Studies of genetic polymorphisms of ADH2 and ALDH2 among the Han population in Luoyang China. // Yi.Chuan.- 2002. V.24. - P.532 -536.