Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поиск и исследование силикатеинов пресноводных губок

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Поиск и исследование силикатеинов пресноводных губок"

На правах рукописи

Калюжная Оксана Внкторовва

ПОИСК И ИССЛЕДОВАНИЕ СИЛИКАТЕИНОВ ПРЕСНОВОДНЫХ ГУБОК

03 00 04-Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток - 2007

003174457

Работа выполнена в Лимнологическом институте СО РАН, (г Иркутск) и в Институте физиологической химии Университета г Майнц, Германия (Institut für Physiologische Chemie, Universität, Mainz, Deutschland)

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор

Беликов С.И.

Официальные оппоненты доктор биологических наук

Картавцев Ю.Ф.

кандидат биологических наук Кожемяко В.Б,

Ведущая организация: Сибирский институт физиологии и биохимии

растений СО РАН, г Иркутск

Защита состоится 8 ноября 2007 г в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005 01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу. 690022, г Владивосток, пр-т 100-летия Владивостока, 159, ТИБОХ ДВО РАН Факс (4232)31-40-50 E-mail-science@piboc dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г Владивосток, пр-т 100-летия Владивостока, 159, ТИБОХ ДВО РАН)

Текст автореферата размещен на сайте http //www piboc dvo ru

Автореферат разослан 6 октября 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук Прокопенко Г И

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Процесс биосилификации, или биологического формирования аморфного кремнезема, довольно широко распространен в природе Усваивать неорганический кремнезём из окружающей среды способны некоторые простейшие, диатомеи, губки, моллюски и высшие растения (Shimizu et al, 1998, Bavestrello et al, 2003, Patwardhan and Clarson, 2002) Но только губки (тип Poniera), единственные из современных многоклеточных организмов, способны формировать из кремния свой скелет Проблема формирования кремнийсодержащего скелета губок интересует ученых во всём мире Однако до недавнего времени объектами их исследования являлись преимущественно морские губки В спикулах морских губок, после растворения их в плавиковой кислоте или ее солях, были найдены белки, обладающие ферментативной активностью и способные гидролизовать эфиры кремниевой кислоты с образованием аморфного кремнезема (Shimízu et al, 1998, Cha et al, 1999, Krasko et al, 2000, Weaver, Morse, 2003) Эти белки, получившие название силикатеины, входят в состав аксиального филамента — центральной «нити», вокруг которой происходит отложение кремнезема и формирование скелетных элементов губок — кремниевых игл, или спикул Силикатеины — белки, гомологичные цистеиновой протеазе катепсину L Основным отличием силикатеинов от катепсинов является наличие в активном центре силикатеина остатка серина, вместо остатка цистеина - у катепсина L (Shimízu et al, 1998, Krasko et al, 2000, Jennifer et al., 2000, Morse et al, 2003). Известные на данный момент последовательности силикатеинов губок принадлежат к двум классам более распространенным является силикатеин-а, для двух видов морских губок было показано также наличие силикатеина-Р (Cha et al, 1999, Krasko et al, 2000) Для лучшего понимания механизма действия силикатеинов актуальным является исследование их структуры у различных морских и пресноводных губок Пресноводные губки представляют особый интерес в связи с тем, что они являются эволюционно более молодой группой, по сравнению с морскими губками Пресноводные губки образовались, вероятно, около 150 млн лет назад в позднемеловую (Early Cretaceous) эпоху, в то время как морские губки образовались ранее, не менее 600 млн. лет назад, в Прекембрии (Early Vendían) (Li et al, 1998, Dunagan, 1999)

В настоящей работе объектом исследований являются силикатеины пресноводных губок, принадлежащих к двум семействам: космополитному — Spongillndae и эндемичному - Lubomirskiidae Большинство представителей семейства Lubomirskiidae, по сравнению с космополитными губками, отличаются массивными размерами и скелетом Так, скелет одного из широко распространенных в оз Байкал видов губок, Lubomirsha baicalensis, достигает размеров 1,5 м Байкальские губки способны обитать в диапазоне глубин от 3 до 900 м (Абрамов и др, 1979, Вейнберг, 2001) Таким образом, эндемичные байкальские губки, по всей видимости, имеют особенности, которые позволили им развить мощный скелет и расселиться по всему дну Байкала.

Для сравнительного исследования силикатеинов в работу были включены космополитные губки семейства Spongilhidae, принадлежащие к родам Ephydatia и Spongilla Кроме того, использовались последовательности силикатеинов морских губок, опубликованные в генетических банках данных

Цель исследования. Определение и сравнительный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей силикатеинов космополитных и эндемичных пресноводных ту бок Задачи исследования: 1 Определить полные последовательности кДНК силикатеинов байкальской губки L baicalensis и космополитных губок Ephydatia muelleri и Spongilla lacustris 2. Проанализировать экзон-интронную структуру генов силикатеинов из геномной ДНК губок семейств Spongilliidae (Е muelleri, S lacustris) и Lubomirskudae (L baicalensis, L mcrustans, Baikalospongia intermedia, В dzhegatajensis, Swartschewskia papyracea).

3 Провести анализ транслированных аминокислотных последовательностей . ' генов силикатеинов.

4 Установить наличие белков, кодируемых соответствующими генами силикатеинов, в спикулах губки.

Научная новизна. В настоящей работе впервые для пресноводных губок показано наличие в их геноме множества генов сшгакатеина-а. Для эндемичной байкальской губки L baicalensis определены полноразмерные последовательности четырех к ДНК силикатеинов и экзон-интронные последовательности всех обнаруженных генов У других исследованных видов пресноводных космополитных и эндемичных губок также обнаружено от 1 до 5 различных генов силикатеина-а Установлена консервативность локализации интронов и размера экзонов у большинства из этих генов Проведен анализ транслированных последовательностей генов, в результате которого выявлена высокая консервативность С-концевого домена зрелых белков силикатеинов. Обнаружено, что в определённых участках последовательностей белков пресноводных губок находятся характерные консервативные аминокислотные остатки. Проведён масс-спектрометрический анализ белков спикул губки L baicalensis, в результате которого в составе спикул обнаружено три белка силикатеина-а.

Практическая значимость работы.

Силикатеины являются потенциально важными ферментами для мйогочисленного использования в медицине и технологии, например, для модификаций поверхностей стёкол, получения силиконовых резин, пластмасс, микро-решеток и катализаторов. Интересующие исследователей поверхности, например, содержащие коллаген, могут быть модифицированы пришивкой на них силикатеина с последующим отложением на этих поверхностях кремнезема с целью использования в виде заменителей костей при протезировании Использование кремнезема, привитого с помощью силикатеина на металлические поверхности, также может быть полезно для получения имплантатов с уменьшенной способность к отторжению. Рекомбинантный

силикатеин может быть использован для получения как нано- так и микроструктур кремнезема с заданными свойствами, необходимыми в качестве добавки к пластмассам, к покровным и красящим материалам, как наполнители резин, как основа для катализаторов и адсорбентов Кроме того, с помощью силикатеинов могут быть получены материалы с заданной прочностью, определенными размерами пор и площадью поверхности, которые необходимы для использования в методах сепарации (Sarikaya et al, 2003; Sun et al, 2004, Kim et al, 2004).

Внедрение в практику. Полученные нуклеотидные последовательности генов депонированы в международный компьютерный банк данных GenBank Основные положения, выносимые на защиту:

1 Пресноводные губки имеют множество генов силикатеина-а

2 В структуре генов силикатеинов пресноводных губок имеется 6 интронов различной длины и строгой локализации

3 Белковые последовательности силикатеинов пресноводных губок отличаются характерными для определенных позиций аминокислотными остатками

4 В спикулах пресноводной губки L baicalensis локализовано, по меньшей мере, три белка силикатеина-а.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международной конференции "Живые клетки диатомей" ("The living diatom cells", Иркутск, 2004), на международном рабочем совещании «Происхождение и эволюция биосферы» (Новосибирск, 2005), на Четвертой Верещагинской Байкальской конференции (Иркутск, 2005), на VI международном симпозиуме по губкам ("7th International Sponge Symposium", Rio de Janeiro, 2006)

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 15 работ, из них 7 статей в реферируемых журналах

Структура и объём работы. Диссертационная работа состоит из введения, 3 глав, выводов, списка литературы и 6 приложений Работа изложена на 120 страницах, иллюстрирована 9 рисунками и 3 таблицами. Список литературы содержит 135 источников, из них 102 на английском языке

Работа выполнялась по проекту «базовых» фундаментальных исследований ЛИН СО РАН «Контроль морфогенеза кремнистых структур на геномном и клеточном уровне» (№ 6 1 1 10) Работа была проведена при поддержке грантов РФФИ (№ 03-04-49685), WTZ Germanj—Russia (German-Russian cooperation through the BMBF), Президиума Российской академии наук (№ 25 5) и Государственного Контракта (№ 02 434 11.7116)

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Образцы байкальских губок были собраны в ходе экспедиций 2004-2006 гг. в районе поселка Большие Коты, вблизи о Ольхон (западное, юго-западное побережье оз Байкал), а также в р Голоустная (юго-западный берег Байкала) и р Духовая (восточное побережье) Экземпляры, которые были использованы

далее для выделения РНК, замораживали в жидком азоте Образцы для выделения ДНК помещали в 70% раствор этанола и хранили при -20°С Препараты спикул L baicalensis получали путем растворения тканей губки в смеси HNO3/H2SO4 (1 4), согласно ранее описанному методу (Cha et al, 1999) с некоторыми модификациями Процесс растворения спикул (0 1 г) в плавиковой кислоте (6М HF) с одновременным окрашиванием аксиального филамента красителем для белков Кумасси (Coomassie brilliant blue R250) наблюдали с использованием светового микроскопа Axiovert-200 (Carl Zeiss) Белки спикул губки L baicalensis выделяли с использованием 2 М HF/8 М NH4F по методу Cha et al (1999) Белок, экстрагированный из спикул, анализировали методом денатурирующего гель-электрофореза в (SDS/PAAG) (Остерман, 1981)

Гидролиз белков спикул трипсином осуществляли после растворения осадка суммарных белков из 1 г спикул в 1 мл раствора, содержащего 420 мг мочевины, 2 мкл меркаптоэтанола и 0 1 М Трис-HCl, pH 8 5 в течение часа Раствор охлаждали до 4°С, добавляли 30 мкл 1 М йодуксусной кислоты и выдерживали 1 ч при 4°С для модификации цистеинов После этого добавляли 25 мкл раствора трипсина (1 мг/мл в 0 1 М HCl) и инкубировали 6 ч при 38°С Анализ гидролизата проводили в режиме "of line" на отечественном приборе MX 5303, оборудованном электрораспылительным источником ионизации и времяпролетным масс-анализатором, разработанным в лаборатории экологической и биомедицинской масс-спектрометрии ИАнП РАН

Выделение суммарной РНК производили из свежих образцов губок с помощью «Tnzol Reagent» (Sigma) по протоколу фирмы. РНК использовали далее для для синтеза к ДНК и получения кДНК-библиотеки L baicalensis Синтез кДНК и определение полноразмерных последовательностей кДНК силикатеинов-а других пресноводных губок проводили методом «3'-5'-RACE» с использованием CapFishing cDNA Isolation Kit (SeeGene) по протоколу фирмы Библиотеку кДНК получали по методике, прилагающейся к набору "SMART™ cDNA Technology" (CLONOTECH) Скрининг библиотеки кДНК для поиска последовательностей, кодирующих силикатеины-а, проводили путем амплификации суммарной клонированной кДНК со специфическими праймерами, выбранными на основе анализа опубликованных структур генов, в сочетании с универсальными плазмидными праймерами, специфичными к промоторам фагов Sp6 и Т7 Структуры специфических праймеров приведены ниже, в скобках указано их положение в нуклеотидной последовательности кДНК силикатеина-а Suberites domuncula

LB_sil_fl - CAGGGAGATTGTGGTGCCAGCTATGC (394-419), LB_sil_r2 - ATGCCGC ATTGGTTGTACTTGTT (940-962) Для определения нуклеотидных последовательностей полноразмерных генов силикатеина-а губки, суммарную ДНК выделяли по методике "QIAGEN RNA/DNA" из образцов L baicalensis, хранящихся в 70% этаноле Выделенную ДНК анализировали электрофорезом в 0 6 % геле агарозы

Определение полных (экзон-интронных) нуклеотидных последовательностей генов силикатеина-al, -а2, -аЗ, -а4 проводили в несколько

этапов путем получения перекрывающихся ампликонов с использованием праймеров на основе соответствующих известных последовательностей кДНК Для определения экзон-нитронной последовательности гена силикатеина-al были использованы следующие праймеры (в скобках указано их положение на полной последовательности гена сшшкатеина-al)

LBSilUTF - GCATTCCTTGCGAAGTACTGA (1-21), LB_gensil_F - GTATTATACTTTTCAGCTTGGCGAGTT (50-76), LBsilJFl - TGGGGACACTTACACTGCCTTCA (1342-1364), LB_sil_R2 - ATGTTGGTCACCGGGTACGGATCG (1788-1812), LBgensilR- TTCCGATGCTCTTTACCCAATG (2005-2024), LB_SilUT_R - GGTCTCATCTAACTGTGTGATTAG (2036-2059). Определение частичных экзон-интронных последовательностей генов силикатеина-а различных видов губок осуществляли с использованием Sil_Fl и Sil_Rl праймеров, последовательности которых определялись исходя из наиболее консервативных участков силикатеинов L baicalensis, учитывая положения интронов (в скобках указано положение на последовательности кДНК силикатеина-а 1)

Sil Fl - GGTCAGTGTGGCGCTAGCTATGC (385-407), Sil_Rl - CTGTTCTTAACAAGCCAGTAAT (860-881) Полученные индивидуальные ПЦР-фрагменты анализировали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле, экстрагировали с использованием набора "PCR clean-up Gel extraction NucleoSpin Extract П" (Macherey-Nagel) no прилагающейся методике и клонировали в векторе "TOPO ТА Clonmg" (Invitrogen) по методике фирмы Трансформацию Е coli проводили с использованием химически компетентных клеток "ТОРЮ" (Invitrogen) или "Novablue" (Novagen-Merck) Выделение плазмидной ДНК проводили по методике, описанной в "High Pure Plasmid Isolation Kit" (Roche) Наличие вставки фрагмента в плазмиде определяли путем обработки ДНК рестриктазой EcoRI Секвенирование клонов производили на автоматическом ДНК-секвенаторе Li-COR 4200 со стандартными наборами, согласно методике фирмы Amersham Поиск гомологичных нуклеотидных последовательностей в базах данных был проведен с помощью сервера BLAST (http //www ebi.ac uk/blastailA Полученные структуры были проанализированы с использованием пакета программ GeneTools, а также с помощью программы ClustalW 1 8 (Thompson et al, 1997) (http //www ebi ас uk/Tools/clu¡>talwO Сравнение аминокислотных последовательностей и построение филогенетических древ осуществляли с использованием программы Mega 2 по методу ближайшего соседства (neighbor-joining method) (van de Peer, de Wächter, 1994). Для филогенетического анализа также были использованы опубликованные в GenBank (сервер NCBI

http //www ncbi.nlm nih gov/sites/entrez/) нуклеотидные последовательности силикатеинов и катепсинов губок Определение аминокислотных остатков предполагаемого сигнального пептида проводили с помощью программы SignalP (http /''www cbs dtu dk'services/SignalP'") Потенциальные сайты N-

гликозилирования определяли с помощью сервера NetNGIyc 1.0

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование скелета губки под микроскопом

В нашей работе впервые проведены исследования скелета байкальской губки Ь. Ьтса1ет1$ с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ). На электронных фотографиях (рис, 1) детально показано строение скелета I. Ьа1са1ет1$, состоящего из пучков кремнийсодержащих спикул, спаянных между собой органическим веществом спонгином (рис. 1А-С). Слегка изогнутые заострённые спикулы покрыты множеством мелких шипов (рис. 10). На сломах спикул обнаружен центральный канал, имеющий ответвления в местах образования шипиков (рис. 1Е-Р).

Рис. 1. Исследование скелета и спикул байкальской губки L. baicalensis с помощью электронной микроскопии Масштаб. А - 1000 мкм; В. С - 100 мкм; D-F - 10 мкм (А-С) Организация скелета L. baicalensis, состоящего из пучков спикул, склеенных между собой органическим веществом, спонгином; (D-F) Спикулы L. baicalensis, имеющие вид заостренного цилиндра, покрыты множеством шипов (D); в центре расположен центральный канал с ответвлениями, которые соответствуют шипам спикул (Е, F).

Известно, что в центральном канале спикул располагается нить белковой природы (Резвой, 1936), или аксиальный филамент (Simpson et al., 1985), в состав которого входят белки (силикатеины), способные гидролизовать эфиры кремниевой кислоты с образованием аморфного кремнезема (Cha et al., 1999; Shimizu et al., 1998; Krasko et al., 2000).

Для визуального обнаружения белков, находящихся в спикулах L baicalensis, был использован световой микроскоп. Аморфный кремнезём спикул растворяли в плавиковой кислоте и одновоременно окрашивали освобождающиеся белки красителем Кумасси (Coomassie Brilliant Blue) (рис. 2). При наблюдении растворения скелетных элементов в динамике, мы

обнаружили не только аксиальные филаменты, но и множество окрашенных гранул белков (рис. 2А-0). Выяснилось также, что филаменты имеют ответвления, соответствующие локализации шипов спикул (рис. 2Р, О). В случае использования СЭМ расположеишо шипов соответствовали ответвления центрального канала. Таким образом, и световая и электронная микроскопия скелетных элементов указывает на то, что аксиальный филамент определяет форму и архитектуру спикул.

Рис. 2. Световая микроскопия спикул ЬиЬопйгякш Ьшсакпяк при частичном растворении в 6М фториде аммония (МН4К) с одновременным окрашиванием красителем Кумаси. Масштаб: А-С - 100 мкм; 0-0 - 10 мкм. (А-С) Динамика растворения спикул (фотографии отражают процесс растворения каждые 3 минуты). Видны окрашенные аксиальные филаменты спикул, а также множество других гранул белка, освобождающихся при растворении спикул. (О-О) При большем увеличении чётко виден аксиальный филамент и его ответвления (Е, в), определяющие локализацию шипов спикул.

Электрофоретическое разделение белков спикул

Суммарные белки спикул можно сконцентрировать и проанализировать с помощью электрофореза в денатурирующем ПААГ. Препараты белков получали после растворения спикул Ь. Ътса1еп$1$ в плавиковой кислоте и её солях (2 М НР/8 М ЫНдР) с последующим диализом против воды. На геле (рис. 3) виден широкий спектр фракций белка с различными молекулярными массами: несколько близко идущих белков с массой порядка 23-26 Ша, белки с массой около 47 Ша и 62 Ша. Имеется также ряд полос белков с массой менее 16 Ша. Теоретически рассчитанные молекулярные массы зрелого бежа (на основе расшифрованной и транслированной последовательности кДНК) для морских губок составляет 23 Ша, в то время как молекулярный вес предшественника у них незначительно различается и составляет 35,5 Ша для Т. аигапЫа, 36,3 Ша - с1опшпси1а и 37,5 Ша - Р. Аа/оггтз. (ЗЫтша е1 а1., 1998; Кгавко Л а!., 2000; РоггоПт е1 а1., 2004).

к1)а М

ттшт*

83

62 — Я

47.5

32 ШШт

25

16

А

кр

200 - 97 -

55 -

36 —

..а

-Р

-у

21 —

14 —

В

81 -

533731 -

С

Рис. 3. Сравнение элсктрофореграмм белков спнкул различных видов губок. (А) Ь.

Ьшса1епя1$, (В) ТеШуа аигапНа (ЗЫгшги, е! а1, 1998); (С) /¡с1/огт1Х (РоггоНш е1 а!..

2004).

Видно, что состав белков спикул Ь. Ьспса1ет18 существенно отличается от такового морских губок (рис ЗВ, С). Зрелому белку силикатеину, по всей видимости, соответсвуют полосы, располагающиеся на электрофореграмме в районе 23-26 кЭа. Однако, вместо 2-3 белков, обнаруженных для морских губок, у пресноводной ¿. бш'са/ежм мы можем различить до 5 белковых полос различной степени интенсивности. Кроме того, на геле идентифицированы полосы белков с молекулярными массами, не обнаруженными ранее у морских губок: около 47 кОа, около 62 кОа, а также пептиды менее 16 кОа (см. рис. 3). Такой обширный спектр белковых полос нами впервые показан для пресноводных губок на примере Ь. Ьшса1епх1х. Подобный результат мы объясняем несколькими причинами. Во-первых, существованием у пресноводных губок множества силикатеинов (а также других белков), имеющих некоторые различия в аминокислотных последовательностях. Во-вторых, наличием различной степени модификации исследуемых белков.

Определение нуклеотидных последовательностей силикатеинов

Ъшайет'ю

Для поиска и определения нуклеотидных последовательностей силикатеинов в векторе Л.Тпр1Ех2 (ОогНесИ) мы получили библиотеку кДНК эндемичной губки I. Ъа[са1епз18. Это типичный для Байкала единственный ветвистый вид губок, широко распространённый на глубине 5-40 м.

Скрининг кДНК-библиотеки для поиска последовательностей силикатеинов был проведён посредством амплификации суммарной клонированной кДНК со специфическими праймерами (ЬВвПЛ и ЬВбП _г2). В результате мы обнаружили четыре группы ампликонов, различающихся по структуре, но гомологичных силикатеину-а морских губок. 5'- и 3'- концевые

последовательности определялись путем клонирования и последующего секвенирования продуктов амплификации суммарной кДНК библиотеки, полученных с помощью праймеров, комплиментарных характерным участкам группы ампликонов, в сочетании с универсальными 8р6 и Т7 плазмидными праймерами, комплиментарными полилинкерным участкам вектора ?Л'пр1Ех2 В результате было доказано, что губка Ь Ьтсактгв имеет четыре гомологичных гена силикатеина-а Последовательности, гомологичные генам силикатеина-В морских губок нами обнаружены не были Структуры генов депонированы в (ЕМВЬ/ОепВапк) кДНК силикатеина-а 1 под кодом доступа А1872183, силикатеина-а2 - А1872190, силикатеина-аЗ - А1872187, силикатеина-а4 - А1872188 Обнаруженные в библиотеке кДНК последовательности генов силикатеинов Ь Ъаюсйетгз имеют следующую степень гомологии с кДНК силикатеина-а 1 силикатеин-а4 — 78% , силикатеин-а2 - 72%, силикатеин-аЗ - 69%

Определение последовательностей кДНК силикатеинов других пресноводных губок

Для более полного исследования структуры силикатеинов пресноводных губок были определены также нуклеотидные последовательности этих генов у космополитных губок Е тиеИеп и 5 /ясгм?га Для этой цели мы использовали метод обратной транскрипции мРНК и кДНК-ЯАСЕ Полученные данные расширили список последовательностей силикатеинов пресноводных губок В общей сложности мы определили девять полноразмерных последовательностей кДНК силикатеинов, принадлежащих трем видам пресноводных губок

Сравнение аминокислотных последовательностей силикатеинов

Полученные нуклеотидные последовательности транслировали в программе ЕёйБея (пакет программ ОКА81аг), затем провели сравнение аминокислотных последовательностей с опубликованными в вепВапк последовательностями силикатеинов-а морских губок (Б с1отипси1а, Т аигапПа, Р /ш/отия), пресноводной губки Е АшшПкя (Бипауэта, е1 а1, 2005) Результаты сравнения аминокислотных последовательностей, выполненного по программе С1ш1а1\\^, приведены на рис 4 Размеры последовательностей силикатеинов пресноводных губок составляют 326-331 а о, из которых 218 принадлежат зрелым пептидам Нами отмечается высокая консервативность аминокислотных последовательностей силикатеинов пресноводных губок 54% а о пребелков и 68% а о зрелых белков являются консервативными Из рисунка 4 видно, что основные различия у силикатеинов находятся в их.]\[-концевых частях (сигнальный пептид и пропептид), которые отщепляются в процессе созревания белка и, возможно, связаны с транспортом и локализацией силикатеинов в клетках Таким образом, последовательности силикатеинов-а всех губок сохраняют общую структуру высокое сходство С-концевого участка (зрелый белок) и значительная вариабельность ]Ч-концевой последовательности (пропептида)

Т. аиг Е. £±С Н. рег

_Бх1а гИа

5Иа

190 210

#1 # В 1.

-SE^эт:xDCsvpxaш^< -вЕдетюсгурхэннс

-ЗЕЙ1ТИВСЗТЛРУЭШ{<

-ЗЕйОТГОСЗУРУаШ«

-ЗЕдЭТИБСЗУАХОЫНС -ЕЕаттсЕ-тАУошк

-SE'2NIIr>CSVPYaNHGCKGaИMYVAFЪУVVЙlIESVDDGQSYP; -ЕЕОНУЪССг^УОЫНССЕСЕБттаАП^ПГ^ТОКЭаЪОТТЕЗУРГ ГЕЕ2Я1тсЕ1руо1теоснэзым5'ПА1т,утайлэ<зтакЕЕАУРгъэкдЕЕ

ЯШИ

ШШ

'2 а | Е1*

яи

!ЕЕЕУЕГК<ЖСЕЕ !еззгзгшж?2331

¡ЕЗЗУЗЕЙ^КаЗЗ' 'ЕБЕУРУКа СОББ ЖЗЗСЗГОАкоЗЗ'

■БЕБУРУКа !ЕЕЕУЕГКС ВЕЗЗУЗЕЯв

ГБОАЕ ЕИТЕОАЕ БКОТС I ££К№<Яг гкклэ&т екгтео. г зтнзедг

ЕККЬОАУ [£К№0%Б

Е. <1от_ Т. аиг_ Е. £ Н. рег"

250

I

ГОТОБЮУОЕЕ

гок^охрхазЕ, Е0\ЛГКХАЗЭ£Е!ГОЬЬЕА> ГОТТЕХАЗ'—----

13УТ*Г1АГ1 ГЭУУЫАЕ!

гауукггзэзЕ'

ТСШЛ313ХЭЗЕ; ТОАУвХЗУвЗЕ,

зШ аНа зШ Б±1а

КЕКЕУЧЬОЧ^

[агмгкззэу з лтекАгкрхдзау а :ч/Нзвмгхдзау а АЕРГУЗБОТ а АГЕгГУКЕ^! зпягудзву а АГЕГУдЗ^а АП!ГХ(23<эт5

290 #1

беесееткш

ззтсвзткх

взтсзтвкш

ЕЕБС31ТТКЬИ ЕЕТСЕМТКЬИ

гззсзнткш

ЗЗЗСЗЫТУМ»

ззэсзтткх

вЗТСЗЭТК! ЕЕТСЗЗТКЫТ

^1SCЗMVSIKSQSESDLQAAVSNVQFVSVAIDGANSAFRFYYS(ЗVYDSSRCSSSS: МЕвЕ\гд1НЕ9ЕЕЕПЬЕАА'УА1:^вРУА',/А1П(ЗЕЕ1^АГиЕ,УУЕЗ,7УБЕЕЯСЕЕЕЕ! АТ9Г\гТ1ЕЕОВЕЕЕЬЕ£АЪЛТАвР17А'1/У1САЕК£ЕЕ<ЭГУКУ<3\ГЫТ\'Р17СЕКЕК1

330

I

зизкшвБзе: зивкуиаюыа: ЕиетзиэЕзэ: ЕИЗКИКЭП» ЗТТОТЗКЭЕЗС

ЗТ«жоттзбз1

ЕРЭК1ТОЭБ31

ЕиэтаивЕза: еиокуиобео:

ЕИЗКУИОБЗЭ'

[ОсэхазсаНУРМЬ [дсахАЕшЛуЕМЬ [<2СЭ1АЗСАЯурмь дСвХАТИАЗУРТЬ [дСвХАЗС«^1ЕМЬ 'ОСвХАЗОзЯуЕТЪ ОСаХАЗОЕЦУРТЬ

з. ¿сш^Па тахэзхвд

т. аиг_БИа ТОУвХЕНЫдЕХ

Е. fi.C__si.la 13МТТЕЕКМКЬЪК

Н.рег_БИа ТвХвТУАЙК

■дСОХАЕПАрУРМЬ

ОСЗХАЕПАЯУЕМЬ ОсахАЕрАцузмь £ИОТИИаЫЗаУШ-1МАИТКУН2Са1АТТ)АЕУРТЬ .ЗИеЕКИвЕЬаУЛГКМАКЫКУНОСЭХАЕОАЕХРТЬ 3'9^ЭЕСТ»а13Э11КМЗКеМЗ№Са1АТ1АЕЕЕТЬ зизтииадзауцммйкакумосахАтпАЕУЕтх.

--------1

Рис. 4. Сравнение аминокислотных последовательностей силикатеинов пресноводных и морских губок, выполненного по программе Ош^аЦУ. На схеме представлены силикатеины пресноводных губок: Ь. Ьеассйепзгз (Ь.Ьайс-а1, -а2, -аЗ, -а4); 5. ¡апиЫ* (8.1аси8_1, 2, 4); Е. тиеИеп (Е.тие11_1, 2); Е. /7ну/айЙ1 (Е.Яиу_8Й); морских губок: сЬтиси1а (8.<1от_я1а); Т. аигапИа (Т.аиг вйа); Р./гс1/огти (Р.ЯсвМа); Н. рег1еу15 (Н.регзПа). Аминокислотные остатки, консервативные для всех последовательностей, выделены светлосерым цветом. Тёмно-серым цветом отмечены остатки, которые остаются консервативными у пресноводных губок, но могут изменяться у морских. Предсказанные последовательности

сигнальных пептидов подчеркнуты Участок, соответствующий зрелому белку, отмечен на схеме зеленым блоком под всеми последовательностями Желтыми блоками обозначены сериновые кластеры, красными - аминокислотные остатки активного центра силикатеина Ser(156), His(296), Asn(316) Значком (#) отмечены позиции цистеинов Аминокислоты, характерные для определенных участков последовательностей силикатеинов пресноводных губок (и отсутствующие в этих сайтах у морских губок), отмечены синими блоками и значком (*)

У всех пресноводных губок сохраняются аминокислоты активного центра силикатеина Ser(156), His(296), Asn(316), причем все они содержат в активном центре Ser вместо Cys, характерного для катепсина L Мы обращаем особое внимание на наличие в последовательностях пресноводных губок остатков аминокислот (13 а о), которые характерны для определенных участков исследуемых белков только пресноводных губок (на рис 4 отмечены синими блоками) Силикатеины морских губок в этих сайтах имеют другие а о По всей видимости, инвариантные для пресноводных губок а о играют важную роль в определении биологической активности силикатеинов именно этой группы губок В последовательностях силикатеинов как пресноводных, так и морских губок, мы обнаружили, сериновые кластеры (на рис 4 они выделены желтым цветом) По мнению Shimizu et al (1998), наличие в последовательности белка участков, богатых серинами, является характерным отличием силикатеинов от катепсинов Было выделено два участка аминокислотных последовательностей силикатеинов, богатых серинами на схеме это область между 218 - 239, и 281 -299 а о (см рис 4) В последовательностях силикатеинов пресноводных губок полностью сохраняются и позиции шести цистеинов (значек #), которые, очевидно, принимают участие в образовании дисульфидных мостиков, определяющих нативную конформацию белка

Известно, что необходимым этапом посттрансляционной модификации катепсинов является гликозилирование (Turk, 2001, Mort, 2002) Анализ последовательностей силикатеинов пресноводных губок (программа NetNGlyc) выявил наличие потенциального сайта N-гликозилирования Asn-X-Ser/Thr (Албертс и др, 1993) у шести из десяти последовательностей Не было обнаружено сайтов гликозилирования в последовательностях L baicalensis sil-аЗ,S lacustris sil (1) и sil (4), E muelleri sil (1) Поскольку посттрансляционное фосфорилирование показано для белков, вовлеченных в процессы биоминерализации (силаффины диатомовых водорослей) (Kroger et al, 2002), для силикатеинов и катепсинов губок мы определили количество потенциальных сайтов фосфорилирования — гидрокси-содержащих а о серина, тирозина, треонина У зрелых силикатеинов пресноводных губок эти а о составляют 26% У силикатеинов морских губок таких а о - 25%, у катепсинов губок — 22% Значения pi зрелых белков пресноводных губок находится в пределах 5 2-5 7, силикатеины морских губок отличаются более вариабельными значеними pi — 4 8-7 9, значения pi катепсинов губок составляет 5 0-7 2

На основе сравнения полных аминокислотных последовательностей силикатеинов методом ближайшего соседства было построено

филогенетическое древо (рис. 5). На рисунке видно, что пресноводные губки отделены от морских в отдельный кластер. Силикатеины пресноводных губок образуют группы гомологичных последовательностей, формирующие разные ветви древа. В каждую группу входит один из четырёх генов силикатеина-а Ь. Ъшса1ет1$. Не образует группу только силикатеин-а1. Приведённые данные говорят о том, что в процессе эволюции силикатеинов пресноводных губок вначале произошла дупликация этих генов, а затем образование новых видов. Очевидно, предок современных пресноводных губок уже обладал, по меньшей мере, четырьмя генами силикатеина-а.

Рис. 5. Филогенетическое древо, построенное методом ближайшего соседства на основе анализа полных амнокислотных последовательностей генов силикатеина-а морских и пресноводных губок В качестве аутгруппы взята последовательность катепсина L S. domuncula. Перед названиями видов, последовательности которых взяты из GenBank, указаны соответствующие коды

Анализ организации экзон-интронной структуры генов силикатеинов

На основе известных последовательностей кДНК четырёх силикатеинов L. baicalensis мы осуществили дизайн набора праймеров, амплификацию геномной ДНК, клонирование ампликонов и определение их нуклеотидных последовательностей. В результате нам удалось обнаружить и определить полноразмерные экзон-интронные последовательности соответствующих генов. Общие размеры этих генов составили: силикатеин-al — 1988 п.н.; -а2 -1668 п.н.; -аЗ — 1657 п.н.; -а4 - 1540 п.н (см. рис. 5). Мы установили, что число интронов (и, соответственно, экзонов) у всех обнаруженных генов остаётся постоянным: 7 экзонов и 6 интронов, при этом их суммарные длины не намного отличаются друг от друга. Для структуры генов катепсина L характерно 7 интронов и 8 экзонов (Mort, 2002). На рис. 6 видно, что длина интронов

98

100

AJ784224 S.domuncu!a(cathepsin L)

варьирует как у различных генов, так и в пределах одного гена (от 47 до 378 п.н.). Длина же соответствующих экзонов остаётся постоянной практически во всех случаях (исключение составляет первый и второй экзоны силикатеина-аЗ).

Ltibamirskia baicalensis

Гены

силнкагенны:

sil ni

(|'№8л II.)

sil <х2 (1668 п.н.)

кДНК(98| п.н.)

231 153 ИЗ 119 133 119 100

т 11Í U 68

203 62

sil аЭ

(1657 IUI.)

79 7Í 123 102 7>

sil а4

(1540 пн.]

Рис. 6. Схема экзон-интронной структуры генов силикатеинов L. baicalensis (sil-al, -a2, -a3, -а4). Чёрными блоками обозначены интроны, с указанием их размера (снизу) и порядка локализации в последовательности гена (сверху). Серыми блоками обозначены экзоны, размеры их последовательностей указаны сверху.

На основе консервативных участков последовательностей кДНК силикатеинов L. baicalensis с учётом позиций интронов в исследуемых генах, были определены структуры пары «универсальных» праймеров, получены продукты амплификации и определены нуклеотидные последовательности фрагментов генов силикатеина-a ещё шести видов пресноводных губок (рис. 7). С использованием программы Mega 2 нам удалось соотнести определённые последовательности силикатеинов с известными для L. baicalensis группами силикатеинов-а. Наиболее представленным здесь оказался силикатеин-а4, который был обнаружен у всех видов губок (6 последовательностей). У трёх видов (S. lacustris, В. intermedia и L. incrustans) были обнаружены последовательности силикатеина-al. У одного вида - В. dzhegatajensis -силикатеин-аЗ (см. рис. 7).

L. baicalensis

201 tu TIS 110 153 119 100

t.....:,-;r ; i t -1 - л а

B. intermedia

L. incrustam

ul a4

153 шш"s 604 ~ » ........ 71

B. dzhegatajensis

a4 a3

usäwoJLMJ JL„s

f ......."H' **

SS « 98

11sJILl1oJ}L 153

ncdBfc. .ЛИ;.':,'.- 1ИЯ :::

62 75 171

E. mueüeri

S. lacusths

cx4

a4

.S', papyracea a4

Рис. 7. Экзон-ингроииаи структура фрагментов генов силикатеинов эндемичных и космополитных пресноводных губок. Чёрными блоками обозначены нитроны, с указанием их размера (снизу) и порядка локализации в последовательности гена (сверху). Серыми блоками обозначены экзоны. размеры их последовательностей указаны сверху. Стрелки обозначают позиции «универсальных» праймеров на полной последовательности силикатеина-а 1 ¿. йа/са/едай, с помощью которых были определены нуклеотидные последовательности фрагментов генов шести видов пресноводных губок.

При сравнении всех полученных последовательностей с привлечением данных СепВапк было построено филогенетическое древо. В анализе были использованы восемь пресноводных губок (всего 20 последовательностей фрагментов силикатеинов). В качестве аутгруппы была взята последовательность катепсина Ь морской губки 5. с1отипси1а (рис. В).

-БМ&твйШ)

¡&

• 1Ьак(1епьЬ{а4) .отлагаии?)

ЕживОег!0} ■— $.'юстпЫ2) ЕЬ1-В.Ьпвив(4)

ЗМШ1ГЕ0) А Е.Ьа&ашаЫа!)

ТЕ I-Л ¡глегтейкт'!}

• 1.Ьасакюя<'(й) Е.тие1Ш(1) 93 >лт195?ЗЕ/и№ШЬ ■ З'шсшшй) -• ЫЫсактЫаЗ)

<*4

о1

х! А т

«2

П

Р с с н о в о Д я ы е

г

У б к я

аЗ

ШЕмшШ(1)

-АЛ720П ¡.¿отипсикКИ а)

-ЛЛВЗии? ¡.аипттви а)

-АУ158071 Р.рсфт&Г&а)

Морские губки

-ЛЛ84224 З^оттсикЛаНщиЛ!)

Рис. 8. Филогенетическое древо, построенное методом ближайшего соседства на основе анализа фрагментов аминокислотных последовательностей генов силикатеина-а морских и пресноводных губок. Силикатеины-а /. ЪтаЛетхз обозначены значком (•). Блоками справа отмечены группы последовательностей, соответствующие четырём силикатеинам Ь. Ьтса1ет15, а также морские губки. В качестве аутгруппы взята последовательность катепсина Ь 5. с1отипси1а. Перед названиями видов, последовательности которых взяты из ОспВапк, указаны соответствующие коды.

На древе последовательности силикатеинов вновь объединены в группы с четырьмя силикатеинам-а Ь. Ьмсактгя (-а1, -а2, -аЗ и -а4). При этом наиболее многочисленной является ветвь, в которую входит силикатеин-а4: девять последовательностей. Примечательно, что три из них принадлежат 5. 1асшМя. В другие группы вместе с известными силикатеинами Ь. Ьшса1ет1Н объединяются от трёх до четырёх последовательностей различных видов пресноводных губок. Таким образом, мы обнаружили, что в геноме пресноводных губок присутствует от 1 до 5 последовательностей силикатеинов-а. Хотя ни у одного из исследованных видов мы не обнаружили всего набора силикатеинов, имеющихся у Ь. Ьмсакпягя, ясно, что для пресноводных губок характерна множественность этих генов.

Масс-спекгрометрическое изучение белков спикул губки Ь. Ьтса1еп,ш

Для доказательства присутствия белков обнаруженных генов в спикулах губок, мы провели расщепление белков спикул Ь Ъагссйетгз трипсином и проанализировали молекулярные массы пептидов, образовавшихся после трипсинолиза на масс-спектрометре МХ 5303, оборудованном электрораспылительным источником ионизации и времяпролетным масс-анализатором I Ьагсакгтз была использована нами для этих целей, поскольку у этой губки найдено наибольшее число силикатеинов и определены их полные последовательности На основании полученных данных был сделан вывод, что в составе анализируемой пробы присутствуют силикатеины-а1, -а2 и -а4, поскольку именно этим белкам соответствуют индивидуальные сигналы в масс-спектре Для силикатеина-а1 идентифицировано 5 индивидуальных сигналов, для силикатеина-а2 - три сигнала, для силикатеина-а4 - два сигнала Индивидуальных сигналов пептидов силикатеина-аЗ не обнаружено В таблице 1 в качестве примера приведены результаты поиска силикатеина-а1 показаны теоретические и измеренные молекулярные массы пептидов — продуктов трипсинолиза суммарных белков, возможные модификации пептидов и их аминокислотные последовательности Таким образом, мы подтвердили присутствие в белках спикул губки Ь Ьтссйети трех из четырёх известных белков силикатеина-а

Таблица 1. Результаты масс-спектрометрического анализа силикатеина-а!

Масса, кДа Модификация Позиция Пептид

теоретич найденная

1425 58 1426 67 - 1427 63 Ме^ох 298-309 ШГОВЭОУТЬМУК.

1409 56 1410 68- 141163 298-309 ^оозотмук

1786 60 1787 74 - 1788 89 255-270 гУ(380УН5888С88ТК

1893 71 1894 87 - 1896 03 185-201 УУГОШСГОТЕЗЗУЗРК

1957 73 1958 89 - 1960 24 310-326 ж тасзсетАЭ о аь темь

1973 73 1974 83 - 1976 01 Р04 185 201 УУЮШОЮТЕЗЗУЗЖ

2078 78 2079 98 - 2081 25 185-203 УУЮШСГОТЕЗБУЗРКОК

2349 93 235106-2352 54 Р04 293-311 NSWSKNWGDSGYПJMVrRNK

2528 04 2529 26 - 2530 92 271-292 ЬШАМЬУТОУ08УЖгКВУ\У ЬУК

2692 02 2693 21 - 2694 91 127-153 У<30<2С0А8УАЕААТСАЬЕ0А БАЬАМЖ

20

ВЫВОДЫ

1 Определены последовательности генов и кДНК силикатеинов 7 видов пресноводных губок семейств Spongilndae и Lubomirskiidae Показано, что пресноводные губки имеют множество генов белка сшшкатеина-а

2 У эндемичной байкальской губки L baicalensis обнаружены четыре гена белка силикатеина-а (-al, -а2, -аЗ и -а4) Для всех генов определены полные последовательности кДНК и экзон-интронная структура генов В геноме других пресноводных губок обнаружены от 1 до 5 генов силикатеина-a Установлена консервативность локализации интронов этих генов и размера экзонов у большинства из них

3 Проведен анализ транслированных последовательностей генов, в результате которого выявлена высокая консервативность С-концевого домена зрелых белков силикатеинов и найдены характерные для всех пресноводных губок аминокислотные замены

4 Методом масс-спектрометрического анализа показано, что в составе спикул L baicalensis имеются, по крайней мере, 3 силикатеина-а

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Kaluzhnaya O.V, Belikov SI, Muller W E.G Seasonal variation of the sihcatem content in the spicules of the endemic Baikalian sponge Lubomirskia baikalensis // Int Symposium 'The Living Diatom Cell' Abstracts. Irkutsk, 2004. P. 48-49.

2. Kaluzhnaya О V, Belikov S I, Schroder H -С, Rothenberger M, Zapf S , Kaandorp J A , Borejko A, Miiller IM , Muller W E G Dynamics of skeletal formation in the Lake Baikal sponge Lubomirskia baicalensis Part I Biological and biochemical studies //Naturwissenschaften 2005 V. 92 №3 P 128-133

3 Kaluzhnaya О V, Belikov S.I, Schroder H.-C , Wiens M, Giovine M, Krasko A, Muller I.M., Muller W E G Dynamics of skeletal formation m the Lake Baikal sponge Lubomirskia baicalensis Part II Molecular biological studies //Naturwissenschaften 2005 V 92 №3 P 134-138

4 Belikov SI, Kaluzhnaya O.V, Krasko A, Muller IM, Muller WEG. Expression of silicatein m spicules from the Baikalian sponge Lubomirskia baicalensis//Cell Biology International 2005 V 29 P 943-951

5 Kaluzhnaya O.V, Muller W E G, Belikov SI Determination of gene structure of sihcatem in deposition of biogenic silica m spicules of Baikal sponge // International workshop 'Biosphere origin and evolution' Abstracts Novosibirsk 2005. P 174

6 Калюжная О В , Беликов С И, Девятайкина Е.А, Мюллер В Е Г Разработка системы амплификации фрагментов генов силикатеина-А байкальских губок // Четвертая Верещанинская Байкальская конференция Тезисы докладов и стендовых сообщений Иркутск 2005 С 18-19.

7 Калюжная О В , Беликов С.И, Мюллер В Е Г., Красько А Г Изучение структуры и организации семейства генов белка силикатеина-А байкальских губок // Четвертая Верещанинская Байкальская конференция. Тезисы докладов и стендовых сообщений. Иркутск. 2005.

8. Müller W.E.G, Belikov SI, Kaluzhnaya О V, Rothenberger M, Schröder Н.-С, Reiber А, Kaandorp J А, Manz В., Mietchen D, Volke F Magnetic resonance imaging of the siliceous skeleton of the demosponge Lubomirskia baicalensis // Journal of Structural Biology 2006 V. 153. P 31-41

9. Wiens M, Belikov SI, Kaluzhnaya ОV, Krasko A., Schroder H.-C, Petrovic-Ottstadt S, Muller W.E G Molecular control of serial module formation along the apical-basal axis in the sponge Lubomirskia baicalensis. silicatems, mannose-bindmg lectin and mago nashi // Dev Genes Evol 2006. V 216 № 5 P. 229-242

10.Wiens M, Belikov SI, Kaluzhnaya O.V., Schroder H-C, Hamer В., Petrovic-Ottstadt S, Borejko A, Luthringer В , Muller I.M, Muller W E.G Axial (apical-basal) expression of pro-apoptotic and pro-survival genes in lake Baikal demosponge Lubomirskia baicalensis // DNA and Cell Biology, V 25 №3 P 152-164.

11.Kaluzhnaya О V, Belikov SI, Krasko A, Schröder H -C , Müller^ WEG Study of the structural and organization of gene family of silicatein-alpha protein in Baikal sponge // 7th International Sponge Symposium Abstracts. Rio de Janeiro 2006. P 156

12.Belikov SI, Kaluzhnaya О V, Burlakova О О., Krasko A., Schroder H -C , Müller W E.G Silica biominerahzation in freshwater sponges- silicateins are the major organic components of spicules // 19th International Diatom Symposium: Abstracts Listvyanka 2006. P 121.

13 Muller W.E.G., Schroder H.-C., Werde P., Kaluzhnaya O.V., Belikov S I Speciation of sponges in Baikal-Tuva region an outline // JZS 2006 V 44 № 2. P. 105-117.

14 Muller WEG, Belikov SI, Kaluzhnaya O.V, Petrovic-Ottstadt S, Fattorusso E., Ushijima H, Anatoli Krasko A, Schroder H -C Cold stress defense in the freshwater sponge Lubomirskia baicalensis. Role of okadaic acid produced by symbiotic dinoflagellates // FEBS Journal 2007 V. 274 № 1. P. 23-36

15.Калюжная O.B, Беликова А С, Подольская Е П, Красько А Г., Мюллер В Е. Г, Беликов С И Идентификация силикатеинов пресноводной губки Lubomirskia baicalensis JJ Молекулярная биология 2007. Т 41 №4 С 616-623.

С 92-93

Соискатель.

Калюжная О В

Список сокращений

а о - аминокислотный (ые) остаток (ки) ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота SDS - додецилсульфат натрия ПААГ - полиакриламидный гель пн - пар нуклеотидов ПЦР — полимеразная цепная реакция Рис -рисунок

РНК - рибонуклеиновая кислота

СЭМ - сканирующий электронный микроскоп

Табл -таблица

Sil - силикатеин

Cath - катепсин

Подписано в печать 04 10 07 Формат 210x1471/16 Бумага писчая белая Печать RIZO Уел печ.л 1 6 Отпечатано в типографии «Академкопия», ИП Овсянвшсов А А Тираж 100 экз Заказ № 38

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Калюжная, Оксана Викторовна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Кремний и кремнийсодержащие организмы 1 о

1.2. Губки - древнейшие многоклеточные организмы с кремниевым скелетом

1.3. Молекулярные основы биосилификации

1.4. Силикатеины - представители семейства папаин-подобных цистеиновых протеаз

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Исследование скелета губки под микроскопом

3.2. Электрофоретическое разделение белков спикул

3.3. Определение последовательностей кДНК силикатеинов Ь. Ъшса1еп

3.4. Определение последовательностей силикатеинов других пресноводных губок

3.5. Сравнение аминокислотных последовательностей силикатеинов

3.6. Анализ организации экзон-интронной структуры генов силикатеинов

3.7. Масс-спектрометрическое изучение белков спикул 80 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 83 ВЫВОДЫ 84 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Поиск и исследование силикатеинов пресноводных губок"

Актуальность проблемы. Процесс биосилификации, или биологического формирования аморфного кремнезёма, довольно широко распространён в природе. Усваивать неорганический кремнезём из окружающей среды способны некоторые простейшие, диатомеи, губки, моллюски и высшие растения (Shimizu et al., 1998; Bavestrello et al., 2003; Patwardhan, Clarson, 2002). Но только губки (тип Porifera), единственные из современных многоклеточных организмов, способны строить из кремния свой скелет.

Проблема формирования кремниевого скелета губок интересует учёных во всём мире. Однако до недавнего времени объектами их исследования являлись преимущественно морские губки. В спикулах морских губок, после растворения их в плавиковой кислоте или ее солях, были найдены белки, обладающие ферментативной активностью и способные гидролизовать эфиры кремниевой кислоты с образованием аморфного кремнезёма (Shimizu et al., 1998; Cha et al., 1999; Krasko et al., 2000; Weaver, Morse, 2003). Эти белки получившие название силикатеины, входят в состав аксиального филамента - центральной «нити», вокруг которой происходит отложение кремнезёма и формирование скелетных элементов губок - кремниевых игл, или спикул. Силикатеины - белки, гомологичные цистеиновой протеазе катепсину L. Основным отличием силикатеинов является наличие в активном центре остатка серина, вместо остатка цистеина - у катепсина L (Shimizu et al., 1998; Cha et al., 1999; Krasko et al., 2000; Morse et al., 2003). Известные на данный момент последовательности силикатеинов морских губок принадлежат к 2 классам: более распространенным является силикатеин-а, для двух видов губок было показано также наличие второго силикатеина - силикатеина-р (Shimizu et al., 1998; Cha et al., 1999; Krasko et al., 2000). Для лучшего понимания механизма действия силикатеинов актуальным является исследование их структуры у различных морских и пресноводных губок. Пресноводные губки представляют особый интерес в связи с тем, что они являются эволюционно более молодой группой, по сравнению с морскими губками. Пресноводные губки образовались, вероятно, около 150 млн. лет назад в позднемеловую (Early Cretaceous) эпоху, в то время как морские губки образовались ранее, не менее 600 млн лет назад, в Прекембрии (Early Vendían) (Li et al., 1998; Dunagan, 1999).

В настоящей работе объектом исследований являются силикатеины пресноводных губок, принадлежащих к двум семействам: космополитному -Spongilliidae и эндемичному - Lubomirskiidae. В состав последнего семейства входят губки, обитающие в озере Байкал, а также единственный вид Baikalospongia dzhegatajensis, живущий в озере Чагытай (республика Тыва).

Большинство представителей семейства Lubomirskiidae, по сравнению с космополитными губками, отличаются массивными размерами и скелетом. Так, кремнероговой скелет широко распространённой в Байкале губки, Lubomirskia baicalensis, достигает размеров 1.5 м. Байкальские губки способны обитать в широком диапазоне глубин: от 3 до 900 м (Абрамов и др., 1979; Вейнберг, 2001), а на глубине 5-40, метров они покрывают каменистое дно озера сплошным ковром. Таким образом, эти эндемичные губки, по всей видимости, имеют особенности, которые позволили им развить мощный скелет и расселиться по всему дну Байкала.

Для сравнительного исследования силикатеинов, в работу были включены космополитные губки семейства Spongilliidae, принадлежащие к родам Ephydatia и Spongilla. Кроме того, использовались последовательности силикатеинов морских губок, опубликованные в генетических банках данных.

Цель исследования. Определение и сравнительный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей силикатеинов космополитных и эндемичных пресноводных губок. Задачи исследования:

1. Определить полные последовательности кДНК силикатеинов байкальской губки L. baicalensis и космополитных губок Ephydatia muelleri и Spongilla lacustris.

2. Проанализировать экзон-интронную структуру генов силикатеинов из геномной ДНК губок семейств Spongilliidae (Е. muelleri, S. lacustris) и Lubomirskiidae (L. baicalensis, L. incrustans, Baikalospongia intermedia, B. dzhegatajensis, Swartschewskia papyracea).

3. Провести анализ транслированных аминокислотных последовательностей генов силикатеинов.

4. Установить наличие белков, кодируемых соответствующими генами силикатеинов, в спикулах губки.

Научная новизна. В настоящей работе впервые для пресноводных губок показано наличие в их геноме множества генов силикатеина-а. Для эндемичной байкальской губки L. baicalensis определены полноразмерные последовательности четырёх кДНК силикатеинов и экзон-интронные последовательности всех обнаруженных генов. У других видов пресноводных космополитных и эндемичных губок также обнаружено от 1 до 5 различных генов силикатеина-а. Установлена консервативность локализации интронов и размера экзонов у большинства из этих генов. Проведён анализ транслированных последовательностей генов, в результате которого выявлена высокая консервативность С-концевого домена зрелых белков силикатеинов. Обнаружено, что в определённых участках последовательностей белков пресноводных губок находятся характерные консервативные аминокислотные остатки. Проведён массспектрометрический анализ белков спикул губки L. baicalensis, в результате которого в составе спикул обнаружено три белка силикатеина-а.

Практическая значимость работы.

Силикатеины являются потенциально важными ферментами для многочисленного использования в медицине и технологии, например, для модификаций поверхностей стёкол, получения силиконовых резин, пластмасс, микро-решеток и катализаторов. Интересующие исследователей поверхности, например, содержащие коллаген могут быть модифицированы пришивкой на них силикатеина с последующим отложением на этих поверхностях кремнезема с целью использования в виде заменителей костей при протезировании. Преимущество такого подхода обусловлено тем, что отложение кремнезема происходит при мягких физиологических условиях, в то время как обычные физико-химические методы модификации поверхностей требуют высоких температур и давлений, и щелочной среды, что может разрушать органические подложки. Использование кремнезема, привитого с помощью силикатеина на металлические поверхности, также может быть полезно для получения имплантатов с уменьшенной способностью к отторжению. Рекомбинантный силикатеин может быть использован для получения как нано- так и микроструктур кремнезема с заданными свойствами, необходимыми в качестве добавки к пластмассам, к покровным и красящим материалам, как наполнители резин, как основа для катализаторов и адсорбентов. Кроме того, с помощью силикатеинов могут быть получены материалы с заданной прочностью, определенными размерами пор и площадью поверхности, которые необходимы для использования в методах сепарации (Sarikaya et al., 2003; Sun et al., 2004; Kim et al, 2004).

Внедрение в практику. Полученные нуклеотидные последовательности генов депонированы в международный компьютерный банк данных GenBank.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Пресноводные губки имеют множество генов силикатеина-а.

2. В структуре генов силикатеинов пресноводных губок имеется 6 интронов различной длины и строгой локализации.

3. Белковые последовательности силикатеинов пресноводных губок отличаются характерными для определённых позиций аминокислотными остатками.

4. В спикулах пресноводной губки L. baicalensis локализовано, по меньшей мере, три белка силикатеина-а.

Личный вклад соискателя. В основу диссертации положены исследования, выполненные автором в лаборатории аналитической биоорганической химии Лимнологического института СО РАН (г. Иркутск) и в лаборатории молекулярной биологии Института физиологической химии Университета им. И. Гутенберга (г. Майнц, Германия) в период с 2004 по 2006 гг. Определение нуклеотидных последовательностей генов и их анализ, а также электрофорез белков спикул в акриламидном геле проводились автором самостоятельно под руководством к.б.н. Красько Анатолия Геннадьевича, д.б.н., проф. Беликова Сергея Ивановича, доктора биологии, проф. Мюллера Вернера Эрнста.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены: на международной конференции "Живые клетки диатомей" ("The living diatom cells", Иркутск, 2004), на международном рабочем совещании «Происхождение и эволюция биосферы» (Новосибирск, 2005), на Четвёртой Верещагинской Байкальской конференции (Иркутск, 2005), на VII международном симпозиуме по губкам ("7th International Sponge Symposium", Rio de Janeiro, 2006).

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 15 работ, из них 9 статей в реферируемых журналах.

Структура и объём работы. Диссертационная работа состоит из введения, трёх глав, заключения, выводов, списка литературы и 6 приложений. Работа изложена на 120 страницах, иллюстрирована 9 рисунками и 3 таблицами. Список литературы содержит 135 наименований, в том числе 102 на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Калюжная, Оксана Викторовна

ВЫВОДЫ

1. Определены последовательности генов и кДНК силикатеинов 7 видов пресноводных губок семейств 8роп§Пнс1ае и ЬиЬогшгБкнсЬе. Показано, что пресноводные губки имеют множество генов белка силикатеина-а.

2. У эндемичной байкальской губки Ь. ЪагсаЫти обнаружены четыре гена белка силикатеина-а (-а1, -а2, -аЗ и -а4). Для всех генов определены полные последовательности кДНК и экзон-интронная структура генов. В геноме других пресноводных губок обнаружены от 1 до 5 генов силикатеина-а. Установлена консервативность локализации интронов этих генов и размера экзонов у большинства из них.

3. Проведён анализ транслированных последовательностей генов, в результате которого выявлена высокая консервативность С-концевого домена зрелых белков силикатеинов и найдены характерные для всех пресноводных губок аминокислотные замены.

4. Методом масс-спектрометрического анализа показано, что в составе спикул Ь. ЪтссАетЬ имеются, по крайней мере, 3 силикатеина-а.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

До настоящего времени силикатеины были исследованы лишь у морских губок. В данной работе мы впервые показали, что в геноме эволюционно более молодой группы пресноводных губок также имеются гены силикатеинов, а в спикулах губок - соответствующие белки. Однако, если у морских губок расшифрованы последовательности кДНК, двух белков: силикатеина-а и -В, то в геноме различных видов пресноводных губок нам удалось обнаружить до пяти генов, гомологичных силикатеину-а морских губок. При сравнении с АК последовательностями силикатеинов морских губок, у пресноводных губок мы выявили ряд особенностей: в определённых участках последовательностей пресноводных губок имеются 13 характерных консервативных а.о.; несколько различается локализация сериновых кластеров; АК последовательности силикатеинов отличаются высокой гомологией (67-99%) и близкими значениями р1 (5.2-5.7); у зрелых белков выше количество гидроксил-содержащих аминокислот -потенциальных сайтов фосфорилирования. Для силикатеинов пресноводных губок отмечена также высокая консервативность С-концевого домена зрелых белков и значительная вариабельность И-концевых последовательностей. Вместе с тем у силикатеинов морских и пресноводных губок сохраняются неизменными а.о. активного центра, а также позиции цистеинов, по-видимому, определяющих конформацию белка. Кроме того, нами определена экзон-интронная структура силикатеинов пресноводных губок и установлено, что различные по длине интроны имеют строгую локализацию в последовательностях генов, длины же экзонов сохраняются неизменными.

Данные нашего исследования представляют большой интерес, поскольку знания о механизмах усвоения и метаболизма кремния являются важными для потенциального применения в медицине и нанотехнологии. Следующим этапом работы может стать сравнительное изучение активности рекомбинантных сликатеинов морских и пресноводных губок.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Калюжная, Оксана Викторовна, Владивосток

1. Глинка Н.Л. Общая химия: Учебное пособие для вузов / Под ред. А.И.Ермакова.- изд. 30-е, исправленное. М.: Интеграл-Прес, 2002. 728 с.

2. Грачев М.А. О современном состоянии экологической системы озера Байкал.

3. Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2002. 156 с. Догель В.А. Зоология беспозвоночных: Учебник для ун-тов / Под ред. проф. Полянского Ю.И. 7-е изд., перераб. И доп. - М: Высш. Школа, 1981. 606 с.

4. Ефремова С. M. Новый род и новые виды губок сем. Lubomirskiidae Rezvoj, 1936. Том 1. Озеро Байкал. Книга 2 // Н.: Наука, 20016. С. 208.

5. Жанаева С.Я., Алексеенко Т.А., Г.А. Шкурат, Короленко Т.А. Изучение связи между эффективностью противоопухолевой терапии и активностью цистеиновых протеаз в ткани лимфосаркомы LS мышей // Биллетень СО РАМН. 2007. №1 (123). С. 84-87.

6. Жимулёв И.Ф. Современные представления о структуре гена у эукариот // Соросовский образовательный журнал. 2000. Т. 6. № 7. С. 17-24.

7. Жимулёв И.Ф.тОбщая и молекулярная генетика: Учеб. пособие.- 2-е изд., испр. и доп.- Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2003. 479 с.

8. Ицкович В.Б., Беликов С.И., Ефремова С.М., Масуда Й. Изучение филогенетических связей пресноводных губок Байкала методом анализа структур гена 18S рРНК // Сиб. экол. журн. 1999. № 6. С. 639 -643.

9. Кожов М.М. Биология озера Байкал / отв. ред. Галазий Г.И. М.: Изд-во Академии Наук СССР. 1962. 315 с.

10. Колесников М.П. Формы кремния в растениях 7/ Успехи биологической химии. 2001. Т.З. С. 301-332.

11. Коничев A.C., Севастьянова Г.А. Молекулярная биология: Учеб. для студ пед. вузов.- М.: Изд. центр «Академия», 2003. 400 с.

12. Короткова Г.П., Анакина Р.П., Ефремова С.М. Морфогенезы у губок // Тр. БиНИИ ЛГУ. Л.: Изд-во Ленингр. Ун-та, 1981. № 33. С. 93-107.

13. Мартинсон Г. Г. Проблемы происхождения фауны Байкала // Зоол. Журнал. 1967. Т. 46. №10. С. 1594-1598.

14. Остерман JI.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М.: Наука, 1981.288 с.

15. Офицеров E.H. Кремний в биосфере // Химия и жизнь. 2002. № 7. С. 32-35.

16. Патрушев Л.И. Экспрессия генов. М.: Наука, 2000. 527 с.

17. Резвой П. Д. Пресноводные губки (Сем. Spongillidae и Lubomirskiidae) // Фауна СССР. М.: Изд-во АН СССР, 1936. Т. 2, вып. 2. 124 с.

18. Резвой П. Д. Пресноводные губки (Сем. Spongillidae и Lubomirskiidae) // Фауна СССР. М.: Изд-во АН СССР, 1936. Т. 2, вып. 2. 124 с.

19. Тимошкин О. А., Мазепова Г.Ф, Мельник Н.Г. и др. Атлас и определитель пелагобионтов Байкала (с краткими очерками по их экологии). Н.: Наука, 1995. С. 14.

20. Тимошкин O.A. 2001. Аннотированный список фауны озера Байкал и его водосборного бассейна. Т. 1. Книга 1. Новосибирск: Наука. С. 179-192.

21. Ходоровская Н.И., Стурова М.В. Исследование влияния концентраций кремния и фосфора на развитие диатомовой микрофлоры водоёма // Известия Челябинского научного центра. Вып. 2. № 15. 2002. С. 50-53.

22. Ченцов Ю.С. Общая цитология: Учебник.- 3-е изд., перераб. и доп.- М.: Изд-во МГУ, 1995.384 с.

23. Шимарев М.Н., Домышева В.М. Климат и многолетняя динамика содержания кремния в водной толще озера Байкал // Геология и геофизика, 2004. Т.45. №3. с. 310-316.

24. Шульц Г., Ширмер Р. Принципы структурной организации белков. М.: Мир, 1982. 349 с.

25. Шкатаржик К.А. География Республики Тува. Кызыл: Тувинское книжное издательство, 1993. 128 с.

26. Якубке Х.-Д. Ешкайт X. Аминокислоты, пептиды, белки. М.: Мир, 1985. 456 с.

27. Barrett A.J. Classification of peptidases // Methods Enzymol. 1994. V. 244. P. 115.

28. Barrett A.J., Rawlings N.D. Evolutionary lines of cysteine peptidases // Biol. Chem. 2001. V. 382. P. 727-733.

29. Bidle K.D., Manganelli M., Azam F. Regulation of oceanic silicon and carbon preservation by temperature control on bacteria // Science. 2002. V. 298(5600). P. 1980-1984.

30. Blom N., Sicheritz-Ponten T., Gupta R, Gammeltoft S., Brunak S. Prediction of post-translational glycosylation and phosphorylation of proteins from the amino acid sequence//Proteomics. 2004 V. 4. P. 1633-1649.

31. Borchiellini C., Manuel M., Alivon E., Bouri-Esnault N., Vacelet J., Le Parco Y. Sponge paraphyly and the origin of Metazoa // J . Evol. Biol. 2001. V. 14. P. 171-179.

32. Cao X., Fu W., Yu X., Zhang W. Dynamics of spicule production in the marine sponge Hymeniacidon perlevis during in vitro cell culture and seasonal development in the field // Cell and Tissue Research. 2007. V. 329. P. 595608.

33. Chapman H.A., Riese. J.P., Shi G.P. Emerging roles for cysteine proteases in human biology // Annu. Rev. Physiol. 1997. V. 59. № 63. P.63-88.

34. Conley D. Riverine contribution of biogenic silica to the ocean silica budget // Limnol. Oceanogr. 1997. V. 42(4). P. 774-777.

35. Conley D.J., Stalnacke P.,Pitkanen H., Wilander A. The transport and retention of dissolved silicate by rivers in Sweden and Finland // Limnol. Oceanogr. 2000. V. 45. №8. P. 1850-1853.

36. Coradin T., Lopez P. J, Biogenic silica patterning: simple chemistry or subtle biology? // Chem. Biochem. 2003. V. 3. P. 1-9.

37. Dickinson D.P. Cysteine peptidases of mammalians: their biological roles and potential effects in the oral cavity and other tissue inhealth and diseas // Crit. Rev. Oral. Biol. Med. 2002. V. 13. № 3. P. 238-275.

38. Dunagan S.P. A North American freshwater sponge (Eospongilla morrisonensis new genus and species) from the Morrison Formation (Upper Jurassic). Colorado // J. Paleontology. 1999. V. 73. № 3. P. 389-393.

39. Epstein E. Silicon // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1999. V. 50. P. 64-64.

40. Foo C.W.P., Huang J., Kaplan D.L. Lessons from seashells: silica mineralization via protein templating // TRENDS in Biotechnology. 2004. V. 22. № 11. P. 577-585.

41. Fischer, H. Robl I., Sumper M., Krgöer N. Targeting and covalent modification of cell wall and membrane proteins heterologously expressed in the diatom Cylindrotheca fusiformis (Bacillariophyceae). J. Phycol. 1999. V. 35. P. 113-120.

42. Garrone R., Simpson T.L., Pottu J. Ultrastructure and deposition of silica in sponges // In: Simpson T.L., Volcani B.E., editors. Silicon ans siliceous structures in biological systems. New York: Springer. 1981. P. 495-525.

43. Grachev M.A., Denikina N.N., Belikov S.I., Likhoshvai E.V., Usoltseva M.V., Tikhonova I.V., Adelshin R.V., Kier S.A., Shcherbakova T.A. Elements ofthe active center of silicon transporters in diatoms // Molecular biology. 2002. V. 36. № 4. P. 534-536.

44. Groves M.R., Coulombe R., Jenkins J., Cygler M. Structural basis for specificity of papain-like cysteine protease proregions toward their cognate enzymes. Proteins. 1998. V. 32. P. 504-14.

45. Grozonka Z., Kasprzykowski F., Wiczk W. Cystein Proteases // In Polaina J. and MacCabe A.P. eds. Industrial Enzymes. Gdansk: Springer. 2007. P. 181195.

46. Hartman W.D. Form and distribution of silica in sponges // In: Simpson T.L., Volcani B.E., editors. Silicon ans siliceous structures in biological systems. New York: Springer. 1981. P. 453-493.

47. Hooper J. N. A., van Soest R. W. M. Class Demospongiae Sollas, 1885 // In: Hooper J. N. A., van Soest R.W.M. (eds) Systema Porifera: A Guide to the Classification of Sponges, vol. 1. New York: Kluwer Academic/Plenum Publishers. 2002. P. 15-18.

48. H.C., Müller W.E.G. Monophyletic origin of freshwater sponges in ancient lakes based on partial structures of COXI gene // Hydrobiologia. 2006. V. 568. P. 155-159.

49. Kaluzhnaya O.V., Belikov S.I., Schröder H.C., Rothenberger M., Zapf S., Kaandorp J.P., Borejko A., Müller I.M., Müller W.E.G. Dynamics of skeleton formation in the Lake Baikal sponge Lubomirskia baicalensis. Part

50. Biological and biochemical studies //Naturwissenschaften. 2005. V. 92. P. 128-133.

51. Kim D. J., Lee K.-B., Chi Y. S., Kim W.-J., Paik H., Choi I.S. Biomimetic Formation of Silica Thin Films by Surface-Initiated Polymerization of 2-(Dimethylamino)ethyl Methacrylate and Silicic Acid // Langmuir. 2004. V. 20. P. 7904-7906.

52. Krasko A., Batel R., Schröder H.C., Müller I.M., Müller W.E.G. Expression of silicatein and collagen genes in the marine sponge Suberites domuncula is controlled by silicate and myotrophin // Europ. J. Biochem. 2000. V. 267. P. 4878-4887.

53. Kröger N., Bergsdorf C., Sumper M. A new calcium binding glycoprotein family constitutes a major diatom cell wall component // EMBO J. 1994. V. 13. № 19. P. 4676-83.

54. Kröger N., Bergsdorf C., Sumper M. Frustulins: domain conservation in a protein family associated with diatom cell walls // Eur. J. Biochem. 1996. V. 239. P. 259-264.

55. Kröger N., Lehmann G., Rachel R., Sumper M. Characterization of a 200-kDa diatom protein that is specifically associated with a silica-based substructure of the cell wall // Eur. J. Biochem. 1997. V. 250. P. 99-105.

56. Kröger N., Sumper M. Diatom cell wall proteins and the cell biology of silica biomineralization //Protist. 1998. V. 149. P. 213-219.

57. Kröger N, Deutzmann R, Sumper M. Polycationic peptides from diatom biosilica that direct silica nanosphere formation // Science. 1999. V. 286. № 5442. P. 1129-1132.

58. Kröger N., Wetherbee R. Pleuralins are involved in the differentiation in the diatom Cylindroiheca fusiformis II Protist. 2000. V. 151. P. 263-273.

59. Kröger N., Deutzmann R., Bergsdorf C., Sumper M. Species specific polyamines from Diatoms control silica morphology // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2000. V. 97. P. 14133-14138.

60. Kröger N., Sumper M. The biochemistry of silica formation in diatoms // In: Baeuerlein E., edits. Biomineralization from biology to biotechnology and medical application. Weinheim: Wiley-VCH. 2000. P. 151-170.

61. Kröger, N., Deutzmann, R. and Sumper, M. Silica precipitating peptides from Diatoms: the chemical structure of silaffin-lA from Cylindroiheca fusiformis II J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 26066-26070.

62. C.-W., Chen J.-Y., Hua T.-E. Precambrian Sponges with Cellular Structures. Science // 1998. V. 279. P. 879-882.

63. Mats V. D. The structure and development of the Baikal rift depression // Earth-Sci. Rev. 1993. V. 34. P. 81-118.

64. Mort J.S. Cathepsin L // In: Barrett A.J., Rawlings N.D., Woessner J.F., editors. Handbook of proteolytic enzymes. Amsterdam: Academic Press. 2002. P. 617-624.

65. Miiller W.E.G., Rothenberger M., Boreiko A., Tremel W., Reiber A., Schroder H.C. Formation of siliceous spicules in the marine demosponge Suberites domuncula//Cell Tissue Res. 2005. V. 321. P. 285-297.

66. Murr M.M., Morse D.E. Fractal intermediates in the self-assembly of silicatein filaments // PNAS. 2005. V. 102. №'33. P. 11657-11662.

67. Nichols S., Wörheide G. Sponges: New Views of Old Animals // Integr. Comp. Biol. 2005. V. 45. P. 333-334.

68. Otto H.-H. and Schirmeister T. Cysteine proteases and their inhibitors // Chem. Rev. 1997. V. 97. P. 133-171.

69. Patwardhan S.V., Clarson S.J. Silicification and Biosilicification Part 6. Poly-1-Histidine Mediated Synthesis of Silica at Neutral pH // Journal of Inorganic and Organometallic Polymers. V. 2003. 13. N. 1. P. 123-135.

70. Perry C.C., Keeling-Tuker T. Biosilicification: the role of organic matrix in structure control // J. Biol. Inorg. Chem. 2000. V. 5. P. 537-550.

71. Poulsen N., Sumper M., Kröger N. Biosilica formation in Diatoms: Characterization of native silaffin-2 and its role in silica morphogenesis // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2003. V. 100. P. 12075-12080.

72. Poulsen N., Kröger N. Silica morphogenesis by alternative processing of silaffins in the diatom Thalassiosira pseudonana II J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 42993-42999.

73. Que X., Reed S.L. Cysteine Proteinases and the Pathogenesis of Amebiasis // Clinical Microbiol. Rev. 2000. V. 13. № 2. P. 196-206.

74. Rawlings N.D., Barrett A.J. Families of cysteine peptidases // Meth. Enzymol. 1994. V. 244. P. 461-486.

75. Reiswig H.M. The axial symmetry of sponge spicules and its phylogenetic significance // Cah. Biol. Mar. 1971. V. 12. P. 505-514.

76. Reilly J.J., Mason R.W., Chen P., Joseph L.J., Sukhatme V.P., Yee R., Chapman H.A. Synthesis and processing of cathepsin L, an elastase, by human alveolar macrophages. Biochem. J. 1989. V. 257. P. 493-498.

77. Rzychon M., Chmiel D., Stec-Niemczyk J. Modes of inhibition of cysteine proteases // Acta Biochim. Polon. 2004. V. 51. № 4. P. 861-873.

78. Sanford F. Physical and chemical analysis of the siliceous skeleton in six sponges of two groups (Demospongiae and Hexactinellida) // Micr. Res. Techn. 2003. V. 62. P. 336-355.

79. Sarikaya M., Tamerler C., Jen A.K., Schulten K., Baneyx F. Molecularbiomimetics: nanotechnology through biology //Nature materials. 2003. V. 2. P. 577-585.

80. Schröder H.-C., Efremova S.M., Itskovich V.B., Belikov S.I., Masuda Y., Krasko A., Müller I.M., Müller W.E.G. Molecular phylogeny of the freshwater sponges in Lake Baikal // J. Zool. Syst. Evol. Research. 2003. V. 41. P. 8086.

81. Shore R.E. Axial filament of siliceous sponge spicules, its organic component and synthesis//Biol. Bull. 1972. V. 143. P. 125-136.

82. Simpson T.L. The Cell Biology of Sponges. New York: Springer-Verlag. 1984. 662 p.

83. Simpson T.L., Langenbruch P.-F., Scalera-Liaci L. Silica spicules and axial filaments of the marine sponge Stelletta grubii (Porifera, Demospongiae) // Zoomorphology. 1985. V. 105. P. 375-382.

84. Shimizu K., Cha J., Stucky G.D., Morse D.E. Silicatein alpha: cathepsin L-like protein in sponge biosilica // Proc. Natl. Acad. Sci. 1998. V. 95. № 11. P. 6234-6238.

85. Shore R.E. Axial filament of siliceous sponge spicules, its organic components and synthesis. Biol Bull. 1972. V. 143. P. 125-136.

86. Sumper M., Kroger N. Silica formation in Diatoms: the function of long-chain polyamines and silaffins // J. Mater. Chem. 2004. V. 14. P. 2059-2065.

87. Sun Q., Vrieling E.G., Santen R.A. van, Sommerdijk N.A.J.M. Bioinspired synthesis of mesoporous silicas // Current Opinion in Solid State and Materials Science. 2004. V. 8. P. 111-120.

88. Tallberg P. Silicon and its impacts on phosphorus in eutrophic freshwater lakes. Ph.D. thesis, Department of Limnology and Environmental Protection, University of Helsinki. Yliopistopaino. Helsinki. 2000. P. 57.

89. Tao K, Stearns N.A., Dong J., Wu Q., Sahagian G.G. The proregion of cathepsin L is required for proper folding, stability and ER exit // Arch. Biochem. Biophys. 1994. V. 311. P. 19-27.

90. Thamatrakoln K., Hildebrand M. Approaches for Functional Characterization of Diatom Silicic Acid Transporters // Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 2005. V. 5. P. 1-9.

91. Thamatrakoln K., Alverson A. J., Hildebrand M. Comparative sequence analysis of diatom silicon transporters: towards a mechanistic model for silicon transport // J. Phycol. 2006. V. 42. P. 822-834.

92. Thamatrakoln K., Hildebrand M. Analysis of Thalassiosira pseudonana silicon transporters indicates distinct regulatory levels and transport activity through the cell cycle // Eucariotic Cell. 2007. V. 6. № 2. P. 271-279.

93. Treguer P., Nelson D.M., Bennekom A.J., DeMaster D.J., Leynaert A., Queguiner B. The silica balance in the world ocean: a reestimate // Sciense. 1995. V. 268. P. 375-379.

94. Turk B., Dolenc I, Lenarcic B., Krizaj I., Turk V., Bieth J.B., Bjork I. Acidic pH as a physiological regulator of human cathepsin L activity // Eur. J. Biochem. 1999. V. 259. P. 926-932.

95. Turk D., Guncar D. Lysosomal cysteine proteases (cathepsins): promising drug targets//Acta Cryst. 2003. V. 59. 203-213.

96. Turk V., Turk B., Turk D. Lysosomal systein proteases: facts and opportunités // The EMBO Jornal. 2001. V. 20. № 17. P. 4629-4633.

97. Uriz M.J., Turon X., Becerro M.A. Silica deposition in Demospongiae: spiculogenesis in Crambe crambe II Cell & Tissue Res. 2000. V. 301. P. 299-309.

98. Villalobo E., Moch C., Fryd-Versavel G., Fleury-Aubusson A., Morin L. Cysteine Proteases and cell differentiation: excystment of the ciliated protist Sterkiella histriomuscorum II Eucariotic Cell. 2003. V.2(6). P. 1234-1245.

99. Weaver J. C., Morse D. E. Molecular Biology of Demosponge Axial Filaments and Their Roles in Biosilicification // Microscopy research and technique. 2003. V. 62. P. 356-367.

100. Wiederanders B. The function of propeptide domains of cysteine proteinases //Adv. Exp. Med. Biol. 2000. V. 477. P. 261-270.

101. Zhou Y., Shimizu K., Cha J.N., Stucky G.D., Morse D.E. Efficient catalysis of polysiloxane synthesis by silicatein a requires specific hydroxyl and imidazole functionalities//Angew. Chemie. 1999. V. 38. P. 780-782.