Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Поиск средств профилактики и лечения отравлений животных тетраметилтиурамдисульфидом

ВАК РФ 06.02.03, Звероводство и охотоведение

Автореферат диссертации по теме "Поиск средств профилактики и лечения отравлений животных тетраметилтиурамдисульфидом"

На правах рукописи

СЕРОВА ЮЛИЯ ВЛАДИМИРОВНА

ПОИСК СРЕДСТВ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ОТРАВЛЕНИИ ЖИВОТНЫХ ТЕТРАМЕТИЛТИУРАМДИСУЛЬФИДОМ

06.02.03 - ветеринарная фармакология с токсикологией

2 8 НОЯ 2013

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань-2013

005541030

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (г. Казань)

Научный руководитель: -Тремасов Михаил Яковлевич-

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты: -Гильмутдинов Рустам Якубович-

доктор биологических наук, профессор, зав. кафедрой патофизиологии Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана

-Ежков Владимир Олегович-доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник отдела животноводства ГНУ «Татарский научно-исследовательский институт агрохимии и почвоведения РАСХН»

Ведущее учреждение: ГНУ «Всероссийский научно-исследо-

вательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» РАСХН (г. Москва)

Защита диссертации состоится « 17 » декабря 2013 года в ¿3 часов на заседании диссертационного совета Д-220.012.01 при ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (420075, Казань, Научный городок-2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». Электронный вариант автореферата и текст объявления о защите размещен на официальных сайтах ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» www.vnivi.ru и ВАК РФ www.vak.ed.gov.ru.

Автореферат разослан « /У » ШЭЯСр&. 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,кандидат ветеринарных наук ^/^Й^ГПУГУ^^ Степанов В.И.

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В связи с интенсивным поступлением химических загрязнителей в окружающую среду и внедрением в практику разнообразных химических соединений экологическое состояние территории России в настоящее время определяется как критическое. В условиях техногенеза важное место среди загрязнителей кормов и пищевых продуктов занимают химические средства защиты растений и животных - пестициды. При использовании таких кормов могут возникать острые, а чаще субхронические и хронические, токсикозы, сопровождающиеся нарушением воспроизводительной функции организма, снижением продуктивности животных и их естественной резистентности. Анализ этиологии отравлений пестицидами у животных в последние годы показал, что наиболее часто регистрируются отравления производными дихлор-феноксиуксусной кислоты, продуктами взаимодействия пестицидов и минеральных удобрений (фотооксидантами), фосфорорганическими соединениями, фостоксином, производными карбаминовой и дитиокарбаминовой кислот, пиретроидами (Ермаков Н.М. и др., 2001; Черных A.M., 2003; Желтов В.А., 2007; Иванов A.B. и др., 2009; Тремасов М.Я. и др., 2012).

Всего в Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации, внесено около 900 наименований средств защиты растений. Фунгицидные препараты занимают лидирующие позиции и имеют высокие объемы применения (262,57 т в год), территориальные нагрузки (75,29±9,13 г/га) и удельный вес (42,67 %) в структуре средств химизации сельскохозяйственного производства. Из многочисленных соединений этого класса наибольшую распространенность получил тетраметил-тиурамдисульфид (ТМТД) (Потапов А.И., Ракитский В.Н., 2001; Проворова М.В., 2006; Смирнов A.M. и др., 2007; Попович В.В., 2010; Ким A.B., 2013).

В этой связи важной проблемой ветеринарной токсикологии является разработка средств и методов профилактики и лечения отравлений животных пестицидами, так как многие существующие средства и методы не удовлетворяют потребностям ветеринарной службы, а антидоты и адаптивные препараты для многих пестицидов не созданы (Тремасов М.Я., Папуниди К.Х., 2009; Смирнов A.M., Дорожкин В.И., 2010).

Цель и задачи исследования. Целью данного исследования явилось изучение эффективности лечения и профилактики животных фармакологическими и микробиологическими средствами при различной степени интоксикации пестицидом ТМТД.

На основании поставленной цели были определены следующие задачи:

> Провести отбор лекарственных средств и изучить эффективность применения антиоксидантов при остром отравлении ТМТД;

> Оценить сорбционные способности энтеросорбентов различных групп в отношении ТМТД;

> Изучить эффективность сорбента Фитосорб при хронической интоксикации ТМТД с учетом изменений клинических, гематологических, биохимических и иммунологических показателей;

> Отобрать штаммы микроорганизмов, наиболее резистентные к ТМТД и определить их эффективность в отношении биодеструкции данного пестицида in vitro, in situ, а также в опытах на лабораторных и сельскохозяйственных животных.

Научная новизна. Впервые в качестве лечебного средства при остром отравлении ТМТД было обосновано использование препарата Мексиприм.

Экспериментально доказана эффективность применения растительного сорбента Фитосорб при хронических интоксикациях пестицидом ТМТД.

Лабораторными и производственными испытаниями доказана безвредность и эффективность деструкции ТМТД изолятом Saccharomyces cerevisiae-11.

Практическая ценность работы. Для устранения признаков токсикоза вызванного пестицидом ТМТД и для нормализации гематологических, биохимических и иммунологических показателей организма рекомендовано в качестве лечебного препарата при остром отравлении применять антиоксидант Мексиприм, а для профилактики хронических интоксикаций использовать Фитосорб или обезвреживать данный пестицид в кормах изолятом дрожжей Saccharomyces cerevisiae-11.

Результаты исследований использованы при составлении Методического пособия по применению микроорганизмов для деструкции ксенобиотиков, утвержденного Отделением ветеринарной медицины РАСХН (Москва, 15.04.13 г.)

Апробация материалов диссертации. Материалы диссертации представлены, обсуждены и одобрены на научных сессиях ученого совета ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» по итогам НИР за 2010-2013 гг., Международных и Всероссийских научно-практических конференциях и симпозиумах (Москва 2012, 2013; Троицк, 2012; Махачкала, 2012; Казань, 2012, 2013; Пущино, 2013; Польша, 2013).

Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано 11 научных работ, в том числе 4 статьи в изданиях рекомендованных ВАК РФ.

Основные положения, выносимые на защиту:

Эффективность антиоксидантного лечения при острых отравлениях

ТМТД;

Профилактическая эффективность Фитосорба при хронических

интоксикациях ТМТД;

Биотрансформирующая эффективность дрожжей рода Saccharomyces

cerevisiae-l 1 в отношении пестицида ТМТД.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 139 страницах компьютерного текста и включают следующие разделы: оглавление, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список использованной литературы, приложения. Работа иллюстрирована 23 таблицами и 16 рисунками. Список использованной литературы содержит 256 библиографических источника, из них 90 -иностранных.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в отделе токсикологии Федерального центра токсикологической, радиационной и биологической безопасности в период с 2011 по 2013 гг., в соответствии с тематическим планом НИР: «Токсикологическая безопасность» (№ гос. per. 01200202603).

Экспериментальные исследования были проведены на лабораторных (белые крысы и мыши, кролики) и сельскохозяйственных (овцы) животных.

В экспериментах использовали ТМТД с содержанием 98,7 % по активнодействующему веществу (АДВ). Препарат был и предоставлен с.н.с.,

к.в.н. Жестковым H.H.

С целью экспериментального контаминирования объектов ветнадзора использовали препарат ТМТД в форме смачивающегося порошка, растворов на хлороформе и ацетоне в дозах 1, 5 и 10 МДУ.

Количественное определение оставшегося ТМТД проводилось на основе базисных методов, согласно «Методическим указаниям по определению ТМТД и продуктов его превращения в воде, зерновых культурах и растительном материале методом ТСХ».

Для экспериментальной интоксикации животных пестицид вводили перорально с помощью зонда в виде водной суспензии в дозах ЛДюо. ЛД50, а также с кормом в дозе 1/20 ЛД50-

В качестве средств профилактики использовали сорбенты: цеолит Майн-ского происхождения Ульяновской области, бентонит Биклянского месторождения РТ (ТатНИИ агрохимии и почвоведения); Фитосорб, разработанный в ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» совместно с Казанским государственным технологическим университетом; уголь активный древесный дробленый марки БАУ-А (ООО «ХимИнвест», Нижний Новгород), Микосорб («Alltech», США), активированный

уголь (ООО «ЭКОТЕКС», Электросталь), сорбент содержащий активированный уголь и живицу (ООО «ХимИнвест», Нижний Новгород), а для лечения -препараты Мексидол-Вет, Мексиприм, Эмоксипин, Сульфокамфокаин, Кокарбоксилазу, Пиридоксин (вит. В6), Гамавит, Цитохром С, Убихинон.

В основу эксперимента по определению адсорбционной способности сорбентов in vitro была положена методика, описанная Крюковым B.C. и др. (1992), с изменениями, учитывающими специфику индикации ТМТД.

Гематологические исследования крови проводили по общепринятым методикам и при помощи анализатора Microlab-ЗОО. Биохимические показатели сыворотки крови определяли на анализаторе «EXPRESS PLUS».

Активность холинэстеразы определяли кинетическим методом с индикатором бутирилтиохолин йодидом (ЗАО «ДИАКОМ-ВНЦМДЛ»), содержание общего кальция в сыворотке крови - фотометрическим методом с глиоксаль-бис-(2-оксанилом) (Камышников B.C., 2011). Содержание общего белка определяли на рефрактометре RL-3, количественное соотношение белковых фракций - нефелометрическим методом (Антонов Б.И. и др., 1991; Кондрахин И.П. и др., 2004).Активность свободнорадикального окисления липидов оценивали по накоплению липидных перекисей, которые определяли в форме малонового диальдегида (МДА) в реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой. Показатели антиоксидантной системы организма оценивали по активности каталазы в реакции с молибдатом аммония (Архипов A.B., 2004).

Фагоцитарную активность нейтрофилов определяли по методике Кост Е.А. и Стенко М.И. (1975), лизоцимную активность по - Маркову Ю.М. (1979). Уровень Т-лимфоцитов в периферической крови определяли методом спонтанного розеткообразования (E-ROK). идентификацию В-лимфоцитов проводили по методике Фримеля Г.и Брока И. (1986).

Гистологические исследования органов и тканей проводили совместно с вед.науч. сотр., к.м.н. Губеевой Е.Г.

В течение 2011-2013 гг. проведен скрининг микроорганизмов-деструкторов ТМТД из коллекции штаммов ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», которые были отобраны и выделены Матросовой JI.E. из органических отходов и почвы территории Республики Татарстан, загрязненной различными ксенобиотиками. Также в исследованиях были использованы коммерческие пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae.

Для определения чувствительности культур к ТМТД использовали метод отпечатков на плотной питательной среде (Егоров Н.С., 1983). Торможение и стимулирование роста штаммов рассчитывали по формуле Эббота (Андреева Е.И., Картомышева B.C., 1990).

Способность выделенных штаммов к биодеструкции ТМТД и его использование в качестве источника энергии изучали на жидкой и плотной синтетической питательной среде М-9. Для подтверждения расщепления субстрата использовали индикатор бромтиоловый синий. Динамику роста изучали по методике Ксенофонтовой О.Ю., Чирова П.А. (2005), а также посевом на питательные среды согласно методике, описанной Грачевой Н.М. и др. (1999).

Фитотоксичность культуральной жидкости и растворов пестицида ТМТД изучали на проростках ячменя сорта «эколог» (Колупаев А.В., 2010). Далее опыты продолжали на лабораторных животных.

Полученные экспериментальные данные подвергали математической обработке общепринятыми методами вариационной статистики с применением критерия достоверности по Стьюденту на персональном компьютере с использованием программного пакета Microsoft Excel ХР (2007).

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1 Скрининг препаратов при остром отравлении ТМТД

Для определения эффективности лечения различными препаратами было сформировано 8 групп белых крыс, разделенных по принципу аналогов по 16 животных в каждой группе, массой по 180-220 г. Экспериментальной моделью отравления служил патологический процесс, вызванный пероральным введением белым крысам ТМТД в дозе ЛДюо- Эффективность отобранных лекарственных средств оценивали по выживаемости животных, продолжительности жизни и степени проявления клинических признаков отравления. Результаты исследования представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Эффективность препаратов при остром отравлении животных ТМТД __________;_

Препарат Доза Количество животных в опыте

Пало Выжило % выживаемости

Мексидол-Вет 15 м г/кг 1 15 93,8

Мексиприм 15 м г/кг 1 15 93,8

Эмоксипин 15 мг/кг 1 15 93,8

Сульфокамфокаин+ 25 мг/кг 63

кокарбоксилаза+ 0,3 мг/кг 6 10

пиридоксин 2 мл/кг

Гамавит 1 мл/кг 10 6 37,5

Цитохром С 1 мг/кг 7 9 56

Убихинон 2 мг/кг 11 5 31

Выбор данных препаратов с целью выявления у них защитных свойств при отравлении ТМТД определялся патогенезом заболевания. Дозы препаратов подбирали на основании инструкции по применению и результатам собственных исследований.

На основании полученных данных, следует, что антиоксиданты различных групп, такие как Мексидол-Вет, Мексиприм и Эмоксипин способствовали повышению выживаемости животных на 93,8 %.

3.2 Изучение эффективности применения Мексиприма при остром отравлении белых крыс ТМТД

После выявления защитных свойств антиоксидантов, было сформировано 5 групп белых крыс, по 18 животных в каждой. 1-я группа служила биологическим контролем. Животным 2-, 3- и 4-й групп пестицид ТМТД вводили внутри-желудочно в дозе ЛД50 (865 мг/кг) с последующим лечением препаратами Мексидол-Вет, Эмоксипин и Мексиприм в дозе 15 мг/кг внутримышечно. Антиоксидантные средства применяли через 2-3 ч после введения пестицида, продолжительность лечения составила 4 суток. Животным 5-й группы задавали пестицид ТМТД в аналогичной дозе, без применения лекарственных средств.

У животных 2-, 3- и 4-й групп клинические признаки интоксикации после применения антиоксидантов были менее выражены. Общее состояние было угнетенное, пищевая возбудимость слабо выражена. Однако эти признаки исчезали в течение 12-48 ч с восстановлением пищевой возбудимости и двигательной активности. Случаев гибели животных за весь период опыта не регистрировали.

При лечении препаратом Мексидол-Вет на 4 сут происходило снижение уровня лейкоцитов на 11,1 %, лимфоцитов - на 10,0 % и гранулоцитов - на 15,0 % (р<0,05). Под действием Эмоксипина происходило уменьшение количества лейкоцитов в крови к 4 сут на 9,5 %, лимфоцитов - на 8,8 % и гранулоцитов - на 15,0 % (р<0,05). В 4-й группе отмечали снижение гранулоцитов к 4 сут исследования на 15,0 % (р<0,05). В остальные периоды исследования данные показатели в этих группах незначительно отличались от биологического контроля.

В 5-й группе отмечали снижение общего количества лейкоцитов на 4, 10 и 16 сут на 27,8 (р<0,01); 48,5 (р<0,001) и 28,6 % (р<0,01), уровня лимфоцитов на 30,4 (р<0,001); 51,9 (р<0,001) и 28,8 % (р<0,01), гранулоцитов на 25,0 (р<0,01); 36,4 (р<0,001) и 29,2 % (р<0,01), увеличение к 4 сут моноцитов на 25,0 (р<0,01) и их снижение к 10 и 16 сут на 25,0 и 20,0 % (р<0,01) соответственно относительно 1-й группы.

Во 2-й, 3-й и 4-й группах животных к 4 сут отмечали увеличение количества эритроцитов на 21,6; 21,4 и 21,1 % (р<0,01) соответственно, относительно контроля, а в 5-й группе - их снижение на 4, 10 и 16 сут на 7,1; 29,1 (р<0,01) и

24,3 % (р<0,01) соответственно.

Результаты исследования продуктов перекисного окисления липидов и активности антиоксидантных ферментов представлены на рисунке 1.

Ill It i Infill-

ж

jf ■r

¿f ж

I #

Рис.1 - Концентрация МДА и каталазы в крови белых крыс при остром отравлении ТМТД в дозе ЛД50 на фоне применения антиоксидантов

Повышение концентрации МДА (рис. 1) отмечали на протяжении всего периода исследования и к 4 сут во 2-, 3-, 4- и 5-й группах оно составило - 79,5; 77,2; 68,2 и 120,5 % (р<0,001), к 10 сут — 65,9; 62,4; 60,0 и 77,6 % (р<0,001), к 16 сут - 37,2; 36,0 (р<0,001); 23,3 (р<0,01) и 87,2 % (р<0,001) соответственно.

Снижение активности каталазы в крови (рис. 1) к 4, 10 и 16 сут во 2-й группе составило 42,9 (р<0,001); 22,0 (р<0,01) и 8,2, в 3-й группе - 38.1 (р<0,001);

19.5 (р<0,05) и 8,2 %, в 5-й группе - 57,1 (р<0,001); 31,7 (р<0,001) и 17,7 % (р<0,05), в 4-й группе к 4 и 10 сут - на 33,3 (р<0,001) и 14,6 % соответственно.

Наиболее выраженные изменения биохимического состава крови у животных отмечали на 4 сут исследования. При введении белым крысам ТМТД в дозе 865 мг/кг наблюдали снижение показателей общего белка на 31,0 % (р<0,001), а-, р-, у-глобулиновна 21,7 % (р<0,01); 18,2% (р<0,05) и 38,0 % (р<0,001) соответственно. При лечении препаратами Мексидол-Вет, Эмоксипин и Мексиприм происходило снижение показателей общего белка на 22,5 (р<0,01);

30.6 (р<0,001) и 21,2 % (р<0,01) и у-глобулиновна 24,8 (р<0,01); 19,8; 19,0 % (р<0,05) соответственно. Содержание а-глобулинов во 2-й и 3-й группе достоверно снижалось на 18,0 и 17,9 % (р<0,05). Активность фермента аланинаминотрансферазы (ACT) в группах, где проводили лечение снижалась к 4 сут на 16,4 и 15,1 % (р<0,05), а в 5-й группе - на 49,9 % (р<0,001) относительно

1-й группы. Во 2-й группе снижение активности аспартатаминотрансферазы (AJIT) относительно контроля составило 35,0 % (р<0,001), в 3-й - 33,9 % (р<0,001), в 4-й - 30,2 % (р<0,001) и в 5-й - 55,5 % (р<0,001). Активность холинэстеразы при лечении угнеталась на 21,3 % (р<0,01), 24,1 % (р<0,01), 17,6 % (р<0,05), а без лечения - на 27,8 % (р<0,01) соответственно. Уровень щелочной фосфатазы в сыворотке крови снижался к 4 сут исследования во 2- и 3-й группах на 36,4 % (р<0,001),в 4-й - на 33,1 % (р<0,001), в 5-й - на 51,8 % (р<0,001). Концентрация глюкозы снижалась относительно биологического контроля во 2-, 3- и 4-й группах на 17,3; 19,2 и 15,4 % (р<0,05), 5-й группе - на 32,7 % (р<0,001) соответственно. Во всех опытных группах в сыворотке крови отмечали увеличение концентрации холестерина относительно интактных животных на 73,3; 66,7 и 60,0 % (р<0,001), в 5-й группе - на 93,3 % (р<0,001) соответственно. Уровень триглицеридов также увеличивался к 4сут на 70,4 % (р<0,001) во 2-й группе, на 59,2 % (р<0,001) - в 3-й группе, на 62 % (р<0,001) - в 4-й группе и на 84,5 % (р<0,001) - в 5-й группе.

Наилучший иммуностимулирующий эффект оказывал препарат Мексиприм (4-я группа). При его применении фагоцитарная активность снижалась только к 4 сут исследования на 15,6 % (р<0,05) соответственно.

На основании гистологических исследований установлено, что применение антиоксидантных препаратов при остром отравлении ТМТД оказывало выраженное антитоксическое действие на головной мозг, сердце и почки, но не полностью предотвращало развитие дистрофических изменений в печени.

Наилучшие результаты были получены при применении Мексиприма, который не только полностью устранял токсическое действие ТМТД на почки, сердце и головной мозг, но и вызывал регенерацию гепатоцитов.

3.3 Изучение эффективности применения Мексиприма при остром отравлении кроликов ТМТД

Исследования были проведены на 12 кроликах породы «Серый Великан» живой массой 2,3 - 2,6 кг. Всем животным вводили внутрь водную суспензию ТМТД в дозе ЛД50 (210 мг/кг). Затем кроликам 1-й группы вводили препарат Мексиприм при развитии характерных признаков отравления в течение 4 суток,

2-я группа кроликов служила контролем затравки.

Клиническая картина острой интоксикации в 1- и 2-й группах была аналогична таковой в предыдущих исследованиях на белых крысах.

Препарат Мексиприм оказывал достаточно выраженный защитный эффект, который проявлялся увеличением количества эритроцитов и гемоглобина в крови опытных животных к 4 сут исследования на 16,2 и 16,1 % (р<0,05), к 10 сут - на 45,4 и 72,3 % (р<0,001), к 16 сут - на 37,1 (р<0,001) и 29,8 % (р<0,01)

соответственно относительно 2-й группы. При анализе лейкоформулы после применения Мексиприма к 10 сут исследования отмечалось увеличение количества лейкоцитов - на 47,6 % (р<0,001), лимфоцитов - на 24,3 % (р<0,01), палочкоядерных нейтрофилов - на 30,9 % (р<0,001) относительно группы 2-й группы.

Анализ совокупности биохимических показателей крови кроликов показал, что использование препарата Мексиприм в качестве лечебного средства оказывало снижение токсического воздействия ТМТД на организм, которое проявлялось восстановлением углеводного, липидного и белкового обменов, а также активности AJIT, ACT, холинэстеразы и щелочной фосфатазы на 10 сут исследования. Тогда как во 2-й группе данные показатели имели достоверные отличия от нормы даже на 16 сут исследования.

При остром пероральном отравлении ТМТД применение Мексиприма способствовало повышению показателей фагоцитарной активности к 4, 10 и 16 сут на 10,1; 48,4 (р<0,001) и 25,1 % (р<0,01), активности лизоцима - на 21,0 (р<0,01); 34,1 (р<0,001) и 27,4 % (р<0,01), количества Т-лимфоцитов - на 29,5 (р<0,01); 43,6 и 35,9 % (р<0,001) и В- лимфоцитов - на 17,6 (р<0,05); 27,8 (р<0,01) и 20,2 % (р<0,01) относительно группы животных без соответствующего лечения.

В результате проведенных исследований на лабораторных животных было установлено, что все исследуемые препараты из группы антиоксидантов, могут быть использованы при остром пероральном отравлении пестицидом ТМТД, поскольку способствуют повышению выживаемости животных. Однако наилучший терапевтический эффект был выявлен у препарата Мексиприм.

3.4 Скрининг сорбентов различных групп в отношении пестицида

ТМТД in vitro

Результаты исследования адсорбционной способности энтеросорбентов различных групп в отношении ТМТД при условиях имитирующих желудочно-кишечный тракт представлены на рисунке 2.

На основании полученных данных, наилучшей адсорбционной способностью в нейтральной и кислой средах обладал Фитосорб (99,0 %). Также высокая адсорбция при аналогичных условиях наблюдалась у сорбента на основе угля и живицы (90,0 %), древесного угля марки БАУ-А(87,3 %) и активированного угля (83,3 %). Бентонит обладал различной сорбцией в зависимости от условий среды: так, при рН 7,0 она составляла 76,8 %, а при рН 2,0 повышалась до 85,6 % соответственно. Схожей адсорбционной способностью обладали цеолит и Микосорб: в нейтральной среде она составляла 77,6 и 77,8 %, а в кислой - 66,4 и 65,6 % соответственно.

Рис. 2 - Адсорбционная способность сорбентов в отношении ТМТД при рН 7,0 и 2,0 температуре 37-39 °С

Проведенные исследования свидетельствуют о высокой адсорбционной способности Фитосорба в отношении ТМТД. Было установлено, что сорбция пестицида происходит сразу после их контакта друг с другом и через 5 мин экспозиции в условиях желудочно-кишечного тракта количество неадсорбированного ТМТД составило 10,3 %, а через 15 мин - 1 %. На основании полученных данных этот сорбент был отобран для дальнейших исследований на лабораторных животных.

3.5 Изучение эффективности применения Фитосорба при хроническом отравлении ТМТД на белых крысах

Для исследования было отобрано 45 белых крыс, разделенных по принципу аналогов на 3 группы. Животные 1-й группы служили биологическим контролем и получали обычный рацион, животные 2-й группы ежедневно в течение 30 сут с кормом получали пестицид ТМТД в дозе 1/20 ЛД50 (43,3 мг/кг) и Фитосорб из расчета 1 г на 1 кг корма, животные 3-й группы получали только пестицид в дозе 1/20 ЛД50(43,3 мг/кг) в течение 30 сут ежедневно вместе с кормом.

При введении в рацион крыс ТМТД в дозе 1/20 ЛД50 развивалась характерная картина хронической интоксикации уже на 5-7 сут в виде угнетения, малоподвижности, диареи, снижении аппетита. Гибель животных отмечали на 14-24 сут. В группе животных, которым кроме ТМТД задавали растительный сорбент в дозе 1 г/кг корма, клиническое состояние не отличалось от нормы, случаев падежа за весь период исследования не наблюдали.

В группе животных, получавших совместно с пестицидом растительный сорбент, гематологические показатели крови находились в пределах физиологической нормы и незначительно отличались от биологического контроля. При сопоставлении изучаемых показателей в группе токсического контроля к 30 сут было выявлено достоверное снижение уровня эритроцитов, гемоглобина и лейкоцитов на 18,0; 16,0 и 16,9% (р<0,05) соответственно. При этом значительные изменения претерпевал лейкоцитарный состав крови. Отмечали достоверное увеличение количества моноцитов на 19,2% (р<0,05) и снижение количества эози-нофилов и палочкоядерных нейтрофилов на 17,9% (р<0,05) соответственно относительно группы биологического контроля.

В опытной группе белых крыс в течение всего периода исследования все биохимические показатели находились в пределах физиологической нормы и лишь к 30 сут отмечали тенденцию к снижению активности АЛТ на 6,6 %, глюкозы - на 7,4 % и увеличение уровня холестерина и триглицеридов в сыворотке крови на 10,7 и 13,4 %, тогда как в 3-й группе наблюдали снижение количества АЛТ, АСТ и глюкозы - на 19,5; 15,3 и 18,5 % (р<0,05) соответственно. К тому же содержание кальция и фосфора в сыворотке крови к 30 сут в 3-й группе снизилось на 20,8 (р<0,01) и 18,9 % (р<0,05) соответственно.

Введение белым крысам пестицида в дозе 1/20 ЛД50 совместно с растительным сорбентом не вызывает существенных изменений в их иммунологическом статусе. У животных 3-й группы на фоне хронического отравления ТМТД отмечали снижение фагоцитарной активности на 15,2 % (р<0,05) к 30 сут исследования, а также количества Т-лимфоцитов на -16,4 % (р<0,05) соответственно.

Л ;

к • & * *» \ *

ЯГ

' *: " :М

тшкШШКГ

Рис.3 - Печень белой крысы, получавшей пестицид ТМТД в дозе 1/20 ЛДю и растительный сорбент. Вакуоли в единичных гепатоцитах. Окраска гематоксилином и эозином, х200

При гистологическом исследовании печени белых крыс опытной группы (рис. 3), отмечали увеличение содержания жира в единичных гепатоцитах, что на

функции печени отразиться не может. В гистологических препаратах головного мозга, сердца, почек, селезенки, семенников патологические изменения не выявлены.

На основании проведенных исследований, установлено, что применение растительного сорбента при экспериментальном хроническом отравлении лабораторных животных ТМТД снижало степень интоксикации организма за счет высокой адсорбционной способности по отношению к данному пестициду, оказывало благоприятное воздействие на изменения морфологических, биохимических и иммунологических показателей крови.

3.6 Изучение эффективности применения растительного сорбента при хроническом отравлении кроликов ТМТД

Для проведения исследования было использовано 12 кроликов породы «Серый Великан», разделенных по принципу аналогов на 2 группы по 6 голов в каждой. Животным 1-й группы вместе с комбикормом задавали пестицид в дозе 1/20 ЛД50 (10,5 мг/кг) и растительный сорбент из расчета 1 г/кг корма ежедневно в течение 30 суток. Животные 2-й группы получали вместе с кормом пестицид в дозе 1/20 ЛД50 (10,5 мг/кг) ежедневно в течение 30 суток.

Клиническая картина хронической интоксикации пестицидом ТМТД развивалась у кроликов 2-й группы и была аналогична таковой у белых крыс предыдущих исследованиях. На 14- и 26-е сут пало по 1 кролику. В группе животных, которым задавали растительный сорбент, клиническое состояние не отличалось от нормы.

Результаты изменения гематологических показателей крови опытных животных отображены в таблице 2.

Таблица 2 — Гематологические показатели крови кроликов при хроническом отравлении ТМТД на фоне применения сорбента

Срок исследования, сут

Показатель Группа исходное 10 20 30

значение

Лейкоциты, 1 7,43±0,37 7,46±0,37 7,36±0,37 7,36±0,37*

х 109/л 2 7,36±0,37 7,30±0,37 7,11 ±0,3 6 6,24±0,31

Эритроциты, 1 5,24±0,26 5,22±0,26 5,18±0,26 5,27±0,26**

х 1012/л 2 5,27±0,26 5,20±0,26 5,02±0,25 4,34±0,22

Гемоглобин, 1 113,00±5,65 112,00±5,60 110,00±5,50 114,00±5,70**

г/л 2 111,00±5,55 108,00±5,40 103,00±5,15 94,00±4,70

Примечание: * - р <0,05 ; ** - р < 0,01

При анализе данных таблицы 2, было установлено, что применение растительного сорбента при экспериментальной хронической интоксикации ТМТД способствовало увеличению количества лейкоцитов, эритроцитов и гемоглобина к 30 сут исследования по сравнению со 2-й группой на 17,9 (р<0,05);

21,4 и 21,2 % (р<0,01) соответственно.

У кроликов 1-й группы под действием Фитосорба к 30 сут происходило повышение уровня глюкозы, АЛТ и ACT в крови на 14,5; 20,2 (р<0,01) и 15,9 % (р<0,05), а- и у-глобулинов - на 17,9 (р<0,05) и 24,9 % (р<0,01) относительно 2-й группы животных.

3.7 Скрининг микроорганизмов-деструкторов ТМТД

Нами было установлено, что пестицид ТМТД на исследуемые штаммы микроорганизмов оказывал различное влияние в зависимости от концентрации и вида микроорганизмов. При концентрации пестицида на уровне МДУ, происходило торможение роста у Bacillus subtilis-93, Bacillus subtilis-99, Bacillus subtilis-2006, Pseudomonas fluorescens, Pichia kudriavzevii-2009 и Saccharomyces cerevisiae на 62,3; 64,2; 63,7 (p<0,001); 13,3; 5,9 и 25 % (p<0,01) соответственно. Стимуляция роста наблюдалась у Pichia kudriavzevii-96 на 10,5 % и Saccharomyces

cerevisiae-l 1 на 31,9 % (р<0,001).

При содержании пестицида в среде на уровне 10 МДУ у Bacillus subtilis-93, Bacillus subtilis-99, Bacillus subtilis-2006, Pseudomonas fluorescens, Pichia kudriavzevii-2009 и Saccharomyces cerevisiae торможение роста составило 91,9; 93,5; 93,3; 62,7; 58 (p<0,001) и 29,8 % (p<0,01) соответственно, стимуляция роста у дрожжей Pichia kudriavzevii-96 и Saccharomyces cerevisiae-U - 7,9 и 18,8 %

(р<0,05) соответственно.

После исследования на чувствительность к высоким и низким дозам ТМТД а также на способность использовать пестицид в качестве источника энергии и роста, были отобраны следующие изоляты микроорганизмов для проведения дальнейших исследований по биодеградации: Pseudomonas fluorescens, Saccharomyces cerevisiae, Pichia kudriavzevii-96 и Saccharomyces cerevisiae-X 1.

Способность деструкции пестицида ТМТД изучали путем внесения штаммов в жидкую среду М-9, содержащую пестицид на уровне 5 и 10 МДУ. Контролем служила проба с аналогичным количеством пестицида, без внесения изолятов микроорганизмов и дрожжей. Результаты исследования представлены в таблице 3.

Исходя из данных таблицы 3, наилучшей способностью к деградации обладали изоляты Saccharomyces cerevisiae-l 1 и Pichia kudriavzevii-96.

В ходе дальнейших исследований было установлено, что увеличение деструкции пестицида ТМТД происходит при росте изолятов дрожжей

$>ассЬаготусе$ сегеу«/ае-11 и увеличении оптической плотности, к тому же они обладают наименьшей фитотоксичностью и не проявляют патогенных свойств на лабораторных животных. В меньшей мере эти свойства выражены у Р\сЫа кис1па\гхеуЦ-96.

Таблица 3 - Биотрансформирующая способность микроорганизмов в отношении ТМТД in vitro (% деструкции)

Микроорганизм, штамм Срок исследования, сут

3 7 14

5 МДУ

Pseudomonas fluorescens 25,00±1,25** 31,30±1,57*** 31,30±1,57***

Pichia kudriavzevii-96 69,50±3,48*** 96,70±4,84*** 97,90±4,90***

Saccharomyces cerevisiae-l 1 55,30±2,77*** 98,30±4,92*** 99,50±4,98***

Saccharomyces cerevisiae 27,70±1,39** 49,20±2,46*** 49,50±2,48***

Контроль 20,00±1,00 20,00±1,00 20,00±1,00

10 МДУ

Pichia kudriavzevii-96 68,80±3,44*** | 93,80±4,69*** 98,80±4,94***

Saccharomyces cerevisiae-\ 1 37,50±1,88*** 94,30±4,72*** 99,40±4,97***

Контроль 20,00±1,00 20,00±1,00 20,00±1,00

Примечание: ** - р< 0,01 *** - р <0,001

На основании результатов предыдущих опытов, для биодеградации кормов от остатков пестицида ТМТД был использован изолят дрожжей .ЧассИаготусея сегеУшое-П. Основу эксперимента была положена методика обезвреживания пестицида в синтетической питательной среде М-9, описанная ранее, с учетом особенностей индикации ТМТД в кормах. Посевная концентрация дрожжей составила 6 КОЕ/см3, содержание пестицида в корме было на уровне 5 и 10 МДУ.

Эффективность обезвреживания зерна в модельных опытах дрожжами ЪассЬаготусеь сегеушае-11 при концентрациях 5 и 10 МДУ составила 99,3 и 98,8 % (р<0,001) соответственно. Что дает основания для применения данного изолята в качестве деструктора ТМТД в опытах на животных.

3.8 Исследование обезвреживающей способности изолята 8асс1гаготусех сегеу'тае-ХХ в отношении ТМТД на лабораторных животных

Исследования были проведены на 20 крысах, разделенных по принципу аналогов на 4 группы по 5 голов в каждой. 1 -я группа служила биологическим контролем и получала обычный, автоклавированный корм, животные 2-й и 3-й групп были опытными и получали корм, содержащий ТМТД в дозе 5 и 10 МДУ после 2-х недельной обработки суточной культурой дрожжей рода ЗассИаготусея

сегег-шае-11 в концентрации 6 ^ КОЕ/см3. 4-я и 5-я группы получали корм, содержащий 5 и 10 МДУ пестицида. Длительность проведения опыта составила 30 суток.

В ходе исследования гематологических показателей крови было установлено снижение количества эритроцитов и гемоглобина, по сравнению с биологическим контролем в 3-й группе - на 4,6 и 4,3 %, в 4-й группе - на 7,0 и 8,5 % и в 5-й группе - на 7,7 и 9,2 % соответственно. Уровень лейкоцитов и лимфоцитов увеличился во 2-й группе на 8,2 и 10,4 % р<0,05), 3-й - на 5,2 и 3,7 %, а в 4-й и 5-й группах снизился на 9,0 и 10,4 %; 11,2 и 12,3 % (р<0,05) соответственно.

Таблица 4 - Биохимические показатели крови белых крыс при воздействии ТМТД на фоне применения изолята БассИаготусея сеге\ч$1ае-\ 1_______

Показатель Группа

1 2 3 4 5

Глюкоза, ммоль/л 5,50±0,28 5,40±0,27 5,30±0,27 5,20±0,26 5,10±0,23

Холестерин, ммоль/л 1,70±0,09 1,75±0,09 1,80±0,09 1,90±0,10 1,95±0,10*

Триглицериды, ммоль/л 1,00±0,05 1,04±0,05 1,06±0,05 1,09±0,06 1,12±0,06*

АЛТ, Ед/л 41,60±2,08 39,80±1,99 38,80±1,94 37,90±1,90 36,20±1,81*

ACT, Ед/л 129,40±6,47 128,80±6,44 126,60±6,33 121,50±6,08 115,70±5,79*

Холинэстераза, ммоль/ч.л 0,88±0,04 0,86±0,04 0,84±0,04 0,82±0,04 0,81±0,04

Примечание: * - р <0,05

На основании полученных данных (табл.4), можно заключить, что у лабораторных животных 2-й группы при скармливании обезвреженного от пестицида ТМТД корма на 30 сут происходило снижение активности АЛТ на 4,3 % и увеличение количества триглицеридов на 4,0 %, в 3-й группе отмечали угнетение активности ACT, холинэстеразы и снижение уровня глюкозы в сыворотке крови на 6,7; 4,5 и 3,6 %, повышение концентрации холестерина и триглицеридов - на 5,9 и 6,0 %, соответственно. Тогда как в 4-й и 5-й группах уровень глюкозы снижался на 5,5 и 7,3%, активность холинэстеразы - на 6,8 и 8,0 %, АЛТ - на 8,9 и 13,0 % (р<0,05), ACT - на 6,1 и 10,5 % (р<0,05), а содержание холестерина и триглицеридов увеличивалось на 11,8 и 14,7 % (р<0,05); 9,0 и 12,0 % (р<0,05) соответственно, относительно группы биологического контроля.

Таким образом, применение изолята дрожжей Saccharomyces cerevisiae-11 устраняет токсическое воздействие пестицида ТМТД на гематологические и биохимические показатели крови крыс в малых концентрациях.

3.9 Изучение эффективности использования изолята Saccharomyces cerevisiae-11 в модельном опыте на овцах

Исследования проводили на 9 овцах породы «Прекос», разделенных по принципу аналогов на 3 группы по 3 гол в каждой. 1-я группа служила биологическим контролем, животные 2-й группы ежедневно получали корм, содержащий пестицид ТМТД в дозе 10 МДУ и обработанный в течение 14 дней Saccharomyces cerevisiae-ll, 3-я группа ежедневно получала корм содержащий, 10 МДУ ТМТД. Продолжительность опыта составила 30 суток.

Количество эритроцитов лейкоцитов и гемоглобина во2-й группе снижалось по сравнению с биологическим контролем к 30 сут эксперимента на 5,2; 3,9 и 8,8% соответственно. У животных 3-й группы, количество эритроцитов к 30 сут снизилось на 10,1%, лейкоцитов - на 8,5%, а содержание гемоглобина - на 12,8%.

В опытах на овцах установили незначительное повышение к 30 сут во 2-й группе уровня АЛТ на 4,0 % и холестерина до 5,3%. Остальные биохимические показатели сыворотки крови в этой группе животных не имели существенных отклонений от биологического контроля.

В 3-й группе животных наблюдали снижение к 30 сут уровня АЛТ и ACT на 10,0 и 6,1 % соответственно. Количество триглицеридов и холестерина к концу исследования повышалось до 7,9 и 14,5%.

Исходя из вышеизложенного, следует, что применение дрожжей Saccharomyces cerevisiae-ll не вызывает изменений в морфологических и биохимических показателях крови лабораторных и сельскохозяйственных животных, снижает токсическое влияние пестицида ТМТД на организм. В связи с этим данные изоляты дрожжей могут быть использованы для искусственного разложения пестицида в кормах.

4 ВЫВОДЫ

1. В результате скрининга потенциальных антидотов карбаматного пестицида ТМТД отобраны антиоксиданты Мексидол-Вет, Эмоксипин и Мексиприм, которые обеспечивают выживаемостьна 93,8% при отравлении животных данным пестицидом в дозе ЛДюо.

2. При отравлении белых крыс и кроликов ТМТД в дозе ЛД» и лечении препаратом Мексиприм в дозе 15 мг/кг в течение 4 дней происходит нормализация гематологических (увеличение количества лейкоцитов, эритроцитов и гемоглобина на 69,5; 18,8 и 63,5 %), биохимических (снижение холестерина на

51,0 %, увеличение уровня глюкозы на 26,5 %, АЛТ и АСТ на 63,0 %, общего белка на 39,0 %) и иммунологических (увеличение фагоцитарной активности, Т- и В-лимфоцитов на 44,0; 51,5 и 27,0 %) показателей относительно группы

токсического контроля.

3. Гистологическими исследованиями установлено, что при затравке белых крыс пестицидом ТМТД в дозе ЛДо (865 мг/кг) и лечении антиоксидантом Мексипримв препаратах головного мозга, сердца и почек патологические изменения не выявлены. В печени обнаружили признаки слабо выраженной зернистой дистрофии гепатоцитов и признаки их регенерации в виде делящихся клеток.

4. Наиболее выраженными адсорбционными свойствами в отношении пестицида ТМТД обладает Фитосорб, сорбционная активность которого составила 99,0 % при температуре 37-39 °С вне зависимости от кислотности среды.

5. Применение Фитосорба в дозе 1 г/кг корма при хронической экспериментальной интоксикации белых крыс и кроликов (1/20 ЛДо) способствует нормализации гематологических (увеличение количества лейкоцитов, эритроцитов и гемоглобина на 18,5; 22,5 и 21,5 %) и биохимических (повышение активности АЛТ и АСТ на 18,0 и 15,5 %) показателей крови, снижает токсическое влияние на печень и другие органы и ткани.

6. В ходе скрининга штаммов-деструкторов ТМТД, установили, что изолят дрожжей БассИаготусез сеготшае-П не утрачивает способность к росту даже при высоких концентрациях данного пестицида в среде (0,05 и 0,1 мг/кг), не обладает токсичностью и наиболее эффективен при деструкции ТМТД.

7. Степень деструкции ТМТД у изолята дрожжей БассЪаготусеь сегетз\ае-\\ при концентрации пестицида в синтетической среде на уровне 5 МДУ составила 97,9 и 99,5 %, а при 10 МДУ - 98,8 и 99,4 %, в зерне - 99,3 и 98,8 "/¿соответственно.

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. В качестве средства для лечения отравлений ТМТД рекомендуется применять антиоксидант Мексиприм. Данный препарат вводят внутримышечно в дозе 15 мг/кг в течение 4 дней.

2. Для профилактики хронических отравлений ТМТД предлагается применять энтеросорбент Фитосорб из расчета 1 г на кг корма.

3. Для устранения токсического воздействия на животных низких концентраций ТМТД в кормах рекомендуется обрабатывать их изолятом дрожжей БассЪаготусе5 сегеч'таеА 1 в дозе 40 мл/кг.

6 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Серова, Ю.В. Клинико-гематологические показатели при субхроническом воздействии карбаматного пестицида / Ю.В. Серова, JI.E. Матросова, М.Я. Тремасов // Матер, фармаколог, научн. конф., посвящ. 90-летию академика Рабиновича М.И. -Троицк, 2012. - С. 83-86.

2. Серова, Ю.В. Патоморфология ТМТД при хронической интоксикации / Серова Ю.В. // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины. - Казань, 2012. - Т. 212. - С. 146-150.*

3. Тремасов, М. Я. Эколого-токсикологическая оценка загрязненности почв и сельскохозяйственной продукции остаточными количествами пестицидов / М.Я. Тремасов, H.H. Жестков, Ю.В. Серова // «Аграрная наука: современные проблемы и перспективы развития»: Матер, международ, науч-практ. конф. -Махачкала, 2012.-С. 1287-1290.

4. Серова, Ю.В. Адсорбционная способность дрожжей в отношении карбаматного пестицида ТМТД / Ю.В. Серова, Л.Е. Матросова // «Современная микология в России»: Матер. 3 съезда микологов России. - Москва, 2012. - С. 98-99.

5. Серова, Ю.В. Скрининг микроорганизмов для деструкции тетраметилтиурамдисульфида / Ю.В. Серова, Л.Е. Матросова, Ю.В. Юсупова // «Биология - наука XXI века»: Матер. 17-я междунар. Пущинской школы-конф. молодых ученых. - Пущино, 2013. - С. 44.

6. Серова, Ю.В. Сорбция дрожжевыми клетками ТМТД / Ю.В. Серова // «Актуальные вопросы ветеринарной фармакологии, токсикологии и фармации»: Матер. IV съезда ветерин. фармакологов и токсикологов России. - Москва, 2013. - С. 522-524.

7. Серова, Ю.В. Гистологические исследования при острой интоксикации ТМТД / Ю.В. Серова, Е.Г. Губеева, E.H. Иванов // «Биотехнология в решении экологических проблем природы, общества и человека в Евразии: взгляд молодых ученых и специалистов»: Матер, международ, научн.-практ. конф. молодых ученых и специалистов. - Казань, 2013. - С. 147 - 149.

8. Степанов, В.И. Применение антиоксидантов для лечения острых отравлений тетраметилтиурамдисульфидом (ТМТД) / В.И. Степанов, М.Я. Тремасов, H.H. Хазипов, Ю.В. Серова и др. // Ветеринарный врач. -2013. -№ 3. - С. 5-7.*

9. Серова, Ю.В. Гемато-биохимические показатели крови при остром отравлении тетраметилтиурамдисульфидом / Ю.В. Серова // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины. - Казань, 2013. -Т. 215,- С. 318-322.*

10. Тремасова A.M. Применение сорбентов при воздействии пестицида ТМТД на организм животных [Электронный ресурс] / A.M. Тремасова, Ю.В.

Серова, Л.Е. Матросова // «Восточное партнерство - 2013»: Матер, науч.-практ. конф. - Польша, 2013. - С. 58 - 61.

11. Серова, Ю.В. Биодеградирующая способность микроорганизмов в отношении тетраметилтиурамдисульфида / Ю.В. Серова, Л.Е. Матросова // Актуальные вопросы ветеринарной биологии. - 2013. - № 3. - С. 37-38.*

* - перечень изданий, рекомендуемых ВАК РФ

Отпечатано в ООО «Печатный двор». г Казань,ул. Журналистов, 2А, оф.022

Тел: 295-30-36, 564-77-41, 564-77-51. Лицензия ПД№7-0215 от 01.11.2001 г. Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТРРФ. Подписано в печать 15.11.2013 г Печ.л. 1,3 Заказ № К-7333. Тираж 100 экз. Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Печать - ризография.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Серова, Юлия Владимировна, Казань

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЙ, РАДИАЦИОННОЙ И

БИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ»

На правах рукописи

04201452884

СЕРОВА ЮЛИЯ ВЛАДИМИРОВНА

ПОИСК СРЕДСТВ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ОТРАВЛЕНИЙ ЖИВОТНЫХ ТЕТРАМЕТИЛТИУРАМДИСУЛЬФИДОМ

06.02.03 - ветеринарная фармакология с токсикологией

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: заслуженный деятель науки РТ, доктор биологических наук, профессор Тремасов М.Я.

Казань-2013

СПИСОК СОКРАЩЕННЫХ ТЕРМИНОВ

AJ1T - аланинаминотрансфераза ACT - аспартатаминотрансфераза

ЛД5о - смертельная доза, вызывающая гибель 50% животных ЛДюо- смертельная доза, вызывающая гибель всех животных

3 3

lg КОЕ/см - десятичный логарифм колониеобразующих единиц в 1 см

МПА - мясо-пептонный агар

ПДК - предельно допустимая концентрация

ЭПС - эндоплазматическая сеть

ТСХ - тонкослойная хроматография

ТМТД - тетраметилтиурамдисульфид

МДА- малоновый диальдегид

ПОЛ - перекисное окисление липидов

НАДФН - восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотидфосфата

НАДН - никотинамидадениндинуклеотид

АДВ - активнодействующее вещество

МАО - моноаминоксидаза

GSH - глутатион

Gly - глицин

Ser - серин

ФАД - флавинадениндинуклеотид ФМН - флавинмононуклеотид

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ..................................................................5

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................................................................................8

1.1 Биологическое действие дитиокарбаматного пестицида ТМТД................8

1.2 Лечение и профилактика интоксикаций ТМТД..........................................................18

1.3 Биодеструкция пестицидов........................................................................................................22

1.3.1 Метаболизм пестицидов и пути снижения их токсичности с 22 использованием микроорганизмов............................................

1.3.2 Основные механизмы микробиологической деструкции 29

пестицидов..................................................................................................

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ......................................................35

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ........................................41

3.1 Скрининг препаратов при остром отравлений ТМТД................................................41

3.2 Изучение эффективности применения Мексиприма при остром 43 отравлении белых крыс ТМТД.................................................

3.3 Изучение эффективности применения Мексиприма при остром 57 отравлении кроликов ТМТД..........................................................

3.4 Скрининг сорбентов различных групп в отношении пестицида 62 ТМТД in vitro.....................................................................

3.5 Изучение эффективности применения Фитосорба при хроническом 64 отравлении ТМТД на белых крысах................................................

3.6 Изучение эффективности применения растительного сорбента при 72 хроническом отравлении кроликов ТМТД.................................

3.7 Скрининг микроорганизмов-деструкторов ТМТД........................ 75

3.8 Исследование обезвреживающей способности изолята 86 Saccharomyces cerevisiae-11 в отношении ТМТД на лабораторных животных.........................................................................

3.9

Изучение эффективности использования изолята Saccharomyces 89 cerevisiae-l 1 в модельном опыте на овцах..................................

4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ......................................92

5 ВЫВОДЫ....................................................................................................................................................107

6 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ................................................................................108

7 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................109

ПРИЛОЖЕНИЯ....................................................................................................................................137

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В связи с интенсивным поступлением химических загрязнителей в окружающую среду и внедрением в практику разнообразных химических соединений экологическое состояние территории России в настоящее время определяется как критическое. В условиях техногенеза важное место среди загрязнителей кормов и пищевых продуктов занимают химические средства защиты растений и животных - пестициды. При использовании таких кормов могут возникать острые, а чаще субхронические и хронические, токсикозы, сопровождающиеся нарушением воспроизводительной функции организма, снижением продуктивности животных и их естественной резистентности. Анализ этиологии отравлений пестицидами у животных в последние годы показал, что наиболее часто регистрируются отравления производными дихлор-феноксиуксусной кислоты, продуктами взаимодействия пестицидов и минеральных удобрений (фотооксидантами), фосфорорганическими соединениями, фостоксином, производными карбаминовой и дитиокарбаминовой кислот, пиретроидами (Ермаков Н.М. и др., 2001; Черных A.M., 2003; Желтов В.А., 2007; Иванов A.B. и др., 2009; Тремасов М.Я. и др., 2012).

Всего в Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации, внесено около 900 наименований средств защиты растений. Фунгицидные препараты занимают лидирующие позиции и имеют высокие объемы применения (262,57 т в год), территориальные нагрузки (75,29±9,13 г/га) и удельный вес (42,67 %) в структуре средств химизации сельскохозяйственного производства. Из многочисленных соединений этого класса наибольшую распространенность получил тетраметил-тиурамдисульфид (ТМТД) (Потапов А.И., Ракитский В.Н., 2001; Проворова М.В., 2006; Смирнов A.M. и др., 2007; Попович В.В., 2010; Ким A.B., 2013).

В этой связи важной проблемой ветеринарной токсикологии является разработка средств и методов профилактики и лечения отравлений животных пестицидами, так как многие существующие средства и методы не удовлетворяют

потребностям ветеринарной службы, а антидоты и адаптивные препараты для многих пестицидов не созданы (Тремасов М.Я., Папуниди К.Х., 2009; Смирнов A.M., Дорожкин В.И., 2010).

Цель и задачи исследования. Целью данного исследования явилось изучение эффективности лечения и профилактики животных фармакологическими и микробиологическими средствами при различной степени интоксикации пестицидом ТМТД.

На основании поставленной цели были определены следующие задачи:

> Провести отбор лекарственных средств и изучить эффективность применения антиоксидантов при остром отравлении ТМТД;

> Оценить сорбционные способности энтеросорбентов различных групп в отношении ТМТД;

> Изучить эффективность сорбента Фитосорб при хронической интоксикации ТМТД с учетом изменений клинических, гематологических, биохимических и иммунологических показателей;

> Отобрать штаммы микроорганизмов, наиболее резистентные к ТМТД и определить их эффективность в отношении биодеструкции данного пестицида in vitro, in situ, а также в опытах на лабораторных и сельскохозяйственных животных.

Научная новизна. Впервые в качестве лечебного средства при остром отравлении ТМТД было обосновано использование препарата Мексиприм.

Экспериментально доказана эффективность применения растительного сорбента Фитосорб при хронических интоксикациях пестицидом ТМТД.

Лабораторными и производственными испытаниями доказана безвредность и эффективность деструкции ТМТД изолятом Saccharomyces cerevisiae-11.

Практическая ценность работы. Для устранения признаков токсикоза вызванного пестицидом ТМТД и для нормализации гематологических, биохимических и иммунологических показателей организма рекомендовано в качестве лечебного препарата при остром отравлении применять антиоксидант Мексиприм, а для профилактики хронических интоксикаций использовать

Фитосорб или обезвреживать данный пестицид в кормах изолятом дрожжей Басскаготусея сегеу1згае-11.

Результаты исследований использованы при составлении Методического пособия по применению микроорганизмов для деструкции ксенобиотиков, утвержденного Отделением ветеринарной медицины РАСХН (Москва, 15.04.13 г.)

Апробация материалов диссертации. Материалы диссертации представлены, обсуждены и одобрены на научных сессиях ученого совета ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» по итогам НИР за 2010-2013 гг., Международных и Всероссийских научно-практических конференциях и симпозиумах (Москва 2012, 2013; Троицк, 2012; Махачкала, 2012; Казань, 2012, 2013; Пущино, 2013; Польша, 2013).

Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано 11 научных работ, в том числе 4 статьи в изданиях рекомендованных ВАК РФ.

Основные положения, выносимые на защиту:

Эффективность антиоксидантного лечения при острых отравлениях

ТМТД;

Профилактическая эффективность Фитосорба при хронических интоксикациях ТМТД;

Биотрансформирующая эффективность дрожжей рода Басскаготусез сегеУ181ае-\ 1 в отношении пестицида ТМТД.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 139 страницах компьютерного текста и включают следующие разделы: оглавление, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список использованной литературы, приложения. Работа иллюстрирована 23 таблицами и 16 рисунками. Список использованной литературы содержит 256 библиографических источника, из них 90 -иностранных.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Биологическое действие дитиокарбаматного пестицида ТМТД

Пестициды (лат. pestis - зараза; caedo - убиваю) - собирательный термин, охватывающий химические соединения различного строения и применяемые для

1

защиты растений от вредителей, болезней, сорняков и грызунов, а также средства защиты животных от насекомых и клещей. Известно, что пестициды и агрохимикаты, относящиеся к группе высокобиологически активных соединений, преднамеренно вносимых в окружающую среду, являются одним из мощных факторов воздействия на организм человека и животных (Жуленко В.Н. и др., 2010; Попович В.В., 2010).

Пестицидные свойства производных карбаминовой кислоты обнаружены сравнительно недавно. Большинство дитиокарбаматов созданы во время и после второй мировой войны (цирам, тирам и др.). Дитиокарбаматы стали применять на практике в качестве фунгицидов и инсектицидов в Великобритании примерно с 1936 г. К тому времени эти вещества уже применялись в качестве фунгицидов и инсектицидов в США, где классический патент был выдан Tisdale и Williams в 1934 г. Интенсивное изучение инсектицидных свойств ряда простых замещенных фенил-Ы-метилкарбаматов, синтез 1 -нафтил-Ы-метилкарбамата (севина) и дальнейшие многочисленные исследования производных карбаминовой, тио- и дитиокарбаминовых кислот привели к тому, что в настоящее время известно более тысячи соединений этого вида, обладающих физиологической активностью (Гигиегические критерии..., 1991).

По современной классификации в соответствии с химическим строением 3 карбаматные пестициды разделяют на следующие группы:

1) Производные карбаминовой кислоты

а) акриловые эфиры N-метилкарбаминовой кислоты (метил и диметилкарбаматы) - беномил, фундазол, БМК, севин, байгон, дикрезил, фурадан (карбофуран), пиримор

б) алкиловые эфиры Ы-арилкарбаминовой кислоты (фенилкарбаматы) -бетанал (фенмедифам), бетанал АМ (десмедифам), карбин (барбан), хлор ИФК (хлорпрофам).

В последние годы, указанные соединения этих групп в Российской Федерации применяют ограниченно, в качестве инсектицидов, акарицидов, фунгицидов и гербицидов в сельском хозяйстве широко применяются соединения класса ариловых эфиров алкилкарбаминовой кислоты и алкиловых эфиров фенилкарбаминовой кислоты.

2) Производные тиокарбаминовой кислоты - авадекс БВ (триаллат), видат (оксамил), превикур (пропамокарб гидрохлорид), ронит, шабет (циклоат), эптам и витокс.

3) Производные дитиокарбаминовой кислоты

В настоящее время в качестве фугицидов используют несколько дитиокарбаматов: ТМТД (тирам), дитан М-45, новозир и пенкоцеб (манкоцеб). Их используют в виде самостоятельных пестицидов и в форме комбинированных препаратов для протравливания семян и опрыскивания растений в период вегетации овощных культур и виноградников (Голышин Н.М., 1993; Зинченко В.А., 2007; Егоров В.И. и др., 2010).

Тирам (ТМТД). По химической структуре - это тетраметилтиурам-дисульфид, а по новой номенклатуре - бис-диметилтиокарбамоилдисульфид, С6Н12М284. Молекулярный вес 240, 4.

СН3

На основе тирама выпускается препарат ТМТД в форме смачивающегося порошка (СП) и пленкообразующей текучей пасты (ПТП), а также в комбинации с другими препаратами. ТМТД можно рассматривать как производное дитиокарбаминовой кислоты. Представляет собой порошок от белого до желтовато-серого цвета, без запаха с температурой плавления 155-156 °С. Препарат хорошо растворим в хлороформе, ацетоне и растительных маслах, слабо растворяется в спирте. Растворимость в воде при комнатной температуре 30 мг/л. Не летуч, стабилен при хранении. Применяют для протравливания семян пшеницы, ржи, сорго, кориандра, арахиса, дынь и арбузов, гороха, фасоли, клевера, вики, чины, люцерны, сои, люпина, чечевицы, бобов кормовых, кормовых многолетних злаковых трав, сахарной, столовой и кормовой свеклы, льна, моркови, мака, многих лекарственных растений, огурцов, капусты, брюквы, редьки, турнепса, томатов, цветочных культур, лука-чернушки, фруктовых и хвойных пород деревьев. Клубни семенного картофеля обрабатывают перед посадкой, лук-севок и чеснок опускают в 3 %-ный раствор также перед посадкой (Мельников H.H. и др., 1995; Герасименко В.Ю., Кравченко Р.В., 2007; Жестков H.H. и др., 2009).

В настоящее время интенсивно внедряют обработку ТМТД с пленкообразующими полимерами или регуляторами роста, при этом удерживаемость фунгицида на зерне составляет не менее 95 % в течение 5 мес против 30-50 % в течение 1 мес без применения пленкообразователей (Асланов P.M. и др., 2005; Кравченко Р.В., Шовканов A.A., 2008). Эффективен в борьбе с фузариозными и гельминтоспориозными корневыми гнилями пшеницы, плесневением семян кукурузы, полиспорозом льна, аскохитозом гороха, корнеедом сахарной свеклы и другими болезнями.

Кроме ТМТД, содержащего действующее вещество тирам, для протравления семян применяют и комбинированные препараты, в состав которых также входит тирам: витавакс 200 (карбоксин 37,5 % + тирам 37,5 %), кемикар-Т (карбоксин 17 % + тирам 17 %), фенорам супер (карбоксин 47 % + тирам 23 %), раксил-Т (тебуконазол 1,5 % + тирам 50 %) и ТМТД-плюс (тирам + регулятор

роста). Эти препараты являются среднетоксичными пестицидами, кумулятивные свойства у них выражены слабо. На организм животных они действуют сходно с ТМТД (Аргунов М.Н. и др., 2007; Лимаренко A.A. и др., 2007; Кравченко Р.В., 2008; Жуленко В.Н. и др., 2010).

Дитиокарбаматы могут оказывать токсическое действие на организм при поступлении через дыхательные пути, желудочно-кишечный тракт, кожу и

ч

слизистые оболочки. По токсичности для теплокровных животных дитиокарбаматы относятся к различным классам опасности. Так, ТМТД относится к соединениям, обладающим средней токсичностью (III класс опасности). ЛД50 для крыс 865 мг/кг, для кроликов, 210 мг/кг, для овец 225 мг/кг. Максимально переносимая доза для кур и свиней 500 мг/кг, для крупного рогатого скота 400 мг/кг. У цыплят токсикоз развивается от ТМТД в дозе 1 мг/кг при поступлении в организм в течение 3 недель. Данный пестицид у кур даже в малых дозах (35 мг/кг), действует гонадотоксически и тератогенно, что проявляется резким снижением яйценоскости и замедлением роста цыплят. У свиней эмбриотоксическое действие особенно выражено при поступлении ТМТД в последней фазе беременности - 70 % поросят рождаются мертвыми. В малых дозах (0,1 и 0,3 мг/кг) пестицид действует гонадо- и эмбриотоксически, в больших (20 - 100 мг/кг) - мутагенно, при поступлении в организм животных в дозе 125 мг/кг - тератогенно. Обладает выраженными кумулятивными свойствами (Медведь Л.И., 1977; Юрченко И.В. и др., 2009; Жуленко В.Н. и др., 2010).

При изучении характера распределения ТМТД в организме теплокровных выявлено, что после введения препарата в желудок пестицид довольно быстро всасывается из желудочно-кишечного тракта и уже через 30 мин обнаруживается в крови, паренхиматозных органах, железах внутренней секреции (надпочечники, 3 щитовидная железа, половые железы, поджелудочная железа), в ткани головного

мозга, мышцах, причем максимальные количества фунгицида выявляются в надпочечниках и щитовидной железе (Антонович Е.А., Векштейн М.Ш., 1970; Антонович Е.А., 1973; Анциферов С.Д., 1976). При введении в желудок крыс по 250 мг/кг с интервалом 3 ч ТМТД в наибольших количествах присутствовал в

желудке с содержимым, почках и моче. Несколько меньшие количества ТМТД содержались в поджелудочной железе, тонкой и толстой кишке с содержимым, а также в печени. В перечисленных тканях обнаруживаются также и продукты превращения дитиокарбаматов: тетраметилтиомочевина или этилентиомочевина, сероуглерод, метилтиоизоционат и другие, которые обладают более высокой токсичностью по сравнению с исходными соединениями и играют существенную роль в механизме действия производных дитиокарбаминовых кислот (Курляндский Б.А. и др., 1996; Шорманов В.К. и др., 2011). С этилентиомочевиной связано наличие у ди�