Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Перевиваемые линии клеток карпа (Cyprinus carpio) и сибирского осетра (Acipenser baeri), их использование в ихтиовирусологии
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология
Автореферат диссертации по теме "Перевиваемые линии клеток карпа (Cyprinus carpio) и сибирского осетра (Acipenser baeri), их использование в ихтиовирусологии"
УДК 639 3 091 619 578
На правах рукописи
Щелкунова Татьяна Ивановна
ПЕРЕВИВАЕМЫЕ ЛИНИИ КЛЕТОК КАРПА (Cyprinus carpió) И СИБИРСКОГО ОСЕТРА {Acipenser baeri), ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ИХТИОВИРУСОЛОГИИ
03 00 06 - вирусология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Покров - 2008 г
003164209
Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии (ГНУ ВНИИВВиМ) РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ и Федеральном государственном унитарном предприятии «Всероссийский научно-исследовательский институт пресноводного рыбного хозяйства» (ФГУП "ВНИИПРХ") Федерального агентства по рыболовству Минсельхоза России
Научный руководитель
доктор биологических наук,
старший научный сотрудник Балышева Вера Ивановна
Официальные оппоненты
доктор биологических наук,
профессор Юрков Сергей Григорьевич
кандидат биологических наук Пыльнов Владимир Александрович
Ведущая организация ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им ЯР Коваленко» РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ (ГНУ «ВИЭВ»)
Защита состоится 22 февраля 2008 г в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006 003 01 при Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии (ГНУ ВНИИВВиМ) РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ по адресу 601120, г Покров
Владимирской области, ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ Тел /факс (49243) 62125
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института Автореферат разослан "18" января 2008 г
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат биологических наук
В Я Савукова
1 Общая характеристика работы
Актуальность темы
Метод культуры клеток - основополагающий метод, появление которого в СЕюе время привело к бурному развитию вирусологии, - и сегодня остается одним из главных ее инструментов Потенциально бессмертные перевиваемые клеточные линии являются незаменимой экспериментальной моделью и нашли чрезвычайно широкое применение при проведении вирусологических исследований болезней рыб и в биотехнологии при производстве противовирусных вакцин
В 1957 г в США на первичной культуре клеток из плавников радужной форели о г рыб был выделен первый вирус - возбудитель инфекционного некроза поджелудочной железы [Wolf, 1960], а вскоре там же была получена первая перевиваемая клеточная линия рыб из гонад радужной форели - RTG-2 [Wolf, Qumby, 1962] Несколько лет спустя были получены новые перевиваемые клеточные линии рыб GF-1 - из плавников синеполосой ронки [Clem et al, 1961], FHM - из хвостового стебля черного толстоголова [Gravell, Malsberger, 1965], STE-137 - из эмбриона радужной форели [Fryer et al , 1965], BF-2 - из хвостового стебля сынежаберного солнечника [Wolf, Qumby, 1966] и другие
С тех пор общее количество клеточных линий рыб стало нарастать лавинообразно, и сегодня их насчитывается более 430 Этот процесс отражает общее развитие ихтиовирусологии Благодаря большому разнообразию появившихся клеточных линий рыб и их применению в вирусологической работе, обнаружено около половины из открытых на сегодня почти 400 ихтиовирусов Новые кпеточные линии позволяют обнаруживать и новые вирусы Так, после получения трех клеточных линий карпа - ССВ, CCG и CaF2 [Neukirch, 1999] - от больных рыб удалось выделить сразу пять разных вирусов [Neukirch, Kunz, 2001]
Помимо вирусологических исследований, клеточные линии рыб сегодня активно используются в иммунологии [Miller et al , 1994], генетике [Gold, 1979, Isa, Shima, 1987], токсикологии и бактериологии [Ahne, 1985], для выделения от рыб риккетсий [Lannan, Fryer, 1991], микоплазм, внутриклеточных протозоа [Kolbl, 1989], культивирования простейших эктопаразитов рыб [Pugovkin, Wahli, 2001]
В нашей стране метод культуры клеток рыб впервые применили 45 лет назад в ГосНИОРХе [Тец, Яковлева, 1962] Позднее исследования по получению культур клеток рыб были развернуты в УкрНИИРХе [Осадчая, 1964], ВИЭВе [Рудиков, 1964], БелНИИРХе [Мамыш, 1975], БелНИВИ [Головнев, Екельчик, 1978] и других
институтах страны Несмотря на серьезные усилия, получить перевиваемые культуры клеток не удавалось
За последнюю четверть века большой скачок в своем развитии претерпела мировая аквакультура - целенаправленное культивирование рыб и других гидробионтов для потребления человеком или восстановления их природных запасов Однако развитие аквакультуры осложняется распространением имеющихся и появлением новых вирусных болезней рыб [OIE, 2003] Для их своевременного выявления ихтиовирусологам необходимо иметь в своем арсенале набор клеточных линий, чувствительных к широкому спектру вирусов Этого требует и значительно обострившаяся в последние годы в стране эпизоотическая ситуация по особо опасным вирусным болезням культивируемых рыб [Щелкунов, 2006]
Так, начиная с 2000 г, на рыбоводных предприятиях страны были зарегистрированы две экзотические вирусные инфекции - инфекционный некроз гемопоэтической ткани лососевых рыб и инфекционный некроз поджелудочной железы В 2003-2006 г г , после многолетнего перерыва, были выявлены новые случаи весенней виремии карпа, а в 2006 г в стране была диагностирована первая вирусная болезнь у культивируемых осетровых рыб Серьезную угрозу рыбоводству представляют и граничащие с Россией скандинавские страны, государства континентальной Европы и юго-восточной Азии, где зарегистрированы опасные болезни, не установленные в нашей стране Ускоренное развитие аквакультуры и активизация международной торговли живыми объектами разведения несут угрозу дальнейшего распространения заразных болезней рыб Поэтому для ихтиовирусологии исследования по получению перевиваемых клеточных линий рыб, являющихся ключевым инструментом при разработке методов диагностики и профилактики вирусных заболеваний, по-прежнему высоко актуальны
Цель и задачи исследований
Целью данной работы является получение перевиваемых клеточных линий карпа (Cypnnus carpió) и сибирского осетра (Acipenser baeri) и оценка возможности их использования для вирусологических исследований рыб
Для достижения данной цели необходимо было решить следующие задачи - эксплантировать и длительно поддерживать в первичной культуре клетки овариальной ткани карпа, паренхиматозных органов и плавников сибирского осетра для использования их в качестве исходного материала при получении перевиваемых линий клеток,
- получить перевиваемую линию клеток яичников неполовозрелого карпа,
- получить перевиваемые линии клеток пула паренхиматозных органов и плавников сибирского осетра,
- определить чувствительность полученных клеточных линий к широко распространенным вирусам рыб разных таксономических групп,
- провести паспортизацию полученных клеточных линий и депонировать их в Российской коллекции клеточных культур
Научная новизна результатов
Впервые получена отечественная перевиваемая линия клеток яичников неполовозрелого карпа (ICO)
Впервые получены две перевиваемые линии клеток пула паренхиматозных органов (SSO-1 и SSO-2) и две перевиваемые линии клеток плавников сибирского осетра (SSF-1 и SSF-2)
Изучены морфологические, кариологические, культуральные и другие свойства полученных перевиваемых клеточных линий рыб
Определена чувствительность клеточных линий к широко распространенным вирусам рыб разных таксономических групп (семейств карповых, лососевых, ссетровых, угревых и щуковых)
Практическая значимость результатов
1 Перевиваемая линия клеток ICO яичников неполовозрелого карпа рекомендована для выделения, идентификации и изучения вирусов рыб разных таксономических групп и включена в Методические указания по идентификации Еирусов и лабораторной диагностике вирусных болезней рыб, утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России
2 Полученные перевиваемые линии клеток тканей сибирского осетра (SSO-1, £>SO-2, SSF-1 и SSF-2) рекомендованы для выделения, идентификации и изучения свойств вирусов разных таксономических групп рыб Их использование позволило диагностировать первую вирусную болезнь у осетровых рыб в России -герпесвирусную болезнь сибирского осетра
3 Паспортизированы и депонированы в Специализированной коллекции перевиваемых соматических культур клеток сельскохозяйственных и промысловых хивотных Российской коллекции клеточных культур при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии (СХЖ РАСХН) две
перевиваемые линии клеток штамм постоянной линии клеток яичников неполовозрелого карпа (ICO) и штамм постоянной линии клеток пула паренхиматозных органов сибирского осетра (SSO-2) Поданы заявки на их патентование (на ICO № 2007132282, на SSO-2 № 2007132283 от 28 08 2007)
Основные положения, выносимые на защиту
- монослойная перевиваемая линия клеток ICO яичников неполовозрелого карпа с эпителиоподобной морфологией, имеет кариотип, близкий к кариотипу хозяина и чувствительна к шести вирусам рыб четырех разных семейств,
- монослойная перевиваемая линия клеток SSO-2 пула паренхиматозных органов сибирского осетра с фибробластоподобной морфологией, имеет кариотип с гипотриплоидным набором хромосом клеток модального класса и чувствительна к восьми вирусам рыб пяти разных семейств,
- монослойная перевиваемая линия клеток SSO-1 пула паренхиматозных органов сибирского осетра с эпителиоподобной морфологией, чувствительна к восьми вирусам рыб пяти разных семейств,
- монослойные перевиваемые линии клеток SSF-1 и SSF-2 плавников сибирского осетра со смешанной и фибробластоподобной морфологией, соответственно, чувствительны к семи вирусам рыб пяти разных семейств,
- методология получения монослойных перевиваемых линий клеток рыб включает щадящую дезагрегацию донорской ткани, одновременное использование питательных сред разного состава, высев донорских клеток в виде "миникультур" и длительное поддержание последних, отбор клеточных популяций для субкультивирования и дифференцированную дезагрегацию клеточного монослоя
Апробация результатов работы
Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого Совета ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ в 2003-2007 гг, Первом конгрессе ихтиологов России (сентябрь 1997 г, г Астрахань), Международном симпозиуме «Тепловодная аквакультура и биологическая продуктивность водоемов аридного климата» (апрель 2007 г , г Астрахань)
Материалы диссертации представлены на Седьмой международной конференции Европейской ассоциации ихтиопатологов (сентябрь 1995 г , Пальма-де-Майорка, Испания), Второй двусторонней российско-американской конференции «Здоровье водных и морских животных» (сентябрь 2003 г , г Шефердстаун, США), Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (октябрь 2006 г, г Санкт-Петербург)
Опубликованность результатов
Основные результаты диссертации опубликованы в 12 научных работах, в том числе 5 статей в журналах по перечню ВАК, глава в книге, глава в учебном пособии для студентов высших учебных заведений, 1 статья в сборнике научных трудов, 4 -в материалах научных конференций (2 из них - в зарубежных)
Личный вклад соискателя
Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно
Исследования проведены в лаборатории ихтиопатологии ФГУП "ВНИИПРХ" и в лабораториях "Биофизика" и "Здоровье гидробионтов" ГНУ ВНИИВВиМ ПЦР-тгстирование линий клеток на наличие микоплазм проводили в лаборатории "Бактериология" ГНУ ВНИИВВиМ (к в н И Ю Егорова) Исследования по подтверждению видовой идентичности полученных клеточных линий проводили в Центре молекулярно-генетической идентификации (руководитель к б н В А Е|арминцев) Научного органа СИТЕС в Российской Федерации в отношении осетровых видов рыб Кариологический анализ перевиваемой культуры клеток ICO проводили совместно со ст н с лаборатории генетики ВНИИПРХ О А Емельяновой Автор выражает искреннюю признательность всем исполнителям и участникам этих работ
Объем и структура работы
Диссертация изложена на 154 страницах, иллюстрирована 15 таблицами и 31 рисунком и дополнена 8 приложениями Список используемой литературы включает 318 источников, из которых 44 - отечественные
2 Собственные исследования 2 1 Материалы и методы
Рыба карп, сибирский осетр, радужная форель, белый амур, гибрид белого и пестрого толстолобиков, выращенные на экспериментальной базе Центрального :кспериментального отдела "Якоть" ФГУП "ВНИИПРХ"
Перевиваемые линии клеток рыб эмбриона атлантического лосося (ASE) [Walker, Hill, 1980], хвостового стебля синежаберного солнечника (BF-2) [Wolf, Quimby, 1966], сердца кеты (СНН-1) [Lannan, 1984], эпидермальных новообразований больного оспой карпа (ЕРС) [Fijan et al , 1983], хвостового стебля черного толстоголова (FHM) [Gravell, Malsberger, 1965], кожи белого осетра (WSSK-1) [Hedrick et al, 1991]
Вирусы - вирус инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых (IHNV), шт FU/0204 (инфекционная активность - 7,5 lg ТЦД50/см3),
- вирус весенней виремии карпа (SVCV), шт М2 (8,0 lg ТЦД5о/см3),
- вирус вирусной геморрагической септицемии (VHSV), шт ЧФ 1 2 (9,0 lg ТЦД50/см3),
- вирус европейского угря (EVEX), шт УФ (7,5 lg ТЦД50/см3),
- рабдовирус мальков щуки (PFRV) (8,3 lg ТЦД5о/см3),
- вирус европейской озерной кумжи (ELTV) (7,0 lg ТЦД50/см3),
- везикуловирус IV геногруппы, изолят "Hecht" (8,3 lg ТЦД5о/см3),
- бирнавирус инфекционного некроза поджелудочной железы (IPNV) (8,0 lg ТЦД50/СМ3),
- иридовирус карпа (CCIV), шт 4БЖ (6,0 lg ТЦД5о/см3),
- герпесвирус сибирского осетра (SSHV), шт SK1/0406 (5,6 lg ТЦД50/см3)
Вирусы поддерживали в лабораторной коллекции ФГУП "ВНИИПРХ" и
лаборатории "Здоровье гидробионтов" ГНУ ВНИИВВиМ
Питательные среды среда Игла основная, Игла MEM, Игла MEM с двойным набором аминокислот и витаминов (2МЕМ), 199, RPMI 1640, Лейбовица L15, триптозофосфатный бульон (ТФБ)
Сыворотки сыворотка крови плода коровы (СПК)
При культивировании перевиваемых клеточных линий рыб использовали рекомендации, описанные авторами для каждой линии
Первичные культуры клеток получали путем ферментативной дезагрегации тканей рыб-доноров Рыбу обездвиживали добавлением в воду анестетика MS 222 и вскрывали с использованием правил асептики и антисептики
Цитоморфологические методы Для изучения морфологических особенностей клеточных линий проводили регулярное, в течение всего срока инкубации, микроскопирование нативных и окрашенных по Паппенгейму препаратов [Мусселиус и др , 1983]
Кариологические методы Для кариологического анализа препараты хромосом готовили стандартным методом [Голубев и др , 1976] с последующей окраской 1%-ным красителем Гимза на фосфатном буфере (рН 6,8) Подсчет числа хромосом вели в 100 метафазных пластинках каждой линии, используя компьютерную программу ACD Photo Editor 3 1
Вирусологические методы Накопление вирусов в культурах клеток, экспериментальное воспроизведение заболеваний, отбор и обработку
патологического материала, выделение вирусов из патологического материала, титрование вирусов в культурах клеток проводили согласно принятым методам [Методические указания по идентификации вирусов и лабораторной диагностике вирусных болезней рыб, 1998] Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча
Чувствительность полученных клеточных линий определяли к 10 широко распространенным вирусам рыб, перечисленным выше
Чувствительность выявления вируса определяли параллельным титрованием на всех полученных клеточных линиях 10% суспензии патологического материала от экспериментально зараженных вирусами (IHNV, VHSV, SVCV, IPNV, SSHV) рыб или к/льтурального вируса (EVEX, PFRV, ELTV, "Hecht", CCIV), накопленного на референсной клеточной линии
Вирусрепродуцирующую активность культуры клеток определяли титрованием на ней культурального вируса, прошедшего на этой культуре клеток не менее трех пассажей
Микробиологические методы Стерильность клеточных линий определяли путем высева на питательные среды МПБ, МПА, Китта-Тароцци, тиогликолевую, С.абуро
nUP-метод Тестирование клеточных линий проводили согласно Наставлению по применению тест-системы «МИК-КОМ» для диагностики микоплазмоза методом полимеразной цепной реакции (1998)
Видовую идентичность подтверждали с помощью молекулярно-генетического анализа участка D-петли митохондриальной ДНК с использованием ПЦР-метода с Еидоспецифическими для осетровых рыб праймерами (для клеточных линий из тканей сибирского осетра) и митохондриального гена цитохром-оксидазы I с использованием секвенирования полученных ампликонов и определения идентичности исследованных последовательностей эталонным образцам из GenBank (для клеточной линии яичников неполовозрелого карпа)
Статистическая обработка результатов Статистическую обработку данных проводили общепринятыми методами [Лакин, 1990]
2 2 Результаты исследований 2 2 1 Получение перевиваемой клеточной линии яичников неполовозрелого карпа, Cyprinus carpió
В качестве доноров ткани использовали четырехгодовалых самок карпа, имеющих вторую стадию зрелости гонад по шкале Киселевича Яичники измельчали
на кусочки объемом 2-3 мм3 и промывали несколько раз средой Игла MEM Дезагрегирование ткани проводили при комнатной температуре щадящим методом дробной дезагрегации, чередуя 10-15-минутные обработки 0,5%-ным раствором трипсина с такими же обработками средой Игла MEM
После центрифугирования (60д, 15-20 мин) осадок клеток ресуспендировали в среде Игла MEM с 10% СПК и высевали в пробирки по 6x105 - 1x10б клеток В качестве ростовой среды использовали среды разного состава с 10-20% СПК и антибиотиками Клетки инкубировали при различных температурах (21е, 24°, 28°, 33°С)
Через двое суток после посева в пробирках, инкубировавшихся при 28°С в среде Игла MEM с 20% СПК, образовывался монослой, состоявший преимущественно из фибробластоподобных клеток На других питательных средах и при других температурах рост был заметно хуже Для субкультивирования использовали первичные культуры клеток разного возраста Через сутки образовывался монослой, состоявший из фибробластоподобных клеток Однако дальнейшее субкультивирование не приводило к формированию монослоя, прикрепившиеся клетки постепенно округлялись и отделялись от поверхности субстрата
В отдельных пробирках на 9 сутки появились островки эпителиоподобных клеток После внесения диспергирующего раствора все клетки, кроме последних, легко снимались с поверхности Добавление в эти пробирки среды Игла MEM с 10% СПК и 2% триптозофосфатного бульона способствовало росту эпителиоподобных клеток и образованию сплошного монослоя На 12 сутки было начато субкультивирование этих культур Дальнейшее пассирование клеток было успешным и привело к получению клеточной линии, получившей название ICO (immature carp ovaries)
2 2 2 Получение перевиваемых клеточных линий пула
паренхиматозных органов сибирского осетра, Acipenser baeri
В качестве доноров использовали двух сеголетков осетра В асептических условиях извлекали печень, почку и селезенку, измельчали и многократно отмывали
средой Игла MEM до получения прозрачной надосадочной жидкости Дезагрегация и
последующая обработка ткани была аналогична таковой при получении первичной культуры из гонад карпа Клетки ресуспендировали в среде 199 с 20% СПК и антибиотиками до конечной концентрации 1 х106 кл/см3, разливали в пробирки по
1 см3 и инкубировали при 21,5°С Через двое суток образовывался монослой, состоявший из смеси фибробласто- и эпителиоподобных клеток
Субкультивирование первичных культур проводили спустя разные интервалы времени с момента посева (18-33 сут) При первом субкультивировании легко удавалось отделять эпителиоподобные клетки, тогда как фибробластоподобные оставались прикрепленными к субстрату Посев эпителиоподобных клеток приводил к формированию монослоя, состоявшего из клеток той же морфологии Однако удалось провести только три пассажа этих клеток При дальнейших пересевах монослой не образовывался, и рост клеток прекратился
В пробирки с оставшимися фибробластоподобными клетками добавляли свежую порцию питательной среды (199 с 20 % СПК и антибиотиками) и продолжали инкубировать при той же температуре, что и первичные культуры Через трое суток Формировался полный монослой При дальнейших пересевах в части пробирок монослой формировался на 4-6 сутки и был представлен крупными срибробластоподобными клетками, тогда как в других пробирках росли мелкие фибробластоподобные клетки, которые значительно быстрее формировали монослой (через сутки)
Крупные фибробластоподобные клетки дали начало клеточной линии SSO-2 (Siberian sturgeon organs - 2), которая успешно культивируется на протяжении уже более 190 пассажей без заметного изменения морфологии клеток До 45 пассажа мелкие фибробластоподобные клетки культивировали в среде 199, а затем перевели на среду Игла 2МЕМ с 20% СПК Со временем культивирование в среде Игла 2МЕМ привело к изменению морфологии клеток, и на протяжении уже более 100 пассажей монослой этой культуры представлен эпителиоподобными клетками полигональной формы Эта клеточная линия получила название SSO-1 (Siberian s.turgeon organs - 1) и прошла уже более 220 пассажей
2 2 3 Получение перевиваемых клеточных линий плавников сибирского осетра, Acipenser Ьаеп
Кусочки хвостовых плавников восьми сеголетков осетра помещали в среду Игла MEM с антибиотиками ( 1000 ЕД/см3 пенициллина, 1000 мкг/см3 стрептомицина, 200 ЕД/см3 нистатина) в соотношении 1 10, выдерживали 10 мин при регулярном помешивании, затем среду сливали, добавляли свежую порцию того же состава, и -ак повторяли трижды После этого плавники обрабатывали в 70° этиловом спирте
(5-7 сек), после чего трехкратно отмывали в среде Игла MEM, содержащей 300 ЕД/см3 пенициллина, 300 мкг/см3 стрептомицина, 100 ЕД/см3 нистатина
Обработанные плавники измельчали ножницами до величины 1-2 мм, трижды отмывали средой того же состава К полученной ткани добавляли 0,25%-ый раствор трипсина в соотношении 1 10 После 15-минутной дезагрегации на магнитной мешалке при комнатной температуре надосадочную жидкость отбрасывали, трижды промывали ткань средой Игла MEM, добавляли, свежую порцию раствора трипсина и дальнейшую дезагрегацию проводили на магнитной мешалке в течение ночи при температуре 6°С, а затем еще 1 час при комнатной температуре (21°С) Последующие манипуляции были аналогичны таковым при получении первичной культуры из пула паренхиматозных органов В качестве ростовых сред использовали среду 199 с 20% СПК и среду Игла MEM с 20% СПК
Через двое суток после посева на обеих средах образовывался монослой, состоявший из смеси фибробласто- и эпителиоподобных клеток За первичными культурами вели длительное наблюдение, в некоторых пробирках периодически производили смену среды (по мере ее закисления) Со временем в отдельных пробирках происходило изменение морфологии в одних - стали преобладать эпителиоподобные клетки, в других появлялись островки фибробластоподобных клеток
Субкультивирование первичных культур проводили в разные сроки с момента посева (от 22 дней до 5 месяцев) по методу, описанному для культур паренхиматозных органов В качестве ростовой среды использовали среды того же состава, что и при получении первичных культур Субкультуры удавалось получить и пассировать до 2-8 раз, после чего клетки погибали
В одной из пробирок с первичной культурой клеток после четырех месяцев инкубации произошло почти полное вытеснение фибробластоподобных клеток эпителиоподобными Субкультивирование этой культуры в среде 199 с 20% СПК ("Gibco") на протяжении 24 пассажей приводило к образованию монослоя из неоднородных, но преимущественно эпителиоподобных клеток С 25 пассажа культуру перевели на среду Игла 2МЕМ с 20% СПК Многократное субкультивирование дало начало перевиваемой клеточной линии SSF-1 (Siberian sturgeon fins -1) К настоящему времени клеточная линия прошла более 220 пассажей
Из пробирок с первичными культурами, в которых в процессе длительной инкубации (около 4 месяцев) появились островки фибробластоподобных клеток,
диспергирующим раствором удалось снять все клетки, кроме клеток, образующих островки Добавление среды 199 с 20% СПК и инкубация при 21,5°С привели к формированию монослоя, состоявшего только из фибробластоподобных клеток Дальнейшие пересевы клеток оказались успешными, в результате чего была получена клеточная линия SSF-2 (Siberian sturgeon fins -2), к настоящему времени она прошла более 220 пассажей без изменения морфологии клеток
Содержание сыворотки в ростовой среде для всех полученых клеточных линий было постепенно снижено до 10%, а добавление антибиотиков прекращено
2 2 4 Характеристика перевиваемых клеточных линий
Морфология линии клеток ICO После посева клетки группируются по 5-10 клеток, а спустя 3-4 часа распластываются по поверхности субстрата, образуя островки, являющиеся очагами роста Островки затем сливаются с образованием монослоя Монослой ровный Клетки эпителиоподобные, преимущественно однородные, их форма близка к кубической Ядра крупные округлые, число ядрышек от 1 до 3, чаще 1 Ядрышки крупные, при окраске по Паппенгейму окружены зоной просветления Цитоплазма гомогенная
Кариологическая характеристика линии клеток ICO Кариологическими исследованиями (59 и 690 пассаж) установили, что модальный класс клеточной пинии ICO 59 пассажа представлен клетками, содержащими 100 хромосом, при интервале варьирования - от 95 до 104 (рис 1) Величина модального класса равнялась 56% Хромосомный набор донорского вида - 2п = 100 [Васильев, 1985] На 690 пассаже модальный класс уменьшился до 90 хромосом, а его величина снизилась до 36% При этом интервал варьирования хромосом резко возрос - от 71 до 178 (рис 2)
95 96 97 98 99 100 102 103 104
Число хромосом
Рис 1 Гистограмма распределения числа хромосом в клетках линии ICO 59 пассажа
-----
-JL^ ur .1 mW.....................Л Jhiihiii......Vflnlninflm Jmi.mJA
70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 Число хромосом
Рис 2 Гистограмма распределения хромосом в клетках линии ICO 690 пассажа
Морфология линии клеток SSO-1 При посеве клетки линии SSO-1 равномерно распределяются по поверхности субстрата Клетки эпителиоподобные, преимущественно однородные, полигональной формы Ядра клеток крупные, округлой, овальной, бобовидной или подковообразной формы, нередко с фестончатыми краями Число ядрышек от 2 до 7, чаще 3-4 При окраске по Паппенгейму структура ядер гомогенная, цитоплазмы - мелкозернистая В клеточном монослое нередки многоядерные клетки - симпласты, обычно имеющие по 4-5 округлых ядер, расположенных в виде кольца
Морфология линии клеток SSO-2 При посеве клетки равномерно распределяются по поверхности субстрата Монослой состоит из пучков крупных фибробластоподобных клеток типичной веретенообразной формы Ядра крупные овальной формы Число ядрышек от 2 до 6, чаще 3-4 Структура ядра и цитоплазмы гомогенная
Кариологическая характеристика линии клеток SSO-2 В силу того, что клетки линии SSO-2 содержат большое количество микрохромосом (более половины от общего числа), подсчитать их количество с точностью до одной хромосомы было невозможно Число хромосом в клетках колебалось от 186 до 371 Предварительный анализ распределения хромосом показал, что оно не имеет выраженных максимумов, и наибольшее количество клеток, содержавшее одинаковое число хромосом, не превышало 8 Поэтому для построения гистограммы распределения хромосом был применен метод вариационных рядов [Лакин, 1990] с расчетом моды и классовых вариант После обработки данных было установлено, что 44% клеток содержат число хромосом в пределах одного класса (от 355 до 374) Этот класс и
был принят за модальный, классовая варианта и мода которого равнялись 364 (рис 3) Хромосомный набор донорского вида - 2п=248±5 [Васильев, 1985]
.ill..
164 184 204 224 244 264 284 304 324 344 364 384 Классовые варианты числа хромосом (класс=20)
Рис 3 Гистограмма распределения числа хромосом в клетках линии SSO-2 186 и 190 пассажей
Морфология линии клеток SSF-1 Популяция клеток линии SSF-1 представлена как эпителио- так и фибробластоподобными клетками В первые 7 суток после посева преобладают в основном эпителиоподобные клетки При окраске по Паппенгейму клетки отросчатые, распластанные по субстрату, с размытыми краями Контакты между клетками неплотные, с большим межклеточным пространством Ядра средних размеров, овальной формы, с четко очерченными границами Цитоплазма и кариоплазма гомогенны Количество ядрышек от 1 до 7, чаще 2-3 на клетку С увеличением возраста культуры морфология клеток постепенно меняется на фибробластоподобную Образующиеся фибробласты представляют собой тонкие длинные нитеподобные клетки
Морфология линии клеток SSF-2 Монослой линии SSF-2 состоит из рыхло лежащих фибробластоподобных клеток, расположенных пучками При окраске по Паппенгейму цитоплазма клеток выглядит неоднородной, с интенсивно и слабоокрашенными участками Ядра клеток крупные, кариоплазма гомогенная Количество ядрышек от 1 до 6, чаще 3-4 на клетку
Влияние посевной плотности клеток на рост клеточных линий Величина посевной плотности (количество клеток, приходящееся на 1 см2 рабочей поверхности) влияла как на время формирования монослоя, так и на индекс пролиферации клеток
Высокая посевная плотность (> 505x103 кл /см2 для ICO и > 62x103 кл /см2 для SSO-2) приводила к формированию очень плотного монослоя уже через 4 часа
35 30 25 20 15 10 5 -0
после посева Спустя 3-5 суток отмечали начало дегенерации культуры Формирование монослоя замедлялось или вообще не происходило при посеве клеток с низкой плотностью (< 95x103кп /см2 для ICO и < 16x103 кл /см2 для SSO-2) Прирост клеток за время наблюдения был незначительным как при чрезмерно высокой, так и при низкой плотности посева
В результате проведенных исследований определена оптимальная посевная плотность клеток для каждой клеточной линии ICO - 3x10s кл /см2, SSO-1 - (9-12) х104 кл /см2, SSO-2 - 3x104 кл /см2, SSF-1 - (8-10) х104 кл /см2, SSF-2 - (13-15) х104 кл /см2
Влияние состава среды на рост клеток Результаты испытаний показали, что клетки линии ICO могут расти во всех использованных средах, но среда Игла 2МЕМ обеспечивала наилучший стартовый рост клеток после посева, достаточно высокий индекс пролиферации (табл 1) и хорошую сохранность клеточного монослоя до конца срока наблюдения Несмотря на более высокий "урожай" клеток к концу эксперимента, в средах Игла основная, L15 и RPMI 1640 через 10 суток отмечали заметную дегенерацию монослоя
Рост клеток линии SSO-1 отмечался во всех испытанных средах и имел схожую динамику Но наибольший прирост клеток наблюдали при культивировании в средах Игла MEM и Игла 2МЕМ
Таблица 1
Влияние состава среды культивирования на ростовые показатели полученных клеточных линий (п=3)
Линия клеток Индекс пролиферации*/ время формирования монослоя (сут ) в разных питательных средах
Игла основная Игла MEM Игла 2МЕМ 199 RPMI 1640 L15
ICO 5,5±0,1/ 6 4,6±0,1/ 4 4,9± 0,2/ 1 5,1+0,1/ 6 5,2±0,1/ 6 5,9±0,2/ 2
SSO-1 3,9±0,2/ 1 4,7±0,2/ 1 5,0±0,1/ 1 3,2±0,2/ 1 3,5±0,1/ 1 3,5±0,1/ 1
SSO-2 2,9±0,1/ 4 2,4±0,1/ 2 2,2±0,2/ 2 4,1 ±0,1/ 1 3,1±0,1/ 2 3,1±0,1/ 2
SSF-1 3,5±0,2/ 1 4,4±0,1/ 1 4,6±0,1/ 1 2,9±0,1/ 1 4,7±0,2/ 1 2,4±0,1/ 1
SSF-2 2,2±0,1/ 1 2,2±0,2/ 1 2,1 ±0,2/ 1 4,0±0,1/ 1 2,2±0,1/ 1 2,3±0,1/ 1
Примечание * - средняя арифметическая ± среднее квадратическое отклонение
Во всех испытанных средах, кроме основной среды Игла и L15, через сутки после посева клеток линии SSO-2 отмечали прирост клеток Культивирование в средах Игла и 199 не приводило к появлению признаков дегенерации монослоя на протяжении всего срока наблюдения, тогда как в средах RPMI 1640 и L15 на 5 сутки отмечали появление округлых клеток на поверхности монослоя, количество которых возрастало с увеличением срока инкубации Наибольший урожай клеток (индекс
пролиферации 4,1) наблюдали в среде 199, которая рекомендована нами для культивирования этой линии клеток
Пролиферацию клеток линий SSF-1 и SSF-2 отмечали во всех испытанных средах Монослой формировался уже через сутки, однако динамика роста этих клеточных линий на разных средах была различной Наилучший рост клеток линии SSF-1 наблюдался в средах Игла MEM, Игла 2МЕМ и RPMI 1640 (индекс пролиферации соответственно 4,4, 4,6 и 4,7), в то время как клетки SSF-2 лучше росли в среде 199 (индекс пролиферации 4) и значительно хуже в других питательных средах (табл 1) К тому же в процессе культивирования клеток линии SSF-2 в средах Игла MEM, Игла 2МЕМ, RPMI 1640 и L15 происходило изменение их морфологии Из фибробластоподобных клетки становились эпителиоподобными
Влияние содержания сыворотки в ростовой среде на рост клеток Суспензии клеток линий ICO и SSO-2 с оптимальной посевной плотностью готовили в ростовых средах с разным содержанием сыворотки крови плода коровы (от 2 до 20%), высевали в 24-луночные планшеты и инкубировали при оптимальных для каждой из них температурах
Пролиферация клеток ICO и SSO-2 происходила во всех вариантах питательных сред, однако концентрация сыворотки влияла на динамику роста клеток, скорость образования монослоя, индекс пролиферации (табл 2) и длительность сохранения культур При культивировании клеток ICO в среде с 2-15% СПК скорость роста клеток возрастала с увеличением содержания сыворотки, и плотность клеток достигала максимальных значений к 14-ым суткам (17-ым суткам для 2% СПК) Дальнейшее увеличение содержания сыворотки было избыточным и приводило к снижению темпов роста клеток и более ранней дегенерации культуры Результаты опыта показали, что оптимальной концентрацией сыворотки для клеток линии ICO является 10%
Таблица 2
Влияние концентрации сыворотки в ростовой среде на ростовые показатели клеток
линий ICO и SSO-2 (п=3)
Линия клеток Индекс пролиферации/ время формирования монослоя (сут ) в средах с разными концентрациями сыворотки
2% 5% 10% 15% 20%
ICO 2,7±0,2/ 3 4,1 ±0,2/ 2 5,0±0,1/ 1 5,1+0,2/ 1 4,0±0,1/ 1
SSO-2 2,0±0,2/ 11 3,2±0,1/ 7 4,0±0,2/ 1 4,3+0,2/ 1 3,8±0,1/ 2
Через сутки после посева клеток линии SSO-2 монослой был полностью сформирован в среде с 10-15% СПК, тогда как с 2-5% СПК он формировался значительно медленнее (с 5% через 7 суток, с 2% - 11 суток) В среде с 20% СПК через сутки плотность клеток оставалась в пределах посевной, а монослой был сформирован примерно на 90% На 14 сутки культивирования в среде этого состава отмечали появление признаков дегенерации культуры Таким образом, оптимальной концентрацией сыворотки для клеток линии SSO-2 является 10-15%
Влияние температуры инкубации на рост клеток Пролиферация клеток линии ICO наблюдалась в интервале температур от 15° до 30°С с оптимумом 25°С, линий SSO-1 и SSF-2 - от 15° до 25°С с оптимумом 20°С, линии SSO-2 - от 10° до 30°С с оптимумом 20-25°С, линии SSF-1 - от 10° до 30°С с оптимумом 20°С (табл 3) Оптимальные температуры роста клеточных культур были близки к таковым рыб-доноров (карп -22-28°С, осетр - 20-26°С) [Щербина, Гамыгин, 2006]
Таблица 3
Влияние температуры инкубации на индекс пролиферации полученных клеточных линий (п=3)
Линии клеток Индекс пролиферации при различных температурах (°С) инкубации
10 15 20 25 30 35
ICO 0,9±0,2 3,1±0,1 4,3+0,1 5,2±0,1 3,4±0,2 0,9±0,2
SSO-1 1,1 ±0,1 2,2±0,2 3,6±0,2 3,3±0,1 1,1±0,2 н и
SSO-2 2,2±0,2 3,0±0,2 2,8±0,1 3,2±0,1 2,0±0,1 н и
SSF-1 2,2±0,2 4,5±0,1 4,6±0,1 4,1±0,1 2,4±0,2 н и
SSF-2 1,0±0,1 2,5+0,1 4,4±0,2 3,4±0,2 0,9+0,1 н и
Примечание н и - не исследовали
Чувствительность к вирусам рыб Установлено, что клеточная линия ICO высокочувствительна почти ко всем испытанным рабдовирусам рыб за исключением ELTV (табл 4, 5) Она также чувствительна к иридовирусу CCIV и не чувствительна к бирнавирусу IPNV и герпесвирусу SSHV
Клеточная линия SSO-2 чувствительна к герпесвирусу SSHV и ко всем испытанным рабдовирусам рыб различных семейств, но нечувствительна к IPNV и CCIV Клеточная линия SSO-1 была чувствительна к тому же спектру вирусов, что и линия SSO-2 Однако такие вирусы, как SVCV, IHNV, PFRV и изолят "Hecht", накапливались в ней в более низких титрах, тогда как титр вируса VHS в ней был на 2,5 порядка выше, чем в SSO-2
Спектры чувствительности клеточных линий SSF-1 и SSF-2 к вирусам рыб схожи, но в то же время индивидуальны Обе клеточные линии чувствительны к герпесвирусу SSHV и почти ко всем испытанным рабдовирусам рыб, за исключением вируса IHN (табл 4, 5) Они нечувствительны также к IPNV и CCIV
Таблица 4
Чувствительность полученных клеточных линий к вирусам рыб, выделяемым из патологического материала или накопленным на референсных линиях клеток
Вирус Титры вирусов на разных культурах клеток
реф кл линия ICO SSO-1 SSO-2 SSF-1 SSF-2
SVCV 7,10±0,11* 7,10±0,13* 7,35±0,10* 7,35±0,12* 7,35±0,10* 7,35±0,13*
IHNV 9,10±0,11* 8,10±0,11* 5,85±0,11* 8,10±0,13* - -
VHSV 6,35±0,12* 6,35±0,20* 5,85±0,11* 4,85±0,11* 5,10±0,10* -
EVEX 7,10±0,1Г 9,10±0,12п 8,10±0,12° 8,85±0,11° 7,35±0,1Г 7,85±0,11°
PFRV 8,60±0,14° 7,35±0,1Г 7,85±0,10° 7,85±0,10° 7,85±0,12° 7,35±0,11°
"Hecht" 8,10±0,13° н и 8,85±0,12° 8,10±0,11 ° 7,10+0,13" 7,10±0,12п
ELTV н и - 5,10±0,12° 7,35±0,13° 5,10±0,11° 7,35±0,11°
IPNV 4,40±0,12* - - - - -
CCIV н и 5,70±0,15* - - - -
SSHV 6,10±0,13* - 5,90±0,12* 6,10±0,12* 5,85±0,12* 5,35±0,12*
Примечание * - титр вируса в патматериале, 1д ТЦД50/г ткани, ° - титр вируса, накопленного на референсной линии клеток, 1д ТЦД5о/см3 культуральной жидкости, н и - не исследовали, — признаков ЦПД не обнаружено
Таблица 5
Вирусрепродуцирующая активность клеточных линий по отношению к некоторым вирусам рыб (после 3-5 пассажей в культурах клеток)
Вирус Титры вирусов на разных культурах клеток, Ig ТЦД5о/см')
реф кл линия ICO SSO-1 SSO-2 SSF-1 SSF-2
SVCV 8,10±0,12 9,10±0,14 6,10±0,11 8,60±0,11 6,10±0,12 8,60±0,12
IHNV 7,85±0,21 7,35±0,10 5,60±0,11 6,35±0,10 - -
VHSV 9,10±0,11 8,60±0,15 7,85±0,10 5,10±0,11 - 5,10±0,11
EVEX 7,85±0,14 9,10+0,11 6,10+0,12 6,10±0,11 6,85±0,12 7,35±0,10
PFRV 8,35±0,12 9,10±0,10 6,85±0,12 8,85±0,13 8,35±0,10 8,85±0,12
"Hecht" 8,35±0,15 н и 5,35±0,11 7,35±0,10 7,35±0,12 7,35±0,12
ELTV 7,10±0,11°° - 5,85±0,10 5,35±0,12 4,35±0,11 6,10±0,11
IPNV 8,10±0,12 - - - - -
CCIV 6,00±0,12 5,70±0,13 - - - -
SSHV 5,60±0,13°° - 5,35±0,13 5,85±0,11 5,85±0,13 5,40±0,13
Примечание пп- титр вируса после 2-х пассажей на референсной линии клеток, ни -не исследовали, — признаков ЦПД не обнаружено
Примечательно, что линия SSF-1 выявляла вирус VHS при выделении его из патологического материала, однако к третьему пассажу т vitro цитопатический эффект вируса утрачивался В то же время, линия SSF-2 вела себя прямо противоположным образом (табл 4, 5) Наиболее чувствительными эти линии оказались к вирусу PFRV, а линия SSF-2 еще и к вирусу SVCV Титры, в которых эти вирусы накапливались в SSF-1 и SSF-2, приближались к таковым для референсных линий, а нередко и превосходили их
Таким образом, проведенные исследования показали, что полученные клеточные линии чувствительны к широкому спектру вирусов рыб разных таксономических групп и могут быть рекомендованы для их выявления, идентификации и изучения
Время появления и характер ЦПЭ рабдовирусов в полученных и референсной клеточных линиях в целом не различались ЦПЭ проявлялось в виде округления клеток, разрежения монослоя и появления клеток с длинными тонкими отростками, придающими пораженной культуре клеток вид сеточки
ЦПЭ герпесвируса сибирского осетра в полученных линиях начиналось с появления множественных очагов округлых клеток, которые постепенно отделялись от субстрата Отличительной особенностью ЦПЭ в культуре клеток SSF-2 было появление крупных округлых клеток увеличенных размеров, имевших форму близкую к шарообразной
Жизнеспособность после криоконсеовации по тесту витального окрашивания трипановым синим после хранения при температуре минус 70°С составила для клеток ICO - 75-80%, для клеток SSO-1 и SSF-1 - 90%, для клеток SSO-2 и SSF-2 -80% При оптимальных условиях культивирования клетки восстанавливают исходные ростовые и морфологические свойства в течение 2 пассажей
Контроль клеточных линий на посторонние контаминанты При исследовании клеточных линий на наличие бактерий, грибов и микоплазм получены отрицательные результаты
Видовая идентичность подтверждена молекулярно-генетическими методами
Характеристика полученных перевиваемых линий клеток приведена в табл 6
Таблица 6
Характеристика полученных перевиваемых клеточных линий карпа и сибирского осетра
Показатели Перевиваемые клеточные линии
ICO SSO-1 SSO-2 SSF-1 SSF-2
Количество проведенных пассажей 690 225 190 225 225
Среда культивирования 2МЕМ 2МЕМ 199 2MEM 199
Сыворотка крови (СПК) 10% 10% 10% 10% 10%
Температура пролиферации, интервал/оптимум, °С 15-30/25 15-25/20 10-30/20-25 10-30/20 15-25/20
Состав диспергирующего раствора, трипсин (0,25%) версен (0,02%) 5 7 1 1,5 1 1,5 1 1,5 1 1,5
Коэффициент пересева 1 5 1 4-1 5 1 4 1 4-1 5 1 4
Посевная плотность кпеток/см2 3x10Ь (9-12) х104 3x10" (8-10) x104 (13-15)x104
Морфология клеток эпителиоподобная эпителиоподобная фибробластоподоб смешанная фибробластоподоб
Размах варьирования числа хромосом 95-104 (59 пас) 71-178 (690 пас) Не исследовали 186-371 (190 пас) Не исследовали Не исследовали
Модальное число хромосом 100 (59 пас) 90 (690 пас) Не исследовали 364 (190 пас) Не исследовали Не исследовали
Величина модального класса 56% (59 пас) 36% (690 пас) Не исследовали 44% (190 пас) Не исследовали Не исследовали
Жизнеспособность после криоконсервации 75-80% 90% 80% 90% 80%
Срок переживания монослоя без смены среды, сут 20-25 25-30 25-30 30-35 25-30
Вирусрепродуцирующая активность, 1дТЦД50/см3 SVCV (9,1), IHNV (7,4), VHSV (8,6), PFRV (9,1), CCIV (5,7), EVEX (9,1) SSHV (5,4), IHNV (5,6), VHSV (7,9), SVCV(6,1), EVEX (6,1), PFRV (6,9), ELTV (5,9), "Hecht" (5,4) SSHV (5,9), IHNV (6,4), VHSV (5,1), SVCV (8,6), EVEX (6,1), PFRV (8,9), ELTV (5,4), "Hecht"(7,4) SSHV (5,9), SVCV (6,1), EVEX (6,9), PFRV (8,4), ELTV (4,4), "Hecht" (7,4) SSHV (5,4), VHSV (5,1), SVCV (8,6), EVEX (7,4), PFRV (8,9), ELTV (6,1), "Hecht" (7,4)
Контаминация посторонними агентами Не выявлена Не выявлена Не выявлена Не выявлена Не выявлена
3 Выводы
1 При создании оптимальных условий культивирования, регулярной смен питательной среды и отборе наиболее жизнеспособных культур получены длительн переживающие (до 4-5 месяцев) первичные культуры клеток овариальной ткан неполовозрелого карпа, паренхиматозных органов и плавников сибирского осетра пригодные для последующего субкультивирования
2 Впервые получены и охарактеризованы по стандартному набору признако перевиваемые линии клеток пула паренхиматозных органов и плавников сибирског осетра (SSO-1, SSO-2, SSF-1 и SSF-2) и линия клеток яичников неполовозрелого карп (ICO) Предложена схема действий по получению монослойных перевиваемы клеточных линий рыб
3 Показано, что селекция активно пролиферирующих клеток, способных дат начало перевиваемым линиям, может быть осуществлена одним из двух путей 1 естественным отбором клеток в ходе продолжительного пассирования т vitro (SSF-1) 2) искусственным отбором с помощью метода дифференцированной дезагрегаци клеточного монослоя (ICO, SSO-1, SSO-2 и SSF-2)
4 Оптимальная посевная плотность клеток, обеспечивающая высокий индек пролиферации, значительный урожай клеток и продолжительную сохранность их культуре, составляет ICO - ЗхЮ5 кл/см2, SSO-1 - (9-12) хЮ4 кл/см2, SSO-2 - 3x10 кл/см2, SSF-1 - (8-10) хЮ4 кл/см2, SSF-2 - (13-15) хЮ4 кл/см2 Увеличение ил уменьшение плотности посева клеток в два и более раз по сравнению с оптимально" приводит к уменьшению индекса пролиферации, ранней дегенерации культуры разреженности монослоя или неспособности клеток к его образованию
5 Использование сред разного состава привело к получению из одних и тех ж образцов донорской ткани перевиваемых клеточных линий, различающихся п свойствам Оптимальной питательной средой для культивирования перевиваемы линий клеток являются среды, на которых они были получены (Игла 2МЕМ для ICO, SSO-1 и SSF-1, среда 199 для SSO-2 и SSF-2) Клеточные линии, растущие малокомпонентной среде Игла 2МЕМ, толерантны к изменению состава среды, тогд как перевод линий клеток, растущих в многокомпонентной среде 199, на другие питательные среды негативно отражается на их пролиферативной активности
6 Установлено, что на начальной стадии роста после очередного субкультивирования перевиваемых клеточных линий ICO и SSO-2 добавление в ростовую среду 10-20% сыворотки плода коровы оказывает защитное действие на клетки, способствуя быстрому началу их активной пролиферации В то же время, на
завершающей стадии пролиферации 20%-ное содержание сыворотки ингибирует рост клеток Оптимальное содержание сыворотки в средах для роста обеих линий клеток составляет 10%
7 Оптимальными температурами культивирования полученных перевиваемых линий клеток являются температуры, близкие к температурным оптимумам рыб-доноров ткани ICO - 25°С, SSO-1, SSF-1 и SSF-2 - 20°С, SSO-2 - 20-25°С Повышение температуры выше оптимальной на 5°С стимулирует бурный рост культур, быстро сменяющийся их дегенерацией Понижение температуры до 10-15°С позволяет длительно сохранять клеточные линии в условиях лаборатории в жизнеспособном состоянии
8 В результате кариотипирования установлено, что модальное число хромосом клеток пинии ICO за более чем 600 пассажей изменилось со 100 (диплоидный набор) до 90 (гиподиплоидный набор) Модальный класс клеток линии SSO-2 составляет 364 фомосомы (гипотриплоидный набор) Выявлен широкий диапазон варьирования числа фомосом в клетках обеих линий ICO - от 71 до 178, SSO-2 - от 186 до 371
9 Все пять полученных линий клеток рыб (ICO, SSO-1, SSO-2, SSF-1 и SSF-2) чувствительны к широкому спектру вирусов рыб разных таксономических групп [семейств карповых, лососевых, угревых, щуковых и осетровых) Использование полученных линий клеток сибирского осетра позволило диагностировать первую зирусную болезнь осетровых рыб в России
4 Практические предложения
Полученные перевиваемые линии клеток карпа и сибирского осетра используются в практической работе для диагностики вирусных болезней культивируемых рыб из семейств карповых, лососевых, угревых, щуковых и осетровых и в экспериментальных вирусологических работах
Разработаны и предложены "Методические указания по идентификации вирусов и лабораторной диагностике вирусных болезней рыб", утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 10 10 1997 г с использованием перевиваемой пинии клеток ICO
Результаты работ положены в основу главы "Методы изучения вирусных болезней рыб" учебного пособия для студентов ВУЗов "Лабораторный практикум по болезням рыб" (под ред В А Мусселиус, 1983)
Список опубликованных работ по материалам диссертации
1 Щелкунова, Т И Методы вирусологических исследований рыб/ Т Щелкунова, И С Щелкунов// Бауер, О H Болезни прудовых рыб/ О H Бауер, В Мусселиус, ЮА Стрелков - M Легкая и пищевая промышленность, 1981 -С 260-270
2 Щелкунова, Т И Методы изучения вирусных болезней рыб/ Т И Щелкунова И С Щелкунов // Лабораторный практикум по болезням рыб под ред В А Мусселиус M Легкая и пищевая промышленность, 1983 - С 131-174 - (Учебное пособие дл студентов высших учебных заведений)
3 Щелкунов, И С Мытье культуральной посуды отечественное средств «Афол» вместо импортного детергента 7Х / И С Щелкунов, Т И Щелкунова Цитология - 1994 -Т 36, №2 - С 215-218
4 Two continuous cell lines from carp, Cyprinus carpió LI IS Shchelkunov , T Shchelkunova, O A Kupinskaya, О V Emelyanova // Dis Fish Shellfish 7th Intern Con EAFP, Palma de Mallorca, 1995 - P 49
5 Клеточные линии из тканей сибирского осетра/ Т И Щелкунова, О Купинская.НА Мащенко, И С Щелкунов//Первый конгресс ихтиологов России тезис докладов, Астрахань, 1997-С 302-303
6 Щелкунов, И С Получение постоянных клеточных линий рыб, практически советы/ И С Щелкунов, Т И Щелкунова// Актуальные вопросы пресноводно аквакультуры сб науч труд ВНИИПРХ -М ВНИРО, 2002 - Вып 78 - С 179-188
7 Shchelkunov, I S Theory and practice of establishing long-term cell lines from fis and shellfish/ I S Shchelkunov , T I Shchelkunova // Aquatic & Manne Animal Health Second Bilateral Conference, Clarion Inn Conference Center Shepherdstown, West Virginia -2003 -P 13
8 Весенняя виремия карпов/ T Д Пичугина, M H Борисова, Л A Завьялова, И С Щелкунов, Т И Щелкунова II Ветеринария - 2004 - № 5 - С 28-30
9 Щелкунова, Т И Температурно-ростовые характеристики постоянны клеточных линий, полученных из тканей сибирского осетра/ Т И Щелкунова, Ю П Колбасова, И С Щелкунов//Цитология -2006 -Т 48, №9 - С 814
10 Щелкунова, ТИ Чувствительность к вирусам рыб постоянных клеточны линий, полученных из тканей сибирского осетра/ Т И Щелкунова, Ю П Колбасова И С Щелкунов//Цитология -2006 - Т 48, №9 - С 814-815
11 Герпесвирусная болезнь у осетровых рыб в России/ И С Щелкунов, Т И Щелкунова, А И Щелкунов, Ю П Колбасова, Л В Диденко, А Ф Быковский / Российский вет журнал Сельскохозяйственные животные -2007 - №1 -С 10-12
12 Герпесвирусное заболевание молоди сибирского осетра/ И С Щелкунов Т И Щелкунова, А И Щелкунов, Ю П Колбасова, Л В Диденко, А Ф Быковский / Тепловодная аквакультура и биологическая продуктивность водоемов аридног климата Материалы и докл Междунар симпоз - Астрахань АГТУ, 2007 - С 522-525
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Щелкунова, Татьяна Ивановна
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
1. ВВЕДЕНИЕ.
1.1. Актуальность темы.
1.2. Цель и задачи исследования.
1.3. Научная новизна.
1.4. Практическая значимость.
1.5. Основные положения, выносимые на защиту.
1.6. Апробация результатов.
1.7. Публикация результатов.
1.8. Личный вклад.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
2.1. История вопроса.
2.2. Перевиваемые клеточные линии из тканей рыб.
2.2.1. Клеточные линии, полученные от рыб семейства карповые - СургШс1ае.
2.2.2. Клеточные линии, полученные от рыб семейства осетровые - АЫретег'к1ае.
2.2.3. Получение перевиваемых клеточных линий рыб.
2.2.4. Условия культивирования клеточных линий.
2.2.5. Характеристика клеточных линий.
2.2.6. Контаминация и деконтаминация культур клеток.
2.2.7. Криоконсервация культур клеток.
2.2.8. Применение культур клеток.
2.3. Вирусы и вирусные заболевания рыб, обнаруженные в России и на прилегающих к ней территориях.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Перевиваемые линии клеток карпа (Cyprinus carpio) и сибирского осетра (Acipenser baeri), их использование в ихтиовирусологии"
Метод культуры клеток - основополагающий метод, появление которого в свое время привело к бурному развитию вирусологии, - и сегодня остается одним из главных её инструментов. Потенциально бессмертные перевиваемые клеточные линии являются незаменимой экспериментальной моделью и нашли чрезвычайно широкое применение при проведении вирусологических исследований болезней рыб и в биотехнологии при производстве противовирусных вакцин.
В 1957 г. в США на первичной культуре клеток из плавников радужной форели от рыб был выделен первый вирус — возбудитель инфекционного некроза поджелудочной железы [299], а вскоре там же была получена первая постоянная клеточная линия рыб из гонад радужной форели - ЫТО-2 [300]. Несколько лет спустя были получены новые перевиваемые клеточные линии рыб - ОР-1 из плавников синеполосой ронки, НаетиЬп бсЫгиб [87], БИМ из хвостового стебля черного толстоголова, РШеркаЫБрготе1аз [128], 8ТЕ-137 из эмбриона стальноголового лосося, Опсогкупскт туИяя [120], ВР-2 из хвостового стебля синежаберного солнечника, Ьерот18 тасгосЫгт [301] и другие.
Общее количество клеточных линий рыб с тех пор стало нарастать лавинообразно, и сегодня их насчитывается более 430. Этот процесс отражает общее развитие ихтиовирусологии. Благодаря большому разнообразию появившихся клеточных линий рыб и их применению в вирусологической работе было обнаружено около половины из открытых на сегодня почти 400 <■ ихтиовирусов. Новые клеточные линии позволяют обнаруживать и новые вирусы. Так после получения трех клеточных линий карпа - из мозга (ССВ), жабр (ССв) и плавников (СаР2) - от больных рыб удалось выделить сразу пять разных вирусов [216, 217].
В нашей стране метод культуры клеток рыб применили впервые 45 лет назад в ГосНИОРХе [35]. Позднее исследования по получению культур клеток рыб были развернуты в УкрНИИРХе [21], в ВИЭВе [29, 31], в БелНИИРХе [14], в БелНИВИ [4] и других институтах страны. Однако, несмотря на серьезные усилия, получить перевиваемые культуры клеток не удавалось.
За последнюю четверть века большой скачок в своем развитии претерпела мировая аквакультура - целенаправленное культивирование рыб и других гидробионтов для потребления человеком или восстановления их природных запасов. Однако развитие аквакультуры осложняется распространением имеющихся и появлением новых вирусных болезней рыб [227]. Для их своевременного выявления ихтиовирусологам необходимо иметь в своем арсенале набор клеточных линий, чувствительных к широкому спектру вирусов. Этого требует и значительно обострившаяся в последние годы в стране эпизоотическая ситуация по особо опасным вирусным болезням культивируемых рыб [39].
Так, начиная с 2000 г., на рыбоводных предприятиях страны были зарегистрированы две экзотические вирусные инфекции - инфекционный некроз гемопоэтической ткани лососевых рыб (IHN) и инфекционный некроз поджелудочной железы (IPN). В 2003-2006 г.г., после многолетнего перерыва, были выявлены новые случаи весенней виремии карпа (SVC), а в 2006 г. в стране была диагностирована первая вирусная болезнь у культивируемых осетровых рыб. Серьезную угрозу рыбоводству представляют и граничащие с Россией скандинавские страны, государства континентальной Европы и юго-восточной Азии, где зарегистрированы опасные болезни, не установленные в нашей стране. Ускоренное развитие аквакультуры и активизация международной торговли живыми объектами разведения несут угрозу дальнейшего распространения заразных болезней рыб. Поэтому для ихтиовирусологии исследования по получению перевиваемых клеточных линий рыб, являющихся ключевым инструментом при разработке методов диагностики и профилактики вирусных заболеваний, по-прежнему высоко актуальны.
Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Щелкунова, Татьяна Ивановна
5. ВЫВОДЫ
1. При создании оптимальных условий культивирования, регулярной смене питательной среды и отборе наиболее жизнеспособных культур получены длительно переживающие (до 4-5 месяцев) первичные культуры клеток овариальной ткани неполовозрелого карпа, паренхиматозных органов и плавников сибирского осетра, пригодные для последующего субкультивирования.
2. Впервые получены и охарактеризованы по стандартному набору > признаков перевиваемые линии клеток пула паренхиматозных органов и плавников сибирского осетра (SSO-1, SSO-2, SSF-1 и SSF-2) и линия клеток яичников неполовозрелого карпа (ICO). Предложена схема действий по получению монослойных перевиваемых клеточных линий рыб.
3. Показано, что селекция активно пролиферирующих клеток, способных дать начало перевиваемым линиям, может быть осуществлена одним из двух путей: 1) естественным отбором клеток в ходе продолжительного пассирования in vitro (SSF-1); 2) искусственным отбором с помощью метода дифференцированной дезагрегации клеточного монослоя (ICO, SSO-1, SSO-2 и , SSF-2).
4. Оптимальная посевная плотность клеток, обеспечивающая высокий индекс пролиферации, значительный урожай клеток и продолжительную сохранность их в культуре, составляет: ICO - 3x105 кл./см2, SSO-1 - (9-12) х104 кл./см2, SSO-2 - ЗхЮ4 кл./см2, SSF-1 - (8-10) хЮ4 кл./см2, SSF-2 - (13-15) хЮ4 кл./см2. Увеличение или уменьшение плотности посева клеток в два и более раз по сравнению с оптимальной приводит к уменьшению индекса пролиферации, ранней дегенерации культуры, разреженности монослоя или неспособности клеток к его образованию. ,
5. Использование сред разного состава привело к получению из одних и тех же образцов донорской ткани перевиваемых клеточных линий, различающихся по свойствам. Оптимальной питательной средой для культивирования перевиваемых линий клеток являются среды, на которых они были получены (Игла 2МЕМ для ICO, SSO-1 и SSF-1; среда 199 для SSO-2 и SSF-2). Клеточные линии, растущие в малокомпонентной среде Игла 2МЕМ, толерантны к изменению состава среды, тогда как перевод линий клеток, растущих в многокомпонентной среде 199, на другие питательные среды негативно отражается на их пролиферативной активности.
6. Установлено, что на начальной стадии роста после очередного субкультивирования перевиваемых клеточных линий ICO и SSO-2 добавление в ростовую среду 10-20% сыворотки плода коровы оказывает защитное действие на клетки, способствуя быстрому началу их активной пролиферации. В то же время, на завершающей стадии пролиферации 20%-ное содержание сыворотки ингибирует рост клеток. Оптимальное содержание сыворотки в средах для роста обеих линий клеток составляет 10%.
7. Оптимальными температурами культивирования полученных перевиваемых линий клеток являются температуры, близкие к температурным оптимумам рыб-доноров ткани: ICO - 25°С; SSO-1, SSF-1 и SSF-2 - 20°С; SSO-2 - 20-25°С. Повышение температуры выше оптимальной на 5°С стимулирует бурный рост культур, быстро сменяющийся их дегенерацией. Понижение температуры до 10-15°С позволяет длительно сохранять клеточные линии в условиях лаборатории в жизнеспособном состоянии.
8. В результате кариотипирования установлено, что модальное число хромосом клеток линии ICO за более чем 600 пассажей изменилось со 100 (диплоидный набор) до 90 (гиподиплоидный набор). Модальный класс клеток линии SSO-2 составляет 364 хромосомы (гипотриплоидный набор). Выявлен широкий диапазон варьирования числа хромосом в клетках обеих линий: ICO -от 71 до 178, SSO-2 - от 186 до 371.
9. Все пять полученных линий клеток рыб (ICO, SSO-1, SSO-2, SSF-1 и SSF-2) чувствительны к широкому спектру вирусов рыб разных таксономических групп (семейств карповых, лососевых, угревых, щуковых и осетровых). Использование полученных линий клеток сибирского осетра позволило диагностировать первую вирусную болезнь осетровых рыб в России.
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
Полученные перевиваемые линии клеток карпа и сибирского осетра используются в практической работе для диагностики вирусных болезней культивируемых рыб из семейств карповых, лососевых, угревых, щуковых и ! осетровых и в экспериментальных вирусологических работах.
Разработаны и предложены "Методические указания по идентификации вирусов и лабораторной диагностике вирусных болезней рыб", утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 10.10.1997 г. с использованием перевиваемой линии клеток ICO (приложение 8).
Результаты работ положены в основу главы "Методы изучения вирусных болезней рыб" учебного пособия для студентов ВУЗов "Лабораторный практикум по болезням рыб" (под ред. В.А. Мусселиус, 1983), которое используется в учебной практике. ¡
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Щелкунова, Татьяна Ивановна, Покров
1. Архангельский, Д.С. Получение первичных культур клеток из гонад судака для вирусологических исследований/ Д.С. Архангельский, О.В. Полякова// Биол. основы рыбных хозяйств, водоемов Средней Азии, Казахстана. Фрунзе, 1978. - С. 244-245.
2. Васильев, В.П. Эволюционная кариология рыб / В.П. Васильев. М.: Наука, 1985.-300 с.
3. Бахтин, Ю.Б. Генетика соматических клеток / Ю.Б. Бахтин. Л.: Наука, 1974.-256 с.
4. Головнев, Л.Н. О выделении возбудителя жаберного некроза карпа и его свойства/ Л.Н. Головнев, Р.З. Екельчик // Сб. науч. трудов. — Л.: Наука, 1988.-С. 29-44.
5. Голубев, Д.Б. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии/ Д.Б. Голубев, A.A. Соминина, М.Н. Медведева. Л.: Медицина, 1976.-224 с.
6. Гончаров, Г.Д. Однослойная клеточная культура почечной ткани леща/ Г.Д. Гончаров, Л.А. Зубкова, М.И. Степанова// Биология внутренних водоемов: Информ. бюл. 1970. - Т. 6. - С. 60-64.
7. Животная клетка в культуре (Методы и применение в биологии) под ред. Л.Д. Дьяконова и В.И. Ситькова М.: Компания Спутник, 2000. - С. 148158.
8. Зубкова, Л.А. Однослойная клеточная культура из гонад самок сома/ Л.А. Зубкова// Биол. внутренних водоемов: Информ. бюл. 1971. - Т. 11. - С. 63-65.
9. Иммунология: в 3-х т. /пер. с англ.; под ред. У. Пола. М.: Мир, 1987. -1988.-476 с.
10. Культура животных клеток. Методы/ Д. Конки и др. под ред. Р.И. Фрешни, перевод с англ.; под ред. М.А. Панова. М.: Мир, 1989. - 333с.
11. Лабораторный практикум по болезням рыб/ под ред. В.А. Мусселиус. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1983. - 296с.
12. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин — М.: Высшая школа. — 1990.352 с.I
13. Мамыш, Т.И. Жаберная болезнь рыб в Белоруссии (Распространение, | этиология, диагностика): автореф. дис. канд. биол. наук/ Т.И. Мамыш. -Минск, 1975. 19 с.
14. Методические указания по идентификации и лабораторной диагностике вирусных болезней рыб. Вирусные болезни. Сб. инструкций по борьбе с болезнями рыб. М.: Отдел маркетинга АМБ-агро, 1998. - 4.1. - С. 60113.
15. Методы культивирования клеток: сб. науч. трудов/ под ред. Г.П. Пинаева Л.: Наука, 1988. - 320с.
16. Михайлова, Г.Р. Методические рекомендации по способу выявления J микоплазм в культурах перевиваемых клеток/ Г.Р. Михайлова, A.C. Новохатский, М.А. Родова. М., 1983. - 8 с.
17. Наставление по применению тест-системы «МИК-КОМ» для диагностики микоплазмоза методом полимеразной цепной реакции: утверждена Деп. ветеринарии Минсельхозпрод России 17 августа 1998 г. 11с.
18. Никольский, В.В. О методе культивирования почечных клеток карпа in vitro/ B.B. Никольский, Е.Ф. Осадчая// Материалы всесоюзной конф. По вопросам ветеринарной вирусологии. М., 1964. - С. 66-67.
19. Никольский, H.H. Биология клетки в культуре / H.H. Никольский, | Ю.Б. Бахтин, Т.Н. Игнатова; под ред. A.C. Трошина. Л.: Наука, 1984. - 280 с.
20. Осадчая, Е.Ф. Выделение цитопатогенных агентов от карпов при острой форме краснухи/ Е.Ф. Осадчая // Ветеринария. 1964. - № 9. - С. 29.
21. Осадчая, Е.Ф. Методика культивирования однослойных клеточных культур из недозрелых гонад самок карпа/ Е.Ф. Осадчая // Рыбное хозяйство. ,I1969.-Вып. 9.-С. 88-92. !
22. Осадчая, Е.Ф. О применении полусинтетической питательной среды для культивирования почечных клеток рыб in vitro / Е.Ф. Осадчая // Рыбное хозяйство. 1969. - вып. 7. — С. 22-26.
23. Осадчая, Е.Ф. Рабдовирусы, выделенные от больных краснухой карпов, и некоторые их свойства/ Е.Ф. Осадчая // Рыбное хозяйство. 1977. - № 5.-С. 36-39.
24. Попкова, Т.И. Выделение вируса от карпов, больных жаберным некрозом/ Т.И. Попкова, И.С. Щелкунов// Рыбное хоз-во. 1978. - №4. - С.4-38. ,
25. Практическая вирусология: перевод с нем.; под ред. В.Н. Сюрина. ^ М.: Колос, 1970.-352 с.
26. Пятиязычный словарь названий животных. Рыбы. Латинский-русский-английский-немецкий-французский/ Ю.С. Решетников и др.. М.: Русский язык, 1989.-734 с.
27. Рабкин, Е.М. Приготовление однослойной культуры тканей из гонад карася и карпа/ Е.М. Рабкин, P.A. Куденцова // Ветеринария. 1969. - № 12. -С. 91-92.
28. Рудиков, Н.И. Применение культур тканей рыб в изучении воспаленияIплавательного пузыря/ Н.И. Рудиков// Актуальные вопросы ветеринарной ! вирусологии. М., 1965. - 4.1. - С. 20-22.
29. Рудиков, Н.И. О клеточных культурах из эмбрионов и личинок пресноводных рыб/ Н.И. Рудиков// Тезисы докл. научно-методического производственного совещания по болезням рыб, 11-15 апреля 1967. М., 1967. -С. 30-31.
30. Рудиков, Н.И. О клеточных культурах из эмбрионов и личинок пресноводных рыб/ Н.И. Рудиков// Рыбоводство и болезни рыб. М., 1969. - С. 221-224.
31. Рудиков, Н.И. Весенняя вирусная болезнь рыб (ВВБ) / Н.И. Рудиков, j Л.И. Грищенко, К.А. Лобунцов // Бюл. ВИЭВ. 1975. - Т. 20. - С. 16-19
32. Рудакова, С.Л. Состояние здоровья популяций лососей на Камчатке и воздействие на них вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани: автореф. дис. . канд. биол. наук./ С.Л. Рудакова. -Петрозаводск, 2004.-24 с.
33. Тец, В.И. Получение культуры тканей карпа и ее применение при изучении этиологии краснухи рыб/ В.И. Тец, Г.С. Яковлева// Научно-технический бюллютень ГОСНИОРХ. 1962. - Т. 15. - С. 73-77.
34. Щелкунов, И.С. О выделении вируса от белого толстолобика ссиндромом краснухи / И.С. Щелкунов и др. // Экспресс-информ. ,
35. ЦНИИТЭИРХ, 1984. Вып. 4. - С. 3-7. !
36. Щелкунов, И.С. Rhabdovirus anguilla у угря в СССР и его патогенность для рыб/ И.С. Щелкунов и др. //Вопросы вирусологии. 1989. -№1.- С. 81-84.
37. Щелкунов, И.С. Вирусные инфекции у осетровых рыб/ И.С. Щелкунов // Рыбное хозяйство. Аналитическая реферативная информация. Серия: Болезни гидробионтов в аквакультуре. — М.: ВВНИЭРХ, 2000. Вып. 1. -С. 3-16.
38. Щелкунов, И.С. Эпизоотическая ситуация по вирусным болезням , культивируемых рыб/ И.С. Щелкунов // Ветеринария. 2006. - № 4. - С. 22-25.
39. Щелкунов, И.С. Герпесвирусная болезнь у осетровых рыб в России/ И.С. Щелкунов и др.// Российский ветеринарный журнал (Сельскохозяйственные животные). 2007. - № 1. - С. 10-12.
40. Щелкунова, Т.И. Rhabdovirus carpió у растительноядных рыб (выделение, идентификация, патогенность)/ Т.И. Щелкунова, И.С. Щелкунов //Сб. науч. трудов ВНИИПРХ М.: 1987. - Вып. 50. - С. 3-11.
41. Щелкунова, Т.И. Клеточные линии из тканей сибирского осетра/ Т.И. Щелкунова и др. //Первый конгресс ихтиологов России: тез. докл. -Астрахань, 1997. С. 302-303.
42. Щербина, М.А. Кормление рыб в пресноводной аквакультуре / М.А. Щербина, Е.А. Гамыгин М.: ВНИРО, 2006. - 360 с.
43. Хлопин, Н.Г. О культивировании in vitro соединительнотканных элементов у рыб/ Н.Г. Хлопин // Известия Биол. НИИ Биол. Станции Пермском
44. Гос. Университете. 1925. - Т. IV, вып. 2. - С. 20-23. j
45. Ahne, W. A rhabdovirus isolated from grass carp (Ctenopharyngodon idella Val.)l W. Ahne // Arch. Virology. 1975. - Vol. 48. - P. 181-185.
46. Ahne, W. Persistent infection in CHSE-214 cells with IPN virus isolated from pike (Esox lucius)/ W. Ahne //Bull. Off. Int. Epizoot. 1977. - Vol. 87. - P. 415-416.
47. Ahne, W. Untersuchungen zur Virusempfanglichkeit von Fishzellkulturen/ W. Ahne, A. Weiler // Deutsche Tierarztliche Wochenschrift. 1978. - В. 87. - S. 56-59.
48. Ahne, W. Fish cell culture: a fibroblast line (PG) from ovaries of juvenile | pike (Esox lucius)/ W. Ahne // In Vitro. 1979. - Vol. 15. - P. 839-840.
49. Ahne, W. Studies on the use of fish tissue cultures for toxicity tests in order to reduce and replace the fish tests/ W. Ahne// Zbl. Bakt. Hyg., Abt. Orig. B. 1985. -Vol. 180.-P. 480-504.
50. Ahne, W. A new virus isolated from cultured grass carp Ctenopharyngodon idella / W. Ahne, Y. Jiang, J. Thomson// Dis. Aquat. Org. 1987. - Vol. 3. - P. 181185.
51. Andral, R. Establishment and characterization of rainbow trout kidney cellline, RTK Montpellier/ R. Andral et al. // Pathology in marine science; eds.: Perkins j F.O., Cheng C.C. San Diego: Academic Press, 1990. - P. 33-42.
52. Babini, A. Coltivazione in vitro in monostratodi tessuti di pesci (Monolayer fish cell cultures in vitro)/ A. Babini, P. Ghittino // Atti. Soc. Ital. Sei. Vet. 1961. -Vol. 15.-P. 456-462.
53. Bejar, J. A continuous cell line from the cultured marine fish gilt-head seabream {Sparus aurata L.)/ J. Bejar, J.J. Borrego, M.C. Alvarez// Aquacultrure. -1997.-Vol. 150.-P. 143-153.
54. Bejar, J. An ES-like cell line from the marine fish Sparus aurata: characterization and chimaera production/ J. Bejar, Y. Hong, M.C. // Alvarez Transgenic Res. 2002. - Vol. 11, N3. - P. 279-289.
55. Blohm, U. Rainbow trout {Oncorhyncus mykiss) slgM-leukocytes secrete an interleukin-2 like growth factor after mitogenic stimulation in vitro/ U. Blohm, E. Siegl, B. Kollner// Fish Shellfish Immunol. 2003. - Vol. 14, Iss. 5. - P. 449-465.
56. Bols, N.C. Development of a cell line from primary cultures of rainbow trout, Onkorhynchus mykiss, gills/ N.C. Bols et al. // J. Fish Dis. 1994. - Vol. 17. -P. 601-611.
57. Bols, N.C. Development of a rainbow trout pituitary cell line that expresses growth hormone, prolactin and somatolactin/ N.C. Bols et al. // Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1995. -N. 4. - P. 154-163.
58. Borenfreund, E. Effect of methylazoxymethanol acetate on bluegill sunfish cell cultures in vitro/ E. Borenfreund, H. Babich, N. Matrin-Alguacil // Ecotoxicol. Environ Saf. 1989. - Vol. 17. - P. 297-307.
59. Bovo, G. Characterization of a rhabdovirus isolated from carpione Salmo trutta carpio in Italy/ G. Bovo et al. // Dis. Aquat. Org. 1995. - Vol. 21, N. 2. - P. 115-122.
60. Bowden, R.A. Lymphocystis in red drum/ R.A. Bowden et al. // J. Aquat. Anim. Health. 1995, N. 7. - P. 231-235.
61. Bowser, P.R. Fish cell lines: establishment of a line from ovaries of channel catfish/ P.R. Bowser, J.A. Plumb// In Vitro 1980. - Vol. 16. - P. 365-368.
62. Bylund, G. Aspects on fish disease problems in Scandinavian countries/ G. Bylund // Parasit. Dis. Natural waters aqualture Nordic Countries. 1987. - P. 102111.
63. Buonocore, F. Production and characterization of a continuous embryonic ; cell line from sea bass {Dicentrarchus labrax L.)l F. Buonocore et al. // Marine biotechnology. 2006. - Vol. 8. - P. 80-85.
64. Castric, J. A viral disease of hatchery- reared turbot Scophthalmus maximus L/J. Castric, F. Baudin-Laurencin, M.F. Coustans //2nd Intern. Colloq. Pathol. Marine Aquae. 7-11 Sept. 1986 Porto (Portugal), 1986. - P. 27.
65. Chang, S.F. Development of a tropical marine fish cell line from Asian sea bass (Lates calcarifer) for virus isolation/ S.F. Chang et al. // Aquaculture. 2001. -Vol. 192.-P. 133-145.
66. Chen, M. The establishment of a heteroploid line from crucian carp and its biological characteristics/ M. Chen, H. Chen, Y. Yi // J. Fish. China. 1985. - N. 9. -P. 121-130.
67. Chen, S.L. Derivation of a pluripotent embryonic cell line from red sea bream blastulas/ S.L. Chen et al. // J. Fish Biol. 2002. - Vol. 63, Iss. 3. - P. 795- ; 805. '
68. Chen, S.L. Establishment of a pluripotent embryonic cell line from sea perch (Lateolabrax japonicus) embryos/ S.L. Chen, Z.X. Sha, H.Q. Ye// Aquaculture -2003. Vol. 218.-P. 141-151.
69. Chen, S.L. Establishment of a continuous embryonic cell line from Japanese flounder Paralichthys olivaceus for virus isolation/ S.L. Chen et al. Il Dis. Aquat. Org. 2004. - Vol. 60. - P. 241-246.
70. Chen, S.L. Development and characterization of a continuous embryonic cell line from turbot {Scophthalmus maximus)/ S.L. Chen et al. // Aquaculture -2005. Vol. 249, Iss. 1-4. - P. 63-68.
71. Chen, S.N. A cell line derived from Japanese eel {Anguilla japonica) ovary/
72. N. Chen, G.H. Kou//Fish Pathol.-1981.-Vol. 16.-P. 129-137.
73. Chen, S.N. A cell line derived from Japanese eel {Anguilla japonica) kidney/ S.N. Chen, Y. Ueno, G.H. Kou // Proc. Nutl. Sci. Counc. R.O.C. 1982. - N.6. P. 93-100.
74. Chen, S.N. Establishment of a cell line from kidney of tilapia/ S.N. Chen et al. // Bull. EAFP. 1983. - N. 3. - P. 1-4.
75. Chen, S.N. A cell line derived from tilapia ovary/ S.N. Chen, Y. Ueno, G.H. Kou//Fish Pathol.-1984.-Vol. 18.-P. 13-18.
76. Cheng, L. Development of cell cultures derived from lake trout liver and kidney in a hormone-supplemented, serum-reduced medium/ L. Cheng, P.R. Bowser, J.M. Spitsbergen//J. Aquat. Anim. Health. 1993. - N. 5. - P. 119-126.
77. Cheng, Y.H. Molecular cloning and characterization of a fish PKR-like gene from cultured CAB cells induced by UV-inactivated virus/ Y.H. Cheng et al. // Fish Shellfish Immunol. 2004. - Vol. 17, Iss. 4. - P. 353-366.
78. Chew-Lim. Grouper cell line for propagating grouper viruses/ Chew-Lim et al. // Sing. J. Pri. Ind. 1994. - Vol. 22. - P. 113-116.
79. Chi, S.C. The effect of temperature on nervous necrosis virus infection in a grouper cell line and in grouper larvae/ S.C. Chi, S.C. Lin, W.W. Hu // Book Abst. 4 Intern. Symp. Viruses Lower Vertebr., Weymouth U.K., 12-15 May. 1998. - PP-07.
80. Chi, S.C. Interference of the life cycle of fish nodavirus with fish retrovirus/ S.C. Chi et al. // 4th Intern. Sym. Aquat. Animal Health., 1-5 Sept. -2002, New Orleans; Louisiana USA. 2002. - P. 200.
81. Chlopin, N.G. Studien über Gewebeskuturen im artfremden Blutplasma. I. ' Allgemeints. II. Das Bindegewebe der Wirbeltiere/ N.G. Chlopin // Z. Mikroskop.-Anat. Forsch. 1925. - N. 2. - S. 324-365.
82. Chlopin, N.G. Gewebskultur niederer Vertebraten/ N.G. Chlopin // Arch. Exptl. Zellforsch. Gewebezucht. 1928. -B. 6. - S. 97-102.
83. Clem, L.W. Studies with cells from marine fish in tissue culture/ L.W. Clem, L. Moewus, M.M. Sigel // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1961. - Vol.108. - P. 762-766.
84. Clem, L.W. An orphan virus isolated in marine fish cell tissue culture/ , L.W. Clem, M.M. Sigel, R.R. Friis // Ann. N.Y. Acad. Sei. 1965. - Vol. 126. - P. ! 343-361.
85. Collodi, P. Culture of cells from zebrafish (Brachydanio rerio) embryo and adult tissues/ P. Collodi et al. // Cell Biol. Tox. 1992. - Vol. 8. - P. 43-61.
86. Comuzzi, M. Establishment of a fish cell line from gilt-head sea bream (Sparus aurata)/ M. Comuzzi, G. Bovo // Abstr. Book. VI Int. Conf. EAFP, Brest; France, 1993.-P. 130.
87. Dannevig, B.H. Isolation of the causal virus of infectious salmon anaemia (ISA) in a long-term cell line from Atlantic salmon head kidney/ B.H. Dannevig, K. Falk, E. Namork//J. Gen. Virol. 1995. - Vol. 76. - P. 1353-1359.
88. Dawe, CJ. Chondrosarcoma of a corn snake (Elaphe guttata) and nephroblastoma of a raibow trout (Salmo gairdneri) in cell culture/ C.J. Dawe et al.
89. I Comp. Path. Zoo Anim.; Eds.: R. Montali, G. Migaki. 1979. - C. 151-156. '
90. Dederer, P.H. The behavior of cells in tissue of Fundulus heteroclitus with special reference to the ectoderm/ P.H. Dederer// Biol. Bull. 1921. Vol. 41. - P. 221-240.
91. Deng, C.X. Studies of cloning techniques in fish cells/ C.X. Deng, X.Q. Yang, H.Z. Chen // Acta Hydrobiolog. Sinica. 1985. - Vol. 9. - P. 194.
92. Deng, C.X. Susceptibility to grass carp reovirus (GCRV) of several fish cell lines/ C.X. Deng, X.Q. Yang, H.Z. Chen // Acta Hydrobiolog. Sinica. 1985. -Vol. 9(4).-P. 351-358.
93. Devoid, M. Use of RT-PCR for diagnosis of infectious salmon anaemia ! virus (ISAV) in carrier sea trout Salmon trutta after experimental infection/ M. Devoid et al. // Dis. Aquat. Organ. 2000. - Vol. 40. - P. 9-18.
94. Dewitte-Orr, S.J. Expression of antiviral genes in different rainbow trout cell lines. SICB/ S.J. Dewitte-Orr, N.C. Bols // 2002 meeting. Abstr. Details. University Waterloo Waterloo, Ontario; University Waterloo, Waterloo, Ontario, 2002.-P. 40.
95. Diago, M.L. Establishment and characterization of a pronephric stromal cell line (TPS) from rainbow trout, Oncorhynchus mykiss W/ M.L. Diago et al. // Fish Shellfish Immun. 1995. - Vol. 5. - P. 441-457. ;
96. Driever, W. Characterization of a cell line derived from zebrafish {Brachydanio rerio) embryos/ W. Driever, Rangini Z. // In Vitro Cell Dev. Biol. -1993. Vol. 29A. - P. 749-754.
97. Ebitani, N. An established marine fish cell line with high plating efficiency/N. Ebitani, Kubo T. // Zool. Sci. 1988 - Vol. 5. - P. 183-186.
98. Ellender, R.D. An established spleen cell line from Bairdiella chrysural R.D. Ellender, J.H. Wharton, B.L. Middlebooks // In Vitro. 1979. - Vol. 15. - P. 112-113.
99. Estepa, A. Morphology of antigen dependent haematopoietic cells from trout surving rhabdoviral infections/ A. Estepa et al. // Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. -1996. Vol. 16 (6). - P. 203-207.
100. Etoh, H. /H. Etoh et al. // Natl. Cancer Inst. 1983. - Vol. 70. - P. 523528.
101. Etoh, H. Establishment and characterization of various cell lines from 1 medaka (Teleostei)/ H. Etoh et al. // Invertebrate and Fish Tissue Culture Eds.: Y.Kuroda, E. Kurstak, K. Maramorosch Tokyo: Japan Sci. Soc. Press, 1988. - P. 166-269.
102. Faisal, M. A cell line (CLC) of adherent peripheral blood mononuclear leucocytes of normal common carp Cyprinus carpiol M. Faisal, W. Ahne // Dev. Comp. Immunol. 1990. - Vol. 14. - P. 255-260.
103. Faisal, M. Fish cell lines of leukocytic origin: maintenance and characterization/ M. Faisal, S. Sami, B.J. Ruban // Techniq. Fish Immunol. FITC 2 Eds.: J.S. Stolen, T.C. Fletcher, D.P. Anderson, S.L. Kaattari, A.F. Rowley 1992. - 1 P. 35-59.
104. Faisal, M. Development of continuous liver cell cultures from the marine teleost, spot (Leiostomus xanthurus, Pisces: Sciaenidae)/ M. Faisal, B.J. Rutan, S. Sami-Demmerle //Aquaculture. 1995. - Vol. 132. - P. 59-72.
105. Fernandez, R.D. Comparative growth response of fish cell lines in different media, temperatures, and sodium chloride concentrations/ R.D. Fernandez et al. // Fish Pathol. 1993. - Vol. 28. - P. 27-34.
106. Fernandez, R.D. Establishment and characterization of seven continuous cell lines from freshwater fish/ R.D. Fernandez et al. // J. Aquat. Anim. Health. | 1993.-N. 5.-P. 137-147.
107. Fernandez, R.D. Characterization of three continuous cell lines from marine fish/ R.D. Fernandez et al. // J. Aquat. Animal Health. 1993. - N. 5. - P. 127-136.
108. Fernandez-Puentes, C. Characterization of a cell line derived from turbot (iScophthalmus maximus L.) TV-l/C. Fernandez-Puentes, B. Novoa, A. Figueras // Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol. 1993. - N. 13. - P. 94-96.
109. Fernandez-Puentes, C. Epithelial cell line (TBE-1) derived from turbot (jScophthalmus maximus L.)/ C. Fernandez-Puentes, A. Figueras // Dis. Fish and Shellfish: 7th Intern. Conf. EAFP, Palma de Mallorca 10-15 Sept. 1995. - P. 48.
110. Fijan, N. Some properties of the Epithelioma papulosum cyprini (EPC) cell line from carp Cyprinus carpió/ N. Fijan et al. // Ann. Virol. (Inst. Pasteur). | 1983. - Vol. 134 E. - P. 207-220. '
111. Fletcher, T.C. Defense mechanisms in fish/ T.C Fletcher // Biochemical and Biophysical Perspectives in Marine Biology Eds. Malins D.C., Sargent J.R. -London; New York: Academic Press, 1978. Vol. 4. - P. 189-222.
112. Follett, J.E. Characterization of a cell line derived from Inconnu/J.E. Follett, M.K. Schmitt // J. Aquatic Animal Health. 1990. - N. 2. - P. 61-67.
113. Fontana, F. Cytogenetic Characterization of cell lines from three sturgeon species/ F. Fontana et al. // Caryologia. 1997. - Vol. 50, N. 1. - P. 91-95.
114. Frerichs, G.N. Ulcerative disease rhabdovirus: cell-line susceptibility and |iserological comparison with other fish rhabdoviruses/ G.N. Frerichs, B.J. Hill, K. Way//J. Fish Dis. 1989. - Vol. 12, N. 1.-P. 51-56.
115. Frerichs, G.N. Spontaneously productive C-tipe retrovirus infection of fish cell lines/ G.N. Frerichs et al. // J. Gen. Virol. 1991. - Vol. 72. - P. 25372539.
116. Fryer, J.L. Methods for the in vitro cultivation of cells from the tissues of salmonid fishes/ J.L. Fryer // Doctoral dissertation, Oregon State University. 1964. - 195p.
117. Fryer, J.L. The in vitro cultivation of tissue and cells of Pacific salmon ¡ and steelhead trout/ J.L. Fryer, A. Yusha, K.S. Pilcher // Ann. N.Y. Acad. Sci. ' 1965. - Vol. 126 (Art. 1).-P. 566-586.I
118. Fryer, J.L. Three decades of fish cell culture: a current listing of cell lines j derived from fishes/ J.L. Fryer, C.N. Lannan // J. Tissue Cult. Method. 1994. -Vol.16.-P. 87-94.
119. Ganassin, R.C. Development of a monocyte/macrophage-like cell line, RTS11, from rainbow trout spleen/ R.C. Ganassin, N.C. Bols // Fish Shellfish Immunol. 1998. - Vol. 8. - P. 457-476.
120. Ghoush, C. Derivation and characterization of a zebrafish liver cell line/ C. Ghoush, Y.L. Zou, P. Collodi // Cell. Biol. Tox. 1994. - Vol. 10, Iss. 3. - P. 167-176.
121. Gold, J.R. Cytogenetics/ J.R Gold // Fish Physiology. 1979. - Vol. VIII. -P. 353-405.j
122. Grand, C.G. Tissue culture studies of pigmented melanomas: fish, mouse and human/ C.G. Grand, Cameron G. // N.Y. Acad. Sei. Spec. Publ. 1948. - Vol. 4. -P. 171-176.
123. Gravell, M. A permanent cell line from the fathead minnow (Pimephales promelas)/ M. Gravell, Malsberger R.C. // Ann. N.Y. Acad. Sei. 1965. - Vol. 126. -P. 555-565.
124. Grützner, L. Versuche zur Züchtung des gewebes von Macropodus opercularis (Linne) und Lebistes reticulates (Peters) in vitro/ L. Grützner // Zentr. Bakteriol., Parasitenk., Abt. I. Orig. 1956. -B. 165. - S. 8-24.
125. Grützner, L. Überprüfung einiger Amwendungsmöglichkeiten der Gewebekultur von Lebistes reticulates (Peters) und Macropodus opercularis (Linne)in der Virusforschung/ L. Grützner // Zentr. Bakteriol., Parasitenk., Abt. I. Orig. -1956.-B. 165 S. 81-96.
126. Grützner, L. In vitro — Züchtung des Leber und Nierengewebes von Tineaivulgaris Cuv. (Schleic) in trypsinierten Einschichtgewebekulturen/ L. Grützner // | Zentr. Bacterid., Parasitenk. Abt. I. Orig. 1958. - B. 173. - S. 195-202.
127. Guo, H.R. Analysis of three marine fish cell lines by rapid assay/ H.R. Guo et al. // In Vitro Cell. Develop. Biol. Animal. 2001. - Vol. 37, N. 7. - P. 430433.
128. Haenen, O.L.M. The emergence of koi herpesvirus and its significance to European aquaculture / O.L.M. Haenen et al. // Bull. Eur. Ass. Fish Path. — 2004. -Vol. 24, N. 6. P. 293-307.
129. Hansen, L.A. Ciprofloxacin treatment eliminates mycoplasma inIcontaminated channel catfish ovary cells/ L.A. Hansen, R.L. Thune // J. Aquat. | Animal Health. 1994. - N.6. - P. 82-84.
130. Hasegawa, S. Fin cell line from isogeneic ginbuna crusian carp/ S. Hasegawa et al. // In Vitro Cell. Dev. Biol. Animal. 1997. - Vol. 33. - P. 232233.
131. Hasegawa, S. A cell line (CFK) from fin of isogeneic ginbuna crusian carp/ S. Hasegawa et al. // Fish Pathology. 1997. - Vol. 32(2). - P. 127-128.
132. Hasegawa, S. Specific cell-mediated cytotoxicity against an allogeneic target cell line in isogeneic ginbuna crusian carp/ S. Hasegawa et al. // Fish Shellfish Immunol. 1998. - Vol. 8. - P. 303-313. !I
133. Hedrick, R.P. Two cell lines from white sturgeon/ R.P. Hedrick et al. // Trans. Am. Fish Soc. 1991.-Vol. 120. - P. 528-534.
134. Hedrick, R.P. A herpesvirus associated with mass mortality of juvenile and adult koi, a strain of a common carp/ R.P. Hedrick et al. // J. Aquat. Anim. Health. 2000. - Vol. 12. - P. 44-57.
135. Hegde, A. Characterization, pathogenicity and neutralization studies of a j nervous necrosis virus isolated from grouper, Epinephelus tauvina, in Singapore/ A. Hegde et al. // Aquaculture. 2002. - Vol. 213, Iss. 1-4. - P. 55-72.
136. Hightower, L.H. Recent applications of fish cell culture to biomedical research/ L.H. Hightower, J.L. Renfro // J. Exp. Zool. 1988. - Vol. 248. - P. 290302. |
137. Hino, K. TNF induces the growth of thymocytes in rainbow trout/ K. Hino ' et al. // Develop. Comp. Immunol. 2006. -Vol. 30, Iss. 7. - P. 639-647.
138. Hong, Y. Pluripotency and differentiation of embryonic stem cell lines from the medakafish (Oryzias latipes)/ Y. Hong, C. Winkler, M. Schartl // Mech. Dev. 1996. - Vol. 60. - P. 33-44.
139. Hong, Y. Establishment of a normal medakafish spermatogonial cell line capable of sperm production in vitro! Y. Hong et al. // Proceeding of the National Academy of Science. 2004. - Vol. 101, N. 21. - P. 8011-8016.
140. Horiuchi, M. A new cell line from carp sac-fry/ M. Horiuchi, M. Nakata, K. Kohga // Bull. Jpn. Soc. Sci. Fish. 1979. - Vol. 45(2). - P. 147-151. !
141. Hsu, Y.L. Characteristics of a new reo-like virus isolated from landlocked salmon {Oncorhynchus masou Brevoort)/ Y.L. Hsu, B.S. Chen, J.L. Wu // Fish Pathol. 1989. - Vol. 24, N. 1. - P. 37-45.
142. Isa, K. Transfection and stable expression of a dominant selective marker Ecogpt in a cultured cell line of the fish, Carassius auratusl K. Isa, A. Shima // J. Cell Science. 1987. - Vol. 88. - P. 219-224.
143. Isshiki, T. Incidence of yellowtail ascites virus (YAV) in wild yelloetail fingerling/ T. Isshiki, K. Kawai, R. Kusuda // Nippon Suisan Gakkaishi. 1989. -Vol. 55(4). - P. 633-637.
144. Iwamoto, R. Isolation and characterization of the Japanese flounder (Paralichthys olivaceus) lymphocystis disease virus/ R. Iwamoto et al. // J. Aqut. Anim. Health. 2002. - Vol. 14. - P. 114-123.
145. Iwamoto, T. Cloning of the fish cell line SSN-1 for piscine nodaviruses/ T. Iwamoto et al. // Dis. Aquat. Org. 2000. - Vol. 43. - P. 81-89.
146. Jensen, M.H. Preparation of fish tissue cultures for virus research/ M.H. Jensen//Bull. Off. Intern. Epizoot. 1963.-Vol. 59.-P. 131-134.
147. Jensen, N.J. A fish cell line from gonads of cod (Gadus morhua)/ N.J. Jensen, K. Christensen //Nord. Vet. Med. 1981. - Vol. 33. - P. 492-497.
148. Jiang, Y. Some properties of the etiological agent of the.hemorrhagic disease of grass carp and black carp/ Y. Jiang, Ahne W. // Viruses Lower Verteb.
149. Eds.: W. Ahne & Kurstak. Springer Verlag Berlin Heidelberg, 1989. - P. 227-240.i '
150. Jiang, Y. Isolation of a aquareovirus from common carp (Cyprinus carpio)in the P.R. China/ Y. Jiang et al. // Second Intern. Symp. Virus. Low. Verteb., Oregon State Univers. Corvallis, Oregon USA, 1991. P. 287-292.
151. Joseph, M.A. Evalution of tissues of Indian major carps for development of cell lines by explant method/ M.A.Joseph et al.//indian carp cell lines.htm. -1998.
152. Kang, M.S. Establishment and characterization of two new cell lines derived from flounder, Paralichthys olivaceus (Temminck & Schlegel)/ M.S. Kang et al. // J. Fish Dis. 2003. - Vol. 26, Iss. 11-12. - P. 657-665.
153. Kasai, H. Characterization of the cell culture replicated Japanese flounder j Lymphocystis disease virus/ H. Kasai et al. // Program and Abst. 5th Intern. Symp. Virus. Lower Vertebr., Seattle, Washington, 2002, P.46.
154. Kasai, H. Establishment of two Japanese flounder embryo cell lines/ H. Kasai, M. Yoshimizu // Bull. Fish. Sei. Hokkaido Univ. 2001. - Vol. 52. - P. 67- j 70.
155. Kelly, R.K. Some properties of an established fish cell line from Xiphophorus helleri (red swordtail)/ R.K. Kelly, Loh P.C. // In Vitro. 1973. - N. 9. - P.73-80.
156. Kelly, R.K. Fish cell culture: characteristics of a continuous fibroblastic cell line from walleye (Stizostedion vitreum vitreum)/ R.K. Kelly et al. // Can. J. Fish. Aquat. Sei.-1980.-Vol. 37. P. 1070-1075.
157. Kelly, R.K. Characterization of herpesvirusvitreum isolated from hyperplastic epidermal tissue of walleye, Stizostedion vitreum vitreum (Mitchill)/ R.K. Kelly et al. // J. Fish Dis. 1983. - Vol. 6. - P. 249-260.
158. Kirsipuu, V.L. Largemouth bass virus in New York state: an Update/V.L. Kirsipuu et al. // Programm and Abst. 30th Eastern Fish Health Workshop, Clarion Inn and Confer. Center Shepherdstown. West Virginia, 2005. P. 50.
159. Kölbl, O. Die Schwimmblasenentzundung des Karpfens: Nachweis eines j intrazytoplasmatisch wachsenden Einzellers mittels Gewebekultur/ O. Kölbl// 1 Zsterreichs Fischerei. 1989. - B. 42. - S. 54-60.
160. Komura, J. Fish cell culture: esteblishment of two fibroblast-like cell lines (OL-17 and OL-32) from fins of the medaka, Oryzias shimal J. Komura, H. Mitani, A. Shima // In Vitro Cell Dev. Biol. 1988. - Vol. 24. - P. 294-298.
161. Koski, P. A rhabdovirus isolated from brown trout {Salmo trutta m. lacustris L.) with lesions in parenchymatous organs/ P. Koski et al. // Bull. EAFP. -1992. Vol. 12, N. 5. - P. 177-180.
162. Kou, C.C. Characterization of three cell lines derived from colored carp, . Cyprinus carpio/ C.C. Kou, Chen S.N. //J. Tiss. Cult. Method. 1991. - P. 140-145. i
163. Kunst, L. Culture of kidney tissue of carp/ L. Kunst // Vet. Arhiv. 1961. -Vol. 31.-P. 241-245.
164. Kunst, L. Kultura bubreznih stanica sarana (Culture of carp kidney cells) / L. Kunst// Vet. Arhiv. 1962. - Vol. 32. - P.121-126.
165. Kunst, L. Preparation of primary monolayer cell cultures of carp ovary/ L. Kunst, N. Fijan// Vet. Archiv. 1966. - Vol. 36. - P. 235-238.
166. Kusuda, R. Establishment and characterization of a cell line derived from the kidney of red sea bream, Pagrus major! R. Kusuda, A. Kawarasaki // Suisonzoshoku. 1993. - Vol. 41. - P. 455-460.
167. Lai,Y.S. Two iridovirus-susceptible cells established from kidney and liver of grouper, Epinephelus awoara (Temminck& Schlegel), and partial characterization of grouper iridovirus/ Y.S. Lai et al. // J. Fish Dis. 2000. - Vol. 23. - P. 379-388.
168. Lai, Y.S. Propagation of yellow grouper nervous virus (YGNNV) in a new nodavirus-susceptible cell line yellow grouper, Epinephelus awoara (Temminck& Schlegel), brain tissue/ Y.S. Lai et al. // J. Fish Dis. 2001. - Vol. 24. - P. 299-309.
169. Lai, Y.S. Establishment of cell lines from a tropical grouper, Epinephelus awoara (Temminck& Schlegel), and their susceptibility to grouper irido- and nodaviruses/ Y.S. Lai et al. // J. Fish Dis. 2003. - Vol. 26. - P. 31-42.
170. Lanfredi, M. Cytogenetic characterization of cell lines from six sturgeon species/ M. Lanfredi et al. // 3rd Intern. Symposium on Sturgeon-Piacenza, Italy, 1997,-El-P.
171. Lannan, C.N. Fish cell lines: establishment and characterization of nine cell lines from salmonids/ C.N. Lannan, J.R. Winton, J.L. Fryer // In Vitro. 1984. -Vol. 20.-P. 671-676.
172. Law, W.M. Fish cell culture: properties of a cell line from the sheepshead, Archosargus probatocephalus! W.M. Law et al. // J. Fish. Res. Board Can. 1978. -Vol. 35.-P. 470-473.
173. Lee, M.H. Some properties of an established marine fish cell line, Caranx mate (Omaka)/ M.H. Lee, P.C. Loh // In Vitro. 1973. - Vol. 8. - P. 406.
174. Lee, L.EJ. Development and characterization of a rainbow trout liver cell line expressing cytochrome P450-dependent monooxygenase activity/ L.E.J. Lee et al. // Cell. Biol. Tox. 1993. - Vol. 9. - P. 279-294.
175. Lewis, D.H. Micricultures of Sarotherodon mossambicus (Peters) cells: their use in detecting fish viruses/ D.H. Lewis, J.E. Marks // J. Fish Dis. 1985. -Vol. 8. - P. 477-478.
176. Li, H. Establishment of cell line PSF from the fibroblast cell of grass carp snout tissue and studies on its biological characteristics/ H. Li et al. // J. Chinese Acad. Fisheries Sci. 1988. -N. 1. - P. 1-8.
177. Li, H. In vitro cytotoxicity of the organophosphorus insecticide methylparathion to FG-9307, the gill cell line of flounder {Paralichthys olivaceus)/ H. Li, S. Zhang // Cell Biol. Tox. 2002. - Vol. 18 (4). - P. 235-241.
178. Li, M.F. A quantitative study of the effects of naturally occurring supplements on the growth of rainbow trout (Salmo gairderi) gonadal cells/ M.F. Li, Stewart J.E. // Can. J. Microbiol. 1965. - Vol. 11. - P. 9-14.
179. Li, M.F. New cell line from the marine lumpfish, Cyclopterus lumpus/ M.F. Li, S. Clyburne//J. Fish Res. Board Can. 1977. - Vol. 34. - P. 134-139.
180. Li, M.F. Fish cell culture: two newly developed cell lines from atlantic sturgeon, {Acipenser oxyrhynchus) and guppy (Poecilia reticulata )/ M.F. Li et al. // Canad. J. Zool. 1985. - Vol. 63. - P. 2867-2874.
181. Li, M.F. A new fish cell line derived from alewife (Alosa pseudoharengus) kidney tissue (abstract)/ M.F. Li, A.R. Moore // In Vitro. 1986. -Vol. 22.-P. 52A.
182. Lie, M.F. Fish cell culture: two newly developed cell lines from atlantic sturgeon, (Acipenser oxyrhynchus) and guppy (Poecilia reticulata)/ M.F. Lie et al. // Canad. J. Zool. 1985. - Vol. 63. - P. 2867-2874.
183. Lidgerding, B.C. Fish cell lines: establishment of the first suspension culture/ B.C. Lidgerding, C.L. Schultz // In Vitro. 1979. - Vol. 15. - P. 216.
184. Lidgerding, B.C. Fish cell lines: Characterization by isozyme analysis/ ! B.C. Lidgerding, S.R. Phelps, W.B. Schill // In Vitro, Tissue Culture Association, Inc. 1984. Vol. 20, N. 3 (Part. 1), P. - 167-171
185. Lin, G.L. Phorbol ester/calcium ionophore activate fish leukocytes and induce long term cultures/ G.L. Lin et al. // Dev. Comp. Immunol. 1992. - Vol. 16.-P. 153-163.
186. Lin, J.H.Y. The development and characterization of novel cell lines from grouper (Epinephelus coioides) and cobia (Rachycentron canadum)l J.H.Y. Lin et al. // Program, and Abstr. 3rd Intern. Symp. On Fish Vaccinology, Bergen, Norway, ( 2003. P. 80. i
187. Liu, H. Isolation of spring viraemia of carp virus (SVCV) from cultured koi (Cyprinus carpio koi) and common carp (C. carpio carpio) in P.R. China/ H. Liu et al. // Bull. Eur. Ass. Fish Path. 2004. - Vol. 24, N. 4. - P. 194-202.
188. Ljungberg, O. Epizootiological and experimental studies of skin tumors in Northern pike (Esox lucius L.) in the Baltic Sea/ O. Ljungberg // Prog. Exp. Tumor Res. 1976. - Vol. 20. - P. 156-165.
189. Lu, Y. Fish cell lines: establishment and characterization of three new cell lines from grass carp (Ctenopharyngodon idella)/ Y. Lu et al. // In Vitro Cell. Dev. Biol. 1990. - Vol. 26. - P. 275-279. |
190. Matsumoto, J. Permanent cell lines from erythrophoromas in goldfish (Carassius auratus)/ J. Matsumoto et al. // J. Natl. Cancer. Inst. 1980. - Vol. 64. -P. 879-890.
191. Matsuyama, H. Compartibilities of antibody and complement among different fish species/ H. Matsuyama, M. Nakao, T. Yano // Nippon Suisan Gakkaishi. 1988. - Vol. 54, N. 5 - P.1993-1996.
192. McAllister, P.E. Viral diseases of fish: first report of carp pox in golden ide (Leuciscus idus) in North America/ P.E. McAllister et al. // J. Wildlife Dis.i1985. Vol. 21(3). - P. 199-204. |
193. McCain, B.B. The Oregon sockeye salmon virus: A. biophysical and . biochemical characteristics; B. antigenic relationship to two other salmonids viruses/ 1 B.B. McCain// Ph.D. thesis. Oregon State Univ., Corvallis. 1970. - 145 pp.
194. McKenzie, L.S. Goldfish tissues/ L.S. McKenzie, N.G. Stephenson // Tissue Cult. Meth. Appl. 1973. - P. 143-146.
195. Meguro, Y. A cell line derived from the fin of Japanase flounder, Paralichthys olivaceusfY. Meguro et al.// Fish Pathol. 1991. - Vol. 26. - P. 69-75.
196. Middlebrooks, B.L. Gulf teleost cell culture: II Characteristics of cells from the speckled trout, Cynoscion nebulosus and the white trout, Cynoscion arenarus/ B.L. Middlebrooks et al. // In Vitro. 1974. - Vol. 10. - P. 379.
197. Middlebrooks, B.L. Fish cell culture: a newcell line from Cynoscium nebulosus/ B.L. Middlebrooks, R.D. Ellender, J.H. Wharton// In Vitro 1979. - Vol. 15.-P. 109-111.
198. Middlebrooks, B.L. Fish cell lines: two new cell lines derived from expiants of trunk musculature of Cynoscion arenariusl B.L. Middlebrooks et al. // , In Vitro-1981.-Vol. 17. P. 427-430. I
199. Miller, N.W. Development and characterization of channel catfish long term B cell lines/ N.W. Miller et al. // J. Immunol. 1994. - Vol. 152. - P. 21802189.
200. Miller, N.W. Development of leukocyte cell lines from the channel catfish (Ictalurus punctstus)/ N.W. Miller, V.G. Chinchar, L.W. Clem // J. Tissue Cult. Method.-1994.-Vol. 16.-P. 117-123.
201. Moritomo, T. Establishment of a cell line with reticulo-endothelial characteristics from a rainbow trout spleen explants/ T. Moritomo, D.P. Anderson, W.B. Schill // Fish Pathol. 1990. - Vol. 25. - P. 165-170.
202. Munday, B.L. Mass mortality associated with a virus-induced vacuolating encephalopathy and retinopathy of larval and juvenile barramundy, LatescalcariferBlochl B.L. Munday et al.// Aquculture. 1992. - Vol. 103. - P. 197-211. jI
203. Nakajima, K. Biological and physico-chemical properties of the iridovirus isolated from cultured red sea bream, Pagrus major/ K. Nakajima, M. Sorimachi // Fish Pathology. 1994. - Vol. 29 (1). - P. 29-33.
204. Nakata, M. Monolayer culture of ovary cells from eel, anguilla japonica: some characteristics and subcultivation techniques of the cells/ M. Nakata^ M. Horiuchi, K. Kohga // Bull. Jap. Soc. Scien. Fish. 1980. - Vol. 46(5)/- P: 599-606.
205. Nelson, R.T. Isolation of a toga-like virus from farmed Atlantic salmo Salmo salar with pacreas disease/ R.T. Nelson et al. // Dis. Aquat. Org. 1995. -Vol. 22. - P. 25-32. j
206. Neukirch, M. Isolation of a virus from koi with altered gills/ M. Neukirch, ! K. Bottcher, S. Bunnajirakul. // Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. 1999. - Vol. 19, N. 5. -P. 221-224.
207. Neukirch, M. Isolation and preliminary characterization of several viruses from koi (Cyprinus carpio) suffering gill necrosis and mortality/ M. Neukirch, U. Kunz//Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. -2001,- Vol. 21, N. 4.-P. 125-135.
208. Nias, A.H. Clone size analysis: a parameter in the study of cell population kinetics/ A.H. Nias // Cell Tissue Kinet. 1968. - Vol. 1. - P. 153-165.
209. Nias, A.H. Clone-size analysis in the study of cell growth following single i or during continuous irradiation/ A.H. Nias et al. // Intern. J. Radiat. Biol. 1965. -Vol. 9.-P. 275-290.
210. Nicholson, B.L. An established cell line from the Atlantic salmon {Salmo salar)/ B.L. Nicholson, C. Byrne // J. Fish Res. Board Can. 1973. - Vol. 30. - P. 913-916.
211. Nicholson, B.L. Growth of fish cell lines on micro carriers / B.L. Nicholson 11 Appl. Environ. Microbiol. 1980. - Vol. 39, N. 2. - P. 394-397.
212. Nicholson, B.L. Techniques in fish cell culture/ B.L. Nicholson //Techniques in the life sciences, CI. Setting up and maintenance of tissue cell cultures, C 105. 1985.-P. 1-16.
213. Nicholson, B.L. Three new continuous cell lines from marine fishes of Asia/ B.L. Nicholson, D.J. Danner, J.L. Wu // In Vitro Cell. Develop. Biology. j 1987. - Vol. 23, N. 3, Part I. - P. 199-204. '
214. Nims, L. Studies of replication of four selected viruses in two cell lines derived from salmonids fish/ L. Nims, J.L. Fryer, K.S. Pilcher // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1970. - Vol. 135. - P. 6-12.
215. Noga, E.J. Studies on channel catfish virus passaged in cell cultures of the walking catfish/ E.J. Noga// M.S. thesis. Florida Atlantic University, Boca Raton, 1977. 53 pp.
216. Noga, E.J. Establishment of cell lines from the walking catfish (Clarias batrachus L.) and their infection with channel catfish virus/ E.J. Noga, Hartmann J.X. , //In Vitro.-1977.-Vol. 13.-P. 160. '
217. OIE Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals. 4th ed. Paris -Office International des Epizooties, 2003.
218. Ojima, Y. Fish chromosome methodology from embryos/ Y. Ojima, T. Ueda // Kwansei Gakuin Univ. Annu. Stud. 1976. - Vol. 25. - P. 121-124.
219. Osowski, H. Uber active Zellbewequnq im explantat von Wirbeitierembryonen/ H. Osowski //Arch. Entuicklunqsmech. Orqan. 1914. - B. 38.-S. 547-583.
220. Parameswaran, V. Splenic cell line from sea bass, Lates calcarifer. establishment and characterization/ V. Parameswaran et al. // Aquaculture. 2006. -Vol. 261.-P. 43-53.
221. Park, E.H. Fish cell line (ULF-23HU) derived from the fin of the central mundminnow {Umbra limi): Suitable characteristics for clastogenicity assay/ E.H. Park et al. 11 In Vitro Cell. Dev. Biol. 1989. - Vol. 25. - P. 987-994.
222. Parkinson, C. A cell line the tilapia Oreochromis spilurus Gunther/ C. Parkinson, C. Agius // J. Fish Biol. 1987. - Supplement A. - P. 239-240.
223. Pfitzner, I. Cell and tissue culture of freshwater fish in virus research/ I. Pfitzner// Ann. N.Y. Acad. Sei. 1965. - Vol. 126. - P. 547-554.
224. Pfitzner, I. In vitro-Züchtung des Gonaden- und Schwimmblasengewebes von Tinea vulgaris Cuv. (Schleie) in trypsinierten Einschichtgewenbekulturen/ I. Pfitzner, L. Grützner // Zentr. Bakteriol., Parasitenk., Abt. I. Orig. 1964. - B. 191. -S. 474-485.
225. Plumb, J.A. Temperature and seeding density: effects on growth rates of RTG-2 cells/ J.A. Plumb, K. Wolf// In Vitro. 1969. -N. 4. - P. 125-126.
226. Puck, T.T. Clonal growth of mammalian cells in vitro. Growth characteristics of clones from single HeLa cells with and without a feeder layer/ T.T. Puck, P.I. Marcus, S.J. Cieciura // J. Exp. Med. 1956. - Vol. 103. - P. 273-284.
227. Rachlin, J.W. Monolayer cultures of gonadal tissue of the zebra danio Brachydanio rerio /J.W. Rachlin, A. Perlmutter, R.J. Seeley// Progress. Fish Cult. -1967. Vol. 29. - P. 232-234.
228. Reed, L.J. A simple method of estimating fifty percent endpoints/ L.J. Reed, H.A. Muench // Amercan J. Hygiene. 1938. - Vol. 24. - P.493-497.
229. Ribeiro, L. Fish cell culture: initiation of a line of pituitary cells from carp {Cyprinus carpio) to study the release of gonadotropin in vitro/ L. Ribeiro, W. Ahne //In Vitro.- 1982.-Vol. 18.-P. 419-420.
230. Ristow, S.S. Susceptibility of four new salmonids cell lines to infectious hematopoietic necrosis virus/ S.S. Ristow, J. de Avila// J. Aquat. Anim. Health. -1994.-Vol. 6.-P. 260-265.
231. Ristow, S.S. Development of long term cell lines from homozygous clones of rainbow trout/ S.S. Ristow et al. // Fish Health Newletter. 1998. - Vol. 26, N. 2. - P. 4-5.
232. Rudakova, S.L. Occurrence and genetic typing of infectious hematopoietic necrosis virus in Kamchatka, Russia/ S.L. Rudakova, G. Kurath, E.V. Bochkova // Dis. Aquat. Org. 2007. - Vol. 75. - P. 1-11.
233. Saito, H. Environmental Toxicology and Chemistry/ H. Saito et al.. -1991.-Vol. 10.-P. 235-241.
234. Sano, T. Herpesvirus cyprini: biological and oncogenic properties/ T. Sano, H. Fukuda, M. Furukawa // Fish Pathology 1985. - Vol. 20(2/3). - P. 381- j 388. '
235. Sano, T. Principal microbial diseases of marine in Japan/ T. Sano, H. Fukuda// Aquaculture. 1987. - Vol. 67. - P. 59-69.
236. Sano, T. A novel carp Coronavirus: characterization and pathogenicity/ T. Sano, T. Yamaki, H. Fukuda // Internat. Fish Health Conf. Conf. handbook, Vancover B.C. Canada, 1988. - P. 160.
237. Sathe, P.S. Establishment and characterization of a new fish cell line, MG-3 from gills of Mrigal, Cirrhinus mrigala/ P.S. Sathe et al. // Indian J. Exp. Biol.- 1995.-Vol. 33.-P. 589-594. j
238. Schmale, M.C. A virus-like agent associated with neurofiromatosis in damselfish/ M.C. Schmale, P.D. Gibbs, C.E. Campbell // Dis. Aquat. Org. 2002. -Vol. 49. - P. 107-115.
239. Shchelkunova, T.I. Enhanced neutralization of spring viraemia of carp virus by fish antibodies in presence of complement/ T.I. Shchelkunova, I.S. Shchelkunov // Diseases Fish and Shellfish: abstract Vth Intern. Conf. EAFP. -Budapest, 1991. P. 95.
240. Shchelkunov, I.S. Two continuous cell lines from carp, Cyprinus carpio L/ I.S. Shchelkunov et al.// Dis. Fish Shellfish: 7th Intern. Conf. EAFP, Palma de j Mallorca, 1995. P. 49.
241. Shea, T.B. A serum-free medium that supports the growth of piscine cell cultures/ T.B. Shea, E.S. Berry // In Vitro. 1983. - Vol. 11. - P. 818-824.
242. Shima, A. Continued in vitro growth of fibroblast-like cells (RBCF-1) derived from the caudal fin of the fish, Carassius auratus/ A. Shima et al. // Expl. Geront. 1980. - Vol. 15. - P. 305-314.
243. Shima, A. Establishment of a cell line (PF line) from a gynogenetic teleost, Poecilia Formosa (Girard) and characterization of its repair ability of UVinduced DNA damage/ A. Shima, R.B. Setlow// Zool. Sci. 1985. - Vol. 2. - P. 477-483.
244. Solis, J. Viral susceptibility range of the fathead minnow (Pimephales promelas) poikilothermic cell line/ J. Solis, E.C. Mora // Appl. Microbiol. 1970. -N. 19.-P. 1-4.
245. Sonstegard, R.A. Establishment of a cell line from lymphosarcoma of theimuskellunge (Esox masquinongy)/ R.A. Sonstegard, K.S. Sonstegard // In Vitro. : 1973.-8.-P. 410.
246. Sorimachi, M. Susceptibility of fish cell lines to eel viruses/ M. Sorimachi// Fish Pathol. 1982. - Vol. 9, N. 17(2). - P. 119-123.
247. Stephenson, E.M. Temperature and other environmental effects on ammocoete organs in culture/ E.M. Stephenson, I.C. Potter // J. Embryol. Exptl. Morphol. 1967.-Vol. 17.-P. 441-452.
248. Stephes, E.B. Establishment of a cell line from the Atlantic menhaden/ E.B. Stephes, F.M. Hetrick // In Vitro. 1979. - Vol. 15. - P. 216.
249. Stone, D.M. Nucleotide sequence analysis of the glycoprotein gene of ^iputative spring viraemia of carp virus and pike fry rhabdovirus isolates reveals four genogroups/ D.M. Stone et al. // Dis. Aquat. Org. 2003. - Vol. 53. - P: 203-210.
250. Stuge, T.B. Development and analysis of various clonal alloantigen-dependent cytotoxic cell lines from channel catfish/ T.B. Stuge et al. // J. Immunol. 2000. - Vol. 164. - P. 2971-2977.
251. Sun, L. ES-like cultures derived from early zebrafish embryos/ L. Sun et al. // Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1995. -N.4. - P. 193-199.
252. Takano, R. Isolation of viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) from wild Japanese flouhder, Paralichthys olivaceusl R. Takano et al. // Bull. Eur. i Ass.FishPath.-2000.-Vol. 20, N. 5.-P. 186-192. 1
253. Tafalla, C. Molecular characterization of sea bream {Sparus aurata) transforming growth factor (3 1/ C. Tafalla et al. // Fish Shellfish Immunol. 2003. -Vol. 14, Iss. 5.-P. 405-421.
254. Tamai, T. Purification and characterization of interferon-like antiviral protein derived from flatfish {Paralichthys olivaceus) lymphocytes immortalized by oncogenes/ T. Tamai et al. //Cytotechnol. 1993. - Vol. 11.-P. 121-131.
255. Tamai, T. Immortalization of cells with oncogene transfection/ T. Tamai et al. // Techniques in Fish Immunology Eds: J.S. Stolen, T.C. Fletcher, A.F. Rowley, D.P. Anderson, S.L. Kaattari, J.T. Zelikoff, S.A. Smith 1994. - Vol. 3. -P.53-60.
256. Tomasec, I. Weiterer Beitrag zur Aetiologie der infektiösen Bauchwassersucht des Karpfens/ I. Tomasec et al. // Jugoslav. Akad. Znanosti Umfetnosti, Zagreb, Mat.- Prirodoslovni Ruzred. 1964. - Vol. 16. - P. 35-44.
257. Tong, S.L. The establishment and partial characterization of a continuous fish cell line FG-9307 from the gill of flounder, Paralichthys olivaceus/ S.L. Tong, H. Li, H.Z. Miao // Aquaculture. 1977. - Vol. 156. - P. 327-333.
258. Tornton, J. Mycoplasma contamination of fish viruses vaccines/ J. Tornton et al. //Bull. EAFP. 1999. - Vol. 19(5). - P. 207-212.
259. Townsley, P.M. Marine fish tissue culture/ P.M. Townsley, H.G. Wight, M.A. Scott// J. Fish. Res. Board Can. 1966. - Vol. 20. - P. 679-684.
260. Tung, L.C. Three cell lines derived from spleen and kidney of black porgy {Acanthopagrus schlegeli)/ L.C. Tung, S.N. Chen, G.H. Kou // Fish. Pathol. 1991. -Vol. 26. - P. 109-117.
261. Vallejo, A.N. Spontaneous development of functionally active long term , monocyte-like cell lines from the channel catfish/ A.N.Vallejo et al. // In Vitro Cell, j Dev. Biol. 1991.-Vol. 27A.-P. 279-285.
262. Wakamatsu, Y. Fish hereditary melanoma cell lines of different degrees of cell differentiation/ Y. Wakamatsu et al. // Devel. Growth Differ. 1984. - Vol. 26. -P. 503-513.
263. Wakamatsu, Y. Establishment of a pluripotent cell line derived from a medaka (Oryzias latipes) blastula embryo/ Y. Wakamatsu, K. Ozato, T. Sasado II ( Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1994.-Vol. 3.-P. 185-191.
264. Walker, D.P. Studies on the culture, assay of infectivity and some in vitro i properties of Lymphocystis virus/ D.P. Walker, B.J. Hill // J. Gen. Virol. 1980. -Vol. 51.-P. 385-395.
265. Wang, H.C. Establishment and characterization of a cell line derived from milkfish (Chanos chanos) heart/ H.C. Wang// Master Thesis, Dep. Zool., Nation. Taiwan Univer., 1989. 56p.
266. Wang, R. Establishment and characterization of macrophage cell line from the goldfish/ R. Wang et al. // Fish & Shellfish Immunol. 1995. - Vol. 5. - P. 329-436.
267. Watanabe, T. Continuous cell line derived from the kidney of yamame, ,i
268. Oncorhynchus masoul T. Watanabe et al. II Bull. Jap. Soc. Sci. Fish. 1978. - Vol. I 44.-P. 415-418.
269. Watanabe, T. Establishment and properties of the continuous cell line derived from the embryonated eggs of chum salmon, Oncorhynchus keta! T. Watanabe et al. II Bull. Jap. Soc. Sci. fish. 1980. - Vol. 46. - P. 1203-1209.
270. Watanabe, Y. Monolayer cell cultures from marine fishes/ T. Watanabe, H. Hanada, M. Ushiyama // Fish Pathol. 1981. - Vol. 15. - P. 201-205.
271. Watanabe, T. Continuous cell line derived from the kidney of Japanese eel, Anguilla japonical T. Watanabe// J. Tokyo Vet. Animal Sci. 1984. - Vol. 32. - , P. 65-69.
272. Watanabe, T. Establishment and properties of a cell line derived from salmonid fish liver/ T. Watanabe, T. Moritomo // Invertebrate and fish tissue culture Eds.: Y. Kuroda, E. Kurstak, K. Maramorosch. Tokyo: Japan Sei. Soc. Press, 1988.- P. 199-202. j
273. Watson, L.R. Characteristics and pathogenicity of a novel herpesvirus ' isolated from adult and sub adult white sturgeon Acipenser transmontanus/ L.R. Watson et al. // Dis. Aquat. Org. 1995. - Vol. 22. - P. 199-210.
274. Wei, Y. Establishment of grass carp (Ctenophoryngodon idellus) caudalfin tissue diploid cell line: GCCF-2 and analysis of some of its biological |icharacteristics/ Y. Wei, R. Lu, G. Bai // Acta Hydrobiol. Sinica. 1986. - Vol. 10. - ! P. 293-294.
275. Wen, C.M. Study of the established cell line derived from jarbua {Therapon jarbua) fin/ C.M. Wen// Master Thesis, Dep. Zool., National Taiwan Univer., 1989.-56 p.
276. Wergeland, H.I. A salmonids cell line (TO) for production of infectious salmon anemia virus (ISAV) / H. I. Wergeland, R.A. Jakobsen // Dis. Aquat. Organ. -2001 Vol. 44.-P. 183-190.
277. Wharton, J.H. Fish cell culture: characteristics of a cell line from the silver perch, Bairdiella chrysural J.H. Wharton et al. // In Vitro. 1977. - 13. - P. 389-397.
278. Winton, J.R. Isolation of a Reovirus from Coho salmon {Oncorhynchus kisutch) in Oregon, USA/ J.R. Winton et al. // Viruses Lower Vertebrates Eds.: W. Ahne & Kurstak SpringerVerlag Berlin Heidelberg, 1989. - P. 257-269.
279. Wizigmann, G. Serologische Untersuchungen uder das Vorkommenvon Antikörpern gegenüber Rhabdovirus Carpio bei Karpfen in bayerischen Teichwirtschaften/ G. Wizigmann, C. Pfeil-Putzien, C. Baath, H. Dangschat, G.
280. Koppel // Fisch und Umwelt. Beiträge zur Fischpathologie und toxikologie.- Heft 8. Gustav Fischer Verlag. Stuttgart. N.Y., 1980. - S. 31-36.
281. Wolf, K. Physiological saline for fresh-water teleost/ K. Wolf // Progressive Fish Culturist. 1963. - Vol. 25. -P. 135-140.
282. Wolf, K. Fish cell culture/ K. Wolf, W. Ahne //Advances in cell culture. -1982.-Vol. 2.-P. 305-328.i
283. Wolf, K. Cultivation of adult teleost tissues in vitro! K. Wolf, Dunbar C.E. !1
284. Proc. Soc. Exptl. Biol. Med. 1957. - Vol. 95. - P. 455-458.
285. Wolf, K. Poikilotherm vertebrate cell lines and viruses: a current listing for fishes/ K. Wolf, J. A. Mann//In Vitro.-1980.-Vol. 16 (2).-P. 168-179.
286. Wolf, K. Preparation of monolayer cell cultures from tissues of some lower vertebrates/K. Wolf et al.//Science. 1960.-Vol. 132. -P. 1890-1891.
287. Wolf, K. Infectious pancreatic necrosis in trout. A tissue culture study/ K. Wolf, M.C. Quimby, S.F. Snieszko // Prog. Fish. Cult. 1960. - Vol. 22. - P. 64-68.
288. Wolf, K. Established eurythermic line of fish cells in vitro! K. Wolf, M.C. Quimby // Science. 1962. - Vol. 135. - P. 1065-1066.
289. Wolf, K. Lymphocystis virus: isolation and propagation in centrarchid fish cell lines/ K. Wolf, M.C. Quimby // Science. 1966. - Vol. 151. - P. 1004-1005.
290. Wolf, K. Low-temperature incubation using a water supply/ K. Wolf, M.C. Quimby//Appl. Microbiol. 1967.-Vol. 15.-P. 1501.153 'I
291. Wolf, K. Fish cell and tissue culture/ K. Wolf, M.C. Quimby// Fish ! Physiology Eds.: W.S. Hoar and D.J. Randall. N.Y. Acad. Press, 1969. - Vol. 3. -P. 253-305.
292. Wolf, K. Primary monolayer of fish cells initiated from minced tissues/ K. Wolf, M.C. Quimby // TCA Manual. 1976. - Vol. 2, N. 4. - P. 445-448.
293. Wolf, K. Primary monolayer of fish cells initiated from trypsinized tissues/ K. Wolf, M.C. Quimby // TCA Manual. 1976. - Vol. 2, N. 4. - P. 453-456.
294. Wolf, K. Procedures for subculturing fish cells and propagating fish cell lines/ K. Wolf, M.C. Quimby // TCA Manual. 1976. - Vol. 2, N. 4. - P. 471-474.
295. Wolf, K. Fish Viruses and Fish Viral Diseases/K. Wolf. Ithaca and 1 London: Cornell University Press, 1988. - 476 p.
296. Yamamoto, K. Chromosomal feature of a cell line from the triploid hybrid between rhodeine cyprinid fishes/ K. Yamamoto, A. Takai, Y. Ojima // CIS (Chromosome Information Service). 1988. - Vol. 45. - P. 27-28.
297. Ye, X. Large-scale culture of grass carp cell and virus by using bioreartor/ X. Ye et al. // J. Fish. China. 1992. - Vol. 16. - P. 1-6.
298. Ye, H.Q. Development and characterization of cell lines from heart, liver, spleen and head kidney of sea perch Lateolabrax japonicusl H.Q. Ye et al. // J. Fish Biology. 2006. - Vol. 69. - P. 115-126. !
299. Yoshimizu, M. Viral diseases of freshwater fishes in Hokkaido/ • M.Yoshimizu// Sci. Rep. Hokkaido Fish Hatchery. 1994. - Vol. 48. - P. 15-24.
300. Young, J.Z. The preparation of isotonic solutions for use in experiments with fish/ J.Z. Young // Publ. Staz. Zool. Napol. 1933. - N. 12. - P. 425-431.
301. Zhang, N.C. The establishment of strain ZC-7901 and substrain ZC-7901Sfrom the snout tissue cells of grass carp/ N.C. Zhang, G.Z. Yang // J. Fish China. -1981. -N. 5. P. 111-119.
302. Zhao, Z. Establishment and characterization of two cell lines from bluefin trevally Caranx melampygus/ Z. Zhao, Lu Yu. // DAO. 2006. - Vol. 68, N. 2. - P. 91-100.
303. Zorriehzahra, M. J. Mortality of wild golden mullet {Liza auratus) in ; iranian waters of the Caspian sea, associated with viral nervous necrosis-like agent/ M.J. Zorriehzahra et al.// Iranian J. Fish. Scie. 2005. - Vol. 4, N. 2. - P. 43-58.
304. Zuo, W. A cell line derived from the kidney of grass carp {Ctenophoryngodon idellus) / W. Zuo, X. Yang // Freshw. Fish 1984. - N. 2. - P. 38-39.i
-
Щелкунова, Татьяна Ивановна
-
кандидата биологических наук
-
Покров, 2008
-
ВАК 03.00.06
- Выявление герпесвируса сибирского осетра с помощью ПЦР в режиме реального времени и молекулярно-генетическая характеристика изолятов вируса
- Влияние тяжелых металлов (Hg,Cu,Cd) и карбофоса на иммунофизиологическое состояние молоди осетровых и карповых рыб
- Интенсивное воспроизводство рыб в разных водоемах с использованием биотехнических приемов
- Внутривидовой генетический полиморфизм русского осетра (Acipenser gueldenstaedtii)
- Биологические, физико-химические и молекулярно-генетические свойства герпесвируса сибирского осетра
