Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПОЧВЕННЫЕ НОКАРДИОПОДОБНЫЕ ОРГАНИЗМЫ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ПОЧВЕННЫЕ НОКАРДИОПОДОБНЫЕ ОРГАНИЗМЫ"

ШкДЭШЯ RXÏK G OOP ИНСТИТУТ ИИКРОЕИШЮГИИ

У - JL&6 Не про sax руколяоя

АРИСТАРХ ОВА вере Иваново«

оочвеяш нокдрдиовоаоБнив орган«»«

(слвцмэяыгоогь 03.00.07 - ижроОаоїогм)

ABTQPEMP«

ДіСОврИІЦ** П ООІСКвМЯ» ГМНОІ «VMCn

мядщ»*а ¿шолоршчммзс мук

(Мнша - ff.

Работа выполнена и Институте микробиологии АН СССР Научный руководитель - академик Е.Н.ЫШУСТИН

Официальные оппонент«: .

доктор'биологических наук Т.П.Преобре*енская

доктор биологических паук В.Д.Кузнецов

Веду це а учреждение: квфедра биологии почв факультете почвоведении Московского государственного Университета ни. п. В. Ломоносове

р

Защита состоится " 1Эех г. в 12 час.30 ими.

на »аоадании Специализированного оояета Л,002.64,01 в Институте микробиологии АН СССР по адресу:

I173X2, г.Мооква, В-ЗІ2, Проспект 60-лвтия Октября, д. 7, корп. 2.

С диссертацией иожно овивкомнтьоя в библиотека Института микробиологии АН СССР '

Учений секретарь Спецнепивирова иного совета, кандидат биологических «бук

Л. Н.иОСКАЛЕЫКО

'в В Е Д В. Н.И Е

Актуальность проблемы. Углубленно« изучение биологии но-кардиоподобвых организмов обусловлено их широкий распространением в природе, актив пик участием в круговороте веществ, патогенностью ряда их представителен для человека и животных. Uaлично нокардиоподобии организмов в соотаве почвенного микрона сал евин доказано о достаточной определенностью. Находясь в почве, они участвуют в сложной серии происходящих та if процессов, разлагая различные органически о вещества - углеводы, в той числе целлюлозу, углеводороды, пестициды и т.д. Показано, что возиояиии субстратом для роста некоторых покардиопо-добшк организмов является гумус (Ыиаустин, Теппер, 196^; Тои-nep, 1976; Groaaet. alt, 1976). ' . '

Более детально роль н о изрдиоподобнюг организмов в трансформации растительных остатков в почве и ее сценического вещества пока остается ненаученкой. В связи о о* /енным .решение вопросов, связанных о выяснением значения кокардиоподобншс микроорганизмов в этом процессе, представляется нам овоевременида я целесообразным. чтобы всесторонне понять роль, которую игра-юг данные микроорганизмы при распадо растительных остатков,попадающих в почву, необходимо сосредоточить внимание на отдельных представителях л изучить юс специфически о свойства. Результаты подобных исследования позволят рационально регулировать численность определенных фор« кокардиоподобных организмов к создадут основу для повыиекия плодородия почвы.

Цель и задачи исследования. Цольв настоящем работы являлось изучение и оно рдио подобных организмов, принимающие участие в трансформации органических весесгв, поступавши в почву. Были поставлены еяедуювде задачи: исследование участия нокардиопо-добных организмов в равложении разных органических субстратов х, в особенности, своя ей растительной органики не определенных этэпцх ее распада; изучение морфологических к физиологических свойств изолированных культур к определение их снстематическо-., го положения; исследование особенностей их тонкой структуры. Было тогас изучено распространение данных микроорганизмов в ряде почв Советского Coosa.

Ц!«тр. шу^ая бкбялош!

И9И. -А- 1'>ж'3 «ЯЬХЗЗ.

£»д. в. а.

Научная нови вид, В настоящей работе впервые установлено уч^отие м прослежена сиена форы .нокарднонодобных оргвимаиоп прк роаяакеина раотнгелыла остатков, поступающих а почву. Данные микроорганизмы принадлежат к двуи родам - овгако»1а м дьоіососоив, вцделвннш и настоптав в реи л в качестве самостоятельных таксонов иэ рода нооагЛе.

Выявлены ноіше, но списанные в литературе, морфологические и физиологические свойства у исследованиях наци ноиардио-п од об и их организиов. Впервые обнаружено наличие жгутиков у вКТИИОМИЦвТОЗ), ИМЄЮЩИХ ІУ ТИП клеточной СТОПКИ (ііо Ьєсіієуп-

Ивг, іас^ліізг,, чэто )» [Іайдеїш также неизвестные ранее у н ок а рд и он од об и их организмов вирости квігугиконоД природы тиле фіш бри И. В составе ДНИ изученных н ока рди он одоб них оргаии:шов виявлено присутствие минорного коипоионга - 5-метилциго8ниа,

У некоторых культур выявлены клеточние структури, которые до настоящего вроиеііи бшш пало изучено: структури, вероятно, связанные о окиелониеи фенола, и клетки, напоминающие ло строении и типу их образования предел ори спорообразувщих бактерий.

Практическая ценность. полученные в настоящей работе данино о специфической деятельности отдельных представителей грудпы н.окарднонодобіїш организмов на разных этапах трансформации органических вецесгв почий приводят к не обходи и ос тм дифференцированного учета их форы при виясненим характерних особенностей микробного ценоза лочви. Данные яо/ш-затеди могут быть использованы при кик роби олегическоА оценке направленности почв енних процессов и их изменении при обработке и мелиорации лочви,

Пока во я пая в работе способнооть нокардиоподобных организмов активно потреблять углеводороды, фенолы, ароматические и, гетероциклические вещества «шат представлять практический интерес при использовании данных микроорганивмов в охране ^окружающей среды. Выявленные новые свойстве (морфологические, фи-81 алогические) могут способствовать режаынп вопросов, свяаав-вых о совериевс'твованиаи клаосифшсвцяи этих микроорганизмов,

Апробация работы. Основные положёриа.двссвртощш ависповц. , на научной конференция Отделе оочвеивш мхвро органа вмов к лв осгваеотвоИ научной конференция отделов Иистнтута иоди-Ожологн АН СССР. 2

рубяикдиид. Опубликовав о 10 статей, отражающее основное содержа вив диссертацией нечаїя находятся одна.

- ОЗъем работы. Диссертация состоят ив введения, литературного обзора, пяти глав экспериментальной часті, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 559 ссылок - 114 яа русском я 445 на гнострзввих пайках. Работа иваохавэ на 145 етреніцах Мавивояионого текста* иллюстрирована 45 рисунками я 17 таблицами. В обзоре литературы приводятся сведений, иасаютвся морфология я фявнологми нокардиоподсйныг организмов, их оваченвя в природа и практика, затронута современные принципы и систематики, показана роль данных микроорганизмов , в почве.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАС" ООъехты иметоды исследования

Основвши объектами исследования являлись культуры яокар^ диоподобвкг оргавишов, выделенные яря компостировании черноземной почвы о различными оргавиесянми веществами я растительными остатками»

Все приготовленные субстраты помечали в термостат ■ выдерживали при 26° и впакиостк, равной 60Í от цояво* вжагоемкооти. Учет колоний я выделение иа них культур производили под контролем микроскопа с бедвой агариэованноЯ среды - обычно о нит-ритного вгара (по методу E.3.Temiepf I963). ■

При исследовании ряда свойств ввделенные культуры оолостав-ияли о ггоовши и коллекционными ктшиами: Hocardla coralllna ДТСС 4ЭТЗ, H.cor&llina IFO 3339. Н.asteroides №В 606. "lijcobaotorlum* rhodochrous NCTC 576, H.asterolde» АТС С 19247» M.braelUeiwl» АТСС 19296. V-'J '

Для изучения кудьтуральн^х и морфологических свойств яополь-вовали ряд сред: мясо- пептоиный агар (ХНА), картдфеяьвив агар <ХА), сусло-агэр (СА), синтетическую среду о глскОзой, витрит-выВ агар. Отмечался характг? poeta.на ияоо-пептоансм бульоне (ИПБ), яа л ом тиха х картофеля it.it

- Paatep я фору клеток, степень распада мицелия, наличие жгутиков изучали в световом, а такие в электронном и пироскопе ва

8

тотальных препаратах* напиленных металлом, 1 * ■

При изучении тонкое структуры клеток использовали стандартный метод фиксации микроорганизмов { Ryter Qt al., 1958) . j лрииенениеи IJ^aoro. раствора 0s04 в ацетат-вероналовок буфера о последующей обработкой. О, раотворои уранилтацетэта л той ха буфера/ Была'текжа'применена двоВцаяфиксации реет-.., порами перианганата калия и четирехокиси осмия. Срезы, иаго-.. товдовяьгв iia'Удьграмикротомв i)dt , окрашивали цитра той свинца ( fieynolde*;. 'I963). Препараты просматривали в електронаьЕс микроскопах Teala SS-515 И J Ell-7. " *'. "..."■:

При изучении эиолorо-биохшипескик свойств исследуемых культур пользовались методами и тастаии.реноиандованнши в , ряде руководств по микробиологии, з лари одических изданиях я. работах отдельпих исследователей (Салибер, 1962; cordon, Наупвэ, Рал«, 1915; Morris, Ribbons, 1971i Skernan, 1967)«

Использование углеводов, органических кислот, спиртов, углеводородов, ароматических. веществ в,качеств« источников углерода Проверял« на среде * Г.<г/л)t KgKPO^ - 0,2( м^зо4 -0,3] HaCX-0,2| F«5tlt -0,01iJiMQ3-l, СЫвСЬ , микроэлементов - t МЛ» дистиллированная'вода'-'1литр'и на сраде Еушнедда-Хааоа (BushJieil-iUas,1941)i использование ииваралькшс источников а&ота, амивооислот, их смеон, мочевины, пептона- на среде , )е I, ва состава которой быв исключен mOj. ■ ..

Ислольэоввиио фааольньк веществ проверяли-rg среде Бушвал-ла-Хаасв и на синтетической среде Ватанабв (Watanabo at <а, 1963); способность окислять фенол определяли по кодифицировав* ному методу «олива <roUn,Cioc*Itou,i92Tt Oltok»1954| ' . Асатиани, 196*0. Определение нуклеотидного ооотавв девокоири-бонуклайвовых кислот в'исследуемых культурах проводили иа чистых препаратах ДНК, волоченных по Uepuypy ('lleraur, 1961), о помо«ьп5ума*ной хроматографии по методу Взивинна (1964).

, ¿нал и а с т ере oats ом еров днвиииопямедяновой кясяогы в гидром-ввтах целых кдаток проводили по методу Баккара о соавторам«' ( Beek« «tel., 1964). \ , ,

Дифференцирующие сахаре (арабипову, гапактоау) определяли в клетках;П0 методу Хепевааье (Leahev«ller, 196ft). *

Наличие лмлнда lch-a в втавол-»фярвых экстрактах 'клеток определяли до методу Кордэрскоя в соавторами ( Honiara*» *t *i

k . .■■■ ' ' ' '

1972). - ■ - ' :. / . .... -*' -V -.

. Идентификацию культур осуществляли, пользуясь определителями Крзсильникова (1949, 1970) и Берги (1957, 1974),, а .также ОрИГИНВЛЬВШИ публикаїшяии íFraueer, Leche Telle г, leche*»-lie*. 1970} Lechévalier Gooüfellow, Aide г eon, 1977). /

... РЕЗУЛЬТАТЫ ИСОВДОВАНИЯ И ИХ ■ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Свойства выделенных культур нокардио-подобных организмов и их идентификация

Дифференцирующие признаки культур, относящихся к двум выделенный группам. Из 500 »таймов нокардиопо fHux организмов, выделенных ив различных почв и раадагающіиия раститальных остатков, доминирующее появление занимали культуры о желто- и красно окрашенным мицелием. Подробно в систематическом и физиологическом отнооенял изучено 13 типичных пред ставит еле я, отобранных из состава обеих групп.

Результаты исследования показали, что все изученные нами культуры должныбыть включены в группу нокардиопддобньа органи вмов, гак как обладают покардиолодобным субстратным мицелием, распадающимся на укороченные елементи. Единственный способом -их равмнохешя является размножение с помочь» фрагментов мицелия. По совокупности морфологических и культуральаых признаков и на основании физиоиого-биохішичаскоя активности иа восьми яелтоокраиеннык культур пять (итамиы59, 67, 124, 140, 144) близки ИЛИ ЯВЛЯЕТСЯ разновидностями Hocardla Oltreá (Xraasl-lnlkov, 1938) Vakeoáa and Henxlol, I948j три Культуры (1,8, 7S) отнесены к»осаг<11а Clava í&ruaailnikov,l93d) Лаквnan and Heiirict, ií»8j одна культура (штамм 56) отнесена к

No с ardla me sent erica (Orla-J вя.эа n, 1919 ) 7áksi»aa and Henr lei, «

1948 (Крэсильвинов,1949, І970;Вег£ву,1957).

Из четырех красноократенных культур двэ итамма (4 и 74) идентифицированы как НоОardía voralllaa (Bergey et al., 192?) üataman luid henrїв94 в^ две культуры (штаммы б к 80) как Nocordta гиф" (¿г»аві1[і1коч,193В) Закзвап and llenxiol,1948.£

(Краоилышков, 1949, 1970; Ввг^эу, 1957, 1974).

По куяьгурадьнш и иорфологичесюш свойотвам пташ 67 отличается ог остальных наученных нами хедтоокравенных органив-иов; н^ дситиках картофеля культуро имеет белый цвет, на большинстве лабораторвшс питательных сред в препаратах можно габлюдать нити мнцелня, разделевяые о ере городка» и иди бее перегородок; укороченных палочек и кокков на образуется* На витритвом агаре черев 72 часа вига мицелияраспадавтся ва укороченные палочки (2,5 х X ики). Данный микрооргавивм, очевидно, относится к иокардвям о вамеддевнш распадом мицелия (- тип мицелия по УмбреАту). Он отлкчеетоя от других «танков м.оіггва также не некоторый физиолого-биоишичеоким свойством,

Физиодогогбиохнмические привваки, наиболее характерные дхс большинства описанных культур внутри каждой иа указанных груші приведены в таблице I.

Иуквеотианый состав ДНК нокатииопо^обных оргдяязнов. Ира определении нуклеотидного состава ДНК было установлено, что содержание ГЦ (гуанин + цитозин) у и.оогаїїіпа, . штами 4 было равных 69,2 моль у я.сііген, штамп 67 - 72,4 коль Полученные результаты оогдасуются о данными других авторов по » оодержанип ГЦ в ДНК нокардиоподобных оргакишов - 62 - 75,1 моаь (Беаоаерский, Свирин, 1960; Ш11,196£; ііаніагеїсі, Ооо&ГеІІегм »« а1.,197в; Могіал-вкі, БоЬааІ аі.» І97в| , гиквриг* вЪ аі., 1970і Гаша^иеЬі; 1967)*

В составе ДШС носледовапных оргааиемов,' кроме обычных оснований, выявлено нриоутотвне минорного компонента - 5 - не* ' тнлцктоанна, в то время как 6-метиламинопурнна обнаружите не . удалось. Содержание метицитоэина о оста вид о 0,87 и 0,25 моль? дня кревно- м жвпіоокрашенной культур соответственно, . "*

.Наличие метилднтознна я метил амкнолурина показано в ДНК > некоторых првдотавитедвй МгооЬайвПив (УапуцеЫп ЯЇ «1,1968), МвТМДЦИТОЗвН обнаружен В ДНК двух ВИДОВ Зігерголуом (Ввіавгі, Увкшмл, 1972); Длн'ДШС вредставателеа порядка. AotlsMvortal.ee очевидно, овоНотвваао пряеутотвхеметхднрованвцх освоаанк* в форм» З-метилцитовинв. •

- iaoлица i

Дифференциация желтб-.и врасноокрашенньсс культур аокардиояодобнш; организмов (HDO) не основании ■ . фаэиолого-биогииическтс свойств .

~~~п7777ГГ iSSSSW'-

^^^^^н^мм * мшшмм^ш

Окисление <О)/Ф0Е«енхация (Ф)

: ГЛЮКОЗЫ

Тест в метил овш красным / - галакхозкдаэвак активность' Гидролиз эскулнна Гидрояив крахмала Poet нэпа рафике _■■■.•. Рвягаениежелаткны Изменение молока Гидролиз казеина Гидролиз тирозина Гидролиз твинов : П-нитрофеволоксидаза ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К ДИ30Ц1ШУ Чувствительность к пенициллину

Примечание: I) Исключение составляют нейногочиеденные втаимы наличие признака - отсутствие признака . . + вариабельность пригодна

СОМОВ КЛетОЧНОЙ стояки. РзЭВИТИв В ЛООЛеДВИе ГОДЫ 16110-¡Гоксоно.^ического направления в систематике ектиншнцетов привело к вычленению из рода :1<эеог<иа. в качестве оахостоя-теяьиых единиц оадедышх таксонов и увеличению числа родов."' . При уточнении систоаатичзского положения предстояитолаЛ ■ желто- и.красноонрашешюй групп описанных иаии организмов учи-, тывали наличке у них днанинотщелиповоД кислоты (ДЛПК), ара-бниозы, гапактозы и лкпидо ься - Л - хецотаксоноиических признаков, , применявшее в настотцэе время дли дифференциации покар-дкоподойньа:ак1инсыицо1ов ка уровне родов.

Как показали результат опыта, красно- и хелтоок раненные ор га ви ai ы отличается по. составу исследуемых компонентов. Гидролиза ты целых клеток изучепнюс краен о окрашен них культур содержали «еао-ДАПК в отяичие от жедтоокраоенных, лииеянше ДАЛЯ. Красноокрашенвые культури содержали л составе кяегочиыг стенок арабниову я галактозу. Отрицательный результат на присутствие врабинозы показали проверенные жеятоокрашенные культури (птаи-мы 8,56,67), галактоза найдена у атамиоз 8 и 56, в отличие от пташа €?, пиве пн о го данного сахара.

Исследования логаэалн, что изученные нами я окардиолод обные бактерии - организмы о разными типами клеточной стенки, Для родовой дифф ер енциа ции'н окардиоподобнщ актиномицетов важное значение имеет.изомерный состав диаминошшелиновой кислоти, который является бтабильнші призникои. ,

Ыезо-нзомер ДШС, арабияоза и галактоза свойственен воем исследованным красноокрашеннгаї микроорганизмам в отличие от : желтоокрашанных культур, лишенных ДАГОС и арабинозы.

Лип ид іс^-дЛїак показали розультаты проведенных исследований, красноокрашенвые нокардиоподобные организмы {етэимы Ь, . 74, б, ВО), а также использованные в качество эталонов культуры N.corallin« АТСQ 42f3# «.astéroïdes ЛТСС 19247, flibraellienaia атс С 1 <С96С0ДЄрХ8ЛИ дипид ьем-А.

Недтоокрашенные нокардиоподобные организмы (штаммы 8, 78, -56, 67, 140) не обладали лшшдом lcu-a.

Представителей красиоокраиениых нокардиоподобных бактерий, которые в процессе изучения предварительно были идентифицированы как N. rubre Н rv.ooriulina, ОбЬЄДИНЯ0Г сходв иб состав клеточной стенки и наличие лилкда lcm-a ,на основании чего их оледует относить » ааотомее время к rpynne rhodooh- .

* для которой было предложено родовое название пнозосов-eva zogt (Ooû4fdlloii, AideTeon, t9/v). Изученные вами культуры не могут быть отнесены К роду Новаїчііа sensu etrloto, объединяющему.известные в настоящее время патогенные Формы, хотя ОНИ ШЄЮТ СХОДНЫЙ состав клеточной сгеики ІУ TKtta(I*ehava-lier, Leüh*vall«r, 19Ô5> И содержат ДІШИД ХСя-А.

По своей морфологии (наличие развитого субстратного мицелия, распедввцегооя на отдельные подвижные фрагменты/, по отсутствию в клетках днамкноонмеживоэой кислоты ш лиги« a lch-a 8 ..■,'•..

ж большшотву фяеяологнческих свойств яолтоокраиеьные нокаі>-даододобныо организмы, предварительно идеатифицироаанныекак К. Пат« к N.citraa, близки X роду Oerstovla. О* Oerskovia turbats оня отличаются ряд см физиологических признаков (неспособность образовывать кислоту из лактозы и гидролизовать ДНК, наличие уреазы, poor ва сукцииате). Отсутствие галактозы в клеточной огепке у штамма 67 выделяет данную культуру среди содержащих галактозу других изученных нами *еатоонравов них организмов и обличает, ее о описанвіа/и Іі.Леяевалье г (Lech*valier,I9?2) неподвижными Oerskovia-подобными бавтервя-йи в родом і»о«іогоиопозрога, впервые ошссаннш Красильня- -новым о соавторами (Крооияьнщков и др., 1961) к близким к Oerskovia,. по палячи» развитого субстратного мицелия.

2* Фявнологлческив особенности аокардиоподобных организмов ■

Источники угяеооуа и яэота. В результате проведенных исследований быки выявлены различил кежду микроорганизмами иа родов o*rskovla я Rhodocoocus по использованию ими соади-вений углерода и азота.

Болыишотаоописашзш: нами культур врсковий использует отдельные моносахариды, дисахарид« и полисахариды, спирты я некоторые органические кислоты.

Тодококкн, как' правило, хорошо усваивает органические кио-дотыцияйа Кребса, углеводороды (как парафинового ряда, так а хроматические), ароматические карбоновые кислоты, фенолы, вещества о двойныи ароматический ядром, гуыияовые кислоты. Указанные-вецества иооольвуктся родокохкамн {за исключенной отдельных шгянмов) обычно лучне, чей углеводы.

Описанные вами культуры эрсковий и родококков могут использовать как нитратпый, так и аммонийный азот, Из органических йот очников азота родокешт хорошо ,уовамвают многие аминокислоты, их, смесь, пептон, мочевину. Это отличает их от представителей рода Oerekovia, уовоявасиих (избирательно) из испытанных нами источников азота немногие отдельные аминокислоты.

Пояш опыты показали, такш обравом, что родококки исполь-эувтболее широкий - спектр соединений углерода и авота я усва-иваюгих о большой интенсивность», чей »рсковни. - ■ ■ '

Возможность» испольвования родококкам иу г л е в одородов, фенолов, гукиновыэс кислог ыожво объяснить распространение деяние -микроорганизмов в таких природных субстратах, как нефть; сточные воды, па рун щи в почвы, где их роль, очевидно, сводится к участию в окислении трудно доступных для других бактерий ароматических и гетероциклических соединений.

Использование ФОИОЛЬНЫХ веществ культурой | Шіоаоооссиз г атаки п. Фенол постоянно, образуется в почвах из поступающих в них л ищи н содержащих растительных остатков, а такие из синтетических детергентов. Предварительные опыты показали, что выделенный нами из субстрата с лигнином шгоіосоосиа, птамм 4 хорошо развивается на фенольних веществах.

Была определена способиость дамкой культуры использовать ..взятие нами в различных концентрациях февольцые вещества, а . также выявлено их влияние на морфологию клеток микроорганизма.

При развитии культуры на истга уей их фенольних веществах, взятых в различных концентрациях, наилучший рост на синтетических средах наблюдался: в присутствии фенола в концентрации I г/литр, двухатомных фенолов (резорцина, орцвпа) в концентрации 0,5 г/литр,'салициловая кислота не подавляла роста организма в самой высокой из испытанных концентраций 8 г/литр,

Микроорганизм испольвует фенол как источник углерода и анергии. При исходной содерлании фенола 500 мг/литр через 3-4 дня

он полностью окисляется культурой (таблица 2).

Окисление Фенола ІШосІоооооца. Таблица 2 (итамм 4)

Время в часах ;Концентрация фенола в мг/литр

: с.шт ; Контроль

'30 ад . 48 . «2 96 500 370 820 55 10 500 , 500 ,490

При микробиологическш окисления фенола происходит райино-іенив клеток, что подтверждается увеличением оптической плотности среды. Фаза задерккя'роста на сиитетической среде о фе~

колем составила ЗО часов, не среде о глюкозой - 12 часов и нв ияоо-пептовиои бульоне она равнялась 8 часа». -

Было показано, что фенольные вещества вызывают изменение морфологии клеток. При культивировании на средах о фенольними веществами не происходило распада мицелия на укороченные клетки, как это происходит на лабораторных средах (Ш1А, МНЕ,' КЛ и т.д.), а наблюдалась тенденция к образованию удлиненных палочек» -

3. Эяектронно-инкросколичесхое исследование морфоло^-" гических свойств и цитологических особенностей яокардиоподобных .организмов . .,. ...

Жгутики и сходные о Димбриями^выросты. Проведенные нами , влехтронно-мнкроскопнческие исследования позволили .обнаружить.... присутствие жгутиковых форм у девяти жедтоокращетшх. культур нокардиопсдобных организмов, предварительно отнесенных к N.fiwaH N.eitraa и позже идентифицированных.нами как

Oerafcovla,

Клетки со жгутиками, которые наблюдали при культивировании■ микроорганизмов на жидких^й твердых средах, имели у изученных .' культур öerafcovla' $орм^ изогнутых палочек, грушевидную,, овальную форму или,это могли быть длинные, иногда с разветвлениями нити мицелия, Хгуткіиі располагались ангулкрво, катераль^ но или ато были клетки о лёрнтрихальныи расположением жгутиков. Отходили жгутики поодиночке или пучками. Их количество в вависшіости от подвижности uiauua было различным.

Как известно, в литературе нет никаких введений о наличии жгутиков у активомицетов, имеющих 17 тип клеточной стенки (до Xechevalter, LeChevalier, 1970).

Нан впервые удалось показать присутствие подвижных $oju у покардиоподобных организмов - представителей рода ßhodococoua, содержащих в соотаве клеточной стенки' мезо-диздкнопимелиновув кислоту, аребинсву и галактозу. Предварительно культуры были идентифицированы нами как ir.rubrei и м.оогліііп». Клеткж во жгутиками наблюдали у данных микрооргениеиов на разных оралах, обычных лабораторных * разбавленных,'.на синтетических средах а фенолами и гяюковой. їсловяя, необходимые мя образование жгутиков, DO-вяднмому, строго индивидуальны для каждого ■таммамучевнмгорганжзмов.

7 вьоііооооств, итамм 80 жгутики сїмечеан нв «яво-лвагонном вгвре.Это была одиночные клетки овальной формы или клетки, вобранные в пигя. Жгутики расположены авгуляра о/п оі яр но, латерально.- у вьоадеесси«, в таим Ч клетки со жгутиками наблюдали на синтетической среде о фенолом в концентрации 0,05^ и с салициловой кислотой в концентрации 0,15^Жгутики от * клеток отходили поодиночке или лучками, вяеневты со жгутиками одиночные, овальной форам ял» в.нитях. Жгутики могли ог-ходять от дистальных концов гифн или латерально от боковой ъ поверхности фрагментов гифа.'-У кресноокраиевных итаммовЧб и 106 жгутики были обнаружена на мисо-лептонном бульоне (раа-ведеиие 1:10)н на среде с тирозином и пептонов.

Диаметр отдельных жгутиков на препаратах, контрастировавшие напыление« метаном, равнялся 16-20 и»., Максимальна« длина жгутиков У желтоокрамивых. культур - 17 міш, у краоноокра-ионных - б мкіі. ','..■;

Помимо типичных жгутиков, был* обнаружены выросты, не описанные прежде'у нокврдисподобвых вятивскицвтов.-Они щелк вид тонких нитей, пряхах ия* слегка искривленных, отходягах от поверхности клеток во во« направлениях, и напомиваяифимб-рии. В настоящее время фимбрии известны главным образом среди греыотрицательных бакгеряй.Дяаметршясвваемыг нами нехгу-тиксвых'выросговна препаратах, контраотнроваввых и а пыл єна ем металла/,ровнялся 2* на, длина колебалась от 0,5 до 5 икн. . Подобных отростков не клетку иногда приходилось свыше 20. Выросты можно было наблюдать украсвоокраиевнідфоргвамясо-лепгоаном агере,мяоо~пептовнсм будьеве в различных раведе-ииях. С их помоям» отдельны» клетки могли быть связаны друг О другой. ; V У""''"

Тонкая структура ішаДосоесца ^итамм»)^ окясляюцего фенол.' Для исследования была взята культура вііо4осооеив, агамій, использующая фенол в качестве едквотавнвогои су очника углероде. . . ;>.;'■..;■:; ':■■

Тонкая структура микрооргэнивид, выращенного на синтетических оредах (жвдкРй среде Буинелла-Хааса и огаризованаоЯ среде Вэтанабэ)' с добавлением.фелозз (0,05$). как един о гвел-ного источника углерода» сравнивалась о тонкой структурой . клеток, культивированных 'На иясо-лептоином агаре,

аьоаоообоив в1аии аыдвлваиай кэ субстрата с.аагнаиои, -характеризуется образованием на питательных средах нитевид-• • 12 :■'. ■ ■■;;/■ ■'■Л;:^

ных ветвящихся клеток, быстро фрагментируюиих на палочки и ' кокковидные элементы 2,5x1, 1,2x1 мкм. Органивм хорово развивается на многих органических соединениях; на синтетической среде о фенолом; салициловой кнодотой может образовывать клет-ви.оожгутикаии.

Научение ультраструктури клеток, выраценных на мясо-пептон-нои агаре* показало, чтй клетка микроорганизма окружена микро" капсулой*.'представленной электронно-плотным слоем, отдаленным ' от стешси светлим электронно-прозрачным пространством; Толщина микроадпоулы 25-50 нм, инйгда на полюоах клетки или о латеральной'стороны она неравномерно утолщена,в некоторых олуча-ях до 90 ни.- ■'

: Под микрокапсудой располагается клеточная стенка. Она выглядиткак одноконтурный плотный слой толщиной около 10-15 ни. Клеточная стонка отделена от цитоплазматической меыбраны'алек-тронно-ароэрачкым слоем периплаэмагаческого пространства.

•Цитоплвэматическая мембрана представляет собой трехслойную унитарную ыоыброну Робертсона, Наружный слой циголлазматиче- • ской мембраны толще и более резко очерчен, чей слой, примыкающий, к цитоплазме. Оба слоя разделены светлым слоем. Средняя топцина цитоплазма тической мембраны в им.

Цитоплазма представлена как умеренно плотная область; заполненная гранулярными компонентами, главным образом, рибосомами. Иногда гранулы расположены группами, образуя, очевидно^ полно омы. 'Наиболее многочисленны они в зоне, окружающей нукле-ояд. ■/■'■■'■■'■ • ..<•■• ■ ■

Ядерный материал занимает довольно обширную центральну» часть клетки к ве окружен ядерной мембраной. Он видев как . участки о более низкой плотностью, чей цитоплазма, к заполнен тонкими нитями.

7 родококна, культивируемого на мясо-пептоннои 'агаре, не - обнаруживаются хорошо развитие внутриклеточные мембранные структуры. Внутрицитодлажатическая мембранная система представлена вебольвими мембранными тельцами овальной форім, Они располагаются в района цитошгааш, близкш к ядру, или в районе, примыкающем к цнтоодаэматичаской мембране. .

Лрм культивировании микроорганизма не агаризованной сред» в фенолом сохраняется типичная организация клетки. Однако во сравнению о клетками, выращенными на мясо-пеоговаои агаре, мг. внутркцигоплеаатячеокая мембранная системе не среде с фенол см

-.13

усложняется. В клетках просматриваются как простые, гак к бо-, лее спсжвав мембраны* .Они представлены трубчатовеаикулярными, а также простыми или летдевидными структурам», равбросанными в цитоплазме, явно прослеживается связь некоторых на них с цитоплазма тич еокой и ембраной. Та ким обра з ом, внутриклеточный мембранный аппарат может изменяться в зависимости от характере метабояивы»^ обусловленного составом питательной среды*

Характерной особенностью клеток микроорганизма при развитии на жидкой среде с фенолом является наличие в них структур, отсутствующих при культивировании микроорганизма на мяоо-пептонном агаре. 8то крупные включения, имеющие вид светлых вокуолчй, содержащих гранулированные и фибриллярные электронно-плотные тельца.

По своему отроению они не могут бы» отнесены к гранулем-пмифосфата, которые обычно выглядят как теле с большой електрон ной плотностью по всей масое, имеют сравнительно ровную ограничивающую стенку и не дифферевдвроьвны на плотнуи централь- t ную часть н светлую електрони о-проврачну» окрухающую зону*

В отличие от включений полй-i -окотшаоляной кислоты о их гладкой ограничивающей втенкей края описываемых нами вакуоляр-ыых структур - неровные и разрыхленные.

Данные структуры можно, эероятШ), цнторпретнровать как место локализации какого-то специфического для клетки веществам По своей организации они сходны во структурами, описанными Нормандии Уэйманом У Arthrobacter вр. u Candida utilla, выращенных не вреде о в-бутвиом в 1-бутеноаш,и названными оксисоыами (Kormendy and Wayaan,19'H)*

Описываемые нами включения, вероятно, могут быть ассоциированы в областями окисления феноле.

Атлас и Хейнц (Atlas and lialnta^ 197?) показали наличие больших электронно-плотных включений у растущих не нефти

ЪНДОВ flavotonateriuia И .Brevibadturlunu. Включения бшіп ОКружены светлыми зонами! Авторыпредполагают, что светлые области возникают в результате скетия^ цитоплазмы в процесса фиксации и заливки^ следствием. чего является отделение сконцоя- . l,■ r рир ов а и и о го' эд ектр онио-плотії ого іготериала от окружающей цито- ' дяааш. ■■ ': . /V,,'. ¿V ' ; ч-^. "

Корменди и Уэймав обьяснявт происхождение светлых эоа ■

хрупкостью окружающих' электронно-плотный м а та ри а л лр о эра ч ных : областей и их резрувёкием''¿.процесорприготовления сроэов. і • . . 14 ''''■■.■':.' '■'■■'."'

Оксисаш чаад находятся вблизи полюсов клетки, так же как и описываемые нами структури и структуры, отмеченные в , "' "■ работе Атласа а іевнца. •

Авторами быяо отмечено величиемостиков цитоплазмы, ов-реоекающих влектронно-ол отное пространство. Некоторые на плот-1 ваг включений, обнаруженных нами внутри вакуолей у ньоіосоеви», во овоей текстуре также могли напоминать нити цитоплазмы.

Таким образом, внутренне» строение н ока р ди оп одоб ник организмов, наученное на примере ЕЬсніооооеия,аналогично строе-ниюграмположктелышх бактерий. Изменение внутрицитоплазмати-чеокой организации'клетки индуцируется ишенанием факторов •оаружаювдй среды.- V

^лектрунн 0-м ик ооо коническое у^учение клодоооовц» (штамм $0). вырвмвддиогона среде о Фенояомт тмміосоасіі8,'ітв>"|'80»,выдел енныйиэ субстрата о инулином, развивается на фенояо гораздо слабее и медленнее в отличие от яімаоаоссив, чтоимЛ.

В одно- и двухоуточних культурах на мяоо-пептовном агаре органної может образовывать одиночные клетки или клетка, со- ' едакениые в нити, обладающие жгутиками, расположенными аагу-лярао, полярно или латерально, .

В ультраструктуре клеток гшааооооаив, игами 60, выращев-ныг'на агаразовавноИ ореде в присутствии фенола (0,05$), удалось отметить некоторые особенности.

Отмечается присутствие двух групп электронно-плотных телец о больней ила менькей'алактровной плотность». Частицы, менее вдекгронво-плотныэ о диаметром 25-50 им, имеют гранулярную структуру а расположены в цитоплазме. У телец, более элект- ' ровно-плотных, гранулярная структура ве просматривается. Таль- ' ця имеют шаровидную форіу, их диаметр 40-60 им. Включения «того типа могут напоминать фаговые частицы. Тельца обоих типов окружены светлыми зонами!

У ВЬоаоооссив, втамм 80 на среде о фенолом наблюдается процесе образования спороподобвис клеток. Способ их образования оходеяо начальной стадией обравомвая бактериальных вндосдор.

В клетках, вал тих на самисуточной культуры, отмечается , видейшавенное сеоткровавие о образованием ва одвсы кз подю-сов ыатеринокой клетки округлых кхеток, напомннаюцмх пред-опоры. Прослеживается процесс охвата предопори мембраиой

К ■ -

материнской клетки. При атогоепта утолщается и принимает, подковообразную форму. На «той стадии отмечается синтеа йе поте клеточной стенки и, вероятно; капсулы, поскольку на клеточной стенке виднызарюдыиевые тонкие слои» напоминающие капсулу. Толщина электронно-прозрачного одоя септы 40-60 км.

На мембране септы,: принадлежащей, материнской клетке, материал клеточной стенки, как правило, отсутствует. Процесс выглядит как у бацилл," однако завершения.поглощения материнской клеткой дочерней выявить не удалось.

Внутренняя структура цитоплазмы предспоры не отличается от структуры цитоплазмы материнской клетки.( В последующем, очевидно, происходит освобождение предспоры из спорангия'Путем рззрыва клеточной стенки последнего. Этот процесе ведет к гибели материнской клетки. Не видно синтеза НОВОГО СЛОЯ клеточной стенки,' а в освобождаемой клетке отмечается дальнейшее развитие олоев (капсулы). ,

Итак, лри культивировании вЬоЛосоасиэ, ' втаим 80 па среде о фенолом сохраняется обцая организация строения клетки, характерная для грампол ожи те льныг бактерий. Организм обладает неравномерно утолщенной,во периметру микрокапсулой,'содержит сложные внутрицнтопяааматкческяе мембраны, .■*"■'

В ультраструктуре родококна при культивировании о фенолої обнаруживаются изменения,: индуцируемые специфическими условиями развития микроорганиэма. Вти условия могут способствовать изменённому циклу развития, что может выражаться в об- : равованин у данного органиш«:клеток,: напоминапщих по способу образования бактериальные вндоопоры. Однако типичных реф-рактильиых опор, обладающих кортекоом к покровами, обнаружить не удалось, и окно полагать, что от образования данных'' споро-подобпых структур ыоясет:8ависвть: устойчивость и выживаемость : организма в, неблагоприятных для него условиях.

4. Экология нокарДиоподобных: организмов и их роль в почвенных процессах

Участие почвенных нокердиоподобрых организмов в разпоже- ' нии органических веществ; Чтобы выяснять роль нокардноподоб-ных организмов в разложении растительных остатков, были по- ' ставлены опыты, позволяющие проследить динамику размножения данных иикрооргавизыов в оу0страте, составленном и8 песка н обогащенномминеральной средой и черноземной почвы прн добавления в него слвжёй- надземной массы молодых растений

фасоли (1058).

Опыты проводили при температура 26° и при влажности бО£ от полной влагоемкости. '

^.Контролем служила вышеупомянутая смесь беа добавления рас» тительных остатков.

Цокардиоподобныеорганиэиы размножались на разлагавшихся/' растениях фасоли в продолжение всего опыта. Абсолютное число хелтоокрешенных нокврдиоподобных организмов иа'рода Оэг«.1со¥1» было" особенно высоким в'первые десять дней опыта, когда юс количество составило 2 млн. 780 тыс. (в 55"раз выве по сравнении с контрольныйвариантом) или 5% от'обцего числа мйкро-. организмов, учитываемых на нитритном агаре. Ч^рез полтора и два ыеояца наряду с вышеуказанными формами начали размножаться и покардиоподобные организмы из рода Шюаоооооив, давшие красные колонии (рис.1). Их количество достигло овоей макся-вольной величины - 5256^ (2 ылн.В55тыо,) через 9 месяцев.

м

4#и

Рис. 1 К*«*» РФ* 4 <у—>ш ^■нмян

Микроорганизмы рода , О«гвкоу1ь, преобладавшие!л первона-чальныв периоды процессв ра зл ожвияя зеленого удобрения, могли интенсивно рцвмншатьея зв счет использования ими храхмаха и углеводов (иди продуктов игра спада), которыми богата зеленая маоса рартеиий Фасоли я водичвотво.которых резко снижается, оогадоно'Картину, о ооввторами.( Ивгно а1.,194г),чвРаа . бОднейпоодоначада раопадв. Как пока зав и нави исследования, врсковии обладают активными гидролитическим■ ферментами, что ' ■"'"- 17

делает возможный их развитие на субстратах, богатых углеводами Я белком.', i . .

¿ипевные протеолятяческнх ферментов, а также амилааы .ж ця-тавы, родококкя, как доказали ваш опыты, могут интенсивно потреблять различные органические соединения - углеводорода, органические молоты цикла Кребса, аршатичоские карбоновыв кислоты, фенолы, гуниновую кислоту, венаства о двойным ароматическим «аром, аминокислоты.

: Таким образом, отсутствие гидролитических ферментов (амилазы, протеияазы) лияает родококков возможности принимать участие в первоначальных периодах разложения свежего органл-чеекого вещества;'однако наличие у них окислительных фермен-* тол позволяет ям использовать промежуточные продукты его распада. ",■■--" ■'. ' -V ..'■,'■■

Факт.появления я ваяем опыте родококховня последнем втапе процесса распада растительной мает (молодые раотения фасоли), отяосятошго богатой азотом я бедной клетчаткой, заставляет предположим, что 8т* микрооргеяяамы могут оказаться связав-, вымя о процессом минерализации более сложных, р то* числе гу- -муоовнх веяест» почвы.: ■■',

Результатыисследований позволяют заключить, что в условиях почвы нокардяоподобвые.органнзннязбяратедьно относятся к рааяячяого рода углеродистым веществами

родовой состав нокардяоаодобащ организмов меняется я процессе происходящего распада органических оубстрзтов, что, по-идямоыу, связано о созданием условий, благоприятных для размножения представителей того идя иного рода.

Наличке свежего органического воцвотва в вяде легкоразла-гаоиого растительного материала способствует развитию организмов на рода Oerskeria в первоначальные периоды его распада и ооадсет условия для размножения представителей рода Ehodocoocus яа последующа этапах «го распада*

Распространение нокардйоподобних организмов в почвах Советского Союза. Исследование ряда почв Советского Союза (21 почвенный образец) показало, что вокардиоподобяые организмы имеют пярокий ереал раояроогровввяя. .. ■

Оня обнаруживаются во многих типах почз, предпочитая в ос-ноовш нейтральные или щелочные почвы, а также почвы, богатые органлческим веществом. 18

выводы

t. Ив почв н разлагающихся растительных остатков в ид едено 500 штаммов нокардиоподобных организмов. Доминирующее положение среди выделенных итаммов запинали культуры о жёато-и краеноокрашенным мицелием. Подробно изучены в систематн-ческш, физиологическом и структурном отношениях 13 ТИПИЧНЫХ представителей нокардиолодобных организмов, отобранных из состава обеих групп.

2. По совокупности морфологических и хекотаКСономических признаков (наличие развитого субстратного мицелнн, распадающегося на отдельные подвижные элементы, отсутствие днамНПО- .. пимелиновоа кислоты и липида ьса-л в клетках, содержа^

ние ГЦ в ДНК) жёлгоокрашеннэя группа вокардиоподобиых орга-, HU3J0B OTHeçQHQ К рОДУ(fruuaer et al., 1970). ' "!

3. Окрашенные в розовый и красный цвет нокардиonодобние " организмы по морфологическим свойствам, составу клеточной отенки(наднчие иезо-Диаминопимелииовой кислоты, арабиноаы, галактозы), присутствию липида lcm-a, содержанию ГЦ в

ДНК отнесены-к роду nhodoooecue Zopf (Qoodfello'*,Aldereon,'l977 j.

4. Впервые обнаружены подвижные формы у представителей рода ithodoaocous. С помощью электронного микроскопа показано наличие клеток оо жгутиками, расположенными ангулярно, полярно, латерально.

5. У изученных культур родококков выявлены не описанные прежде у нокардиоподобных организмов выросты типа фимбрий, имеющие, вид тонких нитей, отходящих от поверхности клеток во воах' направлениях.

€. При изучен НИ улырветруктуры В клетках ШыхЮвовСив найдены не описанные ранее внутриклеточные структуры: структуры, по-видимому, имеющие отношение к окислению фенола,M опоролодобные клетки.

7. Вое исследованные родококки иододьауют бодее шрокий спектр соединений углерода и азота, чей эрокових. Они ассимилируют углеводороды, ароыатьческяв кислоты, фенолы, гуми-новыв к колоты, многие аминокислоты, пептоя, мочевину. В отличи* от врсковий у родококков ,отоутствупт«ктивые гидролитические ферменты (протеина ва, амимавЬДавнме свойства

ние»г для указанных микроорганизмов важное экологическое значение.

8. ¿первые установлено место-в сукцессии при разложении ростктвпьниа. остатков иокардиотсдобных организмов, принадлежащих к малоизученным родам fmodoooccus я Oarskovie. Показано интенсивное размножение микроорганизмов рода Ое^зкот!»

в начальные периоды.процесса распада свежих растительных остатков, что связано с наличием у лих гидролитических внею.еточшсс ферментов (протеиназ к анализ). Появление представителей рода (thodococeus лаблвдаегся да более поздних стадиях распада растительных остатков, что коррелирует с их способностью потреблять, труднодоступные для других бактерий циклические соединения я гумусовые вещества.

9. В результате микробиологического анализа 21 образца лочв из различных районов Советского Сомза показано, что нокардяо-подобные формы обнаруживаются во многих типах почв, предпочитая почвы, богатые органическим веществом, а также почвы о нейтральной или щелочной реакцией*

СПИСОК РАБОТ, опубдиковаивнх по материалам диссертации

1. Арястархова В.И. Участие почвенных проактиномицетов в разложении органических веществ. Известия АН СССР, оер.биол., 1968, 2, 301-305. .

2. Лрястархова В.И. Об отношении иккрооргакигиов рода fjocardia к источникам углерода и азота. Известия АН СССР, оер.биол., 1972, jf, 559-563.

Ъ. Аристарховg В.Й. распад мицелия у иокордий. Известия ЛН СССР, сер.био.т., 1973, 4, 603-605.

4. лрястархова 0. Я. 2 гутики и'подобные фимбриям выросты у нокардий. Известия ЛЯ СССР, сер. бис л., 1974, 762-767.

5. Аристархова В.И.-Использование ароматических веществ микроорганизме)!и рода Ное&пНа.йаьеСти* ДЯ СССР, сор,бита,, 1975 , 9, 443-4W. - .. г-.,.,.:-..^^;,^...

АриО¥архбиа В.И, Электройао-вккроскопичвсков изучение НоодоНд rubra, выращиваемойна среде б 'феи ол ом; ИикрОбиодо-гия, 1976, 4§, 2V"826-828* v ' > •

7, Аристархова И.И. Тонкая структура ыоеопПа еотШпа, окнслявщеб фенол, Микробиология, 1976, 3, 507-51О,

В» Аристархова ВЛК , Хохлова Ю.М. Пигмент Но с ага оогаШва. Известия АН СОТ, сер.биол,, 1976, 5 , 759-761.

9. Сидоренко О,Д., Ари стар хова В.И. Влияние хлорированное смеси пиридєнов на микрофлору затопленной почин. Известия ТСХА. 1976, І25-ІЗІ.

10. Аристархова В.И., Алекоандрушкива Н.И, Нуклвотидний состав ДНК проаитиномяцетов. Известия АН СССР, сер. бнал., 1978, І, 152-154.

11. Арнстархова В.И,, Родионова Е.Г. Хемотаксономические признаки нокардиоподойных организмов, выделенных из комоос-тов. Микробиология (в печати).

1-09952. Подписано н печати 2.УІ.І96І г. Зап.554. Тар. 150 виз. Отпечатано в ПК ВШШИИ 113 ССОР.