Состав, распределение и химическая структура липидов и жирных кислот губок класса Demospongiae

Родькина, Светлана Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Состав, распределение и химическая структура липидов и жирных кислот губок класса Demospongiae
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Состав, распределение и химическая структура липидов и жирных кислот губок класса Demospongiae"

На правах рукописи

РОДЫСИНА Светлана Александровна

СОСТАВ, РАСПРЕДЕЛЕНИЕ И ХИМИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА ЛИПИДОВ И ЖИРНЫХ КИСЛОТ ГУБОК КЛАССА ОЕМОвРОТОТАЕ

03.00.04 — биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток — 2005

Работа выполнена в Институте биологии моря ДВО РАН.

Научный руководитель:

кандидат химических наук, Имбс Андрей Борисович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, Новгородская Татьяна Павловна доктор биологических наук, Калинин Владимир Иванович

Ведущая организация:

Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр (ТИНРО-Центр)

Защита состоится "_"_2005 г. в_час. на заседании Диссертационного

совета Д.005.005.01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100-летия Владивостока, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (4232) 31-40-50.

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, 22, проспект 100-летия Владивостока, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Автореферат разослан /Г" 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук, старший научный сотрудник

Прокопенко Г.И.

ОБЩЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы Губки широко распространены в морских и пресноводных экосистемах. Они часто встречаются в массовом количестве, в ряде случаев являются ведущими формами в биоценозах Способность этих организмов адаптироваться к условиям большинства водных экосистем во многом обусловлена их уникальной организацией на биохимическом уровне и, отчасти, устройством их биологических мембран В отличие от других организмов липиды мембран клеток губок содержат необычные жирные кислоты (ЖК); некоторые из них обладают биологической активностью. В настоящее время ведется целенаправленный поиск новых ЖК, установление их структуры и путей биосинтеза, изучение их свойств и роли в организме Данные о липидном составе губок позволяют расширить наши представления о многообразии биологических молекул и имеют значение для хемосистематики этой группы животных. Анализ литературных данных показывает, что наиболее изученными по составу липидов и ЖК являются губки тропических и субтропических областей, тогда как губки из бореальных областей практически не исследованы Показано, что в сообществах коралловых рифов губки участвуют в процессах создания первичной продукции (за счет фотосингезирующих симбионтов), азотфиксации (за счет симбиотических цианобактерий), нитрификации и деструкции органического вещества Биомасса губок в бентосе Охотского, Японского морей и в оз. Байкал достигает значительных величин, и, вероятно, губки играют важную роль в донных биоценозах ЖК используют как маркеры отдельных групп организмов, например, при изучении структуры микробного сообщества или при исследовании пищевых взаимоотношений в экосистемах. Возможность определить и оценить по ЖК популяцию ассоциированных с губкой микроорганизмов и пищевые предпочтения губок позволяет уточнить роль губок в экологических процессах. Таким образом, получение новых фундаментальных знаний о составе, структуре и биоконверсии липидов и ЖК практически неисследованных холодноводных видов губок является актуальной темой современной биохимии липидов

Цель работы. Изучение закономерностей распределения и химической структуры липидов и жирных кислот в губках класса Петозрог^ае, определение их значения как хемосистематических маркеров и маркеров пищевых взаимоотношений.

Задачи исследования. 1 Определить состав липидов и ЖК в некоторых видах губок класса Demospongiae из Охотского, Японского морей и оз. Байкал.

-42 Провести поиск и установить химическую структуру новых ЖК губок

3 Определить зависимость состава ЖК губки Hahchondria ратсеа от сезона, места сбора и морфологических особенностей.

4 Дать сравнительную характеристику симбиотического сообщества губок Н ратсеа и Ophlitaspongia pennata с помощью метода маркерных ЖК

5 Определить липидные хемосистематические маркеры для губок семейств Myxillidae и Acarnidae

6 Определить различия в составе ЖК между бореальными и тропическими видами губок

Положения, выносимые на защиту.

1 Главными фосфолипидами (ФЛ) в исследованных губках являются фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин и фосфатидилсерин Непостоянство состава ФЛ внутри одного рода не позволяет использовать ФЛ, как маркеры для хемосистематики губок на низких таксономических уровнях

2 Изученные представители класса Demospongiae характеризуются чрезвычайно сложным (более 150 компонентов) составом ЖК В исследованных видах присутствует 19 новых ЖК, которые не были ранее найдены в других морских и пресноводных губках Новые и редкие ЖК могут служить дополнительным систематическим признаком некоторых видов.

3 Доказана структура новых демоспонгиевых кислот 2-Ме-241А17 и 2-Ме-26 1Д17 из морской губки Н panacea, а также новых кислот 20'5А5,8,11,14,18/ и 20 5Д5,8,11,15,18/ из пресноводной губки Baicahspongia bacillifera.

4 Состав ЖК губок зависит от условий обитания и отражает состав пищи и симбиотических микроорганизмов, ассоциированных с губкой.

5. Отличительными чертами бореапьных видов губок класса Demospongiae по сравнению с тропическими и субтропическими видами являются ярко выраженное преобладание доли полиеновых ЖК над насыщенными, с обязательным присутствием кислот п-3 и п-6 серий, а также низкое содержание ЖК бактериального происхождения

Научная новизна. Впервые определен состав фосфолипидов и ЖК из 17 видов

губок Охотского моря, уточнен и дополнен состав фосфолипидов и ЖК из 4 видов губок

Японского моря и оз Байкал В губках впервые обнаружены новые жирные кислоты 13-

Ме-16:0, 14-Ме-17 0, 15-Ме-18 0, 16-Ме-19 0, ш-15 1Д4, /-161А5, 10,14-Ме2-15 1А6,

18:1Д6, 181А8, 22.1Д16, 231Д15, 15-Ме-241А14, 17-Ме-26:1Д16, 28:2Д9,21, 28.3Д5,9,22.

Впервые выделены и охарактеризованы методами масс-спектрометрии и ЯМР две новые 2-метил-замешенные сверхдлинноцепочечные ненасыщенные кислоты (2-Ме-241Д17 и 2-Ме-26 1Д17), а также два уникальных изомера эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК). Впервые показано, что главным изомером ЭПК в пресноводной губке В. bacillifera является кислота 20 5Д5с,8с,11с,14с,18л Установлено, что основное влияние на состав ЖК массового вида морской губки Н. ратсеа оказывает сезон и место обигания Показано, что в ряде случаев ЖК могут быть использованы для хемосистематики губок на уровне семейств и как маркеры симбионтов губок Выявлены характерные отличия состава ЖК бореапьных видов от тропических видов губок.

Апробация полученных результатов. Основные результаты были представлены на Ежегодной научной конференции ИБМ, (Владивосток, 2001), V Региональной конференции по актуальным проблемам экологии, морской биологии и биотехнологии, (Владивосток, 2002), Международной конференции «Marine environment' nature, communication and business» (Владивосток, 2003).

Публикации. Основные результаты исследований, проведенных по теме диссертации, изложены в 8 печатных работах.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы и приложений Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 22 таблицы, 24 рисунка и 177 литературных ссылок.

Автор выражает признательность сотрудникам ИБМ ДВО РАН: к б н. Селину НИ за помощь в сборе материала, д х н Светашеву В И за помощь в проведении исследований, сотруднику ТИБОХ ДВО РАН Красохину В Б за помощь в сборе материала и определении видовой принадлежности губок.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Материалы и методы

Пресноводные губки оз. Байкал были собраны на глубинах 15-20 м в июне 2003 г Морские губки были собраны драгированием на глубинах 34-250 м в Охотском море, в районе Курильских и Шантарских островов в июле 2003 г, в зал Восток (Японское море) с глубины 0,5-2 м в сентябре 2001 г., августе 2002 г., апреле 2003 г, в Амурском заливе (Японское море) в черте г. Владивостока с глубины 4 м в апреле 2003.

Список видов исследованных губок'

Тип Porifera Grant, 1836 Класс Demospongiae Sollas, 1889 Отряд Astrophorida Sollas, 1888 Семейство Pachastrellidae Carter, 1875 Poectllastra sp

Отряд Hadromerida Topsent, 1894 Семейство Polymastiidae Gray, 1867 Polymastia sp.

Отряд Poeciloscleridae Topsent, 1928 Семейство Acarnidae Dendy, 1922 Megaciella fragilts (Koltun, 1955) Megaciella zenkevitchi (Koltun, 1958) Megaciella sp.

Семейство Microcionidae Carter, 1875 Ophhtaspongia pennata (Lambe, 1984) Tylodesma rosea (Fristedt, 1887) Семейство Coelosphaeridae Dendy, 1922 Forcepia uschakowi (Burton, 1935) Семейство Myxillidae Dendy, 1922 Myxilla incrustans (Johnston, 1842)

Stelodoryx toporoki Koltun, 1958 Melonachora kobjakovae Koltun, 1958 Семейство Tedaniidae Ridley et Dendy, 1886 Tedama dirhaphis Hentschcl, 1912 Семейство Esperiopsidae Hentschel, 1923 Esperiopsis digitata (Mikluho-Maclay, 1870) Homoeodiclya pulvihformis Koltun, 1955 Семейство Mycalidae Lundbeck, 1905 Mycale sp.

Отряд Halicbondrida Gray, 1867 Семейство Halichondriidae Gray, 1867 Ilaltchondriapamcea (Pallas, 1766) Hymentacidon assimihs (Levinsen, 1886)

Отряд Haplosclerida Topsent, 1928 Семейство Chalinidae Gray, 1867 Haliclona af. oculata (Pallas, 1766) Haliclona sp. Семейство Spongillidae Batcalospongia bacilli/era Lubomirskia baicalensis

Общие липиды губок экстрагировали по методу Блайя и Дайера. МЭЖК готовили из общих липидов по методу Карро и Дубак Цис- и транс-изомеры МЭЖК разделяли препаративной А$-ТСХ. Пирролидиды ЖК и диметилдисульфидные (ДМДС) производные моноеновых ЖК получали по стандартным методикам Фосфолипиды разделяли двумерной тонкослойной хроматографией. Содержание общего фосфора и отдельных классов фосфолипидов определяли спектрофотомегрически Анализ состава ЖК проводили методом ГЖХ в форме МЭ на капиллярных колонках с фазой 5ире1со\уах 10 или 5РВ-5. Установление структуры ЖК в форме МЭ или пирролидидов выполняли методом ГХ-МС (электронный удар) на капиллярной колонке с фазой 8ире1со,й'ах 10 или МОЫ-58 В ряде случаев для установления положения двойных связей проводили ограниченный восстановительный гидразинолиз ЖК с последующим ГХ-МС анализом ДМДС производных фракции моноеновых ЖК Чистые ЖК выделяли последовательным применением препаративной колоночной хроматографии на силикагеле, импрегнированном А^>ЫОз, и полупрепаративной обращено-фазовой ВЭЖХ Химическую структуру чистых ЖК определяли методами масс-спектрометрии и двумерной спектроскопии ЯМР.

II. Результаты и обсуждение

Определение состава фосфолипидов и жирны» кислот губок

В среднем содержание общих липидов в исследованных губках составило 66 мг/г сухого веса. Максимальное содержание липидов отмечено для Я pulviliformis (195 мг/г сухого веса), минимальное количество липидов было в губке Poecillastra sp (22 мг/г сухого веса) В таблице 1 приведены данные о содержании фосфолипидов в общих липидах и распределении фосфолипидов по классам у исследованных губок. В среднем фосфолипиды составили 32,2% от общих липидов, и их доля варьировала от 19,6% в L. baicalensis до 44,1% в Т dtrhaphis. Главными фосфолипидами в исследованных губках были фосфатидилхолин (ФХ), фосфатидилэтаноламин (ФЭ) и фосфатидилсерин (ФС). Они были найдены у всех видов губок, за исключением губки М. zenkevitchi, у которой отсутствовал ФС Среднее содержание ФХ, ФЭ, ФС от суммы ФЛ составило 30,0%, 30,2%, 27,2%, соответственно. У некоторых видов губок были обнаружены также фосфатидилглицерин (ФГ), дифосфатидилглицерин (ДФГ), фосфатидилинозит (ФИ), лизофосфатидилэтаноламин (ЛФЭ) и фосфатидная кислота (ФК).

Состав фосфолипидов у 17-ти видов губок был изучен впервые, а наши данные по составу фосфолипидов губок В bacillifera, L. baicalensis, М. mcrustans были близки к таковым, опубликованным ранее При сравнении данных по составу фосфолипидов губки Я. рапгсеа, полученных нами, с литературными данными были обнаружены заметные расхождения в содержании ФХ (11,1% против 21%) и ФГ (18,4% против 2%) Мы предполагаем, что такие вариации могут быть связаны с сезонными изменениями количества симбиотических микроорганизмов в губке, так как ФГ является одним из главных классов фосфолипидов бактерий Сравнение состава ФЛ для представителей рода Megaciella выявило большую вариабельность содержания отдельных классов ФЛ внутри одного рода губок (Табл. 1). Содержание ФЭ и ФХ колебалось в пределах 25,148,5% и 25,0-50,1%, соответственно. Кроме того, в липидах М zenkevitchi полностью отсутствовал ФС, обнаруженный у всех остальных губок Отмеченное непостоянство состава ФЛ как отдельных видов, так и нескольких видов внутри одного рода, по нашему мнению, делает невозможным использование ФЛ как хемосистематических маркеров губок на низких таксономических уровнях (вид, род)

В составе общих липидов губок нами было обнаружено более 40 различных насыщенных ЖК (НЖК)' с неразветвленным углеродным скелетом, (/«(-строения, с одним и двумя метальными заместителями в середине цепи, а также разветвленные кислоты изопреноидного строения и кислоты, содержащие циклопропановую группу

Таблица 1 Содержание общих фосфолипидов (ФЛ, % от общих липидов) и основных классов фосфолипидов (% от суммы ФЛ) в губках.

Виды губок ФЛ ФЭ ФХ ФС ФГ ДФГ ФИ ЛФЭ ФК

Baicalospongia bacilhfera 29,6 33,4 44,5 17,1 - - 2,2 1,7 1,1

Clatria pennata 32,3 17,4 19,5 39,9 1,1 3,2 10,1 6,7 2,1

Esperiopsis digiiata 29,4 13,4 14,9 47,8 15,0 8,9 - - -

Forcepia uschakowi 39,2 32,8 10,6 18,5 33,1 - 4,1 - 0,9

Haltchondria pamcea 30,2 29,9 11,1 29,4 18,4 2,9 4,1 4,2 -

Haliclona af. gracilis 38,8 27,3 34 38,7 - - - - -

Hahclona sp. 40,2 33,5 35,4 31,1 - - - - -

Homoeodictya pulvihformis 24,5 28,7 37,6 19,7 - - 5,2 6,5 2,3

Hymemacidon assimrfis 31,1 30,2 42,2 22,6 - - 2,4 1,5 1,1

Lubomirskia baicalensis 19,6 31,4 42,2 16,5 - 1,9 2,4 3,5 2,1

Melonachora kobjakovae 43,0 34,2 27,5 28,2 - - 3,2 4,8 2,1

Mycale sp 32,7 38,8 29,2 21,9 - - 2,6 6,4 1,1

Megaciella fragilis 36,4 33,7 28,4 17,8 4,2 4,1 5,6 4,1 2,1

Megaciella sp 28,5 25,1 25,0 30,1 - - 8,9 9,7 1,2

Megaciella zenkevitchi 34,5 48,5 50,1 - - - - - 1,4

Myxilla mcrustans 33,2 35,5 29,5 22,4 - - 4,2 7,2 1,2

Poecillaslra sp. 28,4 29,2 31,4 34,6 - - 2,5 1,5 0,8

Polymastia sp. 28,7 19,4 17,4 27,8 20,1 15,3 - - -

Stelodoryx toporoki 19,8 31,1 29,9 39 - - - - -

Tedama dirhaphis 44,1 31,1 29,5 28,2 - - 2,5 8,7 -

Tylodesma rosea 30,9 25,6 39,9 29,5 - - 3,1 - 1,9

Сокращения ФХ - фосфатидилхолин, ФЭ - фосфатидилэтаноламин, ФС -фосфатидилсерин, ФГ - фосфатидилглицерин, ДФГ - дифосфатидилглицерин, ФИ -фосфатидилинозит, ЛФЭ - лизофосфатидилэтаноламин, ФА - фосфатидная кислота

Относительное процентное содержание НЖК колебалось от 7,6% (М ко^акомае) до 29,6% (Е (1щ11Ма) и составило в среднем 14,6% от суммы ЖК, при этом был обнаружен весь ряд С14-С26 ЖК Во всех исследованных нами губках присутствовали кислоты 14 0, 15 0, 16 0, 17 0 и 18.0, а кислоты 19 0 и 20 0 отсутствовали только в губках Н аззтнШ и Е (1щИа1а, соответственно Среди неразветвленных НЖК у большинства видов губок преобладала пальмитиновая кислота (16 0); ее относительное содержание

колебалось от 1,7% (М kobjakovae) до 5,5% (L baicalensis) от суммы кислот Другой главной НЖК линейного строения была стеариновая кислота (18 0), содержание которой в среднем составило 1,7% от суммы кислот Количество насыщенных неразветвленных сверхдлинноцепочечных ЖК (СДЖК) было незначительное, в среднем 0,2% от суммы кислот

Содержание в губках НЖК //¿»-строения колебалось в пределах от 1,1% (Я assimilis) до 8,5% (Е digitata) и составило в среднем 4,0% от суммы кислот Были найдены все гомологи i/ai-ЖК - от Си до С21 У всех исследованных нами губок присутствовали i/ai-15 0, i/ai-16'.O и i/ai-17 0, кроме двух видов, Н assimilis и Т dirhaphis, в которых не обнаружены (-16 0 и ш'-16 0, соответственно Были идентифицированы восемь ЖК с одним разветвлением в середине цепи (10-Ме-16 0, 13-Ме-16 0, 14-Ме-17 0, 10-Ме-18 0, 11-Ме-18:0, 15-Ме-18'0, 16-Ме-19 0, 13-Ме-20 0) и одна диметилзамещепная кислота 10,13-Ме2-140 Кислоты 13-Ме-160 (1), 14-Ме-17 0 (2), 15-Ме-18.0 (3), 16-Ме-19 0 (4) ранее не были обнаружены у других губок Мы полагаем, что эти обнаруженные нами кислоты, также как и другие уже известные ЖК с разветвленным скелетом, синтезируются бактериями, ассоциированными с губками. У большинства изученных видов губок в составе общих липидов присутствовали ЖК изопреноидного строения, такие как 4,8,12-Мез-130 и 3,7,11,15-Ме4-16 0. Содержание этих кислот достигает 4,7% (Я assimilis), но в среднем составляет лишь 1,6% от суммы кислот В составе липидов почти у половины видов губок мы обнаружили две НЖК с циклопропановой группой (9,10-метилен-16:0 и 11,12-метилен-18 0) Обе эти ЖК найдены у губок L baicalensis, Я puMliformis, Mycale sp , Poecillastra sp и Polymastia sp . В губке В bacillifera и Haliclona sp. была обнаружена только кислота 9,10-метилен-16 0, а в F uschakowi - только 11,12-метилен-18 0 Некоторые виды содержат лишь незначительное количество этих кислот (в среднем 0,3%), другие - Я pulviliformis, Poecillastra sp., Polymastia sp - заметно больше (в среднем 2,3%) ЖК с циклопропановой группой - типичны для бактерий

В составе общих липидов губок нами было обнаружено более 50 различных моноеновых ЖК (МНЖК), которые имели как неразветвленный углеродный скелет, так и углеродную цепь с одним или двумя метальными заместителями Относительное содержание МНЖК составило в среднем 20,6% от суммы кислот и укладывалось в интервал от 10,3% у О pennata до 27,0% у Polymastia sp Среди всех обнаруженных МНЖК у большинства губок преобладали пальмитолеиновая кислота (161А9) и цис-вакценовая кислота (18 1А11), которые присутствовали во всех исследованных нами видах Значительный вклад вносят сверхдлинноцепочечные 24 1Л15 и 24.1Д17, среднее

(1) 13-Ме-16 0 [М]* т/г 323

(2) 14-Ме-17 0 [М]+тг 337

(3) 15-Ме-18 0 [М]'т2 351

(4) 16-Ме-19 О [М]'т/г 365

(5) 18 1Д6 [М] V* 335

I(6) 18 1А8 [М]*т'г 335

■^^•СОК 3

соц

(7) 22 1Д16 [М]+т4 391

(8) 23 1Д15 [М] т/г 405 СОЫ^З (9) о/-15 144 [МГтг 293

СОЫ^З (10) 1-16 1Д5 [М]+т4 309

—(Н) Ю,14-Ме2-15 1Д6 [М]*тг 321

306. 278

С(Ж

(13) 17-Ме-26 1Д16 [М]+тг461 208

о о

(14) 28 2Д9Д [М]+т/г 473 374 194 152.

[ 386. ¡ 206. |180 [140.

(15) 28 ЗД5,9,22 [М]+т'г471 Рис. 1 Пирролидиды новых жирных кислот из губок и их характеристические фрагменты

(Е1 - масс-спектры)

содержание которых составляло 1,4% и 1,6% от суммы кислот, соответственно Впервые в губках были идентифицированы кислоты 181А6,18 1А8, 22 1Д16 и 231Д15

Кислоты 181Л6 (5) и 18:1Л8 (6) были обнаружены нами только в липидах губки Т dirhaphis. Вероятно, подобные кислоты могут, как попадать с пищей, так и синтезироваться самой губкой Кислота 22.1Д16 (7) была обнаружена нами в липидах губок I. baicalensis, В baciilifera, Haliclona sp , Н. gracilis, Mycale sp., T rosea, T. dirhaphis, H. pulvihformis, M kobjakovae, M. fragilis, Megaciella sp , M zenkevitchi. Так как мы не обнаружили других Д16-моноенов с прямой цепью в исследованных нами губках, мы предполагаем, что эта кислота образуется путем элонгации кислоты 20ТД14 Подтверждением нашей гипотезе может служить то, что у всех вышеперечисленных видов губок присутствуют обе эти кислоты Кислота 23 • 1Д15 (8) была обнаружена нами в липидах губок L. baicalensis, В. baciilifera, М. fragilis, Megaciella sp., М zenkevitchi Кроме того, мы обнаружили другие Д15-моноены с прямой цепью: 20:1, 22.1, 24:1 и 26:1. Следовательно, можно предположить наличие у губок Д15-десатуразы.

В изученных губках было отмечено присутствие восьми различных моноеновых ЖК с одним разветвлением в середине цепи: 5-Ме-141Д4, 7-Ме-16:1Д6, 11-Ме-18:1Д6, 10-Ме-18:1Д13, 2-Ме-24:1Д17, 15-Ме-24:1Д14, 2-Ме-26:1Д17, 17-Ме-26:1Д16, и одной ЖК с двумя разветвлениями: 10,14-Ме2-15:1Д6. Кислота 7-Ме-16:1Д6 была типичной для большинства исследованных губок, ее содержание достигало 3,2% (Е. digitata) и составило в среднем 1,2% от суммы кислот. Из 13-ти обнаруженных нами моноеновых ЖК с разветвленным углеродным скелетом три новых длинноцепочечных ЖК (а/-15:1Д5 (9), i-16:lA5 (10) и 10,14-Ме2-15:1Д6 (11) и четыре новых СДЖК (15-Ме-241Д14 (12), 17-Ме-26:1Д16 (13), 2-Ме-24:1Д17 и 2-Ме-26:1Д17) ранее не были найдены в губках.

Кислоты а;-15:1А4 и 1-16:1Д5 были обнаружены нами только в губке Е, digitata. Кислота 10,14-Ме2-151Д6 была обнаружена нами у губок Poecillastra sp., Т. dirhaphis, Н. pulvihformis Мы полагаем, что эти кислоты синтезируются бактериальными симбионтами губок Кислота 15-Ме-241Д14 была обнаружена нами у губки F uschakowi и у всех изученных нами губок семейств Myxillidae и Acarnidae, кислота 17-Ме-261Д16 -у губки Н. pulvihformis и у двух губок семейства Myxillidae (М kobjakovae, S toporoki). Обе эти кислоты (15-Ме-24ТД14, 17-Ме-26ТД16) вероятно синтезируются путем элонгации кислоты 7-Ме-161 Д6, которая обнаружена у всех этих губок.

В составе общих липидов губок нами было обнаружено более 60 различных полиеновых ЖК (ПНЖК) как линейного, так и г/я/-строения углеродной цепи. У всех

исследованных видов губок около половины всех ЖК приходиться на полиненасыщеные ЖК Доля полиненасыщенных кислот в общих ЖК изученных губок колебалась от 47,7% у Е digitata до 77,9% у Т. dirhaphis Значительную часть среди ПНЖК губок составили неметиленразделенные ЖК, прежде всего Д5,9-ненасыщенные, что является отличительной особенностью состава ЖК изученной группы организмов Из идентифицированных 63-х полиненасыщеных кислот 28 ЖК содержат Д5,9-фрагмент Кислоты 26'2Д5,9 и 26 ЗД5,9,19 были обнаружены во всех изученных губках Кислота 26 2А5,9 была главной у губок Я gracilis, О pennata, F uschakowi Для губок И assimihs, Я pamcea, L baicalensis, В bacillifera, Haliclona sp , Mycale sp главной являлась кислота 26 ЗА5,9,19. Другой распространенной кислотой была 28:ЗД5,9,21 Она является главной у всех исследованных губок из семейств Myxillidae и Acarnidae, а также у Poecillastra sp , Polymastia sp., T dirhaphis, H pulviliformis В липидах губки Е digitata главными Д5,9-ЖК были /-25'2Д5,9, ш-25 2Д5,9 У изученных видов губок мы идентифицировали значительное разнообразие полиеновых ЖК регулярного строения, типичных для других организмов. 16:2п-6, 18 2п-3, 18.2п-6, 18 2п-4, 16.3п-3, 18:3п-6, 18.3л-3, 20:3п-3, 20 Зп-6, 16:4п-3, 18:4п-3, 20.4п-6, 20:5п-3, 20:4п-3,22.4п-6,22:5п-6, 22:6п-3 и 22:5п-3. Среди них у всех исследованных губок присутствовали арахидоновая (20 4п-6), эйкозапентаеновая (20 5п-3) и докозагексаеновая (22'6п-3) кислоты, среднее содержание которых составило 2,3%, 5,4% и 5,4% от суммы кислот, соответственно Метиленразделенные полиеновые Ci6 и Cig ЖК обнаружены только у некоторых губок, особенно богаты ими пресноводные губки L. baicalensis, В. bacillifera Нами были обнаружены 4 новых для губок полиеновых ЖК: 28:2Д9,21 (14), 28:ЗД5,9Д2 (15), 20:5Д5,8,И,14,18/> 20:5Д5,8,11,15,18/.

Установление структуры 2-метил-замешенных СДЖК из губки Н. panlcea

В липидах морской губки Я pamcea были обнаружены две необычных ЖК, которые составили более 5% от суммы кислот Присутствие в масс-спектре ионов с m/z 394 ([МП и m/z 362 ([М-МеОН]*) позволили идентифицировать первый компонент, как МЭ кислоты 25'1 Аналогично, второй компонент был определен как МЭ кислоты 27 1 по наличию в масс-спектре ионов с m'z 422 ([М]") и m/z 390 ([М-МеОН]*) После гидрирования МЭ этих кислот в масс-спектрах присутствовали [М]"+ с m/z 396 и 424, соответственно, что подтверждало наличие одной двойной связи в исходных веществах Присутствие в масс-спектрах МЭЖК 25 1 и 27 1 базового пика иона с m/z 88 (100%) вместо пика иона с m/z 74 указывало на наличие СНз-группы в а-положении В масс-спектре диметилдисульфидного (ДМДС) аддукта МЭ кислоты br-25.1 присутствовали

молекулярный ион с m/z 488, а также характеристические пики ионов с m/z 343 (C2oH39S02+), m/z 311 ([C20H39SO2-MeOH]+) и m/z 145 (C8HnS+), указывающие на Д17 двойную связь В масс-спектре ДМДС-аддукта МЭ кислоты br-27 1 присутствовали молекулярный ион с m/z 516, а также характеристические пики ионов с m/z 343 (C2oH3,S02+), m/z 311 ([QzoHaiSCVMeOH]4) и m/z 173 (C10H2iS+), указывающие на Д17 двойную связь

'Н-ЯМР спектры МЭ двух новых кислот были весьма близки, показав синглет 5 3,67 ррт, квадруплет 5 2,43 ррш и серию мультиплетов в диапазоне 8 1,2-1,35 ррш, принадлежащие, соответственно, трем протонам метилового эфира, одному протону третичного атома углерода С-2 и метиленовым протонам алифатической цепи Три протона метального заместителя дали дублет с S 1,14 ррш, что характерно для 2-метилзамещенных МЭЖК Сигналы протонов 2-х метиленовых групп, расположенных рядом с двойной связью, дали мультиплет с 52,01 ррт. Дублет триплетов с S 5,35 ррт принадлежал двум олефиновым протонам Величина константы спин-спинового взаимодействия олефиновых протонов (J = 10,2 Hz) была характерна для цис-конфигурации двойной связи.

Таким образом, структуры новых кислот из губки Н. ратсеа были определены как 2-метил-17(2)-тетракозеновая (16) и 2-метил-17(2)-гексакозеновая (17) кислоты.

Ранее, только одна 2-метилзамещенная ЖК (2-Ме-180) была обнаружена в фосфолипидах губки Plakortis hahchondroides СДЖК с //ш'-структурой, а также с разветвлением в середине углеродной цепи являются довольно обычными для губок, однако, 2-метилразветвленные ненасыщенные СДЖК обнаружены впервые Установление структуры изомеров ЭПК из губки В. bacilífera В составе липидов пресноводной губки В bacilífera было обнаружено несколько изомеров эйкозапентаеновой (ЭПК) кислоты, которые выделяли последовательным применением колоночной хроматографии на силикагеле, импрегнированном AgNOi, и обрашено-фазовой ВЭЖХ Было получено три индивидуальных изомера метилового эфира ЭПК 95%-ой чистоты Для установления положения двойных связей в углеродной цепи выделенных МЭЖК мы применили частичное восстановление гидразином, с

последующим выделением смеси моноеновых кислот и анализом их ДМДС-аддуктов методом ГЖХ-МС Зная положение двойных связей во всех полученных моноенах, легко реконструировать положение двойных связей в углеродной цепи исходного полиена

В масс-спектрах 4-х из 5-ти ДМДС-аддуктов МЭ моноеновых жирных кислот 201, полученных восстановительным гидразинолизом из основного изомера, присутствовали молекулярный ион с m/z 418, а также четыре пары пиков характеристических ионов с m/z 161 (C7HnS02+) и m/z 257 (CiíH^S4), m/z 203 (CioHuSCV) и m/z 215 (Cnlb7S+), m/z 245 (C13H25SCV) и m/z 173 (CioHziS*), m/z 287 (C16H31SO24) и m/z 131 (C7H15S4), указывающие на положение двойных связей при 5, 8,11 и 14-ом атомах углерода, соответственно. В масс-спектре последнего ДМДС-аддукта МЭ кислоты 20:1 присутствовали интенсивные пики фрагментарных ионов с m/z 343 (C2oH39S02+) и m/z 1Ь (C3H7S4"), соответствующие Д18 двойной связи. Хроматографическая подвижность МЭ и ДМДС-аддукта кислоты 201Д18 указывала на транс-конфигурацию двойной связи. Для подтверждения этого предположения смесь МЭ моноеновых 20'1, полученных восстановительным гидразинолизом, разделяли на цис- и транс-изомеры при помощи препаративной Ag-TCX При этом 4 кислоты 201Д5, 201Д8, 20:1Д11 и 201Д14 были найдены в зоне цис-изомеров, и только одна кислота 201Д18 - в зоне транс-изомеров. Следовательно, основной изомер ЭПК, составляющий 15,9% от суммы всех ЖК губки В. bacilífera, имел необычную структуру 20:5 Д5,8,11,14,18/.

Масс-спектры 4-х из 5-ти ДМДС-аддуктов МЭ моноеновых кислот 20:1, полученных восстановительным гидразинолизом из второго изомера ЭПК, были идентичны масс-спектрам, полученным для продуктов частичного восстановления основного изомера, и указывали на положение дойной связи при 5, 8, 11 и 18-ом атомах углерода Аналогично, кислота 20 1Д18 также имела транс-конфигурацию двойной связи. В масс-спектре последнего ДМДС-аддукта МЭ кислоты 20.1 присутствовали, кроме молекулярного иона с m/z 418, интенсивные пики фрагментарных ионов с m/z 301 (С^НззЗОг^ и m/z 117 (C6Hi3S+), указывающие на Д15 двойную связь. Следовательно, второй изомер ЭПК, составляющий 2,5% от суммы всех ЖК губки В. bacilífera имел необычную структуру 205Д5,8,11,15,18/

В аналогичных экспериментах было показано, что структура третьего изомера ЭПК, составляющего 1,9% от суммы всех ЖК губки В bacilífera, соответствует формуле 20 5Д5,8,11,14,17, т е тривиальной метиленразделеной ЭПК, широко распространенной в природе.

Дополнителыюе подтверждение химической структуры МЭ основного изомера ЭПК было получено методом ЯМР 'Н-ЯМР спектр МЭ кислоты 20 5Д5.8.11,14,18с (18) показал присутствие сигналов 2-х олефиновых протонов (<5 5,41-5,48), 8-ми олефиновых протонов (3 5,33-5,41), 3-х протонов -ОСН3 группы (3 3,67), 6-ти протонов метиленовых групп между двойными связями (3 2,79-2,84), 2-х метиленовых протонов в а-положении (<5 2,32), 6-ти аллильных метиленовых протонов (3 2,01-2,15), 2-х метиленовых протонов в Р-положении (6 1,71) и дублет (3 1,65) от 3-х протонов терминальной метильной группы, сигнал которой был сильно сдвинут по сравнению с положением сигнала аналогичной группы, расположенной в конце насыщенной углеводородной цепи (3 0,89) Отнесение сигналов 'Н-ЯМР спектра было, в основном, сделано по данным эксперимента 'Н-'Н-С08У-45.

2 4 7 10 13 16 18 20

(18)

|3С-ЯМР спектр метилового эфира 20:5Д5,8,11,14,18г (18) показал присутствие сигналов 21-го атома углерода, из которых по данным эксперимента DEPT-135 12 сигналов принадлежало первичным и третичным атомам углерода и 8 сигналов -вторичным, что соответствовало приписанной химической структуре. В спектре присутствовали сигнал карбоксильного атома углерода (3 173,98), 10-ти олефиновых атомов (3 125-131), -ОСНз группы (3 51,38), 8-ми метиленовых групп (3 24-34) и терминальной метильной группы (3 17,81), сигнал которой заметно отличался от значения химического сдвига концевого метила насыщенного углеводорода (á 14,07) Отнесение сигналов 13С-ЯМР спектра было, в основном, сделано по данным 'Н-13С двумерной ЯМР (НМВС, HSQC).

Известно, что в красной водоросли Ptilola fllicma обнаружены 2 изомера ЭПК (20:5A5,7f,9f,14,17 и 20'5Д5/,7г,9/,14,17), которые образуются путем изомеризации молекул обычной ЭПК Кислота 20'5Д5,8,10г,12/,14 была найдена у другой красной водоросли Bossella orbigntna Предполагается, что такая кислота может образовываться из арахидоновой кислоты Грибы Mortterella alpine 1S-4, выращенные на гексадецене, содержат другой изомер ЭПК (20:5 Д5,8,11,14,19/) Очевидно, что обнаруженные нами в губке В. bacilífera необычные изомеры ЭПК не поступают с пищей, а образуются при помощи новых, еще неизвестных ферментных систем губки или ее симбионтов

Зависимость состава ЖК губки Н. ратсеа от сезона, места сбора и морфологических особенностей

Вариации состава ЖК двух цветовых морф Я ратсеа Одна из особенностей морской губки И ратсеа заключается в том, что этот организм встречается в виде нескольких цветовых морф. Наиболее массовыми в зал Петра Великого являются желтая и зеленая морфы Мы предположили, что зеленая окраска может быть связана с присутствием в губке неких окрашенных симбиотических организмов, например, микроводорослей Симбионты губок имеют специфические ЖК, поэтому состав ЖК губок, имеющих разных симбионтов, будет отличаться Мы сравнили состав ЖК у экземпляров желтого и зеленого цвета, собранных в одном месте и в одно время В результате были обнаружены небольшие достоверные различия (Р < 0,05) в относительном содержании только двух кислот' 16 1Д7, 16 0 Содержание остальных компонентов достоверно не отличалось Следовательно, зеленая цветовая морфа Я. ратсеа не имеет специфических симбионтов, придающих ей соответствующую окраску

Зависимость состава ЖК Я ратсеа от времени сбора При сравнении состава ЖК общих липидов Н ратсеа, собранной в апреле и августе в зал Восток (Японское море), были обнаружены достоверные различия (Р < 0,05) в относительном содержании 23-х ЖК Относительное содержание суммы НЖК, суммы разветвленных сверхдлинноцепочечных МНЖК, суммы метиленразделенных ПНЖК, суммы демоспонгиевых ПНЖК достоверно различалось в образцах губки, взятых в разные сезоны Относительное содержание НЖК в общих липидах Я ратсеа, а также кислот См-Сп линейного и разветвленного строения, было выше в апрельских пробах Соотношение между ди- и триеновыми СДЖК в августе составляло 0,6, в апреле - 0,2 В летний период доля диеновых ЖК значительно увеличивалась, в основном, за счет увеличения количества кислоты 26:2Д5,9

Зависимость состава ЖК Я ратсеа от места обитания При сравнении состава ЖК общих липидов Я ратсеа, собранных в апреле 2003 г в Амурском заливе и зал Восток были обнаружены достоверные различия в относительном содержании 17-ти ЖК, а также суммы МНЖК и суммы метиленразделенных ПНЖК

Возможные причины вариаций состава ЖК губки Я ратсеа ЖК с длинной цепи от 14-ти до 22-х атомов углерода, входящие в состав липидов губки, могут поступать с пищей, могут синтезироваться или ассоциированными с губкой микроорганизмами, или самой губкой Губки, прокачивая воду через свою канальную систему, удерживают растворенные в ней органические вещества и взвешенные частицы живой и неживой

природы. Бактерии и микроводоросли, как часть планктона, являются важным источником пищи для губок Эффективность удаления из морской воды бактерий достигает 85-95%, микроводорослей - 30-95% Весеннее цветение диатомовых микроводорослей, вероятно, обуславливает повышенное содержание кислот 14 0, 16 0, 161Д9 и 20.5п-3 (маркеров диатомовых водорослей) в общих липидах у губок Я. pamcea, собранных весной Принято считать, что короткоцепочечные ЖК разветвленного строения, ЖК с нечетным числом атомов углерода и i/uc-вакценовая кислота (181Д11) имеют бактериальное происхождение Увеличение содержания в тканях губки ЖК -бактериальных маркеров в весенний период также может быть связано с увеличением доли бактерий в планктоне и/или увеличением численности симбиотических бактерий

Доля ЖК 14 0, 16:0 и 20'5п-3 (маркеров диатомовых водорослей) в губках, собранных в Амурском заливе, меньше, чем в губках, собранных в менее загрязненном зал Восток в тот же период. Вероятно, пищевой вклад диатомовых водорослей в Амурском заливе, в черте города Владивостока, ниже, чем зал Восток, а основной пищей для губок служит растворенная антропогенная органика Различия также обнаружены для насыщенных ЖК разветвленного строения i/ar-15 0, i-16:0, a/-17 0, /-18:0 и ш-21:0 (маркеров бактерий), относительное содержание которых выше у губок, собранных в Амурском заливе Бактерии участвуют в деструкции органического вещества. Вероятно, при увеличении концентрации органики в воде увеличивается количество бактерий, и как следствие, их вклад в питание губки.

Состав ЖК липидов губок отличается высоким содержанием С24-С30 демоспонгиевых ЖК, которые являются структурными компонентами мембран клеток губки Наши данные показали, что доля диеновых демоспонгиевых ЖК в Я pamcea зависела от сезона и значительно увеличивалась в летний период Изменения в содержании демоспонгиевых ЖК в весенний и летний период, вероятно, обусловлены влиянием температуры воды и необходимы для поддержания оптимальной жидкостности липидного бислоя, составляющий основу мембран клеток губки

Сравнительная характеристика симбиотических микроорганизмов губок Я. vanicea и О. pennata методом маркерных ЖК

За последнее время было описано множество различных ассоциаций между губками и микроорганизмами В губках обитают архебактерии, бактерии (включая цианобактерии), микроводоросли, грибы, простейшие Мы применили метод маркерных ЖК для сравнительной характеристики сообщества симбиотических бактерий губок на примере двух видов - Я pamcea и О pennata Для оценки количества гетеротрофных

бактериальных симбионтов в морских губках был использован ряд специфических для бактерий ЖК (-15:0, ш-150,1-16:0, ш-16:0,1-17:0, а/-17:0, /-19:0, ш-190,18 1Д11 (рис.2). В целом, общий вклад «бактериальных» компонентов в пул ЖК был приблизительно одинаков для двух видов губок По сравнению с О. реппага, относительное содержание суммы //а/-кислот было выше для Н ратсеа, но достоверно (Р < 0,05) различалось количество только 3-х кислот (ш-150, /-17:0 и /-19:0). Содержание а/-15'0 было значительно выше у Н. ратсеа, содержание /-17:0 и /-19 0 было достоверно выше у О. реппаш Относительное содержание другого маркера бактерий - кислоты 181Д11 - у двух видов губок достоверно не различалось (рис 2). Таким образом, состав и доля «бактериальных» ЖК указывает на разнородность сообщества бактерий, ассоциированных с Н. ратсеа и О реппа!а, и примерно равную долю биомассы гетеротрофных бактериальных симбионтов в этих двух видах.

Рис 2. Содержание жирных кислот - маркеров бактерий - в общих липидах морских губок НаЬскоп4гш ратсеа и ОрЫиаяроп&а реппа1а

Анализ возможности применения состава ЖК для хемосистематики исследованных видов губок класса Ретозро/шае

В систематике многих групп организмов наряду с классическими морфологическими методами, широко применяются данные биохимических исследований, частности данные по составу ЖК Анализ литературных и полученных

нами данных показал, что суммарный профиль ЖК имеет небольшую ценность для хемосистематических построений Нам не удалось выявить ярких закономерностей между составом ЖК губок и их принадлежностью к определенному отряду Внутри каждого отряда отмечается большая вариабельность состава ЖК. Причинами этого непостоянства могут служить влияние пищи и места обитания, сезон сбора губок, популяционная изменчивость, вариации в содержании симбионтов

Только для губок из семейств МухПНёае и Асагш<1ае были обнаружены общие закономерности в составе ЖК, которые могут быть в дальнейшем использованы как хемоситематические признаки У представителей семейства МухЛНйае и Асагш<1ае состав ЖК очень схожий, главной ЖК является 28 ЗД5,9,21, и обязательно присутствие кислот 14-Ме-17 0, 15-Ме-180, 16-Ме-19 0, 15-Ме-241А14 и 28 ЗД5,9,22, которые редко встречаются у других губок Надо отметить, что ранее губок Megaclella ер , М и

М гепкеуисЫ из семейства Асагш(1ае также относили к семейству МухЛН<1ае

Как отмечалась в предыдущих главах, некоторые из изученных видов губок имеют уникальные или очень редкие ЖК Поиск этих характеристических компонентов в родственных видах может дать дополнительные основания для дальнейших хемотаксономических построений на низких систематических уровнях. Сравнение состава ЖК бореальных и тропических губок Охотское море и часть Японское моря, в которых были собраны изученные нами губки, относятся к бореальной области Тихого океана. Мы сравнили литературные данные по составу ЖК бореальных и тропических (включая субтропические виды) морских губок класса Demospoпgiae с нашими данными для изученных морских бореальных губок

Соотношение насыщенных и полиненасыщенных ЖК у исследованных нами и другими авторами бореальных видов губок в общих чертах очень схоже (рис 3) Напротив, сравнение состава ЖК бореальных губок с составом ЖК тропических губок выявило весьма заметные отличия (рис 3) Содержание насыщенных ЖК гораздо выше для тропических губок. Для большинства видов тропических губок доля НЖК попадает в диапазон от 50 до 90%, тогда как больше половины бореальных видов губок содержат менее 20% насыщенных ЖК. Обратную картину мы наблюдали при сравнении доли ПНЖК в общих ЖК. По содержанию ПНЖК около половины тропических видов губок попадает в интервал от 10 до 20%, около половины видов бореальных губок попадает в интервал от 60 до 70% (рис. 3) Особенно следует отметить почти полное отсутствие С20 ПНЖК п-3 и п-6 серий у тропических губок Только у небольшого числа видов

тропических губок была обнаружена арахидоновая кислота С другой стороны, у всех видов бореальных губок С20 ПНЖК п-3 и п-6 серий составляют заметный вклад в состав общих ЖК Возможно, высокое содержания ПНЖК у бореальных видов связано с низкой температурой среды обитания, которая, как полагают, активирует синтез и накопление ПНЖК во многих организмах Можно утверждать, что высокое содержание ПНЖК является характерной особенностью всех бореальных видов губок класса Demospongiae

90 -

80 "

70 -

60 -

1 50 -

в 40

§ 30 -

20 -

Д *

• тропические Д бореальные (литература) А бореапьные (наши данные)

Д ^ДД

• •

• •• • • •

• • ** • /

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Содержание НЖК, %

Рис 3 Распределение содержания насыщенных (НЖК) и полиненасыщенных (ПНЖК)

жирных кислот у бореальных и тропических губок класса Demospoпgiae

Мы сравнили суммарное содержание Си.п и 1/т-Сц^ НЖК в липидах тропических и бореальных видов губок. Для 30 бореальных видов губок доля С 15.17 и г/т-С1517 НЖК попадает в узкий диапазон от 0 до 10% Для 30 тропических видов губок диапазон распределение содержания С^.п и /Уш-Сц.п НЖК значительно шире (до 50%) Этой группе НЖК приписывают бактериальное происхождение. Они могут попадать в организм губки с пищей или принадлежать симбиотическим бактериям. Тропические воды обычно олитрофные, и среди доступного для губок планктона доминируют относительно маленькие организмы (<2 цм), такие как бактерии, цианобактерии. В ряде работ было показано, что именно такие маленькие частицы являются основной пищей тропических губок. Однако губки эффективно удерживают и используют в пищу и более

крупные частицы, в частности микроводоросли Бореапьные воды и, в частности, Охотское море являются высоко продуктивными и богаты микроводорослями, которые могут служить пищей для губок Следовательно, на основании сравнения содержания маркерных «бактериальных» ЖК мы полагаем, что, в отличие от тропических губок, вклад бактерий в питание бореальных губок небольшой и замещается вкладом микроводорослей Кроме того, именно микроводоросли являются продуцентом ПНЖК п-3 и п-6 серий, которые были обнаружены в заметных количествах у всех исследованных нами бореальных губок Таким образом, второй характерной особенностью ЖК состава бореальных губок является невысокое по сравнению с тропическими содержание С[5,п и i/a/-C 15,17 ЖК бактериального происхождения и обязательное присутствие ПНЖК n-З и n-б серий, получаемых при питании микроводорослями

III. Выводы

1. Установлены содержание липидов и состав фосфолипидов (ФЛ) у 21 вида губок, для 17 видов губок подобное исследование проведено впервые. Показано, что главными ФЛ в исследованных губках являются фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин и фосфатидилсерин Непостоянство состава ФЛ внутри одного рода и даже вида делает невозможным использования ФЛ как маркерных соединений для хемосистематики губок

2. Изучено распределение жирных кислот (ЖК) общих липидов у 21 вида губок, для 16 видов подобное исследование проведено впервые Было идентифицировано 150 различных ЖК, из которых 19 ЖК были обнаружены в губках впервые Показано широкое распределение этих редких ЖК в губках.

3. Из морской губки Я pamcea были выделены две новые сверхдлинноцепочечные моноеновые кислоты 2-Ме-241Д17 и 2-Ме-26'1Д17, из пресноводной губки В bacillifera - два новых изомера эйкозапентаеновой кислоты 205А5,8,11,14,18/ и 20'5Д5,8,11,15,18/ Структуры этих 4-х ЖК были доказаны рядом химических и физико-химических методов.

4 Показано, что состав ЖК губок зависит от условий обитания и отражает состав пищи и симбиотических микроорганизмов, ассоциированных с губкой

5 Присутствие новых и редких ЖК у некоторых видов губок, может служить дополнительным систематическим признаком вида Определен ряд ЖК, маркерных для семейств Myxillidae и Acarmdae Хемосистематика губок на основе состава общих ЖК не

дает однозначных результатов из-за вариабельности содержания ЖК в зависимости от условий окружающей среды.

6 Отличительными чертами бореальных губок класса Demospongiae по сравнению с тропическими и субтропическими видами являются ярко выраженное преобладание доли полиеновых ЖК над насыщенными, с обязательным присутствием кислот n-З и п-6 серий, а также низкое содержание рядаЖК бактериального происхождения.

Основные публикации по теме диссертации:

1 Родькина С.А. Жирные кислоты как маркеры микроорганизмов ассоциированных с губками // V Региональная конференция естественных наук ДВГУ: Сб. тез -Владивосток. 2002. С. 96-97.

2 Родькина С А. Микроорганизмы ассоциированные с морской губкой Haltchondria panacea II V Региональная конференция естественных наук ДВГУ: Сб. тез. -Владивосток. 2002. С. 98-99.

3 Родькина С А, Латышев Н.А , Имбс А Б Исследование состава жирных кислот общих липидов морской губки Haltchondria panicea II V Региональная конференция естественных наук ДВГУ: Сб. тез. - Владивосток 2002 С. 99-101.

4. Rodkina S.A, Imbs А В, Lathyshev N.A. The using of fatty acids as biomarkers of symbiotic microorganisms associating with sponge Haltchondria panicea // International conference Marine environment: nature, communication and business, Vladivostok, Russia June 1-4, 2003, Book abstr. Vladivostok, 2003, P 35

5. Родькина С А., Латышев H.A., Имбс А Б. Жирные кислоты губки Haltchondria ратсеа из Японского моря // Биоорган, химия. 2003. Т 29, № 4 С. 419-424.

6. Родькина С А. Сравнительная характеристика микробного сообщества двух видов губок из Японского моря с помощью маркеров - жирных кислот // Биология моря. 2003. Т. 29, № 4. С. 287-290.

7. Родькина С А Зависимость состава жирных кислот морской губки Haltchondria ратсеа от сезона, места сбора и морфологических особенностей // Известия ТИНРО. 2003. Т. 135. С. 327-333.

8 Imbs А В , Rodkina S A. Isolation of 2-methyl branched unsaturated very-long fatty acids from marine sponge Haltchondria panicea and identification of them by GC-MS and NMR //Chemistry and Physics of Lipids 2004. V. 129,No.2.P. 173-181

Соискатель

С.А. Родькина

ЗАО «Фартоп» г. Владивосток, ул. Алеутская, 28 Тираж 100 экз. Изготовлено с машинописных листов Отпечатано 10.01.2005

• — 5 12

РНБ Русский фонд

2006-4 1789

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Родькина, Светлана Александровна

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Состав жирных кислот губок.

1.1.1. Насыщенные ЖК.

1.1.2. Моноеновые ЖК.

1.1.3. Полиеновые ЖК.

1.1.4. Жирные кислоты с дополнительными функциональными группами.

1.2. Состав и молекулярные виды фосфолипидов губок.

1.3. Локализация сверхдлинноцепочечных жирных кислот в клетках губок.

1.4. Жирные кислоты ассоциированных с губками микроорганизмов.

1.5. Жирные кислоты и другое органическое вещество, поступающие к губке с пищей

1.6. Хемосистематика представителей типа Spongia на основании состава жирных кислот.

2. Материалы и методы.

2.1. Биологические объекты.

2.2. Реактивы и материалы.

2.3. Приборы и оборудование.

2.4. Экстракция общих липидов.

2.5. Приготовление производных жирных кислот.

2.5.1. Метиловые эфиры ЖК (МЭЖК).

2.5.2. Пирролидиды ЖК.

2.5.3. Гидрирование МЭЖК.

2.5.4. Восстановительный гидразинолиз эйкозапентаеновой кислоты.

2.5.6. Диметилдисульфидные аддукты моноеновых МЭЖК.

2.6. Разделение МЭЖК по степени ненасыщенности на колонке с силикагелем, импрегнированным нитратом серебра.

2.7. Выделение индивидуальных МЭЖК методом ВЭЖХ.

2.8. Тонкослойная хроматография (ТСХ).

2.8.1. Получение золя кремневой кислоты.

2.8.2. Приготовление ТСХ-пластинок на стеклянной подложке.

2.8.3. Обнаружение веществ на ТСХ-пластинках.

2.8.3.1. Неспецифическое обнаружение веществ.

2.8.3.2. Специфическое обнаружение веществ.

2.9. Количественное определение содержания фосфолипидов в экстрактах или хроматографических фракциях.

2.9.1. Рабочие реагенты для количественного определения фосфора.

2.9.2. Количественное определение содержания фосфолипидов в экстрактах.

2.9.3. Количественное определение содержания отдельных классов фосфолипидов.

2.10. Газо-жидкостная хроматография (ГЖХ).

2.11. Газо-жидкостная хроматография - масс-спектрометрия (ГЖХ-МС).

2.12. Статистика.

3. Результаты и обсуждение.

3.1. Определение состава фосфолипидов и жирных кислот.

3.1.1. Содержание общих липидов и состав фосфолипидов.

3.1.2. Состав жирных кислот (ЖК).

3.1.2.1. Насыщенные ЖК.

3.1.2.2. Моноеновые ЖК.

3.1.2.3. Полиеновые ЖК.

3.1.3. Идентификация жирных кислот методом масс-спектрометрии.

3.1.3.1. Пирролидиды насыщенных ЖК.

3.1.3.2. Пирролидиды моноеновых ЖК.

3.1.3.3. Пирролидиды полиеновых ЖК.

3.2. 2-Метил-замещенные моноеновые СДЖК из губки Я panicea.

3.3. Изомеры эйкозапентаеновой кислоты из губки В. bacillifera.

3.4. Ревизия состава ЖК губок, изучавшихся ранее.

3.4. Зависимость состава ЖК губки Н. panicea от сезона, места сбора и морфологических особенностей.

3.5. Сравнительная характеристика симбиотических микроорганизмов губок Я. panicea и О. pennata методом маркерных ЖК.

3.6. Анализ возможности применения состава ЖК для хемосистематики исследованных видов губок класса Demospongiae.

3.7. Сравнение состава ЖК бореальных и тропических губок.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Состав, распределение и химическая структура липидов и жирных кислот губок класса Demospongiae"

Губки представляют собой очень древнюю группу многоклеточных организмов: их останки были найдены в отложениях нижнего кембрия (около 600 млн. лет назад). Как полагают некоторые исследователи (Brinkman, 1966), уже в кембрийском море существовала довольно богатая фауна губок, представленная почти всеми классами и отрядами, существующими и в современный период. В настоящее время описано приблизительно 5000 видов губок, которые разделяют на три отдельные класса: Hexactinellida (стеклянные губки), Demospongiae и Calcarea (известковые губки) (Hooper, Van Soest, 2002). У всех губок отсутствуют настоящие дифференцированные ткани. Тело губок состоит из двух слоев - эктодермального и эндодермального, между которыми расположен слой особого бесструктурного вещества - мезохил. Нервная система у губок отсутствует (Simpson, 1984). В большинстве случаев в теле губки можно обнаружить многочисленные и разнообразные симбиотические организмы. Симбионты могут занимать до 40% от тканевого объема губки. Они играют важную роль в экологии губок и биотрансформации органического вещества (Wilkinson, 1987).

Актуальность работы. Губки широко распространены в морских и пресноводных экосистемах. Они часто встречаются в массовом количестве, в ряде случаев являются ведущими формами в водных биоценозах (Колтун, 1959; Wilkinson, 1987). Уникальная способность губок адаптироваться к различным экосистемам во многом обусловлена возможностью удовлетворять свои пищевые запросы из разных источников, что является следствием специфической организации этих симбиотических организмов на биохимическом уровне. Роль этих животных в экосистемах велика. В сообществах коралловых рифов губки участвуют в процессах создания первичной продукции (за счет фотосинтезирующих симбионтов), азотфиксации (за счет цианобактериальных симбионтов), а также в процессах нитрификации и деструкции органического вещества.

Губки вызывают к себе огромный интерес у липидологов. Оказалось, что эти животные обладают самым большим среди водных животных разнообразием стеринов, липидов и жирных кислот (ЖК), которые имеют необычные, а иногда и уникальные, структуры. Некоторые необычные липиды обладают биологической активностью (Ciminiello et al., 1991; Ichiba et al., 1995; Fatope et al., 2000; Borbone et al., 2001, Carballeira et al., 2002; Meyer, Guyot, 2002). В настоящее время основными направлениями в области изучения липидов губок являются обнаружение новых компонентов, установление их структуры и путей биосинтеза, изучение их свойств и роли в организме (Carballeira et al., 2002; Barnathan et al., 2003; De Rosa et al., 2003; Dembitsky et al., 2003).

Данные о лнпидном составе губок позволяют расширить наши представления о многообразии биологических молекул и имеют значение для хемосистематики этой группы животных. ЖК используют как маркеры отдельных групп организмов, например, при изучении структуры микробных сообществ или для исследования пищевых взаимоотношений в экосистемах. Возможность по маркерным ЖК оценить состав и биомассу популяции микроорганизмов, ассоциированных с губкой, определить пищевые предпочтения губок позволяет четче понять роль губок в экологических процессах.

Анализ литературных данных показывает, что наиболее изученными по составу липидов и ЖК являются губки тропических и субтропических областей, тогда как губки из бореальных областей практически не исследованы. Доля губок в биомассе бентоса Охотского, Японского морей и в оз. Байкал достигает значительных величин, и, очевидно, губки играют важную роль в донных биоценозах этих акваторий. Таким образом, получение новых фундаментальных знаний о составе, структуре и биоконверсии липидов и ЖК практически неисследованных холодноводных видов губок является актуальной темой современной биохимии липидов.

Цель работы. Изучение закономерностей распределения и химической структуры липидов и жирных кислот в губках класса Demospongiae, определение их значения как хемосистематических маркеров и маркеров пищевых взаимоотношений. Задачи исследования.

1. Определить состав липидов и ЖК в некоторых видах губок класса Demospongiae из Охотского, Японского морей и оз. Байкал.

2. Провести поиск и установить химическую структуру новых ЖК губок.

3. Определить зависимость состава ЖК губки Halichondria panicea от сезона, места сбора и морфологических особенностей.

4. Дать сравнительную характеристику симбиотического сообщества губок Я panicea и Ophlitaspongia pennata с помощью метода маркерных ЖК.

5. Определить липидные хемосистематические маркеры для губок семейств Myxillidae и Acarnidae.

6. Определить различия в составе ЖК между бореальными и тропическими видами губок.

Научная новизна и практическая значимость. Впервые определен состав фосфолипидов и ЖК из 17 видов губок Охотского моря, уточнен и дополнен состав фосфолипидов и ЖК из 4 видов губок Японского моря и оз. Байкал. Впервые в губках обнаружены новые жирные кислоты (13-Ме-16:0, 14-Ме-17:0, 15-Ме-18:0, 16-Ме-19:0, ai-15:1 А4, М6:1Д5, 10,14-Ме2-15:1Д6, 18:1Д6, 18:1Д8, 22:1Д16, 23:1Д15, 15-Ме-24:1Д14, 17

Ме-26:1Д16, 28:2А9,21, 28:ЗА5,9,22). Впервые выделены и охарактеризованы методами масс-спектрометрии, 'Н и 13С ЯМР две новые 2-метил-замещенные сверхдлинноцепочечные ненасыщенные кислоты (2-Ме-24:1А-17 и 2-Ме-26:1Д-17), а также два уникальных изомера эйкозапентаеновой кислоты. Впервые показано, что главным изомером эйкозапентаеновой кислоты в пресноводной губке В. bacilli/era является кислота 20:5Д5с,8с,1 lc,14c,18f. Установлено, что основное влияние на состав ЖК массового вида морской губки Н. рапгсеа оказывает сезон и место обитания. Показано, что в ряде случаев ЖК могут быть использованы для хемосистематики губок на уровне семейств и как маркеры симбионтов губок. Выявлены характерные отличия состава ЖК бореальных видов от тропических видов губок. Результаты работы могут быть использованы для изучения пищевых взаимодействий в сложных экосистемах методом биохимических маркеров.

Апробация полученных результатов. Основные результаты были представлены на Ежегодной научной конференции ИБМ, (Владивосток, 2001), V Региональной конференции по актуальным проблемам экологии, морской биологии и биотехнологии, (Владивосток, 2002), Международной конференции «Marine environment: nature, communication and business» (Владивосток, 2003).

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы и приложений. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 22 таблиц, 24 рисунков и 177 литературные ссылки.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Родькина, Светлана Александровна

Заключение

В настоящее время изучен состав липидов и жирных кислот многих видов морских и пресноводных губок, при этом доказано, что губки обладают самым большим среди живых организмов разнообразием жирных кислот. Самой яркой особенностью губок является высокое содержание сверхдлинноцепочечных ЖК, с длиной углеродной цепи более 22 атомов углерода. Эти кислоты входят в состав главных компонентов биологических мембран - фосфолипидов и, по-видимому, определяют свойства мембранных структур клеток губок. Исследование липидов и жирных кислот губок, установление их структуры и путей биосинтеза могут помочь в объяснении ряда феноменов, связанных с жизнедеятельностью губок. В частности, уникальные адаптационные способности губок, которые на протяжении столь длительного времени (начиная с докембрия) продолжают жить в самых разных водных экосистемах (во всех географических областях, от мелководья до больших глубин, в водах с различной соленостью и температурой), могут получить новую трактовку в свете результатов исследований в области химии и биохимии липидов губок.

1. Установлены содержание липидов и состав фосфолипидов (ФЛ) у 21 вида губок, для 17 видов губок подобное исследование проведено впервые. Показано, что главными ФЛ в исследованных губках являются фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин и фосфатидилсерин. Непостоянство состава ФЛ внутри одного рода и даже вида делает невозможным использования ФЛ как маркерных соединений для хемосистематики губок.

2. Изучено распределение жирных кислот (ЖК) общих липидов у 21 вида губок, для 16 видов подобное исследование проведено впервые. Было идентифицировано 150 различных ЖК, из которых 19 ЖК были обнаружены в губках впервые. Показано широкое распределение этих редких ЖК в губках.

3. Из морской губки Н. panicea были выделены две новые сверхдлинноцепочечные моноеновые кислоты 2-Ме-24:1Д17 и 2-Ме-26:1Д17, из пресноводной губки В. bacillifera — два новых изомера эйкозапентаеновой кислоты 20:5А5,8,11,14,18? и 20:5Д5,8,11Д5Д8/. Структуры этих 4-х ЖК были доказаны рядом химических и физико-химических методов.

4. Показано, что состав ЖК губок зависит от условий обитания и отражает состав пищи и симбиотических микроорганизмов, ассоциированных с губкой.

5. Присутствие новых И редких ЖК у некоторых видов губок, может служить дополнительным систематическим признаком вида. Определен ряд ЖК, маркерных для семейств Myxillidae и Acarnidae. Хемосистематика губок на основе состава общих ЖК не дает однозначных результатов из-за вариабельности содержания ЖК в зависимости от условий окружающей среды.

6. Отличительными чертами бореальных видов губок класса Demospongiae по сравнению с тропическими и субтропическими видами является ярко выраженное преобладание доли полиеновых ЖК над насыщенными, с обязательным присутствием кислот n-З и п-6 серий, а также низкое содержание ряда ЖК бактериального происхождения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Родькина, Светлана Александровна, Владивосток

1. Дембицкий В.М. Жирнокислотный состав пресноводных губок класса Demospongiae из оз.

2. Байкал. I. Род Lubomirskia // Хим. Природ. Соед. 1981а. №. 4. С. 511-513. Дембицкий В.М. Жирнокислотный состав пресноводных губок класса Demospongiae из оз. Байкал. II. Род Swartchewskia и Baicalospongia // Хим. Природ. Соед. 1981b. №. 4. С. 513-515.

3. Дембицкий В.М. Плазмологенный состав фосфолипидов пресноводных губок класса

4. Halichondria panicea from the coast of Hokkaido, Japan // Fish. Sci. 1998. V. 64, No. 1. P. 136-139.

5. Arts M.T., Ackman R.G., Holub B.J. "Essential fatty acids" in aquatic ecosystems: a crucial link between diet and human health and evolution // Can. J. Fish. Aquat. Sci. 2001. V. 58. P. 122-137.

6. Ayanoglu E., Kurtz К., Kornprobst J.M., Djerassi С. New natural 2-acetoxy fatty acids using chemical ionization and electron impact mass spectrometry // Lipids. 1985. V. 20, No. 3. P. 141-144.

7. Ayanoglu E., Popov S., Komprobst J.M., Abound-Bichara A., Djerassi C. Phospholipid studies of marine organisms: New a methoxy acids from Higginsia tethyoides И Lipids. 1983. V. 18. P. 830-836.

8. Bergquist P.R., Lawson M.P., Lavis A., Cambie R.C. Fatty acid composition and the classification of the Porifefa// Biochem. Syst. Ecol. 1984. V. 12, No. 1. P. 63-84.

9. Bligh E.G., Dyer W.J. A rapid method of total lipid extraction and purification // Can. J. Biochem. Physiol. 1959. V. 37. P. 911-918.

10. Boger H. Versuch uber das phylogenitische System der Porifera // Meyniana. 1988. V. 40. P. 143-154.

11. Borbone N., De Marino S., Iorizzi M., Zollo F., Debitus C., Ianaro A., Pisano B. New glycosphingolipids from the marine sponge Aplysinella rhax and their potential as nitric oxide release inhibitors // Eur. J. Org. Chem. 2001. No. 24. P. 4651-4656.

12. Brantley S.E., Molinski T.F., Preston C.M., Delong E.F. Brominated acetylenic fatty acids from Xestospongia sp, a marine sponge-bacteria association // Tetrahedron. 1995. V. 51, No. 28. P. 7667-7672.

13. Brinkmann P.R. Abriss der Geologie. Historische geologie. Stuttgart. 1966. P. 360.

14. Burgess J.R., Delarosa R.I., Jacobs R.S., Butler A. A new eicosapentaenoic acid formed from arachidonic acid in the coralline red algae Bossella orbigiana //Lipids. 1991. V. 26. P. 126165.

15. Buija A.M., Hill R.T. Microbial symbionts of the Australian Great Barrier Reef sponge, Candidaspongia flabellataJ! Hydrobiologia. 2001. V. 461. P. 41-47.

16. Busser H.J., Denner E.B.M., Lubitz W. Classification and identification of bacteria: current approaches to an old problem. Overview of methods used in bacterial systematics // J. Biotechnol. 1996. V. 47. P. 3-38.

17. Carballeira N.M., Alicea J. Novel methoxylated FA from the Caribbean sponge Spheciospongia cuspidifera // Lipids. 2002. V. 37, No. 3. P. 305-308.

18. Carballeira N.M., Alicea J. The first naturally occurring alpha-methoxylated branched-chain fatty acids from the phospholipids of Amphimedon complanata // Lipids. 2001. V. 36, No. 1. P. 83-87.

19. Carballeira N.M., Betancourt J.E., Orellano E.A., Gonzalez F.A. Total synthesis and biological evaluation of (5Z,9Z)-5,9-hexadecadienoic acid, an inhibitor of human topoisomerase I // J. Nat. Prod. 2002. V. 65, No. 11. P. 1715-1718.

20. Carballeira N.M., Colon R., Emiliano A. Identification of 2-methoxyhexadecanoic acid in Amphimedon compressa II J. Nat. Prod. 1998. V. 61. P. 675-676.

21. Carballeira N.M., Cruz H., AyalaN.L. Total synthesis of 2-methoxy-14-methylpentadecanoic acid and the novel 2-methoxy-14-methylhexadecanoic acid identified in the sponge Agelas dispar И Lipids. 2002. V. 37, No. 11. P. 1033-1037.

22. Carballeira N.M., Emiliano A. Novel brominated phospholipids fatty-acids from the Caribbean sponge Agelas sp // Lipids. 1993. V. 28, No. 8. P. 763-766.

23. Carballeira N.M., Emiliano A., Morales R. Positional distribution of octadecadienoic acids in sponge phosphatidyletanolamines // Lipids. 1994. V. 29, No. 7. P. 523-525.

24. Carballeira N.M., Emiliano A., Rodriguez J., Reyes E.D. Isolation and characterization of novel 2-hydroxy fatty acids from the phospholipids of the sponge Smenospongia aurea II Lipids. 1992. V. 27, No. 9. P. 681-685.

25. Carballeira N.M., Lopez M.R. On the isolation of 2-hydroxydocosanoic and 2hydroxytricosanoic acids from the marine sponge Amphimedon compressa II Lipids. 1989. V. 24, No. l.P. 89-91.

26. Carballeira N.M., Maldonado L. 7-Methyl-8-hexadecenoic acid a novel fatty-acid from the marine sponge Desmapsama anchorata // Lipids. 1988. V. 23, No. 7. P. 690-693.

27. Carballeira N.M., Maldonado L. Identification of 5,9-hexadecadienoic acid in the marine sponge Chondrilla nucula II Lipids. 1986. V. 21, No. 7. P. 470-471.

28. Carballeira N.M., Maldonado L. New phospholipids fatty acids from the Caribbean sponge Ectyoplasia ferox // Lipids. 1989. V. 24, No. 5. P. 371-374.

29. Carballeira N.M., Maldonado L. The phospholipid fatty acids of the marine sponge Xestospongia muta II Lipids. 1988. V. 23, No. 7. P. 682-684.

30. Carballeira N.M., Maldonado L., Porras B. Isoprenoid fatty acids from marine sponges. Are sponges selective? // Lipids. 1987. V. 22, No. 10. P. 767-769.

31. Carballeira N.M., Maldonado M.E. On the isolation of the new fatty-acid 6,11-eicosadienoic (20-2) and related 6,11-dienoic acids from the sponge Euryspongia rosea II Lipids. 1989. V. 24, No. 7. P. 665-668.

32. Carballeira N.M., Maldonado M.E., Rivera E., Porras B. The fatty acid 4,8,12trimethyltridecanoic as a common constituent of the phospholipids of the sponge families Spirastrellidae and Clionidae // Biochem. Syst. Ecol. 1989. V. 17, No. 4. P. 311-314.

33. Carballeira N.M., Negron V., Reyes E.D. Novel monounsaturated fatty acids from the sponges Amphimedon compressa and Mycale laevis II J. Nat. Prod. 1992. V. 55, No. 3. P. 333-339.

34. Carballeira N.M., Negron V., Reyes E.D. Novel naturally-occurring alpha-methoxy acids from the phospholipids of Caribbean sponge // Tetrahedron. 1992. V. 48, No. 6. P. 1053-1058.

35. Carballeira N.M., Pagan M. Identification and total synthesis of a novel dimethylated fatty acid from the Caribbean sponge Calyxpodatypa И J. Nat. Prod. 2000. V. 63, No. 5. P. 666-669.

36. Carballeira N.M., Pagan M. New methoxylated fatty acids from the Caribbean sponge Callyspongiafallax//J. Nat. Prod. 2001. V. 64, No. 5. P. 620-623.

37. Carballeira N.M., Pagan M., Rodriguez A.D. Identification and total synthesis of novel fatty acids from the Caribbean sponge Calyx podatypa II J. Nat. Prod. 1998. V. 61, No. 8. P. 10491052.

38. Carballeira N.M., Restituyo J. Identification of the new 11,15-icosadienoic acid and related acids in the sponge Amphimedon complanata II J. Nat. Prod. 1991. V. 54. P. 315-317.

39. Carballeira N.M., Reyes E.D. Identification of the new 23-Methyl-5,9 pentacosadienoic acidsin the sponge Cribrochalina vasculum I I Lipids. 1990. V. 25, No. 1. P. 69-71.

40. Carballeira N.M., Reyes E.D. Novel very long-chain fatty-acids from the sponge Petrosia pellasarca II J. Nat. Prod. 1990. V. 53, No. 4. P. 836-840.

41. Carballeira N.M., Rodriguez J. 2 Novel phospholipid fatty acids from the Caribbean sponge Geodia gibberosa II Lipids. 1991. V. 26, No. 4. P. 324-326.

42. Carballeira N.M., Sepulveda J. A. 2 Novel naturally-occurring alpha-methoxy acids from the phospholipids of 2 Caribbean sponges // Lipids. 1992. V. 27, No. 1. P. 72-74.

43. Carballeira N.M., Shalabi F. Identification of naturally-occurring trans, trans delta-5,9 fatty acids from the sponge Plakortis halichondroides II Lipids. 1990. V. 25, No. 12. P. 835-840.

44. Carballeira N.M., Shalabi F. Novel brominated phospholipids fatty-acids from the Caribbean sponge Petrosia sp II J. Nat. Prod. 1993. V. 56, No. 5. P. 739-746.

45. Carballeira N.M., Shalabi F. Unusual lipids in Caribbean sponges Amphimedon viridis and Desmapsamma anchorata II J. Nat. Prod. 1994. V. 57, No. 8. P. 1152-1159.

46. Carballeira N.M., Shalabi F., Maldonado M.E. Identification of the new 18-hexacosenoic acid in the sponge Thalysias juniperina II Lipids. 1990. V. 25, No. 4. P. 235-237.

47. Carballeira N.M., Thompson J.E., Ayanoglu E., Djerassi C. Biosynthesis studies of marine lipids 5. The biosynthesis of long-chain branched fatty acids in marine sponges // J. Org.Chem. 1986. V. 51, No. 14. P. 2751-2756.

48. Carreau J.P., Dubacq J.P. Adaptation of macro-scale method to the micro-scale for fatty acid methyl transesterification of biological lipid extracts // J. Chromatogr. 1978. V. 151. P. 384390.

49. Christie W.W., Brechany E.Y., Marekov I.N., Stefanov K.L., Andreev S.N. The fatty acids of the sponge Hymeniacidon sanguinea from the Black Sea // Сотр. Biochem. Physiol B-Biochem. Molec. Biol. 1994. V. 109, No. 2-3. P. 245-252.

50. Christie W.W. Equivalent chain-lengths of methyl esters derivatives of fatty acids on gas chromatography // J. Chromatogr. A. 1988. V. 447. P. 305-314.

51. Christie W.W. Structural analysis of fatty acids. In: Christie W.W. (Ed.). Advances in Lipid Methodology. Four. Oily Press. Dundee. 1997. P. 119-169.

52. Christie W.W., Brechany E.Y., Stefanov K., Popov S. The fatty-acids of the sponge Dysidea fragilis from the black-sea // Lipids. 1992. V. 27, No. 8. P. 640-644.

53. Ciminiello P., Fattorusso E., Magno S., Mangoni A., Ialenti A., Dirosa M. Furan fatty acid steryl esters from the marine sponge Dictyonella incise show inflammatory activity // Experientia. 1991. V. 47. P. 739-743.

54. Cossin A.R., Friedlander M.J., Prosser C.L. Correlation between behavioural temperature adaptations of goldfish and the viscosity and fatty acid composition of their sympatic membranes //J. Com. Physiol. 1997. V. 120. P. 109-121.

55. Cossin A.R., Lee J.A. The adaptationof membrane structure and lipid composition in cod. In: Gills R. (Ed.) Circulation, respiration, and metabolism. Springer. Berlin. Heidelberg. New York. 1985. P. 266-288.

56. Dalsgaard J., John M., Kattner G., Miiller-Navarra D., Hagen W. Fatty acid trophic markers in the pelagic marine environment // Advances in marine biology. 2003. V. 46. P. 225-340.

57. Dasgupta A., Ayanoglu E., Djerassi C. Phospholipid studies of marine organisms new branched fatty acids from Strongylophora durissima II Lipids. 1984. V. 19, No. 10. P. 768-776.

58. Dasgupta A., Ayanoglu E., Tomer K.B., Djerassi C. High performance liquid chromatography and fast atom bombardment mass spectrometry of unususl branched and unsaturated phospholipids molecular species // Chem. Phys. Lipids. 1987. V. 43. P. 101-111.

59. Dasgupta A., Ayanoglu E., Wegmann-Szente A., Tomer K.B., Djerassi C. Mass spectralbehavior and HPLC of some unusual molecular phospholipid species // Chem. Phys. Lipids. 1986. V. 41. P. 335-347.

60. De Rosa S., Iodice C., Nechev J., Stefanov K., Popov S. Composition of the lipophilic extract from the sponge Suberites dontuncula II J. Serb. Chem. Soc. 2003. V. 68, No. 4-5. P. 249256.

61. De Rosa S., Tommonaro G., Slantchev K., Stefanov K., Popov S. Lipophylic metabolites from the marine sponge Ircinia muscarum and its cell cultures // Mar. Biol. 2002. V. 140, No. 3. P. 465-470.

62. Dembitsky V.M., Kashin A.G., Karaganova M.V. Phospholipid and fatty acid composition of the fresh-water sponge Euspongilla lacustris from Volga river estuary // Сотр. Biochem. Physiol. B-Biochem. Mol. Biol. 1991. V. 100, No. 1. P. 185-187.

63. Dembitsky V.M., Rezanka Т. Unusually high levels of eicosatetraenoic, eicosapentaenoic, and docosahexaenoic fatty acids in Palestinian freshwater sponges // Lipids. 1996. V. 31, No. 6. P. 647-650.

64. Dembitsky V.M., Rezanka Т., Srebnik M. Lipid compounds of freshwater sponges: family Spongillidae class Demospongiae // Chem. Phys. Lipids. 2003. V. 123, No. 2. P. 117-155.

65. Duque C., Cepeda N., Martinez A. The steryl ester and phospholipids fatty acids of the sponge Agelas conifera from the Colombian Caribbean // Lipids. 1993. V. 28, No. 8. P. 767-769.

66. Ederington M.C., McManus G.B., Harvey H.R. Trophic transfer of fatty acids, sterols, and a triterpenoid alcohol between bacteria a ciliate, and copepod Acartia tonsa II Limnol. Oceanogr. 1995. V. 40, No. 5. P. 860-867.

67. Elenkov I.Y., Stefanov K.L., Kljajic Z., Dogovic N., Gasic M.J., Popov S.S. The fatty acid composition of Dysidea fragilis from the Black Sea and Adriatic Sea // J. Serb. Chem. Soc. 1998. V. 63, No. 8. P. 635-638.

68. Fatope M.O., Adoum O.A., Takeda Y. C-18 acetylenic fatty acids of Ximenia americana with potential pesticidal activity // J. Agric. Food Chem. 2000. V. 48, No. 5. P. 1872-1874.

69. Garson M.J., Zimmermann M.P., Hoberg M., Larsen R.M., Battershill C.N., Murphy P.T. Brominated long-chain fatty acids from the phospholipids of the tropical marine sponge Amphimedon terpenensis И Lipids. 1993. V. 28, No. 11. P. 1011-1014.

70. Genius R.B. Biomembranes. Molecular structure and function. Springer-Verlag. New York Berlin. Heidelberg. Tokyo. 1997. P. 622.

71. Gillan F.T., Stoilov I.L., Thompson JE., Hogg R.W., Wilkinson C.R., Djerassi C. Fatty acids as biological markers for bacterial symbionts in sponges // Lipids. 1988. V. 23. P. 1139-1145.

72. Gunstone F.D., Harwood J.L., Padley F.B. The Lipid Handbook. Ed: Gunstone F.D. Harwood J.L. Padley F.B. Chapman. Hall. London. 1994. P. 47-223.

73. Gunstone F.D., Frost D.J. The PMR analysis of non-conjugated alkenoic and alkynoic acids and esters // Chem. Phys. Lipids. 1975. V. 15. P. 53-85.

74. Hahn S., Lam W., Wu I., Silva C.J., Djerassi C. Unusual pattern of fatty acid biosynthesis // J. Biol.Chem. 1989. V. 264, No. 35. P. 448-455.

75. Hill M.S. Symbiotic zooxantellae enhance boring and growth rate of the tropical sponge Anthosigmella varians forma varians I I Mar. Biol. 1996. V. 125. P. 649-654.

76. Hinde R., Pironet F., Borowitzka M.A. Isolation of Oscillatoria spongeliae, the filamentous cyanobacterial symbiont of the marine sponge Dysidea herbacea // Mar. Biol. 1994. V. 119. P. 99-104.

77. Joh Y.G., Elenkov I.J., Stefanov K.L., Popov S.S., Dobson G., Christie W.W. Novel di-, tri-, and tetraenoic fatty acids with bis-methylene- interrupted double-bond systems from the sponge Haliclona cinerea И Lipids. 1997. V. 32, No. 1. P. 13-17.

78. Johns R.B., Gillan F.T., Nichols P.D. Lipid composition of a symbiotic prochlorophyte in relation to its host // Сотр. Biochem. Physiol. 1981. V. 69. P. 843-849.

79. Joseph J.D. Lipid composition of marine and estuarine invertebrates: Porifera and Cnidaria // Prog. Lipid Res. 1979. VI. 18. P. 1-30.

80. Kaneda T. Iso- and anteiso-fatty acids in bacteria: biosynthesis, function and taxonomic significance // Microbial. Reviewss. 1991. V. 55. P. 288-302.

81. Margot H., Acebal C., Toril E., Amils R., Puentes J.L.F. Consistent association of crenarchaeal Archaea with sponges of the genus Axinella // Mar. Biol. 2002. V. 140. P. 739-745.

82. Meyer M., Guyot M. 5,9,23-triacontatrienoic methyl ester, an elastase inhibitor from the marine sponge ChondrillanuculaIILipids. 2002. V. 37, No. 11. P. 1109-1 111.

83. Morales W., Litchfield C. Unusial C24, C25, C26 and C27 polyunsaturated fatty acid of the marine sponge Microciona prolifera // Biochem. Biophis. Acta. 1976. V. 431. P. 206-216.

84. Nechev J., Christie W.W., Robaina R., De Diego F., Popov S., Stefanov K. Lipid composition of the sponge Verongia aerophoba from the Canary Islands // Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2002. V. 104, No. 12. P. 800-807.

85. Nechev J., Christie W.W., Robaina R., Ivanova A., Popov S., Stefanov K. Chemical composition of the sponge Chondrosia reniformis from the Canary Islands // Hydrobiologia. 2002. V. 489, No. 1-3. P. 91-98.

86. Nemoto Т., Yoshino G., Ojika M., Sakagami Y. Amphimic acids and related long-chain fatty acids as DNA topoisomerase-1 inhibitors from an Australian sponge Amphimedon sp. И Tetrahedron. 1997. V. 53. P. 16699-16710.

87. Nichols D.S., McMeekin T.A. Biomarker techniques to screen for bacteria that produce polyunsaturated fatty acids // J. Microbiol. Methods. 2002. V. 48. P. 161-170.

88. Osinga R., Armstrong E., Burgess J.G., Hoffmann F., Reitner J., Schumann-Kindel G. Sponge-microbe associations and their importance for sponge bioprocess engineering // Hydrobiologia. 2001. V. 461, No. 1. P. 55-62.

89. Reiswig H.M. In situ feeding in two shallow-water hexactinellid sponges // In: Rutzler K. (Ed.) New perspectives in sponge biology. Smithsonian Institution Press. Washington. DC. 1990. P. 504-510.

90. Reiswig H.M., Mackie G.O. Studies on hexactinellid sponges III. Taxonomic status of

91. Hexactinellida within the Porifera // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. 1983. V. 301. P. 419428.

92. Reitner J., Mehl D. Monophyly of the Porifera // Verh Naturwiss Ver Hamburg (NF). 1996. V. 36. P. 5-32.

93. Rezanka Т., Dembitsky V.M. Multibranched polyunsaturated and very-long-chain fatty acids of freshwater Israeli sponges //J. Nat. Prod. 2002. V. 65. P. 709-713.

94. Sacchi R, Medina I, Paolillo L, Addeo F. High-resolution C-13-NMR olefinic spectra of DHA and EPA acids, methyl-esters and triacylglycerols. Chem. Phys. Lipids. 1994. V. 69. P. 6573.

95. Sargent J.R., Bell M.V., Henderson R.J., Tocher D.R. The lipids. In: Halver J (Ed) Fish nutrition. Academic. New York. 1989. P. 153-218.

96. Sargent J.R., Parkes R.J., Mueller-Harvey I., Henderson R.J. Lipid biomarkers in marine ecology. In: Sleigh MA (Ed) Microbes in the sea. Horwood. Chichester. UK. 1987. P. 119138.

97. Sata N.U., Kaneniwa M., Masuda Y., Ando Y., Iida H. Fatty acid composition of two species of Japanese freshwater sponge Heterorotula multidentata and Spongilla alba II Fisheries Science. 2002. V. 68. P. 236-238.

98. Shimizu S., Jareonkitmongkol S., Kawashima H., Akimoto K., Yamada H. Prodaction of novel omega-1-eicosapentaenoic acid by Moritella alpine 1S-4 grown on 1-hexadecene // Arch. Microbiol. 1991. V. 156. P. 163-166.

99. Simpson T.L. The cell biology of sponges. New York. Springer-Verlag. New York. 1984. P. 114-121.

100. Smoot J.C., Finday R.H. // Spatial and seasonal variation in a reservoir sedementary microbial community as determined by phospholipid analysis // Microb. Ecol. 2001. V. 42. P. 350-358.

101. Thiel V., Blumenberg M., Hefter J., Pape Т., Pomponi S., Reed J., Reitner J., Worheide G., Michaelis W. A chemical view of the most ancient metazoa biomarker chemotaxonomy of hexactinellid sponges //Naturwissenschaften. 2002. V. 89, No. 2. P. 60-66.

102. Thiel V., Jenisch A., Worheide G., Lowenberg A., Reitner J., Michaelis W. Mid-chain branched alkanoic acids from "living fossil" demosponges: a link to ancient sedimentary lipids? // Org. Geochem. 1999. V. 30, No. 1. P. 1-14.

103. Tocher D. R., Leaver M. J., Hodgson P. A. Recent advances in the biochemistry and molecular biology of fatty acyl desaturases // Prog. Lipid Res. 1998. V. 37, No. 2/3. P. 73-117.

104. Toschi, T.G., Capella, P., Holt, C. and Christie, W.W. A comparison of silver ion HPLC plus GC with Fourier-transform IR spectroscopy for the determination of firans-double bonds in unsaturated fatty acids // J. Sci. Food Agr. 1993. V. 61. P. 261-266.

105. Vaskovsky V.E., Kostetsky E.Y., Vasendin J.M. Universae reagent for determination of phosphorea in lipids // J. Chromatogr. 1975. V. 114. P. 129-141.

106. Verhoeven N.M., Jakobs C. Human metabolism of phytanic acid prystanic acid // Prog. Lipid Res. 2001. V. 40. P. 453-466.

107. Volkman J. K., Barrett S. M., Blackburn S. I., Mansour M. P., Sikes E. L., Gelin, F. O.

108. Microalgal biomarkers: a review of recent research developments // Org. Geochem. 1998. V. 29. P. 1163-1179.

109. Vysotskii M.V., Imbs A.B., Popcov A.A., Latyshev N.A., Svetashev V.I. // Trans-olefinic veryOlong-chain fatty acid (26:3A5c,9c,19t) in lipid of freshwater sponges of Lake Baikal // Tetrhedron Lett. 1990. V. 31. P. 4367-4370.

110. Wagner H., Horhammer L., Walff P. Dunnschtchromatographic von phosphatiden und glykolipiden // Biochem. Z. 1961. V. 334, No. 2. P. 129-141.

111. Wilkinson C.R. Interocean differences in size and nutrition of coral reef sponge populations // Science. 1987. V. 236. P. 1434-1446.

112. Wilkinson C.R. Microbial association in sponges. I.Ecology, physiology and microbial populations of Coral Reef sponges // Mar. Biol. 1978. V. 49. P. 161-167.

113. Wilkinson C.R. Microbial association in sponges.II. Numerical analysis of sponge and water bacterial population // Mar. Biol. 1978. V. 49. P. 169-176.

114. Wilkinson C.R., Carrone R. nutrition in marine sponges.Invilvement of symbiotic bacteria in the uptake of dissolved carbon. In Smith D.C., Tiffon Y. (Ed.). Nutrition in the lower Metazoa. Pergamon. 1980. P. 157-161.

115. Wolff RL, Deluc LG, Marpeau AM, Comps B. Chemotaxonomic differentiation of conifer families and genera based on the seed oil fatty acid compositions: multivariate analyses. Trees // Struct. Funct. 1997. V. 12, No. 2. P. 57-65.

116. Wolff RL. Clarification on the taxonomic position of Sciadopitys verticillata among coniferophytes based on seed oil fatty acid compositions // J. Amer. Oil. Chem. Soc. 1998. V. 75, No. 6. P. 757-758.

117. Yahel G., Sharp J.H., Marie D., Hase C., Genin A. In situ feeding and element removal in the symbiont-bearing sponge Theonella swinhoei: Bulk DOC is the major source for carbon // Limnol. Oceanogr. 2003. V. 48, No. 1. P. 141-149.

118. Zhukova N. V., Aizdaicher N. A. Fatty acid composition of 15 species of marine microalgae // Phytochemistry. 1995. V. 39. P. 351-356.

119. Zhukova N. V., Titlyanov E. A. Fatty acid variations in symbiotic dinoflagellates from Okinawan Corals // Phytochemistry. 2003. V. 62. P. 191-195.

120. Zhukova N.V., Kharlamenko V.I. Sources of essential fatty acids in the marine microbial loop // Aqut. Microb. Ecol. 1999. V. 17. P. 153-157.

121. Zimmerman M.P., Thomas F.C., Thompson J.E., Djerassi C., Streiner H. The distribution of lipids and sterols in the cell types from the sponge Pseudaxinyssa sp II Lipids. 1989. V. 24, No. 3. P. 210-216.

122. Виды губок M ОЛ (мг/г сырого веса) M ОЛ (мг/г сухого веса) ФЛ (% от ОЛ)

123. Baicalospongia bacillifera 3,5 37,5 29,6

124. Ophlitaspongia pennata 8,4 58,9 32,3

125. Esperiopsis digitata 5,5 42,6 29,4

126. Forcepia uschakowi 6,1 59,7 39,2

127. Halichondria panicea 4,9 50,1 30,2

128. Haliclona af gracilis 6,0 56,6 38,8

129. Haliclona sp. 6,2 66,3 40,2

130. Homoeodictya pulviliformis 22,2 195,2 24,5

131. Hymeniacidon assimilis 4,9 20,5 31,11.bomirskia baicalensis 12,5 125,1 19,6

132. Melonachora kobjakovae 5,7 57,5 43,01. Mycale sp. 8,5 60,1 32,7

133. Megaciellafragilis 6,2 59,7 36,4

134. Megaciellasp. 5,1 54,2 28,5

135. Megaciella zenkevitchi 4,4 38,6 34,5

136. Myxilla incrustans 2,7 39,5 33,2

137. Poecillastra sp. 2,3 22,1 28,4

138. Polymastia sp. 9,6 58,6 28,7

139. Stelodoryx toporoki 16,3 131,8 19,8

140. Tedania dirhaphis 12,8 120,8 44,1

141. Tylodesma rosea 3,1 42,9 30,9

142. Примечание М OJ1 -масса общих липидов, ФЛ фосфолипиды

143. Виды губок ФЭ ФХ ФС ФГ ДФГ ФИ ЛФЭ ФК

144. Baicalospongia bacillifera 33,4 44,5 17,1 - 2,2 1,7 1,1

145. Ophlitaspongia pennata 17,4 19,5 39,9 1,1 3,2 10,1 6,7 2,1

146. Esperiopsis digitata 13,4 14,9 47,8 15,0 8,9 -

147. Forcepia uschakowi 32,8 10,6 18,5 33,1 4,1 - 0,9

148. Halichondria panicea 29,9 11,1 29,4 18,4 2,9 4,1 4,2

149. Haliclona af gracilis 27,3 34,0 38,7 - - -

150. Haliclona sp. 33,5 35,4 31,1 - - -

151. Homoeodictya pulviliformis 28,7 37,6 19,7 - 5,2 6,5 2,3

152. Hymeniacidon assimilis 30,2 42,2 22,6 - 2,4 1,5 1,11.bomirskia baicalensis 31,4 42,2 16,5 1,9 2,4 3,5 2,1

153. Melonachora kobjakovae 34,2 27,5 28,2 - 3,2 4,8 2,1

154. Mycale sp. 38,8 29,2 21,9 - 2,6 6,4 1,1

155. Megaciella fragilis 33,7 28,4 17,8 4,2 4,1 5,6 4,1 2,1

156. Megaciella sp. 25,1 25,0 30,1 - 8,9 9,7 1,2

157. Megaciella zenkevitchi 48,5 50,1 - - - - 1,4

158. Myxilla incrustans 35,5 29,5 22,4 - 4,2 7,2 1,2

159. Poecillastra sp. 29,2 31,4 34,6 - 2,5 1,5 0,8

160. Polymastia sp. 19,4 17,4 27,8 20,1 15,3 -

161. Stelodoryx toporoki 31,1 29,9 39,0 - - -

162. Tedania dirhaphis 31,1 29,5 28,2 - 2,5 8,7

163. Tylodesma rosea 25,6 39,9 29,5 - 3,1 - 1,9

Информация о работе

Родькина, Светлана Александровна
кандидата биологических наук
Владивосток, 2005
ВАК 03.00.04

Диссертация

Состав, распределение и химическая структура липидов и жирных кислот губок класса Demospongiae - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы